CN114316279B - 一种以环糊精为核的星形聚合物及其蛋白/多肽偶联物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种以环糊精为核的星形聚合物，该聚合物以环糊精为核，以端基为单/双砜基的PEG为臂，可通过点击化学反应，与含有巯基或二硫键的蛋白/多肽偶联。本发明所述的星形聚合物可以作为蛋白/多肽药物的载体，偶联一种或多种蛋白/多肽，稳定、长效、生物相容性好，制备方法简单高效，并且可以保持蛋白的活性。

Description

一种以环糊精为核的星形聚合物及其蛋白/多肽偶联物

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种以环糊精为核的星形聚合物以及相应的蛋白/多肽偶联物及应用。

背景技术

由于蛋白类药物/酶类药物分子量小，单独的蛋白类药物/酶类药物进入体内血液循环后很容易被代谢并被肾脏清除，很难发挥其功效。因此通常采用对蛋白类药物进行修饰并提高其分子量的方式延长其在体内的长循环时间，提高蛋白类药物的体内半衰期，同时某些修饰可以使蛋白类药物在体内更加稳定，进一步提高治疗效果。

对蛋白类/酶类药物进行PEG修饰是现在普遍采用的提高蛋白类药物的半衰期和稳定性的方法。但是现有的修饰方法大多是集中在单一蛋白或酶类药物的PEG化修饰，提高药物半衰期的能力较弱，且功能较为单一。

以环糊精为核的星型聚合物是一种常见的星型聚合物，多应用于大分子自主装或作为模板来形成形状规整的无机纳米材料。而在纳米药物领域，以环糊精为核的星型聚合物多以侧链可修饰的聚合物为主链，并在侧链进行功能化分子如小分子药物，siRNA或者造影剂的修饰，用作他们的载体，然而作为蛋白或者抗体药物的载体的研究相对较少。

发明内容

本发明针对现有技术不足，提供一种具有良好生物相容性，可以同时偶联多种蛋白/多肽药物的星型聚合物。

本发明具体技术方案如下：

一种以环糊精为核的星形聚合物，以环糊精为核，以PEG为臂，所述PEG的端基为具有单/双砜基、巯基和/或具有碳碳双键的基团中的一种或几种的基团。

优选的，PEG的端基选自如下一种或几种基团：

所述环糊精选自α、β或γ环糊精，优选β环糊精。

优选所述环糊精与PEG通过“点击化学”的方式进行共价连接。

具体的，具体为修饰有炔基的环糊精与修饰有叠氮基的PEG，或者修饰有叠氮基的环糊精与修饰有炔基的PEG通过1,3-偶极环加成反应偶联。进一步优选的，环糊精与PEG通过三氮唑键连接。

进一步优选的，修饰有如下基团中的一种或几种的环糊精，与一端修饰有炔基的PEG发生1,3-偶极环加成反应，所述PEG的另一端修饰有具有单/双砜基、马来酰亚胺基巯基或碳碳双键基团中的一种或几种的基团。

本发明另一目的在于提供上述星形聚合物在制备蛋白或多肽药物载体中的应用。

本发明另一目的在于提供一种以环糊精为核的星形聚合物的蛋白/多肽偶联物，含有巯基或二硫键的蛋白或多肽与本发明所述的星形聚合物通过通过二硫键或硫碳键偶联(通过Click反应)。

所述含有巯基或二硫键的蛋白或多肽选自酪蛋白、胶原蛋白酶、大豆蛋白，透明质酸酶中的一种或几种。

优选的，所述偶联物具有如下结构：

其中，Y代表(S为蛋白上的巯基，通过碳硫键连接蛋白)、(S为蛋白上的巯基，通过碳硫键连接蛋白)或者/>(S为蛋白上的巯基，与蛋白上的巯基通过二硫键连接蛋白)，R代表酪蛋白和/或胶原蛋白酶。

本发明的一个具体的应用为星形聚合物与酪蛋白和/或胶原蛋白酶的偶联物在制备治疗肝纤维化药物中的应用。

本发明所述的以环糊精为核的星型聚合物的制备方法如下：

将聚乙二醇的一端使用炔基端封，一端使用砜基/双砜基、巯基、马来酰亚胺基或具有碳碳双键的基团中的一种或几种端封，炔基与一端具有叠氮基团的环糊精通过点击化学反应偶联，获得星型聚合物。可进一步通过点击化学反应将含有巯基或二硫键的蛋白/多肽与星型聚合物PEG端的砜基/双砜基、巯基、马来酰亚胺基或具有碳碳双键的基团反应，即可得到蛋白/多肽偶联物。

本发明一个具体的示例如下：

a.分别将无水乙醇、对乙酰苯甲酸、哌啶盐酸盐和多聚甲醛加入到圆底烧瓶中，磁子搅拌均匀后加入浓盐酸。加热回流后加入丙酮并混匀后进行过滤，取沉淀，真空干燥则得到化合物A。其结构式为：

b.分别将无水乙醇、甲醇、哌啶、甲醛溶液、化合物A和4-甲基苯硫醇加入到圆底烧瓶中。加热回流后将溶剂旋干，再在甲醇中冷却结晶可得到淡黄色化合物B。其结构式为：

c:将化合物B、OXONE甲醇和水，在室温下搅拌后，分离提纯得到化合物C。其结构为：

d:将化合物C、N-羟基琥珀酰亚胺和DIPC，在氩气保护下反应过夜，加入去离子水萃取，合并两次获得的有机层，旋干，得到白色固体，在室温下真空干燥即可获得化合物D，其结构为：

e：将一端氨基一端炔基的聚乙二醇2000和化合物D在无水DCM溶液中在30℃条件下搅拌反应。将获得的溶液旋干，加入丙酮重结晶，得到化合物E。其结构式为：

f:将环糊精、吡啶和2-溴异丁酰溴溶于二氯甲烷加入到圆底烧瓶中，室温下搅拌过夜。将反应液过滤，滤液在1N盐酸中水洗两遍，再在去离子水中水洗两遍，有机相经无水硫酸钠干燥，旋干。经分离纯化，得到化合物F。其结构式为：

g:将化合物F和叠氮化钠溶解在DMF中，再将该溶液油浴加热至70℃，反应两天。将反应液浓缩，在水中沉淀两次，干燥。得到化合物G：其结构式为：h：将化合物E、叠氮环糊精和无水硫酸亚铜加入反应瓶中。液氮条件下冻抽三次，再将Schlenk瓶置于30℃下搅拌3天，反应结束后加入40mL去离子水后透析两天，冻干，得到星型性聚合物H。其结构式为：

i:将化合物H加入到pH7.8的含有EDTA和TCEP的磷酸盐缓冲液中，再将含有κ-酪蛋白的磷酸盐缓冲液和含有胶原蛋白酶的磷酸盐缓冲液加入到化合物H的溶液中，4℃反应过夜，用截留分子量100000的超滤管超滤五次，即可得到同时偶联酪蛋白和胶原蛋白酶的星型聚合物I。其结构式为：

其中R代表酪蛋白和/或胶原蛋白酶(S为蛋白上的巯基，通过碳硫键连接蛋白)，优选酪蛋白和胶原蛋白酶的质量比为1:1。

在上述示例中，本发明选择将β环糊精的21个羟基全部偶联PEG以得到以环糊精为核的21个臂的星型聚合物。为了能更多地偶联上蛋白/酶类药物，星型聚合物的PEG端基修饰了双砜基团，所得到的星型聚合物端基有42个反应位点，可以与更多的蛋白质上巯基偶联，提高星型聚合物载体的蛋白负载量。

酪蛋白由四种蛋白质组成，包括α_s1-酪蛋白，α_s2-酪蛋白，β-酪蛋白和κ-酪蛋白。酪蛋白也包含了很多生物活性多肽，比如：作用神经系统的阿片样肽，作用于心血管系统的抗血栓肽和抗高血压活性肽，作用于营养系统的酪蛋白磷酸肽和糖巨肽以及作用于免疫系统的免疫调节肽和抗菌肽。I型胶原蛋白酶(Collagenase)，它能在生理pH和温度条件下特异性地水解天然胶原蛋白的三维螺旋结构，而不损伤其它蛋白质和组织。但是由于它是一种有活性的蛋白质，因此，它对温度、pH和导致蛋白质变性的各种因素均非常敏感，极易受到外界条件的影响而改变其本身的构象和性质。

本发明一个具体的示例，考虑到酪蛋白所具有的良好的生物相容性和生物活性，以及胶原蛋白酶的独特优点。结合高分子结构的可设计性，将酪蛋白和胶原蛋白酶同时引入以环糊精为核的星形聚合物，用于制备治疗肝纤维化药物。

本发明优点：

1.本发明所述的以环糊精为核的星形聚合物具有一个或多个反应位点，相比于线性结构的大分子蛋白偶联物，不仅可以提高了多肽/蛋白质的负载量，还可以同时负载多种多肽/蛋白质，可以发挥多种蛋白质/酶类药物的协同作用。

2.本发明所述的环糊精星型聚合物分子量较大，能够延长蛋白体内循环时间的同时保留了蛋白的生物活性。因而可用于组织蛋白药物递送等领域。

3.本发明采用环糊精和PEG生物相容性好，与多肽/蛋白效率高。

4.本发明采用“点击化学”的构思，星形聚合物及其多肽/蛋白偶联物的工艺简单，易于制备。

5.本发明星形聚合物负载酪蛋白和胶原蛋白酶的偶联物可直接用于纤维化疾病特别是肝纤维化的治疗。

附图说明

图1：本发明实施例1化合物H的红外光谱图。

图2：化合物I的SDS-PA GE电泳图。

图3：化合物I的体外细胞毒性测试结果显示，化合物I对正常肝星状细胞的活力没有影响。

图4：化合物I对肝星状细胞活化的影响(αSMA染色)。结果显示化合物I可以显著降低肝星状细胞的活化。

图5：化合物I的血液半衰期测试结果显示，相较于单臂的聚合物蛋白偶联物，星型的化合物I具有更长的血液半衰期，提高了蛋白质的血液长循环时间。

图6：化合物I对小鼠CCl₄诱导的肝纤维化模型的治疗效果。结果显示化合物I可以显著逆转小鼠肝纤维化。

具体实施方式

下面结合实例进一步阐明本发明的内容,但是这些实例并不限制本发明的保护范围。

实施例1：以环糊精为核的星型聚合物的制备。

a.分别将2mL无水乙醇、4g对乙酰苯甲酸、1.9g哌啶盐酸盐和6g多聚甲醛加入到250mL圆底烧瓶中，磁子搅拌均匀后加入0.3mL浓盐酸。135℃下回流4h，在回流2h时，取下烧瓶，再次加入2.74g多聚甲醛后继续回流。回流1h后将圆底烧瓶冷却到室温，加入50mL丙酮并混匀后进行过滤，取沉淀，真空干燥则得到化合物A，其结构式为：

化合物A的核磁氢谱(CDCl₃)表征如下：δ＝1.78(m,6H),3.33(s,4H),3.46(t,2H),3.71(t,2H),8.09(m,4H),10.48(s,1H)。

b.分别将1mL无水乙醇、6mL甲醇、5g化合物A和8g 4-甲基苯硫醇加入到100mL圆底烧瓶中，再依次加入0.1mL哌啶和3.5mL 37％甲醛溶液。在105℃下回流1h后停止加热，待烧瓶冷却后再加入3.5mL 37％甲醛溶液，再次加热回流1h。然后将烧瓶冷却到室温，将溶剂旋干后加入10mL甲醇，先缓慢加热使粗产物溶解，再冷却至室温，在-20℃冰箱中储存过夜。过滤该溶液可得到淡黄色化合物2，并在室温下真空干燥过夜，得到化合物B，其结构式为：

化合物B的核磁氢谱(CDCl₃)表征如下：δ＝2.36(s,6H),3.19(m,4H),3.81(q,1H),7.08(d,4H),7.13(d,4H),7.60(d,2H),8.05(d,2H)。

c:将50mL甲醇比水1:1的溶液加于500mL圆底烧瓶中，再加入36g化合物B及45gOXONE，在室温下搅拌24h后先用50mL氯仿萃取两次，再加入100mL水溶解无机固体后再用100mL氯仿萃取一次。然后在氯仿萃取物中加入100mL食盐水萃取，将有机层分离出来后用无水硫酸镁干燥，过滤后将溶液在40℃下进行旋干。将得到的固体在室温下减压干燥一整夜，则得到化合物C，其结构为：化合物C的核磁氢谱(CDCl₃)表征如下：δ＝2.42(s,6H),3.51(m,4H),4.33(q,1H),7.30(d,4H),7.64(m,6H),8.02(d,2H)。

d:在50mL干燥干净的Schlenk烧瓶中加入4.00g化合物C及8.483g N-羟基琥珀酰亚胺，再用氩气保护。然后在烧瓶中加入5mL无水DCM后在冰浴条件下冷却1min，在搅拌条件下滴加657uL DIPC，并在室温下反应1.5h，然后再次加入另外60μL DIPC并反应1.5h。将获得的溶液用脱脂棉过滤后用约30mL DCM稀释溶液。加入15mL去离子水萃取两次，合并两次获得的有机层，使用无水硫酸镁干燥后进行过滤得到滤液，旋干，得到白色固体，在室温下真空干燥一夜即可获得化合物D，其结构为：

化合物D的核磁氢谱表征如下：δ＝2.41(s,6H),2.87(s,4H)，3.49(m,4H)，4.30(q,1H)，7.30,7.70(q,8H),8.06(q,4H)。

e：在干燥的50mL Schlenk烧瓶中加入0.8g一端氨基一端炔基的聚乙二醇2000，氩气保护。然后在烧瓶中加入5mL无水甲苯后对之稍微加热以使得PEG完全溶解于甲苯之中。然后用油泵将甲苯抽干并用氩气保护。再在烧瓶中加入5mL无水DCM后在冰浴条件下搅拌。在另一个25mL Schlenk烧瓶中加入30m g化合物D，抽真空5min后，氩气保护，然后在烧瓶中加入4mL无水DCM，待固体溶解后将烧瓶冰浴5min。将此溶液逐滴加入到含PEG的烧瓶之中，待其冷却到室温后再在30℃条件下进一步搅拌48h。将获得的溶液旋干，加入2mL丙酮，缓慢加热至全部溶解，得到澄清溶液后将烧瓶置于冰浴中搅拌，等沉淀析出后进行过滤，将得到的固体真空干燥过夜则得到化合物E，其结构式为：

化合物E的核磁氢谱(CDCl3)表征如下：δ＝2.49(s,6H),3.36(s,3H),3.64(m,PEG+4H)，4.30(q,1H),7.30(q,4H),7.72(q,4H)。

f:将4.4gβ环糊精与0.12g吡啶加入到圆底烧瓶中，冰浴下搅拌十分钟，再将1.3g2-溴异丁酰溴溶于10mL二氯甲烷中滴加至圆底烧瓶中。室温下搅拌过夜。将反应液过滤，滤液在1N盐酸中水洗两遍，再在去离子水中水洗两遍，有机相经无水硫酸钠干燥，旋干。经分离纯化，得到化合物F，其结构式为：化合物F的核磁氢谱表征如下：δ＝1.86(s,126H),3.8-5.7(m,49H)。

g:将395g上一步反应所得化合物F和2.33g叠氮化钠溶解在25mL DMF中，再将该溶液油浴加热至30℃，反应两天。将反应液浓缩，在水中沉淀两次，干燥，得到化合物G，结构式为：

化合物G的核磁氢谱(CDCl₃)表征如下：δ＝1.5(s,126H),3.8-5.7(m,49H)。

h:在25mL Schlenk瓶中加入10mL DMF，再将0.05mmol炔基PE G和0.16mmol叠氮环糊精加入到Schlenk瓶中，加入磁子搅拌溶解，再加入1mg无水硫酸亚铜。液氮条件下冻抽三次，再将Schlenk瓶置于30℃下搅拌3天，反应结束后加入40mL去离子水后透析两天，冻干，得到星型性聚合物H，其结构式为：

叠氮环糊精与偶联PEG的环糊精(化合物H)的红外光谱对比如图1所示，从图中可以看出原本在2100cm^-1附近属于叠氮的峰在经过与化合物G反应之后消失，证明了炔基PEG与叠氮环糊精的click反应的发生。

实施例2：星型聚合物-胶原蛋白酶-酪蛋白偶联物的制备。

将20mg化合物H加入到200μL pH7.8的含有25mM EDTA和5mM TCEP的磷酸盐缓冲液中，再将60mL含有1mg/mLα_s2-酪蛋白的磷酸盐缓冲液和20mL含有1mg/mLI型胶原蛋白酶的磷酸盐缓冲液加入到化合物H的溶液中，4℃反应过夜，用截留分子量100000的超滤管超滤五次，即可得到同时偶联酪蛋白和胶原蛋白酶的偶联物。其结构式为：

其中R代表酪蛋白和/或胶原蛋白酶(S为蛋白上的巯基，通过碳硫键连接蛋白)。星型聚合物-胶原蛋白酶-酪蛋白偶联物(CPCaCol)的SDS-PAGE电泳图如图2所示，结果显示该偶联物的分子量达到300kD左右。

实施例3：以环糊精为核的单臂聚合物的制备

a.将1.1gβ环糊精与0.32g吡啶加入到圆底烧瓶中，冰浴下搅拌十分钟，再将0.23g2-溴异丁酰溴溶于10mL二氯甲烷中滴加至圆底烧瓶中。室温下搅拌过夜。将反应液过滤，滤液在1N盐酸中水洗两遍，再在去离子水中水洗两遍，有机相经无水硫酸钠干燥，旋干。经分离纯化，得到化合物I，其结构式为：化合物I的核磁氢谱表征如下：δ＝1.86(s,6H),3.8-5.7(m,49H)。

b.将395g上一步反应所得化合物F和0.3g叠氮化钠溶解在25mL DMF中，再将该溶液油浴加热至70℃，反应两天。将反应液浓缩，在水中沉淀两次，干燥，得到化合物J，其结构式为:化合物J的核磁氢谱(CDCl₃)表征如下：δ＝1.5(s,6H),3.8-5.7(m,49H)。

c.在25mL Schlenk瓶中加入10mL DMF，再将0.05mmol炔基PE G和0.045mmol叠氮环糊精加入到Schlenk瓶中，加入磁子搅拌溶解，再加入1mg无水硫酸亚铜。液氮条件下冻抽三次，再将Schlenk瓶置于30℃下搅拌3天，反应结束后加入40mL去离子水后透析两天，冻干，得到星型性聚合物K。其结构式为：

实施例4：单臂星型聚合物-胶原蛋白酶偶联物的制备

将20mg化合物K加入到200μL pH7.8的含有25mM EDTA和5mM TCEP的磷酸盐缓冲液中，再将20mL含有1mg/mL胶原蛋白酶的磷酸盐缓冲液加入到化合物K的溶液中，4℃反应过夜，用截留分子量100000的超滤管超滤五次，即可得到单臂星型聚合物-胶原蛋白酶偶联物(CPCol)。

其中R为胶原蛋白酶(S为蛋白上的巯基，通过碳硫键连接蛋白)。

实施例5：

采用MTT法测定实施例2制得的星型聚合物-胶原蛋白酶-酪蛋白偶联物(CPCaCol)的体外细胞毒性，细胞株为人源肝星状细胞LX-2。结果如图3所示，即使该偶联物的浓度达到2mg/mL时依然对LX-2细胞没有显著毒性。显示了该偶联物良好的生物相容性。

实施例6：

通过αSMA的细胞免疫荧光染色考察星型聚合物-胶原蛋白酶-酪蛋白偶联物(CPCaCol)对肝星状细胞的活化程度的影响。将2mg/mL的CPCaCol大分子与肝星状细胞共培养24h后，用多聚甲醛对其进行固定，接着分别将细胞与平滑肌动蛋白(αSMA)一抗和二抗共孵育。如图4所示，激光共聚焦荧光显微镜图片显示，αSMA的绿色荧光在加入星型聚合物-胶原蛋白酶-酪蛋白偶联物后显著降低。显示了该偶联物可以抑制肝星状细胞的活化。

实施例7：

将单臂星型聚合物-胶原蛋白酶偶联物(CPCol)、单臂PEG-胶原蛋白酶偶联物(PCol)和星型聚合物-胶原蛋白酶-酪蛋白偶联物(CPCaCol)分别标记上荧光素，再将其分别通过尾静脉注射到健康小鼠体内。在不同时间点通过眼眶取血测量单臂蛋白偶联物和星型蛋白偶联物的体内代谢半衰期。如图5所示，实验组的CPCaCol大分子偶联物在小鼠体内的半衰期可达到22.21h，而对照组的CPCol和PCol的半衰期仅有12.17h和11.59h。证明了星型聚合物蛋白载体可以显著提高蛋白药物的半衰期，延长其体内长循环时间。

实施例8：

通过CCl₄诱导的小鼠肝纤维化模型研究胶原酶和酪蛋白的大分子蛋白偶联物对肝纤维化治疗的影响。通过在ICR小鼠腹腔内注射20％的四氯化碳橄榄油混合物，构建小鼠肝纤维化模型。一周两次，连续注射10周后，通过尾静脉分别将PBS，100mg/kg的PCol、CPCol和CPCaCol大分子蛋白偶联物注射到小鼠体内，连续注射5天后研究小鼠肝纤维化的变化。如图6所示，红色部分代表纤维化造成的胶原累积，红色部分越多表明纤维化程度越高。结果显示在连续给药5天后小鼠肝纤维化的疤痕显著减少。证明胶原酶和酪蛋白的大分子蛋白偶联物可以显著逆转肝纤维化。

Claims (3)

1.一种以环糊精为核的星形聚合物的蛋白/多肽偶联物，其特征在于含有巯基或二硫键的蛋白/多肽与环糊精为核的星形聚合物通过二硫键或硫碳键偶联，所述含有巯基或二硫键的蛋白/多肽选自酪蛋白和胶原蛋白酶，所述星形聚合物以环糊精为核，以 PEG 为臂，所述环糊精与PEG通过三氮唑键连接，所述星型聚合物由修饰有如下基团、、/>中的一种或几种的环糊精与一端修饰有炔基PEG发生1, 3-偶极环加成反应制得，所述PEG的另一端修饰有 />。

2.根据权利要求1所述的偶联物，其特征在于具有如下结构：

，R代表酪蛋白和胶原蛋白酶。

3.根据权利要求1或2所述的偶联物在制备治疗肝纤维化药物中的应用。