KR101210713B1 - 온도 민감성 생리활성 물질 전달체 및 이의 제조방법 - Google Patents

온도 민감성 생리활성 물질 전달체 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 온도 민감성 생리활성 물질 전달체 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 다당류 또는 다당류와 숙신산무수물을 친수성 블록으로 포함하고, 폴리락티드를 비이온성 블록으로 포함하는 양친성 생분해성 블록 공중합체를 포함하는 온도 민감성 생리활성 물질 전달체 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 친수성 고분자-폴리락티드 공중합체는 단백질, 폴리뉴클레오티드 등의 생리활성물질과 이온결합 및 온도민감성 소수성결합을 통해 생체 내 조건에서 안정한 복합체를 형성하여 생리활성물질의 생체 내 전달을 용이하게 하므로 생체 내 약물 전달 시스템 등으로 활용될 수 있다.

Description

온도 민감성 생리활성 물질 전달체 및 이의 제조방법{Temperature-sensitive bioactive agent delivery system and method for producing it}
본 발명은 온도 민감성 생리활성 물질 전달체 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 다당류 또는 다당류와 숙신산무수물을 친수성 블록으로 포함하고, 폴리락티드를 비이온성 블록으로 포함하는 양친성 생분해성 블록 공중합체를 포함하는 온도 민감성 생리활성 물질 전달체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
최근 나노수준의 구조체를 이용한 약물전달시스템의 유용성이 대두되면서, 소수성 블록과 친수성 블록을 함께 가지고 있는 다양한 양친성 고분자의 합성을 통해 보다 효과적인 나노 구조체를 제조하려는 연구들이 주목받고 있다. 수용액 내에서 이러한 양친성 고분자는, 소수성 블록이 시스템의 자유에너지를 낮추기 위해 물을 피해 자기들끼리 회합하려는 성질에 의해 나노입자를 이루고, 친수성 블록이 수용액 내에서 균일하게 용해되기 때문에, 수용액 내에서 열역학적으로 안정한 구조체를 유지할 수 있게 된다. 또한 전하를 띄는 고분자 물질과 함께 생체 내에서 전하를 띄는 생체활성물질인 치료용 단백질과 유전자와 이온 복합체를 형성하여 약물을 전달하는 연구가 진행되고 있다. K. Kataoka 등은 폴리에틸렌 옥사이드와 폴리-L-리신(poly-L-lysine)의 블록 공중합체와 폴리에틸렌 옥사이드와 폴리-L-아스파테이트(poly-L-aspartate)의 블록 공중합체를 함께 사용하여, 서로 다른 전하를 지닌 고분자 간의 이온결합을 이용하여 나노입자를 만드는 폴리온 복합미셀 'polyion complex (PIC) micelle'이라는 개념을 제시한 바 있다(참조: A. Harada and K. Kataoka, Macromolecules , 28, 5294 (1995)). 그는 이 개념을 활용하여 등전점이 11 정도로서 양전하를 지닌 단백질인 라이소자임(lysozyme)을 고분자 미셀 안에 봉입시키는 연구결과를 발표하였다(참조: A. Harada and K. Kataoka, Macromolecules , 31, 288 (1998)). 또한 Biomaterials 28 (2007) p.4132-4142에는 폴리에틸렌이민과 폴리카프로락톤의 공중합체를 이용하여 수용액상에서 양성 전하를 띄는 미셀(Micelles)을 제조함으로써 음성 전하를 가지는 뉴클레오타이드와 같은 약물을 체내에 전달하는 방법에 관한 기술이 개시되어 있다. 하지만 이러한 약물전달체를 이용한 이온 나노 복합체 연구에도 불구하고 생체내의 강한 이온 강도에 의해서 이온복합체의 안정성이 떨어지기 때문에 문제가 되고 있는 실정이다.
이에 본 발명자는 상기 문제점을 해결하기 위하여 이온결합과 소수성결합을 동시에 이용할 수 있는 고분자물질의 개발에 노력해 왔다. 약물을 봉입하는 방법에는 크게 투석막을 이용한 방법과 전하를 띄고 있는 약물을 이온결합을 통하여 복합체를 형성 하는 방법이 있다. 투석막을 이용하는 방법은 이온결합을 통한 결합에 비하여 체내에서의 그 안정성이 높게 평가 되고 있다. 하지만 투석막을 이용하는 방법은 약물을 유기용매에 녹여 물과 유기용매의 치환, 즉 계의 변화에 따라 봉입체가 자유에너지를 낮추기 위해 자기들끼리 회합하는 성질을 이용하여 봉입하는 방법이라 단백질과 같은 유기용매에서 변성이나 분해되는 민감한 물질에는 적합하지 않다. 이러한 계의 변화를 유도하여 봉입체 자체가 자유에너지를 낮추어 자연스럽게 약물을 봉입하는 방법으로 온도민감성을 통해 이를 유도하기 위해 단백질과 결합을 위한 전하그룹과, 온도민감성을 띨 수 있는 잔기를 연결하여 폴리이온성 나노복합체를 제조하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 다당류 및 숙신산무수물(succinic anhydride)의 결합체와 폴리락티드의 공중합체를 포함하는 온도 민감성 생리활성 물질 전달체를 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 목적은 상기 온도 민감성 생리활성 물질 전달체의 제조방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 목적은 상기 온도 민감성 생리활성 물질 전달체 및 그 내부에 봉입된 생리활성 물질을 포함하는 서방형 약물 전달용 조성물을 제공하는 것이다.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다당류 및 숙신산무수물(succinic anhydride)의 결합체와 폴리락티드의 공중합체를 포함하는 온도 민감성 생리활성 물질 전달체를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 다당류는 분자량 5,000 이상의 무독성 단위체를 포함하고 자체적으로 전하를 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 다당류는 친수성의 플루란(pullulan) 또는 히알루론산(hyaluronic acid) 유도체일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 다당류 및 숙신산무수물의 결합체와 폴리락티드는 1:0.5~1:5의 중량비로 결합할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 공중합체에 단백질, 펩타이드, 뉴클레오타이드 및 소수성 또는 친수성 작용기를 가지는 유기 소화합물로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 생리활성 물질이 결합될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 생리활성 물질은 상기 공중합체에 이온 결합 및 소수성 결합으로 결합될 수 있다.
또한, 본 발명은,
다당류와 숙신산무수물을 공유 결합시켜 친수성 고분자를 합성하는 단계; 및
상기 합성된 친수성 고분자와 폴리락티드를 반응시켜 친수성 고분자-폴리락티드 공중합체를 합성하는 단계를 포함하는, 온도 민감성 생리활성 물질 전달체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 친수성 고분자-폴리락티드 공중합체에 생리활성 물질을 첨가하여 복합체를 형성하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 다당류와 숙신산무수물의 공유결합은 디메틸아미노피리딘(4-dimethylaminipyridine:DMAP) 용매를 이용하여 공유결합 시키고, 상기 친수성 고분자-폴리락티드 공중합체의 합성은 디메틸설폭사이드(DMSO)의 용매 하에서 트리에틸아민(TEA)을 촉매로 사용하여 폴리락티드의 개환 중합 방법을 통해 이루어지는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 생리활성 물질은 단백질, 펩타이드, 뉴클레오타이드 및 소수성 또는 친수성 작용기를 가지는 유기 소화합물로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 물질일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 공중합체에 생리활성 물질을 첨가하여 복합체를 형성하는 것은 상기 공중합체의 온도민감도 이하인 4℃~10℃의 온도범위에서 형성될 수 있다.
나아가 본 발명은 본 발명에 따른 상기 온도 민감성 생리활성 물질 전달체 및 그 내부에 봉입된 생리활성 물질을 포함하는 서방형 약물 전달용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 친수성 고분자-폴리락티드 공중합체는 단백질, 폴리뉴클레오티드 등의 생리활성물질과 이온결합 및 온도민감성 소수성결합을 하는 것을 확인하였다. 따라서 상기 공중합체를 포함하는 본 발명의 온도 민감성 생리활성 물질 전달체는 생체 내 조건에서 안정한 복합체를 형성하여 생리활성물질의 생체 내 전달을 용이하게 하여, 생체 내 약물 전달 시스템 등으로 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일실시예에서 합성된 다당류-숙신산무수물을 수소 핵자기 공명 스펙트럼을 이용하여 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에서 합성된 다당류-숙신산무수물-폴리락티드를 수소 핵자기 공명 스펙트럼으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에서 합성된 다당류-숙신산무수물-폴리락티드의 합성 비율 및 온도 변화에 따른 투과도의 변화를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에서 합성된 다당류-숙신산무수물-폴리락티드와 생리활성물질과의 복합체가 온도 변화에 따라 변화되는 입자직경의 분포를 그래프로 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에서 합성된 다당류-숙신산무수물-폴리락티드와 생리활성물질에 형광표지물질을 연결한 후, 복합체의 형성 여부를 형광감도 측정을 이용하여 분석한 것을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에서 합성된 다당류-숙신산무수물-폴리락티드와 생리활성물질에 형광표지물질을 연결한 후, 복합체의 분해 여부를 in vitro 에서 측정하여 나타낸 것이다.
도 7 은 본 발명의 일실시예에서 합성된 다당류-숙신산무수물-폴리락티드와 생리활성물질에 형광표지물질을 연결한 후, 복합체의 분해 여부를 in vivo 에서 측정하여 나타낸 것이다.
본 발명은 약물 전달체 등으로 사용될 수 있는 양친성이며 온도민감성 특징을 가지는 생체적합 고분자를 제공함에 그 특징이 있다. 구체적으로 본 발명은 다당류 및 숙신산무수물의 결합체인 친수성 고분자를 친수성 블록으로 하고, 폴리락티드를 비이온성 블록으로 갖는 공중합체를 포함하는 양친성이고 생분해성이며 온도민감성의 생리활성 물질 전달체를 제공함에 그 특징이 있다.
특히 본 발명의 생리활성 물질 전달체가 가지는 온도 민감성은 상기 공중합체에서 비이온성 블록으로 사용하는 폴리락티드의 중합비율에 따라 조절될 수 있으며, 이러한 조절에 의해 고분자의 상변이온도를 변화시킬 수 있다.
또한, 이때 개시제로는 다당류-숙신산무수물 등을 사용할 수 있으며, 친수성 고분자인 다당류-숙신산무수물 결합체는 온도민감성과 소수성(hydrophobicity)의 특징을 가지는 폴리락티드와 개환중합을 통해 다당류-숙신산무수물-폴리락티드의 공중합체를 합성할 수 있으며, 이때 비이온성 고분자인 폴리락티드의 중합비율이 클수록 소수성이 크게 나타날 수 있다.
따라서 본 발명에 따른 온도 민감성 생리활성 물질 전달체는 상기 전달체의 합성을 위해 사용하는 폴리락티드의 중합비율 및 온도변화에 따라 가역적으로 전달체의 형성 및 방출 거동이 변화될 수 있는 특징이 있으므로, 온도 조절 및 폴리락티드의 중합비율 조절에 따라 전달체의 합성이 제어될 수 있으며, 궁극적으로 약물의 포집 및 방출 제어가 용이한 약물 전달체로서 사용될 수 있다.
나아가 본 발명에 따른 온도 민감성 생리활성 물질 전달체는 체내 안정성을 위해 생분해성인 다당류 고분자를 사용하였고, 이러한 다당류에 이온성을 부여하기 위해 숙신산무수물을 첨가하여 다당류와 숙신산무수물을 친수성 블록으로 사용한 특징이 있다.
한편, 일반적으로 나노 크기의 복합체를 제조하는 종래 방법의 경우에는 투석막을 통한 용액의 치환으로 양친성 고분자가 미셀(micelle)을 형성하는 방법이나, 고온으로 반응기 내부에서 필름 형태로 고분자를 넓게 펴서 복합체를 형성 하는 방법이 있다. 하지만 이러한 제조 방법은 유기용매나 고온에서 불안정한 약물은 봉입 자체가 어려운 문제점이 있다.
이에 본 발명에서는 이러한 문제점을 해결하기 위한 수단으로 숙신산 무수물을 사용하였는데, 즉, 고분자 물질에 이온성을 부여하여 종래의 방법과는 다른 약리효과를 가지는 약물이 고분자 물질과 이온결합을 통하여 복합체를 용이하게 형성 할 수 있게 하였다.
이하, 본 발명에서는 본 발명의 온도 민감성 생리활성 물질 전달체의 제조방법을 각 단계별로 구체적으로 기술한다.
제1단계: 다당류와 숙신산무수물을 공유결합시키는 단계
본 발명에 따른 상기 온도 민감성 생리활성 물질 전달체를 제조하기 위해 먼저 다당류와 숙신산무수물을 공유결합 시킨다. 본 발명에서 사용할 수 있는 상기 다당류는 생체 내에서 생체적합성 및 생분해성이 우수해야 하며, 생체 내에서 안정성이 우수해야 한다. 따라서 본 발명에서 사용할 수 있는 상기 다당류로는 생체 내에서 생체 적합성을 갖는 다당류 또는 다당류 유도체라면 모두 사용가능하며, 자체적으로 전하를 갖는 다당류 또는 전하를 갖는 물질과 결합한 다당류를 사용할 수 있다. 바람직하게는 친수성을 띄는 플루란 또는 히알루론산 유도체를 사용할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 상기 다당류로서 플루란을 사용하였는데, 상기 플루란은 흑효모(Aureobasidium pullulans (DE BARY) ARN.)로부터 생산한 다당류를 분리 정제하여 얻어지는 물질로서 주성분은 중성다당류이다. 다당류는 물에 잘 녹는 반면, 알코올류와 유류에는 녹지 않는 특성이 있고, 다른 검류에 비해 점도는 낮은 편에 속하나, 산, 알칼리, 열 등에 안정하다. 특히, 피막성 외에 강력한 점착력을 가지고 있고, 평균 분자량은 200,000과 100,000의 2종류가 있으며, 점도는 12cps이다. 본 발명에서 상기 다당류는 분자량 5,000 이상의 무독성 단위체를 포함하는 것일 수 있으며, 본 발명의 일실시예에서는 분자량이 100,000인 것을 사용하였다.
또한, 상기 다당류는 시중에서 판매하고 있는 것을 구입하여 사용하거나, 자연으로부터 당업계에 공지된 방법으로 분리 및 정제하여 사용할 수 있고, 바람직하게는 다당류 물질에 존재하는 불순물을 제거하고 순도도 높이기 위해 깨끗이 정제한 것을 사용할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서 사용한 다당류인 플루란의 구조식을 살펴보면 다음과 같다.
Figure 112010041888734-pat00001
<플루란(pullulan)의 구조식>
한편, 다당류와 숙신산무수물을 공유 결합시키는 과정은 먼저 상기 다당류를 유기용매에 용해시킨 후, 숙신산무수물과 반응시켜 공유결합시킬 수 있는데, 이때, 상기 다당류를 유기용매에 용해시키는 과정은 다당류가 유기용매 하에서 충분히 용해될 수 있도록 적당량의 유기용매를 사용하는 것이 바람직하며, 이때 유기용매의 사용량이 너무 적을 경우, 다당류가 서로 엉겨붙는 현상이 일어날 수 있다.
본 발명에서 사용할 수 있는 상기 유기용매로는 이에 제한되지는 않으나, DMSO, 포름아마이드(formamide) 또는 DMF일 수 있으며, 바람직하게는 DMSO일 수 있다.
또한, 본 발명에서는 상기 전하를 갖는 물질로 숙신산무수물을 사용할 수 있는데, 다당류와 공유 결합시키는 물질인 숙신산무수물은 그 구조식이 C4H4O3이며, 분자량은 100.07이고, 숙신산의 산무수물로서 고리 모양 구조를 지닌 유기화합물이다.
본 발명에서 상기 공중합체의 제조에 숙신산무수물을 사용하는 이유는 친수성 중성다당류인 다당류에 이온성을 부여하기 위함이다. 즉, DMSO에 녹아 있는 숙신산무수물은 DMAP에 의해 활성화 되어 다당류의 수산화기에 연결되어 다당류에 카르복실기를 부여함으로써 친수성 중성다당류인 다당류에 이온성을 부여하게 된다. 이러한 숙신산무수물에 의한 이온성 부여 과정은 다음에 나타낸 바와 같다.
Figure 112010041888734-pat00002
<다당류-숙신산무수물(pullulan-succinic acid)>
본 발명의 일실시예에서는 DMSO에 다당류인 플루란을 용해시키고, DMSO에 용해된 숙신산무수물을 디메틸아미노피리딘으로 활성화시킨 다음, 활성화된 숙신산무수물을 DMSO에 용해된 플루란에 한방울씩 떨어뜨려 반응시키는 과정을 통해 다당류인 플루란과 숙신산무수물을 공유결합 시켰다.
제2단계: 다당류- 숙신산무수물을 개시제로 하여 다당류- 숙신산무수물 - 폴리락티드를 합성하는 단계
본 발명에 따른 공중합체의 또 다른 구성 성분인 폴리락티드는 메틸기를 다수 함유하고 있으며, 비이온성의 특성으로 인해 결합되는 고분자 다당류의 소수성을 증가시켜 결과적으로 공중합체의 소수성을 부여할 수 있고, 전달하고자 하는 생리활성물질과 소수성 결합을 가능하게 하는 약할을 한다.
또한 폴리락티드는 다수의 메틸기에 의해 온도 변화에 따라 수용액상에서 자유도가 변하며 따라서 다당류와의 수소결합을 유도할 수 있고 부여된 소수성에도 변화를 줄 수 있다.
특히 이러한 소수성의 변화는 온도가 상승하게 되면 고분자 자체의 소수성이 높아져 고분자들끼리의 결합력을 높일 수 있고 이로써 내부의 생리활성물질을 더 안전하게 목적하고 하는 곳으로 전달할 수 있게 된다.
앞서 기술한 바와 같이 다당류와 숙신산무수물이 공유결합하여 친수성의 고분자가 합성되면, 이후 상기 고분자에 폴리락티드를 반응시켜 친수성 고분자-폴리락티드 공중합체를 합성할 수 있다.
이때 다당류-숙신산무수물의 수산화기가 다중개시제로 역할을 하며 DMSO 용매하에서 트리에틸아민(TEA)을 개환 촉매제로 하여 개환 중합방법으로 폴리락티드의 중합을 유도할 수 있다. 또한, 폴리락티드의 첨가량을 조절하여 본 발명에 따른 공중합체의 소수성 및 온도민감성의 정도를 조절할 수 있고, 상기 다당류-숙신산무수물 결합체와 폴리락티드는 1:0.5 내지 1:5의 중량비로 결합할 수 있다.
본 발명에서 합성된 다당류-숙신산무수물-폴리락티드의 구조 및 폴리락티드의 개환과정을 구조식으로 나타내면 다음과 같다.
Figure 112010041888734-pat00003
<폴리 락티드의 개환 과정>
Figure 112010041888734-pat00004
<다당류-숙신산무수물-폴리락티드(pullulan-S.A-poly-(L-lactide))>
제3단계: 다당류- 숙신산무수물 - 폴리락티드와 생리활성물질 복합체를 형성하는 단계
상기 제2단계에서 친수성 고분자-폴리락티드 공중합체가 합성되면 이후 생리활성 물질을 첨가하여 복합체를 형성할 수 있다.
상기 생리활성 물질로는 목적하는 약리활성을 갖는 물질이라면 모두 사용가능하며, 이에 제한되지는 않으나, 단백질, 펩타이드, 뉴클레오타이드 및 소수성 또는 친수성 작용기를 가지는 유기 소화합물일 수 있고, 본 발명의 일실시예에서는 달걀 흰자 추출 라이소자임(lysozyme from chicken egg white, sigma)을 사용하였다.
상기 라이소자임은 등전점이 9.2로써 생체 내(pH 7.4)에서 음전하를 띄기 때문에 본 발명에서 합성된 고분자 물질과 이온결합이 가능하다. 본 발명에서 상기 생리활성 물질과 상기 공중합체와의 결합을 통한 복합체 형성은 이온결합과 온도민감성에 의한 소수성 결합을 이용한다. 복합체 형성시에 작용하는 소수성 결합은 온도 변화에 의해 그 세기가 결정되므로 상변이 온도 이상의 온도에서는 상기 공중합체가 단독으로 회합체를 형성 할 수 있으므로 소수성 작용이 최소화 되는 4℃~10℃의 냉장상태에서 생리활성물질과 이온결합으로 복합체를 형성하는 것이 바람직하며, 이후 온도를 높여 소수성 결합을 유도할 수 있다.
제3단계를 통해 본 발명의 공중합체와 생리활성 물질이 첨가된 복합체가 형성이 완료되면, 이후 추가로 상기 공중합체와 생리활성 물질에 형광 표지물질을 연결하여 생리활성물질의 체내에서의 방출 정도 및 제체 환경에서의 저항성을 측정할 수 있다.
본 발명에서 합성된 공중합체와 생리활성물질의 복합체는 기본적으로 이온 결합을 기본으로 하여 형성되는 결합이므로 체내 환경에서 염과 세럼(serum) 농도에 의해 상기 복합체가 분해되어 생리활성 물질이 체내에 노출될 수 있으므로 복합체로서의 기능성이 상실하게 된다.
이에 본 발명의 일실시예에서는 본 발명에 따른 복합체의 체내 환경에서의 저항성을 측정하기 위하여 생리활성 물질에 Cy5.5(Amersham, SWE)를 연결하고 고분자 물질에는 Cy5.5파장을 특징적으로 흡수하는 BHQ-3(biosearch technologies, USA)를 연결하여 복합체를 형성했을 때와 생리활성 물질이 단독으로 있을 때 각각의 여기상태를 675nm로 고정하고 방출파장 695nm에서의 차를 이용하여 복합체의 유지 여부를 측정하였다.
그 결과, 본 발명에 따른 복합체는 생리활성 물질이 단독으로 있을때에 비해 복합체 형태로 있을 경우 보다 안정하게 오랜시간 동안 유지된다는 것을 알 수 있었으며, 나아가 폴리락티드가 함유된 복합체가 폴리락티드를 함유하지 않는 복합체에 비해 생리활성 물질을 보다 오랜시간 동안 안정하게 유지한 다음, 서서히 방출시킬 수 있다는 사실을 알 수 있었다(실험예 4 참조).
따라서 본 발명의 온도 민감성 생리활성 물질은 약리 효과를 가지는 물질의 지속성을 생체 내에서 증가시킬 수 있다.
본 발명은 앞서 기술한 바와 같이 온도 민감성 생리활성 물질을 제조하는 방법을 제공할 수 있으며, 상기 방법에 의해 제조된 온도 민감성 생리활성 물질 전달체를 제공할 수 있다.
상기 기술된 방법에 의해 제조된 본 발명의 생리활성 물질 전달체는 수계에서 안정하게 나노입자, 즉, 나노겔 또는 나노미립구의 형태일 수 있으며, 평균 입자 크기는 100~200nm 일 수 있다.
나아가 본 발명은 온도 민감성 생리활성 물질 전달체 및 그 내부에 봉입된 생리활성 물질을 포함하는 서방형 약물 전달용 조성물을 제공할 수 있으며, 이러한 서방성을 통해 체내 반감기가 매우 짧지만 치료를 위해 지속적인 주입이 필요한 단백질, 펩티드 약물(TRAIL, VEGF, bFGF)과, 나노 미립구의 크기를 통해 복합체로서 EPR효과를 통한 암세포의 표적화로 항암제와의 복합체로서도 사용 될 수 있다. 또한 이러한 온도민감성을 통해 체외 보다 체내에서의 강한 소수성이 일반적인 이온 결합에 비해 보다 서방성이 뛰어나 체내에서 지속적인 약물 방출이 가능하여 각종 질병들을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물로 사용될 수 있다.
본 발명에서 상기 '치료'란, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미하며, 본원에서 사용된 상기 '치료'란 용어는 '치료하는'이 상기와 같이 정의될 때 치료하는 행위를 말한다.
바람직하게 본 발명에 따른 온도 민감성 생리활성 물질 전달체를 이용하여 치료를 목적으로 하는 질환은 암일 수 있다.
본 발명에 따른 상기 조성물은 약학적으로 유효한 양의 본 발명의 전달체를 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 "약학적으로 유효한 양"이란 목적하는 질환의 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다.
본 발명에 따른 상기 조성물에서 본 발명의 생리활성 물질 전달체의 약학적으로 유효한 양은 0.5 ~ 100 mg/day/체중kg, 바람직하게는 0.5 ~ 5 mg/day/체중kg이다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 질환 증상의 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.
상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 상기 전달체는 친수성의 고분자와 소수성의 폴리락티드를 포함하고 있어 상기 전달체가 나노미립구의 형태로 존재할 수 있는데, 상기 나노미립구는 치료학적 활성을 나타내는 약물 또는 생물제제를 추가로 더 포함할 수 있으며, 바람직하게는 항암제를 포함할 수 있다. 이때 상기 약물 또는 생물제제는 나노미립구 내부에 봉입된 형태로 포함될 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
< 실시예 1>
다당류- 숙신산무수물 - 폴리락티드 공중합체의 제조
<1-1> 다당류와 숙신산무수물을 공유결합시키는 단계
숙신산 무수물(sigma, 100.07da) 600mg을 100ml 플라스크를 이용하여 10ml의 디메틸설폭사이드(DMSO, sigma)에 녹인 후, 디메틸아미노피리딘(4-dimethylaminopyridine, DMAP)을 처리하여 8시간 동안 반응시켰다. 그런 뒤, 5g의 플루란을 DMSO 50ml에 녹인 후 활성화된 숙신산무수물을 한방울씩 떨어뜨려 24시간 동안 반응시킨 다음, 종래 사용되고 있는 투석막의 방법을 이용하여 유기용매, 미반응 물질 및 부산물을 제거한 후, 동결 건조기를 사용하여 플루란에 숙신산무수물이 결합된 물질을 수득하였다.
<1-2> 다당류- 숙신산무수물 - 폴리락티드의 합성 단계
상기 <1-1>에서 수득한 다당류-숙신산무수물(0.5g)과 폴리락티드(0.9~1.3g)를 디메틸설폭사이드(DMSO, sigma) 30ml에서 반응시켰는데, 이때 트리에틸아민(TEA, sigma)을 개환촉매로 사용하여 75℃에서 12시간 동안 반응시킨 후, 투석막을 이용하여 유기용매, 미반응 물질과 부산물을 제거한 후, 동결건조기를 사용하여 다당류(플루란)-숙신산무수물-폴리락티드를 회수하였다. 이때 각각의 합성물에 따른 질량비와 합성수율은 하기 표 1에 기재하였다.
다당류- 숙신산무수물 - 폴리락티드 합성
합성고분자 코드 합성물 질량비 용매 사용량
( DMSO ) 		용해도
(증류수) 		합성 수율 (질량%)
Pullulan -S.A Poly(L- lactide )
PSPL1 0.5g 0.9g 30ml O 82
PSPL2 0.5g 1.1g 30ml O 76
PSPL3 0.5g 1.3g 30ml O 80
< 실시예 2>
다당류- 숙신산무수물 - 폴리락티드 /생리활성물질 복합체 형성
생리활성물질로서 라이소자임(lysozyme from chicken egg white, sigma)을 사용하여 다당류-숙신산무수물-폴리락티드와의 복합체를 형성하기 위해 pH7.4의 증류수에 라이소자임 0.001g/L와 음이온성 합성고분자물질, 즉 상기 <1-2>에서 합성한 플루란-숙신산무수물-폴리락티드인 PSPL1, PSPL2, PSPL3을 0.01g/L의 농도가 되도록 각각의 용액을 합성 고분자 물질이 소수성을 가장 적게 띄는 4℃의 조건에서 만든 후, 음이온성 합성고분자 물질 1ml에 생리활성물질인 라이소자임 용액 1ml을 떨어뜨려 이온결합을 통한 복합체를 형성하였다. 이때 PSPL1, PSPL2, PSPL3을 0.01g/L의 농도 및 4℃의 온도에서 제조한 이유는 온도가 올라갈 경우 폴리락티드의 온도 민감성이 작용하여 스스로 소수성을 띄거나, 임계미셀농도 이상에서는 합성고분자 물질 스스로 회합체를 형성하기 때문에 단백질과 균일한 복합체를 형성하기가 힘들어진다. 따라서 합성고분자 물질의 임계미셀농도 이하의 저온에서 생리 활성물질과 복합체를 형성하는 것이 바람직하다.
< 실시예 3>
다당류- 숙신산무수물 - 폴리락티드와 생리활성물질에 형광 표지물질을 합성
라이소자임(sigma, 14.3Kda) 13mg을 25ml 플라스크를 이용하여 14ml의 100mM 탄산나트륨 완충용액에 녹인 후, Cy5. 5monoNHS ester(Amersham, SWE) 1mg을 0.5ml의 DMSO에 녹인 다음 한 방울씩 떨어뜨려 반응시켰고, 이때 반응은 4℃에서 8시간 동안 수행하였으며, 이후 투석막을 이용하여 유기용매, 미반응 물질과 부산물을 제거함으로써, Cy5가 표지된 라이소자임을 수득하였으며, 수득한 물질을 1ml씩 분주하여 초저온 냉동고에 보관하였다. 또한, 실시예 1에서 합성된 다당류-숙신산무수물-폴리락티드 200mg은 디메틸포름아마이드(DMF, Junsei) 19ml에 녹였고, BHQ-3 succinimide ester(biosearch technologies, USA)를 디메틸포름아마이드(DMF, Junsei) 1ml에 녹인 후 한 방울씩 떨어뜨려 반응시켰으며, 이때 반응은 8시간 동안 수행하였고, 이후 투석막을 이용하여 유기용매, 미반응 물질과 부산물을 제거한 후, 동결건조기를 사용하여 BHQ-3가 표지된 다당류-숙신산무수물-폴리락티드를 회수하였다.
< 실험예 1>
다당류- 숙신산무수물 - 폴리락티드의 합성 검증
다당류-숙신산무수물-폴리락티드의 합성을 검증하기 위하여 1H-NMR(Avancek 500, Bruker, Germany)을 이용하였다. 먼저 다당류-숙신산무수물의 합성을 검증하기 위해서 D2O에 합성고분자를 녹인 후 당업계에 공지된 방법인 1H-NMR 분석을 수행하였다. 또한, 다당류-숙신산무수물-폴리락티드 합성을 검증하기 위해서 DMSO에 합성고분자를 녹인 후 동일하게 1H-NMR 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 1 및 도 2에 나타낸 것과 같이 합성된 물질들은 모두 화학구조가 명확한 것으로 나타났고, 1H-NMR을 통한 합성비율 및 수평균 분자량은 하기 표 2와 같이 나타났으며, 이러한 결과는 다당류 CH2OH 시그날(6.0~3.0 ppm), 숙신산무수물의 CH2CH2 시그날(3.2~3.0 ppm), 폴리락티드의 CH3 시그날 (1.6~1.0 ppm)을 적분을 통해 그 합성비를 계산한 것이다.
다당류- 숙신산무수물 - 폴리락티드 합성비율 및 수평균 분자량 분석
합성고분자 종류 분자1몰당 단일 유닛 함량 수평균분자량
( Mn , KDa )
Pullulan Succinic anhydride Poly(L- lactide )
PS 95.3 4.7 0 10.5
PSPL1 79.6 3.9 16.5 12.0
PSPL2 77.4 3.8 18.8 12.4
PSPL3 68.5 3.4 28.1 14.1
< 실험예 2>
온도 민감성 측정
본 발명자들은 상기 실시예에서 제조한 본 발명에 따른 합성고분자의 온도 민감성의 차이를 확인하기 위하여 자외선분광광도계(UV-2450, shimadzu, Japan)를 이용하여 온도 변화에 따른 500nm 파장에서 투과도를 측정하였다. 자외선 분광의 측정을 위해, 먼저 합성고분자(즉, 상기 <1-2>에서 수득한 플루란-숙신산무수물-폴리락티드 합성고분자)를 D.W에 5mg/ml 농도로 녹인 후, 4℃에서 저장하였다. 또한, 측정은 5℃에서 60℃까지 온도를 5℃씩 올려가면서, 온도 변화에 따른 합성고분자의 투과도 변화를 측정하였으며, 나아가 정확한 측정을 위해 변화간격을 30분으로 하였고, 각 온도에 따른 합성고분자의 안정화 시간을 가진 후 측정하였다. 이때 대조군으로는 상기 합성 고분자 물질에서 폴리락티드가 중합되지 않은 물질을 사용하였다.
그 결과 도 3 및 하기 표 3에 나타낸 바와 같이, 폴리락티드가 중합되지 않은 PS는 온도 민감성을 나타내지 않았으나. 폴리락티드가 중합 된 후 그 비율에 따라 온도 민감성에 차이를 보이는 것으로 나타났고, 또한 폴리락티드의 중합 비율이 높을수록 더 낮은 온도에서 민감성이 나타난다는 사실을 알 수 있었다.
본 발명자들은 이러한 결과를 통해 체내 온도나 또는 그 이하의 온도에서 온도 민감성을 가지는 합성고분자(예컨대, PSPL1 또는 PSPL2)이 생리활성물질과 복합체를 형성했을 경우, 온도 민감성에 더욱 유리할 수 있다는 사실을 알 수 있었는데, 특히, 37.5℃의 체내 온도 범위에서 온도 민감성을 띄는 PSPL1의 합성 고분자의 경우 다른 합성 고분자에 비해 체내 안정성이 우수하므로 복합체를 형성하는데 가장 유리하다는 것을 알 수 있었다.
다당류- 숙신산무수물 - 폴리락티드의 종류별 온도민감성 측정
합성고분자 종류 온도 민감성 ()
PS N.D
PSPL1 40~50
PSPL2 25~30
PSPL3 15~20
< 실험예 3>
다당류- 숙신산무수물 - 폴리락티드 /생리활성물질 복합체 입자 특성 분석
PSPL과 생리활성물질인 라이소자임을 10:1의 비율로 제조한 나노복합체를 1ml을 취하여 ZetasizerSZ (Malvern, UK)을 이용하여 평균 입자 직경을 분석하였으며, 산란각은 90도로 고정하여 수행하였다.
입자의 특성을 분석한 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 생리활성물질인 라이소자임과 다당류-숙신산무수물-폴리락티드의 복합체 형성시 입자 분포는 냉장 보관시(4℃)에 비해 체내 온도인 37.5℃로 온도가 상승할 경우 복합체의 입자 분포는 감소하는 것으로 나타났고, 이러한 온도의 상승은 복합체의 소수성 특성을 더욱 크게 향상시켜 고분자들끼리의 결합력을 높이기 때문에 더 견고하게 생리활성물질을 보호하여 안전하게 전달할 수 있다.
< 실험예 4>
다당류- 숙신산무수물 - 폴리락티드 /생리활성물질 복합체의 체내 환경 저항성 측정
체내에서의 염농도와 세럼(serum) 농도에 따른 본 발명의 복합체의 저항성을 측정하기 위하여 BHQ-3을 표지한 PSPL과 Cy5.5로 표지된 라이소자임을 10:1의 비율로 혼합하여 제조한 나노복합체를 이용하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.
<4-1> in vitro 에서의 검증
먼저, 본 발명자들은 Cy5.5가 표지된 라이소자임이 단독으로 존재할 경우와 BHQ-3가 표지된 다당류-숙신산무수물-폴리락티드와 복합체를 형성할 경우, 형광의 세기를 RF-5301(shimadzu)을 이용하여 방출 파장을 675nm로 고정하고 여기 파장 695nm에서 측정하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 라이소자임이 단독으로 존재할 경우에 비해 다당류-숙신산무수물-폴리락티드와 복합체를 형성할 경우, 형광의 감도가 감소되는 것을 확인할 수 있었고, 이를 통해 복합체의 형성이 유지되는지의 여부를 확인할 수 있었다.
이에 본 발명자들은 Cy5.5가 표지된 라이소자임을 100으로 정하고, 복합체 형성시를 0으로 하여, 염과 serum의 농도 변화에 따른 복합체의 저항성을 측정하였는데, 상기 저항성의 측정은 도 6에 나타낸 바와 같이, 염과 serum의 농도를 0mM/0%~ 600mM/40%로 각 단계별로 제작한 다음, 이 시료 1.8ml에 0.2ml의 복합체를 주입하여 복합체 형성시의 형광 세기의 변화를 통하여 복합체의 유지 정도를 측정하였다. 이러한 복합체의 유지 정도는 여기 파장 695nm에서의 형광 정도를 아래의 식에 대입하여 %환산 하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 폴리락티드가 중합되지 않은 다당류-숙신산무수물 및 폴리락티드가 중합되었으나 온도 상승에 따른 소수성을 가지지 못한 다당류-숙신산무수물-폴리락티드는 염과 세럼농도의 변화에 따라 그 복합체가 유지되지 못하고 풀어지는 것으로 나타난 반면, 온도 상승에 의해 소수성이 부여된 본 발명의 다당류-숙신산무수물-폴리락티드는 체내 환경인 염과 세럼농도(150mM/10%)에서도 그 복합체가 안정하게 유지됨을 확인할 수 있다.
<4-2> in vivo 에서의 검증
나아가 본 발명자들은 본 발명의 다당류-숙신산무수물-폴리락티드와 생리활성물질의 복합체가 가지는 온도 민감성의 특성을 체내에서 발휘하는지를 확인하기 위해, 누드마우스(Can Cg-Foxnl-nu/ CrljBgi, orient)에 플루란-숙신산무수물/라이소자임 복합체(○)와 플루란-숙신산무수물-폴리락티드/라이소자임 복합체(□)를 피하로 주사한 다음, 라이소자임의 방출정도 및 방출시간을 확인하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 온도민감성 물질인 폴리락티드를 포함하지 않은 다당류-숙신산무수물/라이소자임은 주사 초기부터 라이소자임이 방출되기 시작하여 24시간 정도에 그 방출이 끝나는 것으로 나타난 반면, 다당류-숙신산무수물-폴리락티드/라이소자임의 복합체는 24시간 이후부터 방출이 시작되어 7일 정도 간 그 방출이 지속되는 것으로 나타났다.
따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명에 따른 다당류와 숙신산무수물을 친수성 블록으로 하고, 폴리락티드를 비이온성 블록으로 갖는 공중합체가 생리활성 물질을 체내로 안정하게 전달할 수 있는 전달체로 사용할 수 있다는 것을 알 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (12)

  1. 플루란(pullulan) 및 숙신산무수물(succinic anhydride)의 결합체와 폴리락티드의 공중합체를 포함하는 온도 민감성 단백질 전달체.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 플루란(pullulan) 및 숙신산무수물의 결합체와 폴리락티드는 1:0.5~1:5의 중량비로 결합하는 것을 특징으로 하는 온도 민감성 단백질 전달체.
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서,
    상기 단백질은 상기 공중합체에 이온 결합 및 소수성 결합으로 결합된 것을 특징으로 하는 온도 민감성 단백질 전달체.
  7. 플루란(pullulan)과 숙신산무수물을 공유 결합시켜 친수성 고분자를 합성하는 단계; 및
    상기 합성된 친수성 고분자와 폴리락티드를 반응시켜 친수성 고분자-폴리락티드 공중합체를 합성하는 단계를 포함하는, 온도 민감성 단백질 전달체의 제조방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 친수성 고분자-폴리락티드 공중합체에 단백질을 첨가하여 복합체를 형성하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 온도 민감성 단백질 전달체의 제조방법.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 플루란(pullulan)과 숙신산무수물의 공유결합은 디메틸아미노피리딘(4-dimethylaminipyridine:DMAP) 용매를 이용하여 공유 결합시키고, 상기 친수성 고분자-폴리락티드 공중합체의 합성은 디메틸설폭사이드(DMSO)의 용매 하에서 트리에틸아민(TEA)을 촉매로 사용하여 폴리락티드의 개환 중합 방법을 통해 이루어지는 것을 특징으로 하는 온도 민감성 단백질 전달체의 제조방법.
  10. 삭제
  11. 제8항에 있어서,
    상기 공중합체에 단백질을 첨가하여 복합체를 형성하는 것은 상기 공중합체의 온도민감도 이하인 4℃~10℃의 온도범위에서 형성되는 것을 특징으로 하는 온도 민감성 단백질 전달체의 제조방법.
  12. 제1항, 제4항 또는 제6항에 따른 온도 민감성 단백질 전달체 및 그 내부에 봉입된 단백질을 포함하는 서방형 약물 전달용 조성물.
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