KR101914827B1 - 알부민을 포함하는, 초분자 상호작용에 기초한 자가조립 나노복합체, 이의 제조방법 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 알부민을 포함하는, 초분자 상호작용에 기초한 자가조립 나노복합체에 관한 것으로, 보다 상세하게는 알부민을 기반으로 하되, 사이클로덱스트린과 아다만탄의 초분자 상호작용을 이용함으로써, 항암 부위에 대한 표적지향성과 생체 내에서의 안정성 및 약물의 봉입 방출이 우수한 자가조립 나노복합체, 이의 제조방법 및 이의 다양한 용도에 관한 것이다.

Description

알부민을 포함하는, 초분자 상호작용에 기초한 자가조립 나노복합체, 이의 제조방법 및 이의 용도{Self-assembly nanoparticles base on a supramolecular interaction, manufacturing thereof and use thereof}
본 발명은 알부민을 기반으로 하되, 초분자 상호작용을 이용하여 제조된 자가조립 나노복합체에 관한 것으로, 보다 상세하게는 사이클로덱스트린과 아다만탄의 초분자 상호작용을 기반으로 함으로써, 항암 부위에 대한 표적지향성과 생체 내에서의 안정성 및 약물의 봉입 방출이 우수한 자가조립 나노복합체, 이의 제조방법 및 이의 다양한 용도에 관한 것이다.
최근까지 다양한 부위의 암을 대상으로 하는 우수한 치료효과를 갖는 항암제가 개발되어 왔고, 오늘날 50 여종의 항암제가 시판되고 있다. 이러한 항암제는 치료효과는 우수하나, 암세포에만 선택적으로 작용하는 것이 아니기 때문에 정상세포, 특히 세포분열이 활발한 조직세포에 손상을 입혀 골수기능저하, 위장관 점막손상, 탈모 등 여러 가지 부작용을 동반하는 문제가 존재한다.
따라서 암 치료에 있어서 상기 항암제를 매우 제한적으로 사용할 수 밖에 없는 실정이다.
이러한 문제를 해결하기 위해, 타겟팅 능력이 우수한 나노운반체(nanocarrier) 시스템을 이용하는 기술이 개발되었다(J. Control. Release 200 : 138-157, 2015). 이러한 나노운반체 시스템은 EPR 효과에 의한 수동적 타겟팅 때문에 종양위치에 우선적으로 축적되는 것으로, 분열이나 증식이 빠른 세포에는 모두 작용하므로, 정상적으로 세포분열이 왕성한 세포에도 정도의 차이만 있을 뿐 약물의 축적이 발생한다. 다만 나노운반체 내에 봉입된 항암제의 양에 차이가 있어, 종래 항암제를 직접 투여하는 치료보다 부작용을 억제할 수 있다.
이러한 문제점을 개선하기 위해 종양 조직에 대한 능동적 타겟팅 능력이 향상된 다양한 나노운반체의 개발이 이루어지고 있다.
일예로 생체적합성, 생분해성 및 비면역원성이기 때문에 매우 안전한 알부민을 이용한 나노입자가 공지된 바 있는데, 이는 gp60(클라트린, clathrin)을 매개로 하는 세포외 배출(transcytosis) 현상과 EPR 효과를 가져, 종양조직을 선택적으로 타겟팅할 수 있다는 장점을 갖는다.
그러나 알부민 나노입자는 탈용매화(desolvation), 열성겔화(thermal gelation), 유화(emulsification), 자가조립(self-assembly) 또는 나노분무건조와 같은 많은 전통적인 방법과 고압 호모게나이제이션(high-pressure homogenization)에 의해 제작되기 때문에, 비환경적이고 비가역성이며, 독성물질을 일부 포함하고 있어 생체 내 유해성이 수반되는 등의 문제점이 존재한다.
이러한 내용을 기반으로 본 발명자들은 알부민 나노입자의 상술한 문제점을 해결하면서도, 가역적이고, 표적지향성이 우수하며, 생체 내 안정성이 뛰어남과 동시에 간단하면서도 유기용매를 사용하지 않는 친환경적인 제조방법을 통해 제조된 복합체를 개발하고자 노력한 바, 본 발명을 완성하게 되었다.
특허문헌 1. 대한민국 공개특허 제10-2010-0094664호
본 발명은 상기와 같은 문제점을 감안하여 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 가역적이고, 표적지향성이 우수하며, 생체 내 안정성이 뛰어난 새로운 구조의 알부민을 기반으로 하는 자가조립 나노복합체를 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 목적은 상기 자가조립 나노복합체를 친환경적인 조건에서 대량생산할 수 있는 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 자가조립 나노복합체와 상기 자가조립 나노복합체에 봉입된 항암제를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명은 상기 목적을 이루기 위하여, (a) 아다만탄기를 갖는 알부민; 및 (b) 사이클로덱스트린이 결합된 글라이콜 키토산을 포함하고, 상기 (a)의 아다만탄기와 (b)의 사이클로덱스트린 간에 초분자 상호작용에 의해 결합된 자가조립 나노복합체를 제공한다.
상기 (a) 아다만탄기를 갖는 알부민의 평균분자량은 70000 내지 80000 MW일 수 있다.
상기 (a) 아다만탄기를 갖는 알부민의 아다만탄기 치환도는 10 내지 50일 수 있다.
상기 (a) 아다만탄기를 갖는 알부민은 하기 화학식 Ⅰ로 표시할 수 있다.
[화학식 Ⅰ]
Figure 112016046536678-pat00001
상기 화학식 Ⅰ에서,
ADA는 아다만탄기이고,
L1은 링커 또는 직접 결합이며,
상기 n은 1 내지 56의 정수이다.
상기 ADA는 하기 화학식 1로 표시될 수 있다.
[화학식 1]
Figure 112016046536678-pat00002
상기 화학식 1에서,
X1은 C1 내지 C4 알킬아민기 중에서 선택되는 어느 하나이다.
상기 L1은 직접 결합이거나, 옥살산, 말론산, 말릭산, 숙신산, 글루타르산,
글루탐산, 아디프산, 세바코일산, 수베르산, 도데카노산, 푸마르산, 말레이산, 프탈산 및 테레프탈산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 생분해성 디카르복실기 링커일 수 있다.
상기 (b) 사이클로덱스트린이 결합된 글라이콜 키토산은 하기 화학식 Ⅱ로 표시할 수 있다.
[화학식 Ⅱ]
Figure 112016046536678-pat00003
상기 화학식 Ⅱ에서,
R2 및 R3는 서로 같거나, 서로 상이하거나 각각 독립적으로, *-O-R4-OH 중에서 선택되고,
상기 R4는 C1 내지 C4의 알킬기이다.
L2는 링커 또는 직접 결합이며,
CD는 사이클로덱스트린 또는 상기 사이클로덱스트린의 하이드록실기 중 어느 하나가 아민기로 치환된 사이클로덱스트린이며,
o, p는 각각 10 내지 3000의 정수이다.
상기 L2은 직접 결합이거나, 옥살산, 말론산, 말릭산, 숙신산, 글루타르산, 글루탐산, 아디프산, 세바코일산, 수베르산, 도데카노산, 푸마르산, 말레이산, 프탈산 및 테레프탈산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 생분해성 디카르복실기 링커일 수 있다.
상기 자가조립 나노복합체의 평균 직경은 200 내지 300 ㎚일 수 있다.
본 발명은 상기 또 다른 목적을 이루기 위하여, 하기 단계를 포함하는 상기 자가조립 나노복합체를 제조하는 방법을 제공한다.
ⅰ) 아다만탄 화합물에 제1 링커를 결합시키는 단계;
ⅱ) 상기 아다만탄 화합물과 제1 링커의 결합체에 알부민을 결합시켜, (a) 아다만탄기를 갖는 알부민을 제조하는 단계;
ⅲ) 사이클로덱스트린 화합물에 제2 링커를 결합시키는 단계;
ⅳ) 상기 사이클로덱스트린 화합물과 제2 링커의 결합체에 글라이콜 키토산을 결합시켜 (b) 사이클로덱스트린이 결합된 글라이콜 키토산을 제조하는 단계;
ⅴ) 상기 ⅳ) 단계를 통해 제조된 (b) 사이클로덱스트린이 결합된 글라이콜 키토산에 상기 ⅱ) 단계를 통해 제조된 (a) 아다만탄기를 갖는 알부민을 서서히 첨가하여 반응시키는 단계; 및
ⅵ) 상기 ⅴ) 단계의 반응물에 초음파를 조사하는 단계;
상기 제1 링커와 제2 링커는 서로 동일하거나, 서로 상이하며, 각각 독립적으로 옥살산, 말론산, 말릭산, 숙신산, 글루타르산, 글루탐산, 아디프산, 세바코일산, 수베르산, 도데카노산, 푸마르산, 말레이산, 프탈산 및 테레프탈산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 생분해성 디카르복실기 링커일 수 있다.
상기 ⅰ) 단계에서 상기 아다만탄 화합물과 상기 링커의 당량비는 상기 아다만탄 화합물 1 당량을 기준으로 하여 상기 링커 1 내지 4 당량 범위로 혼합하는 것일 수 있다.
상기 ⅰ) 단계에서 상기 아다만탄 화합물은 하기 화학식 1로 표시되는 것일 수 있다.
[화학식 1]
Figure 112016046536678-pat00004
상기 화학식 1에서
X1은 C1 내지 C4 알킬아민기 중에서 선택되는 어느 하나이다.
상기 ⅱ) 단계에서 상기 아다만탄 화합물과 링커의 결합체;와 알부민의 당량비는 상기 아다만탄 화합물과 링커의 결합체 1 당량을 기준으로 상기 알부민 20 내지 80 당량 범위로 혼합되는 것일 수 있다.
상기 알부민은 소혈청 알부민(BSA), 오브알부민(ovalbumin) 및 인간 혈청 알부민(HSA)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
상기 ⅴ) 단계에서 상기 (a) 아다만탄기를 갖는 알부민 유래의 아다만탄기에 대한, 상기 자가조립 나노복함체에 포함된 (b) 사이클로 덱스트린이 결합된 글라이콜 키토산 유래의 사이클로덱스트린의 당량비는 1 : 0.5-4.0인 것일 수 있다. 상기 당량비 범위를 벗어날 경우, 최종적으로 제조된 자가조립 나노복합체의 크기가 적합하지 않고 안정성이 낮아지는 문제점이 발생한다.
상기 ⅵ) 단계에서 초음파는 10 내지 30 kHz 주파수, 25% 내지 50% 출력 진폭(Amplitude)로 수행되는 것일 수 있다.
본 발명은 상기 또 다른 목적을 이루기 위하여, 상기 자가조립 나노복합체를 포함하고, 상기 자가조립 나노복합체 내에 항암제가 봉입되어 있는 것을 특징으로 하는 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
상기 항암제는 독소루비신, 캄포테칸, 이리노테칸, 파클리탁셀 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 암은 폐암, 비소세포성 폐암, 결장암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 피부 또는 안구 내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 위암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS; central nervous system) 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명은 항암제를 봉입한 초분자 상호작용을 통한 자가조립 나노복합체 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 기존의 알부민 나노입자를 약물 전달체로 사용했을 때 가교제에 의해 야기 될 수 있는 체내 독성 및 부작용을 감소시킬 수 있고, 수용액에서 손쉽게 제조될 수 있어 유기용매와 같은 인체 유해물질에 대한 노출 위험이 없고 동시에 암세포에 대한 표적지향성을 유지할 수 있고 약물의 방출을 조절할 수 있어 암 치료 및 예방 용도로 널리 사용될 수 있으며 특히 대장암 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 아다만탄기를 갖는 알부민의 합성과정을 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명에 따른 사이클로덱스트린이 결합된 글라이콜 키토산의 합성과정을 나타낸 도면이다.
도 3은 화학 항암제(독소루비신)이 봉입된 자가조립 나노복합체의 제조과정을 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 4는 제조예 1 내지 3으로부터 제조된 아다만탄기를 갖는 알부민과 아다만탄기를 갖지 않는 종래 알부민의 지연 역상-고압 액체 크로마토그래프(HPLC)이다.
도 5는 제조예 4로부터 제조된 GC-CD와 순수 CD 및 순수 GC의 화학 구조식를 확인하기 위하여, 이들 각각에 대해 핵자기공명(1H NMR)으로 측정한 결과 그래프이다.
도 6a는 실시예 1 내지 4로부터 제조된 자가조립 나노복합체의 평균 직경을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 6b는 실온에서 장기보관시 용액의 안정성을 비교하기 위하여, 실시예 1 내지 4로부터 제조된 자가조립 나노복합체를 24 시간 상온에 방치하기 전과 후를 촬영하여 나타낸 사진이다.
도 7a는 본 발명에 따른 사이클로덱스트린이 수식된 글라이콜 키토산과 페놀프탈레인 간의 분자 상호작용을 확인하기 위해, 0.02 mg/ml 페놀프탈레인과 다양한 농도의 제조예 4로부터 제조된 사이클로덱스트린이 수식된 글라이콜 키토산을 각각 혼합한 후, 이의 UV-vis 그래프이다.
도 7b는 본 발명에 따른 자가조립 나노복합체를 구성하는 아다만탄과 사이클로덱스트린 간의 초분자 상호작용이 형성되었는지를 확인하기 위해, 0.01 ㎎/㎖ 페놀프탈레인, 제조예 4로부터 제조된 사이클로덱스트린이 결합된 글라이콜 키토산 1.0 ㎎/㎖l 및 다양한 농도의 제조예 2로부터 제조된 아다만탄기를 갖는 알부민 용액(HSA-ASA26)을 각각 혼합한 후, 이들 각각을 측정하여 나타낸 UV-vis 그래프이다.
도 8a는 실시예 5로부터 제조된 항암제가 봉입된 자가조립 나노복합체의 고분해능 투과전자현미경 사진이다.
도 8b는 실시예 5로부터 제조된 항암제가 봉입된 자가조립 나노복합체의 평균 직경을 나타낸 그래프이고, 도 8c는 실시예 5로부터 제조된 항암제가 봉입된 자가조립 나노복합체의 제타 전위를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 9a는 실시예 4로부터 제조된 자가조립 나노복합체(GC-CD/HSA-ADA NPs)의 평균 직경을 나타낸 그래프이고, 도 9b는 실시예 4로부터 제조된 자가조립 나노복합체(GC-CD/HSA-ADA NPs)의 제타 전위를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 10a는 제조예 2로부터 제조된 아다만탄기를 갖는 알부민 용액(HSA-ADA26)의 평균 직경을 나타낸 그래프이고, 도 10b는 제조예 2로부터 제조된 아다만탄기를 갖는 알부민 용액(HSA-ADA26)의 제타 전위를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 11a는 제조예 4로부터 제조된 사이클로덱스트린이 결합된 글라이콜 키토산(GC-CD)의 평균 직경을 나타낸 그래프이고, 도 11b는 제조예 4로부터 제조된 사이클로덱스트린이 결합된 글라이콜 키토산(GC-CD)의 제타 전위를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 12는 제조예 4로부터 제조된 GC-CD와 알부민(HSA)을 혼합한 경우, 제조예 2로부터 제조된 HSA-ADA26와 글라이콜 키토산(GC) 화합물을 혼합한 경우 및 실시예 4로부터 제조된 자가조립 나노복합체의 용액을 촬영한 사진이다.
도 13은 실시예 5로부터 제조된 항암제가 봉입된 자가조립 나노복합체로부터 방출되는 항암제 양을 시간에 따라 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 14는 실시예 5로부터 제조된 항암제가 봉입된 자가조립 나노복합체의 시간에 따른 평균 입경 변화를 나타낸 그래프이다.
도 15a는 폐암 세포주(A549)에서의 실시예 5로부터 제조된 항암제가 봉입된 자가조립 나노복합체의 세포독성을 나타낸 그래프이다.
도 15b는 대장암 세포주(HCT116)에서의 실시예 5로부터 제조된 항암제가 봉입된 자가조립 나노복합체의 세포독성을 나타낸 그래프이다.
도 16은 실시예 5로부터 제조된 항암제가 봉입된 자가조립 나노복합체 또는 음성대조군 또는 양성대조군으로 처리한 후, 염색한 대장암 세포주(HCT116)의 형광 이미지이다.
도 17은 대장암이 유발된 마우스 모델에서의 cy5.5로 라벨링된 실시예 5로부터 제조된 항암제가 봉입된 자가조립 나노복합체의 시간별 이동경로를 촬영하여 나타낸 형광이미지이다.
이하에서, 본 발명의 여러 측면 및 다양한 구현 예에 대해 더욱 구체적으로 살펴보도록 한다.
일반적으로 호스트(host)-게스트(guest) 초분자 화학(supramolecular chemistry)은 가역적이라는 특성 때문에 약물 전달 시스템에 다용도로 적용될 가능성이 높아, 많은 관심을 받아왔다. 초분자 상호작용으로는 정전기적 상호작용(electrostatic interaction) 및 반데르발스 인력(van der Waals force) 등과 같은 비공유성 상호작용(non-covalent interaction)을 의미한다.
일반적인 호스트 거대고리(macrocyclic) 분자로는 크라운 이써(crown ether), 사이클로판(cyclophanes), 크립탠드(cryptands) 및 쿠커비투릴(cucurbiturils) 등이 존재하나, 본 발명에서는 화학적 안정성이 우수하고 독성이 거의 검출되지 않는 사이클로덱스트린을 사용하였다.
나노전달(nanocarrier) 시스템은 타겟물질에 대한 표적 능력을 이용한 것으로, 항암제의 치료효과를 개선하기 위한 가장 효과적인 방법이라 여겨져 왔다. 이러한 나노전달 시스템으로 나노입자, 나노구, 나노화합물 및 나노막대 등의 다양한 시스템들이 개발되어 오고 있다.
상기 나노전달 시스템은 최근 알부민을 이용한 다양한 나노입자들이 공지된 바 있는데, 알부민의 많은 작용기를 이용하여, 약물을 직접적으로 결합시킨 알부민 나노입자 제제가 대표적인 예이다.
이는 생체적합성, 생분해성 및 비면역원성의 알부민을 이용하고 있어 생체 내에 독성을 띄지 않으며, 종양조직을 선택적으로 타겟팅하는 능력이 우수하다는 장점이 있다. 그러나 상기 알부민 나노입자 제제는 종양조직에 대한 타겟팅 능력이 여전히 기대에 못미치는 수준이며, 탈용매화(desolvation), 열성겔화(thermal gelation), 유화(emulsification), 자가조립(self-assembly) 또는 나노분무건조와 같은 많은 전통적인 방법과 고압호모게나이제이션(high-pressure homogenization)에 의해 제작됨에 의해, 유기용매에 노출되고, 공유결합으로 인한 비가역성 및 글루타알데히드(glutaldehyde)와 같은 독성물질을 포함하고 있어 생체 내 유해성이 수반되므로, 임상 개발에 있어 한계가 있다.
이러한 문제점을 보완하고자 본 발명은 알부민을 기반으로 하면서도, 호스트-게스트 초분자 상호작용을 이용한 새로운 구조의 자가조립 나노복합체를 완성하기에 이르렀다. 이러한 결합방식을 추구하고 있기 때문에 유기용매 및 독성물질이 수반되는 것을 방지함과 동시에, 상술한 구조의 본 발명에 따른 자가조립 나노복합체는 가역적(reversible)이면서도 24 시간동안 구조적 안정성을 유지할 수 있으며, 암 조직으로의 우수한 표적 지향성을 확보할 수 있었다.
이하에서, 본 발명에 대해 더욱 구체적으로 설명하고자 한다.
본 발명의 일 측면은 (a) 아다만탄기를 갖는 알부민; 및 (b) 사이클로덱스트린이 결합된 글라이콜 키토산을 포함하고, 상기 (a)의 아다만탄기와 (b)의 사이클로덱스트린 간에 초분자 상호작용에 의해 결합된 자가조립 나노복합체에 관한 것이다.
상기 (a) 아다만탄기를 갖는 알부민의 평균분자량은 70000 내지 80000 MW일 수 있다. 만일 상기 (a) 아다만탄기를 갖는 알부민의 평균분자량의 평균분자량이 70000~80000 범위를 벗어나기 위해서는, 상기 아다만탄기의 치환도가 50을 초과하여 제조되어야 하는데, 50을 초과한 치환도를 가질 경우 소수성 모이어티의 함량이 높아 결합체 자체가 수용액 상에 용해되지 못하고 석출되는 문제가 있다. 게다가 상기 알부민의 일급 아민기가 총 56개 존재하고, 상기 알부민의 아민기 전부가 아다만탄기로 치환되어야만 평균분자량 80000을 초과할 수 있기 때문에, 제조가 매우 어렵다.
상기 (a) 아다만탄기를 갖는 알부민의 아다만탄기 치환도는 10 내지 50 일 수 있다.
상기 (a) 아다만탄기를 갖는 알부민의 아다만탄기 치환도가 10 내지 50 인 것이 바람직한데, 만일 아다만탄기 치환도가 10 미만인 경우 소수성 모이어티의 함량이 상대적으로 적어서 나노입자를 형성하지 못하고, 수용액 중에 쉽게 분해되어버리는 문제가 발생할 수 있고, 아다만탄기 치환도가 50 을 초과하는 경우에는 소수성 모이어티의 함량이 높아 결합체 자체가 수용액 상에 용해되지 못하고 석출되는 문제가 발생한다.
상기 (a) 아다만탄기를 갖는 알부민은 하기 화학식 Ⅰ로 표시될 수 있다.
[화학식 Ⅰ]
Figure 112016046536678-pat00005
상기 화학식 Ⅰ에서,
ADA는 아다만탄기이고,
L1은 링커 또는 직접 결합이며,
상기 n은 1 내지 56의 정수이다.
본 발명에 따른 일 구현예에서 상기 화학식 Ⅰ에서 상기 ADA는 하기 화학식 1로 표시되는 아다만탄기일 수 있다.
[화학식 1]
Figure 112016046536678-pat00006
상기 화학식 1에서 X1은 아민기, C1 내지 C4 알킬아민기 중에서 선택되는 어느 하나이다.
바람직하게 상기 화학식 1은 하기 화학식 1a로 표시되는 1-아다만탄메틸아민(1-adamantanemethylamine)일 수 있다.
[화학식 1a]
Figure 112016046536678-pat00007
상기 화학식 Ⅰ에서 상기 L1은 직접 결합이거나, 옥살산, 말론산, 말릭산, 숙신산, 글루타르산, 글루탐산, 아디프산, 세바코일산, 수베르산, 도데카노산, 푸마르산, 말레이산, 프탈산 및 테레프탈산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 생분해성 디카르복실기 링커일 수 있다. 바람직하게 상기 L은 구체적으로 *??C(=O)-R1-C(=O)-O-*일 수 있다. 이때 R1은 C1 내지 C4의 저급 알킬기이거나, C5 내지 C20의 고급 알킬기이다.
상기 화학식 Ⅰ에서 Albumin은 소혈청 알부민(BSA), 오브알부민(ovalbumin) 및 인간 혈청 알부민(HSA)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 (b) 사이클로덱스트린이 결합된 글라이콜 키토산의 평균 분자량은 103 내지 106 Mw일 수 있다.
상기 (b) 사이클로덱스트린이 결합된 글라이콜 키토산은 하기 화학식 Ⅱ로 표시될 수 있다.
[화학식 Ⅱ]
Figure 112016046536678-pat00008
상기 화학식 Ⅱ에서,
R2 및 R3는 서로 같거나, 서로 상이하거나 각각 독립적으로, *-O-R4-OH 중에서 선택되고,
상기 R4는 C1 내지 C4의 알킬기이다.
L2는 링커 또는 직접 결합이며,
CD는 사이클로덱스트린 또는 상기 사이클로덱스트린의 하이드록실기 중 어느 하나가 아민기로 치환된 사이클로덱스트린이며,
o, p는 각각 10 내지 3000의 정수이다.
상기 CD는 사이클로덱스트린으로, α-, β- 및 γ- 사이클로덱스트린으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있고, 바람직하게는 사이클로덱스트린은 치환되지 않거나, 상기 사이클로덱스트린의 하이드록실기 중 어느 하나가 아민기로 치환된 것일 수 있다.
상기 사이클로덱스트린은 여섯(α), 일곱(β), 혹은 여덟(γ)개의 글루코피라노사이드(α-1,4-linked D-glucopyranoside) 단위를 가진 고리형 올리고당으로, 소수성 내부 공간과 친수성 외부 표면이라는 독특한 특징을 갖고 내부 공간은 소수성 '게스트' 분자와 결합할 수 있는 특성을 갖는다.
이러한 사이클로덱스트린은 도넛 형상의 환 형태를 가지고 있고, 상기 내부 공동의 크기를 만족하는 분자(게스트)와 비공유 상호작용을 통해 결합되는 특성을 갖는다. 이의 안정성은 사이클로덱스트린과 게스트의 특성에 따라 매우 달라지게 된다. 이에 본 발명에서는 사이클로덱스트린이 결합된 글라이콜 키토산(b)과 아다만탄기를 갖는 알부민(a)을 이용함으로써 매우 구조적 안정성이 가장 우수한 자가조립 나노복합체를 완성하였다.
이로 인해, 게스트 물질인 아다만탄과 초분자 상호작용을 형성할 수 있고, 이로 인해 형성된 자가조립 나노복합체는 가역적인 구조를 갖는다.
상술한 구조 중에서 어느 하나라도 빠진다면 본 발명에 따른 자가조립 나노구조체는 쉽게 수계 내에 분해되어 버리는 문제가 발생하며, 설사 복합체를 형성한다 하더라도 구조적 안정성이 현저히 낮아 약물이 암 조직에 전달되기도 전에 쉽게 구조가 분해되어 약물 전달체로써 역할을 수행할 수 없다는 문제점이 있다.
예로 알부민과 키토산(또는 글라이콜 키토산) 만을 이용할 경우, 서로 전하가 다르기 때문에, 쉽게 입자를 형성할 것이라 예상되나, 이들은 서로 간에 결합이 원활하게 형성되지 못하며, 설사 복합체를 형성한다 하더라도 구조적 안정성이 현저히 낮아 약물이 암 조직에 전달되기도 전에 쉽게 구조가 분해되어 약물 전달체로 상용화할 수 없는 문제점이 있다.
즉, 본 발명에서 알부민이 우수한 암 조직으로의 축적률이 높다하더라도 (a) 아다만탄기를 갖는 알부민만을 이용한다 하더라도 복합체를 형성할 수 없고, 약물을 내부에 봉입하지 못하기 때문에 약물 전달체로 상용화할 수 없다.
또한, 본 발명에서 단지 (a) 아다만탄기를 갖는 알부민과 사이클로덱스트린(글라이콜 키토산이 없는)을 이용하거나, (b) 사이클로덱스트린이 결합된 클라이콜 키토산과 알부민(아다만탄기가 없는)을 이용할 경우와 같이 어느 하나의 분자가 존재하지 않을 경우 복합체가 형성되지 못하여 약물 전달체의 역할을 수행할 수 없는 문제가 발생한다.
상술한 구조의 자가조립 나노복합체는 암조직에 대판 표적 지향성 즉, 선택성과 축적률이 높다는 것을 확인하였다. 이는 알부민으로 만든 나노입자의 gp60(클라트린(clathrin))을 매개로 하는 세포외배출(transcytosis) 과 암 조직 주변의 신생 혈관의 높은 투과성으로 인해 발휘되는 EPR(enhanced permeability and retention) 효과에 의해서이다. 게다가 생체 내, 생체 외 수계 내에서 구조적 안전성이 매우 우수하여, 장기간 보관이 가능하다.
상기 (a) 아다만탄기를 갖는 알부민 유래의 아다만탄기;와 상기 (b) 사이클로 덱스트린이 결합된 글라이콜 키토산 유래의 사이클로덱스트린;은 초분자 상호작용으로 인하여 마이셀과 유사한 구형의 자가조립 나노복합체를 형성한다.
상기 자가조립 나노복합체의 평균 직경은 100 내지 1000 ㎚일 수 있으나, 가장 바람직하게는 200 내지 300 ㎚일 수 있는데, 상기 200 내지 300 ㎚의 자가조립 나노복합체일 경우 구조적 안정성이 24 시간 이상 유지되는 것을 확인하였기 때문이다.
이러한 수계 내에서의 자가조립 나노복합체의 외부 환경으로부터 구조적 안정성을 유지하는 특성은 약물전달체로서 임상학적 의의가 있음을 평가하는 매우 중요한 요소들 중 하나로, 특히 본 발명에 따른 자가조립 나노복합체는 상기 자가조립 나노복합체의 구조를 외부 환경으로부터 보호하기 위하여 높은 비용과 시간을 소모하는 화학적 변형을 요구하지 않고 있으며, 수용액 상에서의 초분자 상호작용에 의한 자가조립을 통해 형성함으로써, 유기용매 사용에 의해 독성물질이 수반되는 문제점을 해결하였다.
본 발명의 다른 측면은 하기 단계를 포함하는 상기 자가조립 나노복합체의 제조방법에 관한 것이다.
ⅰ) 아다만탄 화합물에 제1 링커를 결합시키는 단계;
ⅱ) 상기 아다만탄 화합물과 제1 링커의 결합체에 알부민을 결합시켜, (a) 아다만탄기를 갖는 알부민을 제조하는 단계;
ⅲ) 사이클로덱스트린 화합물에 제2 링커를 결합시키는 단계;
ⅳ) 상기 사이클로덱스트린 화합물과 제2 링커의 결합체에 글라이콜 키토산을 결합시켜 (b) 사이클로덱스트린이 결합된 글라이콜 키토산을 제조하는 단계;
ⅴ) 상기 ⅳ) 단계를 통해 제조된 (b) 사이클로덱스트린이 결합된 글라이콜 키토산에 상기 ⅱ) 단계를 통해 제조된 (a) 아다만탄기를 갖는 알부민을 서서히 첨가하여 반응시키는 단계; 및
ⅵ) 상기 ⅴ) 단계의 반응물에 초음파를 조사하는 단계;
상기 자가조립 나노복합체의 제조방법은 유기용매를 사용하지 않고, 수용액 상에서 초분자 상호작용에 의한 자가조립을 이용하여 제조하기 때문에, 친환경적이면서도, 제조과정 중 독성물질을 수반하지 않아 매우 안정하며, 혼합하고 초음파를 조사하는 단순하면서 쉬운 제조방식을 이용하므로 비용을 현저히 절감할 수 있다. 이하 구체적으로 설명하기로 한다.
우선 ｉ) 단계에서 상기 아다만탄 화합물에 제1 링커를 결합시킨다.
상기 제1 링커는 디카르복실 링커로, 바람직하게는 옥살산, 말론산, 말릭산, 숙신산, 글루타르산, 글루탐산, 아디프산, 세바코일산, 수베르산, 도데카노산, 푸마르산, 말레이산, 프탈산 및 테레프탈산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 생분해성 디카르복실기 링커일 수 있다.
상기 제1 링커는 상기 아다만탄 화합물과 알부민의 가교 및 유연성 증가에 기여하는 역할을 한다.
구체적으로 상기 아다만탄 화합물과 링커는 상기 제1 링커의 고리열림 반응을 통해, 서로 간에 가교(cross-linker)를 형성하여 결합되는 것일 수 있다.
상기 아다만탄 화합물은 하기 화학식 1로 표시될 수 있다.
[화학식 1]
Figure 112016046536678-pat00009
상기 화학식 1에서 X1은 아민기 또는 C1 내지 C4 알킬아민기 중에서 선택되는 어느 하나이다.
바람직하게 상기 화학식 1은 하기 화학식 1a로 표시되는 1-아다만탄메틸아민(1-adamantanemethylamine)일 수 있다.
[화학식 1a]
Figure 112016046536678-pat00010
상기 아다만탄 화합물과 상기 링커의 당량비는 상기 아다만탄 화합물 1 당량을 기준으로 하여 상기 링커 1 내지 4 당량 범위로 혼합하는 것일 수 있는데, 만일 상기 아다만탄 화합물 1 당량을 기준으로 하여 상기 링커 1 당량 미만으로 혼합되면 아다만탄의 아민과 반응하기에 링커의 함량이 낮아, 상기 아다만탄 화합물과 제1 링커의 결합체를 형성하지 못하게 되는 문제가 있고, 상기 아다만탄 화합물 1 당량을 기준으로 하여 상기 링커 4 당량 초과하여 혼합되면 미반응한 링커가 알부민의 아민과 반응하여 예상치 못한 부반응이 발생하는 문제가 발생할 수 있다.
다음으로 ⅱ) 상기 아다만탄 화합물과 링커의 결합체에 알부민을 결합시켜, (a) 아다만탄기를 갖는 알부민을 제조한다.
상기 아다만탄 화합물과 링커의 결합체;와 알부민의 당량비는 상기 아다만탄 화합물과 링커의 결합체 1 당량을 기준으로 상기 알부민 20 내지 80 당량 범위로 혼합할 수 있다. 만일 상기 아다만탄 화합물과 링커의 결합체; 1 당량을 기준으로 상기 알부민 20 당량 미만으로 혼합되거나, 80 당량을 초과하여 혼합하면 충분한 아다만탄기 치환도를 갖는 아다만탄기를 갖는 알부민을 제조할 수 없다는 문제가 있다.
상기 알부민은 소혈청 알부민(BSA), 오브알부민(ovalbumin) 및 인간 혈청 알부민(HSA)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있는데 가장 바람직하게는 생체 적합성이 가장 우수한 인간 혈청 알부민일 수 있다.
상기 (a) 아다만탄기를 갖는 알부민은 하기 화학식 Ⅰ로 표시될 수 있다.
[화학식 Ⅰ]
Figure 112016046536678-pat00011
상기 화학식 Ⅰ에서,
ADA는 아다만탄기이고,
L1은 링커 또는 직접 결합이며,
상기 n은 1 내지 56의 정수이다.
본 발명에 따른 일 구현예에서 상기 화학식 Ⅰ에서 상기 ADA는 하기 화학식 1로 표시되는 아다만탄기일 수 있다.
[화학식 1]
Figure 112016046536678-pat00012
상기 화학식 1에서 X1은 아민기, C1 내지 C4 알킬아민기 중에서 선택되는 어느 하나이다.
바람직하게 상기 화학식 1은 하기 화학식 1a로 표시되는 1-아다만탄메틸아민(1-adamantanemethylamine)일 수 있다.
[화학식 1a]
Figure 112016046536678-pat00013
상기 화학식 Ⅰ에서 상기 L1은 직접 결합이거나, 옥살산, 말론산, 말릭산, 숙신산, 글루타르산, 글루탐산, 아디프산, 세바코일산, 수베르산, 도데카노산, 푸마르산, 말레이산, 프탈산 및 테레프탈산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 생분해성 디카르복실기 링커일 수 있다. 바람직하게 상기 L은 구체적으로 *-C(=O)-R1-C(=O)-O-*일 수 있다. 이때 R1은 C1 내지 C4의 알킬기이다.
상기 화학식 Ⅰ에서 Albumin은 소혈청 알부민(BSA), 오브알부민(ovalbumin) 및 인간 혈청 알부민(HSA)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 화학식 Ⅰ은 바람직하게 하기 화학식 Ⅰa일 수 있다.
[화학식 Ⅰa]
Figure 112016046536678-pat00014
상기 화학식 Ⅰa에서 q는 16 내지 40의 정수이다.
다음으로 ⅲ) 사이클로덱스트린 화합물에 제 2 링커를 결합시킨다.
상기 사이클로덱스트린 화합물은 α-, β- 및 γ- 사이클로덱스트린으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있는데, 바람직하게는 상기 사이클로덱스트린은 치환되지 않거나, 상기 사이클로덱스트린의 하이드록실기 중 어느 하나가 아민기로 치환된 것일 수 있다.
상기 사이클로덱스트린 화합물은 여섯(α), 일곱(β), 혹은 여덟(γ)개의 글루코피라노사이드(α-1,4-linked D-glucopyranoside) 단위를 가진 고리형 올리고당으로, 소수성 내부 공간과 친수성 외부 표면이라는 독특한 특징을 갖고 내부 공간은 소수성 '게스트' 분자와 결합할 수 있는 특성을 갖는다.
이러한 사이클로덱스트린 화합물은 도넛 형상의 환 형태를 가지고 있고, 상기 내부 공동의 크기를 만족하는 분자(게스트)와 비공유 상호작용을 통해 결합되는 특성을 갖는다. 이의 안정성은 사이클로덱스트린과 게스트의 특성에 따라 매우 달라지게 된다. 이에 본 발명에서는 사이클로덱스트린이 결합된 글라이콜 키토산(b)과 아다만탄기를 갖는 알부민(a)을 이용함으로써 매우 구조적 안정성이 가장 우수한 자가조립 나노복합체를 완성할 수 있다.
상기 제2 링커는 디카르복실 링커로, 바람직하게는 옥살산, 말론산, 말릭산, 숙신산, 글루타르산, 글루탐산, 아디프산, 세바코일산, 수베르산, 도데카노산, 푸마르산, 말레이산, 프탈산 및 테레프탈산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 생분해성 디카르복실기 링커일 수 있다.
상기 링커는 상기 사이클로덱스트린과 글라이콜 키토산의 가교 및 유연성 증가에 기여하는 역할을 한다.
구체적으로 상기 사이클로덱스트린 화합물과 제2 링커는 상기 제2 링커의 고리열림 반응을 통해, 서로 간에 가교(cross-linker)를 형성하여 결합되는 것일 수 있다. 이러한 과정의 예를 하기 도 2에 구체적으로 기재하였다.
이후, ⅳ) 상기 사이클로덱스트린 화합물과 제2 링커의 결합체에 글라이콜 키토산을 결합시켜 (b) 사이클로덱스트린이 결합된 글라이콜 키토산을 제조한다.
상기 (b) 사이클로덱스트린이 결합된 글라이콜 키토산은 하기 화학식 Ⅱ로 표시될 수 있다.
[화학식 Ⅱ]
Figure 112016046536678-pat00015
상기 화학식 Ⅱ에서,
R2 및 R3는 서로 같거나, 서로 상이하거나 각각 독립적으로, *-O-R4-OH 중에서 선택되고,
상기 R4는 C1 내지 C4의 알킬기이다.
L2는 링커 또는 직접 결합이며,
CD는 사이클로덱스트린 또는 상기 사이클로덱스트린의 하이드록실기 중 어느 하나가 아민기로 치환된 사이클로덱스트린이며,
o, p는 각각 10 내지 3000의 정수이다.
상기 CD는 사이클로덱스트린으로, α-, β- 및 γ- 사이클로덱스트린으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있고, 바람직하게는 사이클로덱스트린은 치환되지 않거나, 상기 사이클로덱스트린의 하이드록실기(hydroxyl) 중 어느 하나가 아민기(amines)로 치환된 것일 수 있다.
상기 사이클로덱스트린은 여섯(α), 일곱(β), 혹은 여덟(γ)개의 글루코피라노사이드(α-1,4-linked D-glucopyranoside) 단위를 가진 고리형 올리고당으로, 소수성 내부 공간과 친수성 외부 표면이라는 독특한 특징을 갖고 내부 공간은 소수성 '게스트' 분자와 결합할 수 있는 특성을 갖는다.
이러한 사이클로덱스트린은 도넛 형상의 환 형태를 가지고 있고, 상기 내부 공동의 크기를 만족하는 분자(게스트)와 비공유 상호작용을 통해 결합되는 특성을 갖는다. 이의 안정성은 사이클로덱스트린과 게스트의 특성에 따라 매우 달라지게 된다. 이에 본 발명에서는 사이클로덱스트린이 결합된 글라이콜 키토산(b)과 아다만탄기를 갖는 알부민(a)을 이용함으로써 매우 구조적 안정성이 가장 우수한 자가조립 나노복합체를 완성하였다.
이로 인해, 게스트 물질인 아다만탄과 초분자 상호작용을 형성할 수 있고, 이로 인해 형성된 자가조립 나노복합체는 가역적인 구조를 갖는다.
다음, ⅴ) 상기 ⅳ) 단계를 통해 제조된 (b) 사이클로덱스트린이 결합된 글라이콜 키토산에 상기 ⅱ) 단계를 통해 제조된 (a) 아다만탄기를 갖는 알부민을 서서히 첨가하여 반응시킨다.
상기 (a) 아다만탄기를 갖는 알부민 유래의 아다만탄기에 대한, 상기 자가조립 나노복함체에 포함된 (b) 사이클로 덱스트린이 결합된 글라이콜 키토산 유래의 사이클로덱스트린의 당량비는 1 : 1-4, 가장 바람직하게는 1 : 1.5-2.5일 수 있다.
만일 상기 (a) 아다만탄기를 갖는 알부민 유래의 아다만탄기에 대한, 상기 자가조립 나노복함체에 포함된 (b) 사이클로 덱스트린이 결합된 글라이콜 키토산 유래의 사이클로덱스트린의 당량비는 1 : 1.5 미만이거나, 1 : 2.5를 초과하여 제조된 자가조립 나노복합체는 24 시간 이전에 이미 용액의 상태가 투명해지는 등 육안으로 관찰될 정도의 상태변화를 쉽게 나타내며, 이는 곧 자가조립 나노복합체가 안정한 콜로이드 상태를 유지하고 못하고 응집체를 형성해 침전되는 문제가 있다.
따라서 상기 (a) 아다만탄기를 갖는 알부민 유래의 아다만탄기에 대한, 상기 자가조립 나노복함체에 포함된 (b) 사이클로 덱스트린이 결합된 글라이콜 키토산 유래의 사이클로덱스트린의 당량비가 1 : 1.5-2.5인 것이 24 시간 이상, 1 내지 30 시간 동안 장기간 안정성 측면에서 가장 우수하다는 것을 확인하였다.
상기 ⅵ) 단계에서 초음파는 10 내지 30 kHz 주파수, 25% 내지 50% 출력 진폭(Amplitude)로 수행될 수 있는데, 상기 10 kHz 미만의 주파수 및 25% 미만의 출력 진폭으로 수행될 경우 균일한 분산이 어려워 균일한 평균 직경을 얻을 수 없는 문제가 존재하고, 상기 30 kHz 주파수를 초과하고, 50%를 초과한 출력 진폭으로 수행할 경우 열에 의해 자가조립 나노복합체의 변성(특히, 알부민의 변성)이 발생한다.
본 발명의 또 다른 측면은 자가조립 나노복합체를 포함하고, 상기 자가조립 나노복합체 내에 항암제가 봉입되어 있는 것을 특징으로 하는 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
상기 자가조립 나노복합체 내에 봉입된 항암제의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 1 내지 10 중량%일 수 있다.
상기 항암제는 상기 자가조립 나노복합체 내부에 비공유 결합(소수성 상호작용 및 흡착)을 통해 봉입될 수 있다. 상기 자가조립 나노복합체 내부에 비공유 결합을 형성하여 봉입될 수 있는 항암제는 독소루비신, 캄포테칸, 이리노테칸, 파클리탁셀 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물에서 상기 자가조립 나노복합체의 평균 직경은 100 내지 1000 ㎚, 바람직하게는 수계 내에서도 매우 안정적으로 구조를 장시간 유지할 수 있는 200 내지 300 ㎚일 수 있다.
다만, 이러한 초분자 상호작용을 통해 상기 자가조립 나노복합체 내에 상기 항암제를 봉입하고 있기 때문에 동일한 항암제를 사용함에도 불구하고 암 조직에 대한 선택성 및 축적률 등이 현저히 우수하기 때문에 더 많은 양의 함암제를 암조직에 축적하여 효과적으로 항암 작용을 발휘할 수 있도록 한다. 이러한 효과는 다른 전달체에 비해 매우 우수하다.
또한 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 상기 자가조립 나노복합체의 구조 안정성이 매우 우수하다.
상기 암은 폐암, 비소세포성 폐암, 결장암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 피부 또는 안구 내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 위암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS; central nervous system) 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
이하에서 실시예 등을 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 하며, 다만 이하에 실시예 등에 의해 본 발명의 범위와 내용이 축소되거나 제한되어 해석될 수 없다. 또한, 이하의 실시예를 포함한 본 발명의 개시 내용에 기초한다면, 구체적으로 실험 결과가 제시되지 않은 본 발명을 통상의 기술자가 용이하게 실시할 수 있음은 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연하다.
또한 이하에서 제시되는 실험 결과는 상기 실시예 및 비교예의 대표적인 실험 결과만을 기재한 것이며, 아래에서 명시적으로 제시하지 않은 본 발명의 여러 구현예의 각각의 효과는 해당 부분에서 구체적으로 기재하도록 한다.
제조예 1 내지 3. 화학식 Ⅰa로 표시되는 아다만탄기를 갖는 알부민의 합성(이하, HSA - ADA 16 , HSA - ADA 26 , HSA - ADA 40 이라고도 한다.)
[화학식 Ⅰa]
Figure 112016046536678-pat00016
상기 화학식 Ⅰa에서 q는 16 내지 40의 정수이다.
상기 화학식 Ⅰa로 표시되는 아다만탄기를 갖는 알부민을 제조하기 위하여, 하기 반응식 1에 표시된 과정을 통해 합성하였다.
[반응식 1]
Figure 112016046536678-pat00017
우선 상기 화학식 1a로 표시되는 아다만탄 화합물에 링커를 결합시키기 위하여 107 μl의 하기 화학식 1a로 표시되는 아다만탄 화합물을 5 ㎖의 0.3%(TEA/DMSO)에 용해하고, 숙신산 무수물 120 ㎎을 첨가하여 3 시간 동안 교반하여 아다만탄 화합물과 링커의 결합체를 제조하였다.
다음 상기 아다만탄 화합물과 링커의 결합체에 알부민을 결합시키기 위하여, 상기 아다만탄 화합물과 링커의 결합체에 DCC(N,N'-Dicyclohexylcarbodiimide) 250 ㎎과 NHS(N-Hydroxysuccinimide) 140 ㎎을 첨가하고 6 시간 더 반응시켜 상기 아다만탄 화합물과 링커의 결합체를 활성화시켰다. 이를 원심 분리기에서 4000 rpm에서 15분 처리한 뒤, 가라앉은 부산물을 제거하고 상등액은 -70 ℃에 보관하였다.
5 ㎖의 PBS(10 mM pH 7.4)에 녹인 알부민 용액(10 ㎎/㎖)에 상기 - 70 ℃에 보관한 활성화된 아다만탄 화합물과 링커의 결합체(20 ㎎/㎖)를 25 분 동안 천천히 넣고, 이후 12 시간 동안 상온에서 교반하였다. 반응이 종료된 후 침전물을 제거하고, 상등액을 Centricon(MWCO : 30k)을 이용하여 50 ㎎/㎖로 농축시켜 상기 화학식 Ⅰa로 표시되는 아다만탄기를 갖는 알부민을 수득하였다. 상기 화학식 Ⅰa로 표시되는 아다만탄기를 갖는 알부민의 농도는 BCA protein assay로 정량하여 확인하였다.
이때, 제조예 1(HSA-ADA16)은 알부민 용액에 상기 - 70 ℃에 보관한 활성화된 아다만탄 화합물과 링커의 결합체(20 ㎎/㎖)를 0.25 ㎖(ADA:HSA=20 당량) 첨가한 것이고, 제조예 2(HSA-ADA 26 )는 알부민 용액에 상기 - 70 ℃에 보관한 활성화된 아다만탄 화합물과 링커의 결합체(20 ㎎/㎖)를 0.5 ㎖(ADA:HSA=40 당량) 첨가한 것이며, 제조예 3(HSA-ADA40)은 알부민 용액에 상기 - 70 ℃에 보관한 활성화된 아다만탄 화합물과 링커의 결합체(20 ㎎/㎖)를 1 ㎖(ADA:HSA=80 당량) 첨가한 것이다.
제조예 4. 화학식 Ⅱa로 표시되는 사이클로덱스트린이 결합된 글라이콜 키토산의 합성(이하, GC -CD라고도 한다.).
[화학식 Ⅱa]
Figure 112016046536678-pat00018
상기 화학식에서 N, M은 각각 10 내지 3000의 정수이다.
상기 화학식 Ⅱa로 표시되는 사이클로덱스트린이 결합된 글라이콜 키토산을 제조하기 위하여, 하기 반응식 2에 표시된 과정을 통해 합성하였다.
[반응식 2]
Figure 112016046536678-pat00019
우선 상기 화학식 2a로 표시되는 사이클로덱스트린 화합물에 링커를 결합시키기 위하여, 100 ㎎의 사이클로덱스트린 화합물(화학식 2a)을 2 ㎖의 0.3% TEA/DMSO에 용해하고, 숙신산 무수물 120 ㎎을 함께 혼합한 후 3 시간 동안 교반하였다.
다음 상기 사이클로덱스트린 화합물과 링커의 결합체에 글라이콜 키토산을 결합시키기 위하여, 상기 사이클로덱스트린 화합물과 링커의 결합체에 DCC 250 ㎎과 NHS 140 ㎎을 첨가하고, 6 시간 더 반응시켜 상기 사이클로덱스트린 화합물과 링커의 결합체를 활성화시켰다. 이를 원심 분리기로 4000 rpm에서 15 분 처리한 뒤, 가라앉은 부산물을 제거하고 얻은 상등액을 - 70 ℃에 보관하였다.
상기 활성화된 사이클로덱스트린 화합물과 링커의 결합체 1.6 ㎖를 6.4 ㎖의 PBS(100 mM pH 8.0)에 희석하고 그 결과 생긴 침천물을 원심 분리하여 제거하였다. 분리된 상등액에 22 ㎖ 글라이콜 키토산(이하 'GC'라고도 한다)(화학식 3a) 용액(100 ㎎: 사이클로덱스트린 대비 1/60 당량)을 빠르게 첨가하였다. 최종적으로 상기 혼합용액을 상온에서 24 시간 동안 반응시킨 후, 3 일 동안 투석(MWCO 10 kDa) 하여 미반응된 사이클로덱스트린을 제거하고, 이를 동결건조하여 분말 형태의 화학식 Ⅱa로 표시되는 사이클로덱스트린이 결합된 글라이콜 키토산을 제조하였다.
이때, 상기 글라이콜 키토산 용액은 22 ㎖의 PBS (100 mM pH 8.0)에 100 ㎎ 글라이콜 키토산(화학식 3a)를 6 시간 동안 미리 녹여 제조한 것을 사용하였다.
실시예 1 내지 4. 자가조립 나노복합체의 제조.
1 ㎖ 주사기를 이용하여 제조예 2로부터 제조된 아다만탄기를 갖는 알부민 용액(HSA-ADA 26 , 2 ㎎/㎖) 0.5 ㎖를 제조예 4로부터 제조된 사이클로덱스트린이 결합된 글라이콜 키토산 용액(GC-CD) 1.5 ㎖에 25 분동안 서서히 드랍방식으로 첨가하였다.
이때, 상기 HSA-ADA 26 유래의 아다만탄기에 대한, 상기 GC-CD 유래의 사이클로덱스트린의 최종 당량비가 [ADA]:[CD] = 1:0.5, 1:1.0, 1:2.0, 1:4.0가 되도록 혼합하였고, 각각 순서대로 실시예 1, 2, 3, 4이다.
상기 각각의 반응 결과물을 얼음이 들어있는 각각의 용기에 담고 초음파 주파기(Sonics & Materials Inc. New-town, CT, USA: amp 40%)를 사용하여 2분 동안 처리하였다.
이하, 실시예 1은 GC-CD/HSA-ADA 0.5로, 실시예 2는 GC-CD/HSA-ADA 1로, 실시예 3은 GC-CD/HSA-ADA 2로, 실시예 4은 GC-CD/HSA-ADA 4로 표기하기도 한다.
실시예 5. 독소루비신이 봉입된 자가조립 나노복합체(항암 조성물)의 제조.
제조예 2로부터 제조된 아다만탄기를 갖는 알부민 용액(HSA-ADA 26 , 2 ㎎/㎖) 0.5 ㎖에 독소루비신 0.4 ㎎을 혼합하고, 이를 1 ㎖ 주사기에 넣어 제조예 4로부터 제조된 사이클로덱스트린이 결합된 글라이콜 키토산 용액(GC-CD) 1.5 ㎖(5.4 ㎎)에 25 분동안 서서히 드랍방식으로 첨가하였다.
이때, 상기 HSA-ADA 26 유래의 아다만탄기에 대한, 상기 GC-CD 유래의 사이클로덱스트린의 최종 당량비가 [ADA]:[CD] = 1:2.0이 되도록 혼합되었다.
상기 반응 결과물을 얼음이 들어있는 각각의 용기에 담고 초음파 주파기(Sonics & Materials Inc. New-town, CT, USA: amp 40%)를 사용하여 2분 동안 처리하여, 항암제인 독소루비신이 봉입된 자가조립 나노복합체를 제조하였다.
실험예 1. 제조예 1 내지 3의 아다만탄기를 갖는 알부민의 물리적 특성.
분자량(Molecular masses)은 Ultraflex Xtreme MALDI-TOF mass spectrometer(Bruker, Conventry, UK)를 사용하여 측정하였다. 스펙트럼(Spectra)은 25kV 가압에 선형 모드로 기록되었다.
종래의 알부민(HSA)과 제조예 1 내지 3으로부터 제조된 아다만탄이 수식된 알부민(HSA-ADA16, HSA-ADA26, HSA-ADA40)의 분자량을 측정하기 위하여, 우선 상기 종래의 알부민(HSA)과 제조예 1 내지 3으로부터 제조된 아다만탄이 수식된 알부민을 각각 탈이온수에 1 ㎎/㎖로 용해시켜, 제1 용액을 준비해둔다.
0.1% trifluoroacetic acid(TFA)/탈이온수-acetonitrile(ACN)(1 : 1)에 시나핀 산(Sinapinic acid)을 용해시킨 포화 용액을 제조하여 제2 용액을 준비해둔다.
각각의 제1 용액와 제2 용액을 1 : 4의 부피비로 혼합한 다음, 각각의 1 ㎕를 타겟 플레이트에 첨가하고, 상온에서 건조하여 시료를 결정화(crystallization)한 후, 기기에 삽입하여 상술한 기기를 통해 각각의 시료에 대한 분자량과 물리적 특성을 측정하였다.
구체적으로 본 발명에 따른 제조예 1 내지 3으로부터 제조된 아다만탄기를 갖는 알부민과 아다만탄기를 갖지 않는 종래의 알부민의 분자량 및 물리적 특성을 비교하기 위하여, 이를 상술한 과정을 통해 측정하고 그 결과를 표 1에 나타내었다.
시료 ADA:HSA당량비 분자량 DS
종래 알부민(HSA) 0 66470 none
제조예 1(HSA-ADA16) 20 70789 16
제조예 2(HSA-ADA 26 ) 40 73574 26
제조예 3(HSA-ADA40) 80 77451 40
표 1에 나타난 바와 같이, 제조예 1 내지 3으로부터 제조된 아다만탄기를 갖는 알부민은 분자량이 각각 70789 m/z, 73574 m/z, 77451 m/z로 확인되었는데 반해, 순수한 종래의 알부민은 66470 m/z였다.
이를 통해 제조예 1 내지 3으로부터 제조된 아다만탄기를 갖는 알부민에 있어서, 하나의 알부민에 대한 아다만탄기의 치환도(DS)가 16, 26 및 40이라는 것을 알 수 있다.
실험예 2. 제조예 1 내지 3의 아다만탄기를 갖는 알부민의 HPLC 측정.
제조예 1 내지 3으로부터 제조된 아다만탄기를 갖는 알부민를 역상-고압 액체 크로마토그래프(RP-HPLC)를 사용하여 보호 카트리지(5 × 3 ㎜, Agilent Technologies)가 장착된 PLRP-S 컬럼(150 × 4.6 mm, Agilent Technologies)으로 40 ℃ 에서 분석하였다.
경사용리(gradient elution)액을 사용하여 분획물을 용출하였고, 여기서 경사용리액은 유속 1.0 ㎖/min로 컬럼으로 주입하였다. 또한 상기 경사용리액으로는 탈이온수에 녹아있는 0.1% TFA를 A 용액으로, ACN에 녹아있는 0.1% TFA을 B 용액으로 사용하였다. 경사용리된 분획물을 각각 220 ㎚로 측정하였다.
도 4는 제조예 1 내지 3으로부터 제조된 아다만탄기를 갖는 알부민과 아다만탄기를 갖지 않는 종래 알부민의 지연 역상-고압 액체 크로마토그래프(HPLC)이다.
도 4에 나타난 바와 같이, 제조예 1 내지 3으로부터 제조된 아다만탄기를 갖는 알부민은 지연 역상-고압 액체 크로마토그래프에서 지연시간은 6.60 분, 7.43 분, 9.08 분인데 반해, 종래 알부민은 지연시간이 5.65 분으로, 아다만탄기의 치환도와 당량이 증가할수록 소수성이 증가함에 따라 지연시간이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 3. 제조예 4로부터 제조된 GC -CD, 순수 CD 및 순수 GC 의 핵자기공명( 1 H NMR) 분석.
핵자기 공명 스펙트럼을 측정하기에 앞서, 제조예 4로부터 제조된 GC-CD와 순수 CD 및 순수 GC를 각각 2 ㎎/㎖ 중수(D2O)에 용해한 뒤 1H 핵자기공명 스펙트럼측정기(Varian Unity-Inova 500, St, Louis, MO)로 측정하고, 각각의 결과 도 5에 나타내었다.
이때, 순수 사이클로덱스트린(CD)은 제조예 4에서 GC와 CD를 혼합하여 GC-CD를 제조하기 전의 사이클로덱스트린 화합물(화학식 2a)과 글라이콜 키토산(화학식 3a)을 의미한다.
도 5는 제조예 4로부터 제조된 GC-CD와 순수 CD 및 순수 GC의 화학 구조식를 확인하기 위하여, 이들 각각에 대해 핵자기공명(1H NMR)으로 측정한 결과 그래프이다.
도 5에 나타난 바와 같이, 제조예 4의 GC-CD는 순수 CD와 순수 GC의 특징적인 피크(peak)를 포함한 핵자기공명 스펙트럼을 나타내는 것을 확인하였다. 이를 통해 제조예 4의 GC-CD가 순수 CD와 순수 GC의 결합을 통해 이루어졌다는 것을 알 수 있고, 동시에 상기 순수 CD와 순수 GC가 숙신산을 링커로 하여 성공적으로 결합되었음을 알 수 있다.
실험예 4. 실시예 1 내지 4로부터 제조된 자가조립 나노복합체의 평균 직경 .
도 6a는 실시예 1 내지 4로부터 제조된 자가조립 나노복합체의 평균 직경을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 6a에 나타난 바와 같이, 실시예 1로부터 제조된 자가조립 나노복합체는 평균 직경이 500 내지 700 ㎚이고, 실시예 2로부터 제조된 자가조립 나노복합체는 평균 직경이 300 내지 400 ㎚이며, 실시예 3으로부터 제조된 자가조립 나노복합체는 200 내지 300 ㎚이며, 실시예 4로부터 제조된 자가조립 나노복합체는 350 내지 450 ㎚였다.
즉, 상기 ADA-HSA 유래의 아다만탄기에 대한, 상기 GC-CD 유래의 사이클로덱스트린의 최종 당량비가 [ADA]:[CD] 점차 증가할수록 자가조립 나노복합체의 평균 직경이 크게 줄었으나, 상기 당량비가 어느 시점에 도달하게 되면 자가조립 나노복합체의 평균 직경이 오히려 증가하는 것을 확인할 수 있다.
이를 통해 실시예 3으로부터 제조된 자가조립 나노복합체가 200 내지 300 ㎚로 EPR effect를 갖기에 가장 적합한 평균 직경인 것을 확인하였고, 이를 위해 요구되는 [ADA]:[CD] 당량비도 확인하였다.
실험예 5. 실시예 1 내지 4로부터 제조된 자가조립 나노복합체의 안정성.
도 6b는 실온에서 장기보관시 용액의 안정성을 비교하기 위하여, 실시예 1 내지 4로부터 제조된 자가조립 나노복합체를 24 시간 상온에 방치하기 전과 후를 촬영하여 나타낸 사진이다.
도 6b에 나타난 바와 같이, 실시예 3으로부터 제조된 자가조립 나노복합체의 경우 24 시간 실온에 방치하여도 용액이 여전히 뿌옇게 유지되고 있고, 이외의 상태 역시 변화가 미미한 것을 확인할 수 있었다. 이는 실시예 3으로부터 제조된 자가조립 나노복합체의 구조에 있어서, 아다만탄기를 갖는 알부민과 사이클로덱스트린이 결합된 글라이콜 키토산 간의 상호작용이 여전히 이루어져 있고, 이로 인해 구형의 나노복합체가 풀어지거나 분해되지 않고 용액 상에서 24 시간 이상 유지하였음을 유추할 수 있다.
이를 통해 상기 (a) 아다만탄기를 갖는 알부민 유래의 아다만탄기에 대한, 상기 자가조립 나노복함체에 포함된 (b) 사이클로 덱스트린이 결합된 글라이콜 키토산 유래의 사이클로덱스트린의 당량비가 1 : 1.5-2.5인 것이 장기간 안정성 측면에서 가장 우수하다는 것을 확인하였다.
만일 상기 (a) 아다만탄기를 갖는 알부민 유래의 아다만탄기에 대한, 상기 자가조립 나노복함체에 포함된 (b) 사이클로 덱스트린이 결합된 글라이콜 키토산 유래의 사이클로덱스트린의 당량비가 1 : 1.5 미만이거나, 1 : 2.5를 초과하는 경우에는 도 5b의 실시예 1, 2, 4로부터 제조된 자가조립 나노복합체와 같이 24 시간 이전에 이미 용액의 상태가 투명해지고, 이는 곧 자가조립 나노복합체가 응집체를 형성해 침전되었다는 것을 의미하는 것이다.
도 6a 및 도 6b의 결과를 종합하면 본 발명의 실시예 3으로부터 제조된 자가조립 나노복합체가 EPR 효과에 적합한 평균 직경을 가지면서도, 실온에서 24 시간이상, 바람직하게는 1 내지 30 시간동안 우수한 콜리이드 안정성을 유지할 수 있음을 확인할 수 있었다.
실험예 6. 사이클로덱스트린과 페놀프탈레인의 초분자 상호작용 증명-자외선 흡수 스펙트럼.
도 7a는 본 발명에 따른 사이클로덱스트린이 수식된 글라이콜 키토산과 페놀프탈레인 간의 분자 상호작용을 확인하기 위해, 0.02 mg/ml 페놀프탈레인과 다양한 농도의 제조예 4로부터 제조된 사이클로덱스트린이 수식된 글라이콜 키토산을 각각 혼합한 후, 이들 각각을 측정하여 나타낸 UV-vis 그래프이다.
도 7a에서 a 그래프는 제조예 4로부터 제조된 사이클로덱스트린이 결합된 글라이콜 키토산이 0 ㎎/㎖ 사용된 것이고, b 그래프는 제조예 4로부터 제조된 사이클로덱스트린이 결합된 글라이콜 키토산이 1.0 ㎎/㎖ 사용된 것이며, 제조예 4로부터 제조된 사이클로덱스트린이 결합된 글라이콜 키토산이 1.5 ㎎/㎖ 사용된 것이며, 제조예 4로부터 제조된 사이클로덱스트린이 결합된 글라이콜 키토산이 3.0 ㎎/㎖ 사용된 것이다.
UV-Vis 그래프는 Infinite 200 PRO Microplate Reader(Tecan Genios, Durham, NC)을 사용하여 350 내지 650 ㎚의 흡수파장 영역에서의 피크를 측정 및 기록하였다.
도 7a에 나타난 바와 같이, 사이클로덱스트린이 결합된 글라이콜 키토산(제조예 4)과 페놀프탈레인을 단순 혼합하였을 때(이때 페놀프탈레인의 농도는 고정하고, GC-CD의 농도는 증가시킴), 사이클로덱스트린과 페놀프탈레인이 서로 상호작용하고 있음을 확인할 수 있다.
구체적으로 사이클로덱스트린과 페놀프탈레인은 상기 사이클로덱스트린의 내부 공간에 상기 페놀프탈레인이 봉입되는 상호작용을 통해 결합관계를 형성하기 때문에, 봉입된 페놀프탈레인은 UV 흡광도 피크가 관찰되지 않는다.
도 7a에서 사이클로덱스트린이 수식된 글라이콜 키토산의 농도가 증가함에 따라 페놀프탈레인의 UV 흡광도가 비례하여 저하되는 것이 관찰되기 때문에, 본 발명에 따른 사이클로덱스트린이 수식된 글라이콜 키토산은 효과적으로 페놀프탈레인과 상호작용을 형성하고 있음을 알 수 있는 것이다.
실험예 7. 아다만탄과 사이클로덱스트린의 초분자 상호작용 증명-자외선 흡수 스펙트럼.
도 7b는 본 발명에 따른 자가조립 나노복합체를 구성하는 아다만탄과 사이클로덱스트린 간의 초분자 상호작용이 형성되었는지를 확인하기 위해, 0.01 ㎎/㎖ 페놀프탈레인, 제조예 4로부터 제조된 사이클로덱스트린이 결합된 글라이콜 키토산 1.0 ㎎/㎖l 및 다양한 농도의 제조예 2로부터 제조된 아다만탄기를 갖는 알부민 용액(HSA-ASA26)을 각각 혼합한 후, 이들 각각을 측정하여 나타낸 UV-vis 그래프이다.
UV-Vis 그래프는 Infinite 200 PRO Microplate Reader(Tecan Genios, Durham, NC)을 사용하여 350 내지 650 ㎚의 흡수파장 영역에서의 피크를 측정 및 기록하였다.
도 7b에서 a 그래프는 제조예 2로부터 제조된 아다만탄기를 갖는 알부민 용액(HSA-ASA26)을 0 ㎎/㎖ 사용한 것이고, b 그래프는 제조예 2로부터 제조된 아다만탄기를 갖는 알부민 용액(HSA-ASA26)을 0.2 ㎎/㎖ 사용한 것이며, 제조예 2로부터 제조된 아다만탄기를 갖는 알부민 용액(HSA-ASA26)을 0.4 ㎎/㎖ 사용한 것이며, 제조예 2로부터 제조된 아다만탄기를 갖는 알부민 용액(HSA-ASA26)을 1.0 ㎎/㎖ 사용된 것이다.
도 7b에 나타난 바와 같이, 제조예 2로부터 제조된 아다만탄기를 갖는 알부민 용액(HSA-ASA26)의 농도가 증가함에 따라 결합상수가 높은 아다만탄기와 사이클로덱스트린의 상호작용이 더욱 커지고 있음을 알 수 있다.
이때, 페놀프탈레인은 UV-Vis 흡수를 나타내는 흡수단 역할을 하는 것으로, 자가조립 나노복합체 내에 봉입되지는 않고, 상기 사이클로덱스트린에 대해 아다만탄과 경쟁적으로 상호작용을 한다.
실험예 8. 실시예 4의 자가조립 나노복합체( GC -CD/ HSA -ADA NPs ) 및 실시예 5로부터 제조된 항암제가 봉입된 자가조립 나노복합체의 특성 확인
도 8a는 실시예 5로부터 제조된 항암제가 봉입된 자가조립 나노복합체의 고분해능 투과전자현미경 사진이다.
실시예 5로부터 제조된 항암제가 봉입된 자가조립 나노복합체를 10 ㎕의 1% 포스포텅스텐산(phosphotungstric acid)로 3 차례에 걸쳐 염색(negative staining)한 후, 건조하였고, 이를 JEM ARM 200F 투과전자현미경(TEM)으로 촬영하였다.
도 8b는 실시예 5로부터 제조된 항암제가 봉입된 자가조립 나노복합체의 평균 직경을 나타낸 그래프이고, 도 8c는 실시예 5로부터 제조된 항암제가 봉입된 자가조립 나노복합체의 제타 전위를 측정하여 나타낸 그래프이다.
평균 입경과 제타 전위는 Zetasizer Nano-ZS90 (Malvern Instruments, Malvern, UK)을 사용하여 633 ㎚ 파장의 헬륨-네온 레이저 빔을 90°의 산란각으로 측정하였다.
도 8b 및 도 8c에 나타난 바와 같이, 실시예 5로부터 제조된 항암제가 봉입된 자가조립 나노복합체의 평균 직경은 200 내지 300 ㎚인 것을 다시 한번 확인하였다.
또한 실시예 5로부터 제조된 항암제가 봉입된 자가조립 나노복합체의 표면 제타 전위는 1 내지 15 ㎷, 바람직하게 5 내지 15 mV, 구체적으로 11.5 ㎷인 것을 확인하였다.
도 9a는 실시예 4로부터 제조된 자가조립 나노복합체(GC-CD/HSA-ADA NPs)의 평균 직경을 나타낸 그래프이고, 도 9b는 실시예 4로부터 제조된 자가조립 나노복합체(GC-CD/HSA-ADA NPs)의 제타 전위를 측정하여 나타낸 그래프이다.
평균 입경과 제타 전위는 Zetasizer Nano-ZS90 (Malvern Instruments, Malvern, UK)을 사용하여 633 ㎚ 파장의 헬륨-네온 레이저 빔을 90°의 산란각으로 측정하였다.
도 9a 및 도 9b에 나타난 바와 같이, 실시예 4로부터 제조된 자가조립 나노복합체의 평균 직경은 200 내지 300 ㎚인 것을 다시 확인하였다.
또한 실시예 4로부터 제조된 자가조립 나노복합체의 표면 제타 전위는 1 내지 15 mV로, 바람직하게는 5 내지 15 mV, 구체적으로 5.93 mV인 것을 확인하였다.
실험예 9. 제조예 2로부터 제조된 HSA - ADA 26 , 제조예 4로부터 제조된 GC -CD의 특성 확인
도 10a는 제조예 2로부터 제조된 아다만탄기를 갖는 알부민 용액(HSA-ADA26)의 평균 직경을 나타낸 그래프이고, 도 10b는 제조예 2로부터 제조된 아다만탄기를 갖는 알부민 용액(HSA-ADA26)의 제타 전위를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 10a 및 도 10b에 나타난 바와 같이 제조예 2로부터 제조된 아다만탄기를 갖는 알부민은 평균 직경이 4.67 ㎚이였고, 표면 전위는 - 34.0 mV로 음전하를 띄고 있음을 확인하였다.
도 11a는 제조예 4로부터 제조된 사이클로덱스트린이 결합된 글라이콜 키토산(GC-CD)의 평균 직경을 나타낸 그래프이고, 도 11b는 제조예 4로부터 제조된 사이클로덱스트린이 결합된 글라이콜 키토산(GC-CD)의 제타 전위를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 11a 및 도 11b에 나타난 바와 같이 제조예 4로부터 제조된 사이클로덱스트린이 결합된 글라이콜 키토산(GC-CD)은 평균 직경이 15.77 ㎚이였고, 제타 전위는 16.2 mV로 양전하를 띄고 있었다.
다시 말해, 도 8, 9, 10 및 11을 종합하면 제조예 4로부터 제조된 사이클로덱스트린이 결합된 글라이콜 키토산(GC-CD)이 양전하를 듸고 있고, 제조예 2로부터 제조된 아다만탄기를 갖는 알부민 용액(HSA-ADA26)가 음전하를 띄고 있는데, 실시예 4와 실시예 5의 자가조립 나노복합체는 양전하를 갖고 있음을 확인하였다.
이러한 결과를 통해 실시예 4와 실시예 5의 자가조립 나노복합체는 아다만탄기를 갖는 알부민(HSA-ADA26)을 사이클로덱스트린이 결합된 글라이콜 키토산(GC-CD)이 둘러싸고 있는 구조로 형성되어 있기 때문에 양전하를 띄고 있다고 유추할 수 있다.
본 발명에 따른 자가조립 나노복합체는 양전하를 띄고 있기 때문에, 상기 자가조립 나노복합체 간의 반발력이 존재하기 때문에, 용액 상에서 안정적으로 분산되어 있는 장점을 갖는다.
실험예 10. 제조예 2로부터 제조된 HSA - ADA 26 와 사이클로덱스트린 화합물을 혼합한 경우, 제조예 4로부터 제조된 GC -CD와 알부민을 혼합한 경우 및 실시예 4로부터 제조된 자가조립 나노복합체의 상호작용 여부 확인
도 12는 제조예 4로부터 제조된 GC-CD와 알부민(HSA)을 혼합한 경우, 제조예 2로부터 제조된 HSA-ADA26와 사이클로덱스트린 화합물을 혼합한 경우 및 실시예 4로부터 제조된 자가조립 나노복합체의 용액을 촬영한 사진이다. 상기 용액들의 변화를 통해 나노입자가 생성되었는지 여부를 확인할 수 있다.
도 12에 나타난 바와 같이, 상기 제조예 4로부터 제조된 GC-CD와 알부민(HSA)을 혼합한 경우(HSA+GC-CD)의 용액은 변화가 전혀 관찰되지 않고, 투명한 것을 확인하였다.
상기 제조예 2로부터 제조된 HSA-ADA와 사이클로덱스트린 화합물을 혼합한 경우(HSA-ADA+GC)의 용액 역시 변화가 전혀 관찰되지 않고, 투명하게 유지되는 것을 확인하였다.
반면 실시예 4로부터 제조된 자가조립 나노복합체의 용액은 불투명하게 변해있는 것을 확인할 수 있었다.
이를 통해 사이클로덱스트린과 아다만탄이 존재한다고 하여 약물을 봉입할 수 있는 구형의 나노복합체가 제조되는 것은 아니라는 것을 확인하였다. 구체적으로 아다만탄 분자 또는 사이클로덱스트린 분자 중 어느 하나라도 존재하지 않으면 구형의 나노복합체가 형성되지 않는 문제가 있음을 확인하였다.
즉 본 발명에서와 같이 사이클로덱스트린이 결합된 글라이콜 키토산(GC-CD)과 아다만탄기를 갖는 알부민(HSA-ADA)의 결합을 통해서만 약물을 봉입할 수 있는 구형의 나노복합체를 제조할 수 있다.
실험예 11. 실시예 5로부터 제조된 항암제가 봉입된 자가조립 나노복합체로부터 항암제의 방출 양상.
도 13은 실시예 5로부터 제조된 항암제가 봉입된 자가조립 나노복합체로부터 방출되는 항암제 양을 시간에 따라 측정하여 나타낸 그래프이다.
실시예 5로부터 제조된 항암제가 봉입된 자가조립 나노복합체로부터 방출되는 항암제 양을 측정하기 위하여, 우선 실시예 5로부터 제조된 항암제가 봉입된 자가조립 나노복합체 용액을 2 ㎖의 투석백(MwCO 10 kDa)에 넣고 밀봉한 다음, 이를 200 ㎖ PBS가 담겨있는 비커 안에 넣어 고정시킨 뒤 37 ℃에서 24 시간동안 방치(incubation)하는데, 방치되는 동안 시간별(0, 1, 2, 3, 6, 9, 12, 18 및 24 시간)로 상기 투석백 외부에 존재하는 PBS 2 ㎖를 채취하여, 독소루비신의 양을 480 ㎚ 파장으로 측정하여 도 13의 Dox(NPs)로 결과를 도시하였다.
이때, 시료로 2 ㎖ PBS를 채취하고 난 후, 다시 채취한 부피만큼 새로운 PBS를 채워, 항상 투석백 외부에 존재하는 PBS가 동일한 부피를 유지하도록 하였다.
독소루비신은 Infinite 200 PRO Microplate Reader(Tecan Genios, Durham, NC)를 사용하여 UV-Vis 492 ㎚에서 흡광도를 측정하여 정량하였다. 이것을 상대값으로 하여 계산된 방출 양상을 도시하였다.
대조군(Dox(free))으로 실시예 5로부터 제조된 항암제가 봉입된 자가조립 나노복합체 대신에 순수 독소루비신 용액(0.14 ㎎/㎖)을 투석백에 넣은 것을 제외하고는 상기 도 9의 실험과 동일하게 하였고, 도 9의 Dox(free)에 결과를 도시하였다.
누적 방출양(cumulative percent(%))은 아래 식 1을 통해 계산하였다.
[식 1]
{각 시간별 측정한 투석백 외부로 방출된 독소루비신 양}/{초기 투석백 내부에 존재하는 독소루비신 양} * 100
도 13에 나타난 바와 같이, 실시예 5로부터 제조된 항암제를 봉입한 자가조립 나노복합체는 1 시간부터 방출이 되기 시작하지만, 3시간 까지 최대 60% 까지만 방출되며, 3 시간 이후부터는 서서히 방출이 진행되어 24시간 까지 80%까지만 방출되는 것을 확인하였다.
이에 반해 대조군은 1 시간에 이미 60% 이상 방출이 되었고, 3 시간 이전에 100% 방출되어버린 것을 확인하였다.
본 발명에 따른 자가조립 나노복합체를 이용할 경우, 내부에 봉입된 약물의 방출속도가 24 시간동안 서서히 유지되고 있다는 것을 확인하였다.
실험예 12. 실시예 5로부터 제조된 항암제가 봉입된 자가조립 나노복합체의 안정성.
도 14는 실시예 5로부터 제조된 항암제가 봉입된 자가조립 나노복합체의 시간에 따른 평균 입경 변화를 나타낸 그래프이다.
이를 위해 우선 실시예 5로부터 제조된 항암제가 봉입된 자가조립 나노복합체를 10 mM PBS(pH 7.4)에 재분산한 후, 37 ℃에서 48 시간동안 방치하였다.
이때 상기 방치되는 시간(0, 3, 6, 9, 12, 24 및 48 시간)에 따라 Zetasizer Nano-ZS90 (Malvern Instruments, Malvern, UK)을 사용하여 실시예 5로부터 제조된 항암제가 봉입된 자가조립 나노복합체의 평균 입경을 측정하였다.
상기 Zetasizer Nano-ZS90 (Malvern Instruments, Malvern, UK)는 633 ㎚ 파장의 헬륨-네온 레이저 빔을 90ㅀ의 산란각을 측정하였다.
도 14에 나타난 바와 같이, 실시예 5로부터 제조된 항암제가 봉입된 자가조립 나노복합체는 처음 0 내지 12시간까지는 평균 입경이 변화가 주기적으로 관찰되었으나, 12시간 이후부터는 유지되고 있음을 확인하였다.
또한 상기 평균 입경의 변화 범위가 200 내지 300 ㎚ 범위이므로, 구조적 형태가 변화하는 정도의 유의한 차이 이상으로는 변화하지 않는 것을 알 수 있다. 이로부터 본 발명에 따른 자가조립 나노복합체는 48 시간 이상, 바람직하게는 1 내지 50 시간 동안 구조적 안정성을 가지고 있는 것을 확인할 수 있다.
실험예 13. 암세포에 대한 실시예 5로부터 제조된 항암제가 봉입된 자가조립 나노복합체의 생장저해 효과.
도 15a는 폐암 세포주(A549)에서의 실시예 5로부터 제조된 항암제가 봉입된 자가조립 나노복합체의 세포독성을 나타낸 그래프이고, 도 15b는 대장암 세포주(HCT116)에서의 실시예 5로부터 제조된 항암제가 봉입된 자가조립 나노복합체의 세포독성을 나타낸 그래프이다.
다만 본 실험예 12에서 사용된 실시예 5로부터 제조된 항암제가 봉입된 자가조립 나노복합체는 봉입된 독소루비신의 함량을 0.01 내지 10 ㎍/㎖로 다양하게 조절하여 제조한 것을 사용하였다. 구체적으로 실시예 5의 방법 중 혼합되는 독소루비신의 함량을 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5 및 10 ㎍/㎖로 한 것을 제외하고는 실시예 5와 모두 동일하게 하여 다양한 함량의 독소루비신이 봉입된 자가조립 나노복합체를 제조하였고, 이를 이용하여 시료로 사용하여 세포독성을 실험하였다.
이를 측정하기 위해 우선, 폐암 세포(A549) 또는 대장암 세포주(HCT116)를 RPMI 1640 배지(1% 페니실리/스트렙토마이신을 포함하는 10%(v/v) FBS)에 5% 이산화탄소 95% 상대습도, 37 ℃에서 24 웰 플레이트에서 배양한 후, 각 웰로부터 배지를 제거하고, 다양한 함량의 독소루비신이 봉입된 자가조립 나노복합체를 처리하고, 24 시간 동안 배양한 다음 세포 생존력(cell viability)을 MTT 분석법을 통해 측정하여 도 15a, b에 Dox(NPs)로 기재하였다.
MTT 분석법은 A549(폐암 세포) 또는 대장암 세포주(HCT116)에서의 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)-based assay를 통해 측정하는 것이다.
이때 대조군(Dox(free))은 세포에 독소루비신이 봉입된 자가조립 나노복합체를 처리하는 대신에 순수 독소루비신을 처리한 것을 제외하고는 모두 동일하게 하여, 세포 생존력을 측정한 것이다.
도 15a 및 도 15b에 나타난 바와 같이, 폐암 세포(A549)와 대장암 세포주(HCT116)에 대해, 본 발명에 따른 자가조립 나노복합체에 항암제를 봉입한 경우가 순수 독소루비신을 직접 처리한 경우보다 암의 세포 생존력을 훨씬 저하시키고 있다는 것을 알 수 있다.
실험예 14. 인 비보( in vivo )에서의 실시예 5로부터 제조된 항암제가 봉입된 자가조립 나노복합체의 암세포 표적지향성.
대장암 세포주(HCT116)들을 12 웰(well, 1×105 세포/웰(well))의 커버 글라스 위에 분주하여 24 시간 동안 미리 배양하였다. 다음으로 1%(v/v) FBS를 포함하는 DMEM 900 μl 배지로 교체하고, 100 μl 실시예 5의 항암제가 봉입된 자가조립 나노복합체(1 μg/ml의 독소루비신(항암제)이 봉입됨) 또는 100 μl 음성대조군(control(Non-treat)) 또는 100 μl 양성대조군(Dox(free) 1㎍/㎖)을 4 시간 동안 처리하였다.
상술한 과정을 통해 100 μl 실시예 5의 항암제가 봉입된 자가조립 나노복합체(1 μg/ml의 독소루비신(항암제)이 봉입됨) 또는 100 μl 음성대조군(control(Non-treat)) 또는 100 μl 양성대조군(Dox(free) 1㎍/㎖)을 처리한 세포들을 DPBS로 세척하고, 4% 포름알데하이드(formaldehyde)로 고정한 다음, 세포의 엔도좀(endosomes)과 핵(nuclei)을 각각 Lysotrackerㄾ green DND-26 (green fluorescent dye, Molecular Probe)과 DAPI(blue fluorescent dye, Sigma)로 매뉴얼에 따라 염색하였다. 세포의 세포질 내로 흡수된 독소루비신의 경우 붉은 형광 신호를 자체적으로 나타내기 때문에 추가적인 염색없이 확인이 가능하다. 상기 염색이 완료된 후, 세포를 CLSM Image Browser software (Zeiss)를 사용하여 형광 이미지를 분석하였다.
음성대조군은 아무것도 처리하지 않은 것이고, 양성대조군은 순수 독소루비신 1 ㎍/㎖으로만 처리한 것이다.
도 16은 실시예 5로부터 제조된 항암제가 봉입된 자가조립 나노복합체 또는 음성대조군 또는 양성대조군으로 처리한 후, 염색한 대장암 세포주(HCT116)의 형광 이미지이다.
도 16에 나타난 바와 같이, 실시예 5의 항암제가 봉입된 자가조립 나노복합체로 처리한 대장암 세포주는 독소루비신이 DAPI로 염색한 세포질 내부에 위치하고 있는 것을 확인하였다.
이에 반해, 음성대조군은 독소루비신이 세포질 내외에서 전혀 검출되지 않았고, 양성대조군에서는 미미한 양이 세포 내에서 검출되고 있음을 확인하였다.
이러한 결과를 통해 본 발명에 따른 자가조립 나노복합체 내에 약물을 봉입하여 세포에 투여할 경우, 약물을 직접 세포로 투여하는 경우와 달리, 내포작용(endocytosis)에 의해서 독소루비신이 보다 효율적으로 세포내로 유입되고, 핵으로 방출되고 있음을 알 수 있다.
다시 말해, 약물을 직접 투여하는 것보다 본 발명에 따른 자가조립 나노복합체 내에 약물을 봉입하여 투여할 경우, 약물의 세포질 흡수(cellular uptake)를 매우 향상시킬 수 있음을 확인하였다.
또한, 본 발명에 따른 자가조립 나노복합체에 약물을 봉입할 경우, 암세포에 대한 표적지향성이 우수하다는 것을 확인하였다.
실험예 15. 인 비트로(in vitro)에서 실시예 5로부터 제조된 항암제가 봉입 된 자가조립 나노복합체의 암세포 표적지향성.
도 17은 대장암이 유발된 마우스 모델(Five-week-old, nude, male BALB/c nu/nu mice)(Hanlim Experimental Animal Laboratory (Seoul, South Korea))에서의 cy5.5로 라벨링된 실시예 5로부터 제조된 항암제가 봉입된 자가조립 나노복합체의 시간별 이동경로를 촬영하여 나타낸 형광이미지이다.
우선, 새롭게 배양한(freshly harvested) 대장암 세포(HCT 116)(4×106 세포/마우스, 100 μl 주입량)를 BALB/c nu / nu mice로 피하 접종한 후, 4 주 동안 키워 대장암이 유발된 마우스 모델을 준비하였다.
상기 대장암이 유발된 마우스 모델에 cy5.5로 라벨링된 실시예 5로부터 제조된 항암제가 봉입된 자가조립 나노복합체 50 ㎕을 꼬리 정맥을 통해 주입하였다. 주입한 후 3, 6, 9, 12 및 24 시간에 걸쳐 cy5.5로 라벨링된 실시예 5로부터 제조된 항암제가 봉입된 자가조립 나노복합체가 암세포 부위를 구획화(localization)하는 것을 Optix MX3 in vivo imaging system (Advanced Research Technologies, Saint-Laurent, Quebec, Canada)을 사용하여 형광이미지를 촬영하였고, 그 결과를 도 17에 나타내었다.
이때 cy5.5로 라벨링된 실시예 5로부터 제조된 항암제가 봉입된 자가조립 나노복합체는 실시예 5로부터 제조된 항암제가 봉입된 자가조립 나노복합체에 Cyc5.5 NHS ester dye (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) 수용액을 첨가한 후, 3 시간 동안 반응시켜 제조하였다.
도 17에 나타난 바와 같이, cy5.5로 라벨링된 실시예 5로부터 제조된 항암제가 봉입된 자가조립 나노복합체는 대장암이 유발된 마우스 모델에 주입된 후, 6 시간이 지나자 간세포와 암세포 부위에서 관찰되었고, 12 시간, 24 시간이 지나자 간세포에서의 형광 강도는 점차 작아지고, 암세포 부위에서만 강한 형광 강도가 관찰되었다.
이러한 결과를 통해 처음 주입하고 나서 간세포, 암세포에 본 발명에 따른 자가조립 나노복합체가 위치하였으나(이때에도 간세포보다 암세포에서 자가조립 나노복합체의 농도가 가장 강한 것을 확인할 수 있다), 시간이 지날수록 본 발명에 따른 자가조립 나노복합체는 암세포에만 축적되고 있음을 알 수 있다.
즉, 본 발명에 따른 자가조립 나노복합체는 생체 내 실험을 통해 암세포에 대한 표적지향성이 매우 우수한 것을 확인하였다.

Claims (20)

  1. (a) 아다만탄기를 갖는 알부민 및
    (b) 사이클로덱스트린이 결합된 글라이콜 키토산을 포함하고,
    상기 (a)의 아다만탄기와 (b)의 사이클로덱스트린이 소수성 상호작용에 의해 결합된 것인, 자가조립 나노복합체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 (a) 아다만탄기를 갖는 알부민의 평균분자량은 70000 내지 80000 MW인 것을 특징으로 하는 자가조립 나노복합체.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 (a) 아다만탄기를 갖는 알부민의 아다만탄기 치환도는 10 내지 50인 것을 특징으로 하는 자가조립 나노복합체.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 (a) 아다만탄기를 갖는 알부민은 하기 화학식 Ⅰ로 표시하는 것을 특징으로 하는 자가조립 나노복합체.
    [화학식 Ⅰ]
    Figure 112018054692302-pat00020

    상기 화학식 Ⅰ에서,
    ADA는 아다만탄기이고,
    L1은 링커 또는 직접 결합이며,
    상기 링커는 상기 아다만탄기와 알부민 사이에 가교결합을 형성하는 것으로서 옥살산, 말론산, 말릭산, 숙신산, 글루타르산, 글루탐산, 아디프산, 세바코일산, 수베르산, 도데카노산, 푸마르산, 말레이산, 프탈산 및 테레프탈산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 생분해성 디카르복실기 링커이며,
    상기 n은 1 내지 56의 정수이다.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 ADA는 하기 화학식 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 자가조립 나노복합체.
    [화학식 1]
    Figure 112016046536678-pat00021

    상기 화학식 1에서,
    X1은 아민기 또는 C1 내지 C4 알킬아민기 중에서 선택되는 어느 하나이다.
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서,
    상기 (b) 사이클로덱스트린이 결합된 글라이콜 키토산은 하기 화학식 Ⅱ로 표시되는 것을 특징으로 하는 자가조립 나노복합체.
    [화학식 Ⅱ]
    Figure 112018054692302-pat00022

    상기 화학식 Ⅱ에서,
    R2 및 R3는 서로 같거나, 서로 상이하거나 각각 독립적으로, *-O-R4-OH 중에서 선택되고,
    상기 R4는 C1 내지 C4의 알킬기이다.
    L2는 링커 또는 직접 결합이며,
    상기 링커는 상기 사이클로덱스트린과 글라이콜 키토산 사이에 가교결합을 형성하는 것으로서, 옥살산, 말론산, 말릭산, 숙신산, 글루타르산, 글루탐산, 아디프산, 세바코일산, 수베르산, 도데카노산, 푸마르산, 말레이산, 프탈산 및 테레프탈산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 생분해성 디카르복실기를 포함하는 물질이며,
    CD는 사이클로덱스트린 또는 상기 사이클로덱스트린의 하이드록실기 중 어느 하나가 아민기로 치환된 사이클로덱스트린이고,
    o, p는 각각 10 내지 3000의 정수이다.
  8. 삭제
  9. 제1항에 있어서,
    상기 자가조립 나노복합체의 평균 직경은 200 내지 300 ㎚인 것을 특징으로 하는 자가조립 나노복합체.
  10. ⅰ) 아다만탄 화합물에 옥살산, 말론산, 말릭산, 숙신산, 글루타르산, 글루탐산, 아디프산, 세바코일산, 수베르산, 도데카노산, 푸마르산, 말레이산, 프탈산 및 테레프탈산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 생분해성 디카르복실기를 포함하는 물질인 제1 링커를 결합시키는 단계;
    ⅱ) 상기 아다만탄 화합물과 제1 링커의 결합체에 알부민을 결합시켜, (a) 아다만탄기를 갖는 알부민을 제조하는 단계;
    ⅲ) 사이클로덱스트린 화합물에 옥살산, 말론산, 말릭산, 숙신산, 글루타르산, 글루탐산, 아디프산, 세바코일산, 수베르산, 도데카노산, 푸마르산, 말레이산, 프탈산 및 테레프탈산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 생분해성 디카르복실기를 포함하는 물질인 제2 링커를 결합시키는 단계;
    ⅳ) 상기 사이클로덱스트린 화합물과 제2 링커의 결합체에 글라이콜 키토산을 결합시켜 (b) 사이클로덱스트린이 결합된 글라이콜 키토산을 제조하는 단계;
    ⅴ) 상기 ⅳ) 단계를 통해 제조된 (b) 사이클로덱스트린이 결합된 글라이콜 키토산에 상기 ⅱ) 단계를 통해 제조된 (a) 아다만탄기를 갖는 알부민을 서서히 첨가하여 반응시키는 단계; 및
    ⅵ) 상기 ⅴ) 단계의 반응물에 초음파를 조사하는 단계;를 포함하는 자가조립 나노복합체의 제조방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 제1 링커와 제2 링커는 서로 동일하거나, 서로 상이한 생분해성 디카르복실기 링커인 것을 특징으로 하는 자가조립 나노복합체의 제조방법.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 ⅰ) 단계에서 상기 아다만탄 화합물과 상기 링커의 당량비는 상기 아다만탄 화합물 1 당량을 기준으로 하여 상기 링커 1 내지 4 당량 범위로 혼합하는 것을 특징으로 하는 자가조립 나노복합체의 제조방법.
  13. 제10항에 있어서,
    상기 ⅰ) 단계에서 상기 아다만탄 화합물은 하기 화학식 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 자가조립 나노복합체의 제조방법.
    [화학식 1]
    Figure 112016046536678-pat00023

    상기 화학식 1에서
    X1은 C1 내지 C4 알킬아민기 중에서 선택되는 어느 하나이다.
  14. 제10항에 있어서,
    상기 ⅱ) 단계에서 상기 아다만탄 화합물과 링커의 결합체;와 알부민의 당량비는 상기 아다만탄 화합물과 링커의 결합체 1 당량을 기준으로 상기 알부민 20 내지 80 당량 범위로 혼합되는 것을 특징으로 하는 자가조립 나노복합체의 제조방법.
  15. 제10항에 있어서,
    상기 알부민은 소혈청 알부민(BSA), 오브알부민(ovalbumin) 및 인간 혈청 알부민(HSA)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 자가조립 나노복합체의 제조방법.
  16. 제10항에 있어서,
    상기 ⅴ) 단계에서 상기 (a) 아다만탄기를 갖는 알부민 유래의 아다만탄기에 대한, 상기 자가조립 나노복함체에 포함된 (b) 사이클로 덱스트린이 결합된 글라이콜 키토산 유래의 사이클로덱스트린의 당량비는 1 : 1.5-2.5인 것을 특징으로 하는 자가조립 나노복합체의 제조방법.
  17. 제10항에 있어서,
    상기 ⅵ) 단계에서 초음파는 10 내지 30 kHz 주파수, 25% 내지 50% 출력 진폭(Amplitude)로 수행되는 것을 특징으로 하는 자가조립 나노복합체의 제조방법.
  18. 제1항에 따른 자가조립 나노복합체를 포함하고,
    상기 자가조립 나노복합체 내에 독소루비신, 캄포테칸, 이리노테칸, 파클리탁셀 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상의 물질이 봉입되어 있는 것을 특징으로 하는 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  19. 삭제
  20. 제18항에 있어서,
    상기 암은 폐암, 비소세포성 폐암, 결장암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 피부 또는 안구 내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 위암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS; central nervous system) 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나이상인 것을 특징으로 하는 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
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