KR101797829B1 - 표면전하 전환형 약물전달용 나노입자 및 이의 제조방법 - Google Patents

표면전하 전환형 약물전달용 나노입자 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명의 여러 구현예에 따르면, 암 질환 부위가 갖고 있는 특이적 약산성 조건(pH 6.0 내지 7.0에서 보다 바람직하게는 pH 6.5 내지 6.8)에서만 상기 약물전달용 나노입자의 표면이 세포 내로 효과적으로 침투할 수 있는 양전하로 변환되기 때문에, 암세포 특이적으로 반응하여 효과적으로 약물을 암세포로 전달하는 효과를 달성할 수 있다.
즉, 본 발명에 따른 상기 약물전달용 나노입자는 암세포가 가지고 있는 특이적인 조건에서 활성화될 수 있기 때문에, 매우 효과적으로 암세포에만 약물을 전달할 수 있다.

Description

표면전하 전환형 약물전달용 나노입자 및 이의 제조방법{surface charge conversion type nanoparticles for drug delivery and manufacturing method thereof}
본 발명은 담즙산, 이황화 화합물 및 음전하 생성용 화합물이 폴리에틸렌이민 골격에 치환되어 있는 고분자로 이루어진 코어-쉘 구조의 약물전달용 나노입자에 관한 것으로, 상세하게 암 질환 부위의 환경조건에 대해 특이적으로 반응하여, 암세포 내로 선택적으로 약물을 전달함으로써, 약물의 치료효과를 극도로 향상시키는 약물전달용 나노입자 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
항암 효과를 갖는 소수성 약물을 효과적으로 암조직에 전달할 수 있는 약물전달체로, 다양한 고분자 나노입자가 개발되어 왔다. 이러한 나노크기의 입자 내에 소수성 약물이 봉입됨에 따라, 약물의 용해성을 향상시키고, 부가효과를 감소시키며, 암조직으로의 침투성과 생체 내에서 안정성을 증가시켰다. 또한, 소수성 약물을 효과적으로 암조직에 축적시킬 수 있다.
이러한 고분자 나노입자들 중에서도 암 질환부위에서의 다양한 환경조건(저산소, pH, 특이적 효소, 전위 등)을 인지할 수 있는 자극 감응성 나노입자(stimuli-responsive nanoparticles)에 대한 많은 관심이 집중되고 있다.
더욱이, 암세포 내부에 존재하는 pH 구배 및 높은 글루타치온(glutathione) 농도 등의 특이적 환경요인들을 이용하여, 나노입자의 내부 결합 깨짐 또는 분해를 야기함으로써, 암세포 내에서 선택적으로 약물을 방출할 수 있는 시스템을 구축하는데 많은 연구가 이루어져 왔다.
이러한, 고분자 나노입자로부터 상술한 암세포 특이적 약물 전달 효율을 증대시키기 위해서는 나노입자의 구조, 크기, 표면전하 및 형태와 같은 다양한 물리화학적 특성에 많은 영향을 받는다.
특히 표면전하의 경우, 약물을 봉입한 나노입자와 세포간의 상호작용으로 인해, 침투력 및 안정성에 많은 영향을 미치는 요인으로, 이러한 고분자 나노입자의 표면전하를 양전하를 띄게 함으로써, 음의 전하를 띄는 세포막과의 상호작용을 통해 세포로 깊게 침투하여 약물을 효과적으로 세포에 전달할 수 있는 예가 공지되어 있다. 허나, 이러한 장래성에도 불구하여, 양전하를 띄는 표면으로 인해 인체 내 혈관에 존재하는 다양한 생체분자들에 대해서 비특이적으로 상호작용을 형성하기 때문에, 세포독성을 나타내게 되는 큰 문제가 존재한다.
반면, 음 표면전하를 갖도록 제조된 고분자 나노입자의 경우에는 생체 혈관 속에서 이동속도가 현저히 느려지게 되고, 안정성이 낮아 세포로 약물을 효과적으로 전달하기에 적합하지 않다.
이러한 다수의 시도에도 불구하고, 암 세포 내로 약물을 전달하기 위한 전반적인 각 과정에 따라 특이적으로 표면 특성을 변화할 수 있는 다중 기능적인 전달체에 특성화된 나노입자는 보고된 바 없다.
대한민국 등록특허 제10-1570300호
본 발명의 목적은 암 질환부위의 환경조건에 특이적으로 표면전하가 변환되는 약물전달용 나노입자를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 약물전달용 나노입자를 대량 생산할 수 있는 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 대표적인 일 측면에 따르면, 평균 분자량이 400 내지 30000 달톤(Da)인 선형 또는 분지형의 폴리에틸렌이민을 골격으로 하고,
상기 폴리에틸렌이민의 골격 내 1 이상의 아미노기의 수소는 (a) 담즙산 (b) 이황화 화합물 및 (c) 음전하 생성용 화합물;중에서 1종 이상으로 치환되어 있는 것을 특징으로 하는 고분자로 이루어지고,
상기 (b) 이황화 화합물은 이황화결합을 포함하고, 상기 골격인 폴리에틸렌이민의 아미노기와 반응이 가능한 하나의 카르복시기 또는 설포네이트기를 갖는 것을 특징으로 하며,
상기 (c) 음전하 생성용 화합물은 pKa가 6 내지 6.8인 것을 특징으로 하는 코어-쉘 구조의 약물전달용 나노입자에 관한 것이다.
상기 약물전달용 나노입자는 상기 (b) 이황화 화합물 간에 형성되는 이황화 결합을 통해 상기 고분자 간에 형성된 가교결합에 의해 상기 약물전달용 나노입자의 코어가 형성되는 것을 특징으로 한다.
상기 약물전달용 나노입자의 쉘층은 pH 7.2 내지 8.0에서 음전하를 나타내는 것일 수 있다.
상기 약물전달용 나노입자의 쉘층은 pH 7.2 내지 8.0에서 - 30 내지 - 10 mV 표면전하를 갖는 것일 수 있다.
상기 약물전달용 나노입자의 코어의 외면은 양전하를 나타내는 것일 수 있다.
상기 약물전달용 나노입자의 평균 입경은 50 내지 300 ㎚일 수 있다.
상기 약물전달용 나노입자는 상기 폴리에틸렌이민의 아미노기와 상기 (c) 음전하 생성용 화합물 간에 아마이드 결합이 형성되고, 상기 아미이드 결합은 pH 6.0 내지 6.8에서 가수분해가 되는 것을 특징으로 한다.
상기 음전하 생성용 화합물은 maleic anhydride, 1,2-cis-cyclopentanedicarboxylic anhydride, 1,2-cis-cyclohexanedicarboxylic anhydride 및 citraconic anhydride으로 이루어진 dicarboxylic acid anhydride 계열의 화합물 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 이황화 화합물은 Sulfo-LC-SPDP (sulfosuccinimidyl 6-(3'-(2-pyridyldithio)propionamido)hexanoate), Lipoic acid 및 3-(Propyldisulfanyl)propanoic acid 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 폴리에틸렌이민에 대한 상기 담즙산의 치환도는 10-19%일 수 있다.
상기 폴리에틸렌이민에 대한 상기 이황화 화합물의 치환도는 6.2-12.5%일 수 있다.
상기 폴리에틸렌이민에 대한 상기 음전하 생성용 화합물의 치환도는 20-40 %일 수 있다.
상기 약물전달용 나노입자의 표면전하는 특정 pH 6.0 내지 6.8 조건에서 특이적으로 음전하에서 양전하로 변환될 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 하기 단계를 포함하는 상기 약물전달용 나노입자의 제조방법에 관한 것이다.
Ⅰ) 평균 분자량이 400 내지 30000 달톤(Da)인 선형 또는 분지형의 폴리에틸렌이민을 포함하는 용액을 준비하는 단계;
Ⅱ) 상기 Ⅰ) 단계 용액에 (a) 담즙산, (b) 이황화 화합물 및 (c) 음전하 생성용 화합물 중에서 1종 이상이 포함된 용액을 첨가하고, 반응시켜 상기 폴리에틸렌이민의 1 이상의 아미노기의 수소를 (a) 담즙산, (b) 이황화 화합물 및 (c) 음전하 생성용 화합물 중에서 1종 이상으로 치환시키는 단계; 및
Ⅲ) 상기 Ⅱ) 단계에서 제조된 상기 (a) 담즙산, (b) 이황화 화합물 및 (c) 음전하 생성용 화합물 중에서 1종 이상으로 치환된 상기 폴리에틸렌이민에 가교제를 첨가하여 구형의 약물전달용 나노입자를 제조하는 단계;를 포함한다.
상기 담즙산은 상기 폴리에틸렌이민에 존재하는 1차 및 2차 아민의 전체 몰에 대해 20 내지 30 몰%로 혼합될 수 있다.
상기 이황화 화합물은 상기 폴리에틸렌이민에 존재하는 1차 및 2차 아민의 전체 몰에 대해 10 내지 20 몰%로 혼합될 수 있다.
상기 음전하 생성용 화합물은 상기 폴리에틸렌이민에 존재하는 1차 및 2차 아민의 전체 몰에 대해 40 내지 50 몰%로 혼합될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 약물전달용 나노입자; 및 상기 약물전달용 나노입자 내부에 봉입된 약물;을 포함하는 암 치료 또는 암전이 억제용 약학적 조성물에 관한 것이다.
상기 약물은 파클리탁셀 (paclitaxel), 독소루비신 (doxorubicin), 레티노익 산 (retinoic acid)계열, 시스플라틴 (cis-platin), 캄토세신 (camptothecin), 5-FU, 도세탁셀 (Docetaxel), 타목시펜(Tamoxifen), 아나스테로졸(anasterozole), 카보플라틴(carboplatin), 토포테칸(topotecan), 베로테칸(belotecan), 이리노테칸(irinotecan), 글리벡(gleevec) 및 빈크리스틴(vincristine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나이상의 항암제일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 암 질환 부위의 pH 6.0 내지 6.8에서, 상기 약물전달용 나노입자의 표면전하가 변환되어 암세포 내로 침투되어, 암세포 내부에서 약물을 방출하게 되는 특성을 가질 수 있다.
상기 암은 폐암, 자궁암, 자궁경부암, 전립선암, 두경부암, 췌장암, 뇌종양, 유방암, 간암, 피부암, 식도암, 고환암, 신장암, 대장암 및 직장암 중에서 선택되는 어느 하나이상일 수 있다.
본 발명의 여러 구현예에 따르면, 암 질환 부위가 갖고 있는 특이적 약산성 조건(pH 6.0 내지 6.8에서 보다 바람직하게는 pH 6.5 내지 6.8)에서만 상기 약물전달용 나노입자의 표면이 세포 내로 효과적으로 침투할 수 있는 양전하로 변환되기 때문에, 암세포에 특이적으로 반응함으로써, 효과적으로 약물을 암세포 내로 효율적으로 전달할 수 있다.
즉, 본 발명에 따른 약물전달용 나노입자는 암세포가 가지고 있는 특이적인 조건에서 활성화될 수 있기 때문에, 매우 효과적으로 암세포에만 약물을 전달할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 약물전달용 나노입자는 평소에는 표면의 전하가 음전하를 띄고 있기 때문에, 구조적으로 안정하므로 목적지점으로 가는동안 용해되지 않고, 생체내 목적지점인 암세포까지 안정적으로 도달할 수 있으며, 상기 암세포를 제외한 다른 정상 세포들에게는 피해를 미치지 않는다. 나아가 본 발명의 약물전달용 나노입자는 생체적합성이 뛰어나고, 세포독성을 나타내지 않으므로 암 치료를 위해 임상적으로 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 약물전달용 나노입자의 구조를 개략적으로 도시한 도면이다.
도 2는 본 발명에 따른 약물전달용 나노입자의 약물 전달 과정을 개략적으로 도시한 도면이다.
도 3은 본 발명의 실시예 1로부터 제조된 bPEI-LCA-SPDP-DMA 고분자(B)와 비교예 4로부터 제조된 bPEI-LCA 고분자(A)에 대한 1H NMR 스펙트라이다.
도 4a는 비교예 9로부터 제조된 P-NPs와 실시예 2로부터 제조된 CC-NPs의 입경분포를 나타낸 그래프이다.
도 4b는 비교예 9로부터 제조된 P-NPs를 FE-SEM으로 촬영한 사진이다.
도 4c는 실시예 2로부터 제조된 CC-NPs를 FE-SEM으로 촬영한 사진이다.
도 5a는 pH 7.4 또는 pH 6.5에서 측정된 비교예 9로부터 제조된 P-NPs와 실시예 2로부터 제조된 CC-NPs의 제타 포텐셜을 나타낸 그래프이다.
도 5b는 pH 7.4와 6.5에서 시간에 따른 비교예 9로부터 제조된 P-NPs와 실시예 2로부터 제조된 CC-NPs의 제타 포텐셜의 변화를 측정한 그래프이다.
도 6은 5일 동안 PBS(pH 7.4) 존재하에서 비교예 9로부터 제조된 P-NPs와 실시예 2로부터 제조된 CC-NPs의 안정성을 확인하기 위해, 각각의 나노입자의 평균 입경 변화를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 7a는 24 시간동안, 10% FBS(fetal bovine serum)를 포함하는 PBS(pH 7.4)에서 배양한 후, 비교예 9로부터 제조된 P-NPs와 실시예 2로부터 제조된 CC-NPs의 안정성을 확인하기 위해, 각각의 나노입자의 평균 입경 변화를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 7b는 24 시간동안, 10% FBS(fetal bovine serum)를 포함하는 PBS(pH 7.4)에서 배양한 후, 비교예 9로부터 제조된 P-NPs와 실시예 2로부터 제조된 CC-NPs의 안정성을 확인하기 위해, 각각의 나노입자의 입경 분포를 나타낸 그래프이다.
도 8은 시험관에서(in vitro), 10 mM GSH가 존재하는 경우와 존재하지 않는 경우에 비교예 14로부터 제조된 DOX-P-NPs와 실시예 3으로부터 제조된 DOX-CC-NPs의 독소루비신(DOX)의 방출 정도를 측정하여 나타낸 그래프이다. 이때 pH 7.4이고, 데이터는 평균 ± 표준오차로 표기하였다.
도 9는 시험관에서(in vitro), 10 mM GSH가 존재하는 경우와 존재하지 않는 경우에 비교예 14로부터 제조된 DOX-P-NPs와 실시예 3으로부터 제조된 DOX-CC-NPs의 독소루비신(DOX)의 방출 정도를 측정하여 나타낸 그래프이다. 이때 pH 6.5이고, 데이터는 평균 ± 표준오차로 표기하였다.
도 10은 시험관에서(in vitro), SCC7 세포에 대한 분지화된 PEI(평균 분자량 1.8 kDa), 비교예 9로부터 제조된 P-NP 및 실시예 2로부터 제조된 CC-NPs의 독성을 비교하기 위해, 세포 생존율을 측정하여 나타낸 그래프이다. 데이터는 평균 ± 표준오차로 표기하였다(n=5).
도 11은 각기 다른 pH 조건 하에서, Cy5.5(cyanine)으로 라벨된 비교예 9로부터 제조된 P-NP 및 실시예 2로부터 제조된 CC-NPs의 SCC7 세포 침투여부를 확인하기 위한 공초점 현미경(confocal microscop)로 촬영한 이미지이다. 이때, 세포의 핵은 DAPI(청색)으로 염색하였다. 스케일 바는 20 ㎛이다.
도 12는 세포 내에서 약물 방출 여부를 확인하기 위하여, 실시예 3으로부터 제조된 DOX-CC-NPs 및 비교예 14로부터 제조된 DOX-P-NPs의 각기 다른 pH 조건 하에서, SCC7 세포내 약물 방출 정도를 확인하기 위한 공초점 현미경(confocal microscop)로 촬영한 이미지이다. 스케일 바는 20 ㎛이다.
도 13은 실시예 3으로부터 제조된 DOX-CC-NPs 및 비교예 14로부터 제조된 DOX-P-NPs를 유세포 분석(flow cytometric analyses)한 결과 그래프이다. 이때, 도 13A는 pH 7.4에서 측정한 것이고, 도 13B는 pH 6.5에서 측정한 것이다.
도 14는 시험관에서(in vitro), SCC7 세포에 대한 실시예 3으로부터 제조된 DOX-CC-NPs 및 비교예 14로부터 제조된 DOX-P-NPs의 독성을 비교하기 위해, 세포 생존율을 측정하여 나타낸 그래프이다. 데이터는 평균 ± 표준오차로 표기하였다(n=5).
도 15는 종양이식된 누드마우스 꼬리 정맥을 통해 Cy5.5(cyanine)으로 라벨된 비교예 9로부터 제조된 P-NP 및 Cy5.5(cyanine)으로 라벨된 실시예 2로부터 제조된 CC-NPs을 주입한 후, 상기 누드마우스 내에서의 생체분포를 촬영한 형광 사진이다.
도 16은 Cy5.5(cyanine)으로 라벨된 비교예 9로부터 제조된 P-NP 및 Cy5.5(cyanine)으로 라벨된 실시예 2로부터 제조된 CC-NPs를 각각 주입한 종양이식된 누드마우스의 각 장기조직을 생체 밖에서(ex vivo), 촬영한 형광이미지이다.
도 17은 Cy5.5(cyanine)으로 라벨된 비교예 9로부터 제조된 P-NP 및 Cy5.5(cyanine)으로 라벨된 실시예 2로부터 제조된 CC-NPs를 각각 주입한 종양이식된 누드마우스의 각 장기조직(organs)들 및 암조직의 형광세기를 측정하여 나타내는 그래프이다. 데이터는 평균 ± 표준오차로 표기하였다(n=3). *) p<0.05
도 18은 도 17에서 간, 폐 및 암 조직 간의 형광세기 비(ratio of fluorescence intensities)를 계산하여 나타낸 그래프이다. 데이터는 평균 ± 표준오차로 표기하였다(n=3). *) p<0.05
도 19는 각 실험군에 따른 약물을 주입한 종양이식된 C3H/GeN 마우스에서의 암 조직의 부피를 측정하여 나타낸 그래프이다. 이때, 상기 각 실험군에 따른 약물을 주입한 후, 14 일 동안 암조직의 부피를 측정하였다. *) p<0.05
도 20은 각 실험군에 따른 약물을 종양이식된 C3H/GeN 마우스에 주입한 후, 14일 후의 암 조직의 무게를 측정하여 나타낸 그래프이다. *) p<0.05
도 21은 각 실험군(실험군 1-4)에 따른 약물을 종양이식된 C3H/GeN 마우스에 주입한 후, 14일이 지난 후 절단한 암조직과 각 장기(간, 폐, 신장, 심장 및 비장)의 조직들을 H&E 조직학적 염색 방법으로 분석한 사진이다.
도 22는 비교예 11 내지 15로부터 제조된 약물전달용 나노입자의 평균 입경을 나타낸 그래프이다.
도 23은 비교예 16 내지 19로부터 제조된 약물전달용 나노입자의 평균 입경 및 수득율(intensity; kcps)을 나타낸 그래프이다.
이하에서, 본 발명의 여러 측면 및 다양한 구현예에 대해 더욱 구체적으로 살펴보도록 한다.
본 발명의 일 측면은 평균 분자량이 400 내지 10000 달톤(Da)인 선형 또는 분지형의 폴리에틸렌이민을 골격으로 하고, 상기 폴리에틸렌이민의 골격 내 1 이상의 아미노기의 수소는 (a) 담즙산 (b) 이황화 화합물 및 (c) 음전하 생성용 화합물; 중에서 1종 이상으로 치환되어 있는 것을 특징으로 하는 고분자로 이루어지고, 상기 이황화 화합물은 이황화결합을 포함하고, 상기 골격인 폴리에틸렌이민의 아미노 기와 반응이 가능한 하나의 카르복시기 또는 설포네이트기를 갖는 것을 특징으로 하며, 상기 음전하 생성용 화합물은 pKa가 6이상인 것을 특징으로 하는 코어-쉘 구조의 약물전달용 나노입자에 관한 것이다.
본 발명에 따른 상기 폴리에틸렌이민은 400 내지 10000 달톤(Da)인 선형 또는 분지형의 폴리에틸렌이민일 수 있으나, 바람직하게는 1,200 내지 25,000 달톤(Da) 평균 분자량을 갖는 선형 또는 분지형의 폴리에틸렌이민일 수 있다. 왜냐하면 1200 달톤(Da) 미만일 경우, 상기 폴리에틸렌이민 골격 내 상기 담즙산, 이황화 화합물 및 음전하 생성용 화합물로 치환되기 위해 존재하는 아미노기가 충분하지 않아 안정성이 우수한 약물전달용 나노입자를 형성할 수 없다는 문제가 존재하고, 25000 달돈(Da)를 초과하게 되면 과도하게 많은 담즙산, 이황화 화합물 및 음전하 생성용 화합물이 치환되어 특정 pH에서 제대로 작동하지 않는 문제가 발생한다.
또한, 본 발명의 폴리에틸렌이민의 아미노기 수소가 치환되기 이전에 상기 폴리에틸렌이민에 존재하는 1차 및 2차 아민과 3차 아민의 비율은 2-4 : 1 인 것이 바람직한데, 왜냐하면 폴리에틸렌이민의 3차 아민은 pKa가 11.5로 정상조직의 pH인 7.4에서도 양성자화되며, 3차 아민에는 이황화 화합물 또는 음전하 생성용 화합물의 치환이 용이하지 않아 혼합 시 치환 가능한 아민기의 확보가 필요하기 때문이다.
보다 구체적으로 상기 선형의 폴리에틸렌이민의 경우, 하기 화학식 1로 표기할 수 있다.
[화학식 1]
Figure 112015126368208-pat00001
상기 화학식에서 n은 9 내지 194이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 폴리에틸렌이민의 아미노기의 수소는 -N-H의 H로, 1차 아민의 아미노기일 수 있다.
또한, 상기 약물전달용 나노입자는 상기 폴리에틸렌이민을 골격으로 하고, 상기 폴리에틸렌이민의 아미노기의 수소가 (a) 담즙산, (b) 이황화 화합물 및 (c) 음전하 생성용 화합물로 치환되어 형성된 고분자가 자기조립에 의해 구형으로 제조되며, 구체적으로는 자기조립 과정에서 친수성을 띄는 (c) 음전하 생성용 화합물로 치환된 부분은 외부에 위치하여, 쉘을 구성하고, (b) 이황화 화합물로 치환된 부분은 소수성 약물을 봉입하는 코어를 구성하고, 상기 (a) 담즙산으로 치환된 부분은 상기 코어의 외면 즉, 쉘과 코어 사이에 위치하여 양전하층을 형성하고 있는 것을 특징으로 한다.
상기 (a) 담즙산, (b) 이황화 화합물 및 (c) 음전하 생성용 화합물과 상기 폴리에틸렌이민의 골격 내 1 이상의 아미노기의 수소는 아마이드 결합을 통해 결합되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 약물전달용 나노입자는 구형의 코어-쉘 형태를 띄고 있는데(도 1), 상기 (b) 이황화 화합물 간에 형성되는 이황화 결합을 통해 상기 고분자 간에 형성된 가교결합으로 인해, 상기 나노입자의 코어가 형성되며, 이렇게 구성된 상기 약물전달용 나노입자의 코어 내부에는 약물을 봉입할 수 있다.
또한, 이러한 구조적 특성에 의해 코어쉘의 내부에 약물이 위치하기 때문에 서방성이 보장되고, 정상세포에 대한 독성이 감소될 수 있다. 특히 본 발명에 따른 약물전달용 나노입자는 암질환부위의 환경조건 하에서 반응하는 구조를 가지고 있기 때문에, 암세포에 대해서만 특이적으로 세포 내 침투현상이 유발되며, 이로 인해 암세포로의 약물 전달능이 매우 현저히 향상된 장점을 갖는다.
구체적으로, 도 2는 본 발명에 따른 약물전달용 나노입자의 약물 전달 과정을 개략적으로 도시한 도면으로, 이를 참고로하여 약물 전달과정을 설명하기로 한다.
본 발명에 따른 약물전달용 나노입자는 상술한 구조로 인하여, 상기 약물전달용 나노입자의 쉘이 pH 7.2 내지 8.0에서는 음전하를 나타내고, 코어의 외면은 양전하를 나타내는 것을 특징으로 하는데, 이로 인해 평소 음의 표면전하를 갖기 때문에 세포 내로 침투하지 못하다가, 암 질환부위의 암세포 외 환경인 약산성 pH 6.0 내지 6.8에서 보다 바람직하게는 pH 6.5 내지 6.8 조건을 만나게 되면, 상기 약물전달용 나노입자의 쉘을 구성하던 상기 폴리에틸렌이민의 아미노기와 상기 (c) 음전하 생성용 화합물간의 아마이드 결합이 깨져, 상기 쉘이 붕괴됨에 따라, 양전하를 띄는 코어의 외면이 나타나게 되어, 상기 약물전달용 나노입자가 암세포 내로 성공적으로 침투하게 된다(도 2의 (ⅰ) 단계).
이후, 상기 암세포 내로 상기 약물전달용 나노입자가 침투하게 되면, 상기 암세포 내에 존재하는 효소 특히 GSH에 의해 상기 약물전달용 나노입자의 코어를 구성하는 (b) 이황화 화합물 간의 이황화결합이 붕괴되어, 이들 사이로 코어에 봉입되어 있던 약물이 외부로 방출되어 상기 암세포 내에서 상기 약물전달용 나노입자로부터 약물이 효과적으로 방출되는 효과를 달성할 수 있다(도 2의 (ⅱ) 단계).
즉, 이러한 과정을 통해, 본 발명에 따른 약물전달용 나노입자는 약산성 조건을 띄는 암 질환부위에서 특이적으로 음전하에서 양전하로 표면전하가 전환되어, 상기 암 질환부위에 존재하는 암세포 내로 성공적으로 침투할 수 있을 뿐만 아니라, 상기 암세포 내에 존재하는 효소에 의해 활성화되어 약물을 방출되는데, 이러한 본 발명의 약물전달용 나노입자는 약물 방출을 위한 이중 장치가 작용하고 있으므로 매우 효과적이고, 특이적으로 암세포에 약물을 전달한다.
이러한 본 발명에 따른 약물전달용 나노입자의 쉘층은 pH 7.2 내지 8.0에서 - 30 내지 - 10 mV 표면전하를 갖는 것을 특징으로 하는데, - 10 mV를 초과할 경우 pH 7.4에서도 표면전하가 쉽게 증가하므로, 다른 정상세포들에게 피해를 주는 문제가 발생하고, - 30mV 미만일 경우 약산성 환경인 pH 6.0 내지 6.8에서 보다 바람직하게는 pH 6.5 내지 6.8에 노출되었음에도 불구하고, 상기 약물전달용 나노입자의 쉘이 붕괴됨으로 인해 표면전하가 양전하로 변환되는데, 소요되는 시간이 증가하여 암세포로의 약물전달 효율이 저하되는 문제점이 존재한다.
본 발명에 따른 약물전달용 나노입자는 평균입경이 50 내지 300 ㎚인 것이 바람직한데, 더욱 바람직하게는 100 내지 200 ㎚일 수 있다. 만약 상기 나노입자의 평균입경이 100 ㎚ 미만이면 충분한 양의 약물이 코어에 봉입되기 어렵고, 200 ㎚를 초과하면 암세포 내로 침투에 있어 그 효과가 감소하게 되는 문제가 발생할 수 있다.
상기 약물전달용 나노입자는 단분산(monodispersity) 특성을 가지는 것이 바람직한데, 이러한 단분산 특성은 분자량의 분포 범위 또는 상기 약물전달용 나노입자의 평균입경 범위가 매우 좁은 것으로, 특히 상기 약물전달용 나노입자의 평균 입경과 관련하여 체계적인 약물전달시스템 설계를 위해 상기 단분산 특성을 필수적 특성이다.
본 발명에 따른 약물전달용 나노입자는 작은 크기와 구조적 특성으로 인해 암세포에 특이적으로 침투(uptake)할 수 있어, 내부에 봉입된 약물과 함께 암세포 내로 도입될 수 있다.
상기 약물전달용 나노입자는 세포에 독성을 나타내지 않으며, 생체친화적인 것으로, 이는 후술하는 실시예를 통해 확인할 수 있다.
본 발명에 따른 약물전달용 나노입자의 쉘은 상기 (c) 음전하 생성용 화합물이 위치하여 구성되는데, 상기 (c) 음전하 생성용 화합물은 상기 폴리에틸렌이민의 아미노기의 수소와 아마이드 결합을 통해 결합되어 있고, 이는 외부 환경에 노출되어 있는 쉘을 구성한다.
상기 쉘을 구성하는 상기 폴리에틸렌이민의 아미노기의 수소와 상기 (c) 음전하 생성용 화합물의 아마이드 결합은 pH 6.0 내지 6.8에서 보다 바람직하게는 pH 6.5 내지 6.8에서 가수분해가 되는 것을 특징으로 하는데, 상기 (c) 음전하 생성용 화합물의 종류에 따라 상기 아마이드 결합이 분해되는 pH 범위가 달라지게된다. 즉, 본 발명은 상기 (c) 음전하 생성용 화합물은 상기 약물전달용 나노입자의 쉘을 형성하는 것으로, 상기 (c) 음전하 생성용 화합물과 상기 폴리에틸렌이민의 아미노기의 수소와의 아마이드 결합이 pH 6.5 내지 6.8에서 분해되면, 상기 약물전달용 나노입자는 음의 표면전하를 갖는 쉘이 붕괴되어, 양의 표면전하로 변환되는데, 상기 양의 표면전하는 세포막과의 상호작용이 우수하므로 세포 내로 성공적으로 침투할 수 있도록 한다.
따라서, 상기 (c) 음전하 생성용 화합물이 상기 폴리에틸렌이민과 pH 6.0 내지 6.8에서 보다 바람직하게는 pH 6.5 내지 6.8에서 분해되는 아마이드 결합을 형성하는 종류가 선택되어지는 것이 매우 중요하다. 상기 (c) 음전하 생성용 화합물은 pKa 6을 초과하면 상기 골격인 폴리에틸렌이민과 아마이드 결합을 형성하는 것이면 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게 상기 (c) 음전하 생성용 화합물은 pKa가 6 내지 6.8인 것일 수 있는데, 일예로 1,2-cis-cyclohexanedicarboxylic angydride, citraconic anhydride 및 3,4,5,6-tetrahydrophthalic anhydride 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 상기 (c) 음전하 생성용 화합물로 사용하기 어려운 것으로는, pKa가 6 미만인 화합물들이 있고, 대표적으로 glutaric anhydride 또는 succinic anhydride이 있다.
또한, 상기 (b) 이황화 화합물은 상기 약물전달용 나노입자의 코어를 형성하여 약물을 효과적으로 코어 내에 봉입하고, 생체안정성을 향상시키며 구조적 안정성을 완성하는 역할을 수행하는 것으로, 이황화결합을 포함하고, 상기 폴리에틸렌이민의 아미노기와 반응이 가능한 하나의 카르복시기 또는 설포네이트기를 갖는 것이면 특별히 이에 제한되지 않으나, 만일 상기 폴리에틸렌이민의 아미노기와 반응이 가능한 카르복시기 또는 설포네이트기가 둘 이상일 경우 상기 약물전달용 나노입자 내에서 가교결합이 과량 형성되어, 약물 방출이 효과적으로 수행되지 못하는 어려움이 있다.
상기 (b) 이황화 화합물로 바람직한 것은 Sulfo-LC-SPDP (sulfosuccinimidyl 6-(3'-(2-pyridyldithio)propionamido)hexanoate), Lipoic acid 및 3-(Propyldisulfanyl)propanoic acid 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 바람직하지 않은 것은 3,3'-Disulfanediyldipropanoic acid와 같이 카르복시기 또는 설포네이트기가 둘 이상인 이황화 화합물이다.
나아가, 본 발명에 따른 약물전달용 나노입자에 있어서, 상기 폴리에틸렌이민에 대한 상기 담즙산의 치환도는 10 내지 19%인 것이 바람직하다.
상기 담즙산의 치환도가 10% 미만인 경우 상기 약물전달용 나노입자 평균 입경의 표준 편차가 크고, 균일성을 판단하는 척도인 PDI가 0.3 이상으로 측정되는 것을 확인하였다. 또한 상기 담즙산의 치환도가 19 %를 초과하는 경우 상기 약물전달용 나노입자가 과도하게 소수성을 띄어 수득율이 낮아지는 문제가 발생하게 되었다. 따라서, 본 발명에 따른 약물 전달용 나노입자는 담즙산의 치환도는 10-19%인 것이 바람직하다는 것을 하기 실시예를 통해 확인할 수 있다.
상기 담즙산의 치환도는 상기 폴리에틸렌이민에 존재하는 전체 아미노기 100% 중에서 상기 담즙산으로 치환된 아미노기가 10 내지 19%라는 것을 나타내는 것으로, 더욱 구체적으로 상기 아미노기는 상기 폴리에틸렌이민에 존재하는 1차 아민의 아미노기를 의미하는 것이다.
상기 이황화 화합물의 치환도는 6.2 내지 12.5%인 것이 바람직한데, 상기 이황화 화합물의 치환도가 12.5%를 초과한 경우 수득율(intensity가 50 이하로, 4배 이상 저하됨)이 현저히 저하되는 문제가 발생하는 것을 확인하였다. 또한 상기 이황화 화합물의 치환도가 6.2 %를 초과하는 경우 약물전달용 나노입자의 평균입경, 표준편차, PDI 수치가 허용범위를 벗어남에 따라, 제조된 약물전달용 나노입자의 형성이 불안정한 것을 확인하였다.
상기 이황화 화합물의 치환도는 상기 폴리에틸렌이민에 존재하는 전체 아미노기 100% 중에서 상기 이황화 화합물로 치환된 아미노기가 6.2 내지 12.5%라는 것을 나타내는 것으로, 더욱 구체적으로 상기 아미노기는 상기 폴리에틸렌이민에 존재하는 1차 아민의 아미노기를 의미하는 것이다.
나아가, 상기 폴리에틸렌이민에 대한 상기 음전하 생성용 화합물의 치환도는 15 내지 30%인 것이 바람직한데, 음전하 생성용 화합물에 의해 본 발명에 따른 약물전달용 나노입자의 표면전하가 결정되기 때문에, 이의 치환도는 약물전달용 나노입자의 거동에 영향을 미친다고 볼 수 있다. 상기 음전하 생성용 화합물의 치환도가 15% 미만이면 상기 약물전달용 나노입자의 표면전하가 양의 표면전하를 띄게 되며, 30%를 초과하게 되면 약산성 환경에 노축되었을 때 표면전하의 전환 거동이 효율적이지 못해, 상기 약물전달용 나노입자의 쉘이 붕괴됨으로 인해 표면전하가 양전하로 변환되는데, 소요되는 시간이 증가하여 항암효과가 저하되는 문제가 발생한다.
상기 이황화 화합물의 치환도는 상기 폴리에틸렌이민에 존재하는 전체 아미노기 100% 중에서 상기 이황화 화합물로 치환된 아미노기가 15 내지 30%라는 것을 나타내는 것으로, 더욱 구체적으로 상기 아미노기는 상기 폴리에틸렌이민에 존재하는 1차 아민의 아미노기를 의미하는 것이다.
본 발명에 따른 약물전달용 나노입자는, 암 질환부위의 특정 pH 조건인 pH 6.0 내지 6.8에서 보다 바람직하게는 pH 6.5 내지 6.8 하에서 특이적으로 표면전하가 음에서 양으로 변환되어 암세포 내로 침투하는 특이적 작용을 하기 때문에, 평소에는 매우 안정적인 구조로 존재하다가 암 조직의 세포외 기질에서의 pH 환경과 조우하게 되면 이를 선택적으로 표적화할 수 있다는 것을 장점으로 한다.
본 발명의 약물전달용 나노입자는 암조직으로 전달되는 과정은 도 2에 나타낸 바와 같이 세포 내외로 연속적인 단계를 통해 수행되는 것을 특징으로 한다.
즉, 본 발명에 따른 약물전달용 나노입자는 생체 내에 주입후, 혈관 속을 안정적으로 돌아다니다가, 암 질환부위가 가지고 있는 특정 pH 조건인 pH 6.0 내지 6.8에서 보다 바람직하게는 pH 6.5 내지 6.8에 도달하는 즉시, 상기 약물전달용 나노입자의 표면 전하가 암의 온화한 산화 외부세포 구조(matrix)를 인지함으로써, 상기 약물전달용 나노입자의 쉘이 붕괴(아마이드 결합의 붕괴를 통한)되어 음전하로부터 양전하로 전환되어, 암세포 내로 상기 약물 전달체의 절달 성능이 향상됨에 의해, 상기 약물전달용 나노입자가 암세포 내로 특이적이면서 효과적으로 침투한다(도 2의 (ⅰ) 단계).
상기 암세포 내로 약물전달용 나노입자 침투된 후, 상기 약물전달용 나노입자는 암 세포내 기질에 존재하는 GSH에 의해, 이황화결합이 붕괴되어 코어에 봉입되어 있던 약물이 선택적으로 암세포 내로 방출된다. 이는 화학적으로 연결된 코어의 disulfide 결합이 세포내 환원 환경에 의해 깨지기 때문이다(도 2의 (ⅱ) 단계).
이러한 본 발명에 따른 약물전달용 나노입자는 상기와 같은 구조로 인하여 암의 환경조건에 특이적으로 반응하므로 우수한 암 표적능력과 극적인 약물의 항암효과를 갖는다.
본 발명에 따른 약물전달용 나노입자는 상술한 바와 같이, 암 질환부위의 환경에 특이적으로 표면 전하를 변환할 수 있는 약물전달용 나노입자 구조를 가지고 있는 것을 특징으로 하는 것으로, 구체적으로 상기 약물전달용 나노입자의 쉘층과 코어 외면의 전하가 서로 상이한 구조를 갖고 있어, 암 질환부위의 환경에 특이적으로 결합하여, 상기 약물전달용 나노입자의 쉘층(음전하)이 붕괴되고 코어 외면의 전하(양전하)로 변환하게 됨으로써 암세포 내로 쉽게 침투할 수 있을 뿐만 아니라, 암세포 내의 환경에 특이적으로 반응하여 약물을 방출하도록 이중 장치로 설계되었기 때문에, 종래 하나의 장치만으로 약물을 방출하는 약물전달용 나노입자에 비해 암세포에 대한 민감도가 현저히 우수하다.
또한, 본 발명의 다른 측면은 상기 약물전달용 나노입자는 아래 단계를 포함하는 제조방법을 제공한다.
Ⅰ) 평균 분자량이 400 내지 30000 달톤(Da)인 선형 또는 분지형의 폴리에틸렌이민을 포함하는 용액을 준비하는 단계;
Ⅱ) 상기 Ⅰ) 단계 용액에 (a) 담즙산, (b) 이황화 화합물 및 (c) 음전하 생성용 화합물 중에서 1종 이상이 포함된 용액을 첨가하고, 반응시켜 상기 폴리에틸렌이민의 1 이상의 아미노기의 수소를 (a) 담즙산, (b) 이황화 화합물 및 (c) 음전하 생성용 화합물 중에서 1종 이상으로 치환시키는 단계; 및
Ⅲ) 상기 Ⅱ) 단계에서 제조된 상기 (a) 담즙산, (b) 이황화 화합물 및 (c) 음전하 생성용 화합물 중에서 1종 이상으로 치환된 상기 폴리에틸렌이민에 가교제를 첨가하여 구형의 약물전달용 나노입자를 제조하는 단계;를 포함한다.
이하, 상기 제조방법을 단계별로 설명한다.
상기 폴리에틸렌이민은 400 내지 10000 달톤(Da)인 선형 또는 분지형의 폴리에틸렌이민일 수 있으나, 바람직하게는 1,200 내지 25,000 달톤(Da) 평균 분자량을 갖는 선형 또는 분지형의 폴리에틸렌이민일 수 있다. 왜냐하면 1200 달톤(Da) 미만일 경우, 상기 폴리에틸렌이민 골격 내 상기 담즙산, 이황화 화합물 및 음전하 생성용 화합물로 치환되기 위해 존재하는 아미노기가 충분하지 않아 안정성이 우수한 약물전달용 나노입자를 형성할 수 없다는 문제가 존재하고, 25000 달톤(Da)를 초과하게 되면 과도하게 많은 담즙산, 이황화 화합물 및 음전하 생성용 화합물이 치환되어 특정 pH에서 제대로 작동하지 않는 문제가 발생한다.
또한, 본 발명의 폴리에틸렌이민의 아미노기 수소가 치환되기 이전에 상기 폴리에틸렌이민에 존재하는 1차 및 2차 아민과 3차 아민의 비율은 2-4 : 1 인 것이 바람직한데, 왜냐하면 폴리에틸렌이민의 3차 아민은 pKa가 11.5로 정상조직의 pH인 7.4에서도 양성자화되며, 3차 아민에는 이황화 화합물 또는 음전하 생성용 화합물의 치환이 용이하지 않아 혼합 시 치환 가능한 아민기의 확보가 필요하기 때문이다.
보다 구체적으로 상기 선형의 폴리에틸렌이민의 경우, 하기 화학식 1로 표기할 수 있다.
[화학식 1]
Figure 112015126368208-pat00002
상기 화학식에서 n은 9 내지 194이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 폴리에틸렌이민의 아미노기의 수소는 -N-H의 H로, 1차 아민의 아미노기일 수 있다.
이후, Ⅱ) 상기 Ⅰ) 단계 용액에 (a) 담즙산, (b) 이황화 화합물 및 (c) 음전하 생성용 화합물 중에서 1종 이상이 포함된 용액을 첨가하고, 반응시켜 상기 폴리에틸렌이민의 1 이상의 아미노기의 수소를 (a) 담즙산, (b) 이황화 화합물 및 (c) 음전하 생성용 화합물 중에서 1종 이상으로 치환시키는 단계를 수행한다.
이때 상기 Ⅱ) 단계는 (a) 담즙산, (b) 이황화 화합물 및 (c) 음전하 생성용 화합물 중에서 1종 이상이 포함된 용액을 동시에 혼합하거나, (a) 담즙산, (b) 이황화 화합물 및 (c) 음전하 생성용 화합물을 각각 용액에 포함시켜, 이들을 순차적으로 혼합할 수 있는데, 순차적으로 혼합하는 것이 가장 바람직하다.
순차적으로 (a) 담즙산, (b) 이황화 화합물 및 (c) 음전하 생성용 화합물을 혼합할 경우, 가장 먼저 상기 Ⅰ) 단계 용액에 (a) 담즙산을 혼합하고, 이후 (b) 이황화 화합물을 혼합한 후, 최종 (c) 음전하 생성용 화합물을 혼합하는 것이 바람직하다.
순차적으로 혼합할 경우, 상기 Ⅱ) 단계는 구체적으로 Ⅱ-1) 상기 Ⅰ) 단계 용액에 (a) 담즙산이 포함된 용액을 첨가하고, 질소 분위기 하에서, 반응시켜 상기 폴리에틸렌이민의 1 이상의 아미노기의 수소를 담즙산으로 치환시키는 단계;
Ⅱ-2) 상기 Ⅱ-1) 단계의 상기 담즙산이 치환된 상기 폴리에틸렌이민에 이황화 화합물이 포함된 용액을 첨가하고 반응시켜 상기 폴리에틸렌이민의 1 이상의 아미노기의 수소를 이황화 화합물로 치환시키는 단계; 및
Ⅱ-3) 상기 Ⅱ-2) 단계의 담즙산과 이황화 화합물이 치환된 상기 폴리에틸렌이민에 음전하 생성용 화합물이 포함된 용액을 첨가하고, 반응시켜 상기 폴리에틸렌이민의 1 이상의 아미노기의 수소를 음전하 생성용 화합물로 치환시키는 단계;를 포함할 수 있다.
이때, Ⅱ-1) 단계의 상기 담즙산이 포함된 용액은 상기 담즙산을 유기용매에 용해시켜 용액상태로 준비한 것으로, 상기 유기용매는 테트라하이드로퓨란인 것이 바람직하며, 상기 Ⅰ) 단계 용액에 상기 담즙산 용액을 첨가하고, 실온에서 12 내지 24 시간 동안 교반시키는 것이 바람직하다. 특히 질소 분위기 하에서 수행되는 것이 바람직하다. 이때 여과지를 이용하여 여과함으로써, 상기 폴리에티렌이민의 아미노기와 담즙산의 카르복실기가 결합된 폴리에틸렌이민 고분자를 85 내지 95% 수율로 얻을 수 있다.
본 발명에 따른 상기 Ⅱ-2) 단계의 상기 이황화 화합물이 포함된 용액 역시 유기용매에 용해시켜 용액상태로 준비된 것으로, 상기 유기용매는 DMSO를 사용할 수 있다. 상기 Ⅱ-1) 단계의 상기 담즙산이 치환된 상기 폴리에틸렌이민에 상기 이황화 화합물이 포함된 용액을 첨가하여, 실온에서 12 내지 24 시간 동안 교반시키는 것이 바람직하다. 이후 MWCO = 1 kDa로 투석하고 동결건조시킴으로써, 상기 폴리에틸렌이민의 1 이상의 아미노기의 수소를 이황화 화합물로 치환시킨, 상기 담즙산과 이황화 화합물로 치환된 상기 폴리에틸렌이민 고분자를 수득할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 Ⅱ-3) 단계의 상기 음전하 생성용 화합물이 포함된 용액은 상기 음전하 생성용 화합물을 유기 용매에 용해시켜 용액상태로 준비된 것으로, 상기 유기용매는 DMSO를 사용하였다. 상기 Ⅱ-2) 단계의 담즙산과 이황화 화합물이 치환된 상기 폴리에틸렌이민에에 음전하 생성용 화합물 용액을 실온에서 24 내지 50 시간동안 반응시켜 상기 폴리에틸렌이민의 1 이상의 아미노기의 수소를 음전하 생성용 화합물로 치환시키는 것이 바람직하다.
이후 MWCO = 1 kDa로 투석하고 동결건조시킴으로써, 함으로써, 상기 담즙산과 이황화 화합물 및 음전하 생성용 화합물이 치환된 상기 폴리에틸렌이민 골격 고분자를 수득할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 Ⅲ) 단계는 상기 담즙산과 이황화 화합물 및 음전하 생성용 화합물이 치환된 상기 폴리에틸렌이민을 pH 7-8의 버퍼용액에 용해하여 준비한다. 여기에 가교제를 첨가하여 가교반응시켜 본 발명에 따른 약물전달용 나노입자를 제조할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 약물전달용 나노입자의 제조를 위해서, 상기 담즙산은 상기 폴리에틸렌이민에 존재하는 1차 및 2차 아민의 전체 몰에 대해 20 내지 30 몰%로 혼합되는 것이 바람직한데 왜냐하면 상기 범위로 혼합해야만 상기 화학식 1로 표시되는 폴리에틸렌이민에 대한 상기 담즙산의 치환도가 10-19%가 되도록 수득할 수 있기 때문이다.
또한, 상기 이황화 화합물은 상기 폴리에틸렌이민에 존재하는 1차 및 2차 아민의 전체 몰에 대해 10 내지 20 몰%로 혼합되는 것이 바람직한데 왜냐하면 상기 범위로 혼합해야만 상기 화학식 1로 표시되는 폴리에틸렌이민에 대한 상기 이황화 화합물의 치환도가 6.2-12.5%를 달성할 수 있기 때문이다.
상기 음전하 생성용 화합물은 상기 폴리에틸렌이민에 존재하는 1차 및 2차 아민의 전체 몰에 대해 40 내지 50 몰%로 혼합되는 것이 바람직한데 왜냐하면 상기 폴리에틸렌이민에 대한 상기 음전하 생성용 화합물의 치환도가 15-30 몰%를 달성할 수 있기 때문이다.
다만, 이때 사용한 상기 폴리에틸렌이민은 아미노기 수소가 치환되기 이전에 상기 폴리에틸렌이민에 존재하는 1차 및 2차 아민과 3차 아민의 비율이 2-4 : 1 인 것을 사용하는 것이 바람직한데, 왜냐하면 폴리에틸렌이민의 3차 아민은 pKa가 11.5로 정상조직의 pH인 7.4에서도 양성자화되며, 3차 아민에는 이황화 화합물 또는 음전하 생성용 화합물의 치환이 용이하지 않아 혼합 시 치환 가능한 아민기의 확보가 필요하기 때문이다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 약물전달용 나노입자; 및 상기 약물전달용 나노입자 내부에 봉입된 약물;을 포함하는 암 치료 또는 암전이 억제용 약학적 조성물에 관한 것이다.
상술한 바와 같이 상기 약물전달용 나노입자는 그 자체로 가용화된 약물의 항암효과를 나타낼 수 있는 소수성 화학약물을 암세포로 전달하는 약물 전달체로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 암 치료 또는 암전이 억제용 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양의 약물을 단독으로 포함하거나, 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 약물이 동물 또는 사람에게 투여되어 목적하는 생리학적 또는 약리학적 활성을 나타내기에 충분한 양을 말한다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 투여 대상의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.
상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 암 치료 또는 암 전이 억제용 약학적 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 약물의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다. 또한, 본 발명의 약물 전달용 고분자 조성물은 약물이 목적하는 효과를 상승시킬 수 있는 공지의 화합물과도 병행하여 투여할 수 있다.
상기 약물은 파클리탁셀 (paclitaxel), 독소루비신 (doxorubicin), 레티노익 산 (retinoic acid)계열, 시스플라틴 (cis-platin), 캄토세신 (camptothecin), 5-FU, 도세탁셀 (Docetaxel), 타목시펜(Tamoxifen), 아나스테로졸(anasterozole), 카보플라틴(carboplatin), 토포테칸(topotecan), 베로테칸(belotecan), 이리노테칸(irinotecan), 글리벡(gleevec) 및 빈크리스틴(vincristine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나이상의 항암제일 수 있고, 소수성을 갖는 약물을 봉입하는 것이 바람직하다.
상기 약학적 조성물은 정상체내 조건인 pH 7.2 내지 8.0 범위에서는 표면전하가 양전하를 띄고 있기 때문에 세포 내로 흡수되지 못하는데 반해, 암 질환 조직의 비정상 조건인 pH 6.0 내지 6.8 범위에서는 표면전하가 양전하에서 음전하로 변환되어, 암 세포 내로 흡수 및 침투되어, 상기 암세포 내부에서 약물을 방출할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 약학적 조성물로 치료가 가능한 암은 폐암, 자궁암, 자궁경부암, 전립선암, 두경부암, 췌장암, 뇌종양, 유방암, 간암, 피부암, 식도암, 고환암, 신장암, 대장암 및 직장암 중에서 선택되는 어느 하나이상일 수 있다.
이하에서 실시예 등을 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 하며, 다만 이하에 실시예 등에 의해 본 발명의 범위와 내용이 축소되거나 제한되어 해석될 수 없다. 또한, 이하의 실시예를 포함한 본 발명의 개시 내용에 기초한다면, 구체적으로 실험 결과가 제시되지 않은 본 발명을 통상의 기술자가 용이하게 실시할 수 있음은 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연하다.
또한 이하에서 제시되는 실험 결과는 상기 실시예 및 비교예의 대표적인 실험 결과만을 기재한 것이며, 아래에서 명시적으로 제시하지 않은 본 발명의 여러 구현예의 각각의 효과는 해당 부분에서 구체적으로 기재하도록 한다.
실험재료
가지화 폴리에틸렌이민(MW=1.8 kDa, 25% NH2, 50% NH와 25% N)(이하, bPEI로 칭하기로 한다.)은 Polysciences Inc.(warrington, PA, USA)에서 구입하였다. 리토콜산(Lithocholic acid; LCA), 3-(2-피리딜디티올)프로피오닉산 N-하이드로숙신이미드 에스터(3-(2-pyridyldithio)propionic acid N-hydroxysuccinimide ester; SPDP), 디시클로헥실카르보디이미드(dicyclohexylcarbodiimide; DCC), N-하이드로숙신이미드(N-hydroxysuccinimide; NHS), 독소루비신 하이드로클로라이드(doxorubicin hydrochloride; DOX·HCl), DL-디티오트레이톨(DL-dithiothreitol; 가교제), 트리메틸아민(trimethylamine), 피리딘(pyridine), 디메틸설폭시드(dimethylsulfoxide; DMSO) 및 세포 개체수 측정용 키트-8(cell counting kit-8; CCK-8)는 모두 시그마-알드리치(St. Louis, MO, USA)를 통해 구입하였다. 근적외선 형광 염료(The near-infrared fluorescent dye), Cy5.5-NHS 에스터는 GE Healthcare(Piscataway, NJ, USA)를 통해 얻은 것을 사용하였다. 2,3-디메틸말레익 언하이드라이드(2,3-Dimethylmaleic anhydride; DMA)는 Alfa Aesar(Ward Hill, Massachusetts, USA)에서 구입한 것을 사용하였다.
소태아혈청(fetal bovine serum; FBS), 세포 배양액 RPMI 1640, Dulbecco's phosphate buffered saline(DPBS), antibiotic-antimycotic solution(AA) 및 트립신-EDTA 등의 세포 배양을 위한 제품은 WelGENE (Seoul, Korea)으로부터 구입한 것을 사용하였다. Squamous cell carcinoma (SCC7) 세포는 American Type Culture Collection(Rockville, MD, USA)로부터 구입하였다.
모든 살아있는 동물과 모든 실험은 관련 법률과 기관 위원회의 승인을 받은 성균관대의 제도적 지침을 준수하여 수행하였다.
모든 다른 화합물 및 시약은 특별한 기재가 없는 한, 분석용 AG(analytical grade)을 사용하였다.
실험기기
1H-NMR 스펙트라는 Varian Unity 500 MHz 스펙트로미터(Palo Alto, CA, USA)를 사용하여 얻었다. 이때, D2O와 CD3OD 및 듀테로화한 디메틸 설폭시드(dimethyl sulfoxide; DMSO-d 6)를 용매로 사용하였다.
약물전달용 나노입자의 유체역학 크기 분배 및 제타포텐셜은 동적광산란(dynamic light scattering; DLS)으로 측정하였다. 이때, 사용된 측정 기기는 He-Ne laser(633nm)를 갖는 Zetasizer Nano ZS90(Malvern Instruments, Worcestershire, UK)을 사용하였다. 이때 측정하기 위한 시료는 0.5 내지 0.1 mg/㎖의 농도로 준비하고, 이를 0.45 ㎛ 실린지 필터로 여과한 것을 사용하였다.
FE-SEM의 경우, 15 kV 에서 작동하는 JEOL-7600F(Tokyo, japan)을 사용하였다.
실험방법 1. 약물전달용 나노입자의 제타 포텐셜 측정.
시료(P-NPs, CC-NPs)를 0.1 ㎎/㎖ 농도의 PBS(phosphate buffered saline) 용액(pH 7.4, 6.5)에 분산시켰다. 이후, 각기 다른 배양 시간으로 배양한 후, 제타 포텐셜을 모니터하였다. 각각의 측정은 총 3번씩 반복하여 수행하였다.
실험방법 2. 약물전달용 나노입자의 안정성 측정
37 ℃하에서 시료(P-NPs, CC-NPs)를 0.5 ㎎/㎖ 농도의 PBS(phosphate buffered saline) 용액(pH 7.4, 6.5)에 분산시키고, 이를 100 rpm으로 오비탈 혼합기를 사용하여 저어주었다. 그리고 나서, 5일 동안 상기 시료의 입경 변화를 모니터하였다.
또한, 물리적인 조건에 따라 시료의 세럼 안정성을 조사하기 위해서는 37 ℃의 10 % FBS를 포함하는 PBS에 시료를 분산시키고, 24 시간동안 상기 시료들의 입경 변화를 각 지점에서 측정하였다.
실험방법 3. 약물전달용 나노입자에 봉입된 DOX 함량과 DOX 의 봉입효율 분석.
DOX의 봉입된 함량(loading content; LC)과 봉입효율(loading efficiency; LE)을 측정하기 위해서, 시료(DOX, DOX-P-NPs, DOX-CC-NPs)를 증류수/DMSO(1:3 v/v)에 용해시키고, 상기 UV-Vis 스펙트로포토미터(optizen 33320, mecasys Inc., Korea)를 사용하여 480 ㎚에서 흡광도를 측정하여 DOX의 농도를 평가하였다.
이때, 검량선(calibbration curve)를 통해 상기 시료의 DOX 농도를 계산하는데, 상기 검량선은 각기 다른 DOX 농도가 용해된 증류수/DMSO(1:3 v/v) 용액을 제조하고, 이들에 대한 480 ㎚ 흡광도를 측정하여 얻을 수 있다.
상기 LE와 LC는 아래 수학식 1, 2를 통해 계산하였다.
Figure 112015126368208-pat00003
Figure 112015126368208-pat00004
상기 식에서,
weight of the loaded drug는 약물전달용 나노입자 내에 봉입된 약물의 무게를 의미하고, weight of drug in feed는 약물전달용 나노입자 내에 봉입시키기 위해 첨가된 약물의 총 무게를 의미하며, weight of drug in polymer는 약물이 봉입된 상태의 약물전달용 나노입자 전체 무게를 의미합니다.
실험방법 4. 세포독성 분석.
24 시간 예비 처리후, CCK-8 에세이에 의해 측정된 SCC7 세포(murine squamous cell carcinoma cell line)의 생존율을 통해 비교예 9로부터 제조된 P-NPs 및 실시예 2로부터 제조된 CC-NPs의 세포독성을 평가할 수 있다. 실험방법은 아래와 같다.
세포독성 실험을 하기 위해, 우선 SCC7 세포(1 × 104 cells per wall)는 96 웰 플레이트상에 심어진 후, 100 ㎕ RPMI 1640 배지를 첨가한 후, 37 ℃, 5% CO2 분위기 하에서 24시간 동안 배양하였다. 이후 다양한 조성의 고분자 용액(p-NPs 또는 CC-NPs)을 25 시간동안 세포와 배양하고, 상기 플레이트의 각 웰의 배지에 200 ㎕의 CCK-8 용액(10 v/v% in RPMI 1640)을 넣고, 2 시간동안 더 배양하였다.
이후, 상기 각 웰에 존재하는 세포의 생존율을 마이크로플레이트 리더기(Synergy HT Multi-Mode microplage reader, Biotek, USA)로 450 ㎚의 흡광도를 측정하였다.
본 발명에서 수행하는 생체 외 세포 실험은 SCC7 세포를 사용하였다.
다만, DOX가 봉입된 약물전달용 나노입자의 세포독성은 SCC7 세포(1 × 104 cells per wall)는 96 웰 플레이트에 접지하고, 배양한 후, 아래 설명한 바와 같이 24 시간동안 배양하였다. 다양한 pH 조건(pH 7.4 또는 6.5)에서 DOX의 다양한 농도를 갖는 배지에 존재하는 DOX가 봉입된 비교예 9로부터 제조된 P-NPs 및 실시예 2로부터 제조된 CC-NPs를 플레이트에 첨가하고 3 시간동안 배양하였다. 세포 생존율(%)은 오직 세포 배양 배지에서 성장한 세포를 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
실험방법 5. 시험관에서 (in vitro) 약물 방출
DOX가 봉입된 시료 용액 1 ㎎/㎖을 투석막 백(MWCO = 1 kDa)에 놓아 두었다. 방출 시험은 각기 다른 방출 배양액(PBS(pH 7.4), PBS(pH 6.5), 10 mM GSH를 포함하는 PBS(pH 7.4), 10 mM GSH를 포함하는 PBS(pH 6.5)을 상기 투석막 백 안에 넣고, 설정된 시간 간격에, 상기 방출 배양액을 새로운 방출 배양액으로 갈아준 후, 이를 UV-Vis 스펙트로포토미터를 사용하여 480 ㎚에서 흡광도를 측정함으로써 방출된 DOX의 양을 계산하였다.
실험방법 6. 라벨링된 시료의 형광 측정.
형광체로 라벨된 시료의 형광을 분석하였다. 본 발명의 실험에서는 Cy 5.5를 사용하여 시료를 라벨링하였다. 구체적으로, 시료를 PBS(pH7.4)에 용해시키고, 여기에 Cy5.5-NHS (3 ㏖% of primary amine, 2 ㎎/㎖ in DMSO)를 서서히 첨가하여준 후, 상온에서 밤새 저어주고, 미반응 Cy5.5를 제거하기 위해서 2 일간 셀룰로오스 막(MWCO=1 kDa)을 사용하여 증류수에서 투석하여, 청색의 용액을 얻었다. 이를 동결건조하여 라벨링된 시료를 수득하였다. 이 모든 과정은 암(dark)환경에서 수행되었다.
실험방법 7. 시험관에서 (in vitro) 세포내 침투 분석을 위한 세포와 시료 혼합.
Cy5.5로 라벨된 시료와 세포를 3 시간동안 배양하는데, 구체적인 실험 내용은 아래와 같다. SCC7 세포를 젤라틴이 코팅된 6 웰 플레이트(6 well plates)의 슬립(slips)에 웰당 1 × 105(cell per well)의 세포 밀도로 접지하고, 2 ㎖ RPMI 1640(10 % FBS, 1 % AA)에서 24 시간동안 배양하였다. 상기 배양액은 pH 7.4 또는 6.5에서 100 ㎍/㎖의 농도의 Cy5.5로 라벨된 시료를 포함하는 배양액으로 바꿨다. 그리고, 상기 세포는 5 % CO2를 포함하는 대기 분위기하에서 37 ℃에서 3 시간동안 배양한 다음, DPBS로 두 번 세척하고, 4 % 파라포름알데히드 용액으로 고정하였다. 이후, 상기 세포의 핵을 4,6-디아미디노-2-페닐인돌(4,6-diamidino-2-phenylindole)을 사용하여 염색하고, 고정된 상기 세포를 공초점 레이저 현미경(LSM 510 META NLO, Carl Zeiss GmbH, Heidelberg, Germany)을 사용하여 관찰하였다.
실험방법 8. 시험관에서 (in vitro) DOX 가 봉입된 시료의 세포 내 침투를 유 세포 분석(flow cytometric analyses) 방법.
SCC7 세포를 6 웰 플레이트(6 well plates)의 슬립(slips)에 웰당 1 × 105(cell per well)의 세포 밀도로 접지하고, 5% CO2를 포함하는 대기 분위기, 37 ℃에서 세포를 24 시간동안 배양하였다. 배양액을 pH 7.4 또는 6.5인 DOX가 봉입된 시료(DOX dose = 1 ㎍/㎖)를 포함하는 배양액으로 바꿨다. 이후, DPBS로 두 번 상기 세포를 세적하고, 트립신 처리하여 수득한 후, 수득된 세포를 DPBS에 현탁한 다음, 1500 rpm, 3 분, 4 ℃ 조건에서 원심분리하였다. 원심분리한 세포 펠렛(cell pellets)에서 배양액에 잔재하는 형광체를 제거하기 위해, DPBS로 두 번 세척하였다. 이후 세포를 DPBS 200 ㎕로 재현한 후, 유세포 분석기기(flow cytometry; guava easyCyte, EMD Millipore, USA)를 사용하여 측정하였다. 세포에 아무처리도 하지 않은 것을 대조군으로 사용하였다.
실험방법 9. 생체 내에서(in vivo ), 생체 외에서(ex vivo ), 근적외선 형광 (NIRF; near-infrared fluorescence) 이미지 분석 방법.
SCC7 종양이 이식된 마우스는 DPBS(60 ㎕)에 분산된 세포(1 × 106 cells for each mouse) 용액을 무흉선(athymic) 누드마우스의 등(dorsa) 정맥(intravenous)을 통해 피하(subcutaneous)에 주입하여 준비하였다.
상기 준비된 마우스에 200 ㎕의 시료를 마우스의 꼬리 정맥을 통해(n = 3 per group) 처리하였다.
형광 이미지는 eXplore Opix system(ART advanced Research Technologies, Inc., Montreal, Canada)를 이용하여 시간 지점마다 미리 검출하였다. 여기서, 분석용 Workstation software(ART Advanced Reasearch Technoogies, Inc., Montreal, Canada)의 관심영역(ROI) 기능을 사용하여, tp 동물의 그룹에서 평균 수치를 측정함으로써, 결과와 데이터를 계산하였다.
실험방법 10. 생체 내에서(in vivo ), 항암 효율 분석.
SCC7 종양이 이식된 마우스는 C3H/HeN 마우스에게 생리 saline(60 ㎕)에 있는 SCC7 종양세포(1 × 106 cells for each mouse)의 피하 주입에 의해 준비되었다. 상기 DOX는 1 회분이 마우스 몸무게 당 2 ㎎ 또는 5 ㎎로 고정하였고, 마우스는 총 5 군으로 나눴다.
실험군 1(saline) : 200 ㎕를 주입하였다.
실험군 2(free DOX(2㎎/㎏)) : 마우스의 몸무게 1 kg당 2 ㎎ DOX를 200 ㎕의 saline에 녹여 정맥주사하였다.
실험군 3(PNP(2㎎/㎏ DOX)) : 비교예 3으로부터 제조된 DOX-P-NPs를 주입하되, 마우스 몸무게 1 kg당 2 mg DOX가 주입되도록 정맥주사하였다.
실험군 4(CCNP(2㎎/㎏ DOX)) : 실시예 3으로부터 제조된 DOX-CC-NPs를 주입하되, 마우스 몸무게 1 ㎏당 2 ㎎ DOX가 주입되도록 정맥주사하였다.
실험군 5(CCNP(5㎎/㎏ DOX)) : 실시예 3으로부터 제조된 DOX-CC-NPs를 주입하되, 마우스 몸무게 1 ㎏당 5 ㎎ DOX가 주입되도록 정맥주사하였다.
상기 암 부피는 이식성 전이가 발생하기 전인 200 ㎣ 크기일 때까지 실험하였고, 상기 시료는 매일 3일 동안 꼬리 정맥을 통해 4번 주입하였다. 14일 동안 캘리퍼를 사용하여 암 성장을 매일 모니터하였다. 암 부피는 (a×b2)/2로 계산하였다. 이때 a는 길이(length)고, b는 너비(width)이다.
H&E 조직학적 염색을 위해서는, 암조직 및 여러 장기 조직들을 각 실험군으로 14 일이 지난 후 적출하여, 4% 포름알데히드 용액에 24 시간 처리하여 고정한 후, 탈파라핀화한(deparaffinized) 조직을 준비하고, 암조직 및 여러 장기 조직들의 부위(5 ㎛)를 H&E(hematoxylin and eosin)으로 염색한 다음, 광학 현미경(BX 51, Olympus, USA)으로 관찰하였다.
실시예 1. bPEI - LCA - SPDP -DMA 고분자의 제조.
[반응식 1]
Figure 112015126368208-pat00005
1) bPEI - LCA 컨쥬게이트
bPEI-LCA 컨쥬게이트를 합성하기 위하여 [D. Kim, D. Lee, Y. L. Jang, S. Y. Chae, D. Choi, J. H. Jeong, S. H. Kim, Eur . J. Pharm . Biopharm . 2012, 81, 14.] 논문을 참조하였다. LCA의 카르복실기와 bPEI의 아미노기를 컨쥬게이트 시키는데, 이러한 과정을 아래에서 구체적으로 설명하였다.
우선, LCA(1.0 g, 2.7 mmol)을 테트라하이드로퓨란(25 ㎖)에 용해하고, 여기에 DCC(0.66 g, 3.2 mmol)와 NHS(0.37 g, 3.2 mmol)를 상온에서 첨가하여 혼합액을 제조하였다. 상기 혼합액을 12 시간 동안 질소 분위기 하에서 섞어준 후, 침전되는 디사이클로헥실우레아(dicyclohexylurea)를 여과하였다. 여과된 액체에 n-헥산(n-hexane)을 사용하여 침전물을 침전시키고, 여과한 후, 상온의 진공조건 하에서 건조하여 LCA-NHS(NHS-activated LCA)를 얻었는데, 이때 수율은 94%이였다.
상기 활성화된 LCA(0.99g, 2.1 mmol)와 bPEI(0.6g, equivalent to 10.5 mmol of -NH2, -NH-)를 컨쥬게이트하였다. bPEI와 LCA-NHS는 메틸렌 클로라이드에 용해하였고, 여기에 bPEI 용액을 혼합하여 밤새 반응시킨 후, 회전농축기(rotary evaporator)를 이용하여 건조하고, 이를 0.1 M 염산에 용해한 다음 메탄올/증류수 및 증류수로 4일 동안 투석하고(MWCO = 1 kDa), 동결건조(MW = 3.1 kDa, 1HNMR 스펙트럼으로 검량하였다)하여 bPEI-LCA 컨쥬케이드를 합성하였다.
1HNMR(500 MHz, D2O/CD3OD)δ(ppm):3.33-2.51(m, 4H), 0.60(s, 3H).
2) bPEI - LCA - SPDP 합성
상기 1) 단계에서 얻은 bPEI-LCA 컨쥬케이드(0.2 g, equivalent to 3.1 mmol of -NH2 and -NH-)를 3 ㎎/㎖ 농도로 100 mM 소듐포스페이트 버퍼액(sodium phosphate buffer)에 용해하여 bPEI-LCA 용액을 제조하였다. 또한 SPDP(193.3 ㎎, 0.62 mmol)는 25 mM로 무수 DMSO(24.8 ㎖)에 용해한 후, 여기에 상기 bPEI-LCA 용액을 서서히 혼합하고, 이를 상온에서 12시간 동안 반응시켰다. 상기 결과물을 메탄올/증류수와 증류수로 3일 동안 투석(MWCO = 1kDa)한 후, 동결건조(MW = 3.1 kDa, UV-vis 스펙트로포토미터로 측정하였다)하여 bPEI-LCA-SPDP를 합성하였다.
3) bPEI - LCA - SPDP -DMA 합성
상기 2) 단계에서 얻은 bPEI-LCA-SPDP(0.1 g, 1.43 mmol of -NH2 and ??NH-)과 10 ㎖ 메탄올을 100 ㎖ 플라스크에 넣어 마그네틱바로 섞어준 후, 이를 무수 DMSO 4 ㎖에 용해된 DMA(90 ㎎, 0.72 mmol) 용액과 혼합하여 준 다음, 질소 분위기 하에서 트리에틸아민(0.2 ㎖)과 피리딘(0.2 ㎖)를 첨가하고, 48 시간 동안 상온에서 섞어준 후, 이를 3일 동안 유기 용매를 제거하기 위해서 증류수로 투석(MWCO = 1 kDa)하고, 동결건조(MW=4.3 kDa, 1HNMR 스펙트럼으로 계산하였다) 하였다.
1HNMR(500 MHz, DMSO-d 6 )δ(ppm) : 3.44-2.47(br, 4H), 0.53(s, 3H), 8.36-7.14(m, 4H), 1.82(s, 6H).
실시예 2. 표면전하 변환특성을 갖는 약물전달용 나노입자(CC- NPs )의 제조.
상기 제조예 1로부터 얻은 bPEI-LCA-SPDP-DMA(50 ㎎, 0.097 mmol of SPDP) 고분자를 PBS 버퍼액(phosphate buffer saline; pH 7.4)에 용해하고, 여기에 가교제인 DTT(22 ㎎, 0.15 mmol)을 첨가하여 24 시간동안 가교반응시킨 후, 증류수를 이용하여 2일 동안 투석(MWCO = 1 kDa)하여, 표면전하 변환특성을 갖는 약물전달용 나노입자(CC-NPs)를 얻었다.
실시예 3. DOX 가 봉입된 CC- NPs ( DOX -CC- NPs )의 제조.
DOX가 봉입된 약물전달용 나노입자를 제조하기 위해서, DMSO(10 ㎎/㎖)에 용해된 DOX·HCl 용액에 트리에틸아민을 첨가하였다. 여기에 DMSO(10 ㎎/㎖)에 용해된 실시예 2의 CC-NPs를 혼합하고 24 시간동안 섞어 준 후, 1 ㎎/㎖의 농도를 갖는 용액을 얻기 위해 프로브 형태의 초음파기기를 사용하여 PBS(pH 7.4)를 서서히 혼합하고, 1 시간 동안 저어 혼합액을 제조하였다. 상기 혼합액을 12 시간동안 증류수로 투석(MWCO = 1 kDa)하고, 봉입되지 않은 DOX를 제거하기 위해 0.8 ㎛ 실린지 필터로 이를 여과한 다음 동결건조하여 DOX-CC-NPs를 얻었다.
다만, 초음파 처리 후, 제조된 DOX-CC-NPs를 포함하는 용액에 DTT를 과량 첨가하여 준다.
실시예 4-7. 약물전달용 나노입자의 제조.
상기 제조예 1로부터 얻은 bPEI-LCA-SPDP-DMA(50 ㎎, 0.097 mmol of SPDP) 고분자 대신에 아래와 같은 조성으로 제조된 bPEI-LCA-SPDP-DMA을 사용한 것을 제외하고는 실시예 2와 동일하게 제조되었다.
표 1은 상기 분지화된 폴리에틸렌(bPEI)에 존재하는 1차 및 2차 아민의 총 몰에 대해 혼합된 LCA, SPDP 및 DMA 각각의 몰%를 나타낸 표이다.
LCA의 몰% SPDP
몰%		 DMA
몰%
실시예 4 20 20 20
실시예 5 20 30
실시예 6 20 40
실시예 7 20 50
이때, 상기 분지화된 폴리에틸렌(bPEI)은 분지화된 폴리에틸렌에 존재하는 1차 및 2차 아민과 3차 아민의 비율이 3 : 1인 것을 사용하였고, 상기 LCA, SPDP 또는 DMA는 각각 상기 분지화된 폴리에틸렌에 존재하는 1차 및 2차 아민의 전체 몰에 대해 상기 몰%로 각각 혼합하여 실시예 4-7을 제조하였다.
구체적으로, 상기 SPDP를 혼합할 당시, LCA가 치환된 분지화된 폴리에틸렌에 존재하는 1차 및 2차 아민의 전체 몰에 대한 상기 몰%로 혼합하여 제조하였고, 상기 DMA를 혼합할 당시, LCA 및 SPDP가 치환된 분지화된 폴리에틸렌에 존재하는 1차 및 2차 아민의 전체 몰에 대한 상기 몰%로 혼합하여 제조하였다.
비교예 1-5. bPEI - LCA 고분자 제조.
bPEI-LCA 컨쥬게이트를 합성하기 위하여 [D. Kim, D. Lee, Y. L. Jang, S. Y. Chae, D. Choi, J. H. Jeong, S. H. Kim, Eur . J. Pharm . Biopharm . 2012, 81, 14.] 논문을 참조하였다. LCA의 카르복실기와 bPEI의 아미노기를 컨쥬게이트 시키는데, 이러한 과정을 아래에서 설명한다.
우선, LCA(1.0 g, 2.7 mmol)을 테트라하이드로퓨란(25 ㎖)에 용해하고, 여기에 DCC(0.66 g, 3.2 mmol)과 NHS(0.37 g, 3.2 mmol)을 상온에서 첨가하여 혼합액을 제조하였다. 상기 혼합액을 12 시간 동안 질소 분위기 하에서 섞어준 후, 침전되는 디사이클로헥실우레아(dicyclohexylurea)를 여과하였다. 여과된 액체에 n-헥산(n-hexane)을 사용하여 침전물을 침전시키고, 여과한 후, 상온의 진공조건 하에서 건조하여 LCA-NHS(NHS-activated LCA)를 얻었는데, 이때 수율은 94%이였다.
상기 활성화된 LCA(0.99g, 2.1 mmol)와 bPEI(0.6g, equivalent to 10.5 mmol of -NH2, -NH-)를 컨쥬게이트하였다. bPEI와 LCA-NHS는 메틸렌 클로라이드에 용해하였고, 여기에 bPEI 용액을 혼합하여 밤새 반응시킨 후, 회전농축기(rotary evaporator)를 이용하여 건조하고, 이를 0.1 M 염산에 용해한 다음 메탄올/증류수 및 증류수로 4일 동안 투석하고(MWCO = 1 kDa), 동결건조(MW = 3.1 kDa, 1HNMR 스펙트럼으로 검량하였다)하여 bPEI-LCA 컨쥬케이드를 합성하였다.
1HNMR(500 MHz, D2O/CD3OD)δ(ppm):3.33-2.51(m, 4H), 0.60(s, 3H).
상기 실험은 비교예 1에 관한 것이고, 나머지 비교예 2 내지 5는 아래의 몰%에 따라 각각 제조하였다.
이때, 상기 분지화된 폴리에틸렌(bPEI)은 분지화된 폴리에틸렌에 존재하는 1차 및 2차 아민과 3차 아민의 비율이 3 : 1인 것을 사용하였고, 상기 LCA는 상기 분지화된 폴리에틸렌에 존재하는 1차 및 2차 아민의 전체 몰에 대해 5 몰%, 10 몰%, 15 몰%, 20 몰% 및 30 몰%로 각각 혼합하여 비교예 1 내지 5를 순서대로 제조하였다.
비교예 4-10. 양전하를 띄는 약물전달용 나노입자(P- NPs )의 제조.
상기 비교예 1 내지 5로부터 얻은 각각의 bPEI-LCA(50 ㎎)를 PBS 버퍼액(phosphate buffer saline; pH 7.4)에 각각 용해하고, 여기에 증류수를 이용하여 2일 동안 투석(MWCO = 1 kDa)하여, 자기 조립을 통해 형성된 비교예 6 내지 10의 약물전달용 나노입자(P-NPs)를 각각 얻었다.
구체적으로 비교예 1로부터 비교예 6을, 비교예 2로부터 비교예 7을, 비교예 3으로부터 비교예 8을, 비교예 4로부터 비교예 9를, 비교예 5으로부터 비교예 10을 얻었다.
비교예 11-15. DOX 가 봉입된 P- NPs ( DOX -P- NPs )의 제조.
DOX가 봉입된 약물전달용 나노입자를 제조하기 위해서, DMSO(10 ㎎/㎖)에 용해된 DOX·HCl 용액에 트리에틸아민을 첨가하였다. 여기에 DMSO(10 ㎎/㎖)에 비교예 6 내지 10의 P-NPs를 각각 용해하여 혼합하고, 24 시간동안 섞어 준 후, 1 ㎎/㎖의 농도를 갖는 용액을 얻기 위해 프로브 형태의 초음파기기를 사용하여 PBS(pH 7.4)를 서서히 혼합하고, 1 시간 동안 저어 혼합액을 제조하였다. 상기 혼합액을 12 시간동안 증류수로 투석(MWCO = 1 kDa)하고, 봉입되지 않은 DOX를 제거하기 위해 0.8 ㎛ 실린지 필터로 이를 여과한 다음 동결건조하여 비교예 11-15 각각의 DOX-P-NPs를 얻었다.
구체적으로 비교예 6으로부터 비교예 11을, 비교예 7로부터 비교예 12를, 비교예 8로부터 비교예 13을, 비교예 9로부터 비교예 14를, 비교예 10으로부터 비교예 15를 얻었다.
비교예 16 내지 19. bPEI - LCA - SPDP 고분자 제조.
표 2의 몰%로 LCA 및 SPDP를 혼합한다는 것을 제외하고는 모두 상기 실시예 1- 1) 및 2)와 동일하게 bPEI-LCA-SPDP 고분자를 합성하였다.
표 2는 상기 분지화된 폴리에틸렌(bPEI)에 존재하는 1차 및 2차 아민의 총 몰에 대해 혼합된 LCA 및 SPDP 각각의 몰%를 나타낸 표이다.
LCA의 몰%(치환도) SPDP
몰%
비교예 16 20(11.3) 10
비교예 17 20(11.3) 20
비교예 18 20(11.3) 30
비교예 19 20(11.3) 40
이때, 상기 분지화된 폴리에틸렌(bPEI)은 분지화된 폴리에틸렌에 존재하는 1차 및 2차 아민과 3차 아민의 비율이 3 : 1인 것을 사용하였고, 상기 LCA 또는 SPDP는 각각 상기 분지화된 폴리에틸렌에 존재하는 1차 및 2차 아민의 전체 몰에 대해 상기 몰%로 각각 혼합하여 비교예 16 내지 19을 제조하였다.
구체적으로, 상기 SPDP를 혼합할 당시, LCA가 치환된 분지화된 폴리에틸렌에 존재하는 1차 및 2차 아민의 전체 몰에 대한 상기 몰%로 혼합하여 제조하였다.
도 3은 본 발명의 실시예 1로부터 제조된 bPEI-LCA-SPDP-DMA 고분자(b)와 비교예 4로부터 제조된 bPEI-LCA 고분자(a)에 대한 1H NMR 스펙트라이다.
도 3a를 참조하면, 비교예 4로부터 제조된 bPEI-LCA 고분자는 자극에 감응하지 않는 고분자로, 본 발명의 약물전달용 나노입자의 대조군이다. 이러한 비교예 4의 bPEI-LCA 고분자는 분지화된 폴리에틸렌이민을 골격으로 하고, 여기에 LCA만으로 치환되어 있는 구조인 것을 알 수 있다.
반면, 도 3b를 참조하면, 실시예 1로부터 제조된 bPEI-LCA-SPDP-DMA 고분자는 분지화된 폴리에틸렌이민을 골격으로 하고, 이의 1 이상의 아미노기의 수소가 LCA, SPDP 및 DMA로 치환되어 있음을 확인할 수 있으며, LCA, SPDP, DMA 치환정도가 각각 11.3, 12.5, 21.5라는 것을 알 수 있다.
도 4a는 비교예 9로부터 제조된 P-NPs와 실시예 2로부터 제조된 CC-NPs의 입경분포를 나타낸 그래프이고, 도 4b는 비교예 9로부터 제조된 P-NPs를 FE-SEM으로 촬영한 사진이고, 도 4c는 실시예 2로부터 제조된 CC-NPs를 FE-SEM으로 촬영한 사진이다.
도 4를 참조하면, 비교예 9로부터 제조된 P-NPs와 실시예 2로부터 제조된 CC-NPs는 구형의 약물전달용 나노입자인데, 비교예 9로부터 제조된 P-NPs는 표면전하가 양전하를 띄는 것을 특징으로 하고, 실시예 2로부터 제조된 CC-NPs는 가교결합을 통해 형성된 전하변환 가능하다는 것을 특징으로 한다.
상기 비교예 9로부터 제조된 P-NPs와 실시예 2로부터 제조된 CC-NPs 약물전달용 나노입자는 평균 입경이 단봉(unimodal)형의 분포 곡선을 가지고, 평균 입경은 각각 191 내지 198 ㎚인 것을 알 수 있다.
표 3은 비교예 9로부터 제조된 P-NPs와 실시예 2로부터 제조된 CC-NPs의 크기분포를 비롯한 다양한 물리화학적 특성을 측정하여 나타낸 것이다.
feed ratioa )
[몰%]		 (치환도)degree of substitutionb )
[%]		 size
[㎚]		 PDIc ) zeta potentials
[mV]
비교예 4
(bPEI-LCA 고분자)		 20 - 191.3 ± 0.9 0.21 20.9 ± 3.9
실시예 1
(bPEI-LCA-SPDP-DMA 고분자)		 20(SPDP) 12.5 255.1 ± 5.9 0.21 -13.3 ± 2.4
50(DMA) 21.5
실시예 2
(CC-NPs)		 - - 198.4 ± 3.0 0.06 -11.4 ± 2.2
상기 표 3에서,
a) pH 7.4에서 실험을 수행하였고, 그 결과는 평균 ± 표준오차로 표기하였다. 상기 분지화된 폴리에틸렌(bPEI)에 존재하는 1차 및 2차 아민의 총 몰에 대해 혼합된 SPDP 및 DMA 각각의 몰%를 나타내는 것이고,
b) 분지화된 PEI에 존재하는 이차 아민과 이차 아민의 전체 몰에 대해 치환된 SPDP와 DMA 각각의 치환된 몰%를 나타낸 것이며,
c) polydispersity index를 의미하는 것이다.
표 3을 참조하면, 실시예 2로부터 제조된 CC-NPs의 평균입경의 분포 곡선이 비교예 9로부터 제조된 P-NPs의 평균입경의 분포 곡선보다 좁다는 것을 알 수 있다. 상기 제타 포텐셜은 pH 7.4에서 측정한 것으로 실시예 1 및 2는 표면전하가 음전하인데 반해, 비교예 4의 bPEI-LCA 고분자의 제타포텐셜은 양전하임을 알 수 있다.
도 5a는 pH 7.4 또는 pH 6.5에서 측정된 비교예 9로부터 제조된 P-NPs와 실시예 2로부터 제조된 CC-NPs의 제타 포텐셜을 나타낸 그래프이다.
도 5a를 참조하면, 실시예 2로부터 제조된 CC-NPs는 pH 7.4에서 -11.4 ± 2.23 mV의 제타 포텐셜이 측정된 것으로부터, 상기 실시예 2의 CC-NPs의 표면은 음전하 생성용 화합물의 카르복실기의 존재로 인해, 음전하를 띄고있음을 확인하였다. 또한, 실시예 2로부터 제조된 CC-NPs는 pH 6.5에서 + 12.4 ± 0.23 mV로 음전하를 띄던 표면이 양전하로 변환되었음을 확인하였는데, 이를 통해 실시예 2로부터 제조된 CC-NPs의 쉘층은 분지화된 폴리에틸렌이민(branched polyethyleneimine) 골격과 아마이드 결합으로 연결된 음전하 생성용 화합물(DMA)로 이루어져 있고, 상기 아마이드 결합은 pH가 6.5로 낮아짐에 따라 가수분해되어 붕괴되고, 양전하를 띄는 담즙산의 코어 외면이 드러나게 되면서 음전하에서 양전하로 표면전하가 변환되는 것으로 보여진다.
대조적으로 비교예 9로부터 제조된 P-NPs는 pH가 7.4에서 6.5로 변함에 따라 + 20.9 ± 2.02 mV에서 + 28.4 ± 1.65 mV로 제타 포텐셜의 변화가 거의 없는 것을 확인하였다.
도 5b는 pH 7.4와 6.5에서 시간에 따른 비교예 9로부터 제조된 P-NPs와 실시예 2로부터 제조된 CC-NPs의 제타 포텐셜의 변화를 측정한 그래프이다.
도 5b에 나타난 바와 같이, 3 시간동안 pH에 따른 제타 포텐셜 변화를 관찰한 결과, 도 5a에서와 같이 실시예 2로부터 제조된 CC-NPs는 암 세포외 환경과 같은 pH 6.5의 약산성 조건에서 음전하에서 양전하로 표면전하가 즉시 변환되는 것을 확인하였고, 이에 반해 비교예 9로부터 제조된 P-NPs는 pH 조건이 변하더라도 전혀 표면전하가 변환되지 않음을 확인하였다.
도 6은 5일 동안 PBS(pH 7.4) 존재하에서 비교예 9로부터 제조된 P-NPs와 실시예 2로부터 제조된 CC-NPs의 안정성을 확인하기 위해, 각각의 약물전달용 나노입자의 평균 입경 변화를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 6에 나타난 바와 같이, pH 7.4인 PBS 버퍼액 존재하에서, 비교예 9로부터 제조된 P-NPs와 실시예 2로부터 제조된 CC-NPs의 안정성을 비교한 결과, 비교예 9로부터 제조된 P-NPs는 하루만에 평균 입경이 300 ㎚로, 약 0.5 배 이상 커졌으나, 실시예 2로부터 제조된 CC-NPs는 5일 동안 평균 입경이 200 ㎚로 일정하게 유지되고 있음을 확인할 수 있었다.
이는 비교예 9로부터 제조된 P-NPs는 소수성 상호작용을 통해 자기조립(self-assembled)되어 형성된 것이기 때문에, 안정성이 현저히 낮은데 반해, 실시예 2로부터 제조된 CC-NPs는 이황화 결합에 의해, 상기 CC-NPs를 구성하는 고분자 간에 가교결합을 형성하고 있으므로, 비교예 9의 P-NPs와 달리 평균 입경이 크게 변화하지 않은, 우수한 안정성을 나타낸다.
도 7a는 24 시간동안, 10% FBS(fetal bovine serum)를 포함하는 PBS(pH 7.4)에서 배양한 후, 비교예 9로부터 제조된 P-NPs와 실시예 2로부터 제조된 CC-NPs의 안정성을 확인하기 위해, 각각의 약물전달용 나노입자의 평균 입경 변화를 측정하여 나타낸 그래프이고, 도 7b는 24 시간동안, 10% FBS(fetal bovine serum)를 포함하는 PBS(pH 7.4)에서 배양한 후, 비교예 9로부터 제조된 P-NPs와 실시예 2로부터 제조된 CC-NPs의 안정성을 확인하기 위해, 각각의 약물전달용 나노입자의 입경 분포를 나타낸 그래프이다.
도 7a와 도 7b는 생체내 조건과 유사한 환경으로 조성된 세럼을 포함하는 배양액에서 약물전달용 나노입자의 입경 변화를 측정함으로써 약물전달용 나노입자의 비특이적 상호작용과 구조적 안정성을 조사할 수 있었다. 결과적으로 실시예 2로부터 제조된 CC-NPs는 24 시간 동안 우수한 안정성과 단봉(unimodal)형 입경 분포 그래프가 나타났다.
이와 대조적으로 비교예 9로부터 제조된 P-NPs는 초기 입경의 53%까지 극도로 감소하였고, 다봉(multimodal)형 입경 분포 그래프를 가졌으며, 이는 비교예 9로부터 제조된 P-NPs가 상당히 붕괴되었음을 나타내는 것이다.
표 4는 각 비교예 14로부터 제조된 DOX-P-NPs와 실시예 3으로부터 제조된 DOX-CC-NPs에 항암제인 독소루비신(doxorubicin; DOX)을 봉입하고, 각각에 대한 특성을 측정하여 나타낸 것이다.
sizea)
[㎚]		 zeta potentialsa)
[mV]		 loading efficiency;
LE [%]		 loding content; LC [%]
비교예 14
DOX-P-NP		 205.5 ± 2.1 20.5 ± 1.4 78.2 7.8
실시예 3
DOX-CC-NP		 195.4 ± 2.1 -11.0 ± 1.2 77.0 7.7
상기 표 4에서,
a) pH 7.4에서 실험을 수행하였고, 그 결과는 평균 ± 표준오차로 표기하였다.
표 4에 나타난 바와 같이, 비교예 14로부터 제조된 DOX-P-NPs와 실시예 3으로부터 제조된 DOX-CC-NPs의 치료 효과를 조사하기 위해서, 비교예 14로부터 제조된 DOX-P-NPs와 실시예 3으로부터 제조된 DOX-CC-NPs에 항암제인 독소루비신을 봉입하였다. 이때 상기 비교예 14로부터 제조된 DOX-P-NPs와 실시예 3으로부터 제조된 DOX-CC-NPs에 각각 봉입된 독소루비신의 함량(loding content)은 78%, 77%였다.
도 8은 시험관에서(in vitro), 10 mM GSH가 존재하는 경우와 존재하지 않는 경우에 비교예 14로부터 제조된 DOX-P-NPs와 실시예 3으로부터 제조된 DOX-CC-NPs의 독소루비신(DOX)의 방출 정도를 측정하여 나타낸 그래프이다. 이때 pH 7.4이고, 데이터는 평균 ± 표준오차로 표기하였다.
도 8에 나타난 바와 같이, 혈관과 암세포의 세포 내 환원 환경과 유사한 조건 하에서, 약물 방출에 GSH의 영향을 평가하였다.
도 8 상에 GSH가 존재하지 않는 경우의 비교예 14로부터 제조된 DOX-P-NPs는 'P-NP(GSH 0 mM)'로 표기하였고, GSH가 존재하지 않는 경우의 실시예 3으로부터 제조된 DOX-CC-NPs는 'CC-NP(GSH 0 mM)'로 표기하였고, 10 mM GSH가 존재하는 경우의 비교예 14로부터 제조된 DOX-P-NPs는 'P-NP(GSH 10 mM)'로 표기하였고,10 mM GSH가 존재하는 경우의 실시예 3으로부터 제조된 DOX-CC-NPs는 'CC-NP(GSH 10 mM)'로 표기하였다.
pH 7.4하에서, 0 mM GSH(글루타치온)가 존재하지 않는 경우, 24 시간 동안 반응시킨 결과, 실시예 3으로부터 제조된 DOX-CC-NPs는 DOX를 25% 방출하였고, 비교예 14로부터 제조된 DOX-P-NPs는 DOX를 46% 방출하였음을 확인할 수 있다. 즉, 실시예 3으로부터 제조된 DOX-CC-NPs는 이황화 결합이 확산 막으로 활동함으로써, 실시예 3으로부터 제조된 DOX-CC-NPs로부터 서서히 DOX가 방출되었다.
한편, pH 7.4하에서 10 mM GSH가 존재하는 경우, 24 시간동안 반응시킨 결과, 실시예 3으로부터 제조된 DOX-CC-NPs는 DOX를 90% 이상 방출하였고, 비교예 14로부터 제조된 DOX-P-NPs는 GSH가 존재하지 않는 경우와 유사한 정도로 DOX(약 50%)를 방출하였음을 확인할 수 있다.
도 9는 시험관에서(in vitro), 10 mM GSH가 존재하는 경우와 존재하지 않는 경우에 비교예 14로부터 제조된 DOX-P-NPs와 실시예 3으로부터 제조된 DOX-CC-NPs의 독소루비신(DOX)의 방출 정도를 측정하여 나타낸 그래프이다. 이때 pH 6.5이고, 데이터는 평균 ± 표준오차로 표기하였다.
도 9 상에 GSH가 존재하지 않는 경우의 비교예 14로부터 제조된 DOX-P-NPs는 'P-NP(GSH 0 mM)'로 표기하였고, GSH가 존재하지 않는 경우의 실시예 3으로부터 제조된 DOX-CC-NPs는 'CC-NP(GSH 0 mM)'로 표기하였고, 10 mM GSH가 존재하는 경우의 비교예 14로부터 제조된 DOX-P-NPs는 'P-NP(GSH 10 mM)'로 표기하였고,10 mM GSH가 존재하는 경우의 실시예 3으로부터 제조된 DOX-CC-NPs는 'CC-NP(GSH 10 mM)'로 표기하였다.
도 9에 나타난 바와 같이, pH 6.5에서 측정된 DOX의 방충 정도는 pH 7.4에서 측정된 DOX 방출 정도와 유사한 성향으로 관찰되었다. 다만 실시예 3으로부터 제조된 DOX-CC-NPs의 경우 산에 불안정산 아미드 결합을 갖고 있기 때문에, 실시예 3으로부터 제조된 DOX-CC-NPs와 DOX의 아미노기 간에 이온 반발(ionic repulsion) 때문에 방출되는 약물의 양이 현저히 증가하였음을 확인할 수 있다.
도 10은 시험관에서(in vitro), SCC7 세포에 대한 분지화된 PEI(평균 분자량 1.8 kDa), 비교예 9로부터 제조된 P-NP 및 실시예 2로부터 제조된 CC-NPs의 독성을 비교하기 위해, 세포 생존율을 측정하여 나타낸 그래프이다. 데이터는 평균 ㅁ 표준오차로 표기하였다(n=5).
도 10 상에, 분지화된 PEI는 'bPEI(1.8kDa)'로 표기하였고, 비교예 9로부터 제조된 P-NP를 사용한 경우는 'P-NP'로 표기하였으며, 실시예 2로부터 제조된 CC-NPs를 사용한 경우는 'CC-NP'로 표기하였다.
도 10에 나타난 바와 같이, 아무것도 봉입되지 않은 실시예 2로부터 제조된 CC-NPs는 100 ㎍/㎖ 농도까지 세포독성을 나타내지 않았으나, 분지화된 PEI와 비교예 9로부터 제조된 P-NP는 농도가 증가할수록 세포독성이 점차 커지는 것을 알 수 있다.
도 11은 각기 다른 pH 조건 하에서, Cy5.5(cyanine)으로 라벨된 비교예 9로부터 제조된 P-NP 및 실시예 2로부터 제조된 CC-NPs의 SCC7 세포 침투여부를 확인하기 위한 공초점 현미경(confocal microscop)로 촬영한 이미지이다. 이때, 세포의 핵은 DAPI(청색)으로 염색하였다. 스케일 바는 20 ㎛이다.
도 11에 나타난 바와 같이, 암 조직의 세포외 조직에서 실시예 2로부터 제조된 CC-NPs는 표면 전하를 변화하도록 설계됨에 따라 암조직의 산 환경에서 세포 내로 침투가 용이한데 반해, 일반 pH(중성)에서는 세포내로 비특이적인 침투가 일어난다.
실시예 2로부터 제조된 CC-NPs의 세포내 침투가 pH에 의존적으로 발생함을 확실시하기 위하여, SCC7 세포 배양액에 Cy5.5(cyanine)으로 라벨된 비교예 2로부터 제조된 P-NP 및 Cy5.5(cyanine)으로 라벨된 실시예 2로부터 제조된 CC-NPs를 각기 다른 pH 조건하에서 3 시간 동안 배양한 후, 공초첨 레이저 현미경을 이용하여 SCC7 세포로 Cy5.5(cyanine)으로 라벨된 실시예 2로부터 제조된 CC-NPs가 침투되었는지 여부를 촬영하였다.
그 결과, Cy5.5(cyanine)으로 라벨된 비교예 2로부터 제조된 P-NP는 pH 조건에 상관없이 모두 세포 내로 침투되어 있는 것을 확인할 수 있었으나, Cy5.5(cyanine)으로 라벨된 실시예 2로부터 제조된 CC-NPs는 pH 6.5에서만 세포 내로 침투되었음을 확인하였다.
즉, 실시예 2로부터 제조된 CC-NPs는 pH 6.5 에서 세포막과 약물전달용 나노입자 간의 정전기적 상호작용에 의해 내포작용(endocytosis) 때문에 세포 내 침투력이 향상된다는 것을 알 수 있다.
도 12는 세포 내에서 약물 방출 여부를 확인하기 위하여, 실시예 3으로부터 제조된 DOX-CC-NPs 및 비교예 14로부터 제조된 DOX-P-NPs의 각기 다른 pH 조건 하에서, SCC7 세포내 약물 방출 정도를 확인하기 위한 공초점 현미경(confocal microscop)로 촬영한 이미지이다. 스케일 바는 20 ㎛이다.
이때, DOX는 이미지 내에서 붉은 색으로 표시되고, 세포의 핵은 DAPI(청색)으로 염색하였다.
도 12에 나타난 바와 같이, 실시예 2로부터 제조된 CC-NPs는 중성의 pH 조건에서는 무시할 정도의 약물만 방출하는데 반해, 산성 pH 조건에서 선택적으로 세포의 핵산으로 DOX를 전달하였음을 알 수 있다.
이러한 결과들을 통해 본 발명에 따른 CC-NPs(실시예 2)는 산성의 암질환 부위에서 양전하를 가지기 때문에 성공적으로 암세포 내로 침투하고, 암 세포의 핵에 약물을 효과적으로 방출한다는 것을 확인하였다.
도 13은 실시예 3으로부터 제조된 DOX-CC-NPs 및 비교예 14로부터 제조된 DOX-P-NPs를 유세포 분석(flow cytometric analyses)한 결과 그래프이다. 이때, 도 13a는 pH 7.4에서 측정한 것이고, 도 13b는 pH 6.5에서 측정한 것이다.
대조군(control)은 약물전달용 나노입자를 처리하지 않고 배양된 세포를 사용하였다.
도 13에 나타난 바와 같이, pH 7.4에서 실시예 3으로부터 제조된 DOX-CC-NPs는 DOX를 대조군 수준으로 방출하지 않고 있으나, 비교예 14로부터 제조된 DOX-P-NPs는 다량 약물을 방출하고 있음을 확인하였다.
한편 pH 6.5에서 실시예 3으로부터 제조된 DOX-CC-NPs는 DOX를 비교예 14로부터 제조된 DOX-P-NPs와 유사한 수준으로 다량 약물을 방출하고 있음을 확인하였다.
도 14는 시험관에서(in vitro), SCC7 세포에 대한 실시예 3으로부터 제조된 DOX-CC-NPs 및 비교예 14로부터 제조된 DOX-P-NPs의 독성을 비교하기 위해, 세포 생존율을 측정하여 나타낸 그래프이다. 데이터는 평균 ± 표준오차로 표기하였다(n=5).
도 14 상에, 비교예 14로부터 제조된 DOX-P-NP의 경우는 'P-NP'로 표기하였으며, 실시예 3으로부터 제조된 DOX-CC-NPs의 경우는 'CC-NP'로 표기하였다.
도 14a는 pH 7.4에서 실험한 결과이고, 도 14b는 pH 6.5에서 실험한 결과이다.
도 14에 나타난 바와 같이, 실시예 3으로부터 제조된 DOX-CC-NPs는 확산 배리어 역할을 하는 이황화 가교결합으로 인해, 중성의 pH 조건에서 50 ㎍/㎖ DOX 농도까지 우수한 세포 생존율(59.0 ± 5.4 %)을 유지하고 있음을 알 수 있다. 그러나, 비교예 14로부터 제조된 DOX-P-NPs 상관없이 세포 생존율을 80% 까지 감소시키는 것을 알 수 있다.
한편, 실시예 3으로부터 제조된 DOX-CC-NPs는 산성 pH에서 빠르게 세포 생존율이 70% 이하로 감소하는 것을 확인할 수 있다. 즉 본 발명에 따른 실시예 3으로부터 제조된 DOX-CC-NPs는 비교예 14로부터 제조된 DOX-P-NPs와 달리 암 세포 또는 암 질환 부위의 환경조건(pH)에 특이적으로 반응하여 약물을 효과적으로 방출한다는 장점을 갖는다.
비교예 14로부터 제조된 DOX-P-NPs와 같은 경우 암 조직에 대해 비특이적이므로 암세포를 제외한 다른 세포의 생존율도 감소시키는 문제점을 갖는다.
도 15는 종양이식된 누드마우스 꼬리 정맥을 통해 Cy5.5(cyanine)으로 라벨된 비교예 9로부터 제조된 P-NP 및 Cy5.5(cyanine)으로 라벨된 실시예 2로부터 제조된 CC-NPs을 주입한 후, 상기 누드마우스 내에서의 생체분포를 촬영한 형광 사진이다.
도 15에서, 비교예 9로부터 제조된 P-NP를 주입한 경우는 'P-NP'로 표기하였으며, 실시예 2로부터 제조된 CC-NPs를 주입한 경우는 'CC-NP'로 표기하였다.
이때, 종양이식된 누드마우스는 SCC7를 피하에 이종이식시킨 것을 사용하였다. 또한 상기 P-NPs와 CC-NPs는 상기 누드마우스의 꼬리 정맥을 통해 주입하였다.
도 15에 나타난 바와 같이, 암 세포가 이식된 누드마우스 Cy5.5(cyanine)으로 라벨된 실시예 2로부터 제조된 CC-NPs.는 안정적인 가교결합 구조와 음전하 표면 전하를 가지고 있어서, EPR(enhanced permeability and retention) 효과를 통해 암세포에 쉽고 효과적으로 축적되고 있음을 확인할 수 있다.
반면, Cy5.5(cyanine)으로 라벨된 비교예 9로부터 제조된 P-NP는 일반적인 유기물과 음 전하를 띠는 다양한 생체 내 물질과의 상호작용 때문에 누드마우스 몸 전체에 분포되어 있는 것을 확인할 수 있다. 이는 양이온 고분자가 갖고 있는 문제점이다.
또한, 암세포에 축적된 실시예 2로부터 제조된 CC-NPs의 형광 세기는 비교예 9로부터 제조된 P-NP의 형광 세기보다 1.8 배 더 우수한 것을 확인할 수 있다.
도 16은 Cy5.5(cyanine)으로 라벨된 비교예 9로부터 제조된 P-NP 및 Cy5.5(cyanine)으로 라벨된 실시예 2로부터 제조된 CC-NPs를 각각 주입한 종양이식된 누드마우스의 각 장기조직을 생체 밖에서(ex vivo), 촬영한 근적외선 형광이미지이다.
도 16에서, 비교예 9로부터 제조된 P-NP를 주입한 경우는 'P-NP'로 표기하였으며, 실시예 2로부터 제조된 CC-NPs를 주입한 경우는 'CC-NP'로 표기하였다.
이때, 종양이식된 누드마우스는 SCC7를 피하에 이종이식시킨 것을 사용하였다. 또한 상기 P-NPs와 CC-NPs는 상기 누드마우스의 꼬리 정맥을 통해 주입하였다.
도 16에 나타난 바와 같이, 실시예 2로부터 제조된 CC-NPs가 주입된 누드마우스의 조직부위에서의 형광세기가 비교예 9로부터 제조된 P-NP를 주입한 누드마우스의 조직부위에서의 형광세기보다 현저히 강하게 나타나는 것을 확인하였다.
도 17은 Cy5.5(cyanine)으로 라벨된 비교예 9로부터 제조된 P-NP 및 Cy5.5(cyanine)으로 라벨된 실시예 2로부터 제조된 CC-NPs를 각각 주입한 종양이식된 누드마우스의 각 장기조직(organs)들 및 암조직의 형광세기를 측정하여 나타내는 그래프이다. 데이터는 평균 ± 표준오차로 표기하였다(n=3). *) p<0.05
도 17에서, 비교예 9로부터 제조된 P-NP를 주입한 경우는 'P-NP'로 표기하였으며, 실시예 2로부터 제조된 CC-NPs를 주입한 경우는 'CC-NP'로 표기하였다.
이때, 종양이식된 누드마우스는 SCC7를 피하에 이종이식시킨 것을 사용하였다. 또한 상기 P-NPs와 CC-NPs는 상기 누드마우스의 꼬리 정맥을 통해 주입하였다.
도 17에 나타난 바와 같이, 비교예 9로부터 제조된 P-NP가 주입된 경우, 종양이식된 누드마우스는 여러 조직부위와 암조직에서 동일한 정도의 형광세기가 측정되었다. 이는 이전 연구에서 밝혀진 바와 같이 세럼 단백질과 비교예 9로부터 제조된 P-NP과의 상호작용이 향상되기 때문인 것으로 여겨진다.
반면, 실시예 2로부터 제조된 CC-NPs가 주입된 종양이식된 누드마우스는 다른 조직부위에서 형광 세기는 무시할만한 정도의 수준이였으나, 암조직에서는 비교예 9로부터 제조된 P-NP보다 2.8배 더 높은 수준의 형광 세기가 검출되고 있음을 확인하였다.
이러한 결과를 통해, 본 발명에 따른 실시예 2로부터 제조된 CC-NPs는 특이적으로 암 조적에 축적되고 있다는 것을 알 수 있다.
도 18은 도 17에서 간, 폐 및 암세포 간의 형광세기 비(ratio of fluorescence intensities)를 계산하여 나타낸 그래프이다. 데이터는 평균 ± 표준오차로 표기하였다(n=3). *) p<0.05
도 18에서, 비교예 9로부터 제조된 P-NP를 주입한 경우는 'P-NP'로 표기하였으며, 실시예 2로부터 제조된 CC-NPs를 주입한 경우는 'CC-NP'로 표기하였다.
도 18에 나타난 바와 같이, 비교예 9로부터 제조된 P-NP가 주입된 경우, 종양이식된 누드마우스에서 암조직/간조직의 형광세기 비와 암조직/폐조직의 형광세기 비는 각각 1.4, 0.8로, 일반적인 조직 세포에도 피해를 야기하고 있음을 확인할 수 있다.
이에 반해, 실시예 2로부터 제조된 CC-NPs는 주입된 종양이식된 누드마우스에서 암조직/간조직의 형광세기 비와 암조직/폐조직의 형광세기 비는 각각 4-10, 20-25로, 구조적 붕괴와 비특이적인 세포 침투가 최소화되는 EPR 효과를 통해서 암조직에만 성공적으로 축적된다는 것을 알 수 있다.
종양이식된 C3H/HeN 마우스에 각각의 실험군에 따른 1회분의 약물을 꼬리 정맥을 통해 매일 3일 동안 4 번 주입한 후, 항암 효과를 측정하기로 하였다.
실험군 1(saline) : 200 ㎕를 주입하였다.
실험군 2(free DOX(2㎎/㎏)) : 마우스의 몸무게 1 kg당 2 ㎎ DOX를 주입하였다.
실험군 3(PNP(2㎎/㎏ DOX)) : 비교예 14로부터 제조된 DOX-P-NPs를 주입하되, 마우스 몸무게 1 kg당 2 mg DOX가 주입되도록 정맥주사하였다.
실험군 4(CCNP(2㎎/㎏ DOX)) : 실시예 3으로부터 제조된 DOX-CC-NPs를 주입하되, 마우스 몸무게 1 ㎏당 2 ㎎ DOX가 주입되도록 정맥주사하였다.
실험군 5(CCNP(5㎎/㎏ DOX)) : 실시예 3으로부터 제조된 DOX-CC-NPs를 주입하되, 마우스 몸무게 1 ㎏당 5 ㎎ DOX가 주입되도록 정맥주사하였다.
도 19는 각 실험군에 따른 약물을 주입한 종양이식된 C3H/GeN 마우스에서의 암 조직의 부피를 측정하여 나타낸 그래프이다. 이때, 상기 각 실험군에 따른 약물을 주입한 후, 14 일 동안 암조직의 부피를 측정하였다. *) p<0.05
도 19에 나타난 바와 같이, 실험군 1 내지 3의 약물을 주입한 결과 암조직 부피가 가장 크게 성장하였고, 실험군 4 및 5로 처리한 경우 암 성장이 가장 크게 감소되었다. 오직 실험군 4 및 5로 처리한 경우에서만 암조직 최종 부피가 51%였다.
도 20은 각 실험군에 따른 약물을 종양이식된 C3H/GeN 마우스에 주입한 후, 14일 후의 암 조직의 무게를 측정하여 나타낸 그래프이다. *) p<0.05
도 20에 나타난 바와 같이, 예상했던대로 실험군 4 및 5으로 처리한 마우스의 암조직이 가장 무게가 작았다. 반면 실험군 1로 처리한 마우스의 암조직이 가장 무게가 큰 것을 확인하였다.
도 21은 각 실험군(실험군 1-4)에 따른 약물을 종양이식된 C3H/GeN 마우스에 주입한 후, 14일이 지난 후 절단한 암조직과 각 장기(간, 폐, 신장, 심장 및 비장)의 조직들을 H&E 조직학적 염색 방법으로 분석한 사진이다.
도 21에 나타난 바와 같이, 실험군 4에 따른 약물이 주입된 마우스는 다른 조직에서는 무시할 정도로 거의 관찰되지 않는 괴저성(necrotic) 부위가, 암조직에서는 넓게 형성되어 있는데, 이는 암조직이 가지고 있는 환경에서 실시예 2의 CC-NPs가 특이적으로 반응하여 암조직에 효과적으로 축적되기 때문인 것으로 볼 수 있다. 이에 반해, 실험군 2 및 3에 따른 약물이 주입된 마우스의 암조직은 그런 형상이 다른 조직에서도 관찰되는 것을 볼 수 있는데, 이는 암조직에 대해서만 특이적이지 않아, 다른 장기 조직에도 피해를 끼치고 있음을 확인할 수 있다.
도 22는 비교예 11 내지 15로부터 제조된 약물전달용 나노입자의 평균 입경을 나타낸 그래프이다. 표 5는 대조군인 bPEI 고분자와 비교예 11 내지 15로부터 제조된 약물전달용 나노입자의 치환도, 평균입경 및 제타포텐셜을 나타낸 표이다.
DS
(%)		 평균 입경
(㎚)		 PDI 제타 포텐셜
(mV)
대조군(bPEI) - - - -
비교예 11 3.5 90.4 ± 22.66 0.55 26.7 ± 0.97
비교예 12 5.6 106.0 ± 20.12 0.41 26.2 ± 2.16
비교예 13 7.2 149.9 ± 9.24 0.32 24.1 ± 3.10
비교예 14 11.3 191.3 ± 0.87 0.21 20.9 ± 3.86
비교예 15 18.5 230.0 ± 3.25 0.21 21.2 ± 2.44
도 22와 표 5에 나타난 바와 같이, LCA의 치환도(DS)가 10% 미만인 경우 약물전달용 나노입자의 평균 입경이 표준 편차가 크고, 균일성을 판단하는 척도인 PDI가 0.3 이상으로 측정되는 것을 확인하였다. 또한 LCA의 치환도가 19 %를 초과하는 경우 약물전달용 나노입자가 과도하게 소수성을 띄어 수득율이 낮아지는 문제가 발생하게 되었다. 따라서, 본 발명에 따른 약물 전달용 나노입자는 담즙산의 치환도는 10-19%인 것이 바람직하며, 이를 위해 혼합되는 상기 폴리에틸렌과 LCA(담즙산)의 혼합비는 상기 담즙산이 상기 폴리에틸렌이민에 존재하는 1차 및 2차 아민의 전체 몰에 대해 20 내지 30 몰%로 혼합되는 것이 바람직하다는 것을 알 수 있다.
도 23은 비교예 16 내지 19로부터 제조된 약물전달용 나노입자의 평균 입경 및 수득율(intensity; kcps)을 나타낸 그래프이다. 표 6은 대조군인 bPEI 고분자와 비교예 16 내지 19로부터 제조된 이황화 화합물(SPDP) 몰비를 변화시켜 제조한 약물전달용 나노입자의 치환도 및 평균입경을 나타낸 표이다.
DS
(%)		 평균 입경
(㎚)		 PDI
대조군(bPEI) - - -
비교예 16 6.2 209.9 ± 2.44 0.23
비교예 17 12.5 255.1 ± 5.86 0.21
비교예 18 17.3 299.1 ± 16.54 0.34
비교예 19 20.8 319.1 ± 11.25 0.46
도 23 및 표 6에 나타난 바와 같이, SPDP의 치환도(DS)가 증가할수록 약물전달용 나노입자의 평균입경이 증가하는 것을 확인할 수 있다. 그러나, SPDP의 치환도가 12.5%를 초과한 경우 수득율(intensity가 50 이하로, 4배 이상 저하됨)이 현저히 저하되는 문제가 발생하는 것을 확인하였다. 또한 SPDP의 치환도가 6.2 %를 미만인 경우 약물전달용 나노입자의 평균입경, 표준편차, PDI 수치가 허용범위를 벗어남에 따라, 제조된 약물전달용 나노입자의 형성이 불안정한 것을 확인하였다.
상기와 같은 내용을 통해, 본 발명에 따라 제조된 약물전달용 나노입자는 상기 SPDP 즉 이황화 화합물이 상기 폴리에틸렌이민에 존재하는 1차 및 2차 아민의 전체 몰에 대해 10 내지 20 몰%로 혼합되는 것이 바람직하다는 것을 확인할 수 있다.

Claims (19)

  1. 평균 분자량이 400 내지 30000 달톤(Da)인 선형 또는 분지형의 폴리에틸렌이민을 골격으로 하고,
    상기 폴리에틸렌이민의 골격 내 3 이상의 아미노기의 수소는 (a) 담즙산 (b) 이황화 화합물 및 (c) 음전하 생성용 화합물로 치환되어 있는 것을 특징으로 하는 고분자로 이루어지고,
    상기 이황화 화합물은 이황화결합을 포함하고, 상기 골격인 폴리에틸렌이민의 아미노기와 반응이 가능한 하나의 카르복시기 또는 설포네이트기를 가지며, Sulfo-LC-SPDP (sulfosuccinimidyl 6-(3'-(2-pyridyldithio)propionamido)hexanoate), Lipoic acid 및 3-(Propyldisulfanyl)propanoic acid 중에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하며,
    상기 음전하 생성용 화합물은 pKa가 6 내지 6.8이며, maleic anhydride, 1,2-cis-cyclopentanedicarboxylic anhydride, 1,2-cis-cyclohexanedicarboxylic anhydride 및 citraconic anhydride으로 이루어진 dicarboxylic acid anhydride 계열의 화합물 중에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 코어-쉘 구조의 약물전달용 나노입자.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 약물전달용 나노입자는 상기 (b) 이황화 화합물 간에 형성되는 이황화 결합을 통해 상기 고분자 간에 형성된 가교결합에 의해 상기 약물전달용 나노입자의 코어가 형성된 것을 특징으로 하는 코어-쉘 구조의 약물전달용 나노입자.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 약물전달용 나노입자의 쉘은 pH 7.2 내지 8.0에서 음전하를 나타내는 것을 특징으로 하는 약물전달용 나노입자.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 약물전달용 나노입자의 쉘은 pH 7.2 내지 8.0에서 - 30 내지 - 10 mV 표면전하를 갖는 것을 특징으로 하는 약물전달용 나노입자.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 약물전달용 나노입자의 코어 외면은 양전하를 나타내는 것을 특징으로 하는 약물전달용 나노입자.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 약물전달용 나노입자의 평균 입경은 50 내지 300 ㎚인 것을 특징으로 하는 약물전달용 나노입자.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 약물전달용 나노입자는 상기 폴리에틸렌이민의 아미노기와 상기 (c) 음전하 생성용 화합물 간에 아마이드 결합이 형성되고, 상기 아미이드 결합은 pH 6.0 내지 7.0에서 가수분해가 되는 것을 특징으로 하는 약물전달용 나노입자.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 제1항에 있어서,
    상기 폴리에틸렌이민에 대한 상기 담즙산의 치환도는 10-19%이고,
    상기 폴리에틸렌이민에 대한 상기 이황화 화합물의 치환도는 6.2-12.5%이며,
    상기 폴리에틸렌이민에 대한 상기 음전하 생성용 화합물의 치환도는 15-30 %인 것을 특징으로 하는 약물전달용 나노입자.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 나노입자의 표면전하는 특정 pH 6.0 내지 6.8 조건에서 특이적으로 음전하에서 양전하로 변환되는 것을 특징으로 하는 약물전달용 나노입자.
  12. Ⅰ) 평균 분자량이 400 내지 30000 달톤(Da)인 선형 또는 분지형의 폴리에틸렌이민을 포함하는 용액을 준비하는 단계;
    Ⅱ) 상기 Ⅰ) 단계 용액에 (a) 담즙산, (b) 이황화 화합물 및 (c) 음전하 생성용 화합물이 포함된 용액을 첨가하고, 반응시켜 상기 폴리에틸렌이민의 3 이상의 아미노기의 수소를 (a) 담즙산, (b) 이황화 화합물 및 (c) 음전하 생성용 화합물로 치환시키는 단계; 및
    Ⅲ) 상기 Ⅱ) 단계에서 제조된 상기 (a) 담즙산, (b) 이황화 화합물 및 (c) 음전하 생성용 화합물로 치환된 상기 폴리에틸렌이민에 가교제를 첨가하여 제1항에 따른 구형의 약물전달용 나노입자를 제조하는 단계;를 포함하며,
    상기 이황화 화합물은 Sulfo-LC-SPDP (sulfosuccinimidyl 6-(3'-(2-pyridyldithio)propionamido)hexanoate), Lipoic acid 및 3-(Propyldisulfanyl)propanoic acid 중에서 선택되는 어느 하나이며,
    상기 음전하 생성용 화합물은 maleic anhydride, 1,2-cis-cyclopentanedicarboxylic anhydride, 1,2-cis-cyclohexanedicarboxylic anhydride 및 citraconic anhydride으로 이루어진 dicarboxylic acid anhydride 계열의 화합물 중에서 선택되는 어느 하나인 것인 약물전달용 나노입자의 제조방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 담즙산은 상기 폴리에틸렌이민에 존재하는 1차 및 2차 아민의 전체 몰에 대해 20 내지 30 몰%로 혼합되는 것을 특징으로 하는 약물전달용 나노입자의 제조방법.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 이황화 화합물은 상기 폴리에틸렌이민에 존재하는 1차 및 2차 아민의 전체 몰에 대해 10 내지 20 몰%로 혼합되는 것을 특징으로 하는 약물전달용 나노입자의 제조방법.
  15. 제12항에 있어서,
    상기 음전하 생성용 화합물은 상기 폴리에틸렌이민에 존재하는 1차 및 2차 아민의 전체 몰에 대해 40 내지 50 몰%로 혼합되는 것을 특징으로 하는 약물전달용 나노입자의 제조방법.
  16. 제1항에 따른 약물전달용 나노입자; 및 상기 약물전달용 나노입자 내부에 봉입된 약물;을 포함하는 암 치료 또는 암전이 억제용 약학적 조성물.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 약물은 파클리탁셀 (paclitaxel), 독소루비신 (doxorubicin), 레티노익 산 (retinoic acid)계열, 시스플라틴 (cis-platin), 캄토세신 (camptothecin), 5-FU, 도세탁셀 (Docetaxel), 타목시펜(Tamoxifen), 아나스테로졸(anasterozole), 카보플라틴(carboplatin), 토포테칸(topotecan), 베로테칸(belotecan), 이리노테칸(irinotecan), 글리벡(gleevec) 및 빈크리스틴(vincristine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나이상의 항암제인 것을 특징으로 하는 암 치료 또는 암전이 억제용 약학적 조성물.
  18. 제16항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 암 질환 부위의 pH 6.0 내지 6.8에서, 상기 약물전달용 나노입자의 표면전하가 변환되어 암세포 내로 침투되어, 암세포 내부에서 약물을 방출하게 되는 특성을 갖는 것을 특징으로 하는 암 치료 또는 암전이 억제용 약학적 조성물.
  19. 제16항에 있어서,
    상기 암은 폐암, 자궁암, 자궁경부암, 전립선암, 두경부암, 췌장암, 뇌종양, 유방암, 간암, 피부암, 식도암, 고환암, 신장암, 대장암 및 직장암 중에서 선택되는 어느 하나이상인 것을 특징으로 하는 암 치료 또는 암전이 억제용 약학적 조성물.
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