CN108273061A - 一种抗纤维化药物纳米制剂及其制备方法 - Google Patents

一种抗纤维化药物纳米制剂及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高效靶向型抗纤维化药物纳米制剂及其制备方法，一种胶原酶和/或维生素A修饰的纳米制剂及其载体，首先借助胶原酶可透过纤维化胶原屏障，进而通过维生素A能够特异性靶向肝星状细胞，实现高效靶向递送抗肝纤维化药物，从而达到高效的肝纤维化治疗的目的。本发明首次利用胶原酶修饰纳米制剂来克服肝纤维病程中过多胶原累积造成的物质交换屏障，为抗肝纤维化药物的高效递送提供了一种新的途径和策略。

Description

一种抗纤维化药物纳米制剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种抗纤维化药物纳米制剂，特别涉及一种肝星状细胞靶向的抗纤维化药物纳米制剂的制备及其应用。
背景技术
肝纤维化及肝硬化是威胁人类健康的重大慢性疾病之一。当肝脏持续受到损伤时，肝脏各类细胞分泌的炎症因子会促进肝星状细胞活化，肝星状细胞活化后会分泌大量的纤维化胶原进行损伤修复，同时肝星状细胞分泌的基质金属蛋白酶的量降低，导致纤维化胶原在细胞外基质的大量累积，形成肝纤维化，肝纤维化进一步恶化则发展为肝硬化。
由于肝星状细胞在肝纤维化进程中发挥的作用，肝星状细胞是肝纤维化治疗中常见的靶细胞。近年来，大量研究通过各种纳米载体将基因药物、化学药物靶向递送至肝星状细胞以提高肝纤维化治疗效果。但是在肝纤维化进程中，大量纤维化胶原累积于细胞外基质形成瘢痕组织，对物质的交换造成了障碍，也势必会对纳米制剂的靶向吸收造成阻碍，影响药物的治疗效果。肿瘤微环境也存在大量纤维化胶原及透明质酸累积的现象，为克服纤维化胶原及透明质酸对化疗药物渗透吸收的障碍，许多研究利用具有胶原酶或透明质酸酶修饰的纳米制剂通过降解胶原和透明质酸以提高化疗药物向肿瘤内部的渗透，并取得了良好的效果，但目前这种策略在肝纤维化中并未得以尝试与验证。目前，利用双亲性嵌段共聚物中的疏水嵌段负载疏水性药物进行递送是常见的方法之一，PLGA（聚乳酸-聚羟基乙酸）、PLA（聚乳酸）、PGA（聚乙交酯）、PCL（聚己内酯）是常见的具有良好生物相容性的疏水嵌段，常在双亲性嵌段共聚物中作为疏水性内核，对大多数的疏水性药物具有较好的亲和力。
在本发明中，我们利用胶原酶及维生素A修饰的X-PEG(X为疏水段，X为PLGA、PLA、PGA、PCL)纳米粒，通过双亲性嵌段共聚物中的疏水段实现对具有一定疏水性的抗纤维化药物的负载，通过PEG实现纳米粒在体内的长循环，通过修饰的胶原酶克服纤维化胶原屏障，通过维生素A能够特异性靶向肝星状细胞，实现了抗纤维化化学药物对肝星状细胞高效的靶向递送。
发明内容
目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种抗纤维化药物纳米制剂。
技术方案：为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种用于负载抗纤维化药物的纳米制剂，其特征在于：所述纳米制剂载体负载药物的部分为X-PEG-MAL ，修饰具有纤维化胶原降解的胶原酶，和/或，修饰具有肝星状细胞靶向的成份维生素A；其中X为疏水段，X选自PLGA、PLA、PGA、PCL。
所述的纳米制剂载体，其特征在于：包括仅修饰有胶原酶的载体PPC、仅修饰有维生素A的载体PPR、同时修饰有胶原酶和维生素A的载体PPCR。
作为优选方案，所述的纳米制剂载体，其特征在于：具有纤维化胶原降解的胶原酶包括胶原酶I、胶原酶III。更优选的，使用巯基修饰的I型胶原酶。
本发明还提供一种抗纤维化药物纳米制剂，其特征在于：为上述的纳米制剂载体负载有抗纤维化药物，包括PPCR/药物，PPC/药物，PPR/药物。
所述抗纤维化药物包括优选的尼罗替尼、吡非尼酮、水飞蓟宾、罗汉果醇、汉防己甲素、岑酮及其它有待发掘的抗纤维化药物。
具体的，PPCR/药物的制备方法如下：
步骤（1）首先将抗纤维化药物与X-PEG-MAL混合，通过薄膜分散法、直接滴定法或反向溶剂法制备负载抗纤维化药物的纳米粒；
步骤（2）将负载抗纤维化药物的纳米粒与巯基修饰的胶原酶反应，通过巯基和纳米粒外壳暴露的MAL反应，在纳米粒的外端共价修饰胶原酶；
步骤（3）将修饰了胶原酶的纳米粒分别与MAL-PEG-VA、SH-PEG-VA反应，在聚合物纳米粒的外端再修饰一层PEG，用于保护所修饰的胶原酶，保证胶原酶在体内的生理活性；同时在聚合物纳米粒外层修饰了维生素A，实现肝星状细胞的靶向。
反应中，加入的聚合物纳米粒、巯基修饰的胶原酶质量比为20:1~1:2；更优选为5:2。
加入的聚合物纳米粒、MAL-PEG-VA质量比为50:1~50:4，更优选为50：2。
加入的聚合物纳米粒、SH-PEG-VA质量比为50:1~50:8，更优选为50:4。
反应中，加入的聚合物纳米粒、巯基修饰的胶原酶、MAL-PEG-VA、SH-PEG-VA质量比更优选为50:20:2:4。
PPC/药物的制备方法如下：
步骤（1）首先将抗纤维化药物与X-PEG-MAL混合，通过薄膜分散法、直接滴定法或反向溶剂法制备负载抗纤维化药物的聚合物纳米粒；
步骤（2）将负载抗纤维化药物的纳米粒与巯基修饰的胶原酶反应，通过巯基和纳米粒外壳暴露的MAL反应，在纳米粒的外端共价修饰胶原酶；
步骤（3）将修饰了胶原酶的纳米粒先后分别与MAL-PEG、SH-PEG反应，在纳米粒的外端再修饰一层PEG，用于保护所修饰的胶原酶，保证胶原酶在体内的生理活性。
反应中，加入的聚合物纳米粒、巯基修饰的胶原酶质量比为20:1~1:2；更优选为5:2。
加入的聚合物纳米粒、MAL-PEG质量比为50:1~50:4，更优选为50：2。
加入的聚合物纳米粒、SH-PEG质量比为50:1~50:8，更优选为50:4。
反应中，加入的聚合物纳米粒、巯基修饰的胶原酶、MAL-PEG、SH-PEG质量比，更优选为50:20:2:4。
PPR/药物的制备方法如下：
步骤（1）首先将抗纤维化药物与X-PEG-MAL混合，通过薄膜分散法、直接滴定法或反向溶剂法制备负载抗纤维化药物的聚合物纳米粒；
步骤（2）将负载抗纤维化药物的聚合物纳米粒与一定比例的SH-PEG-VA反应，在聚合物纳米粒外层修饰了维生素A，实现肝星状细胞的靶向。
反应中，加入的聚合物纳米粒、SH-PEG-VA质量比为50:1~50:8，更优选为50: 4。
作为优选方案，所述的抗纤维化药物纳米制剂，其特征在于：X-PEG-MAL中，其中X的分子量范围为2000-20000，PEG的分子量范围为1000-5000；MAL-PEG-VA、SH-PEG-VA中，PEG的分子量范围为400-5000。
MAL-PEG-VA、SH-PEG-VA、MAL-PEG、SH-PEG中，PEG的分子量范围为500-5000。更优选的使用分子量为2K的PEG。
优选地，所述抗纤维化药物纳米制剂的载药量在0.5%-20%之间，粒径大小在50nm-300 nm之间。
本发明要求上述的纳米制剂载体、抗纤维化药物纳米制剂在制备治疗肝纤维化疾病药物中的应用。
本发明为一种可以克服纤维化胶原屏障并具有肝星状细胞靶向的抗纤维化化学药物输送载体，特点是该载体包括化学药物负载成份，克服胶原屏障成份及肝星状细胞靶向成份。所述化学药物负载成份为末端具有马来酰亚胺修饰的双亲性聚合物，克服胶原屏障成份为巯基化修饰的胶原酶，肝星状细胞靶向的成份为修饰了维生素A的PEG(MAL-PEG-VA，SH-PEG-VA)。
本发明的还制备了没有胶原酶及维生素A修饰的制剂PP/药物，仅有维生素A修饰的载体材料PPR/药物，仅有胶原酶修饰的载体材料PPC/药物，这些载体材料的制备方式与上述方法相同，仅投料成份有所不同，具体详见下表：
有益效果：本发明提供的抗纤维化药物纳米制剂，与现有技术相比，具有以下优点：载体中的X-PEG-MAL(X为疏水段，X为PLGA、PLA、PGA、PCL)可以很好的实现难容性的药物的负载，载体上的胶原酶可以很好的实现对肝纤维化进程中过多累积的纤维化胶原（I、III型胶原）的降解，载体中的维生素A能够特异性的实验肝星状细胞的靶向，载体中的PEG可以很好的保护胶原酶在体内的活性，同时延长载体在血液中的循环时间，通过此载体可以大大的提高药物的利用度。本发明的胶原酶及维生素A修饰的纳米制剂，利用胶原酶可透过纤维化胶原屏障，利用维生素A能够特异性靶向肝星状细胞，实现高效的抗肝纤维化药物递送，从而达到高效的肝纤维化治疗目的。本发明首次利用胶原酶修饰来克服肝纤维病程中过多纤维化胶原累积造成的物质交换屏障，为肝纤维化化学药物高效递送提供了一种新的途径。
附图说明
图1是本发明纳米制剂制备的流程示意图；
图2是本发明中所制备的纳米制剂的各成份最佳投料比；
图3是本发明最佳制剂（PPCR/药物）的纳米制剂粒径分布；
图4是本发明最佳制剂（PPCR/药物）的纳米制剂透射电镜图；
图5是本发明最佳制剂（PPCR/药物）在各溶液中的纳米制剂稳定性；
图6是本发明所制备的纳米载体对L02、LX2及HSC-T6细胞的细胞毒性；
图7是本发明所用LX2（A）及L02（B）细胞摄取包覆香豆素6纳米制剂流式细胞仪定量分析；
图8是本发明所制备包覆荧光染料（DiR）的纳米制剂在健康小鼠肝脏蓄积的小动物活体成像图片（A）及其定量分析（B）；
图9是本发明所制备包覆荧光染料（DiR）的纳米制剂在CCl4造模4周小鼠肝脏蓄积的小动物活体成像图片（A）及其定量分析（B）；
图10是本发明所制备包覆荧光染料（DiR）的纳米制剂在CCl4造模8周小鼠肝脏蓄积的小动物活体成像图片（A）及其定量分析（B）。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作更进一步的说明。
实施例1 纳米制剂成份的合成及制备，如图1所示：
一、MAL-PEG-VA及SH-PEG-VA的合成
称取100 mg MAL-PEG-NHS或SH-PEG-NHS 溶于5 mL DMSO溶液中，在称取22.5 mg维生素A溶于上述溶液中，避光条件下，搅拌反应过夜，透析出去DMSO溶液，微膜过滤除去未反应完全的维生素A，冻干备用。
二、巯基化胶原酶I
称取100 mg I型胶原酶和2.75 mg 2-亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐溶于5 mL 0.01M磷酸盐缓冲液中，室温条件下反应1 h，葡聚糖凝胶柱（G-25）脱盐纯化，紫外（280 nm）检测纯化溶液蛋白浓度，备用。
三、包载药物的PLGA-PEG-MAL纳米粒的制备
采用薄膜分散法，直接滴定法及反向溶剂法均可制备负载抗纤维化药物或荧光染料（作为代替药物的模型，用于制剂追踪）的聚合物纳米粒。本发明优选的采用直接滴定法制备包载抗纤维化药物尼罗替尼的PLGA-PEG-MAL纳米粒。具体制备方法如下：
称取200 mg PLGA-PEG-MAL 和40 mg尼罗替尼溶于5 mL DMSO溶液中，超声溶解。在搅拌条件下，将DMSO溶液滴加至15 mL纯水溶液中，利用分子量3500的透析袋透析除去DMSO，微膜过滤除去未包载的尼罗替尼。
四、具有胶原酶及维生素A修饰的聚合物纳米粒制备
将负载药物的PLGA-PEG-MAL纳米粒与巯基化的胶原酶I按照图2中的比例，室温条件下，0.01M磷酸盐缓冲液中反应过夜；加入如图2比例的MAL-PEG-VA，室温反应4h；加入图2所示比例SH-PEG-VA室温反应4 h；利用10000 g离心重悬三次，收集所制备的纳米粒，除去未反应的巯基化的胶原酶I。
利用本法所制备的PP/尼洛替尼，PPR/尼洛替尼，PPC/尼洛替尼及PPCR/尼洛替尼载药量在0.5%-20% 之间，粒径大小在50 nm-300 nm之间。本发明最佳制剂（PPCR/尼罗替尼）的纳米制剂粒径分布，透射电镜图及纳米制剂稳定性如图3、图4、图5所示,该纳米制剂粒径分布均匀，并具有很好的形态；在纯水溶液、生理缓冲盐溶液、DMEM培养基及含有10%血清的DMEM培养基中均具有良好的稳定性。
实施例2 纳米制剂载体材料安全性的考察
采用MTT法测定PP、PPR、PPC及 PPCR空载体对各种肝脏细胞（L02、LX2及HSC-T6）的细胞毒性，具体操作步骤如下：首先将对数生长期的细胞分别加入到96孔板中，每孔铺板密度是1×104 / 200 μL，在细胞培养箱中培养24 h。然后使用不含FBS的培养基将PP、PPR、PPC及PPCR空载体组稀释成一系列浓度梯度，并以不给予材料的细胞作为对照组，只在空白孔中加培养基的作为空白组。细胞给予的药物浓度分别为5、10、20、50、100 μg/mL。吸去96孔板中的培养基，然后每孔加入100 μL不同浓度梯度的样品，每个浓度重复5个孔。给药后继续培养24或48 h，避光条件下加入20 μL的MTT，细胞培养箱中继续培养4 h。取出96板，用1 mL注射器吸走上清液，加入150 μL DMSO，在37 oC摇床中振摇10-15 min，酶标仪490 nm处检测各孔的OD值（A），计算细胞生存率。
本实施例所测得的细胞毒性数据如图6所示，PP、PPR、PPC及 PPCR空载体在100 μg/mL浓度以内，对L02、LX2及HSC-T6细胞均无毒副作用，证明本发明所使用的载体具有很好的安全性。
实施例3 LX2及L02细胞摄取包覆香豆素6纳米制剂流式细胞仪定量分析
按照实施例1所述制备PP/香豆素6、PPR/香豆素6、PPC/香豆素6及PPCR/香豆素6 纳米制剂。将LX2及L02细胞分别以1×105 / 1mL接种于24孔板中，于37 ℃，5% C02细胞培养箱中贴壁生长24 h后，吸去培养基，分别加入500 μL 游离香豆素6、PP/香豆素6、PPR/香豆素6、PPC/香豆素6及PPCR/香豆素6 的不含血清培养基溶液，每组别设置三个副孔，以所含香豆素6的浓度为0.025 mg/mL统一标准。继续培养6h，用PBS清洗三次，胰酶消化，2000 rpm离心沉淀细胞，用不含血清的培养基重悬细胞，利用流式细胞仪对摄取的香豆素6进行定量检测。
本实施例所测得的细胞摄取数据如图7所示，在分泌胶原较多的人肝星状细胞中（A），PPR/香豆素6的摄取明显高于PP/香豆素6的摄取，证明维生素A的接枝有利于增加肝星状细胞对纳米制剂的特异性摄取；PPC/香豆素6的摄取明显高于PP/香豆素6，说明接枝胶原酶的纳米制剂可以通过降解胶原的方式增加细胞摄取率；本发明最佳制剂PPCR/香豆素6相对于其它制剂，摄取率最佳；在分泌胶原较少的人肝细胞中（B），仅能观察到含有维生素A的纳米制剂PPR/香豆素6，PPCR/香豆素6有助于摄取，而PPC/香豆素6摄取与PP/香豆素6之间无明显差异，也进一步侧面证明了含有胶原酶的制剂可以通过降解胶原的方式克服胶原屏障增加纳米制剂的细胞摄取率。
实施例4包覆荧光染料（DiR）的纳米制剂在不同程度纤维化小鼠的肝脏蓄积
按照实施例1所述制备PP/DiR、PPR/DiR、PPC/DiR及PPCR/DiR 纳米制剂。
配置含25%四氯化碳（CCl4）的橄榄油溶液。采用4-6周龄的C57雄性黑鼠进行试验，空白组不做任何处理，纤维化造模4周组和八周组分别为腹腔注射四氯化碳（CCl4）的橄榄油溶液（4 μl/g），每周两次，为期4周和八周。将空白组，纤维化造模4周组和纤维化造模八周组的小鼠随机分配为5组，每组5只，分别通过尾静脉注射游离DiR、PP/DiR、PPR/DiR、PPC/DiR及PPCR/DiR ，以所注射的DiR为1 μg/g小鼠体重为标准。在尾静脉注射后的5h、10h、1d、2d、3d、5d、7d、9d利用小动物活体成像仪对小鼠进行活体成像。
本实施例中所制备包覆荧光染料（DiR）的纳米制剂在健康小鼠肝脏蓄积的小动物活体成像图片（A）及其定量分析（B）；在CCl4造模4周小鼠肝脏蓄积的小动物活体成像图片（A）及其定量分析（B）；在CCl4造模8周小鼠肝脏蓄积的小动物活体成像图片（A）及其定量分析（B）。在健康小鼠、CCl4造模4周小鼠（纤维化程度轻）及CCl4造模8周小鼠（纤维化程度重）上，纳米制剂在肝脏的蓄积程度如下：PPCR/DiR > PPC/DiR > PPR/DiR > PP/DiR, 证明了维生素A及胶原酶的修饰有利于纳米制剂在肝脏的蓄积。
PLGA（聚乳酸-聚羟基乙酸）、PLA（聚乳酸）、PGA（聚乙交酯）、PCL（聚己内酯）是常见的具有良好生物相容性的疏水嵌段，常在双亲性嵌段共聚物中作为疏水性内核，对大多数的具有一定疏水性的药物具有较好的亲和力。在上述实施例中，利用PLA-PEG-MAL，PGA-PEG-MAL，PCL-PEG-MAL嵌段共聚物代替PLGA-PEG-MAL嵌段共聚物，同样可以负载具有一定疏水性的药物，形成纳米粒的目的，对于本领域技术人员来说，是清楚的。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种用于负载抗纤维化药物的纳米制剂载体，其特征在于：所述纳米制剂载体负载药物的部分为X-PEG-MAL ，修饰具有纤维化胶原降解的胶原酶，和/或，修饰具有肝星状细胞靶向的成份维生素A；其中X为疏水段，X选自PLGA、PLA、PGA、PCL。
2.根据权利要求1所述的纳米制剂载体，其特征在于：包括仅修饰有胶原酶的载体PPC、仅修饰有维生素A的载体PPR、同时修饰有胶原酶和维生素A的载体PPCR。
3.根据权利要求1所述的纳米制剂载体，其特征在于：具有纤维化胶原降解的胶原酶包括胶原酶I、胶原酶III，和/或；所述抗纤维化药物包括尼罗替尼、吡非尼酮、水飞蓟宾、罗汉果醇、汉防己甲素、岑酮。
4.一种抗纤维化药物纳米制剂，其特征在于：为权利要求1-3任一项所述的纳米制剂载体负载有抗纤维化药物，包括PPCR/药物，PPC/药物，PPR/药物。
5.根据权利要求4所述的抗纤维化药物纳米制剂，PPCR/药物的制备方法如下：
步骤（1）首先将抗纤维化药物与X-PEG-MAL混合，通过薄膜分散法、直接滴定法或反向溶剂法制备负载抗纤维化药物的纳米粒；
步骤（2）将负载抗纤维化药物的纳米粒与巯基修饰的胶原酶反应，通过巯基和纳米粒外壳暴露的MAL反应，在纳米粒的外端共价修饰胶原酶；
步骤（3）将修饰了胶原酶的纳米粒分别与MAL-PEG-VA、SH-PEG-VA反应，在聚合物纳米粒的外端再修饰一层PEG，用于保护所修饰的胶原酶，保证胶原酶在体内的生理活性；同时在聚合物纳米粒外层修饰了维生素A，实现肝星状细胞的靶向。
6.根据权利要求4所述的抗纤维化药物纳米制剂，PPC/药物的制备方法如下：
步骤（1）首先将抗纤维化药物与X-PEG-MAL混合，通过薄膜分散法、直接滴定法或反向溶剂法制备负载抗纤维化药物的聚合物纳米粒；
步骤（2）将负载抗纤维化药物的纳米粒与巯基修饰的胶原酶反应，通过巯基和纳米粒外壳暴露的MAL反应，在纳米粒的外端共价修饰胶原酶；
步骤（3）将修饰了胶原酶的纳米粒先后分别与MAL-PEG、SH-PEG反应，在纳米粒的外端再修饰一层PEG，用于保护所修饰的胶原酶，保证胶原酶在体内的生理活性。
7.根据权利要求4所述的抗纤维化药物纳米制剂，PPR/药物的制备方法如下：
步骤（1）首先将抗纤维化药物与X-PEG-MAL混合，通过薄膜分散法、直接滴定法或反向溶剂法制备负载抗纤维化药物的纳米粒；
步骤（2）将负载抗纤维化药物的纳米粒与SH-PEG-VA反应，在纳米粒外层修饰了维生素A，实现肝星状细胞的靶向。
8.根据权利要求5所述的抗纤维化药物纳米制剂，其特征在于：X-PEG-MAL中，其中X的分子量范围为2000-20000，PEG的分子量范围为1000-5000；MAL-PEG-VA、SH-PEG-VA中，PEG的分子量范围为400-5000。
9.根据权利要求4所述的抗纤维化药物纳米制剂，其特征在于：所述抗纤维化药物纳米制剂的载药量在0.5%-20%之间，粒径大小在50 nm-300 nm之间。
10.权利要求1-3任一项所述的纳米制剂载体、权利要求4所述的抗纤维化药物纳米制剂在制备治疗肝纤维化疾病药物中的应用。
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