CN114042169A - Ⅰ型胶原酶修饰的载槲皮素脂质体 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种Ⅰ型胶原酶修饰的载槲皮素脂质体，属于药物制剂技术领域。所述脂质体为长循环脂质体，内部包载有槲皮素，在脂质体表面通过巯基连接有Ⅰ型胶原酶。本发明选用可以抑制肺成纤维细胞增殖的槲皮素作为主药，以长循环脂质体作为载体，将胶原酶修饰在脂质体表面的新策略，有助于增加药物在纤维化部位细胞外基质的渗透，达到更好地疗效。

Description

Ⅰ型胶原酶修饰的载槲皮素脂质体
技术领域
本发明属于药物制剂技术领域，具体涉及一种Ⅰ型胶原酶修饰的载槲皮素脂质体及其制备方法和应用。
背景技术
肺纤维化是一种慢性、进行性和纤维化性的普通性间质性肺炎，表现为胶原聚集、异常的细胞外基质(ECM)沉积、肺泡结构紊乱，导致正常组织结构破坏。
由于肺纤维化中成纤维细胞和肌成纤维细胞聚集在肺部，开发一种可吸入的给药系统来定位治疗可减少全身副作用。在考虑向呼吸系统输送的同时，肺部也是富含脂质的环境。以脂质体作为载体进行肺部给药具有以下优势：①适于作为亲水性或亲脂性药物的载体，对于脂溶性药物，制成脂质体可改善其在水中的溶解性，从而提高有效药物浓度；②脂质体肺部给药后可形成储库，通过磷脂双分子层持续释放被包封的药物，从而达到长效缓释的效果，还可通过调整脂质体处方来调节释药速率，提高药物的生物利用度；③脂质体与肺部内源性物质组成相似，有较好的生物相容性，脂质体肺部给药可减少局部刺激和肺损伤，降低毒性和免疫反应的发生几率；④药物用脂质体包封后，肺泡上皮细胞表面的受体可与脂质体选择性结合，从而增强被包封药物的细胞内转运作用，提高治疗指数；⑤脂质体表面易于修饰，可连接特定的功能基团。目前，吸入性脂质体制剂已被证明具有局部给药和肺部疾病靶向给药的能力。
肺纤维化部位细胞外基质(ECM)异常沉积，形成物理屏障，导致药物渗透困难，实验证明在肿瘤细胞外基质(ECM)中，赋予纳米载体蛋白水解表面可以促进它们的渗透，能够达到更好的疗效。目前在肺纤维化治疗中，尚未有人运用。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明提供了一种Ⅰ型胶原酶修饰的载槲皮素脂质体及其制备方法和应用。
为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
Ⅰ型胶原酶修饰的载槲皮素脂质体，所述脂质体为长循环脂质体，内部包载有槲皮素，在脂质体表面通过巯基连接有Ⅰ型胶原酶。
上述Ⅰ型胶原酶修饰的载槲皮素脂质体的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，采用薄膜分散制备长循环脂质体：取槲皮素、磷脂、胆固醇、DSPE-PEG2000和DSPE-PEG2000-Mal溶解有机溶剂中，减压旋转蒸发形成均匀薄膜，加入水化液进行水合，冰浴条件下超声破碎，得到长循环脂质体；
步骤2，将巯基化试剂Traut’s reagent与Ⅰ型胶原酶溶液混合孵育，得到巯基化胶原酶；
步骤3，将步骤1的长循环脂质体与步骤2的巯基化胶原酶混合孵育，制得所述脂质体。
进一步地，步骤1中，槲皮素的用量为磷脂重量的2％-8％，胆固醇和磷脂的重量比为1:4-1:12，DSPE-PEG2000和DSPE-PEG2000-Mal的用量为磷脂摩尔量的1％-4％，DSPE-PEG2000-Mal与DSPE-PEG2000的摩尔为2:3、1:2或1:4；有机溶剂为三氯甲烷和甲醇的混合溶液，三氯甲烷和甲醇体积比为5:1。
进一步地，水化液为5wt.％葡萄糖溶液，水合的条件为37或43℃、30min。
进一步地，步骤2中，巯基化试剂Traut’s reagent与Ⅰ型胶原酶溶液的浓度分别为2mg/mL和5mg/mL，二者的体积比为1:10。
进一步地，步骤2中，孵育条件为20-30℃、1h。
进一步地，步骤3中，孵育条件为20-30℃、12h。
上述Ⅰ型胶原酶修饰的载槲皮素脂质体在制备肺纤维化治疗药物中的应用。
本发明选用可以抑制肺成纤维细胞增殖的槲皮素作为主药，以长循环脂质体作为载体，将胶原酶修饰在脂质体表面的新策略，有助于增加药物在纤维化部位细胞外基质的渗透，达到更好地疗效。
附图说明
图1为槲皮素的检测波长结果。
图2为槲皮素的标准曲线。
图3为投药量的筛选结果。
图4为胆脂比的筛选结果。
图5为水合温度的筛选结果。
图6为PEG加入量的筛选结果。
图7为水化体积的筛选结果。
图8为槲皮素长循环脂质体的图片。
图9为巯基化胶原酶的洗脱曲线。
图10为胶原酶修饰脂质体的洗脱曲线。
图11为BCA的标准曲线。
图12为胶原酶修饰的载槲皮素脂质体的图片。
具体实施方式
槲皮素是一种疏水性药物，天然的多羟基黄酮类化合物，广泛存在于很多膳食蔬菜、水果、植物种子、坚果、茶叶和中草药植物中。分子式为C15H10O7，分子量为302.24，熔点为314℃。具有抗氧化应激、减轻炎症反应、抗肿瘤、保护心血管、降压、抗血栓、抗黏附、抗动脉粥样硬化作用等多种生理活性。近年来有研究证实，槲皮素有明确治疗肺纤维化的作用，其作用是多靶点的。
发明人的前期研究发现槲皮素(QU)体外可以抑制肺成纤维细胞的增殖。而且QU灌胃给药后明显改善模型小鼠肺组织纤维化程度，降低反映肺损伤程度的一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)，减少反映肺组织胶原沉积的羟脯氨酸(HYP)含量，降低导致肺纤维化的肿瘤坏死因子α(TNF-α)、转化生长因子(TGF)、白细胞介素(IL)的含量。
ECM中沉积的胶原成分主要含有Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ和V型，其中Ⅰ、Ⅲ型胶原常作为反映肺纤维化的指标。实验结果表明，I型胶原增加的幅度远超过Ⅲ型胶原。I型胶原酶是针对I型胶原具有特异性的酶，可以降解I型胶原，从而破坏ECM，增加药物载体的渗透。胶原酶本身已经被FDA批准为临床上用于组织清创的药膏，具有安全性。
将I型胶原酶修饰脂质体，可以有助于脂质体在细胞外基质的渗透。从而有利于药物的释放和作用。此外，槲皮素也具有抑制胶原合成的作用，与胶原酶协同作用减少ECM沉积，增强抗肺纤维化疗效。因此，本发明设计将槲皮素载入修饰胶原酶的脂质体以有助于增加药物在纤维化部位细胞外基质的渗透，达到更好地疗效。
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到，未详细描述的技术均按照本领域人员熟知的标准方法进行。
实施例1
槲皮素检测的方法学研究
1、检测波长的确定
称取槲皮素溶于甲醇溶解，于200-600nm波长范围进行紫外扫谱，确定槲皮素在甲醇溶液下最大吸收波长。
将适量空白脂质体用甲醇破乳稀释，将空白脂质体与槲皮甲醇溶液混合，分别于200-600nm波长范围进行紫外扫谱。确定载体材料是否对槲皮素的紫外测定存在干扰。
由图1可知，槲皮素在甲醇中的最大吸收波长为205nm，但在该波长处载体材料也存在紫外吸收，容易对槲皮素的检测造成干扰，因此选择另一较大吸收波长369nm作为槲皮素在甲醇中的检测波长，载体材料在该波长处没有干扰。
2、标准曲线的建立
精密称取5mg的槲皮素标准品于50mL容量瓶内，加入甲醇超声溶解，稀释定容至刻度并摇匀，得到100μg/mL的槲皮素标准品储备液。分别精密量取上述储备液0.25、0.5、1.0,、2.0、3.0、4.0、5.0mL置于25mL容量瓶中，用甲醇稀释定容至刻度并摇匀，配制成浓度分别为1、2、4、8、12、16、20μg/mL的系列溶液，将上述制备的槲皮素标准溶液分别于369nm波长处测定吸光度，并以槲皮素的浓度(C)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标，绘制槲皮素甲醇溶液中的标准曲线。
如图2所示，以吸光度(A)和药物浓度(C)进行线性回归，得到槲皮素在甲醇溶液中的标准曲线为：A＝0.0655C+0.0031，R2＝0.9998，在1-20μg/mL范围内槲皮素的浓度与吸光度的线性关系良好。
3、精密度实验
取槲皮素甲醇储备液，配制成2μg/mL(低浓度)、8μg/mL(中浓度)、16μg/mL(高浓度)的槲皮素甲醇标准溶液各三份，分别于一日内测定3次，计算日内精密度；每份样品每日测定一次，连续测定3天，计算日间精密度。结果如下表。
Figure BDA0003361357770000041
低、中、高三种浓度的槲皮素甲醇溶液的日内与日间测定结果的RSD值均小于2％，表明该方法精密度良好，方法稳定可靠。
4、回收率实验
精密称取2、8、16mg的DIP，分别置于100mL容量瓶中，加入适量的空白脂质体，用甲醇破乳定容。后取1mL稀释定容至10mL。于369nm测定吸光度，计算回收率。结果如下表。
Figure BDA0003361357770000051
低、中、高浓度下的回收率均在100～103％之间，RSD值均小于1％，说明本方法回收率合格。
5、溶液稳定性实验
取适量槲皮素甲醇储备液，配制成8μg/mL的槲皮素甲醇标准溶液，并分别于0，2，4，8，12，24h时测定吸光度，计算RSD，考察溶液的稳定性。结果如下表。
Figure BDA0003361357770000052
槲皮素甲醇溶液在24h内的测定结果RSD值均小于1％，说明槲皮素溶液的稳定性良好。
6、溶解度测定实验
精密称取10.0mg槲皮素，加入装有5mL pH7.4缓冲液的10mL EP管中，涡旋混合20min后于37℃，120rpm条件下恒温振荡48h。振荡完毕取出后于8000rpm下离心30min，取上清液，用甲醇进行适当稀释，于369nm处测定吸光度，计算药物含量。
测得槲皮素在pH7.4磷酸缓冲液中溶解度为6.18±0.55μg/mL，说明槲皮素的水溶性差。
7、油水分配系数测定实验
分别量取50mL的pH7.4缓冲液和正辛醇，分别置于250mL分液漏斗中，振摇混合20min，使水相与正辛醇相充分饱和，静置24h使其分层。精密称取5.0mg槲皮素置于25mL容量瓶中，用水饱和的正辛醇溶液溶解，超声，并稀释定容至刻度，配制得到200μg/mL槲皮素的缓冲液饱和正辛醇溶液。移取5mL正辛醇饱和的pH7.4缓冲液于具塞试管中，并向其加入2mL槲皮素的缓冲液饱和正辛醇溶液，涡旋混合20min后于37℃，120rpm条件下恒温振荡72h。振荡完毕取出后于8000rpm下离心20min，取上层油相溶液，用甲醇进行适当稀释，于369nm处测定吸光度，计算药物含量。
计算所得槲皮素logP＝1.42±0.09，logP>0.5，证明槲皮素脂溶性良好，适合做成脂质体，载入脂质体双分子层间，改善其溶解度。
实施例2
长循环脂质体的制备与筛选
本发明选用薄膜分散法制备长循环脂质体。具体地：精密称取适量槲皮素、磷脂、胆固醇、DSPE-PEG2000，溶解在三氯甲烷和甲醇混合溶液中，40℃下减压旋转蒸发1h，形成均匀薄膜，之后加入5％葡萄糖溶液5mL，于43℃下水合30min，置于100w冰浴超声破碎。
1、回收率实验
称取适量槲皮素，加入5％葡萄糖溶液5mL，探头超声。经0.45μm的微孔滤膜过滤，取续滤液，测定滤液中槲皮素含量。计算滤膜对槲皮素的截留率。结果如下表。
Figure BDA0003361357770000061
如表所示，槲皮素截留率均大于99％，能被滤膜截留，说明该方法回收率良好。
2、加样回收率实验
称取适量载体材料和槲皮素，加入5％葡萄糖溶液5mL，探头超声。经0.45μm的微孔滤膜过滤，取续滤液，测定滤液中槲皮素含量。计算滤膜对槲皮素的截留率。结果如下表。
Figure BDA0003361357770000062
如表所示，槲皮素和载体材料混合后，截留率均大于95％，槲皮素能被滤膜截留。说明该方法回收率良好。
3、有机溶剂的选择
不同的有机溶剂对于薄膜分散法中形成均一薄膜会产生影响，从而影响脂质体的包封率。采用三氯甲烷和甲醇不同比例的混合溶液作为有机溶剂，考察对脂质体包封率的影响。结果如下表。
Figure BDA0003361357770000071
如表所示，单独使用三氯甲烷，和三氯甲烷：甲醇(2:1)作为有机溶剂时，包封率较低，采用三氯甲烷：甲醇(5:1)作为有机溶剂时，能在成膜时形成均一薄膜，包封率较高。
4、投药量的筛选
称取磷脂50mg，胆固醇12.5mg，DSPE-PEG2000 3.7mg，分别按磷脂用量的2％、4％、6％、8％加入1mg、2mg、3mg、4mg槲皮素。溶于氯仿甲醇溶液中超声助溶，40℃水浴旋蒸1h除去有机溶剂，后加入5mL水化液43℃水合30min。100w冰浴探头超声350s。
结果如图3所示，投药量为3mg时，槲皮素脂质体包封率最高为(99.94±1.10)％，粒径和PDI分别为(122.69±1.27)nm和0.255±0.014，粒径小且分布较窄。继续增加投药量，当达到4mg时槲皮素脂质体包封率为(49.25±0.96)％，粒径过大为(259.53±3.33)nm，原因可能是投药量较大导致磷脂双分子层过载，大量药物无法包载进入脂质体而悬浮于水相中。本着尽可能增大载药量的原则，最终选择投药量为3mg。
5、胆脂比的筛选
称取磷脂50mg，槲皮素3mg，DSPE-PEG2000 3.7mg，分别加入比例为1:4、1:6、1:8、1:12的胆固醇。溶于氯仿甲醇溶液中超声助溶，40℃水浴旋蒸1h除去有机溶剂，后加入5mL水化液43℃水合30min。100w冰浴探头超声350s。
结果如图4所示，胆固醇与磷脂的比例对槲皮素脂质体的包封率具有影响，其比例为1:8时包封率最大；胆固醇加入量过多或过少均会使其包封率降低，原因是胆固醇的作用是调节脂质体磷脂双分子层的流动性，使脂质体的磷脂膜排列更加紧密，胆固醇含量过低时影响其成膜性，导致包封率低，适当的增加胆固醇的量可以提高包封率和稳定性，但胆固醇含量过高，则导致脂质体的磷脂膜刚性过强容易破裂，药物泄露而降低包封率。胆固醇比例较低时，槲皮素脂质体的粒径和PDI较小，脂质体的粒径均在110nm以下，PDI在0.3以下，粒径较小且分布比较均匀。所以，最终选择胆固醇与磷脂的比例为1:8。
6、水合温度的的筛选
称取磷脂50mg，胆固醇12.5mg，DSPE-PEG2000 3.7mg，槲皮素3mg。溶于氯仿甲醇溶液中超声助溶，40℃水浴旋蒸1h除去有机溶剂，后加入5mL水化液于30℃、37℃、43℃、50℃水合30min。100w冰浴探头超声350s。
结果如图5所示，随着水化温度的增大，槲皮素脂质体的包封率先增大，随后减小，粒径呈现减小的趋势。原因可能是磷脂在水相中形成脂质体的过程中有自身的相变温度，当达到相变温度，脂质体膜从胶晶状态变成液晶状态，流动性增大，包封率增大，但超过最适温度后，温度过高导致脂质体膜流动性和通透性过大，药物容易泄露，包封率降低，高温也会使磷脂不稳定，粒径分布不均匀。由于37℃和43℃条件下槲皮素脂质体的包封率接近，但43℃下脂质体的粒径与PDI更小，所以最终选择水化温度为43℃进一步考察。
7、PEG加入量筛选
称取磷脂50mg，槲皮素3mg，6.25mg胆固醇，分别按磷脂摩尔量的1％、2％、3％、4％加入DSPE-PEG2000 1.85mg、3.7mg、5.55mg、7.4mg。溶于氯仿甲醇溶液中超声助溶，40℃水浴旋蒸1h除去有机溶剂，后加入5mL水化液43℃水合30min。100w冰浴探头超声350s。
结果如图6所示，槲皮素脂质体粒径随着DSPE-PEG2000加入比例的增大而增大，当超过2％时，脂质体包封率减小。原因是DSPE-PEG2000是一种表面活性剂，加入适宜比例的DSPE-PEG2000可以增加脂质体的稳定性，提高包封率，防止药物泄露，并覆盖在脂质体表面一层形成空间位阻，防止脂质体聚集，使其分布窄且均匀，但加入比例过大时，会与包载的药物形成竞争关系，降低包封率。所以选取包封率最高，粒径仪与PDI最小的2％作为DSPE-PEG2000的加入比例。
8、水化体积筛选
称取磷脂50mg，槲皮素3mg，6.25mg胆固醇，加入DSPE-PEG2000 3.7mg。溶于氯仿甲醇溶液中超声助溶，40℃水浴旋蒸1h除去有机溶剂，后分别加入3mL、4mL、5mL、6mL水化液43℃水合30min。100w冰浴探头超声350s。
结果如图7所示，水化体积减小，槲皮素脂质体包封率降低，粒径和PDI增大，原因是水化体积减小，溶液中磷脂浓度相应增大，脂质体容易粘连絮集，导致槲皮素脂质体粒径和PDI增大，稳定性降低，药物容易泄露。水化体积增大为6mL时，虽然包封率较高，但是载药浓度过低。当水化体积为5mL时，包封率最高，粒径与PDI最小，脂质体分布均匀。所以最终选择水化体积为10mL。
综上，槲皮素长循环脂质体的最佳处方比例为磷脂50mg、槲皮素3mg、胆固醇6.25mg、DSPE-PEG2000 2％，水化体积5mL，水合温度43℃。该处方下制备的槲皮素脂质体包封率为(100.51±2.22)％，粒径与PDI分别为(102.8±1.54)nm和0.245±0.017。zeta电位为37.97±1.72mv，如图8所示，制备得到槲皮素长循环脂质体澄清透明，具有明显淡蓝色乳光现象，无沉淀产生。
实施例3
胶原酶的修饰
1、胶原酶的巯基化与纯化
将Traut’s reagent(2mg/mL)与Ⅰ型胶原酶溶液(5mg/mL)按体积比1:10于室温下混合搅拌孵育1h，形成巯基化胶原酶。将提前预溶胀的葡聚糖凝胶G-25装填入蛋白层析柱，采用PBS(pH7.4)进行洗脱，凝胶柱装柱完成后，采用恒流泵控制洗脱速度为1mL/min。平衡3-4个柱体积后，开始上样洗脱，每3mL为一管洗脱液。于280nm下检测洗脱液的吸光度，并绘制洗脱曲线。将洗脱出的巯基化胶原酶收集，置于超滤管中，6000rpm离心25min，将体积浓缩至1mL。
Traut’s reagent可与胶原酶中伯胺反应生成稳定的巯基。如图9所示，巯基化胶原酶在21-33mL之间被洗脱下来。将洗脱下来的巯基化胶原酶进行浓缩，供下一步实验。
2、胶原酶修饰的脂质体的制备与纯化
薄膜分散法：精密称取适量槲皮素、磷脂、胆固醇、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG2000-Mal溶解在三氯甲烷和甲醇混合溶液中，40℃下减压旋转蒸发1h，形成均匀薄膜，之后加入5％葡萄糖溶液5mL，于43℃下水合30min，置于100w冰浴超声破碎，制备含Mal的脂质体。取制备得到的脂质体与浓缩的巯基化胶原酶按体积比2:1在室温氮气保护下孵育过夜。将提前预溶胀的琼脂糖CL-4B装填入蛋白层析柱，采用PBS(PH7.4)进行洗脱，凝胶柱装柱完成后，采用恒流泵控制洗脱速度为1mL/min。平衡3-4个柱体积后，开始上样洗脱，每3mL为一管洗脱液。分别于280nm和500nm下检测洗脱液的吸光度，并绘制洗脱曲线。将洗脱出的胶原酶修饰脂质体收集，置于超滤管中，6000rpm离心25min，将体积浓缩至1mL。
巯基化胶原酶可与Mal基团反应结合，从而连接在脂质体上。如图10所示，500nm下测得，胶原酶脂质体于18-24mL之间被洗脱下来，而在280nm下也出现了胶原酶峰，说明胶原酶成功连接到脂质体上并被洗脱下来。在54mL处游离的巯基化胶原酶也被洗脱下来，说明脂质体与胶原酶较好的分离。
3、胶原酶的接枝率的测定
不同比例的DSPE-PEG2000-Mal会对胶原酶的连接率以及脂质体的性质造成影响。将DSPE-PEG2000-Mal与DSPE-PEG2000摩尔比调整为2:3、1:2、1:4。制备成脂质体。
配置0，100，200，400，800，1200，2000μg/mL的BSA标准液。取96孔板置于冰上，于每个孔加入12μl的BSA标准液，每组平行三孔。每孔加入96μl的BCA标准工作液。37℃摇床下孵育30min，取出后采用酶标仪于562nm下测定吸光度。绘制BSA标准工作曲线。取12μL胶原酶修饰的脂质体，采用同样方法，测定胶原酶含量。接枝率＝连接上的胶原酶质量/脂质体总质量。
如图11所示，BCA标准曲线为A＝0.0003C+0.0194，R2＝0.9959。浓度范围为0-2000μg/mL，标准曲线拟合度良好。采用相同方法测得胶原酶浓度。结果如下表。
Figure BDA0003361357770000101
如表所示，当摩尔比为1:4时，胶原酶的接枝率最高，为9.15％。
综上所述，胶原酶修饰的载槲皮素脂质体成功制得，包封率为(92.86±1.03)％，粒径和PDI分别为102.75±1.13nm和0.207±0.011。zeta电位为﹣30.96±2.09mv。胶原酶接枝率9.15±0.84％，如图12所示，为脂质体澄清透明，分布均一，无沉淀产生，具有明显的乳光。

Claims (8)

1.Ⅰ型胶原酶修饰的载槲皮素脂质体，其特征在于：所述脂质体为长循环脂质体，内部包载有槲皮素，在脂质体表面通过巯基连接有Ⅰ型胶原酶。
2.权利要求1所述的Ⅰ型胶原酶修饰的载槲皮素脂质体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1，采用薄膜分散制备长循环脂质体：取槲皮素、磷脂、胆固醇、DSPE-PEG2000和DSPE-PEG2000-Mal溶解有机溶剂中，减压旋转蒸发形成均匀薄膜，加入水化液进行水合，冰浴条件下超声破碎，得到长循环脂质体；
步骤2，将巯基化试剂Traut’s reagent与Ⅰ型胶原酶溶液混合孵育，得到巯基化胶原酶；
步骤3，将步骤1的长循环脂质体与步骤2的巯基化胶原酶混合孵育，制得所述脂质体。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤1中，槲皮素的用量为磷脂重量的2%-8%，胆固醇和磷脂的重量比为1:4-1:12，DSPE-PEG2000和DSPE-PEG2000-Mal的用量为磷脂摩尔量的1%-4%，DSPE-PEG2000-Mal与DSPE-PEG2000的摩尔为2:3、1:2或1:4；有机溶剂为三氯甲烷和甲醇的混合溶液，三氯甲烷和甲醇体积比为5:1。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤1中，水化液为5wt.%葡萄糖溶液，水合的条件为37或43℃、30min。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤2中，巯基化试剂Traut’sreagent与Ⅰ型胶原酶溶液的浓度分别为2mg/mL和5mg/mL，二者的体积比为1:10。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤2中，孵育条件为20-30℃、1h。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤3中，孵育条件为20-30℃、12h。
8.权利要求1所述的Ⅰ型胶原酶修饰的载槲皮素脂质体在制备肺纤维化治疗药物中的应用。
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