CN108578368B - 一种伊立替康-胆固醇琥珀酸单脂离子对及脂质体和制备方法及应用 - Google Patents

一种伊立替康-胆固醇琥珀酸单脂离子对及脂质体和制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种伊立替康‑胆固醇琥珀酸单脂离子对及脂质体和制备方法及应用，其中，胆固醇琥珀酸单脂作为反离子剂，其结构中羧基的活泼质子转移至伊立替康氨基的氮上，形成了配位键，与伊立替康形成离子对，提高了伊立替康的脂溶性，更易采用简单的制备方法将药物包裹到脂质体的磷脂层，提高载药量和包封率。本发明将疏水离子对技术与纳米给药系统相结合，改善难溶性药物的脂溶性，将更有利于将其开发为纳米制剂，并简化其工艺制备的复杂程度，有利于扩大工业化生产。此外，本发明的伊立替康离子对脂质体在偏酸环境下释放更快，具有一定的pH敏感性，良好的抗肿瘤效果和安全性，将有很好的应用。

Description

一种伊立替康-胆固醇琥珀酸单脂离子对及脂质体和制备方 法及应用
技术领域
本发明属于药物制剂领域，尤其涉及一种伊立替康-胆固醇琥珀酸单脂离子对及脂质体和制备方法及应用。
背景技术：
伊立替康(Irinotecan，CPT-11)，化学名7-乙基-10[4-(1-哌啶基)-1-哌啶基]羧氧基喜树碱，分子式为C33H38N4O6，相对分子质量为586.69。CPT-11最早由日本DaiichiSeiyaku公司和Yakult Honsha公司研发，1994年作为治疗转移性结直肠癌的特效药物在日本首次上市，引起了全世界广泛关注，目前已获得FDA和欧盟的共同批准在全球100多个国家上市，主要用于治疗成人转移性大肠癌以及晚期(转移性)胰腺癌。此外，胃癌、食管癌、乳腺癌、广泛期小细胞肺癌等多种适应症也在持续开发中。
伊立替康是一种喜树碱类前体药物，其抗癌活性强，常以盐酸盐三水合物的形式存在，水溶性较好。伊立替康和盐酸伊立替康的化学结构式如下所示：
Figure BDA0001627304510000011
伊立替康在体内经羧酸酯酶裂解将转化为7-乙基-10-羟基喜树碱(SN-38)而发挥作用。SN-38是细胞S期特异性的药物，通过抑制拓扑异构酶I(Topo I)，使其可断裂复合物稳定化，导致DNA单链断裂，不能再度连接，干扰DNA复制和细胞分裂，以实现其细胞毒作用。Topo在生物体中广泛存在，参与细胞增殖的关键过程，在真核细胞中分为Topo I和TopoII，二者作用部位不同，Topo I通过暂时切断DNA分子的一条单链而使DNA超螺旋结构解旋，以利于复制和转录的进行，Topo II切断双链。伊立替康作为Topo I抑制剂，不是直接作用于该酶抑制其催化活性，而是阻断Topo I与DNA在切口部位的重新结合而发挥效力。伊立替康可以将Topo I转变成对DNA有害的物质，所以，Topo I浓度越高的部位，对伊立替康越敏感，疗效越好。研究表明，结肠癌、宫颈癌、卵巢癌等肿瘤细胞内都存在丰富的Topo I，这使得伊立替康具有很广泛的临床应用前景。
现已上市的剂型主要有注射液和冻干粉针。该药在剂量较大时，可引起严重不良反应包括急性胆碱能综合征、迟发性腹泻、恶心与呕吐、骨髓抑制、肝功能损害等，尤其腹泻最为常见，这些不良反应被认为是与剂型相关的毒性。另外，和其他喜树碱类药物一样，伊立替康结构中的内酯环具有pH依赖性，在生理条件下会可逆的转变为无药理活性且毒性较大的羧酸盐形式。临床上经静脉给药后，游离药物直接处在偏碱性的生理环境下，其结构中的内酯环易发生水解反应转变为羧酸盐形式，从而失去活性，间接的降低了药物的疗效。由此看来，目前伊立替康的上市剂型在安全性、有效性及患者顺应性方面均存在较大的改进空间，这无疑限制了其在临床上更为广泛地应用。
为了降低药物骨髓抑制、胃肠道反应(严重腹泻)以及肝肾毒性等毒副作用，研究人员从两方面入手：一是合成药物的衍生物；二是建立新的给药途径。第一种方法从开始研发到应用于临床，所需周期长，耗费大量的人力、物力；第二种方法则大大缩短了进入临床的周期，节省了人力、物力。因此选用适当的药物载体来达到高效低毒即降低毒性的目的就显得十分重要。
脂质体作为近年来研究较为广泛的一种药物载体，其主要特点是可以保护被包封药物，增加药物稳定性，改变药物在体内的分布行为，携载药物被动或主动靶向到病变部位。脂质体作为抗肿瘤药物的良好载体可有效的提高药物疗效，降低毒副作用。目前世界范围内已经有许多伊立替康脂质体处于临床研究阶段。比如，日本Yakult Honsha公司开发的伊立替康脂质体制剂IHL305已经进入临床研究；伊立替康的活性代谢产物SN-38的脂质体制剂也在美国开展相关临床研究；Celator公司开发的伊立替康与氟脲苷的复方脂质体制剂正在美国开展I期临床研究。而2017年美国FDA更是批准了Merrimack公司的伊立替康脂质体注射液(Onivyde)与氟二氧嘧啶及甲酰四氢叶酸合并用于治疗既往以吉西他滨为基础化疗药物治疗过的晚期(转移性)胰腺癌患者。
此外，专利CN200580017600.8公开了一种伊立替康脂质体的处方和制备方法，该制剂通过离子梯度的方法主动将伊立替康药物以较高的浓度载入由磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、卵磷脂、心磷脂、胆固醇等构成的脂质体中。虽然显著提高了药物在血液中的滞留性，提高了药物制剂的稳定性。但制备工艺较为复杂，首先需要制备具有脂质体内外离子梯度的空白脂质体，然后才能进行药物装载。从工艺的复杂程度及工业化放大的角度来看均不利于产品的批量制备，且工艺中需要控制的质量指标较多，任何指标的变化都可能会导致药物包封率的降低或脂质体稳定性下降。而专利CN2011066684也公开了一种伊立替康或盐酸伊立替康脂质体的制剂处方及其制备方法，但该制剂限定了中性磷脂与胆固醇的比例，通过现有技术硫酸铵梯度法将药物载入脂质体内。同样采用了离子梯度的方法制备伊立替康脂质体，除工艺复杂、难以工业化生产外，还对磷脂与胆固醇的比例进行了限定。
因此可以了解到，虽然伊立替康脂质体有很大的开发前景，但仍然存在两个问题：第一，伊立替康本身水溶性差，不稳定，常以盐酸盐三水合物的形式存在，盐酸伊立替康虽然水溶性较好，但制备伊立替康脂质体时需要通过离子梯度的方法主动载药；制备工艺较为复杂，不利于工业化放大；第二，通过主动载药的方法制备伊立替康脂质体，药物能否以较高的包封率包入脂质体内部不得而知，往往存在载药量和包封率低的问题。如果包封率较低，工艺生产中则还需要采用必要的纯化手段将未包封的药物去除，进一步增加了工艺的复杂程度。
发明内容
本发明的目的是采用新型的疏水性离子对技术结合工艺简单的被动载药脂质体制备方法来解决背景技术中提到的不足，提供了一种伊立替康-胆固醇琥珀酸单脂离子对及伊立替康-胆固醇琥珀酸单脂离子对脂质体的制备方法及应用，选择反离子试剂胆固醇琥珀酸单酯(CHEMS)与伊立替康形成离子对(CCHIP),改善了伊立替康的脂溶性，即可采用简单的薄膜水化法将伊立替康离子对包载在脂质体磷脂膜上，从而简化复杂的工艺制备过程，并且有效提高伊立替康脂质体的载药量和包封率。
实现本发明目的的具体技术方案是：
一种伊立替康-胆固醇琥珀酸单脂离子对，特点是：胆固醇琥珀酸单脂为反离子剂，其化学结构羧基上有活泼氢质子，伊立替康哌啶环氮上的孤对电子被胆固醇琥珀酸单脂羧基上的活泼氢质子化，以配位键形成伊立替康-胆固醇琥珀酸单脂离子对，具有下式结构：
Figure BDA0001627304510000031
一种上述伊立替康-胆固醇琥珀酸单脂离子对的制备方法，该方法包括以下具体步骤：步骤1：称取盐酸伊立替康，加入超纯水，搅拌成浆，向浆液中逐滴滴加1mol/L NaHCO3溶液，继续搅拌30-40min直至反应完全；离心，弃去上清，用超纯水洗涤沉淀2～3次，收集沉淀；40℃真空干燥2h；得到伊立替康游离碱；其中，所述盐酸伊立替康与NaHCO3的摩尔比为1:1；步骤2：称取胆固醇琥珀酸单酯加入氯仿溶液至全部溶解，再称取伊立替康游离碱，往伊立替康碱中逐滴滴加前述的胆固醇琥珀酸单酯氯仿溶液，边滴加边搅拌，然后再冰浴搅拌1.5h，直至溶液澄清，接着逐滴滴加反溶剂甲基叔丁基醚，直到溶液出现浑浊停止，放置通风橱中使溶剂自然挥干，再在真空干燥箱中40℃干燥2h；得到所述伊立替康-胆固醇琥珀酸单酯离子对；其中，胆固醇琥珀酸单酯与伊立替康游离碱的摩尔比为1:1。
一种上述伊立替康-胆固醇琥珀酸单脂离子对脂质体，特点是：由高纯蛋黄卵磷脂PC-98T、聚乙二醇化磷脂DSPE-PEG200、胆固醇琥珀酸单脂及伊立替康-胆固醇琥珀酸单脂离子对组成，其中高纯蛋黄卵磷脂PC-98T、聚乙二醇化磷脂DSPE-PEG200形成磷脂双分子层，胆固醇琥珀酸单脂和伊立替康-胆固醇琥珀酸单脂离子对被包裹在磷脂膜上。
一种上述伊立替康-胆固醇琥珀酸单脂离子对脂质体的制备方法，该方法包括以下具体步骤：
步骤1：配置pH7.4的PBS溶液作为水相，60℃保温备用；
步骤2：按照1:0.5～1:1～2.5:5～6的质量比分别称取伊立替康-胆固醇琥珀酸单脂离子对、DSPE-PEG2000、胆固醇琥珀酸单脂、PC-98T，加入氯仿溶液至全部溶解，转移至茄形瓶中，50℃旋转蒸发除掉氯仿后，氮气吹干；将所得的磷脂干膜用步骤1制得的水相在60℃水化30min，得伊立替康-胆固醇琥珀酸单脂离子对脂质体粗分散体系，备用；
步骤3：将所得的伊立替康-胆固醇琥珀酸单脂离子对脂质体粗分散体系用细胞破碎仪冰浴超声分散，超声总时间为8min，超声3s，停歇2s；接着依次用0.45μm,0.22μm的滤膜过滤3-4次，除去超声过程中产生的铁削；
步骤4：将步骤3所得用配备200nm、100nm聚碳酸酯膜的脂质体挤出器循环挤出21次，装瓶，氮气灌封，即得所述伊立替康-胆固醇琥珀酸单脂离子对脂质体。
一种上述伊立替康-胆固醇琥珀酸单脂离子对脂质体的应用，特点是：该脂质体在制备肿瘤药物中的应用。
优点及效果
为了证明本发明伊立替康-胆固醇琥珀酸单脂离子对脂质体的效果分别做了如下测定：
测定伊立替康-胆固醇琥珀酸单脂离子对的核磁共振氢谱
测定伊立替康-胆固醇琥珀酸单脂离子对的油水分配系数
测定伊立替康-胆固醇琥珀酸单脂离子对脂质体的粒径和Zeta电位
测定伊立替康-胆固醇琥珀酸单脂离子对脂质体的包封率和载药量
测定伊立替康-胆固醇琥珀酸单脂离子对脂质体在不同pH介质中的体外释放
测定伊立替康-胆固醇琥珀酸单脂离子对脂质体的细胞毒性和体内药效
结果表明，根据本发明所述，制备的伊立替康-胆固醇琥珀酸单脂离子对脂质体粒径93.0nm，ζ电位-24.73mv，pH值≈5.68，包封率>90％。将伊立替康包载于脂质体磷脂膜上，保护其维持活性内酯环形式，不仅避免药物在生理条件下开环降解，提高药物的稳定性，而且有更大的脂质结构空间提供给伊立替康，提高其包封率和载药量。通过与胆固醇琥珀酸单酯结合形成的伊立替康离子对有更大的油水分配系数，显著提高了其脂溶性，更利于脂质体对药物进行包载，并且通过简单的薄膜分散工艺即可实现高的包封率，有效的简化工艺制备流程，有利于扩大工业化生产。另外，由于胆固醇琥珀酸单酯是一种pH敏感材料，制备的伊立替康-胆固醇琥珀酸单脂离子对脂质体脂质体在不同pH介质中的体外释放不同，表明其具有一定的pH敏感特性，针对肿瘤微环境低pH的特点，将具有良好的靶向性，从而提高药效，降低毒性。而后续的体外细胞毒性实验和体内药效实验也证明伊立替康-胆固醇琥珀酸单脂离子对脂质体其有更好的药效和安全性。
附图说明
图1为本发明脂质体结构示意图；
图2为伊立替康(碱)、胆固醇琥珀酸单酯、伊立替康-胆固醇琥珀酸单酯离子对的核磁共振氢谱图；
图3为本发明脂质体的粒径图；
图4为本发明脂质体在不同pH介质中的药物体外释放曲线图；
图5为本发明脂质体细胞毒性实验图；
图6为本发明脂质体与盐酸伊立替康注射液对结直肠癌荷瘤裸鼠肿瘤生长的抑制结果对比图；
图7为本发明脂质体与盐酸伊立替康注射液对结直肠癌荷瘤裸鼠体重影响结果对比图。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步说明。
本发明的伊立替康-胆固醇琥珀酸单脂离子对脂质体形成机制如下式所示：
Figure BDA0001627304510000051
本发明的伊立替康-胆固醇琥珀酸单脂离子对脂质体，其每100mL含有以下组分：
Figure BDA0001627304510000061
其中,蛋黄卵磷脂PC-98T为高纯蛋黄卵磷脂，PC含量大于98％，能够充分保证伊立替康离子对载在脂质体的磷脂膜上；DSPE-MPEG是二硬脂酰磷脂酰乙醇胺的聚乙二醇化衍生物——甲氧基封端，使用PEG化的磷脂制备的脂质体可以显著提高脂质体的空间稳定性，延长体内循环时间；伊立替康与胆固醇琥珀酸单酯的质量比为1:3～1:5。
实施例1
伊立替康-胆固醇琥珀酸单酯离子对的制备
称取盐酸伊立替康，加入适量超纯水，搅拌成浆,逐滴滴加1mol/L NaHCO3溶液，其中，称取的盐酸伊立替康与NaHCO3是等摩尔比的；继续搅拌直至反应完全。离心，弃去上清，用超纯水洗沉淀2～3次，收集沉淀。40℃真空干燥2h。将最终得到的类白色粉末即为伊立替康游离碱，保存在西林瓶中，4℃冰箱避光保存备用。等摩尔比的伊立替康游离碱和胆固醇琥珀酸单酯，加适量氯仿溶液溶解，冰浴搅拌1.5h，逐滴滴加反溶剂甲基叔丁基醚，溶液变浑浊停止，放置通风橱中使溶剂自然挥干，再在真空干燥箱中40℃干燥2h。将最终得到的淡黄色粉末即为伊立替康-胆固醇琥珀酸单酯离子对，保存在西林瓶中，4℃冰箱避光保存备用。
实施例2
氢-核磁光谱学研究
称量约5mg的盐酸伊立替康、伊立替康碱、胆固醇琥珀酸单酯及伊立替康-胆固醇琥珀酸单脂离子对样品，分别加入适量的DMSO-d6溶解，超声5min，待溶液完全澄清，移入NMR样品管中，密封，20℃静置一段时间。采用Bruker Advance-400MHz设备检测，TMS作为化学位移(δ)测定的内标准物质。测量结果如图2所示，会更加直观的观察到氢质子转移的发生。在伊立替康碱的核磁谱中，低场区并没有活泼氢的存在。而在胆固醇琥珀酸单脂及伊立替康-胆固醇琥珀酸单脂离子对的低场区域中，有明显的活泼氢峰存在。胆固醇琥珀酸单脂的羟基氢出现在12.25ppm处，伊立替康-胆固醇琥珀酸单脂离子对的氨基氢出现在8.33ppm。这意味着胆固醇琥珀酸单脂中活泼的质子转移至伊立替康氨基的氮上，形成了配位键。O-H键的极性强于N-H键，因此胆固醇琥珀酸单脂的氢转移至氮上后，δ值会向高场区移动。
实施例3
溶解度和表观油水分配系数的测定
按照中国药典(2010版)二部附录溶解度测定法测定，取过量盐酸伊立替康原料药粉末，伊立替康游离碱粉末，伊立替康-胆固醇琥珀酸单脂离子对粉末分别置于注射用水中，然后放入37℃的恒温振荡器中，100rpm振摇72h,室温放置一段时间后，离心取上清，用0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液适当稀释，HPLC进样测定其药物浓度，测定各饱和溶液的溶解度结果见表1。
表1伊立替康及伊立替康-胆固醇琥珀酸单脂离子对的溶解度
Figure BDA0001627304510000071
依据中国药典规定采用摇瓶法测定油水分配系数。配制pH 6.8和7.4的缓冲液，分别加入等体积的正辛醇于碘量瓶中，密封置于恒温振荡器中，37℃，100rpm，振摇72h，分离后分别得到水饱和的正辛醇溶液和正辛醇饱和的水溶液，即油水两相。盐酸伊立替康溶于水相，伊立替康游离碱、伊立替康-胆固醇琥珀酸单脂离子对溶于油相，再加入等体积的另一相，37℃，100rpm，振摇72h直至两相达到平衡，静置，用HPLC分别测定两相中的药物浓度，计算表观油水分配系数。结果见表2。
表2伊立替康及伊立替康-胆固醇琥珀酸单脂离子对的表观油水分配系数
Figure BDA0001627304510000072
由溶解度和表观油水分配系数的数据可见，伊立替康与胆固醇琥珀酸单脂形成离子对后，改善了伊立替康的两性，既显著提高了伊立替康的脂溶性，也略微改善了伊立替康的水溶性，为改善脂质体包封率和载药量提供了依据。
实施例4
伊立替康-胆固醇琥珀酸单脂离子对脂质体配方，以100ml脂质体计，伊立替康含量600mg:100ml
Figure BDA0001627304510000081
其余为超纯水；
伊立替康-胆固醇琥珀酸单脂离子对脂质体的制备：
步骤1：将Na 2HPO 4·12H 2O 0.29g、NaH 2PO 4·2H 2O 0.13g、KH 2PO 4 0.02g、NaCl 0.8g、KCl 0.02g分散于100mL超纯水中，使其全部溶解，制得水相，60℃保温备用；步骤2：称取伊立替康-胆固醇琥珀酸单脂离子对1.2g、DSPE-PEG2000 0.6g、胆固醇琥珀酸单脂1.2g、PC-98T 6g(W:W:W:W＝1:0.5:1:5:)用20ml氯仿溶解，转移至250ml茄形瓶中，50℃旋转蒸发除掉氯仿后，氮气吹干；将所得的磷脂干膜用步骤1制得的水相在60℃水化30min，得伊立替康离子对脂质体粗分散体系，备用；
步骤3：将所得的脂质体粗分散体系用细胞破碎仪冰浴超声分散(超声总时间为8min，超声3s，停歇2s)；接着依次用0.45μm,0.22μm的滤膜过滤3-4次，除去超声过程中产生的铁削；
步骤4：将步骤3均质后的脂质体用配备200nm、100nm聚碳酸酯膜的脂质体挤出器循环挤出21次，装瓶，氮气灌封，即得伊立替康-胆固醇琥珀酸单脂离子对脂质体。
实施例5
采用Malvern Nano ZS粒度测定仪对脂质体的粒径、分布情况及Zeta电位进行考察。将样品用PBS稀释至有淡淡的乳光，放入样品池内，调节光强度(Intensity)至300左右，进行测定，保存数据。其中粒径分布情况如图3所示。结果表明，伊立替康-胆固醇琥珀酸单脂离子对脂质体粒径为93.0nm，DPI为0.20，分布均匀，分散良好，而且小于100nm符合EPR效应，能被机体的网状内皮系统所吞噬，滞留在网状内皮组织中，具有靶向性，提高药效，降低毒性。另外，伊立替康离子对脂质体的Zeta电位为-24.73mv在-20～-45mV之间，具有良好物理稳定性。
实施例6
伊立替康-胆固醇琥珀酸单脂离子对脂质体载药量及包封率的测定
载药量的测定方法：精密量取伊立替康离子对脂质体1.0mL至10mL容量瓶中，用适量的盐酸-异丙醇混合溶液(1:9，v/v)破乳，用HPLC测定伊立替康-胆固醇琥珀酸单脂离子对脂质体中伊立替康的含量。
包封率的测定方法：取伊立替康-胆固醇琥珀酸单脂离子对脂质体0.5ml，加入超滤离心管中，置离心机中以3,000rpm离心15min，重复操作3次，合并离心套管中的超滤液，用HPLC测定水相中药物含量，并按以下公式计算包封率：
包封率(EE)％＝(1-水相中药物浓度/药物总浓度)×100％；结果如表3所示。
表3伊立替康-胆固醇琥珀酸单脂离子对脂质体的载药量和包封率
Figure BDA0001627304510000091
实施例7
测定伊立替康-胆固醇琥珀酸单脂离子对脂质体在不同pH介质中的体外释放。取伊立替康离子对脂质体1mL置于透析袋(分子量14000Da)中，两端用细绳系紧，置于20mL西林瓶中，加入10mL释放介质(pH 6.0,7.4PBS,0.01M)，将西林瓶置于37℃的水浴振荡器中，100次/分震荡，按照设定好的时间点(0.25h，0.5h，1h，2h，4h，6h，8h，12h，24h)取样，每次取样后将介质全部换掉，取出的介质用HPLC进行含量测定。结果如图4所示，伊立替康-胆固醇琥珀酸单脂离子对脂质体在pH 6.0的介质中释放快于pH 7.4的释放介质，可能是由于CHEMS的pH敏感性，在低pH的环境中，CHEMS的分子形态由双层的圆筒形变为倒锥形，使更多的伊立替康离子对从磷脂膜上脱离，从而使更多伊立替康游离出来。
实施例8
伊立替康-胆固醇琥珀酸单脂离子对脂质体体外细胞毒性实验。取对数生长期HT-29细胞以每孔5×103个接种于96孔板中，置37℃、5％CO2条件培养24h。待细胞贴壁后，分别加入含不同浓度的伊立替康离子对脂质体和盐酸伊立替康溶液剂，每个浓度设3个复孔，并设空白对照组。在培养箱中孵育48h后，弃去培养液，每孔重新加入含CCK-8的培养液，继续培养4h后，用酶标仪在450nm波长处测定吸光度OD值。计算HT-29细胞存活率，以细胞存活率对药物浓度作图，并以GraphPad Prism 5.0软件对数据进行拟合，计算IC50。结果显示如图5所示，伊立替康离子对脂质体和盐酸伊立替康溶液剂的IC 50分别为15.8和21.3g/ml。在低浓度下伊立替康离子对脂质体和盐酸伊立替康溶液剂对HT-29细胞的生长抑制作用并不明显，在较高浓度下，伊立替康离子对脂质体对HT-29细胞的生长抑制作用明显优于盐酸伊立替康溶液剂。
实施例9
将人源的结直肠癌组织复苏后，插块接种于裸鼠的腋窝皮下部位。待长出肿瘤后，传两代后，取新鲜的结直肠癌组织重新插块到裸鼠腋窝皮下部位，建立结直肠癌PDX肿瘤裸鼠模型。待肿瘤体积长至约为100～200mm3时，将荷瘤裸鼠随机分成3组，分别为生理盐水组，盐酸伊立替康溶液剂组，伊立替康离子对脂质体组。三组荷瘤裸鼠经尾静脉分别注射生理盐水、盐酸伊立替康溶液剂、伊立替康离子对脂质体，之后每2天给药1次，每次给药剂量为2.5mg/kg，共给药3次。荷瘤裸鼠自第一次给药后，每2天观察小鼠存活状态，称体重，用电子游标卡尺测量肿瘤体积，绘制荷瘤裸鼠体重变化曲线和肿瘤体积变化曲线，采用如下公式计算肿瘤体积(V)：V(mm3)＝(L×W2)/2，L为肿瘤的最长直径(mm)，W为肿瘤的最短直径(mm)。连续观察17天。结果如图6、图7所示，伊立替康离子对脂质体组和盐酸伊立替康溶液剂组相比于生理盐水组都有肿瘤抑制作用，伊立替康离子对脂质体组抑制效果更好。从荷瘤裸鼠的体重变化情况可以看到，盐酸伊立替康溶液剂使荷瘤裸鼠体重下降严重，有很大毒性，安全性不佳。而伊立替康离子对脂质体组和生理盐水组对荷瘤裸鼠的体重影响基本保持一致。因此结果表明伊立替康离子对脂质体比盐酸伊立替康溶液剂有更好的抗癌效果和安全性。
从上述实施例可以看出：本发明叙述伊立替康-胆固醇琥珀酸单脂离子对脂质体可采用“一步被动载药法”薄膜分散法制备，工艺简单，利于工业扩大化。制得的伊立替康离子对脂质体粒径均一、稳定，具有较高的载药量和包封率，在偏酸环境下释放更快，有良好的抗肿瘤效果和安全性。因此本发明伊立替康-胆固醇琥珀酸单脂离子对脂质体将有很好的应用前景。

Claims (4)

1.一种伊立替康-胆固醇琥珀酸单脂离子对，其特征在于，胆固醇琥珀酸单脂为反离子剂，其化学结构羧基上有活泼氢质子，伊立替康哌啶环氮上的孤对电子被胆固醇琥珀酸单脂羧基上的活泼氢质子化，以配位键形成伊立替康-胆固醇琥珀酸单脂离子对，具有下式结构：
Figure FDA0002711934770000011
2.一种权利要求1所述伊立替康-胆固醇琥珀酸单脂离子对的制备方法，其特征在于，该方法包括以下具体步骤：
步骤1：称取盐酸伊立替康，加入超纯水，搅拌成浆，向浆液中逐滴滴加1mol/L NaHCO3溶液，继续搅拌30-40min直至反应完全；离心，弃去上清，用超纯水洗涤沉淀2～3次，收集沉淀；40℃真空干燥2h；得到伊立替康游离碱；其中，所述盐酸伊立替康与NaHCO3的摩尔比为1:1；
步骤2：称取胆固醇琥珀酸单酯加入氯仿溶液至全部溶解，再称取伊立替康游离碱，往伊立替康碱中逐滴滴加前述的胆固醇琥珀酸单酯氯仿溶液，边滴加边搅拌，然后再冰浴搅拌1.5h，直至溶液澄清，接着逐滴滴加反溶剂甲基叔丁基醚，直到溶液出现浑浊停止，放置通风橱中使溶剂自然挥干，再在真空干燥箱中40℃干燥2h；得到所述伊立替康-胆固醇琥珀酸单酯离子对；其中，胆固醇琥珀酸单酯与伊立替康游离碱的摩尔比为1:1。
3.一种权利要求1所述伊立替康-胆固醇琥珀酸单脂离子对脂质体，其特征在于，由高纯蛋黄卵磷脂PC-98T、聚乙二醇化磷脂DSPE-PEG2000、胆固醇琥珀酸单脂及伊立替康-胆固醇琥珀酸单脂离子对组成，其中高纯蛋黄卵磷脂PC-98T、聚乙二醇化磷脂DSPE-PEG2000形成磷脂双分子层，胆固醇琥珀酸单脂和伊立替康-胆固醇琥珀酸单脂离子对被包裹在磷脂膜上；所述伊立替康-胆固醇琥珀酸单脂离子对脂质体的制备包括以下具体步骤：
步骤1：配置pH7.4的PBS溶液作为水相，60℃保温备用；
步骤2：按照1:0.5～1:1～2.5:5～6的质量比分别称取伊立替康-胆固醇琥珀酸单脂离子对、DSPE-PEG2000、胆固醇琥珀酸单脂、PC-98T，加入氯仿溶液至全部溶解，转移至茄形瓶中，50℃旋转蒸发除掉氯仿后，氮气吹干；将所得的磷脂干膜用步骤1制得的水相在60℃水化30min，得伊立替康-胆固醇琥珀酸单脂离子对脂质体粗分散体系，备用；
步骤3：将所得的伊立替康-胆固醇琥珀酸单脂离子对脂质体粗分散体系用细胞破碎仪冰浴超声分散，超声总时间为8min，超声3s，停歇2s；接着依次用0.45μm,0.22μm的滤膜过滤3-4次，除去超声过程中产生的铁削；
步骤4：将步骤3所得产物用配备200nm、100nm聚碳酸酯膜的脂质体挤出器循环挤出21次，装瓶，氮气灌封，即得所述伊立替康-胆固醇琥珀酸单脂离子对脂质体。
4.一种权利要求3所述伊立替康-胆固醇琥珀酸单脂离子对脂质体的应用，其特征在于，该脂质体在制备肿瘤药物中的应用。
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The Study of Polyethyleneglycol-Coated Liposomes Containing CPT-11;Yasuyuki Sadzuka等;《Journal of Liposome Research》;19971231;第7卷(第2-3期);参见摘要 *

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