CN104173288A - 一种克拉霉素离子对脂质体注射液及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种采用胆固醇琥珀酸单酯(CHEMS)制备克拉霉素离子对脂质体注射液的方法。以100ml注射液计，其包含：克拉霉素0.05g～0.8g；胆固醇琥珀酸单酯0.3g～1.0g；高纯蛋黄卵磷0.8g～5g；MPEG-DSPE0.05～0.5g；Na2HPO4·12H2O0.2～0.4g；NaH2PO4·2H2O0.1～0.2g；KH2PO40.01～0.03g；NaCl0.7～0.9g；KCl0.01～0.03g；注射用水70g～90g，本发明的克拉霉素脂质体注射液，理化性质符合静脉用药要求。同时，本研究采用在全球首次将离子对技术应用于纳米制剂的制备，提高了克拉霉素的跨膜能力，降低细菌耐药性，提高药效。本研究所制备的样品长期储存物理化学稳定性良好，并且血管刺激性小，能够提高患者顺应性，提高疗效。

Description

一种克拉霉素离子对脂质体注射液及其制备方法
技术领域：
本发明属于药物制剂领域，具体而言，特别是涉及一种采用胆固醇琥珀酸单酯(CHEMS)制备克拉霉素离子对脂质体注射液的方法。
背景技术：
克拉霉素(clarithromycin,CLA)化学名是6-O-甲基红霉素，因此也称为甲红霉素，1981年由日本大正制药公司以红霉素为原料,将6位羟基用甲氧基取代而成。红霉素是第一个开发成功的大环内酯类抗生素，也是其代表药物。但红霉素对革兰氏阴性菌作用较差，易使这些菌产生耐受性；其在酸性条件下也不稳定，血药和尿药浓度低，胃肠道副反应亦大。近十多年来人们认识到红霉素对日益流行的革兰氏阳性菌，包括耐药性金黄色葡萄球菌及较难控制的支原体、衣原体和军团菌等具有较好的疗效，为克服红霉素的上述缺陷，各国制药公司投入了大量的人、物、财力与时间进行红霉素衍生物的研究与开发。代表药物克拉霉素就是将红霉素的分子结构进行改造得到的产物。化学结构式如下所示：
克拉霉素属大环内酯类抗生素，其机制是通过阻碍细胞核蛋白50S亚基的联结，抑制蛋白质的合成而产生抑菌作用。克拉霉素主要用于①下呼吸道感染(如支气管炎、肺炎)；②上呼吸道感染(如咽炎、窦炎)；③皮肤及软组织感染(如毛囊炎、蜂窝组织炎、丹毒)；④由鸟型分支杆菌或细胞内分支杆菌引起的局部或弥散性感染。由海龟分支杆菌、意外分支杆菌或堪萨斯分支杆菌引起的局部感染。⑤克拉霉素适用于CD4淋巴细胞数小于或等于100/mm3的HIV感染的病人预防由弥散性鸟型分支杆菌引起的混合感染。⑥存在胃酸抑制剂时，克拉霉素也适用于根除幽门螺杆菌，从而减少十二指肠溃疡的复发。⑦牙源性感染的治疗。
克拉霉素的传统剂型有普通片剂、缓释片、颗粒剂、胶囊剂、干混悬剂以及分散剂等。贝庆生的研究显示，克拉霉素注射途径给药更能发挥克拉霉素的药效。鉴于此，美国雅培公司开发了注射用克拉霉素()，该制剂为克拉霉素的乳糖酸盐冻干粉针，经稀释后溶液pH远远低于生理pH，因此血管刺激性大。同时由于克拉霉素自身也具有很强的刺激性，因此其在临床上应用时，频频发生化学性静脉炎，血管痉挛，该不良反应发生率高达92％，此外50％患者因注射部位疼痛而中止给药，如此低的耐受性只有当临床上无可替代的药物时才会应用，目前该制剂已经退市。目前全世界范围内还没有克拉霉素的注射剂品种再度上市或处于临床研究。
但开发克拉霉素注射剂存在两个问题：第一，克拉霉素本身水溶性差，水中溶解度为1：1000，具有一定的脂溶性；不仅如此，其在油中的溶解度较低也决定了很难将其开发成注射剂；第二，即使通过一定工艺制成普通注射剂，但大都不稳定；且有报道克拉霉素在静脉滴注时存在极大的刺激性，导致局部疼痛，严重者甚至导致静脉炎。
为了解决以上两个问题，全世界范围内的专家学者进行了大量的研究。1994年，M.W.Love1l等曾报道过一种含有油酸和己酸的低刺激性静脉注射克拉霉素脂肪乳剂的处方和制备方法，但是因为油酸和己酸的存在限制了其灭菌方法，它只能以0.22μm微孔滤膜无菌过滤的方法灭菌，这一方面影响了乳剂的稳定性，另一方面限制了乳剂的工业化生产和临床应用的前景。2006年，秦玲浩发表了关于克拉霉素脂肪乳剂研究的论文，秦玲浩解决了克拉霉素溶解性差的问题和克拉霉素注射剂的刺激性问题，但其研究的克拉霉素脂肪乳剂不能耐受常规的热压灭菌条件，长期稳定性试验中药物降解等原因，无法开发成克拉霉素注射剂品种。2008年，陆岩发表了克拉霉素脂质微球注射剂的论文。论文中作者采用将维生素E做油相，制备克拉霉素脂质微球注射剂。同样，陆岩解决了克拉霉素本身溶解性问题和克拉霉素的刺激性问题，但是同时带来了新的问题，维生素E具有剂量限制性心脏毒性；同时，陆岩论文中所述的克拉霉素脂质微球注射液不能经受热压灭菌，常温放置有严重的药物降解等原因，无法将其开发成产品应用于临床。2011年，Ghobad Mohammadi等人进行了克拉霉素PLGA纳米粒的研究，证实了将克拉霉素制备成纳米分散制剂可以降低MIC，提高药效。但克拉霉素PLGA纳米粒的包封率低于80％，并不能满足克拉霉素注射剂产品的要求。克拉霉素的适应症多，抗菌谱广泛，药效良好。但口服生物利用度有限，仅为50％。当患者感染严重尤其是艾滋病患者分支杆菌感染时，为了达到治疗目的，口服剂量过高，导致不良反应副作用明显。故开发克拉霉素注射用品种势在必行。克拉霉素的油水溶解性均不理想，且由于刺激性强导致静脉注射时易发生静脉炎。
2012年，专利201210081925.4(一种克拉霉素冻干脂质体及其制备方法)和刘晓娜发表的关于注射用克拉霉素脂质体的研究的学术论文中将克拉霉素的载药量提高到15mg/ml,解决了克拉霉素静脉注射时产生的刺激性问题，并且提出用冷冻干燥的方法来解决克拉霉素脂质体的长期稳定性问题，同时提出了所制备脂质体的结构假说，对克拉霉素注射用品种的开发提供了宝贵的经验。但其冻干复溶后的样品粒径变化过大，复溶时间过长；同时，其处方中使用了胆固醇硫酸酯钠和己酸，胆固醇硫酸酯钠的溶解性差，并不适合工业生产；同时，己酸使最终的制剂存在异味，降低了临床使用的顺应性。
专利200510109312.7(克拉霉素的脂质微球注射液及其制备方法)虽然解决了克拉霉素静脉注射时带来的刺激性和克拉霉素开发成注射品种自身的溶解性问题，但因为油酸和己酸的存在限制了其灭菌方法。
专利200610066404.6(注射用克拉霉素水溶性制剂)很好的解决了克拉霉素的水溶性差问题和静脉注射时的刺激性问题，具备开发成克拉霉素注射剂产品的可行性，但第一：其工艺中灭菌条件并没有明确说明是否能耐受高压蒸汽灭菌，且灭菌后冻干需要无菌操作程序，提高了生产成本。第二：其最终制剂的pH值为6，在高压蒸汽灭菌时会发生很严重的药物降解问题。克拉霉素离子对脂质微球注射液最终pH值为8.0，使克拉霉素具备良好的热稳定性，同时它具备终端灭菌的特点，安全性高，生产成本低。
专利200810182692.0(克拉霉素亚微乳注射液及其制备方法)采用磷脂复合物的方法，成功制备了克拉霉素亚微乳注射剂，解决了克拉霉素的溶解性和注射刺激性问题，但是专利表述中介绍了灭菌条件是100℃，30min，并没有满足灭菌F0≥8的高压蒸汽灭菌指标，没有实现终端灭菌，安全性低。
专利201310420525.6(克拉霉素注射液及其制备方法)和专利201310420637.1(克拉霉素冻干粉针及其制备方法)在处方中使用了大量的聚乙二醇4000，该辅料一般不作为静脉注射制剂的增溶剂，如果使用也有一定限度，同时该制剂的最终pH值偏低，无法耐受高压蒸汽灭菌。
脂质体用作药物的递送和靶向载体后，人们很快便发现其主要缺点：传统组成的脂质体很快离开血流，聚集于肝脏的Kupffer细胞和脾脏的巨噬细胞(RES)中。为解决此问题，人们尝试了各种方法。人们研究了与脂质体相关的几种参数，其中取得了一定的成功。用含有胶态磷脂(如DSPE)和胆固醇的小脂质体(<100nm)进行试验时，发现其循环时间显著延长。研究中最有意义和最成功的可能是修饰脂质体表面。目前制备长循环脂质体最常用的方法是在脂质体表面包覆线型聚乙二醇，即PEG。长循环脂质体又名空间保护型长循环脂质体，顾名思义，其不光具有长循环特性，也具备了优良的空间稳定性，在提高脂质体的物理稳定性方面做出了重要的贡献。本研究所用磷脂为MPEG-DPSE和PC-98T，MPEG-DPSE为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺的聚乙二醇化衍生物——甲氧基封端，PEG支链的分子量为2000；PC-98T为高纯蛋黄卵磷脂，PC含量大于98％，各项指标达到或远超过药典标准。
克拉霉素脂质体注射液所用磷脂为PC-98T和MPEG-DSPE，PC-98T为高纯的蛋黄卵磷脂，更适合制备稳定的脂质体；MPEG-DSPE为PEG化磷脂，提高制剂的空间稳定性，长期物理稳定性，并且延长了制剂在体内的循环时间，提高药效。
而克拉霉素脂质微球注射液所用蛋黄磷脂为PL-100M，该磷脂的PC含量为80％以上，具有良好的乳化性，更适合制备稳定的脂质微球注射液。
克拉霉素脂质体注射液与克拉霉素脂质微球注射液，具有相当的长期稳定性；但克拉霉素脂质体注射液的体内循环时间要显著长于克拉霉素脂质微球注射液，更适合长期用药的患者。且克拉霉素脂质体注射液中不含中链油，大豆油等油性成分，更适合高血脂合并感染的患者应用。
因此，有必要应用离子对技术开发克拉霉素离子对脂质体注射液和克拉霉素离子对脂质微球注射液。
近年来，利用疏水性离子对技术[hydrophobic ion pairing approach(HIP)]来改善药物分子溶解、跨膜等性质的策略备受关注。含有离子化基团的药物和带有相反电荷的反离子之间通过离子键形成的整体，我们称之为离子对。离子对相比于药物母体具有更大的油水分配系数，提高了药物跨生物膜的渗透能力，进而增强了细胞对药物的摄取，最终提高了药物的全身吸收。
本研究首次采用离子对载药技术将克拉霉素制备成静脉注射用脂质体，解决了克拉霉素的溶解度问题和刺激性问题。同时，本研究的克拉霉素离子对脂质体注射液具有长循环缓释，长期稳定性良好等优势，满足了临床需要。
发明内容：
发明目的：
本发明所要解决的技术问题在于针对克拉霉素本身水溶性差，水中溶解度为1：1000，具有一定的脂溶性；不仅如此，其在油中的溶解度较低也决定了很难将其开发成注射剂，即使通过一定工艺制成普通注射剂，但大都不稳定；且有报道克拉霉素在静脉滴注时存在极大的刺激性的不足，本发明提供一种采用胆固醇琥珀酸单酯制备克拉霉素离子对脂质体注射液的方法。
在克拉霉素离子对脂质微球注射液的基础上，开发克拉霉素离子对脂质体注射液更适合长期用药患者和高血脂患者。
技术方案：为实现以上目的，本发明采用以下技术方案：
一种克拉霉素离子对脂质体注射液，其特征在于：按100ml计，其包含：
其中，MPEG-DSPE是二硬脂酰磷脂酰乙醇胺的聚乙二醇化衍生物——甲氧基封端，使用PEG化的磷脂制备的脂质体可以显著提高脂质体的空间稳定性，延长体内循环时间；蛋黄卵磷脂PC-98T为高纯蛋黄卵磷脂，PC含量大于98％，能够充分保证克拉霉素离子对载在脂质体的磷脂膜上；克拉霉素与胆固醇琥珀酸单酯的质量比为1:1～1:3。
以100ml注射液计，其包含：
其余为注射用水
其中，克拉霉素和胆固醇琥珀酸单酯的质量比为1:2。
脂质体的粒径在70.1nm，ζ电位在-39.94mv，pH值>7，包封率>95％。
一种如上所述的克拉霉素离子对脂质体注射液的制备方法，其特征在于：以制备100ml注射液计，该方法包括：
步骤1：将Na2HPO4·12H2O0.2～0.4g、NaH2PO4·2H2O0.1～0.2g、KH2PO40.01～0.03g、NaCl0.7～0.9g、KCl0.01～0.03g分散于100mL注射用水中，使其全部溶解，制得水相，60℃保温备用；
步骤2：将蛋黄卵磷脂0.8g～5g、克拉霉素0.05g～0.5g、胆固醇琥珀酸单酯0.3g～0.8g、MPEG-DSPE0.05～0.5g用适量无水乙醇溶解，旋转蒸发除掉乙醇后，氮气吹干；将所得的磷脂干膜用步骤1制得的水相在60℃水化30min，得克拉霉素脂质体粗分散体系，备用；
步骤3：将脂质体粗分散体系转移至高压均质机中进行均质；
步骤4：将步骤3均质后的脂质体用0.1mol·L-1氢氧化钠或盐酸溶液调节pH值至8.0，备用；
步骤5：将步骤4调过pH的脂质体制剂用配备100nm聚碳酸酯膜的脂质体挤出器循环挤出4次，装瓶，氮气灌封，即得克拉霉素离子对脂质体注射液；其中克拉霉素含量为0.05g～0.5g。
该方法操作步骤如下：
步骤1：将Na2HPO4·12H2O0.29g、NaH2PO4·2H2O0.13g、KH2PO40.02g、NaCl0.8g、KCl0.02g分散于100mL注射用水中，使其全部溶解，制得水相，60℃保温备用；
步骤2：将蛋黄卵磷脂4.5g、克拉霉素0.25g、胆固醇琥珀酸单酯0.5g、MPEG-DSPE0.5g用适量无水乙醇溶解，旋转蒸发除掉乙醇后，氮气吹干；将所得的磷脂干膜用步骤1制得的水相在60℃水化30min，得克拉霉素脂质体粗分散体系，备用；
步骤3：将脂质体粗分散体系转移至高压均质机中进行均质，以冰水浴控制均质温度在40℃以下，5800psi均质8次；
步骤4：将步骤3均质后的脂质体用0.1mol·L-1氢氧化钠或盐酸溶液调节pH值至8.0，备用；
步骤5：将步骤4调过pH的脂质体制剂用配备100nm聚碳酸酯膜的脂质体挤出器循环挤出4次，装瓶，氮气灌封，即得克拉霉素离子对脂质体注射液；
优点及效果：本发明的“疏水性离子对载药技术”的克拉霉素脂质体注射液，具有如下优点：
该克拉霉素脂质体的粒径在70.1nm，ζ电位在-39.94mv，pH值>7，包封率>95％，含量保持稳定。与溶液剂相比，本发明的克拉霉素脂质体可以显著的降低克拉霉素引起的给药部位疼痛和血管刺激性，并提高克拉霉素的抗菌活性，解决了耐药问题。长期储存物理化学稳定性良好，其各项指标都达到了国家食品药品监督管理局关于新药研究开发的要求。
振摇稳定性实验表明以离子对载药的克拉霉素脂质体注射液经剧烈振摇后粒径无显著变化，无絮凝、合并现象产生，说明该制剂可经受住制备、灭菌及运输和储藏过程中振摇碰撞所产生的影响。
以离子对载药的克拉霉素脂质体注射液在高温60℃放置10天后，含量仅下降5.5％，仍在标示量的90％以上；长期稳定性考察的结果显示：在25±2℃及10±2℃条件下放置6个月，其外观、pH、药物含量、包封率以及平均粒径等指标都没有发生显著的变化，仍符合静脉用药要求。
本研究中的疏水性离子对[hydrophobic ion pairing(HIP)]是将含有离子化基团的药物和带有相反电荷的反离子之间通过离子键形成的整体。离子对相比于药物母体具有更大的油水分配系数，提高了药物跨生物膜的渗透能力，进而增强了细胞对药物的摄取，最终提高了药物的全身吸收。本项研究中，反离子采用胆固醇琥珀酸单酯(CHEMS)结构如下：
离子对生成机制：
本发明的克拉霉素离子对脂质体注射剂，由于克拉霉素包裹于脂质体磷脂膜上，这种“包封”起到了增强稳定性的作用，避免了药物和血管壁的直接接触，降低了药物的血管刺激性。另外，克拉霉素离子对脂质体在体内缓慢释放，避免药物在注射初期浓度过高而引起的不良反应。本发明的克拉霉素离子对脂质体注射剂是粒径在70nm左右的小微粒，能被机体的网状内皮系统所吞噬，滞留在网状内皮组织中，具有靶向性，提高药效，降低毒性。
本发明的克拉霉素离子对脂质体注射剂，由于采用了离子对载药技术，提高了克拉霉素的跨细菌细胞膜能力，进而达到了提高药效的目的，一定程度上解决了长期应用抗生素带来的细菌耐药问题。
附图说明：
图1a克拉霉素原料药粉末红外光谱图；
图1b胆固醇琥珀酸单酯红外光谱图；
图1c物理混合物红外光谱图；
图1d克拉霉素离子对红外光谱图；
图220120530批样品的粒径测定高斯分布图(PSDI,PSDV,PSDN)；
图320120530批样品的ζ-电位测定图谱；
图4实施例3制备的克拉霉素离子对脂质体注射液在振揺前后粒度分布变化图；
图5a为阴性对照组距离给药部位1cm处的病理切片图；
图5b为阴性对照组距离给药部位5cm处的病理切片图；
图5c为阳性对照组距离给药部位1cm处的病理切片图；
图5d为阳性对照组距离给药部位5cm处的病理切片图；
图5e为本发明待检组距离给药部位1cm处的病理切片图；
图5f为本发明待检组距离给药部位5cm处的病理切片图；
图6克拉霉素离子对脂质体示意图。
具体实施方式：
本发明的目的在于提供一种“疏水性离子对载药”的克拉霉素脂质体注射液。该脂质体注射液具有以下性质：①理化性质符合静脉用药要求，采用100nm循环挤出4次除菌。②长期储存稳定性良好。③血管刺激性小，适合临床使用。④应用离子对技术，提高了克拉霉素的杀菌效力，解决了耐药问题。⑤采用PEG化磷脂制备脂质体，延长克拉霉素脂质体在血循环中的时间，提高脂质体空间稳定性。
本发明的目的在于提供上述克拉霉素脂质体注射液的制备方法。
根据本发明的第一目的，本发明提供“疏水性离子对载药”的克拉霉素脂质体注射液，以100ml注射液计，其包含：
其中，克拉霉素与胆固醇琥珀酸单酯的质量比为1:1～1:3。
在本发明最优选的实施方案中，所述克拉霉素脂质体注射液，以100ml注射液计，其包含：
其余为注射用水；
其中，克拉霉素和胆固醇琥珀酸单酯的质量比为1:2。
根据本发明的另一目的，本发明提供“疏水性离子对载药”的克拉霉素脂质体注射液的制备工艺，以制备100ml注射液计，该工艺包括：
步骤1：将Na2HPO4·12H2O0.2～0.4g、NaH2PO4·2H2O0.1～0.2g、KH2PO40.01～0.03g、NaCl0.7～0.9g、KCl0.01～0.03g分散于100mL注射用水中，使其全部溶解，制得水相，60℃保温备用；
步骤2：将蛋黄卵磷脂0.8g～5g、克拉霉素0.05g～0.5g、胆固醇琥珀酸单酯0.3g～0.8g、MPEG-DSPE0.05～0.5g用适量无水乙醇溶解，旋转蒸发除掉乙醇后，氮气吹干；将所得的磷脂干膜用步骤1制得的水相在60℃水化30min，得克拉霉素脂质体粗分散体系，备用；
步骤3：将脂质体粗分散体系转移至高压均质机中进行均质；
步骤4：将步骤3均质后的脂质体用0.1mol·L-1氢氧化钠或盐酸溶液调节pH值至8.0，备用；
步骤5：将步骤4调过pH的脂质体制剂用配备100nm聚碳酸酯膜的脂质体挤出器循环挤出4次，装瓶，氮气灌封，即得克拉霉素离子对脂质体注射液；其中克拉霉素含量为0.05g～0.5g。
更具体而言，该方法各步骤具体如下：
步骤1：将Na2HPO4·12H2O0.29g、NaH2PO4·2H2O0.13g、KH2PO40.02g、NaCl0.8g、KCl0.02g分散于100mL注射用水中，使其全部溶解，制得水相，60℃保温备用；
步骤2：将蛋黄卵磷脂4.5g、克拉霉素0.5g、胆固醇琥珀酸单酯0.65g、MPEG-DSPE0.5g用适量无水乙醇溶解，旋转蒸发除掉乙醇后，氮气吹干；将所得的磷脂干膜用步骤1制得的水相在60℃水化30min，得克拉霉素脂质体粗分散体系，备用；
步骤3：将脂质体粗分散体系转移至高压均质机中进行均质，以冰水浴控制均质温度在40℃以下，5800psi均质8次；
步骤4：将步骤3均质后的脂质体用0.1mol·L-1氢氧化钠或盐酸溶液调节pH值至8.0，备用；
步骤5：将步骤4调过pH的脂质体制剂用配备100nm聚碳酸酯膜的脂质体挤出器循环挤出4次，装瓶，氮气灌封，即得克拉霉素离子对脂质体注射液；
本发明所采用的MPEG-DSPE是二硬脂酰磷脂酰乙醇胺的聚乙二醇化衍生物——甲氧基封端，使用PEG化的磷脂制备的脂质体可以显著提高脂质体的空间稳定性，延长体内循环时间；蛋黄卵磷脂PC-98T为高纯蛋黄卵磷脂，PC含量大于98％，能够充分保证克拉霉素离子对载在脂质体的磷脂膜上
本发明所采用的克拉霉素脂质体的粒径在70.1nm，ζ电位在-39.94mv，pH值>7，包封率>95％，含量保持稳定。与溶液剂相比，本发明中所涉及的克拉霉素脂质体可以显著的降低克拉霉素引起的给药部位疼痛和血管刺激性，并提高克拉霉素的抗菌活性，解决了耐药问题。长期储存物理化学稳定性良好，其各项指标都达到了国家食品药品监督管理局关于新药研究开发的要求。
下面通过实施例具体地说明本发明，但本发明不局限于这些实施例。以下实施例中，克拉霉素原料药来自浙江华义医药有限公司，CHEMS来自北京百灵威公司，蛋黄卵磷脂、MPEG-DSPE来自上海艾伟特有限公司(卫生部药品标准)。
实施例1 配方1 克拉霉素含量250mg:100ml
以100ml注射液计
其余为注射用水；
克拉霉素离子对脂质体注射液的制备：
步骤1：将Na2HPO4·12H2O0.29g、NaH2PO4·2H2O0.13g、KH2PO40.02g、NaCl0.8g、KCl0.02g分散于100mL注射用水中，使其全部溶解，制得水相，60℃保温备用；
步骤2：将蛋黄卵磷脂4.5g、克拉霉素0.25g、胆固醇琥珀酸单酯0.325g、MPEG-DSPE0.5g用适量无水乙醇溶解，旋转蒸发除掉乙醇后，氮气吹干；将所得的磷脂干膜用步骤1制得的水相在60℃水化30min，得克拉霉素脂质体粗分散体系，备用；
步骤3：将脂质体粗分散体系转移至高压均质机中进行均质，以冰水浴控制均质温度在40℃以下，5800psi均质8次；
步骤4：将步骤3均质后的脂质体用0.1mol·L-1氢氧化钠或盐酸溶液调节pH值至8.0，备用；
步骤5：将步骤4调过pH的脂质体制剂用配备100nm聚碳酸酯膜的脂质体挤出器循环挤出4次，装瓶，氮气灌封，即得克拉霉素离子对脂质体注射液；
实施例2 配方2 克拉霉素含量100mg:100ml；
以100ml注射液计
其余为注射用水；
克拉霉素离子对脂质体注射液的制备：
步骤1：将Na2HPO4·12H2O0.29g、NaH2PO4·2H2O0.13g、KH2PO40.02g、NaCl0.8g、KCl0.02g分散于100mL注射用水中，使其全部溶解，制得水相，60℃保温备用；
步骤2：将蛋黄卵磷脂4.5g、克拉霉素0.1g、胆固醇琥珀酸单酯0.13g、MPEG-DSPE0.5g用适量无水乙醇溶解，旋转蒸发除掉乙醇后，氮气吹干；将所得的磷脂干膜用步骤1制得的水相在60℃水化30min，得克拉霉素脂质体粗分散体系，备用；
步骤3：将脂质体粗分散体系转移至高压均质机中进行均质，以冰水浴控制均质温度在40℃以下，5800psi均质8次；
步骤4：将步骤3均质后的脂质体用0.1mol·L-1氢氧化钠或盐酸溶液调节pH值至8.0，备用；
步骤5：将步骤4调过pH的脂质体制剂用配备100nm聚碳酸酯膜的脂质体挤出器循环挤出4次，装瓶，氮气灌封，即得克拉霉素离子对脂质体注射液；
实施例3 配方3 克拉霉素含量500mg:100ml
以100ml注射液计
其余为注射用水；
克拉霉素离子对脂质体注射液的制备：
步骤1：将Na2HPO4·12H2O0.29g、NaH2PO4·2H2O0.13g、KH2PO40.02g、NaCl0.8g、KCl0.02g分散于100mL注射用水中，使其全部溶解，制得水相，60℃保温备用；
步骤2：将蛋黄卵磷脂4.5g、克拉霉素0.5g、胆固醇琥珀酸单酯0.65g、MPEG-DSPE0.5g用适量无水乙醇溶解，旋转蒸发除掉乙醇后，氮气吹干；将所得的磷脂干膜用步骤1制得的水相在60℃水化30min，得克拉霉素脂质体粗分散体系，备用；
步骤3：将脂质体粗分散体系转移至高压均质机中进行均质，以冰水浴控制均质温度在40℃以下，5800psi均质8次；
步骤4：将步骤3均质后的脂质体用0.1mol·L-1氢氧化钠或盐酸溶液调节pH值至8.0，备用；
步骤5：将步骤4调过pH的脂质体制剂用配备100nm聚碳酸酯膜的脂质体挤出器循环挤出4次，装瓶，氮气灌封，即得克拉霉素离子对脂质体注射液；
实施例4 配方4 克拉霉素含量250mg:100ml
以100ml注射液计
其余为注射用水；
克拉霉素离子对脂质体注射液的制备：
步骤1：将Na2HPO4·12H2O0.29g、NaH2PO4·2H2O0.13g、KH2PO40.02g、NaCl0.8g、KCl0.02g分散于100mL注射用水中，使其全部溶解，制得水相，60℃保温备用；
步骤2：将蛋黄卵磷脂4.5g、克拉霉素0.25g、胆固醇琥珀酸单酯0.325g、MPEG-DSPE0.5g用适量无水乙醇溶解，旋转蒸发除掉乙醇后，氮气吹干；将所得的磷脂干膜用步骤1制得的水相在60℃水化30min，得克拉霉素脂质体粗分散体系，备用；
步骤3：将脂质体粗分散体系转移至微射流仪中，5000psi循环8次；
步骤4：将步骤3均质后的脂质体用0.1mol·L-1氢氧化钠或盐酸溶液调节pH值至8.0，备用；
步骤5：将步骤4调过pH的脂质体制剂用配备100nm聚碳酸酯膜的脂质体挤出器循环挤出4次，装瓶，氮气灌封，即得克拉霉素离子对脂质体注射液；
实施例5 配方5 克拉霉素含量100mg:100ml；
以100ml注射液计
其余为注射用水；
克拉霉素离子对脂质体注射液的制备：
步骤1：将Na2HPO4·12H2O0.29g、NaH2PO4·2H2O0.13g、KH2PO40.02g、NaCl0.8g、KCl0.02g分散于100mL注射用水中，使其全部溶解，制得水相，60℃保温备用；
步骤2：将蛋黄卵磷脂4.5g、克拉霉素0.1g、胆固醇琥珀酸单酯0.13g、MPEG-DSPE0.5g用适量无水乙醇溶解，旋转蒸发除掉乙醇后，氮气吹干；将所得的磷脂干膜用步骤1制得的水相在60℃水化30min，得克拉霉素脂质体粗分散体系，备用；
步骤3：将脂质体粗分散体系转移至微射流仪中，5000psi循环8次；
步骤4：将步骤3均质后的脂质体用0.1mol·L-1氢氧化钠或盐酸溶液调节pH值至8.0，备用；
步骤5：将步骤4调过pH的脂质体制剂用配备100nm聚碳酸酯膜的脂质体挤出器循环挤出4次，装瓶，氮气灌封，即得克拉霉素离子对脂质体注射液；
实施例6 配方6 克拉霉素含量500mg:100ml；
以100ml注射液计
其余为注射用水；
克拉霉素离子对脂质体注射液的制备：
步骤1：将Na2HPO4·12H2O0.29g、NaH2PO4·2H2O0.13g、KH2PO40.02g、NaCl0.8g、KCl0.02g分散于100mL注射用水中，使其全部溶解，制得水相，60℃保温备用；
步骤2：将蛋黄卵磷脂4.5g、克拉霉素0.5g、胆固醇琥珀酸单酯0.65g、MPEG-DSPE0.5g用适量无水乙醇溶解，旋转蒸发除掉乙醇后，氮气吹干；将所得的磷脂干膜用步骤1制得的水相在60℃水化30min，得克拉霉素脂质体粗分散体系，备用；
步骤3：将脂质体粗分散体系转移至微射流仪中，5000psi循环8次；
步骤4：将步骤3均质后的脂质体用0.1mol·L-1氢氧化钠或盐酸溶液调节pH值至8.0，备用；
步骤5：将步骤4调过pH的脂质体制剂用配备100nm聚碳酸酯膜的脂质体挤出器循环挤出4次，装瓶，氮气灌封，即得克拉霉素离子对脂质体注射液；
测试例
一、克拉霉素离子对的表征
1.克拉霉素离子对的制备
将摩尔比1:1的克拉霉素和胆固醇琥珀酸单酯加入适量无水乙醇中，40℃搅拌下溶解，继续搅拌4h，室温放置过夜。将过夜样品置于40℃真空干燥箱中干燥3d，除去溶剂乙醇。将得到的粉末状克拉霉素离子对储存在10ml西林瓶中，4℃冰箱保存。
2.物理混合物的制备
将摩尔比1:1的克拉霉素和胆固醇琥珀酸单酯加入研钵中，研磨30～40min后，将物理混合物粉末储存在10ml西林瓶中，4℃冰箱保存。
3.溶解度及表观油水分配系数
按照中国药典(2010版)二部附录溶解度测定法测定，将过量克拉霉素原料粉末、克拉霉素离子对粉末置100mL锥形瓶中，分别加入正辛醇、氯仿、无水乙醇、pH7.4PBS和注射用水中，于37℃的恒温水浴(转速100rpm)中，振摇3天，于室温(25℃)放置1天后，进行测定，将饱和溶液过0.22μm微孔滤膜，取续滤液20μL用于HPLC分析，测定各饱和溶液的溶解度结果见表1。
表1 克拉霉素及克拉霉素离子对的溶解度
配制pH7.4的克拉霉素及克拉霉素离子对饱和PBS溶液，分别精密移取以上溶液10mL加入水饱和正辛醇10mL于磨口三角瓶中，置恒温空气浴振荡器中振摇(37℃，100rpm)3天至平衡，分离水相与正辛醇相。离心并HPLC法测定药物浓度，及母液中的药物浓度，表观油水分配系数计算结果见表2。
表2 克拉霉素及克拉霉素离子对的表观油水分配系数
P(油水分配系数) Log P
克拉霉素 64.55 1.81
克拉霉素离子对 316.78 2.50
由克拉霉素及克拉霉素离子对的溶解度和表观油水分配系数的数据可见，将克拉霉素制成Cla-Chems离子对，改善了克拉霉素的两性，既显著提高了克拉霉素的脂溶性，也略微改善了克拉霉素的水溶性，为克拉霉素离子对脂质体注射液降低MIC值，提高药效，改善耐药性提供了依据。
4.红外光谱学研究
Rosario Pignatello等人的研究结果显示，红霉素和脂氨基酸形成的离子对，在红外光谱中的1580cm-1有吸收峰。这已经是含有氨基类药物形成离子对的一种简便的表征手段。由于克拉霉素和红霉素的结构仅差一个甲基，故仍可沿用RosarioPignatello等人的方法进行离子对表征。
取克拉霉素原料药粉末、胆固醇琥珀酸单酯粉末、克拉霉素离子对粉末及克拉霉素胆固醇琥珀酸单酯物理混合物粉末做红外光谱学研究，得红外光谱图(见附图1a～d)。
从红外光谱图中可见，克拉霉素和胆固醇琥珀酸单酯在1580cm-1附近并无吸收峰，克拉霉素离子对在1580cm-1有明显的吸收峰，证明克拉霉素形成了离子对。物理混合物的红外光谱在1580cm-1附近也有微弱的吸收峰，推测是由于研磨过程中，一部分热能促使克拉霉素和胆固醇琥珀酸单酯形成极少量的离子对。
二、克拉霉素离子对脂质体注射液的质量评价
1.外观
肉眼观察实施例1-3的克拉霉素离子对脂质体注射液的外观均为半透明淡黄色混悬液体。
2.粒径及粒度分布考察
用过0.22μm微孔滤膜的注射用水将按实施例3配方制得的脂质体样品稀释5000倍后立即放入NicompTMPSS380粒度测定仪的样品池内，调节光强度至300±20，光源为HeNe激光(λ0＝633nm)，将操作参数中温度设为测定时的室温，开始测定，保持测定至Time history曲线趋于直线时停止测定，保存数据。20120530批样品典型的粒径测定高斯分布图(PSDI,PSDV,PSDN)如图2所示。三批样品的粒度测定结果见表3所示。
表3 三批样品的粒度测定结果结果
批号 表示形式 PSDI(nm)
20120528 高斯分布 70.6±25.2
20120529 高斯分布 71.3±22.5
20120530 高斯分布 70.1±24.3
3.ζ-电位的测定
采用NicompTMPSS380进行ζ-电位的测定。将按实施例3配方制得的脂质体样品用过0.22μm微孔滤膜的注射用水稀释50倍，放入样品池内，调节光强度至2000左右，光源为HeNe激光(λ0＝633nm)，电场强度10V/cm，散射角θ＝18.9°，将操作参数中温度设为测定时室温，测定时间1min。三批样品ζ-电位测定典型的图谱见图3.三批样品ζ-电位测定结果见表4.
表4 三批样品的ζ-电位测定结果
批号 20120528 20120529 20120530
ζ-电位(mV) -38.69 -38.34 -39.94
由图2和表4看出，ζ-电位为-30mV左右，在-20～-45mV之间，具有良好物理稳定性。
4.含量测定及包封率(Entrapment efficiency,EE)考察
采用90％异丙醇+10％0.5mol·L-1盐酸破坏脂质体，用HPLC测定克拉霉素离子对脂质体注射液中克拉霉素的含量。
包封率的测定方法：取克拉霉素离子对脂质体注射液0.5ml，加入超滤离心管中，置离心机中以3,000rpm离心15min，重复操作3次，合并离心套管中的超滤液，用HPLC测定水相中药物含量，并按以下公式计算包封率：
包封率(EE)％＝(1-水相中药物浓度/药物总浓度)×100％
将按实施例3配方制得的三批克拉霉素脂质体注射液的含量和包封率测定结果如下表5所示。
表5 三批样品的克拉霉素含量和包封率测定结果
批号 20120528 20120529 20120530 平均值
含量(％) 100.9 100.5 100.3 100.6
EE(％) 94.3 95.6 94.8 94.9
5.克拉霉素离子对脂质体注射液的稳定性考察
1)振摇稳定性考察
取实施例3制备的克拉霉素脂质体注射液适量，充氮气、密封于西林瓶中，于室温置空气浴振荡器中，以100rpm振摇，分别于3h、6h、12h、24h取样，测定零时及各取样时间点下乳剂的粒度，结果如图4所示。由图4可见，乳剂平均粒径及粒度分布无显著性变化，可认为克拉霉素脂质体注射液振摇稳定性良好，适于工业化生产和运输。
2)高温稳定性考察
取实施例3制备的克拉霉素脂质体注射液放置于60℃烘箱中，分别于第3、6和10天取样进行外观、pH、粒度、含量测定，测定结果见如下表6.
表6 克拉霉素离子对脂质体注射液60℃条件下高温稳定性实验结果
3天 6天 10天
外观 良好 良好 良好
pH 7.80 7.58 7.42
PSD(nm) 75.1±28.3nm 79.3±30.5nm 83.4±34.2nm
含量(％) 97.5 95.0 93.3
由表4看出，克拉霉素离子对脂质体注射液在高温60℃加速10天后，含量仅下降了6.7％，仍在标示量的90％以上。
3)加速稳定性考察
取按实施例3配方制备的克拉霉素离子对脂质体注射液三批样品(批号：20120528、20120529、20120530)放置于25℃±2℃条件下储藏6个月，分别于第1、2、3、6月取样进行各项理化性质的检查与测定，结果见表7。
表7 克拉霉素离子对脂质体注射液加速稳定性实验结果(25℃±2℃)
应用MPEG-DSPE磷脂后，克拉霉素离子对注射液的加速稳定性考察的结果显示：在25℃±2℃条件下放置6个月，其外观、pH值、药物含量、包封率及平均粒径等指标都没有发生显著的变化，仍符合静脉注射用药要求。
4)长期稳定性考察
取按实施例3配方制备的克拉霉素离子对脂质体注射液三批样品(批号：20120528、20120529、20120530)放置于4℃±2℃条件下储藏12个月，分别于第3、6、9、12、18、24月取样进行各项理化性质的检查与测定，结果见表8。
表8 克拉霉素离子对脂质体注射液长期稳定性实验结果(4℃±2℃)
应用MPEG-DSPE磷脂后，克拉霉素离子对注射液的长期稳定性考察的结果显示：在4℃±2℃条件下放置24个月，其外观、pH值、药物含量、包封率及平均粒径等指标都没有发生显著的变化，仍符合静脉注射用药要求。
6.克拉霉素离子对脂质体注射液的刺激性研究
6.1小鼠抓挠试验
将实验小鼠随机分3组：阴性对照组、阳性对照组和待检组(实施例3所得样品)，每组6只小鼠，以小鼠背部皮下注射的方式给药，阴性对照组注射生理盐水，阳性对照组注射克拉霉素溶液剂，待检组注射经注射用水稀释的克拉霉素离子对脂质体注射液，注射量均为0.15mL，记录注射后15min内每只小鼠抓挠给药部位的首次时间和总次数，其中克拉霉素溶液剂和稀释后的克拉霉素离子对脂质体注射液的克拉霉素浓度均为4mg/mL。结果用T检验进行统计，见表9。
表9 小鼠抓挠实验结果(15min内)
结果表明，在95％的置信区间内，克拉霉素离子对脂质体注射液与溶液剂相比存在显著性差异，对疼痛的抑制率达到80％以上，明显降低了疼痛和刺激性。对疼痛的抑制率是以15min内每只小鼠抓挠给药部位的总次数为指标，以阳性对照组为参照计算而得。
6.2大鼠舔足试验
将实验大鼠(体重80kg～120kg)随机分为3组：阴性对照组、阳性对照组和待检组(实施例3所得样品)，每组6只，以大鼠右后足注射的方式给药，阴性对照组注射生理盐水，阳性对照组注射克拉霉素溶液剂，待检组注射经注射用水稀释的克拉霉素离子对脂质体注射液，注射剂量均为0.1ml，记录注射后15min内每只大鼠舔足的首次时间和总舔足次数，其中克拉霉素溶液剂和稀释后的克拉霉素离子对脂质体注射液的克拉霉素浓度均为4mg/ml。结果用T检验进行统计，见表10。
表10 大鼠舔足试验结果(15min内)
结果表明，在95％的置信区间内，克拉霉素离子对脂质体注射液与溶液剂相比存在显著性差异，对疼痛的抑制率达到80％以上，明显降低了疼痛和刺激性。对疼痛的抑制率是以15min内每只大鼠舔足的总次数为指标，以阳性对照组为参照计算而得。
6.3家兔耳缘静脉刺激性试验
将实验家兔(体重3kg左右)随机分为3组，即阳性对照组、阴性对照组和待检组(实施例3所得样品)，每组3只，各组均采用耳静脉注射方式给药，其中阴性对照组为生理盐水注射液，阳性对照组为注射克拉霉素溶液剂，待检组为克拉霉素离子对脂质体注射液，阳性对照组和待检组中的克拉霉素浓度均为5mg/ml，每只兔子给药5ml，给药速率均为1ml/min，连续给药3天。给药过程中观察给药部位是否变色、出现红斑和肿胀。末次给药后处死兔子，将兔子耳静脉组织制成病理切片(见附图5a～f)，从图中可以看出，阳性对照组存在明显的炎性细胞浸润，待检组与阳性对照组相比存在显著性差异，待检组可以明显降低血管刺激性。
7.克拉霉素离子对脂质体注射液的体外抗菌活性研究
取实施例3配方制备的克拉霉素离子对脂质体注射液，采用微量肉汤稀释法测定体外抗菌活性
1)药敏板制备及测定方法：在无菌间或无菌净化台内将克拉霉素原料药和克拉霉素离子对脂质体注射液的11个倍比稀释浓度贮存液以微量加样器依次加入经消毒的8×12孔V型微量滴度版内，每孔10μl，第12孔为无药空白对照、再用相同面积四边有不干胶的塑料纸密封后置于-20℃，为冰冻的药敏板。
2)肉汤增菌4～6小时的对数期菌悬液，首先纠正其浊度至1/2麦氏标准，再以MH肉汤稀释成1～5×105菌数/ml接种物，无菌方法每孔加接种物100μl，35℃孵育18～20小时，以肉眼观察无菌生长的最低浓度孔为MIC(mg/L)。
3)每株受试菌均以微量法测定3次
表11 体外抗菌活性实验结果
综上结果显示，ATCC29213的测定值均为0.125mg/L，质控范围为0.12～0.5mg/L，可认为在质控范围。生长对照细菌生长良好，阴性对照均无细菌生长。因此，认为本实验有效。
实验结果显示，克拉霉素离子对脂质体注射液显著降低了克拉霉素的最低抑菌浓度，提高了药效，一定程度上改善了药物的抗菌活性，解决了一部分菌株的耐药问题。

Claims (5)

1.一种克拉霉素离子对脂质体注射液，其特征在于：按100ml计，其包含：
其中，MPEG-DSPE是二硬脂酰磷脂酰乙醇胺的聚乙二醇化衍生物——甲氧基封端，使用PEG化的磷脂制备的脂质体可以显著提高脂质体的空间稳定性，延长体内循环时间；蛋黄卵磷脂PC-98T为高纯蛋黄卵磷脂，PC含量大于98％，能够充分保证克拉霉素离子对载在脂质体的磷脂膜上；克拉霉素与胆固醇琥珀酸单酯的质量比为1:1～1:3。
2.根据权利要求1所述的克拉霉素离子对脂质体注射液，其特征在于：以100ml注射液计，其包含：
其余为注射用水
其中，克拉霉素和胆固醇琥珀酸单酯的质量比为1:2。
3.根据权利要求1或2所述的克拉霉素离子对脂质体注射液，其特征在于：脂质体的粒径在70.1nm，ζ电位在-39.94mv，pH值>7，包封率>95％。
4.一种如权利要求1所述的克拉霉素离子对脂质体注射液的制备方法，其特征在于：以制备100ml注射液计，该方法包括：
步骤1：将Na2HPO4·12H2O0.2～0.4g、NaH2PO4·2H2O0.1～0.2g、KH2PO40.01～0.03g、NaCl0.7～0.9g、KCl0.01～0.03g分散于100mL注射用水中，使其全部溶解，制得水相，60℃保温备用；
步骤2：将蛋黄卵磷脂0.8g～5g、克拉霉素0.05g～0.5g、胆固醇琥珀酸单酯0.3g～0.8g、MPEG-DSPE0.05～0.5g用适量无水乙醇溶解，旋转蒸发除掉乙醇后，氮气吹干；将所得的磷脂干膜用步骤1制得的水相在60℃水化30min，得克拉霉素脂质体粗分散体系，备用；
步骤3：将脂质体粗分散体系转移至高压均质机中进行均质；
步骤4：将步骤3均质后的脂质体用0.1mol·L-1氢氧化钠或盐酸溶液调节pH值至8.0，备用；
步骤5：将步骤4调过pH的脂质体制剂用配备100nm聚碳酸酯膜的脂质体挤出器循环挤出4次，装瓶，氮气灌封，即得克拉霉素离子对脂质体注射液；其中克拉霉素含量为0.05g～0.5g。
5.根据权利要求4所述的克拉霉素离子对脂质体注射液的制备方法，其特征是，该方法操作步骤如下：
步骤1：将Na2HPO4·12H2O0.29g、NaH2PO4·2H2O0.13g、KH2PO40.02g、NaCl0.8g、KCl0.02g分散于100mL注射用水中，使其全部溶解，制得水相，60℃保温备用；
步骤2：将蛋黄卵磷脂4.5g、克拉霉素0.5g、胆固醇琥珀酸单酯0.65g、MPEG-DSPE0.5g用适量无水乙醇溶解，旋转蒸发除掉乙醇后，氮气吹干；将所得的磷脂干膜用步骤1制得的水相在60℃水化30min，得克拉霉素脂质体粗分散体系，备用；
步骤3：将脂质体粗分散体系转移至高压均质机中进行均质，以冰水浴控制均质温度在40℃以下，5800psi均质8次；
步骤4：将步骤3均质后的脂质体用0.1mol·L-1氢氧化钠或盐酸溶液调节pH值至8.0，备用；
步骤5：将步骤4调过pH的脂质体制剂用配备100nm聚碳酸酯膜的脂质体挤出器循环挤出4次，装瓶，氮气灌封，即得克拉霉素离子对脂质体注射液。
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