CN108685944A - 包含活体染料的药物组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种包含活体染料的药物组合物、该组合物在预防和治疗哺乳动物实体肿瘤的局部给药中的方法和用途。根据本发明提供一种用于预防和治疗哺乳动物实体肿瘤的药物组合物，其包含活体染料和任选存在的一种或多种可药用赋形剂，且其组成使得该药物组合物在被施用于所述实体肿瘤后能够提供峰浓度>2％w/v、优选≥3％w/v的所述活体染料。

Description

包含活体染料的药物组合物及其应用

技术领域

本发明涉及一种包含活体染料的药物组合物、该组合物在预防和治疗哺乳动物实体肿瘤的局部给药中的方法和用途。

背景技术

在人体中可以使用的活体染料例如包括亚甲蓝(Methylene blue)、专利蓝、异硫蓝等，主要是用作活体染色剂。亚甲蓝被作为化疗药物的主要应用是消毒，例如亚甲蓝注射液通过静脉注射来治疗外源性高铁血红蛋白血症和氰化物中毒。亚甲蓝还对多个生物靶点有药学活性。例如，第201310149697.4号中国专利申请将亚甲蓝用于制备镇痛药物组合物，第201410252319.3号中国专利申请将亚甲蓝用于制备抗急性脑缺血损伤组合物。如第200910140884.X号中国专利申请中所公开的，通常认为现有研究“已证实亚甲蓝作为抗肿瘤药物本身是无效的”。因此，亚甲蓝在现有技术中应用于实体肿瘤防治时，主要是用作光敏剂通过光动力提高其活性。例如，申请号200910140884.X的中国专利便是开发更高光敏活性、而非化疗活性的亚甲蓝衍生物。

此外，现有技术还对亚甲蓝的安全性、尤其是局部给药安全性存在广泛担心。例如，业内人士的通常看法是，1％浓度亚甲蓝即“不能皮下、肌肉或鞘内注射，前者引起坏死，后者引起瘫痪”(国家药品监督管理局药监注函[2002]58号中发布的亚甲蓝注射液使用说明书参考样稿)。

发明内容

根据本发明的一个方面，其提供一种用于预防和治疗哺乳动物实体肿瘤的药物组合物，其包含活体染料和任选存在的一种或多种可药用赋形剂，且其组成使得该药物组合物在被施用于所述实体肿瘤后能够提供峰浓度>2％w/v、优选≥3％w/v的所述活体染料。

根据本发明的一个实施方案，在施用于所述实体肿瘤后，根据本发明的药物组合物所提供的活体染料的峰浓度为3-12％w/v、4-11％w/v或5-12％w/v，优选为5-10％w/v或6-10％w/v。

根据本发明之药物组合物的一个实施方案，所述活体染料包括碱性活体染料，其中所述碱性活体染料为选自以下组中的一种或多种：苏木精、结晶紫、中性红、亚甲蓝、专利蓝、异硫蓝、甲苯胺蓝、台盼蓝、碱性蓝及其衍生物。

根据本发明之药物组合物的一个实施方案，所述活体染料包括前哨淋巴结染料，其中所述前哨淋巴结染料优选为选自以下组中的一种或多种：亚甲蓝、专利蓝、异硫蓝及其衍生物。

根据本发明之药物组合物的一个实施方案，所述药物组合物还可以包含用以增强药效的多价金属盐。所述多价金属盐例如可以为选自以下之一种或多种的金属盐：铁盐、铜盐、锌盐、锰盐、铝盐，优选为铁盐和铜盐，更优选为选自以下之一种或多种的亚铁盐：二氯化铁、硫酸亚铁、琥珀酸亚铁、富马酸亚铁、葡萄糖酸亚铁、乳酸亚铁。

根据本发明的一个实施方案，在施用于所述实体肿瘤后，根据本发明的药物组合物所提供的金属盐的峰浓度可以为0.02-2％w/v，优选为0.05-1.5％w/v，更优选为0.1-1.2％w/v或0.1-1.6％w/v。

根据本发明之药物组合物的一个实施方案，所述药物组合物还可以包含用以增强药效的其它抗肿瘤药物。

根据本发明之药物组合物的一个实施方案，所述其它抗肿瘤药物包括有效抗肿瘤药物和低效抗肿瘤药物，其中所述低效抗肿瘤药物可以是选自以下组中之一种或多种：非甾体抗炎化合物、喹啉类化合物、青蒿素衍生物、酚类化合物。

根据本发明的一个实施方案，在施用于所述实体肿瘤后，根据本发明的药物组合物所提供的低效抗肿瘤物质的峰浓度可以为0.1-15％w/v、优选0.2-10％w/v或0.5-10％w/v。

根据本发明之药物组合物的一个实施方案，所述药物组合物还可以包含用以增强药效的靶向剂，其中所述靶向剂包括靶向化合物、靶向抗体或它们的组合，优选为靶向化合物，更优选为选自以下组中的一种或多种：叶酸、透明质酸、转铁蛋白及其衍生物。

根据本发明的一个实施方案，在施用于所述实体肿瘤后，根据本发明的药物组合物所提供的靶向剂的峰浓度可以为0.2-3％w/v，其优选为0.25-2.5％w/v，更优选为0.5-1.5％w/v或0.3-1.5％w/v。

根据本发明之药物组合物的一个实施方案，所述药物组合物还可以包含用以增强药效的生物活性成分，其中所述生物活性成分为选自具有以下之一种或多种结构的活性生物提取物及其类似物：苷、多酚、多糖、萜类、黄酮。

根据本发明的一个实施方案，在施用于所述实体肿瘤后，根据本发明的药物组合物所提供的生物活性成分的峰浓度可以为0.1-15％w/v，其优选为0.25-10％w/v，更优选为0.5-6％w/v或1-6％w/v。

根据本发明之药物组合物的一个实施方案，所述药物组合物还包含用以增强药效的缓释载体，所述缓释载体包括凝胶基质、微粒载体、胶束基质，所述微粒载体可以是选自以下组中的一种或多种：氢氧化铝微粒、磷酸钙微粒、磷酸铝微粒、硫酸铝微粒、纳米碳粒子、碳纳米管、富勒烯、纳米金刚石、纳米碳点。

根据本发明的一个实施方案，在施用于所述实体肿瘤后，根据本发明的药物组合物所提供的缓释载体的峰浓度可以为0.2-10％w/v，其优选为0.5-8％w/v，更优选为0.5-6％w/v或1-5％w/v。

根据本发明之药物组合物的一个实施方案，所述药物组合物还包含免疫佐剂。所述免疫佐剂选自以下组中的一种或多种：无机佐剂、合成佐剂、油/乳佐剂、生物佐剂。其中所述生物佐剂选自以下组中的一种或多种：微生物、细菌、病毒、及它们的佐剂成分。其中所述佐剂成分包括非甲基化胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸-脱氧寡核苷酸(CpG ODN))。

根据本发明之药物组合物的一个实施方案，所述药物组合物还包含止痛剂。

根据本发明之药物组合物的一个实施方案，所述药物组合物为冻干制剂。

根据本发明的另一个方面，其提供活体染料在制备用于预防和治疗哺乳动物实体肿瘤的药物组合物中的应用，其中活体染料在该药物组合物中的含量能够使该药物组合物在被施用于所述实体肿瘤后提供峰浓度>2％w/v、优选≥3％w/v的所述活体染料。

根据本发明的一个实施方案，在施用于所述实体肿瘤后，所述药物组合物所提供的活体染料的峰浓度为3-12％w/v、4-11％w/v或4-12％w/v，优选为5-10％w/v或6-10％w/v。

根据本发明之应用的一个实施方案，所述局部给药包括瘤内给药。

根据本发明的再一个方面，其提供一种预防和治疗哺乳动物实体肿瘤的方法，其包括以下步骤：向有此需要的个体局部给药包含活体染料的药物组合物，其中活体染料在该药物组合物中的含量能够使该药物组合物在被施用于所述实体肿瘤后提供峰浓度>2％w/v、优选≥3％w/v的所述活体染料。

根据本发明的一个实施方案，在施用于所述实体肿瘤后，所述药物组合物所提供的活体染料的峰浓度为3-12％w/v、4-11％w/v或4-12％w/v，优选为5-10％w/v或6-10％w/v。

根据本发明的实施方案与现有抗肿瘤技术相比具有以下优点：与现有的化疗技术相比，显示出超乎寻常的超髙有效性却未见降低的安全性；与现有的活体染料光动力技术相比，显示出同样髙效却可以不必需光源的有效性。

此外，通过不同药理的药物(例如多价金属盐等)的引入也产生了额外的协同作用，从而可以进一步提高治疗的安全性和有效性。更进一步，该组合物制备方便、成本便宜，特别有助于使难以承受高额费用的广大人群也享受到有效治疗。

以下将参考附图对本发明进行更为详细的说明。

附图说明

图1给出以荷肝癌细胞裸鼠为模型的一个体内活性比较研究实验的结果，显示亚甲蓝不同于临床对照药物(5-氟尿嘧啶)的药学表现。

图2给出以荷肝癌细胞裸鼠为模型的一个瘤内注射多因素(剂量、浓度、瘤体体积)研究实验的结果，显示亚甲蓝浓度不同寻常的药学表现。

图3给出以荷肝癌细胞裸鼠为模型的一个治疗实验结果，显示超高浓度亚甲蓝且瘤内注射才产生超有效活性。

图4给出以荷肝癌细胞裸鼠为模型的一个治疗实验结果，显示超高浓度亚甲蓝与某些添加剂的组合物在瘤内注射时产生协同作用。

具体实施方式

在本发明中，除非另有说明，术语“浓度”是指组合物单位体积中指定组分的含量，并以％(v/w)表示重量/体积百分比浓度，以％(v/v)表示体积/体积百分比浓度。

在本发明的范围中，术语“组合物”是指包括包含指定量的各指定组分的产品，以及直接或间接从指定量的各指定组分的组合产生的任何产品。根据本发明，所述的“组合物”与“药物组合物”可以互换使用。本发明的组合物中的组分，在以下叙述中也被简写为组分1/组分2、或组分1/组分2/组分3。组合物中各组分的浓度也可以被冠在组分之前，例如0.4％二氯化铁/5％亚甲蓝是指一个二氯化铁和亚甲蓝的组合物，其中二氯化铁的浓度为0.4％w/v，亚甲蓝的浓度为5％w/v。其它多组分组合物的简写方式以此类推。

本发明的发明人通过大量的实验和摸索，意外地发现活体染料在特定的条件下能够用于治疗哺乳动物实体肿瘤，并产生非常良好的治疗效果。

根据本发明的一个方面，其提供一种用于预防和治疗哺乳动物实体肿瘤的药物组合物，其包含活体染料和任选存在的一种或多种可药用赋形剂，且其组成使得当该药物组合物被施用在所述实体肿瘤后能够提供峰浓度>2％w/v、优选≥3％w/v的所述活体染料。

根据本发明的一个实施方案，在施用于所述实体肿瘤后，所述药物组合物所提供的活体染料的峰浓度为3-12％w/v、4-11％w/v或4-12％w/v，优选为5-10％w/v或6-10％w/v。

在本发明的范围中，术语“活体染料”是指进入动物活体组织后能够使组织、细胞、亚细胞单元等结构上色、但对动物整体没有不可接受的危害性的芳香化合物染料。所述活体染料可以是本领域技术人员已知的任意合适者，例如可以是选自以下组中的一种或多种有机染料及其水合物或衍生物：亚甲蓝(本发明中也包括水合物)、专利蓝、异硫蓝、甲苯胺蓝、台盼蓝、碱性蓝、伊红、碱性品红、结晶紫、龙胆紫、中性红、詹纳斯绿B、番红。

根据本发明，所述活体染料优选碱性活体染料。在本发明的范围中，术语“碱性活体染料”是指解离后带正电的活体染料。所述碱性活体染料可以是本领域技术人员已知的任意合适者，例如可以是选自以下组中的一种或多种有机染料及其水合物或衍生物：苏木精、结晶紫、中性红、亚甲蓝、专利蓝、异硫蓝、甲苯胺蓝、台盼蓝、碱性蓝和没食子蓝等。

根据本发明，所述活体染料优选前哨淋巴结染料。在本发明的范围中，术语“前哨淋巴结染料”是指可用于检出前哨淋巴结的活体染料。所述前哨淋巴结染料可以是本领域技术人员已知的任意合适者，例如可以是选自以下组中的一种或多种有机染料及其水合物或衍生物：亚甲蓝、专利蓝、异硫蓝。以亚甲蓝为例，其衍生物包括例如以亚甲蓝为先导物设计或合成的吩噻嗪类化合物(例如新亚甲蓝、1，9-二甲基亚甲蓝、1-甲基亚甲蓝等)。根据本发明，所述活体染料优选碱性活体染料。

令人惊奇的是，根据本发明的实施例，这些化学结构很不相同的活体染料在本发明提供的相同条件(靶区给药、超高浓度)下不仅产生了相同的超有效抗肿瘤活性，而且对病理很不相同的其它实体肿瘤也产生了相同的超有效治疗活性。

在根据本发明的药物组合物中，其包含药物学上可接受的赋形剂。所述赋形剂可以是本领域技术人员已知的任意合适者，其可例如包括以下之一种或多种：分散介质、防腐剂、稳定剂、湿润剂和/或乳化剂、增溶剂、增粘剂、用于调节渗透压的盐和缓冲剂。所述增粘剂例如为羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯毗咯烷酮或明胶。所述防腐剂是例如抗氧化剂例(如抗坏血酸)或杀微生物剂(如山梨酸或苯甲酸)。

根据本发明，除活体染料和药物学上可接受的赋形剂外，所述组合物还可以进一步包含以下一种或多种物质：多价金属化合物、其它抗肿瘤药物、靶向剂、生物活性成分、缓释载体、免疫佐剂和止痛剂。

根据本发明的一个实施方案，所述药物组合物可进一步任选包含多价金属化合物。在本发明的范围中，术语“多价金属化合物”包括包含相应二价或以上价金属的金属盐和有机金属化合物，其中所述二价或以上价金属例如可以是铁、铜、镁、锌、锰、铝和钙中的一种或多种。该多价金属化合物优选为选自以下之一种或多种的金属盐：铁盐、铜盐、镁盐、锌盐、锰盐、铝盐和钙盐，优选为铁盐和铜盐。

具体对于铁盐而言，其包括铁(III)离子盐和亚铁(II)离子盐，其总称为铁盐。铁盐包括任何药物学上可以接受的铁盐，可以是铁离子或亚铁离子与上述无机酸或有机酸形成的盐。例如，亚铁离子盐包括二氯化铁、硫酸亚铁、琥珀酸亚铁、富马酸亚铁、葡萄糖酸亚铁、乳酸亚铁、蔗糖铁等。铁(III)离子盐包括例如枸橼酸铁铵、右旋糖酐铁、蛋白琥珀酸铁。在根据本发明的药物组合物中，所述金属化合物优选为亚铁离子盐，更优选为选自以下之一种或多种的亚铁盐：二氯化铁、硫酸亚铁、琥珀酸亚铁、富马酸亚铁、葡萄糖酸亚铁、乳酸亚铁、蔗糖铁。

所述多价金属化合物还包括金属有机化合物，例如转铁蛋白、含铁血红素、氨基酸络合铁、多糖靶向剂铁等。

根据本发明的一个实施方案，所述药物组合物可进一步任选地包含其它抗肿瘤药物。在本发明的范围内，术语“其它抗肿瘤药物”是指具有预防和治疗实体肿瘤的活性且药物学上可接受的物质，其可以是有效药物，也可以是相应的低效药物。按照针对实体肿瘤的不同活性，所述其它抗肿瘤药物可分为抗肿瘤药物、抗非瘤肿大药物、抗微生物局部感染药物、抗分泌腺功能异常药物等。所述其它抗肿瘤药物可以是碱性活体染料之外的、本领域技术人员已知的任意合适者(例如有效药物、低效药物或它们的组合)，加入后可以例如提高药效、或者降低毒性。

在本发明的范围内，术语“有效药物”是指在安全剂量内全身单独用药时即可显示出有效活性的药物。以有效抗肿瘤药物为例，其为例如动物实验中全身用药时抑瘤率可达40％以上的药物，其可以是本领域技术人员已知的任意合适者，例如包括以下抗肿瘤药物中的一种或多种：烷化剂类(例如环磷酰胺、白消安、氮芥、卡莫斯丁等)、破坏DNA的铂类(例如顺铂、卡铂、奈达铂等)、破坏DNA的抗生素类(例如博莱霉素、平阳霉素、丝裂霉素等)、影响核酸生物合成的药物(例如氟尿嘧啶、吉西他滨、阿糖胞苷等)、干扰转录过程和阻止RNA合成的药物(例如阿柔比星、多柔比星等)、拓扑异构酶抑制剂(例如伊立替康、羟喜树碱等)、影响微管蛋白合成的药物(例如长春新碱、紫杉醇、多西他赛等)、小分子靶向药物(例如吉非替尼、伊马替尼、索拉菲尼等)、抗体药物(例如利妥昔单抗、替伊莫单抗、西妥昔单抗等)。碱性活体染料除了本身具有抗肿瘤活性，还具有逆转有效抗肿瘤药物的肿瘤细胞耐药性的功能。

在本发明的范围内，术语“低效药物”是指具有一定活性但在安全剂量内全身单独用药时未显示出与有效药物相当的有效活性的药物。以低效抗肿瘤药物为例，其在动物实验中全身用药时的抑瘤率未达40％、或低于有效药物的抑瘤率。在本发明提供的技术方案中，活体染料显示出与低效药物的异乎寻常的协同作用。在本发明的组合物中，所述低效药物例如可以是选自以下组中的一种或多种：非甾体抗炎化合物、喹啉类化合物、青蒿素衍生物、酚类化合物，这些低效药物可同时起到抗肿瘤、抗非瘤肿大、抗微生物局部感染、抗分泌腺功能异常的作用。

在本发明的范围中，术语“非甾体抗炎化合物”是指不含有甾体结构、但具有抗炎作用的化合物及其衍生物，其可以是本领域技术人员已知的任意合适者，包括例如水杨酸类化合物、丙酸类抗炎化合物(例如布洛芬、芬必得、萘普生等)、吲哚类抗炎化合物(例如吲哚美辛、舒林酸等)、苯胺类抗炎化合物(例如非那西丁、N-(4-羟基苯基)乙酰苯胺(对乙酰氨基酚))、灭酸类抗炎化合物(例如甲灭酸、氯灭酸、双氯灭酸和氟灭酸等)、乙酸类抗炎化合物(例如双氯芬酸钠等)、喜康类抗炎化合物(例如炎痛喜康等)、吡唑酮类抗炎化合物(例如保泰松，羟基保泰松等)。

在本发明的范围中，术语“水杨酸类化合物”是指水杨酸及其衍生物，其可以是本领域技术人员已知的任意合适者，包括例如以下化合物及其衍生物：乙酰水杨酸(Aspirin阿斯匹林)、二氟苯水杨酸、氨基水杨酸、水杨酰苯胺、水杨酸苯酯、双水杨酸酯、双香豆素等。以乙酰水杨酸衍生物为例，可以是包括例如其单一衍生物(例如一氧化氮阿司匹林、硫化氢阿司匹林等)、两种衍生物形成的衍生物(例如一氧化氮阿司匹林和硫化氢阿司匹林形成的一氧化氮硫化氢(NOSH)阿司匹林)。

在本发明的范围中，术语“喹啉类化合物”是指药学上可以接受的含有喹啉环的喹啉衍生物，包括例如氯喹(chloroquine)、羟氯喹啉、氨甲喹、氨酚喹、奎宁、硝喹、哌喹、伯氨喹(primaquine)、扑疟喹、戊烷喹及其异构体和药物学上可接受的盐，其中优选为奎宁、氯喹、伯氨喹及其异构体和药物学上可接受的盐，更优选为奎宁及其药物学上可接受的盐。奎宁盐例如可以是盐酸奎宁、二盐酸奎宁、硫酸奎宁等。

在本发明的范围中，术语“青蒿素衍生物”可以是本领域技术人员已知的任意合适者，包括例如青蒿素的酯类衍生物、醚类衍生物、肽类衍生物、二聚体衍生物、及多聚体衍生物等，优选青蒿琥酯、双氢青蒿素、蒿甲醚、蒿乙醚等。

在本发明的范围中，术语“酚类化合物”是指其化学结构中含有酚基团的化合物，其可以是本领域技术人员已知的任意合适者，优选具有解偶联作用者，包括例如硝基酚化合物、氯酚化合物和氨基酚化合物。所述硝基酚化合物可以包括例如2,4-二硝基苯酚(dinitrophenol，本发明中简记作DNP)、间硝基苯酚、邻硝基苯酚等和它们的衍生物。DNP衍生物可以包括例如2,4-二硝基-1-萘酚(玛蒂乌斯黄)、4,6-二硝基-邻甲酚(维多利亚黄)、酚类氟姜黄色素衍生物等。所述氯酚化合物可以包括例如2,4,5-三氯苯酚、3,3’,4’,5-四氯水杨酰苯胺(TCS)等和它们的衍生物。所述氨基酚化合物可以包括例如对乙酰氨基酚及其衍生物。在根据本发明的药物组合物中，所述酚类化合物优选为选自硝基酚化合物和氨基酚化合物，更优选为选自以下化合物之一种或多种：2,4-二硝基苯酚、间硝基苯酚、对乙酰氨基酚及其衍生物。

在本发明提供的技术方案中，活体染料显示出与生物活性成分的异乎寻常的协同作用。在本发明的范围中，术语“生物活性成分”是指具有药学活性的生物提取物及其类似物。术语“活性”是指针对所述实体肿瘤相关疾病能够产生治疗作用的药理学性质。术语“生物提取物”是指以生物材料为原料、通过分离过程及其它加工过程获取的特定组分(例如包含以下之一种或多种结构的提取物：苷、多酚、多糖、萜类、黄酮、生物碱)，术语“生物”包括动物、植物、微生物等。在本发明的范围中，术语“生物提取物类似物”是指与生物提取物虽不相同、但结构或/和性质上相似的天然产物、衍生物、半合成物、或合成物。

在根据本发明的药物组合物中，所述生物活性成分可以是例如选自分子量大于5000、优选大于10000的高分子生物活性成分。

在根据本发明的药物组合物中，所述生物活性成分可以是例如具有以下之一种或多种基团的生物活性成分：磺酸基、羧甲基化、乙酰基，优选为具有磺酸基的生物活性成分。

在根据本发明的药物组合物中，所述生物活性成分包括活性多糖。在本发明的范围中，术语“多糖”是指由10个以上的单糖通过糖苷键连接形成的聚合物，其可以是本领域技术人员已知的任意合适者，例如可以是包括以下之一种或多种及其类似物：刺松藻多糖、紫菜多糖、海带多糖、褐藻多糖、褐藻多糖硫酸脂酯、石莼聚糖、浒苔多糖、礁膜多糖、螺旋藻多糖、紫球藻多糖、小球藻多糖、红球藻多糖、三角褐指藻、等鞭金藻多糖、人参多糖、黄茋多糖、红芪多糖、香菇多糖、茯苓多糖、猪苓多糖、灵芝多糖、云芝多糖等，优选为选自以下一种或多种：褐藻多糖硫酸脂酯、螺旋藻多糖、海藻硒多糖、人参多糖、黄茋多糖、红芪多糖、香菇多糖、茯苓多糖、猪苓多糖、灵芝多糖、云芝多糖等。

根据本发明的药物组合物，所述生物活性成分包括活性苷。

在本发明的范围中，术语“苷”是指糖和糖的衍生物如氨基糖、糖醛酸等与另一非糖物质通过糖的端基碳原子连结而成的化合物。所述活性苷可以是本领域技术人员已知的任意合适者，例如可以是包括以下之一种或多种及其类似物：人参皂苷、三七总皂苷、皂角苷、虎杖皂苷、海参总皂苷等。

根据本发明的药物组合物，所述生物活性成分包括活性多酚。

在本发明的范围中，术语“多酚”是指具有多个羟基酚基团的化合物，包括例如类黄酮、水解单宁、原花青素等。所述活性多酚可以是本领域技术人员已知的任意合适者，例如可以是包括以下之一种或多种及其类似物：茶多酚、白藜芦醇、苹果多酚等。

根据本发明的药物组合物，所述生物活性成分包括活性萜。

在本发明的范围中，术语“萜”是指由甲戊二羟酸衍生而成，基本碳架多具有2个或2个以上异戊二烯单位结构特征的化合物。所述活性萜可以是本领域技术人员已知的任意合适者，例如可以是包括以下之一种或多种及其类似物：青蒿素、大花旋覆花内酯、倍半萜烯内酯等。

根据本发明的药物组合物，所述生物活性成分包括活性黄酮。

在本发明的范围中，术语“黄酮”是指两个苯环(A-与B-环)通过中央三碳链相互联结而成的化合物。所述活性黄酮可以是本领域技术人员已知的任意合适者，例如可以是包括以下之一种或多种及其类似物：葛根素、木犀草素、水飞蓟宾、白杨素、染料木素、川陈皮素、甘草总黄酮等。

根据本发明的药物组合物，所述生物活性成分包括活性生物碱。

在本发明的范围中，术语“生物碱”是指来源于生物界的含氮有机化合物。所述活性生物碱可以是本领域技术人员已知的任意合适者，例如可以是包括以下之一种或多种及其类似物：喜树碱类生物碱、苦参碱类生物碱、长春花类生物碱、石蒜科生物碱、小檗碱类生物碱等。

在进一步的实施方案中，根据本发明的药物组合物还可包含用以增强药效的靶向剂，其选自靶向化合物、靶向抗体或它们的组合。在本发明的范围中，“靶向剂”是指能特异性结合实体肿瘤中的药靶的物质，其中当特异性结合物质为化合物时称作靶向化合物，当特异性结合物质为抗体时称作靶向抗体。本发明的药物组合物中的靶向剂优选为靶向化合物。靶向化合物可以是本领域技术人员已知的任意合适者，例如为选自以下组中的一种或多种化合物及其衍生物：叶酸、透明质酸、转铁蛋白。

在进一步的实施方案中，根据本发明的药物组合物还可包含缓释载体。所述缓释载体可以是本领域技术人员已知的任意合适者，包括例如凝胶基质、微粒载体、胶束基质等。

在本发明的范围内，术语“微粒载体”是指可以与药物相互作用(物理包埋、化学键合、静电相互作用等)的微粒，术语“微粒”是指所有能以局部给药方式进入身体局部(例如病变组织)內的微小粒子，其尺寸在1nm-100μm之间。微粒载体按基质材料分类包括有机材料载体、无机材料载体以及它们的组合，按微粒尺寸分类包括缓释载体(尺寸在1-1000nm之间)、微米载体(尺寸在1-100μm之间)以及它们的组合。

有机材料载体可以是本领域技术人员已知的任意合适者，例如包括以下之一种或多种：高分子基质微粒、脂质体微粒、纳米胶束基质、水油微球等，其中所述高分子基质优选为选自以下高分子及其衍生物之一种或多种：聚乳酸、聚氨基酸、聚羟基丁酸酯、乙交酯-丙交酯共聚物、聚氰基丙烯酸烷酯、聚酰胺、聚乙烯醇、聚丙烯酸树脂、壳聚糖等。

无机材料载体可以是本领域技术人员已知的任意合适者，例如包括以下之一种或多种：无机盐微粒、硅材料载体、铁化合物载体和碳材料载体。所述无机盐微粒优选为选自以下组中的一种或多种：氢氧化铝微粒、磷酸钙微粒、磷酸铝微粒、硫酸铝微粒及其衍生物。所述碳材料载体优选为选自以下组中的一种或多种：微米碳粒子、纳米碳粒子、碳纳米管、富勒烯、纳米金刚石、纳米碳点及其衍生物。

根据本发明的药物组合物还可任选地包含药学上可接受的疫苗佐剂。在本发明的范围中，术语“疫苗佐剂”(也简称佐剂)是指与目标抗原混合后能增强机体针对目标抗原的免疫应答能力、或改变免疫反应类型的物质。根据这一定义，疫苗佐剂与通常意义上的免疫增强剂有所不同，后者起作用往往不必与目标抗原混合。

根据本发明的药物组合物，所述疫苗佐剂可以是本领域技术人员已知的任意合适者，例如可以是包括以下以佐剂材料所分类的一种或多种：无机佐剂、合成佐剂、油/乳佐剂、生物佐剂，也可以是包括以佐剂尺寸所分类的微粒佐剂、或/和分子佐剂。

在本发明的范围中，术语“无机佐剂”是指基于无机物的佐剂(例如矿物质盐)；术语“合成佐剂”是指基于合成物的佐剂(例如双链多聚核苷酸)；术语“油/乳佐剂”是指基于油或/和乳化物的佐剂(例如弗式佐剂、MF59)；术语“生物佐剂”是指基于生物来源的佐剂(例如微生物、细菌、病毒、它们的佐剂成分(DNA、蛋白质、多肽片断、等等)及其类似物)；术语“微粒佐剂”是指微粒形式的佐剂(例如脂质体微粒佐剂)；术语“分子佐剂”是指微粒形式以外的分子形式的佐剂(例如TLR9激动剂非甲基化胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸-脱氧寡核苷酸(CpG ODN))。

根据本发明的药物组合物，所述疫苗佐剂优选为选自分子量大于5000的大分子佐剂、尺寸大于1nm的微粒佐剂及它们的组合。

根据本发明的药物组合物，所述微粒佐剂包括佐剂微粒和佐剂化微粒。

在本发明的范围中，术语“微粒”是指所有能以局部给药方式进入身体局部(例如病变组织)內的微小粒子，其尺寸在1nm-100μm之间；术语“佐剂微粒”是指起佐剂作用的物质本身具有微粒形式的一类微粒佐剂；术语“佐剂化微粒”是指起佐剂作用的主要物质本身不具有微粒形式但被固定在微粒载体上的一类微粒佐剂。

根据本发明的药物组合物，所述佐剂微粒包括以下组的一种或多种：佐剂固体微粒、佐剂半固体微粒、佐剂脂质微粒。

在根据本发明的药物组合物中，所述佐剂固体微粒可以是包括例如无机佐剂微粒，其中所述无机佐剂微粒可以是包括例如以下组的一种或多种：氢氧化铝微粒、磷酸钙微粒、磷酸铝微粒、硫酸铝微粒等。

在根据本发明的药物组合物中，所述佐剂半固体微粒可以是包括例如生物微粒，其中所述生物微粒可以是包括例如以下组的一种或多种：分枝杆菌、百日咳杆菌、内毒素、细菌提取物、磷脂酶G(PLG)、病毒样颗粒(VLP)等。

在根据本发明的药物组合物中，所述佐剂脂质微粒例如可以是包括例如乳剂微粒，其中所述乳剂微粒可以是包括例如本领域技术人员已知的以下组的一种或多种：MF59、AS02、MPL、QS21、W₈₀5EC、ISA-51、ISA-720等。

根据本发明的药物组合物，所述佐剂化微粒例如可以是包括以下组的一种或多种：固定在微粒载体(例如纳米金刚石)上的细胞因子、独特抗原构架、多肽(例如CpG ODN)、热休克蛋白、白细胞介素等。

根据本发明的药物组合物，所述大分子佐剂包括生物大分子免疫刺激剂，其中所述生物免疫剌激剂包括以下之一种或多种：粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、热休克蛋白。

在根据本发明的药物组合物中，所述疫苗佐剂例如可以是包括由一种以上的多种疫苗佐剂组成的联合疫苗佐剂，其中所述联合疫苗佐剂例如可以是包括以下组:氢氧化铝微粒和CpG ODN、氢氧化铝微粒和MPL、AS04(LPS衍生物、单磷脂酰脂质A和铝佐剂)、AS03(维生素E、角鲨烯和吐温-80)等。

在进一步的实施方案中，根据本发明的药物组合物还可包含止痛剂。所述止痛剂可以是本领域技术人员已知的任意合适者，以减轻患者的疼痛感，例如苯甲醇、盐酸普鲁卡因、三氯叔丁醇、盐酸利多卡等。

本发明的药物组合物的一个优选实施方案，所述局部给药剂型或组织内给药剂型为固体剂型(例如固相植入剂)、半固体剂型(例如半固相植入剂)或液体剂型(例如注射剂)。

在本发明的范围内，术语“峰浓度”是指药物进入病变部位或其体外模型后活性组分于整个存在期内在液相介质中的最高浓度。因此，峰浓度亦可被视作药剂被递送至动物目标部位后活性组分在某一时间的作用强度。尽管具体的作用机理尚待进一步研究，根据本发明的实施例，本发明的组合物中的活性组分在瘤体内是通过外源性或/和内源性液体介质进行输运且至少在一个瞬间其作用强度(峰浓度)必需大于一个临界值，这样才能够对病变形成实现本发明目的所需的攻击。本发明据此提供了规定本发明的组合物的组成的技术方案。

以药剂的物理形态分类，本发明的组合物的剂型包括液体剂型、固体剂型、半固体剂型。

在本发明的一个实施方案中，本发明的组合物为液体剂型，例如溶液剂型或悬浮液剂型，其可以通过例如注射针管进入给药部位(例如瘤内)，然后将组合物药物液体推入给药靶区。因而，所述活体染料的峰浓度可以用其位于针管出口处的浓度，也就是此时其在所述组合物液体中的组成浓度(或给药浓度)来表示。

根据本发明的一个实施方案，所述药物组合物为液体形式的局部给药剂型，其中所述活体染料在该药物组合物中的含量为>2％w/v、优选≥3％w/v。根据本发明的一个优选实施方案，所述活体染料在该药物组合物中的含量为3-12％w/v、4-11％w/v或4-12％w/v，优选为5-10％w/v或6-10％w/v。

根据本发明的液体剂型的药物组合物，如果存在，所述多价金属化合物(例如铁盐或铜盐，尤其是亚铁盐)的浓度为0.02-2％w/v，其优选为0.05-1.5％w/v，更优选为0.1-1.2％w/v或0.1-1.6％w/v。

根据本发明的液体剂型的药物组合物，如果存在，所述其他有效药物的浓度可以为0.1-10％w/v。

根据本发明的液体剂型的药物组合物，如果存在，所述其他低效药物的浓度可以为0.1-15％w/v。在进一步的实施方案中，根据本发明的组合物中所述非甾体抗炎化合物的浓度为1.5-15％w/v、优选3-15％w/v或4-10％w/v。在进一步的实施方案中，根据本发明的组合物中所述喹啉类化合物的浓度为1.5-10％w/v、优选2-10％w/v或3-8％w/v。在进一步的实施方案中，根据本发明的组合物中所述青蒿素衍生物的浓度为1-6％w/v、优选2-5％w/v或3-5％w/v。在进一步的实施方案中，根据本发明的组合物中所述酚类化合物的浓度可以为0.1-10％w/v、优选0.1-8％w/v，其中所述硝基酚化合物的浓度可以为0.1-1％w/v，而所述氨基酚化合物的浓度可以为2-10％w/v。在进一步的实施方案中，根据本发明的组合物中所述生物活性组分的浓度可以为0.1-10％w/v、优选0.25-8％w/v或0.5％-4％。

根据本发明的液体剂型的药物组合物，如果存在，所述所述缓释载体的浓度为0.5-13％w/v、优选为1-12％w/v或1-10％w/v。

根据本发明的液体剂型的药物组合物，如果存在，所述止痛剂的浓度例如可以是0.1-4％(重量)。例如苯甲醇的浓度可以为1-4％，盐酸普鲁卡因、三氯叔丁醇、盐酸利多卡的浓度可以分别为1-3％。

根据本发明的液体剂型的药物组合物，如果存在，免疫佐剂的浓度例如为0.01-5％(重量)。

在本发明的一些实施例中，本发明的组合物为固体剂型或半固体剂型(例如植人剂、药物释放支架、栓剂、霜剂及凝胶剂)。

本发明组合物的固体剂型可以通过本领域内公知的知识制备。例如，将活性组分干粉(活体染料、生物活性成分和疫苗佐剂等)与适量固相赋形剂(例如成胶剂、增粘剂、增容剂等)混合均匀、出料、入模、成型(例如90℃、12小时热成型)、出模、降温，可制备适合于常规植入枪植入的固体剂型。该组合物固体通过植入枪管进入给药部位(例如瘤内)后，可向该部位体液中释放活性组分。

本发明组合物的半固体剂型(例如原位凝胶剂型)可以通过本领域内公知的知识制备。例如，在含活体染料、生物活性成分和疫苗佐剂等的液体中加入适量成胶剂[例如泊洛沙姆(P407/P188)]，便可制得温敏型原位凝胶。组合物液体通过注射针管进入给药部位(例如瘤内)后，将药物液体推入给药部位并形成凝胶。凝胶可向该部位体液中释放活性组分。

本发明的组合物为固体剂型或半固体剂型时，其中的活性组分(活体染料、生物活性成分和疫苗佐剂等)的有放释放是通过其所接触的液体介质(例如体液)来进行的。因此，活性组分的峰浓度可以用其峰溶出浓度来表示。在本发明的范围内，术语“峰溶出浓度”是指该剂型药剂置放于液相介质中时所述活性组分从该剂型药剂的最高溶出浓度；术语“溶出浓度”是指该剂型药剂置放于液相介质中时所述活性组分从该剂型药剂中溶出的局部浓度，计算公式为：

溶出浓度＝(Ws/Vs)×100％

式中，Ws为所述活性组分从该剂型药剂溶出的重量，Vs为所述活性组分溶出Ws所至的液体介质体积。

本发明的组合物主要是通过液体介质接触瘤体内组织从而产生药效的。要达到本发明的目的，本发明的组合物固体剂型或半固体剂型同样要求活性组分至少在一个瞬间在瘤体内的作用强度(峰浓度)大于一个临界值。实际上，从使用液体剂型的实施例所获得的活性组分浓度条件，也可以是其它剂型的活性组分浓度条件。

此外，在根据本发明的药物组合物为固体剂型或半固体剂型时，其中所述活体染料在该药物组合物中的含量能够使该药物组合物在被施用于所述实体肿瘤后提供峰浓度>2％w/v、优选≥3％w/v的所述活体染料。根据本发明的一个优选实施方案，所述活体染料在该药物组合物中的含量能够使该药物组合物在被施用于所述实体肿瘤后提供峰浓度为3-12％w/v、4-11％w/v或4-12％w/v，优选为5-10％w/v或6-10％w/v的活体染料。

根据本发明的固体剂型或半固体剂型的药物组合物，如果存在，所述多价金属化合物(例如铁盐或铜盐，尤其是亚铁盐)含量能够使该药物组合物在被施用于所述实体肿瘤后提供峰浓度为0.02-2％w/v，其优选为0.05-1.5％w/v，更优选为0.1-1.2％w/v或0.1-1.6％w/v的所述金属化合物。

根据本发明的固体剂型或半固体剂型的药物组合物，如果存在，所述其他有效药物的含量能够使该药物组合物在被施用于所述实体肿瘤后提供峰浓度为0.1-10％w/v的其他有效药物。

根据本发明的固体剂型或半固体剂型的药物组合物，如果存在，所述其他低效药物在该药物组合物中的含量能够使该药物组合物在被施用于所述实体肿瘤后提供峰浓度为0.1-15％w/v的其他低效药物。在进一步的实施方案中，根据本发明的组合物中所述非甾体抗炎化合物在该药物组合物中的含量能够使该药物组合物在被施用于所述实体肿瘤后提供峰浓度为1.5-15％w/v、优选3-15％w/v或4-10％w/v的非甾体抗炎化合物。在进一步的实施方案中，根据本发明的组合物中所述喹啉类化合物在该药物组合物中的含量能够使该药物组合物在被施用于所述实体肿瘤后提供峰浓度为1.5-10％w/v、优选2-10％w/v或3-8％w/v的喹啉类化合物。在进一步的实施方案中，根据本发明的组合物中所述青蒿素衍生物在该药物组合物中的含量能够使该药物组合物在被施用于所述实体肿瘤后提供峰浓度为1-6％w/v、优选2-5％w/v或3-5％w/v的青蒿素衍生物。在进一步的实施方案中，根据本发明的组合物中所述酚类化合物在该药物组合物中的含量能够使该药物组合物在被施用于所述实体肿瘤后提供峰浓度为0.1-10％w/v、优选0.1-8％w/v的酚类化合物，其中所述硝基酚化合物在该药物组合物中的含量能够使该药物组合物在被施用于所述实体肿瘤后提供峰浓度为0.1-1％w/v的硝基酚化合物，而所述氨基酚化合物在该药物组合物中的含量能够使该药物组合物在被施用于所述实体肿瘤后提供峰浓度为2-10％w/v的氨基酚化合物。在进一步的实施方案中，根据本发明的组合物中所述生物活性组分在该药物组合物中的含量能够使该药物组合物在被施用于所述实体肿瘤后提供峰浓度为可以为0.1-10％w/v、优选0.25-8％w/v或0.5％-4％的生物活性组分。

根据本发明的固体剂型或半固体剂型的药物组合物，如果存在，所述缓释载体在该药物组合物中的含量能够使该药物组合物在被施用于所述实体肿瘤后提供峰浓度为0.5-13％w/v、优选为1-12％w/v或1-10％w/v的缓释载体。

根据本发明的固体剂型或半固体剂型的药物组合物，如果存在，所述止痛剂的在该药物组合物中的含量能够使该药物组合物在被施用于所述实体肿瘤后提供峰浓度为0.1-4％w/v的止痛剂。

本领域技术人员会理解，根据所需用药方式和浓度参数，可将本发明的组合物制成不同的制剂，例如固体制剂、半固体制剂和液体制剂。更具体而言，本发明的药物组合物的固体制剂可以是舌下片剂、粘贴片、固相植入剂；半固体制剂可以是软膏剂、硬膏剂、糊剂、贴剂、栓剂；液体制剂可以是注射剂、外用溶液剂、洗剂、搽剂、滴剂、以及以下气态制剂的母液：喷雾剂、气雾剂、粉雾剂。

根据本发明的一个实施方案，根据本发明的局部给药液体制剂为乳剂。该乳剂可以是水包油或者油包水型乳剂。所述乳剂的分散介质可以本领域技术人员已知的任意合适者，例如常用于注射目的植物油、合成油或半合成油作为油组。植物油可以是例如棉籽油、杏仁油、橄榄油、蓖麻油、芝麻油、大豆油和花生油。

根据本发明的一个实施方案，根据本发明的局部给药液体制剂为悬浊剂。所述悬浊剂的分散介质可以本领域技术人员已知的任意合适者，例如微米材料或缓释载体。

根据本发明的一个实施方案，根据本发明的局部给药液体制剂为溶液剂。该溶液剂可以是通过将组合物组分溶解在分散介质中而形成的，也可以是单独地将上述组分溶解在分散介质、然后混合而形成的。所述溶液的分散介质包括溶媒，优选在药学上适宜的亲水溶媒。术语“亲水溶媒”是指具有亲水性的溶媒，其包括例如水、水可混溶性有机溶剂、或者包含水和水可混溶性有机溶剂的溶媒系统。

以本发明组合物的液体制剂(例如注射剂)为例，其可按照以下方法来制备。

方法一：如果组合物中所含活体染料、以及任选存在的其他添加剂(例如金属盐、其它抗肿瘤药物、其它增效剂、止痛剂、赋形剂等)的所需浓度均在水溶或水可分散的浓度范围内时，则将这些原料直接加入注射用水即可获得相应的液体制剂。

方法二：如果组合物中所含活体染料、以及任选存在的其他添加剂(例如金属盐、硬化剂、其它抗肿瘤药物、其它增效剂、止痛剂、赋形剂等)的所需浓度有不在水溶或水可分散的浓度范围内时，则将这些原料溶于或分散于所有组合物组分均可在所需浓度下溶解或分散的溶媒(例如含水可混溶有机溶剂的水溶液)中，即可获得相应的液体制剂。

方法三：首先制备(例如通过上述方法)含全部组份的液体，再将其制备(例如通过冻干工艺)为干粉，使用前将该干粉与不含任何组份的溶媒(例如注射用水或含水可混溶有机溶剂的溶媒)混合形成组合物液体制剂。

方法四:首先制备(例如通过上述方法)含部份组份的液体，再将其制备(例如通过冻干工艺)为干粉，使用前将该干粉与含有另外部份组份的液体(例如水溶液或含水可混溶有机溶剂的溶液)混合形成组合物液体制剂。

以本发明组合物的气态制剂(例如喷雾剂)的母液为例，其制备方法可参考上述组合物液体制剂制备方法，通过在上述液体制剂的制备中加入以下一种或多种赋形剂来制备：甘油、聚山梨酯-80、苯扎氯铵、微晶纤维素-羧甲基纤维素钠等。

以本发明组合物的半固体制剂(例如栓剂)为例，其制备方法可参考上述组合物液体制剂制备方法，通过在上述液体制剂的制备中加入以下一种或多种赋形剂来制备：棉籽油、杏仁油、橄榄油、青篙油、薄荷脑、冰片、增溶乳化剂、甘油等。

按上述这些方法的原则，本领域技术人员可以采用任意合适的具体方法制备多种包含本发明组合物的局部给药制剂。例如，本发明的制剂中的变化包括：含不同种类和浓度的碱性活体染料，含不同种类和浓度的金属盐，含不同种类和浓度的其他添加剂(例如其它有效药物、止痛剂、增活剂等)。

根据本发明的一个实施方案，本发明的组合物在局部给药之前，可以为冻干剂的形式，并在使用时复溶。

根据本发明的一个方面，其提供活体染料在制备用于预防和治疗哺乳动物实体肿瘤的药物组合物中的应用，其中碱性活体染料在该药物组合物中的含量能够使该药物组合物在被施用于所述实体肿瘤后提供峰浓度>2％w/v、优选≥3％w/v的所述碱性活体染料。

根据本发明的一个实施方案，在施用于所述实体肿瘤后，所述药物组合物所提供的碱性活体染料的峰浓度为3-12％w/v、4-11％w/v或4-12％w/v，优选为5-10％w/v或6-10％w/v。

根据本发明的再一个方面，其提供一种预防和治疗哺乳动物实体肿瘤的方法，其包括以下步骤：向有此需要的个体局部给药包含碱性活体染料的药物组合物，其中碱性活体染料在该药物组合物中的含量能够使该药物组合物在被施用于所述实体肿瘤后提供峰浓度>2％w/v、优选≥3％w/v的所述碱性活体染料。

根据本发明的一个实施方案，在施用于所述实体肿瘤后，所述药物组合物所提供的碱性活体染料的峰浓度为4-12％w/v、5-11％w/v或5-12％w/v，优选为5-10％w/v或6-10％w/v。

对于根据本发明的应用和方法，上述有关药物组合物之方面的内容也适用他们，包括其制备方法、所含碱性活体染料的种类及其含量、以及赋形剂和诸如以下成分的种类和用量：多价金属化合物、其它抗肿瘤药物、靶向剂、生物活性成分、缓释载体、免疫佐剂和止痛剂。

根据本发明之应用和方法的一个实施方案，所述局部给药包括瘤内给药。

在本发明的范围内，术语“肿瘤”是指实体肿瘤，其包括恶性实体肿瘤和非恶性实体肿瘤。所述恶性肿瘤包括例如乳腺癌、胰腺癌、甲状腺癌、鼻咽癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、肠癌、口腔癌、食道癌、胃癌、喉癌、睾丸癌、阴道癌、子宫癌、卵巢癌等。所述非恶性瘤包括例如乳腺瘤、胰腺瘤、甲状腺瘤、前列腺瘤、肝瘤、肺瘤、肠瘤、口腔瘤、食道瘤、胃瘤、鼻咽瘤、喉瘤、睾丸瘤、阴道瘤、子宫瘤、输卵管瘤、卵巢瘤等。

在本发明的范围中，术语“局部给药”是指主要利用外源方式(例如注射、植入、灌注、喷出、滴入、插入或其他方式)将药物递送至接近或相邻实体肿瘤、与实体肿瘤部位邻近或直接相邻、在实体肿瘤周边或与实体肿瘤接触、或者实体肿瘤内部的身体部位。术语“局部给药剂型”是指可局部给药的剂型。

本发明的组合物以及该组合物的医用制剂还可与其它介入疗法(例如经动脉导管灌注/拴塞)、全身化疗、免疫疗法、光动力疗法、声动力疗法、加热疗法、物理消融法(例如射频、微波、激光、高强度聚焦超声(HIFU)、纳米刀、氩氦刀等消融)、手术干预或此类疗法的组合相组合施用，以进一步提高疗效。

基于在下文中更详细描述的研究，尽管具体机理尚待进一步研究，本发明的组合物显示出促进哺乳动物实体肿瘤所在组织的相关结构(例如病变组织、病变细胞及参与构成它们的任一结构)的更为有效的破坏，从而达到治疗疾病的更好药学效果。

实施例

通过以下具体实施例对本发明作进一步的说明，但不作为对本发明的限制。在以下实施例中，所有的实验均依照相关规定在细胞或实验动物上进行。如无特殊说明，所有实验均按常规方法进行。

以下具体实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中所用的部分试剂列于表1中。

表1

此外，以下生物提取物由西安瑞林生物科技有限公司提供:虫草多糖、猪苓多糖、猴头茹多糖、海藻硒多糖、香菇硒多糖、螺旋藻多糖、复合真菌多糖、三七总皂苷(纯度>80％)、人参提取物(人参总皂苷含量≥80％)、茶多酚(纯度>98％)、苹果多酚(纯度>98％)、蜂胶黄酮(纯度>98％)、葛根黄酮(纯度>98％)、枳实黄酮(纯度>98％)等等。

在以下实施例中，受试肿瘤细胞包括：人肝癌细胞(HepG2)、人乳腺癌细胞(MDA-MB231)、人肺癌细胞(A549)、人甲状腺癌细胞(SW579)、人前列腺癌细胞(LNCaP/AR)、人胰腺癌细胞(PANC-1)、人结肠癌细胞(COLO205)、人头颈癌细胞(Fμda)、人鼻咽癌细胞(CNE1)、人胃癌细胞(BGC823)、卵巢癌(PA1)、皮肤癌细胞(A341)等。本发明的实施例的研究方法和结果也适用于其它肿瘤细胞。

在以下实施例中，除非另有说明，皮下移植瘤动物试验按药管当局颁发的试验指南进行。动物为6～8周龄、体重17.5-20.5g的雌性裸鼠(BALB/C-Nμde)。将上述受试肿瘤细胞皮下接种于裸鼠，待肿瘤长至所需体积(例如70-100mm3左右)，采用PEMS 3.2软件(四川大学华西公共卫生学院编制)随机区组为阴性对照组、阳性对照组和若干个研究组，每组8只裸鼠。

分组当日开始给药。试验设阴性对照组、阳性对照组和若干个研究组，分别加入阴性对照物、阳性对照物和若干个研究药物。阴性对照物为组合物溶媒，其给药方式和体积均与研究组相同。阳性对照物选自上述现有抗瘤药物，其给药方式为腹腔注射给药，其日给药剂量均按所选药物的惯例进行(例如5-氟尿嘧啶25mg/kg)。除另有说明，研究组均为瘤区注射研究药物，注射量由剂量和浓度确定。试验观察、测量和分析的项目，包括一般状态、体重、摄食量、肿瘤体积、瘤重等。

肿瘤生长抑制率(本发明中简记为抑瘤率)计算公式如下：

抑瘤率(％)＝(TW-CW)/CW×100％，其中TW为阳性对照组或研究组的平均瘤重；CW为阴性对照组的平均瘤重。

研究组的基于抑瘤率的药效评价标准为：抑瘤率<40％为无效活性，抑瘤率≥40％(但是<70％)并经方差分析与阴性对照组相比P<0.05为有效活性，抑瘤率≥70％并经方差分析与阴性对照组相比P<0.05为超有效活性。

在以下实施例中，实验均采用重复测量方差分析(Repeated Measμres ANOVA)分别对指标均数的组别差异进行统计学检验。组别差异有统计学意义时(P≤0.05)，采用最小显著差异法对各组与阴性对照组间差异进行比较。定量指标采用均数±标准误(X±SEM)描述。当LEVENE方差齐性检验提示方差不齐时(P≤0.05)，采用Mann-WhitneyΜ秩和检验(M-W法)比较组间差异。所有的统计分析，均在SPSS for Windows 13.0软件下完成。

实施例1：组合物的制备

1、液体制剂的制备

使用前述制备方法，本实施例制备的部分本发明的药物组合物溶液的组成列于表2。其中的赋形剂包括溶媒，除另有说明，溶媒均含注射用水。

表2

*:含65％醇类溶剂，其中乙醇、PEG300和丙二醇的浓度可以分别是25％、20％和20％。

具体而言，例如，以最终10ml组合物溶液体积计，在室温下，按照表2所示的量量取相应的碱性活体染料干粉以及任选存在的其他组分(如水杨酸类化合物)的干粉加入8ml适当溶媒(如含醇类溶剂的溶媒)溶解，再加入其它液态添加剂(例如苯甲醇，0.2ml)和溶媒使总体积达到10ml，混合均匀后分装为2ml/瓶备用，制得组合物溶液。

2、冻干制剂的制备

上述液体制剂(例如表2)可进一步制成冻干制剂。具体而言，例如，称取3g亚甲蓝加入60ml注射用水中溶解，形成5％亚甲蓝溶液，经0.22μm微孔膜过滤，再以每支2ml的液装量灌装在7ml容量小瓶中，再经冷冻干燥、压塞和轧盖，即得到注射用亚甲蓝冻干粉针制剂。

上述冷冻干燥的优选工艺条件如下。预冻条件：在预冻温度-45℃下保持4小时，样品溶液完全冻实。升华干燥条件：升华干燥阶段的升温速率为0.1℃/分钟、且升至-15℃时至少保持10小时，水分基本升华完全，且无喷瓶现象发生。解吸附干燥条件：在解吸附干燥阶段，于30℃保持6小时，将样品水分控制在3％以下。

上述亚甲蓝冻干粉针制剂的外观均为类白色疏松块状物，其在室温下以注射用水复溶至2ml时溶解性均小于20秒，复溶后亚甲蓝含量(固装量)按照中国药典(2005年版)二部亚甲蓝质量标准含量测定项下方法测定为液装含量的97-103％之间，其他各项指标也均符合冻干制剂的相关规定。

总之，本发明的组合物的制备，既可以将碱性活体染料单独(例如表2中的1-7)制成冻干制剂、临用前再与注射用水或含其它组分的溶液(例如表2中所示的其它组分的溶液、或其它抗肿瘤药物注射液)混合溶解制成，也可以将碱性活体染料与其它组分(例如表2中的8-10)制成冻干制剂、临用前再与注射用水混合溶解制成，还可以将碱性活体染料与部分其它组分制成冻干制剂、临用前再与含剩余的其它组分的溶液(例如表2中的其它组分的溶液、或其它抗肿瘤药物注射液)混合溶解制成。

3、固体剂型的制备

按照表2中的相对量量取组合物活性组分，例如500mg亚甲蓝，将其加入成胶剂(例如500mg羧甲基纤维素钠)、增粘剂(例如500mg聚乙烯醇)、增容剂(例如5000mg葡萄糖等)中，然后加入定容至10ml的注射用水，混合均匀制成可成型的软材，再通过小型成型机挤压成型为直径≤1mm的线材，加温干燥，称重然后切割为长度≤5mm的固相植入条。该固相植入条可通过临床常用的I¹²⁵粒子植入枪植入动物体内。

将5条固相植入条放入含100μl生理盐水容器(模仿荷瘤裸鼠实验中瘤体体积100mm³)内并适度摇动，15分钟之后从残存条之外的溶液中取样，按常规方法(例如分光光度计比色法)测定亚甲蓝浓度(平均溶出浓度)。根据亚甲蓝浓度及其与其它活性组分的相对量，可计算出其它活性组分的平均溶出浓度。平均溶出浓度必然小于或等于峰溶出浓度。

通过调整组合物活性组分和成胶剂用量的量比，可获得所需要的峰溶出浓度。在本实施例中，当固相植入条中亚甲蓝组成≥7％(w/v)、羧甲基纤维素钠组成≤5％(w/v)、聚乙烯醇组成<8％(w/v)，所获得的固相组合物中亚甲蓝的平均溶出浓度经测定≥2％(w/v)。

实施例2：超有效活性技术方案研究

在本发明的范围内，术语“活性”是指物质的显示出一定治疗作用的性质，术语“有效活性”是指物质具有的与现有临床药物相当的治疗作用的性质，术语“超有效活性”是指物质与现有临床药物相比具有明显更高的治疗作用的性质。现有抗肿瘤临床化疗药物均显示出有效抑瘤活性。在动物实验中，通常以抑瘤率达到40％及以上为有效抑瘤活性。

在本发明的范围内，术语“活性条件”、“有效活性条件”和“超有效活性条件”分别指研究者提供的使物质显示出活性、有效活性和超有效活性的条件。

1、体外活性比较研究

本实验选用人肝癌细胞株(HepG2)，设阴性对照组(阴性对照物为生理盐水)和药物组，使用CCK8比色法测定药物的肿瘤细胞抑制活性。测试溶液均为侍测药物给定浓度的水溶液，实验条件和步骤按cck-8试剂盒(日本同仁化学)的说明书进行。比色选择490nm波长在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值(A₄₉₀)，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。按下式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率：

肿瘤细胞生长抑制率(IR)＝(1-药物组A₄₉₀/对照组A₄₉₀)X100％。

以同一试验物不同浓度对肿瘤细胞抑制率作图，可得到剂量-效应曲线，然后采用Logit法计算出半数有效浓度(简记为IC50值)。本发明中，半数有效浓度(IC50)即实验中细胞存活率减少50％时的药物浓度。

在一个试验中，设阴性对照组、研究组和临床药物对照组。各组试验物如下：阴性对照组为生理盐水，研究组为亚甲蓝、临床药物对照组为5-氟尿嘧啶。亚甲兰和5-氟尿嘧啶的IC50分别为2.8μg/ml和2.5μg/ml，显示出相同的肿瘤细胞抑制活性。2、体内活性比较研究

在一个针对荷肝癌细胞裸鼠(瘤体95-135mm³)的动物实验中，成功建模的试验动物随机分组为腹腔注射系列和瘤体注射系列。腹腔注射系列包括阴性对照组、2个亚甲蓝组(A、B组)和2个5-氟尿嘧啶组(C、D组)，瘤体注射系列也包括阴性对照组、2个亚甲蓝组(E、F组)及2个5-氟尿嘧啶组(G、H组)。阴性对照组注射生理盐水，A、E组注射1％亚甲蓝水溶液，B、F组注射浓度2％亚甲蓝水溶液，C、G组注射1％5-氟尿嘧啶，D、H组注射2％5-氟尿嘧啶。研究药物均为按实施例1的制备方法配置，用药剂量均为100mg/kg。用药结束后7日，对动物进行安乐死，解剖后测定抑瘤率。图1给出结果。

图1中，对5-氟尿嘧啶而言，无论是浓度倍增(C、D组比较；G、H组比较)还是给药方式改变(C、G组比较；D、H组比较)，各组之间的抑瘤率区别没有统计学意义(P>0.05)。5-氟尿嘧啶显示出常规抗瘤化疗剂的特性：药效主要取决于剂量而非浓度、亦非给药方式。尤其是在瘤区用药时，其在有效浓度之上的更高浓度(D、H组比较)的抑瘤率区别没有统计学意义(P>0.05)。这与现有抗瘤化疗剂在临床上都很少用于瘤体注射的现实相符。

按照常规抗瘤化疗剂的通常用药方式(例如腹腔注射)时，不仅亚甲蓝浓度倍增(A、B组比较)之间的抑瘤率区别没有统计学意义(P>0.05)，而且其所显示的活性均为无效活性(抑瘤率小于40％)。这合乎某些现有技术的教导，也与亚甲蓝并未被用作抗实体瘤临床药物的现实相符。

出乎意料的是，与5-氟尿嘧啶明显不同，相同浓度的亚甲蓝腹腔注射组与瘤内注射组之间(A、E组比较；B、F组比较)的抑瘤率区别有统计学意义(P<0.05)。而且在瘤内注射系列中，不同浓度组(E、F组比较)的抑瘤率区别也有统计学意义(P<0.05)。这个不同于临床对照药物的结果，使得亚甲蓝第一次有可能成一个有效、甚至超有效抗肿瘤药物。

3、瘤内注射多因素研究

在一个针对荷肝癌细胞裸鼠的实验中，研究了抑瘤率与多个因素(亚甲蓝剂量、亚甲蓝浓度、瘤体体积)的关系，以获得超有效活性条件。成功建模的试验动物随机分组为小瘤体(瘤体体积95-165mm³)糸列和大瘤体(瘤体体积234-305mm³)糸列。研究药物均为按实施例一的方法制备的亚甲蓝水溶液。小瘤体系列5个组(a、b、c、d、e、f组)和大瘤体系列5个组(A、B、C、D、E、F组)分别瘤内注射5个不同浓度(0.5％、1％、1.5％、2％、3％、4％)亚甲蓝水溶液，注射剂量均为100mg亚甲蓝/kg动物；两系列还各有3个组(分别为g、h、i组和G、H、I组)瘤内分别注射1％、3％、4％亚甲蓝水溶液，注射剂量均为150mg亚甲蓝/kg动物。阴性对照组瘤内注射100μl生理盐水。用药结束后3日，对动物进行安乐死，解剖后测定抑瘤率。图2给出结果。出乎意料的是，图2显示出3个性质很不相同的区间。

(1)亚甲蓝浓度≤1％：在相同亚甲蓝剂量时(100mg/kg)，无论是亚甲蓝浓度倍增(a、b组比较；A、B组比较)还是瘤体体积倍增(a、A组比较；b、B组比较)，各组之间的抑瘤率区别没有统计学意义(P>0.05)。而在相同亚甲蓝浓度(1％)时，不同亚甲蓝剂量各组(b、g组比较；B、G组比较)之间的抑瘤率区别有统计学意义(P<0.05)。该区间合乎现有技术的教导：疗效主要由剂量确定。

(2)亚甲蓝浓度1.5-3％：在相同亚甲蓝剂量时(100mg/kg)，大、小瘤体系列中不同亚甲蓝浓度组(c、d、e组比较；C、D、E组比较)之间的抑瘤率区别有统计学意义(P<0.05)。在相同亚甲蓝浓度(3％)时，小瘤体糸列中不同亚甲蓝剂量组(e、h组比较)的抑瘤率区别没有统计学意义(P>0.05)，而大瘤体糸列中不同亚甲蓝剂量组(E、H组比较)的抑瘤率区别有统计学意义(P<0.05)。在该区间上，疗效由瘤体体积、亚甲蓝浓度与剂量共同确定。

(3)亚甲蓝浓度>3％：在相同亚甲蓝浓度(4％)时，不同亚甲蓝剂量(f、i组比较；F、I组比较)、不同瘤体体积(f、F组比较；i、I组比较)的抑瘤率区别没有统计学意义(P>0.05)。与先前试验中5-氟尿嘧啶的表现相比，亚甲蓝在此区间犹为异乎寻常：该超有效活性由亚甲蓝浓度决定，而不是由剂量和瘤体体积决定。

4、技术方案的进一步研究

在一个针对荷肝癌细胞裸鼠(瘤体平均体积254mm³)的动物实验中，动物分为经口给药、腹腔注射、瘤周注射和瘤内注射4个系列(分别记为系列A、B、C、D)。每个系列分设阴性对照组和2个研究组(分别记为组1和组2)。阴性对照物为生理盐水。各系列中的2个研究组(分别记为A1、B1、C1、D1组和A2、B2、C2、D2组)的研究药物分别为2％和4％亚甲蓝水溶液，用药剂量均为100mg亚甲蓝/kg动物。用药后7日，对动物进行安乐死，解剖后测定抑瘤率。图3给出结果。

图3中，经口给药、腹腔注射和瘤周注射各组均观察不到有效活性(抑瘤率<40％)，而且不同亚甲蓝浓度组(A1、A2组比较；B1、B2组比较；C1、C2组比较)之间的抑瘤率区别没有统计学意义(P>0.05)。尽管其中的瘤周注射可以使亚甲蓝直接与瘤体接接触，也是一种局部给药，却只有瘤内注射显示出有效活性(抑瘤率>40％)。且瘤内注射不同亚甲蓝浓度组(D1、D2组)的抑瘤率的区别有统计学意义(P<0.05)。尽管原因不详，亚甲蓝显示出不同寻常的药学行为:当且仅当瘤内注射与超高浓度共用才产生超有效活性。

5、超有效活性条件的安全性研究

在上述动物实验期间，亚甲蓝研究组与5-氟尿嘧啶对照组相比较，一般状况类似，均未见裸鼠死亡，但5-氟尿嘧啶对照组的平均体重下降更大(大于20％)。与阴性对照组相比较，亚甲蓝研究组中、尤其是高浓度亚甲蓝(1-3％)和超高浓度亚甲蓝(>3％)组中注射部位均有明显的色泽变化、甚至伴有肌肉变性。这提示该应用条件确实引起了肌细胞的部分损伤，注射部位有炎性细胞浸润，似乎证实了现有技术对于高浓度亚甲蓝的局部应用安全性的担心。通常认为，1％亚甲蓝注射液以经不能用作局部注射，否则有安全性风险。在将其作局部给药时，均应尽可能稀释处理(吴伟标，不同浓度亚甲蓝在肛肠术后镇痛中的效果比较，北方药学2016年第13卷第10期，pp190-191)。然而，进一步的动物实验结果却出人意料。

取体重1.9～2.5kg新西兰兔，分为阴性对照组、5个临床药物(乙醇)对照组和5个亚甲蓝研究组，每组6只动物。阴性对照物为生理盐水，临床药物对照物分别为浓度12％、25％、50％、、70％、95％的乙醇水溶液，研究药物分别为浓度1％、2％、4％、6％和10％的亚甲蓝水溶液。各组动物在右腿股四头肌注入1.0ml药物。24h后各组处死4只兔子，进行注射部位的病理切片检查，观察有无充血、水肿、变性、坏死等刺激现象。刺激反应评分标准：阴性记0分；可疑1分；轻度2分；强度3分；严重4分；极严重5分。局部刺激试验结果见表3。

表3

在表3中，临床药物对照组的局部刺激试验结果合乎通常的浓度-毒性关系，各组的刺激反应评分总分随乙醇浓度增加而增加。出乎意料的是，在整个试验区间内，亚甲蓝各组的刺激反应评分总分并未随浓度变化而明显变化。

对各组剩下的4只动物继续观察，4周后各组处死剩下的兔子，纵向切开注射部位肌肉，观察注射部位。可见临床药物对照组及亚甲蓝各组黏膜及浅肌层被弥漫增生的纤维结缔组织取代，组织已基本再生愈合，细胞密集呈梭形，呈束状排列。在整个试验区间内，亚甲蓝组的再生愈合并未随浓度变化而明显变化，其所产生的组织损伤均是可同等修复的。

在其它荷瘤动物试验、以及使用本发明的其它类似组合物(例如含专利蓝或异硫蓝的组合物)实验时，也可以观察到与上述类似的有效性和安全性结果。

实施例3：协同增效技术方案研究

在一个针对荷肝癌细胞裸鼠的实验中，成功建模的试验动物(瘤体体积212-285mm³)随机分组为阴性对照组和9个研究组(A、B、C、D、E、F、G、H、I组)。阴性对照物为生理盐水，9个研究药物分别为3％亚甲蓝、3％二盐酸奎宁、3％亚甲蓝/2％二盐酸奎宁、0.5％氯化亚铁、3％亚甲蓝/0.5％氯化亚铁、1％纳米金刚石、3％亚甲蓝/1％纳米金刚石、0.5％螺旋藻多糖、3％亚甲/0.5％螺旋藻多糖。

阴性对照组和研究组均为瘤内注射，研究组注射剂量均为80mg亚甲蓝/kg动物。用药后7日，对动物进行安乐死，解剖后测定抑瘤率。图4给出结果，其中各比较研究组之间(A、B、C组比较；A、D、E组比较；A、F、G组比较；A、H、I组比较)的抑瘤率区别有统计学意义(P<0.05)。

利用专利蓝进行的类似研究，也有类似结果。利用表2中制备的活体染料/多价金属盐组合物、活体染料/其它抗肿瘤物质组合物、活体染料/靶向剂组合物、活体染料/缓释载体组合物、活体染料/生物活性成分组合物进行的类似研究，也有类似结果。

实施例4：应用于肿瘤的预防与治疗

针对多种荷癌细胞裸鼠(癌细胞如前所述，瘤体184-245mm3)的动物实验中，成功建模的试验动物随机分组。阴性对照组(A组)和亚甲蓝组(B组)分别瘤内注射生理盐水和4％专利蓝水溶液(按实施例一的制备方法配置，专利蓝用药剂量均为150mg/kg)。用药结束后7日，对动物进行安乐死，解剖后测定抑瘤率。结果如表4所示。

表4

此外，我们还研究了在本发明的组合物用于抗不同发育的肿瘤，实验方法如下。将裸鼠分为先接种鼠群和后接种鼠群。先接种鼠群先于后接种鼠群7天接种人肝癌细胞。在后接种鼠群接种后7天，进行裸鼠分组(每组8只)。先接种鼠群(瘤体体积138-215mm³)分为阴性对照组(A组)和研究组(B组)，后接种鼠群(瘤体体积50-100mm³)也分为阴性对照组(C组)和研究组(D组)。阴性对照物为生理盐水，研究药物为5％亚甲蓝水溶液，A、B组瘤内注射给药100μl，C、D组瘤内注射给药50μl。用药结束后7日，对动物进行安乐死，解剖后测定抑瘤率。

本实施例中，D组和B组的抑瘤率分别为91％和83％。本发明的组合物不仅可应用于恶性肿瘤治疗，甚至于可用于完全去除有一定致癌风险的肿瘤，以防止其发展为恶性肿瘤。

在使用实施1制备的其它组合物(例如表2中的其它组合物)时，也可以观察到与上述两个实验类似的结果。

Claims (10)

1.一种用于预防和治疗哺乳动物实体肿瘤的药物组合物，其包含活体染料和任选存在的一种或多种可药用赋形剂，且其组成使得该药物组合物在被施用于所述实体肿瘤后能够提供峰浓度>2％w/v、优选≥3％w/v的所述活体染料。

2.根据权利要求1的药物组合物，其中所述活体染料的峰浓度为3-12％w/v、4-11％w/v或4-12％w/v，优选为5-10％w/v或6-10％w/v。

3.根据权利要求1的药物组合物，其中所述活体染料包括碱性活体染料，其中所述碱性活体染料为选自以下组中的一种或多种：亚甲蓝、专利蓝、异硫蓝、甲苯胺蓝、台盼蓝、碱性蓝及其衍生物；优选为选自以下组中的一种或多种：亚甲蓝、专利蓝、异硫蓝及其衍生物。

4.根据权利要求1-3之一的药物组合物，其中所述药物组合物还可以包含用以增强药效的多价金属盐，所述多价金属盐可以为选自以下之一种或多种的金属盐：铁盐、铜盐、锌盐、锰盐、铝盐，优选为铁盐和铜盐，更优选为选自以下之一种或多种的亚铁盐：二氯化铁、硫酸亚铁、琥珀酸亚铁、富马酸亚铁、葡萄糖酸亚铁、乳酸亚铁。

5.根据权利要求1-3之一的药物组合物，其中所所述金属盐在所述药物组合物中的含量能够使该药物组合物在施用于所述实体肿瘤后提供峰浓度为0.02-2％w/v，优选为0.05-1.5％w/v，更优选为0.1-1.2％w/v或0.1-1.6％w/v的金属盐。

6.根据权利要求1-5之一的药物组合物，其还可以包含用以增强药效的其它抗肿瘤药物，所述其它抗肿瘤药物包括有效抗肿瘤药物和低效抗肿瘤药物，其中所述低效抗肿瘤药物可以是选自以下组中之一种或多种：非甾体抗炎化合物、喹啉类化合物、青蒿素衍生物、酚类化合物。

7.根据权利要求1-6之一的药物组合物，其还可以包含用以增强药效的生物活性成分，其中所述生物活性成分为选自具有以下之一种或多种结构的活性生物提取物及其类似物：苷、多酚、多糖、萜类、黄酮。

8.根据权利要求1-7之一的药物组合物，其中所述药物组合物还包含用以增强药效的缓释载体，所述缓释载体包括凝胶基质、微粒载体、胶束基质，所述微粒载体可以是选自以下组中的一种或多种：氢氧化铝微粒、磷酸钙微粒、磷酸铝微粒、硫酸铝微粒、纳米碳粒子、碳纳米管、富勒烯、纳米金刚石、纳米碳点。

9.根据权利要求1-8之一的药物组合物，其中所述药物组合物还包含疫苗佐剂，所述疫苗佐剂包括无机佐剂、合成佐剂、油/乳佐剂、生物佐剂。

10.活体染料在制备用于预防和治疗哺乳动物实体肿瘤的药物组合物中的应用，其中所述活体染料在该药物组合物中的含量能够使该药物组合物在被施用于所述实体肿瘤后能够提供峰浓度>2％w/v、优选≥3％w/v的所述活体染料。