CN108685927A - 包含亚甲蓝类化合物和生物活性成分的药物组合物及其用途 - Google Patents

Abstract

本项发明涉及一种包含亚甲蓝类化合物和生物活性成分药物组合物、以及该组合物在制备用于预防和治疗哺乳动物局部病变相关疾病的药物中的用途。

Description

包含亚甲蓝类化合物和生物活性成分的药物组合物及其用途

技术领域

本项发明涉及一种包含亚甲蓝类化合物和生物活性成分药物组合物、该组合物在制备用于预防和治疗哺乳动物局部病变相关疾病的药物中的用途、以及用其预防和治疗哺乳动物之局部病变相关疾病的方法。

背景技术

针对哺乳动物局部病变相关疾病、尤其是顽固性疾病，例如恶性肿瘤、顽固性炎症、顽固性微生物感染、顽固性皮肤病等的治疗，仍旧主要依赖于诸如外科手术、化学疗法和放射疗法。

经典化学疗法通常是通过提供针对局部病变病原体的特异性有效化学药物来进行。经典化疗药物(例如细胞毒性药物)主要是经血管输运至病变部位进攻病原体(例如病变细胞)，从而产生药学效应。以肿瘤治疗为例，经典抗肿瘤药物(例如5-氟尿嘧啶)可以通过多种给药方式(通常是全身给药方式)攻击肿瘤细胞而产生药效。然而，对于局部病变相关疾病、尤其是顽固性疾病，这种治疗的现有技术被认为疗效很有限、全身性副作用很大。

1955年出现了一种被称作化学消融的治疗方法。研究者把无水乙醇注射到脑部病变组织以治疗帕金森病，并称其为“化学刀(chemical knife)”。不同于经典化疗药，化学消融剂通常在全身给药时作用不大，而在局部给药、尤其是组织内给药时能够有效作用。化学消融剂直接介入病变组织，使该组织出现坏死,其中的相关结构得到有效破坏，从而获得抑制甚至消灭病变的效果。目前临床上常用的化学消融剂主要是蛋白凝固剂，其典型代表为无水乙醇。此外，还有局部破坏性更高的乙酸、盐酸、硫酸、氧氧化钠等。

临床治疗试验表明，化学消融已成功地应用于需要消除局部病变组织的若干疾病，例如肿瘤、囊肿、结节、异常静脉团(例如痔疮等)、局部炎症、微生物感染发肿、梗阻等。以肿瘤为例，经皮瘤内注射无水乙醇(或乙酸)的化学消融法具有定位准、创伤小、痛苦轻、疗效确切等优点，已成功应用于原发性肝癌、肾上腺肿瘤及转移性淋巴结等的治疗。

然而，现有的化学消融疗法也存在很大的局限性。首先，上述化学消融剂在肿瘤组织学特征(非均质性)下有效浓度能够达到的区间受限。其次，化学消融剂的组织破坏性没有多少特异性，使得难以避免的药物溢出可能损害正常组织、或/和造成患者剧烈疼痛，从而使得实际能应用的消融剂量受限。现有技术的这些缺陷，使得化学消融疗法的疗效有限。例如，无水乙醇在针对直径大于5cm的肝肿瘤时，显示出的疗效仍然非常之低。

发明内容

根据本发明的一个方面，其提供一种用于预防和治疗哺乳动物局部病变相关疾病的药物组合物，其包含药学上可接受的亚甲蓝类化合物和生物活性成分，且其组成使得当该药物组合物被施用在所述局部病变后能够提供峰浓度>1％(w/v)、优选≥2％(w/v)的亚甲蓝类化合物，以及峰浓度>0.25％(w/v)、优选≥0.50％(w/v)的生物活性成分。

根据本发明的一个实施方案，根据本发明的药物组合物所提供的亚甲蓝类化合物的峰浓度为1.5-15％(w/v)，优选为2-10％(w/v)或3-10％(w/v)。

根据本发明的一个实施方案，根据本发明的药物组合物所提供的生物活性成分的峰浓度为0.3-15％(w/v)，优选为0.5-10％(w/v)，更优选为1-6％(w/v)或1-4％(w/v)。

根据本发明的药物组合物可以为液体剂型，例如溶液剂、混悬剂或乳剂，也可以是固体或半固体剂型，例如植入剂、药物释放支架、栓剂、霜剂、乳膏剂或凝胶剂。

在根据本发明的药物组合物中，所述生物活性成分为选自具有以下之一种或多种结构的活性生物提取物及其类似物：苷、多酚、多糖、萜类、黄酮和生物碱。所述生物活性成分可以为具有以下性质的活性成分：常温下在水中的均匀分散度大于5mg/ml、优选为大于10mg/ml。

在根据本发明的药物组合物中，所述生物活性成分包括以下生物提取物及其类似物的一种或多种：褐藻多糖硫酸脂酯、螺旋藻多糖、海藻硒多糖、人参多糖、党参多糖、黄茋多糖、香菇多糖、香菇硒多糖、茯苓多糖、猪苓多糖、灵芝多糖、云芝多糖、人参皂苷、三七总皂苷、虎杖皂苷、海参总皂苷、茶多酚、葛根黄酮、蜂胶黄酮。

在根据本发明的药物组合物中，所述生物活性成分和亚甲蓝类化合物的重量比为1:8-6:1、优选为1:4-4:1、更优选为大于1:4至小于4:1或大于1:4至小于2:1。

根据本发明的另一个方面，其提供根据本发明的药物组合物在制备用于预防和治疗哺乳动物局部病变相关疾病的药物中的应用。

根据本发明的再一个方面，其提供一种预防和治疗哺乳动物局部病变相关疾病的方法，其包括向所述局部病变或其所在的组织内给药根据本发明的药物组合物。

根据本发明的药物组合物与经典化学消融剂相比，显示出明显更低的局部刺激性和更高疗效；与亚甲蓝类化合物单药相比，显示出可以使用较低浓度的亚甲蓝类化合物即可获得超乎寻常的超髙有效活性；与经典细胞毒性药物相比，显示出更低毒性、更高疗效。更进一步，根据本发明的组合物制备方便、成本便宜，特别有助于使难以承受高额费用的广大人群也享受到有效治疗。

以下将参考附图对本发明进行更为详细的说明。

附图说明

图1给出以荷肝癌细胞裸鼠为模型的实验结果，显示4个亚甲蓝/螺旋藻多糖组(A1、B1组和A2、B2组)和4个亚甲蓝/5-氟尿嘧啶组(C1、D1组和C2、D2组)(X轴)的抑瘤率(Y轴)。

图2给出以荷肝癌细胞裸鼠为模型的实验结果，显示不同给药方式时，各研究组(X轴)的抑瘤率(Y轴)。

图3给出以荷肝癌细胞裸鼠为模型的实验结果，显示当人参多糖浓度固定为1％时，其与不同浓度亚甲蓝(X轴)的组合物的抑瘤率(Y轴)。

图4给出当亚甲蓝浓度固定为1％时，其与不同浓度三七总皂苷(X轴)的组合物的抑瘤率(Y轴)。

具体实施方式

本发明的发明人通过大量的实验，摸索并优化了多种实验条件，制备了一种用于预防和治疗哺乳动物中局部病变相关疾病、尤其是顽固性疾病的药物组合物，其包含药学上可接受的亚甲蓝类化合物和生物活性成分，且所述亚甲蓝类化合物和生物活性成分包含在同一个局部给药剂型中。

根据本发明的一个方面，其提供一种用于预防和治疗哺乳动物局部病变相关疾病的药物组合物，其包含药学上可接受的亚甲蓝类化合物和生物活性成分，且其组成使得当该药物组合物被施用在所述局部病变后能够提供峰浓度>1％(w/v)的亚甲蓝类化合物，以及峰浓度>0.25％(w/v)的生物活性成分。

根据本发明的一个实施方案，根据本发明的药物组合物所提供的亚甲蓝类化合物的峰浓度为1.5-15％(w/v)，优选为2-10％(w/v)或3-10％(w/v)。

根据本发明的一个实施方案，根据本发明的药物组合物所提供的生物活性成分的峰浓度为0.3-15％(w/v)，优选为0.5-10％(w/v)，更优选为1-6％(w/v)或1-4％(w/v)。

根据本发明的一个实施方案，所述亚甲蓝类化合物和生物活性成分包含在同一个局部给药剂型中。

在本发明的范围中，术语“组合物”是指包括包含指定量的各指定组分的产品，以及直接或间接从指定量的各指定组分的组合产生的任何产品(例如化合物、复合物)。根据本发明，所述的“组合物”与“药物组合物”可以互换使用。本发明的组合物，在以下叙述中也被简写为组分1/组分2、或组分1/组分2/组分3。

在本发明中，以％(v/w)表示重量/体积百分比浓度，以％(v/v)表示体积/体积百分比浓度。组合物中各组分的浓度，也可以被冠在组分之前。例如4％亚甲蓝/2％褐藻多糖硫酸酯是指亚甲蓝和褐藻多糖硫酸酯的一个组合物，其中亚甲蓝的浓度为4％(w/v)，褐藻多糖硫酸酯的浓度为2％(w/v)。其它多组分组合物的简写方式以此类推。

在本发明的范围中，术语“局部给药”是指主要利用外源方式(例如注射、植入、灌注、喷出、滴入、插入或其他方式)将药物递送至接近或相邻局部病变、与局部病变部位邻近或直接相邻、在局部病变周边或与局部病变接触、或者局部病变内部的身体部位。术语“局部给药剂型”是指可局部给药的剂型。

本发明的药物组合物包含药学上可接受的亚甲蓝类化合物和生物活性成分。在本发明的范围中，术语“亚甲蓝类化合物”是指亚甲蓝(C₁₆H₁₈ClN₃S·3H₂O或C₁₆H₁₈ClN₃S)及其类似物。在本发明的范围中，术语“类似物”是指虽不相同、但结构或/和性质上相似的物质，这些物质可以是天然产物、衍生物、半合成物、或合成物。亚甲蓝类似物包括例如有化学消融功能的亚甲蓝衍生物。亚甲蓝衍生物包括例如以亚甲蓝为先导物设计或合成的吩噻嗪类化合物(例如新亚甲蓝、1,9-二甲基亚甲蓝、1-甲基亚甲蓝等)。

在本发明的范围中，术语“生物活性成分”是指具有药学活性的生物提取物及其类似物。术语“活性”是指针对所述局部病变相关疾病能够产生治疗作用的药理学性质。术语“生物提取物”是指以生物材料为原料、通过分离过程及其它加工过程获取的特定组分(例如基于特定结构的皂苷纯化物、多酚纯化物、多糖纯化物、萜类纯化物、黄酮纯化物、生物碱纯化物)，术语“生物”包括动物、植物、微生物等。例如，褐藻提取物包括褐藻素(岩藻黄质)、褐藻硫酸多糖、褐藻多糖硫酸脂酯、褐藻糖胶等。在本发明的范围中，术语“生物提取物类似物”是指与生物提取物虽不相同、但结构或/和性质上相似的天然产物、衍生物、半合成物、或合成物。例如，多糖衍生物保留了相应天然多糖的所需生物学活性，但是相对于天然多糖又具有增强所需活性的某些生化修饰，包括例如引入功能团(例如硫酸化多糖)、金属螯合等处理的多糖提取物。

生物活性成分被报道具有多种生物活性，例如免疫调节、抗病毒、抗肿瘤、抗凝血、抗氧化等生物活性。目前，这些生物活性成分广泛应用于保健品的制备，个别也被应用作辅助治疗剂。尽管生物活性成分的构效关系尚不清楚，然而其在本发明的组合物中却起着不可或缺的重要药学作用。

根据本发明的药物组合物的一个优选实施方案，所述生物活性成分和亚甲蓝类化合物包含在组织内给药剂型中。在本发明的范围中，术语“组织内给药”是指主要利用外源方式(例如注射、植入、灌注、插入或其他方式)将药物递送至局部病变组织内、或局部病变所在组织内，术语“组织内给药剂型”是指可组织内给药的剂型。

本发明的药物组合物的一个优选实施方案，所述局部给药剂型或组织内给药剂型为固体剂型(例如固相植入剂)、半固体剂型(例如半固相植入剂)或液体剂型(例如注射剂)。

在本发明的范围内，术语“峰浓度”是指药物进入病变部位或其体外模型后活性组分于整个存在期内在液相介质中的最高浓度。因此，峰浓度亦可被视作药剂被递送至动物目标部位后活性组分在某一时间的作用强度。尽管具体的作用机理尚待进一步研究，根据本发明的实施例，本发明的组合物中的活性组分在局部病变区(例如瘤体)内是通过外源性或/和内源性液体介质进行输运且至少在一个瞬间其作用强度(峰浓度)必需大于一个临界值，这样才能够对病变形成实现本发明目的所需的攻击。本发明据此提供了规定本发明的组合物的组成的技术方案。

以药剂的物理形态分类，本发明的组合物的剂型包括液体剂型、固体剂型、半固体剂型。

在本发明的一个实施方案中，本发明的组合物为液体剂型，例如溶液剂型或悬浮液剂型，其可以通过例如注射针管进入给药部位(例如瘤内)，然后将组合物药物液体推入给药靶区。因而，所述活性组分(化学消融剂、生物活性成分和疫苗佐剂等)的峰浓度可以用其位于针管出口处的浓度，也就是此时其在所述组合物液体中的组成浓度(或给药浓度)来表示。

本发明的组合物为液体剂型时，其中所述亚甲蓝类化合物在所述组合物液体中的组成浓度>1％(w/v)、优选≥2％(w/v)，以及所述生物活性成分在所述组合物液体中的组成浓度>0.25％(w/v)、优选≥0.50％(w/v)。

根据本发明的一个实施方案，所述药物组合物为液体剂型，其中亚甲蓝类化合物的浓度可以为1.5-15％(w/v)、优选为2-10％(w/v)或3-10％(w/v)，以及所述生物活性成分的浓度可以为0.25-15％(w/v)、优选为0.5-10％(w/v)、更优选为1-6％(w/v)或1-4％(w/v)。

在本发明的一些实施例中，本发明的组合物为固体剂型或半固体剂型(例如植人剂、药物释放支架、栓剂、霜剂及凝胶剂)。

本发明组合物的固体剂型可以通过本领域内公知的知识制备。例如，将活性组分干粉(化学消融剂、生物活性成分和疫苗佐剂等)与适量固相赋形剂(例如成胶剂、增粘剂、增容剂等)混合均匀、出料、入模、成型(例如90℃、12小时热成型)、出模、降温，可制备适合于常规植入枪植入的固体剂型。该组合物固体通过植入枪管进入给药部位(例如瘤内)后，可向该部位体液中释放活性组分。

本发明组合物的半固体剂型(例如原位凝胶剂型)可以通过本领域内公知的知识制备。例如，在含化学消融剂、生物活性成分和疫苗佐剂等的液体中加入适量成胶剂[例如泊洛沙姆(P407/P188)]，便可制得温敏型原位凝胶。组合物液体通过注射针管进入给药部位(例如瘤内)后，将药物液体推入给药部位并形成凝胶。凝胶可向该部位体液中释放活性组分。

本发明的组合物为固体剂型或半固体剂型时，其中的活性组分(化学消融剂、生物活性成分和疫苗佐剂等)的有放释放是通过其所接触的液体介质(例如体液)来进行的。因此，活性组分的峰浓度可以用其峰溶出浓度来表示。在本发明的范围内，术语“峰溶出浓度”是指该剂型药剂置放于液相介质中时所述活性组分从该剂型药剂的最高溶出度；术语“溶出度”是指该剂型药剂置放于液相介质中时所述活性组分从该剂型药剂中溶出的程度，计算公式为：

溶出度＝(Ws/Vs)×100％

式中，Ws为所述活性组分从该剂型药剂溶出的重量，Vs为所述活性组分溶出Ws所至的液体介质体积。

本发明的组合物主要是通过液体介质接触体内的局部病变从而产生药效的。要达到本发明的目的，本发明的组合物固体剂型或半固体剂型同样要求活性组分至少在一个瞬间在局部病变区(例如瘤体)内的作用强度(峰浓度)大于一个临界值。实际上，从使用液体剂型的实施例所获得的活性组分浓度条件，也可以是其它剂型的活性组分浓度条件。

此外，在根据本发明的药物组合物为固体剂型或半固体剂型时，所述亚甲蓝类化合物和生物活性成分的含量应能够使得在施用该固体或半固体剂型的药物组合物时上述三种活性成分的峰溶出浓度符合以下要求：>1％(w/v)、优选≥2％(w/v)的亚甲蓝类化合物，以及>0.25％(w/v)、优选≥0.50％(w/v)的生物活性成分。

根据本发明的一个实施方案，在根据本发明的药物组合物为固体剂型或半固体剂型时，根据本发明的药物组合物所提供的亚甲蓝类化合物的峰溶出浓度为1.5-15％(w/v)，优选为2-10％(w/v)，更优选为3-10％(w/v)。

根据本发明的一个实施方案，在根据本发明的药物组合物为固体剂型或半固体剂型时，根据本发明的药物组合物所提供的生物活性成分的峰溶出浓度为0.3-15％(w/v)，优选为0.5-10％(w/v)，更优选为1-6％(w/v)或1-4％(w/v)。

为实现上述要求，例如，在根据本发明的药物组合物为固体剂型或半固体剂型中，所述亚甲蓝类化合物的组成含量≥5％(w/v)、优选≥10％(w/v)，以及所述生物活性成分的组成含量≥2％(w/v)、优选≥4％(w/v)，它们和适量成胶剂一起可使得活性组分的溶出峰浓度满足本发明组合物的技术方案的要求。

包含在根据本发明的药物组合物中的所述生物活性成分优选为选自具有以下之一种或多种结构的生物提取物及其类似物：苷、多酚、多糖、萜类、黄酮和生物碱。

根据本发明的药物组合物，所述生物活性成分优选为选自具有以下性质的活性成分：常温下在水中的均匀分散度大于5mg/ml、优选为大于10mg/ml。在本发明的范围中，术语“均匀分散”是指以如下之一种或多种方式的分散：溶解液、悬浮液、悬浊液。

在根据本发明的药物组合物中，所述生物活性成分可以是例如选自分子量大于5000、优选大于10000的高分子生物活性成分。

在根据本发明的药物组合物中，所述生物活性成分可以是例如具有以下之一种或多种基团的生物活性成分：磺酸基、羧甲基化、乙酰基，优选为具有磺酸基的生物活性成分。

在根据本发明的药物组合物中，所述生物活性成分包括活性多糖。在本发明的范围中，术语“多糖”是指由10个以上的单糖通过糖苷键连接形成的聚合物。

在根据本发明的药物组合物中，所述活性多糖包括藻类来源的活性多糖及其类似物(本发明中简称藻类活性多糖)。所述藻类活性多糖可以是本领域技术人员已知的任意合适者，例如可以是包括以下之一种或多种及其类似物：刺松藻多糖、紫菜多糖、海带多糖、褐藻多糖、褐藻多糖硫酸脂酯、石莼聚糖、浒苔多糖、礁膜多糖、螺旋藻多糖、紫球藻多糖、小球藻多糖、红球藻多糖、三角褐指藻、等鞭金藻多糖等，优选为选自以下一种或多种：褐藻多糖硫酸脂酯、螺旋藻多糖、海藻硒多糖。

在根据本发明的药物组合物中，所述活性多糖包括植物来源的活性多糖及其类似物(本发明中简称植物活性多糖)。所述植物活性多糖可以是本领域技术人员已知的任意合适者，优选为选自药用植物中提取的活性多糖及其类似物，其中所述药用植物中提取的活性多糖包括例如以下一种或多种：人参多糖、黄茋多糖、红芪多糖。

在根据本发明的药物组合物中，所述活性多糖包括真菌来源的活性多糖及其类似物(本发明中简称真菌活性多糖)。所述真菌活性多糖可以是本领域技术人员已知的任意合适者，优选为选自药用真菌中提取的活性多糖及其类似物，其中所述药用真菌中提取的活性多糖包括例如以下一种或多种：香菇多糖、茯苓多糖、猪苓多糖、灵芝多糖、云芝多糖。

根据本发明的药物组合物，所述生物活性成分包括活性苷。

在本发明的范围中，术语“苷”是指糖和糖的衍生物如氨基糖、糖醛酸等与另一非糖物质通过糖的端基碳原子连结而成的化合物。所述活性苷可以是本领域技术人员已知的任意合适者，例如可以是包括以下之一种或多种及其类似物：人参皂苷、三七总皂苷、皂角苷、虎杖皂苷、海参总皂苷等。

根据本发明的药物组合物，所述生物活性成分包括活性多酚。

在本发明的范围中，术语“多酚”是指具有多个羟基酚基团的化合物，包括例如类黄酮、水解单宁、原花青素等。所述活性多酚可以是本领域技术人员已知的任意合适者，例如可以是包括以下之一种或多种及其类似物：茶多酚、白藜芦醇、苹果多酚等。

根据本发明的药物组合物，所述生物活性成分包括活性萜。

在本发明的范围中，术语“萜”是指由甲戊二羟酸衍生而成，基本碳架多具有2个或2个以上异戊二烯单位结构特征的化合物。所述活性萜可以是本领域技术人员已知的任意合适者，例如可以是包括以下之一种或多种及其类似物：青蒿素、大花旋覆花内酯、倍半萜烯内酯等。

根据本发明的药物组合物，所述生物活性成分包括活性黄酮。

在本发明的范围中，术语“黄酮”是指两个苯环(A-与B-环)通过中央三碳链相互联结而成的化合物。所述活性黄酮可以是本领域技术人员已知的任意合适者，例如可以是包括以下之一种或多种及其类似物：葛根素、木犀草素、水飞蓟宾、白杨素、染料木素、川陈皮素、甘草总黄酮等。

根据本发明的药物组合物，所述生物活性成分包括活性生物碱。

在本发明的范围中，术语“生物碱”是指来源于生物界的含氮有机化合物。所述活性生物碱可以是本领域技术人员已知的任意合适者，例如可以是包括以下之一种或多种及其类似物：喜树碱类生物碱、苦参碱类生物碱、长春花类生物碱、石蒜科生物碱、小檗碱类生物碱等。

根据本发明的药物组合物，所述生物活性成分包含二种或二种以上不同结构类别的活性成分，优选为包含活性多糖和一种或多种以下活性成分：活性苷、活性多酚、活性萜类、活性黄酮、活性生物碱。

根据本发明的药物组合物，所述生物活性成分包含二种或二种以上不同生物来源的活性成分，其中所述不同生物来源优选为选自以下组：藻类和植物、藻类和真菌、植物和真菌。

根据本发明的药物组合物还可任选地包含一种或多种以下物质：赋形剂、止痛剂和增效剂。

所述赋形剂可以是本领域技术人员已知的任意合适者，其可包括例如以下之一种或多种：分散介质、防腐剂、稳定剂、湿润剂和/或乳化剂、增溶剂、增粘剂、用于调节渗透压的盐和缓冲剂。所述增粘剂例如为羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯毗咯烷酮或明胶。所述防腐剂是例如抗氧化剂例(如抗坏血酸)或杀微生物剂(如山梨酸或苯甲酸)。

所述止痛剂用以减轻患者的疼痛感，其可以是本领域技术人员已知的任意合适者，例如苯甲醇、盐酸普鲁卡因、三氯叔丁醇、盐酸利多卡等。

所述增效剂用以增强药效，其可以是例如以下之一种或多种：多价金属化合物、靶向剂、缓释载体、疫苗佐剂或其它药物。

根据本发明的药物组合物还可进一步任选包含多价金属化合物。所述多价金属化合物可以是本领域技术人员已知的任意合适者，其例如可以是铁、铜、镁、锌、锰、铝和钙中的一种或多种金属的化合物。

所述多价金属化合物包括以下之一种或多种的金属盐：铁盐、铜盐、镁盐、锌盐、锰盐、铝盐和钙盐，优选为铁盐和铜盐。具体对于铁盐而言，其包括铁(III)离子盐和亚铁(II)离子盐，其总称为铁盐。铁盐包括任何药物学上可以接受的铁盐，可以是铁离子或亚铁离子与上述无机酸或有机酸形成的盐。例如，亚铁离子盐包括二氯化铁、硫酸亚铁、琥珀酸亚铁、富马酸亚铁、葡萄糖酸亚铁、乳酸亚铁、蔗糖铁等。铁(III)离子盐包括例如枸橼酸铁铵、右旋糖酐铁、蛋白琥珀酸铁。在根据本发明的药物组合物中，所述金属化合物优选为亚铁离子盐，更优选为选自以下之一种或多种的亚铁盐：二氯化铁、硫酸亚铁、琥珀酸亚铁、富马酸亚铁、葡萄糖酸亚铁、乳酸亚铁、蔗糖铁。所述多价金属化合物还包括金属有机化合物，例如转铁蛋白、含铁血红素、氨基酸络合铁等。

根据本发明的药物组合物还可进一步任选包含靶向剂。在本发明的范围中，“靶向剂”是指能特异性结合局部病变中的药靶的物质，其中当特异性结合物质为化合物时称作靶向化合物，当特异性结合物质为抗体时称作靶向抗体。本发明的药物组合物中的靶向剂包括靶向化合物。靶向化合物可以是本领域技术人员已知的任意合适者，例如优选为选自以下化合物及其衍生物之一种或多种：叶酸、透明质酸、转铁蛋白。

根据本发明的药物组合物还可进一步任选包含缓释载体。所述缓释载体可以是本领域技术人员已知的任意合适者，包括例如凝胶基质、微粒载体、胶束基质等。

在本发明的范围内，术语“微粒载体”是指可以与药物相互作用(物理包埋、化学键合、静电相互作用等)的微粒，术语“微粒”是指所有能以局部给药方式进入身体局部(例如病变组织)內的微小粒子，其尺寸在1nm-100μm之间。微粒载体按基质材料分类包括有机材料载体、无机材料载体以及它们的组合，按微粒尺寸分类包括纳米载体(尺寸在1-1000nm之间)、微米载体(尺寸在1-100μm之间)以及它们的组合。

有机材料载体可以是本领域技术人员已知的任意合适者，例如包括以下之一种或多种：高分子基质微粒、脂质体微粒、纳米胶束基质、水油微球等，其中所述高分子基质优选为选自以下高分子及其衍生物之一种或多种制备的微粒载体：聚乳酸、聚氨基酸、聚羟基丁酸酯、乙交酯-丙交酯共聚物、聚氰基丙烯酸烷酯、聚酰胺、聚乙烯醇、聚丙烯酸树脂、壳聚糖等。

无机材料载体可以是本领域技术人员已知的任意合适者，例如包括以下之一种或多种：硅材料载体、铁化合物载体和碳材料载体。碳材料载体优选为选自以下组中的一种或多种微米碳粒子、纳米碳粒子、碳纳米管、富勒烯、纳米金刚石、纳米碳点及其衍生物。

根据本发明的药物组合物还可任选地包含药学上可接受的疫苗佐剂。在本发明的范围中，术语“疫苗佐剂”(也简称佐剂)是指与目标抗原混合后能增强机体针对目标抗原的免疫应答能力、或改变免疫反应类型的物质。根据这一定义，疫苗佐剂与通常意义上的免疫增强剂有所不同，后者起作用往往不必与目标抗原混合。

根据本发明的药物组合物，所述疫苗佐剂可以是本领域技术人员已知的任意合适者，例如可以是包括以下以佐剂材料所分类的一种或多种：无机佐剂、合成佐剂、油/乳佐剂、生物佐剂，也可以是包括以佐剂尺寸所分类的微粒佐剂、或/和分子佐剂。

在本发明的范围中，术语“无机佐剂”是指基于无机物的佐剂(例如矿物质盐)；术语“合成佐剂”是指基于合成物的佐剂(例如双链多聚核苷酸)；术语“油/乳佐剂”是指基于油或/和乳化物的佐剂(例如弗式佐剂、MF59)；术语“生物佐剂”是指基于生物来源的佐剂(例如微生物、细菌、病毒、它们的佐剂成分(DNA、蛋白质、多肽片断、等等)及其类似物)；术语“微粒佐剂”是指微粒形式的佐剂(例如脂质体微粒佐剂)；术语“分子佐剂”是指微粒形式以外的分子形式的佐剂(例如TLR9激动剂非甲基化胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸-脱氧寡核苷酸(CpG ODN))。

根据本发明的药物组合物，所述疫苗佐剂优选为选自分子量大于5000的大分子佐剂、尺寸大于1nm的微粒佐剂及它们的组合。

根据本发明的药物组合物，所述微粒佐剂包括佐剂微粒和佐剂化微粒。

在本发明的范围中，术语“微粒”是指所有能以局部给药方式进入身体局部(例如病变组织)內的微小粒子，其尺寸在1nm-100μm之间；术语“佐剂微粒”是指起佐剂作用的物质本身具有微粒形式的一类微粒佐剂；术语“佐剂化微粒”是指起佐剂作用的主要物质本身不具有微粒形式但被固定在微粒载体上的一类微粒佐剂。

根据本发明的药物组合物，所述佐剂微粒包括以下组的一种或多种：佐剂固体微粒、佐剂半固体微粒、佐剂脂质微粒。

在根据本发明的药物组合物中，所述佐剂固体微粒可以是包括例如无机佐剂微粒，其中所述无机佐剂微粒可以是包括例如以下组的一种或多种：氢氧化铝微粒、磷酸钙微粒、磷酸铝微粒、硫酸铝微粒等。

在根据本发明的药物组合物中，所述佐剂半固体微粒可以是包括例如生物微粒，其中所述生物微粒可以是包括例如以下组的一种或多种：分枝杆菌、百日咳杆菌、内毒素、细菌提取物、磷脂酶G(PLG)、病毒样颗粒(VLP)等。

在根据本发明的药物组合物中，所述佐剂脂质微粒例如可以是包括例如乳剂微粒，其中所述乳剂微粒可以是包括例如本领域技术人员已知的以下组的一种或多种：MF59、AS02、MPL、QS21、W₈₀5EC、ISA-51、ISA-720等。

根据本发明的药物组合物，所述佐剂化微粒例如可以是包括以下组的一种或多种：固定在微粒载体(例如纳米金刚石)上的细胞因子、独特抗原构架、多肽(例如CpG ODN)、热休克蛋白、白细胞介素等。

根据本发明的药物组合物，所述大分子佐剂包括生物大分子免疫刺激剂，其中所述生物免疫剌激剂包括以下之一种或多种：粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、热休克蛋白。

在根据本发明的药物组合物中，所述疫苗佐剂例如可以是包括由一种以上的多种疫苗佐剂组成的联合疫苗佐剂，其中所述联合疫苗佐剂例如可以是包括以下组:氢氧化铝微粒和CpG ODN、氢氧化铝微粒和MPL、AS04(LPS衍生物、单磷脂酰脂质A和铝佐剂)、AS03(维生素E、角鲨烯和吐温-80)等。

根据本发明的药物组合物，其中还可进一步任选包含其它药物。所述其它药物可以是本领域技术人员已知的任意具有增强药效功能的药物，包括例如以下抗肿瘤药物的一种或多种：烷化剂类(例如环磷酰胺、白消安、氮芥、卡莫斯丁、等)、破坏DNA的铂类(例如顺铂、卡铂、奈达铂等)、破坏DNA的抗生素类(例如博莱霉素、平阳霉素、丝裂霉素等)、影响核酸生物合成的药物(例如氟尿嘧啶、吉西他滨、阿糖胞苷等)、干扰转录过程和阻止RNA合成的药物(例如阿柔比星、多柔比星等)、拓扑异构酶抑制剂(例如伊立替康、羟喜树碱、等)、影响微管蛋白合成的药物(例如长春新碱、紫杉醇、多西他赛等)、小分子靶向药物(例如吉非替尼、伊马替尼、索拉菲尼等)、抗体药物(例如利妥昔单抗、替伊莫单抗、西妥昔单抗等)，等等。根据本发明的药物组合物还可用于逆转这些抗肿瘤药物的肿瘤细胞耐药性。

根据本发明的药物组合物还可以包含解偶联剂，例如二硝基苯酚(DNP)。

如果存在，所述多价金属化合物、靶向剂、缓释载体、止痛剂以及其他药物在本发明药物组合物中的含量应能够使得在施用该药物组合物之后提供如下峰浓度的上述成分：

所述多价金属化合物的峰浓度例如为0.02-2％(w/v)，其优选为0.05-1.5％(w/v)，更优选为0.1-1.2％(w/v)或0.1-1.6％(w/v)；

所述靶向剂的峰浓度例如为0.1-3％(w/v)，其优选为0.25-2.5％(w/v)，更优选为0.5-2％(w/v)或0.5-1.5％(w/v)；

所述缓释载体的峰浓度例如为0.5-13％(w/v)、优选为1-12％(w/v)或1-15％(w/v)；

所述疫苗佐剂的峰浓度为0.3-12％(w/v)，优选为0.3-6％(w/v)，更优选为1-4％(w/v)；

所述其它药物的峰浓度例如为0.1-15％(w/v)；和

所述止痛剂的峰浓度例如可以是0.1-4％(w/v)。例如苯甲醇的浓度可以为1-4％(w/v)，盐酸普鲁卡因、三氯叔丁醇、盐酸利多卡的浓度可以分别为1-3％(w/v)。

例如，在一个实施方案中，根据本发明的组合物为液体剂型，其中：

如果存在，所述多价金属化合物的浓度例如为0.02-2％(w/v)，其优选为0.05-1.5％(w/v)，更优选为0.1-1.2％(w/v)或0.1-1.6％(w/v)；

如果存在，所述靶向剂的浓度例如为0.1-3％(w/v)，其优选为0.25-2.5％(w/v)，更优选为0.5-2％(w/v)或0.5-1.5％(w/v)；

如果存在，所述缓释载体的浓度例如为0.5-13％(w/v)、优选为1-12％(w/v)或1-15％(w/v)；

如果存在，所述疫苗佐剂的峰浓度为0.3-12％(w/v)，优选为0.3-6％(w/v)，更优选为1-4％(w/v)；

如果存在，所述其它药物的浓度例如为0.1-15％(w/v)；和

如果存在，所述止痛剂的浓度例如可以是0.1-4％(w/v)。例如苯甲醇的浓度可以为1-4％(w/v)，盐酸普鲁卡因、三氯叔丁醇、盐酸利多卡的浓度可以分别为1-3％(w/v)。

本领域技术人员会理解，根据所需给药方式和浓度参数，可将本发明的组合物制成例如固体制剂、半固体制剂或液体制剂。更具体而言，本发明的药物组合物的固体制剂包括例如舌下片剂、粘贴片、固相植入剂；半固体制剂包括例如软膏剂、硬膏剂、糊剂、贴剂、栓剂；液体制剂包括例如注射剂、外用溶液剂、洗剂、搽剂、滴剂、以及以下气态制剂的母液：喷雾剂、气雾剂、粉雾剂。

根据本发明的一个实施方案，根据本发明的局部给药液体制剂为乳剂。该乳剂可以是水包油或者油包水型乳剂。所述乳剂的分散介质可以本领域技术人员已知的任意合适者，例如常用于注射目的植物油、合成油或半合成油作为油组。植物油可以是例如棉籽油、杏仁油、橄榄油、蓖麻油、芝麻油、大豆油和花生油。

根据本发明的一个实施方案，根据本发明的局部给药液体制剂为悬浊剂。所述悬浊剂的分散介质可以本领域技术人员已知的任意合适者，例如微米材料或纳米材料。

根据本发明的一个实施方案，根据本发明的局部给药液体制剂为溶液剂。该溶液剂可以是通过将组合物组分溶解在分散介质中而形成的，也可以是单独地将上述组分溶解在分散介质、然后混合而形成的。所述溶液的分散介质包括溶媒，优选在药学上适宜的亲水溶媒。术语“亲水溶媒”是指具有亲水性的溶媒，其包括例如水、水可混溶性有机溶剂、或者包含水和水可混溶性有机溶剂的溶媒系统。

根据本发明的药物组合物，所述亚甲蓝类化合物和生物活性成分和化学消融剂之一部分或全部在给药前可以是在冻干制剂的剂型中。

以本发明组合物的液体制剂(例如注射剂)为例，其可按照以下方法来制备。

方法一：如果组合物中所含亚甲蓝类化合物、生物活性成分以及任选存在的其他添加剂(例如金属盐、其它药物、其它增效剂、止痛剂、赋形剂等)的所需浓度均在水溶或水可分散的浓度范围内时，则将这些原料以及任选添加的疫苗佐剂直接加入注射用水即可获得相应的液体制剂。

方法二：如果组合物中所含亚甲蓝类化合物、生物活性成分、以及任选存在的其他添加剂(例如金属盐、硬化剂、其它药物、其它增效剂、止痛剂、赋形剂等)的所需浓度有不在水溶或水可分散的浓度范围内时，则将这些原料以及任选添加的疫苗佐剂溶于或分散于所有组合物组分均可在所需浓度下溶解或分散的溶媒(例如含有机溶剂的水溶液)中，即可获得相应的液体制剂。

方法三：首先制备(例如通过上述方法)含全部组份的液体剂，再将其制备(例如通过冻干工艺)为干粉，使用前将该干粉与不含任何组份的溶媒(例如注射用水或含水可混溶有机溶剂的溶媒)混合形成组合物液体制剂。

方法四：首先制备(例如通过上述方法)含部份组份的液体，再将其制备(例如通过冻干工艺)为干粉，使用前将该干粉与含有另外部份组份的液体(例如水溶液或含水可混溶有机溶剂的溶液)混合形成组合物液体制剂。

以本发明组合物的气态制剂(例如喷雾剂)的母液为例，其制备方法可参考上述组合物液体制剂制备方法，通过在上述液体制剂的制备中加入以下一种或多种赋形剂来制备：甘油、聚山梨酯-80、苯扎氯铵、微晶纤维素-羧甲基纤维素钠等。

以本发明组合物的半固体制剂(例如栓剂)为例，其制备方法可参考上述组合物液体制剂制备方法，通过在上述液体制剂的制备中加入以下一种或多种赋形剂来制备：棉籽油、杏仁油、橄榄油、青篙油、薄荷脑、冰片、增溶乳化剂、甘油等。

按上述这些方法的原则，本领域技术人员可以采用任意合适的具体方法制备多种包含本发明组合物的局部给药制剂。例如，本发明的制剂中的变化包括：含不同种类和浓度的亚甲蓝类化合物，含不同种类和浓度的生物活性成分、含不同种类和浓度的金属盐，含不同种类和浓度的其他添加剂(例如其它有效药物、止痛剂、增活剂等)。

根据本发明的另一个方面，其还提供根据本发明的药物组合物在制备预防和治疗哺乳动物局部病变相关疾病的药物中的应用。根据本发明的应用，其中所述预防和治疗哺乳动物局部病变相关疾病的药物具有局部给药的剂型、优选组织内给药的剂型。

根据本发明的再一个方面，其还提供一种预防和治疗包含局部病变的疾病的方法，该方法包括向由此需要的个体给药根据本发明的药物组合物。本发明的方法是一种具有化学消融作用、甚至于在某些条件下可能还有免疫作用的治疗方法。

根据本发明的方法，所述给药包括局部给药、优选组织内给药。

在本发明的范围内，术语“局部病变相关疾病”是指具有局部病变症状的疾病。术语“局部病变”是指在动物身体局部部位原生或继生的病变。术语“局部部位”可以是本领域技术人员已知的任意合适者，例如可以是包括以下一种或多种器官中的局部：分泌系统所在的分泌器官、血液循环系统所在的心血管器官、皮肤等。术语“病变”是指结构、形态或功能上的不正常，其可以是本领域技术人员已知的任意合适者，例如可以是包括以下一种或多种：肿瘤、非瘤肿大、局部炎症、分泌腺分泌功能异常等。

在本发明的范围内，术语“肿瘤”是指血液系统肿瘤(例如白血病)之外的所有具有肿瘤细胞局部集中区的肿瘤、优选实体肿瘤，其包括恶性肿瘤和非恶性肿瘤。肿瘤可以是本领域技术人员已知的任意合适者，包括例如按照肿瘤细胞类型进行分类的以下组:上皮细胞肿瘤、肉瘤、淋巴瘤、生殖细胞肿瘤、胚细胞瘤；以及包括按照肿瘤细胞集中区所在的器官或组织来命名的肿瘤，包括例如按照以下器官或组织来命名的肿瘤:皮肤、骨、肌肉、乳腺、肾、肝、肺、胆囊、胰腺、脑、食道、膀肌、大肠、小肠、脾、胃、前列腺、翠丸、卵巢或子宫。本发明中的肿瘤也包括所有形式的肿瘤和处于任何阶段的肿瘤。

所述恶性肿瘤包括例如乳腺癌、胰腺癌、甲状腺癌、鼻咽癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、肠癌、口腔癌、食道癌、胃癌、喉癌、睾丸癌、阴道癌、子宫癌、卵巢癌、等等。所述非恶性肿瘤包括例如乳腺瘤、胰腺瘤、甲状腺瘤、前列腺瘤、肝瘤、肺瘤、肠瘤、口腔瘤、食道瘤、胃瘤、鼻咽瘤、喉瘤、睾丸瘤、阴道瘤、子宫瘤、输卵管瘤、卵巢瘤等。

在本发明的范围内，术语“非瘤肿大”包括肿瘤以外的肿大，包括例如增生(例如乳腺、胰腺、甲状腺、甲状旁腺、前列腺等的增生)、囊肿(例如乳腺、甲状腺、甲状旁腺等的囊肿)、结节(例如乳腺、甲状腺、甲状旁腺等的结节)、异常静脉团(例如痔疮等)、局部炎症发肿、微生物感染发肿。所述痔疮包括内痔、外痔、混合痔。

在本发明的范围内，术语“局部炎症”是指局部部位的非瘤性发炎，包括例如变质性炎(alterative inflammation)、渗出性炎(exudative inflammation)和增生性炎。分泌腺器官的发炎包括例如乳腺炎、胰腺炎、甲状腺炎、前列腺炎、肝炎、肺炎、肠炎、口腔炎、咽炎、食道炎、胃炎、胃溃疡、鼻炎、鼻窦炎、喉炎、气管炎、支气管炎、阴道炎、子宫炎、输卵管炎、卵巢炎等。其它局部炎症包括例如退行性关节炎等。

在本发明的范围内，术语“分泌腺分泌功能异常”包括分泌腺功能亢进症和分泌腺功能减退症。其中，术语“分泌腺功能亢进症”是指分泌细胞功能过分活跃则激素合成增加分泌也增加，例如甲状腺功能亢进症。术语“分泌腺功能减退症”是指分泌细胞功能下降或某种特有的酶缺少使激素合成减少并分泌减少，例如甲状腺功能減退症、胰岛功能減退症(糖尿病之一种)等。术语“激素”是指内分泌细胞合成并直接分泌入体液的化学信息物质，其包括类固醇激素(例如肾上腺皮质激素、性激素等)、氨基酸衍生物激素(例如甲状腺素、肾上腺髓质激素、松果体激素等)、肽与蛋白质激素(例如下丘脑激素、垂体激素、胃肠激素、胰岛素、降钙素等)、脂肪酸衍生物激素(例如前列腺素)。

根据本发明的一个实施方案，所述局部病变相关疾病包括分泌疾病。在本发明的范围内，术语“分泌疾病”是指原生或继生在分泌腺或分泌腺所在的组织、器官的病变，术语“分泌腺”是指由腺细胞或腺细胞群组成的、执行分泌功能(secretion)的结构，其包括外分泌腺和内分泌腺。

根据本发明的一个实施方案，所述局部病变相关疾病包括皮肤病。在本发明的范围内，术语“皮肤病”是指原生或继生在皮肤或皮肤附属器官的病变，其可以是本领域技术人员已知的任意合适者，例如可以是包括以下一种或多种：皮肤癌、皮肤非恶性肿瘤、病毒性皮肤病(例如疱疹、疣、风疹、手足口病)、细菌性皮肤病(例如脓疱病、疖、麻风)、真菌性皮肤病(例如各种癣)、性传播疾病(例如梅毒、淋病及尖锐湿疣)、过敏性与自身免疫性皮肤病(例如接触性皮炎、湿疹、荨麻疹)、物理性皮肤病(例如日光性皮肤病、冻疮、鸡眼、手足皲裂、压疮)、结缔组织疾病(例如红斑狼疮)、色素障碍性皮肤病(例如雀斑、色素痣、各种斑)、皮肤附属器疾病(例如痤疮、酒渣鼻、脂溢性皮炎、斑秃、秃发、多汗症及臭汗症)。

局部给药剂型要求药物组成(活性成分、组成比及及组分浓度)可通过局部手段给用给局部病变所在的组织、并在该组织内产生所需要的疗效。例如，当病变为肿瘤时，局部组织为肿瘤细胞所在的瘤体。当病变为非瘤肿大时，局部组织为肿块(例如增生、囊肿、结节等病变肿块)。当病变为局部炎症时，局部组织为发炎区(例如发炎肿大体)。当病变为分泌异常时，局部组织为异常源或其所在的分泌腺体。又例如，当疾病为胰岛素分泌异常时，异常源在胰岛，局部组织则为胰岛或胰岛所在的胰腺。当疾病为皮肤病时，局部组织为病变皮肤或病变皮肤的附属器官。

本发明的组合物以及该组合物的医用制剂还可与其它介入疗法(例如经动脉导管灌注/拴塞)、全身化疗、其它免疫疗法、光动力疗法、声动力疗法、加热疗法、物理消融法(例如射频、微波、激光、高强度聚焦超声(HIFU)、纳米刀、氩氦刀等消融)、手术干预或此类疗法的组合相组合施用，以进一步提高疗效。

基于在下文中更详细描述的研究，尽管具体机理尚待进一步研究，本发明的组合物显示出促进哺乳动物局部病变所在组织的相关结构(例如病变组织、病变细胞及参与构成它们的任一结构)的更为有效的破坏，从而达到治疗疾病的更好药学效果。

实施例

通过以下具体实施例对本发明作进一步的说明，但不作为对本发明的限制。在以下实施例中，所有的实验均依照相关规定在细胞或实验动物上进行。如无特殊说明，所有实验均按常规方法进行。

以下具体实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中所用的部分试剂列于表1中。

表1

此外，以下生物提取物由西安瑞林生物科技有限公司提供:虫草多糖、猪苓多糖、猴头茹多糖、海藻硒多糖、香菇硒多糖、螺旋藻多糖、复合真菌多糖、三七总皂苷(纯度>80％)、人参提取物(人参总皂苷含量≥80％)、茶多酚(纯度>98％)、苹果多酚(纯度>98％)、蜂胶黄酮(纯度>98％)、葛根黄酮(纯度>98％)、枳实黄酮(纯度>98％)等等。

在以下实施例中，受试肿瘤细胞包括：人肝癌细胞(HepG2)、人乳腺癌细胞(MDA-MB231)、人肺癌细胞(A549)、人甲状腺癌细胞(SW579)、人前列腺癌细胞(LNCaP/AR)、人胰腺癌细胞(PANC-1)、人结肠癌细胞(COLO205)、人头颈癌细胞(Fμda)、人鼻咽癌细胞(CNE1)、人胃癌细胞(BGC823)、卵巢癌(PA1)、皮肤癌细胞(A341)等。本发明的实施例的研究方法和结果也适用于其它肿瘤细胞。

在以下实施例中，除非另有说明，皮下移植瘤动物试验按药管当局颁发的试验指南进行。动物为6～8周龄、体重17.5-20.5g的Balb/c裸鼠。将上述受试肿瘤细胞皮下接种于裸鼠，待肿瘤长至所需体积(例如100-500mm3左右)，采用PEMS 3.2软件(四川大学华西公共卫生学院编制)随机区组为阴性对照组、阳性对照组和若干个研究组，每组8只裸鼠。

分组当日开始给药。试验设阴性对照组、阳性对照组和若干个研究组，分别加入阴性对照物、阳性对照物和若干个研究药物。阴性对照物为组合物溶媒，其给药方式和体积均与研究组相同。阳性对照物选自上述现有抗瘤药物，其给药方式为腹腔注射给药，其日给药剂量均按所选药物的惯例进行(例如5-氟尿嘧啶25mg/kg)。除另有说明，研究组均为瘤区注射研究药物，注射量由剂量和浓度确定。试验观察、测量和分析的项目，包括一般状态、体重、摄食量、肿瘤体积、瘤重等。

肿瘤体积计算公式如下：

肿瘤体积(V)＝l/2×a×b²，其中a表示肿瘤长，b表示肿瘤宽。

相对肿瘤体积计算公式如下：

相对肿瘤体积(RTV)＝Vt/Vo，其中Vo为分笼给药当天(即第一天)测量所得肿瘤体积，Vt为给药次日及之后测量时的肿瘤体积。

肿瘤生长抑制率(本发明中简记为抑瘤率)计算公式如下：

抑瘤率Y(％)＝(TW-CW)/CW×100％，其中TW为研究组的平均瘤重；CW为阴性对照组的平均瘤重。

在以下实施例中，实验均采用重复测量方差分析(Repeated Measμres ANOVA)分别对指标均数的组别差异进行统计学检验。组别差异有统计学意义时(P≤0.05)，采用最小显著差异法对各组与阴性对照组间差异进行比较。定量指标采用均数±标准误(X±SEM)描述。当LEVENE方差齐性检验提示方差不齐时(P≤0.05)，采用Mann-WhitneyΜ秩和检验(M-W法)比较组间差异。所有的统计分析，均在SPSS for Windows 13.0软件下完成。

实施例1：组合物的制备

1、液体制剂的制备

使用前述制备方法，本实施例制备的部分本发明的药物组合物溶液的组成列于表2。其中的赋形剂包括溶媒，除另有说明，溶媒均含注射用水。药物组合物溶液均在配制完成后存放2小时以上再行使用。

表2

*:溶媒为含25％乙醇、15％PEG300和15％丙二醇的水溶液。

具体而言，例如，以最终100ml组合物溶液体积计，在室温下，按照表2所示的量量取相应的化学消融剂(例如亚甲蓝或)、生物活性成分(例如褐藻多糖硫酸脂或/和三七总皂苷)以及任选存在的其他组分(如多价金属化合物、其它药物等)的干粉加入80ml溶媒(例如注射用水或乙醇水溶液)中溶解、混合、分散，再加入其它添加剂(例如止疼剂、离子强度调节剂、pH调节剂)和注射用水使总体积达到100ml，混合均匀后分装为2ml/瓶备用，制得组合物液体剂。

2、冻干制剂的制备

上述液体剂(例如表2)可进一步制成冻干制剂。具体而言，例如，称取4g亚甲蓝和2g褐藻多糖硫酸酯干粉加入其它添加剂和注射用水制得100ml的4％亚甲蓝/2％褐藻多糖硫酸酯水溶液，该水溶液以每支2ml的液装量灌装在7ml容量小瓶中，再经冷冻干燥、压塞和轧盖，即得到注射用亚甲蓝/褐藻多糖硫酸酯冻干粉针制剂。

上述冷冻干燥的优选工艺条件如下。预冻条件:在预冻温度-45℃保持4小时，样品溶液就能完全冻实。升华干燥条件:当升华干燥阶段的升温速率为0.1℃/分钟、且升至-15℃时至少保持10小时，则水分基本升华完全，且无喷瓶现象发生。解吸附干燥条件：在解吸附干燥阶段，于30℃保持6小时，则样品水分能控制在3％以下。

总之，本发明的组合物的液体剂的制备，包括以下方法：将所有组分与溶媒混合一起制成；将所有组分与溶媒混合一起制成冻干制剂、临用前再用溶媒溶制成；将部分组分混合一起制成冻干制剂、临用前再用含其它组分的溶液混合复溶制成。

3、固体剂型的制备

按照表2中的相对量量取组合物活性组分，例如500mg亚甲蓝和200mg三七总皂苷，将其加入成胶剂(例如500mg羧甲基纤维素钠)、增粘剂(例如500mg聚乙烯醇)、增容剂(例如5000mg葡萄糖等)中，然后加入定容至10ml的注射用水，混合均匀制成可成型的软材，再通过小型成型机挤压成型为直径≤1mm的线材，加温干燥，称重然后切割为长度≤5mm的固相植入条。该固相植入条可通过临床常用的I¹²⁵粒子植入枪植入动物体内。

将5条固相植入条放入含100μl生理盐水容器(模仿荷瘤裸鼠实验中瘤体体积100mm³)内并适度摇动，15分钟之后从残存条之外的溶液中取样，按常规方法(例如分光光度计比色法)测定亚甲蓝浓度(平均溶出度)。根据亚甲蓝浓度及其与其它活性组分的相对量，可计算出其它活性组分的平均溶出度。平均溶出度必然小于或等于峰溶出度。

通过调整组合物活性组分和成胶剂用量的量比，可获得所需要的峰溶出度。在本实施例中，当固相植入条中亚甲蓝组成≥5％(w/v)、三七总皂苷组成≥2％(w/v)、羧甲基纤维素钠组成≤5％(w/v)、聚乙烯醇组成<8％(w/v)，所获得的固相组合物中亚甲蓝的平均溶出度经测定≥2％(w/v)、三七总皂苷的平均溶出度经计算≥0.25％(w/v)。

实施例2：协同性研究

1、体外合用活性研究

本实验首先选用人肝癌细胞株(HepG2)，设阴性对照组(阴性对照物为生理盐水)和药物组，使用CCK8比色法测定药物的肿瘤细胞抑制活性。测试溶液均为侍测药物给定浓度的水溶液，实验条件和步骤按cck-8试剂盒(日本同仁化学)的说明书进行。比色选择490nm波长在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值(A₄₉₀)，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。按下式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率，其试验的结果列于表3中。

肿瘤细胞生长抑制率(IR)＝(1-药物组A₄₉₀/对照组A₄₉₀)X100％。

表3

在表3中，亚甲蓝类化合物/生物活性成分组合物不仅显示出对生物活性成分浓度变化的不敏感、还显示出明显的桔抗作用。

2、体内合用活性比较研究

在一个以亚甲蓝/5-氟尿嘧啶为协同目标物、以亚甲蓝/螺旋藻多糖为拮抗对照物的动物实验中，成功建模的试验动物(荷肝癌细胞裸鼠，瘤体平均体积105mm³)随机分组为腹腔注射系列和瘤内注射系列。两个系列各包括1个阴性对照组、4个亚甲蓝/螺旋藻多糖组(A1、B1组和A2、B2组)和4个亚甲蓝/5-氟尿嘧啶组(C1、D1组和C2、D2组)。阴性对照组注射生理盐水，A1、A2组分别腹腔注射和瘤内注射1％亚甲蓝/1％螺旋藻多糖水溶液，B1、B2组分别腹腔注射和瘤内注射浓度1％亚甲蓝/2％螺旋藻多糖水溶液，C1、C2组分别腹腔注射和瘤内注射1％亚甲蓝/1％5-氟尿嘧啶水溶液，D1、D2组分别腹腔注射和瘤内注射1％亚甲蓝/2％5-氟尿嘧啶。研究药物均为按实施例1的制备方法配置，用药剂量均为75mg亚甲蓝/kg。用药结束后7日，对动物进行安乐死，解剖后测定抑瘤率。图1给出各研究组(X轴)的抑瘤率(Y轴)。

图1中，腹腔注射时，亚甲蓝/螺旋藻多糖组(A1、B1组)的抑瘤率比亚甲蓝/5-氟尿嘧啶组(C1、D1组)低(P>0.05)。而瘤内注射时，亚甲蓝/螺旋藻多糖组(A2、B2组)显示出比亚甲蓝/5-氟尿嘧啶组(C2、D2组)明显更高的抑瘤率(P<0.05)。尽管5-氟尿嘧啶被认为是特异性、活性都很高的抗肿瘤药，却是螺旋藻多糖与亚甲蓝的组合物显示出高得不同寻常的协同作用。

另一个荷肝癌细胞裸鼠实验中，成功建模的试验动物(瘤体平均体积113mm3)随机分组为腹腔注射系列和瘤内注射系列。两个系列各包括1个阴性对照组、4个亚甲蓝/三七总皂苷组(A1、B1组和A2、B2组)和4个亚甲蓝/5-氟尿嘧啶组(C1、D1组和C2、D2组)。阴性对照组注射生理盐水，A1、A2组分别腹腔注射和瘤内注射1％亚甲蓝/1％三七总皂苷水溶液，B1、B2组分别腹腔注射和瘤内注射注射浓度1％亚甲蓝/2％三七总皂苷水溶液，C1、C2组分别腹腔注射和瘤内注射1％亚甲蓝/1％5-氟尿嘧啶水溶液，D1、D2组分别腹腔注射和瘤内注射1％亚甲蓝/2％5-氟尿嘧啶。研究药物均为按实施例1的制备方法配置，用药剂量均为75mg亚甲蓝/kg。用药结束后7日，对动物进行安乐死，解剖后测定抑瘤率。所得结果与图1中的结果类似。

在进一步的试验中，本发明的其它组合物(例如表2中的组合物)也显示出类似作用。

实施例3：超有效活性研究

活性其实是一个相对的概念。在本发明的范围内，术语“活性”是指物质的显示出一定治疗作用的性质，术语“有效活性”是指物质具有的与现有临床药物相当的治疗作用的性质，术语“超有效活性”是指物质与现有临床药物相比具有明显较高的治疗作用的性质。以现有临床抗肿瘤化疗药物(例如5-氟尿嘧啶)为例，它们在荷瘤裸鼠试验中的抑瘤率为45-75％。这就是现有临床药物的疗效。超有效活性要求明显较高的治疗作用，例如荷瘤裸鼠试验中的抑瘤率>75％。

在本发明的范围内，术语“活性条件”、“有效活性条件”和“超有效活性条件”分别指研究者提供的使物质显示出活性、有效活性和超有效活性的条件。尽管提供超有效活性条件的技术方案也许看上去会很简单。其实这点点有区别的简单，就是那个难上又难、需要突被之处。

1、给药方式的进一步研究

在一个针对荷肝癌细胞裸鼠(瘤体平均体积118mm3)的动物实验中，动物分为阴性对照组和6个研究组。阴性对照组瘤内注射生理盐水，4个研究组(A、B、C、D组)分别经口给药、腹腔注射、瘤周注射、瘤内注射1％亚甲蓝/1％人参总皂苷水溶液。研究药物均为按实施例一的制备方法配置。亚甲蓝用药剂量为100mg/kg动物。用药1次，用药后7日对动物进行安乐死，解剖后测定抑瘤率。图2给出不同给药方式时，各研究组(X轴)的抑瘤率(Y轴)。

图2中，在相同剂量下给药同一个亚甲蓝/人参总皂苷组合物时，不同给药方式所显示的抑瘤率差别不同寻常。瘤周注射(C组)可以使药物直接与瘤体接接触，显示出比全身用药组(A、B组)明显更高的抑瘤率(P<0.05)。瘤内注射组(D组)则显示出不仅比全身用药组(A、B组)、而且比瘤周注射组(C组)明显更高的抑瘤率(P<0.05)。

在一个针对荷肝癌细胞裸鼠(瘤体平均体积154mm³)的动物实验中，动物分为阴性对照组和6个研究组。阴性对照组瘤内注射生理盐水，4个研究组(A、B、C、D组)分别经口给药、腹腔注射、瘤周注射、瘤内注射1％亚甲蓝/1％褐藻多糖硫酸脂水溶液。研究药物均为按实施例一的制备方法配置。亚甲蓝用药剂量为100mg/kg动物。用药1次，用药后7日对动物进行安乐死，解剖后测定抑瘤率。所得结果与图2中的结果类似。

在进一步的试验中，本发明的其它组合物(例如表2中的组合物)也显示出类似作用。

2、亚甲蓝类化合物浓度研究

在一个针对荷肝癌细胞裸鼠的实验中，研究了抑瘤率与组合物中亚甲蓝浓度的关系。成功建模的试验动物(瘤体平均体积125mm3)随机分组为阴性对照组和5个研究组(A、B、C、D、E组)。阴性对照组瘤内注射生理盐水，A、B、C、D、E组分别瘤内注射按实施例一的方法制备的5个亚甲蓝/人参多糖水溶液。其中，人参多糖浓度均为1％，而亚甲蓝浓度分别为0.25％、0.5％、1％、2％、3％。研究药物均为按实施例一的制备方法配置，注射剂量均为100mg亚甲蓝/kg动物。用药结束后7日，对动物进行安乐死，解剖后测定抑瘤率。图3给出当人参多糖浓度固定为1％时，其与不同浓度亚甲蓝(X轴)的组合物的抑瘤率(Y轴)。

图3中，亚甲蓝浓度<1％时，抑瘤率均随亚甲蓝浓度增加而增加但仍然在无效区内，抑瘤率在1≤亚甲蓝浓度≤2区间随亚甲蓝浓度增加而快速增加，2％≤亚甲蓝浓度时显示出超高活性的抑瘤率。在相同亚甲蓝剂量时(100mg/kg)，抑瘤率随亚甲蓝浓度变化出现的明显变化、以及抑瘤率变化所达到的高度说明疗效主要由浓度而非剂量确定。

在一个针对荷肝癌细胞裸鼠的实验中，研究了抑瘤率与组合物中亚甲蓝浓度的关系。成功建模的试验动物(瘤体平均体积113mm³)随机分组为阴性对照组和5个研究组(A、B、C、D、E组)。阴性对照组瘤内注射生理盐水，A、B、C、D、E组分别瘤内注射按实施例一的方法制备的5个亚甲蓝/三七总皂苷水溶液。其中，三七总皂苷浓度均为1％，而亚甲蓝浓度分别为0.25％、0.5％、1％、2％、3％。研究药物均为按实施例一的制备方法配置，注射剂量均为100mg亚甲蓝/kg动物。用药结束后7日，对动物进行安乐死，解剖后测定抑瘤率。所得结果与图3中的结果类似。

在进一步的试验中，本发明的其它组合物(例如表2中的组合物)也显示出类似作用。

3、组合物相对量与活性多糖浓度研究

一个针对荷肝癌细胞裸鼠(瘤体平均体积98mm³)的动物实验中，成功建模的试验动物随机分组为阴性对照组和7个研究组(A、B、C、D、E、F、G组)。阴性对照组瘤内注射生理盐水，研究组分别瘤内注射含1％亚甲蓝和不同浓度(0、0.125％、0.25％、0.5％、1％、2％、4％)三七总皂苷的组合物。研究药物均为按实施例一的制备方法配置，用药剂量均为50mg化学消融剂/kg动物。用药结束后7日，对动物进行安乐死，解剖后测定抑瘤率。图4给出当亚甲蓝浓度固定为1％时，其与不同浓度三七总皂苷(X轴)的组合物的抑瘤率(Y轴)。

图4中，B、C、D、E、F、G组的三七总皂苷/亚甲蓝相对量分别为1:8、1:4、1:2、1:1、2:1、4:1。与A组抑瘤率相比较，各组均显示出明显增加的抑瘤率。但在三七总皂苷/亚甲蓝相对量为4:1(F组)时，三七总皂苷相对量的倍增(与E组)却意外地显示出明显下降的抑瘤率。

图4中，在三七总皂苷浓度≤0.25％时，1周抑瘤效应均随三七总皂苷浓度增加而平稳增加，但区别不明显。在三七总皂苷浓度大于0.25％后，1周抑瘤效应随浓度增加而快速增加。

一个针对荷肝癌细胞裸鼠(瘤体平均体积103mm³)的动物实验中，成功建模的试验动物随机分组为阴性对照组和7个研究组(A、B、C、D、E、F、G组)。阴性对照组瘤内注射生理盐水，研究组分别瘤内注射含1％亚甲蓝和不同浓度(0、0.125％、0.25％、0.5％、1％、2％、4％)黄芪多糖的组合物。研究药物均为按实施例一的制备方法配置，用药剂量均为50mg亚甲蓝类化合物/kg动物。用药结束后7日，对动物进行安乐死，解剖后测定抑瘤率。所得结果与图4中的结果类似。

在进一步的试验中，本发明的其它组合物(例如表2中的组合物)也显示出类似作用。

尽管原因不详，亚甲蓝类化合物/生物活性成分组合物显示出不同寻常的药学行为，即只有在以下三个条件同时具备时，其可以产生超有效活性:组织内给药，亚甲蓝类化合物给药浓度≥1.5％、优选≥2％；生物活性成分给药浓度>0.25％、优选≥0.5％。

此外，考虑到生物活性成分多有免疫增强作用，组合物还有可能产生有意义的长效活性。

4、超有效活性条件的安全性研究

在上述裸鼠实验期间，亚甲蓝类化合物/生物活性成分研究组在用药后的实验期间均未见裸鼠因给药死亡。与阴性对照组相比较，研究组中、尤其是利用上述超有效活性技术方案的研究组中注射部位均有明显的色泽变化和肌肉变性。这提示该应用条件确实引起了肌细胞的部分损伤。例如，通常认为1％亚甲蓝注射液以经不能用作局部注射，否则有安全性风险。在将其作局部给药时，均应尽可能稀释处理(吴伟标，不同浓度亚甲蓝在肛肠术后镇痛中的效果比较，北方药学2016年第13卷第10期，pp190-191)。然而，进一步的动物实验结果却出人意料。

取体重1.9～2.5kg新西兰兔，分为阴性对照组、临床药物对照组和3个研究组，每组6只动物。阴性对照组给药生理盐水，临床药物给药无水乙醇，研究组(A、B、C组)分别给药2％亚甲蓝/2％香菇硒多糖、3％亚甲蓝/2％香菇硒多糖、4％亚甲蓝/2％香菇硒多糖水溶液。各组动物均在右腿股四头肌注入1.0ml药物。24h后各组处死4只兔子，进行注射部位的病理切片检查，观察有无充血、水肿、变性、坏死等刺激现象。刺激反应评分标准:阴性记0分，可疑1分，轻度2分，强度3分，严重4分，极严重5分。局部刺激试验结果见表4。

表4

组别	刺激反应评分
		阴性对照组	0
临床药物对照组	3
		A组	0
B组	0
		C组	0

在表4中，出乎意料的是，在整个试验区间内，研究组各组并未观察到在裸鼠试验中出现的肌肉变性，也未观察到使用经典亚甲蓝类化合物经常出现的局部刺激(临床药物对照组)，其刺激反应评分总分更接近阴性对照组、而明显低于临床药物对照组，而且在本发明的组合物的刺激反应评分总分并未随亚甲蓝类化合物浓度变化而明显变化。

对各组剩下的4只动物继续观察，3周后各组处死剩下的兔子，纵向切开注射部位肌肉，观察注射部位。可见临床药物对照组及各研究组黏膜及浅肌层被弥漫增生的纤维结缔组织取代，组织已基本再生愈合，细胞密集呈梭形，呈束状排列。在整个试验区间内，研究组的再生愈合并未随浓度变化而明显变化，其所产生的组织损伤均是可同等修复的。

无水乙醇是现有技术中应用最为广泛的化学消融剂。与无水乙醇相比较,4％亚甲蓝/2％香菇硒多糖水溶液不仅在上述实验中显示出更低的局部刺激性，而且在另一个荷肝癌裸鼠实验(瘤体平均体积58mm³、药物瘤内注射量35ul)中显示出更高的抑瘤效果(无水乙醇抑瘤率71％、4％亚甲蓝/2％香菇硒多糖水溶液抑瘤率95％)。

在进一步的试验中，本发明的其它组合物(例如表2中的组合物)也显示出类似结果。

实施例4：进一步的增效技术方案研究

在一个针对荷肝癌细胞裸鼠的实验中，成功建模的试验动物(瘤体体积125mm³)随机分组为阴性对照组、阳性对照组(A组)和4个研究组(B、C、D、E组)。阴性对照物为生理盐水，阳性对照物为2％亚甲蓝/1％黄茋多糖水溶液，4个研究药物分别为2％亚甲蓝/1％黄茋多糖之外还含以下增效剂的水溶液:0.7％氯化亚铁、0.5％叶酸、2％纳米金刚石、2％氢氧化铝粒子。药物均为按实施例一的制备方法配置，注射剂量均为80mg亚甲蓝/kg动物。用药后7日，对动物进行安乐死，解剖后测定抑瘤率。表5给出结果。

表5

实施例5：动物模型的扩大化研究

针对多种荷癌细胞裸鼠(瘤体131-206mm3)的动物实验中，成功建模的试验动物随机分组。阴性对照组和研究组分别瘤内注射生理盐水和2％亚甲蓝/1％三七总皂苷水溶液。各研究组(A、B、C、D、E、F、G、I、H、J组)裸鼠所荷癌细胞分别如下:乳腺癌细胞(MDA-MB231)、肺癌细胞(A549)、甲状腺癌细胞(SW579)、前列腺癌细胞(LNCaP/AR)、胰腺癌细胞(PANC-1)、结肠癌细胞(COLO205)、头颈癌细胞(Fμda)、鼻咽癌细胞(CNE1)、胃癌细胞(BGC823)、卵巢癌细胞(PA1)。研究药物按实施例一的制备方法配置，注射剂量均为100mg亚甲蓝/kg动物。用药后7日，对动物进行安乐死，解剖后测定抑瘤率。表6给出结果。

表6

在使用实施1制备的其它组合物(例如表2中的其它组合物)时，也可以观察到与上述实验类似的结果。

具有局部病变症状的疾病、尤其是顽固性疾病的治疗通常以肿瘤为模型。因此，以肿瘤为模型所获的技术方案也适用于其它局部病变相关疾病。

与临床抗瘤药物(例如5-氟尿嘧啶)相比，本发明组合物中的亚甲蓝类化合物和生物活性成分都不是癌细胞的特异性药物,它们的抗肿瘤活性的构效关糸尚不清楚,通常都未归入细胞毒性药物。在体外癌细胞实验中,生物活性成分几乎未显示出对亚甲蓝类化合物抑制癌细胞增殖的明显协同作用。然而，在动物实验中,本发明的组合物在瘤内给药、也仅仅在瘤内给药时却显示出远超5-氟尿嘧啶的效果。

尽管不打算将本发明限于任何特定的原理，但认为在局部给药条件下，本发明的组合物产生了协同作用。考虑到体内、外的不同共用效果,该作用与其说是抗肿瘤细胞协同，不如说是化学消融协同。因而，以肿瘤为模型所获的技术方案，应该也适用于其它局部病变相关疾病，通常认为化学消融适用于这些疾病。

除本文中描述的那些外，根据前述描述，本发明的多种修改对本领域技术人员而言会是显而易见的。这样的修改也意图落入所附权利要求书的范围内。本申请中所引用的各参考文献(包括所有专利、专利申请、期刊文章、书籍及任何其它公开)均以其整体援引加入本文。

Claims (8)

1.一种用于预防和治疗哺乳动物局部病变相关疾病的药物组合物，其包含药学上可接受的亚甲蓝类化合物和生物活性成分，且其组成使得当该药物组合物被施用在所述局部病变后能够提供峰浓度>1％(w/v)的亚甲蓝类化合物，以及峰浓度>0.25％(w/v)的生物活性成分。

2.根据权利要求1的药物组合物，其中所述亚甲蓝类化合物的峰浓度为1.5-15％(w/v)、优选2-10％(w/v)或3-10％(w/v)，以及生物活性成分的峰浓度为0.3-15％(w/v)、优选0.5-10％(w/v)、1-6％(w/v)或1-4％(w/v)。

3.根据权利要求1的药物组合物，其为液体剂型，例如溶液剂、混悬剂或乳剂。

4.根据权利要求1的药物组合物，其为固体或半固体剂型，例如植入剂、药物释放支架、栓剂、霜剂、乳膏剂或凝胶剂。

5.根据权利要求1-4之一的药物组合物，其中所述生物活性成分为选自具有以下之一种或多种结构的活性生物提取物及其类似物：苷、多酚、多糖、萜类、黄酮。

6.根据权利要求5的药物组合物，其中所述生物活性成分为具有以下性质的活性成分：常温下在水中的均匀分散度大于5mg/ml、优选为大于10mg/ml。

7.根据权利要求5或6的药物组合物，其中所述生物活性成分包括以下生物提取物及其类似物的一种或多种：褐藻多糖硫酸脂酯、螺旋藻多糖、海藻硒多糖、人参多糖、党参多糖、黄茋多糖、香菇多糖、香菇硒多糖、茯苓多糖、猪苓多糖、灵芝多糖、云芝多糖、人参皂苷、三七总皂苷、虎杖皂苷、海参总皂苷、茶多酚、葛根黄酮、蜂胶黄酮。

8.根据权利要求1-7之一的药物组合物，其中所述生物活性成分和亚甲蓝类化合物的重量比为1:8-6:1、优选为1:4-4:1、更优选为大于1:4至小于4:1或大于1:4至小于2:1。