CN103690556B - 一种羟基喜树碱长循环脂质体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种羟基喜树碱长循环脂质体及其制备方法。所述的羟基喜树碱长循环脂质体，其制备原料由按重量计的羟基喜树碱1份、磷脂5~30份、胆固醇1~5份、TPGS？1~20份和泊洛沙姆188？1~8份组成。依据本发明制备得到的羟基喜树碱长循环脂质体粒径合适、包封率高，原料价廉，工艺简单，适宜工业化生产。

Description

一种羟基喜树碱长循环脂质体

技术领域

本发明涉及药物制剂领域，特别涉及一种羟基喜树碱长循环脂质体及其制备方法。

背景技术

羟基喜树碱（Hydroxycamptothecin，HCPT）是从我国特有植物喜树中提取的一种微量生物碱，由于其含量极其低微，现在更多的是通过在喜树碱的10位羟基化衍生而得到。喜树碱类化合物自从1966年被发现以来，由于其优异的抗肿瘤作用，一直被人们重视和关注。与喜树碱相比，羟基喜树碱具有抗癌疗效更高、毒副作用更少的优点，在胃癌、肝癌、白血病、乳腺癌、头颈部肿瘤的治疗中具有很强的应用价值，已在临床中广泛应用。

研究表明，喜树碱类化合物的抗肿瘤活性，主要是通过抑制肿瘤细胞拓扑异构酶I（TopoI）的活性而发挥作用。在肿瘤细胞DNA的复制过程中，TopoI能够和DNA形成一个二元复合物，使DNA的双螺旋结构结构在复制过程中有一个暂时的单链缺口，使复制能顺利进行下去。而喜树碱类化合物，可以和TopoI-DNA形成的二元复合物不可逆结合而生成“喜树碱-TopoI-DNA”三元复合物，从而打乱了DNA的复制进程，起到对肿瘤细胞的杀伤作用。

喜树碱类化合物的抗肿瘤活性与其特殊的化学结构紧密相关。在喜树碱的五个环状结构中，E环的内酯结构可能在与TopoI-DNA二元复合物的不可逆结合中起到关键作用，为喜树碱类化合物的关键药效基团。然而由于内酯结构的不稳定性，喜树碱类化学物存在着内酯形式与羧酸形式的平衡，只有在酸性条件下，才有利于内酯形式的存在。有文献（非专利文献1：JournalofPharmaceuticalSciences，1992，81：676-684）报道，在生物体内的pH条件下，超过80%的药物是以羧酸盐存在形式。对于羟基喜树碱来说，其水溶性极低，在pH4的条件下溶解度约为0.499mg/100mL。在pH7.4条件下由于羧酸形式增多，水溶性有所增加，但也仅为4.99mg/100mL，而此条件下，具有抗肿瘤疗效的内酯形式仅占16%，体内半衰期t_1/2也只有21分钟（非专利文献2：JournalofMedicinalChemistry，1993，36：2580-2582；非专利文献3：JournalofMedicinalChemistry，2008，51：1740-1746）。羟基喜树碱的上述不利特征，使其在临床中的应用受了一定限制。

为了改善羟基喜树碱的上述不利特点，增加抗肿瘤疗效，减轻毒副作用，人们相继将其制成钠盐、衍生物或前药等形式改善其水溶性。但是，目前的一些研究或已上市的一些药物制剂都存在着一些难以解决的问题。如在我国临床中广泛使用的“羟基喜树碱氯化钠注射液”或“注射用羟基喜树碱”，为了增加药物的水溶性，将其制成钠盐，虽然水溶性问题得到了解决，但带来了疗效降低、毒副作用增多等问题。利用前药或衍生物技术研制并已上市的药物伊立替康（Iriontecan，10-羟基-7-乙基喜树碱的水溶性前药）和托普替康（Topotecan，10-羟基-9-二甲胺基甲基喜树碱）也存在着体内作用时间短、需频繁给药等不利特点。因此，采用一些新型的药物递送系统改变药物在体内的动力学参数，达到增强药物疗效、缓释、靶向、减轻毒副作用等特点，是此类药物研发的一个重要方向。

脂质体是一种由磷脂双分子层构成的囊泡，其中包裹着水性内相。因为它的双亲特性，脂质体可作为载体包封大量不同物理化学性质的药物。另外，脂质体能保护被包封的药物避免外界因素（如光、pH以及酶等）的破坏，因此，脂质体被认为是最有前途的药物递送系统。但脂质体注射进入血液循环后，会被网状内皮系统（RES）从血中快速清除，这在肝和脾中特别明显。为了解决这一问题，人们研发了立体稳定脂质体，这种脂质体不易被RES所发现和捕获，比传统脂质体在体内循环时间更长，称为长循环脂质体或隐形脂质体。

虽然制备长循环脂质体有多种可选择的材料，如聚乙烯醇类、聚乙烯吡咯烷酮类、吐温类等，但采用聚乙二醇（PEG）对脂质体的表面进行亲水性修饰是一种最常见的选择。可用于修饰长循环脂质体的聚乙二醇-磷脂衍生物，常用的有聚乙二醇-磷脂酰胆碱（PEG-PC）、聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺（PEG-PE）、聚乙二醇-硬脂酰磷脂酰胆碱（PEG-DSPC）、聚乙二醇-硬脂酰磷脂酰乙醇胺（PEG-DSPE）等。这些聚乙二醇修饰的长循环材料，为全合成或半合成磷脂材料，生产工艺复杂，价格昂贵，极大地增加了生产成本和患者的经济负担。中国专利（专利文献1：申请公布号CN101889982A）公开了一种新型的长循环脂质体组合物及其制备方法，处方中采用聚乙二醇分子量为2000的维生素E聚乙二醇2000琥珀酸酯（TPGS2000）为长循环材料，取得了较好效果。但该专利中TPGS2000由于聚乙二醇链长的原因，与目前市售的聚乙二醇分子量为1000的TPGS有一定差别，目前尚无市售产品，难以广泛普及。另一中国专利（专利文献2：公开号CN101548951A）公开了一种羟基喜树碱纳米脂质体及其制备方法，该脂质体采用高压均质方法制备，其处方中采用了泊洛沙姆，由于泊洛沙姆型号众多，性质各异，该专利未公布其型号，难以应用，另外该专利处方中无长循环材料，属于普通脂质体的范畴。

发明内容

本发明的目的是要解决羟基喜树碱普通剂型的不足，提供一种既能提高羟基喜树碱的水溶性和稳定性，又具有一定的靶向性和缓释性的长循环脂质体。

本发明的技术方案如下：

本发明公开的一种羟基喜树碱长循环脂质体，其特征在于由羟基喜树碱、磷脂、胆固醇、维生素E聚乙二醇1000琥珀酸酯（TPGS）和泊洛沙姆188制成，各组分按重量计算分别为：羟基喜树碱1份，磷脂5~30份，胆固醇1~5份，TPGS1~20份，泊洛沙姆1881~8份。

进一步地，上述羟基喜树碱长循环脂质体，其处方组成优选为：羟基喜树碱1份，磷脂10~20份，胆固醇2~3份，TPGS3~5份，泊洛沙姆1882~3份。

本发明的一种羟基喜树碱长循环脂质体，其中磷脂可以是大豆卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、氢化蛋黄卵磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇或烷基醚磷脂酰胆碱中的一种或任意几种的混合物。

本发明通过下述制备方法和步骤完成：

（1）脂质薄膜的形成：按处方比例称取适当重量的羟基喜树碱、磷脂、胆固醇、TPGS、泊洛沙姆188，加入适量有机溶剂至溶解完全，然后将混合溶液转移入圆底烧瓶中，于40~65℃水浴条件下缓慢旋转减压蒸发，直到完全除去有机溶剂，形成均匀透明的薄膜。

（2）水化：在上述形成脂质薄膜的烧瓶中加入适量缓冲溶液，在氮气流保护下于40~65℃水浴条件下进行水化至溶液透明无不溶物，然后将水化物高压均质或用微孔膜挤出的方式制备得到脂质体混悬液。

（3）冷冻干燥：将上述脂质体混悬液采用聚偏氟乙烯膜过滤后，分装于容器中，冷冻干燥后得羟基喜树碱长循环脂质体固体。

上述的制备方法中，有机溶剂是选自氯仿、二氯甲烷、甲醇、乙醇中的一种或几种，优选是乙醇。

上述羟基喜树碱长循环脂质体在制备过程中加入缓冲溶液，该缓冲溶液是选自磷酸盐缓冲液、枸橼酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液中的一种或多种，优选是磷酸盐缓冲液或枸橼酸盐缓冲液。

本发明通过薄膜分散法制备的羟基喜树碱长循环脂质体，采用磷脂等膜性材料将羟基喜树碱包封入脂质体中，克服了药物在水中不溶的缺陷，能够显著增加制剂的载药剂量，而且其主要药物成份羟基喜树碱可定量缓慢释放，扩大了其应用范围。另外，本发明制备的羟基喜树碱长循环脂质体除了具有普通脂质体的优点，如提高药物的稳定性、延长药物作用时间，对淋巴系统具有靶向性外，还具有如下优点：

（1）提高羟基喜树碱脂质体的稳定性。将脂质体冷冻干燥后制成固体状态，可解决普通脂质体的聚集、沉降、融合、渗漏等不稳定性问题。制成的羟基喜树碱长循环脂质体可长期稳定放置，用前加水水合振荡即成普通脂质体。

（2）制备羟基喜树碱长循环脂质体采用的材料具有非常强的生物相容性。由于脂质体的制备采用磷脂等天然材料，与生物体细胞膜的结构非常类似，不会引起局部组织损伤和免疫抑制作用，不诱发过敏反应而能多次长期使用，对人体无毒害。

（3）特别地，本发明采用市场容易获得的TPGS作为脂质体的长循环材料，避免使用PEG-DSPC、PEG-DSPE、PEG-PC、PEG-PE等人工合成、价格昂贵的磷脂材料，可有效节约生产成本，减轻患者的经济负担。除此之外，TPGS还具有一定的抗肿瘤作用，可以作为羟基喜树碱的辅助物共同作用于肿瘤细胞，提高抗癌疗效。

（4）本发明的羟基喜树碱长循环脂质体，采用泊洛沙姆188作为脂质体的稳定材料，在脂质体的制备中尚不多见。泊洛沙姆是一种非离子型高分子表面活性剂，应用于脂质体可有效维护磷脂双分子层的稳定性，减轻药物泄漏现象。另外泊洛沙姆具有非常高的安全性，无刺激性和抗原性，是目前为数不多的可在注射剂型中使用的高分子药用辅料。除此之外，泊洛沙姆还具有抑制血栓形成、减轻炎症及组织损伤等药理作用，将其应用于羟基喜树碱长循环脂质体中，也将起到有益的作用。

（5）本发明的羟基喜树碱长循环脂质体，粒径在100~200nm之间，大小及分布合理，可发挥包括小尺寸效应和表面效应在内的纳米效应，可实现药物对肿瘤细胞和组织被动靶向输送的目的。

（6）本发明的羟基喜树碱长循环脂质体，克服了常规羟基喜树碱脂质体载药量和包封率低、批次间质量差异大等缺陷，批与批之间质量稳定，根据本发明制备的羟基喜树碱长循环脂质体包封率均在85%以上，优选方案包封率甚至可达93%。

本发明对制备所得的羟基喜树碱长循环脂质体的质量依据《中国药典》2010年版的有关要求进行了质量评价，评价方案主要包括脂质体的稳定性、粒径及分布范围、包封率、脂质体中药物含量、初步的体外及体内实验等性能测试，取得了有益的效果，具体结果通过下面的实施例加以详细说明。

具体实施方式

以下通过具体实施示例的形式对本发明的上述内容进行进一步的详细说明，但本发明的范围不仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均包含在本发明的范围之内。

实施例1：羟基喜树碱长循环脂质体的制备

处方组成为：羟基喜树碱0.4g，大豆卵磷脂7.5g，胆固醇1.0g，TPGS1.5g，泊洛沙姆1881.0g。

制备工艺

（1）脂质薄膜的形成：称取羟基喜树碱0.4g，大豆卵磷脂7.5g，胆固醇1.0g，TPGS1.5g，泊洛沙姆1881.0g于小烧杯中，加无水乙醇40ml，加入磁子轻轻搅拌至完全溶解得澄清溶液。将上述澄清混合溶液转入500ml圆底烧瓶中，加入玻璃珠少许，保持水浴温度为55℃，于旋转蒸发仪上缓慢旋转减压蒸发，至溶剂挥干后，继续真空蒸发2h直至完全除去有机溶剂，此时在烧瓶壁上形成均匀透明的脂质薄膜。

（2）水化：在上述形成脂质薄膜的烧瓶中加入磷酸盐缓冲溶液40ml，在氮气流保护下，于55℃水浴中适当缓慢搅拌进行水化，直至脂质薄膜全部脱落溶解，得到无不溶物呈半透明状的脂质体混悬液为止。然后将此脂质体混悬液通过高压均质机进行均质，制备得到粒径80~200nm的脂质体混悬液。

（3）冷冻干燥：将上述脂质体混悬液通过0.22μm的聚偏氟乙烯膜进行无菌过滤，分装于西林瓶中，进行冷冻干燥，干燥后的固体为淡黄色疏松状，往西林瓶中通入氮气，压盖密封，于冰箱中保存，即得羟基喜树碱长循环脂质体固体。

对实施例1制备得到的羟基喜树碱长循环脂质体进行质量评价，结果如下：

（1）脂质体的微观形态和粒径分布利用透射电镜观察脂质体的微观形态，采用负染法对样品进行前处理。由电镜图可见，制备得到的脂质体外观呈球形或近球形，结构完整，大小均一。同时，采用微粒粒度测定仪对其进行粒度测定，复溶后的羟基喜树碱脂质体粒度分布为48~175nm之间，平均粒径为125nm。

（2）脂质体的包封率测定利用Sephadex-G50葡聚糖的凝胶柱对复溶得到的脂质体进行洗脱分离，分离得到的脂质体混悬液加无水甲醇进行破乳，利用分光光度法测定药物的含量，从而计算羟基喜树碱的包封率。按照此方法进行测定，脂质体中羟基喜树碱的包封率为91.3%，RSD为1.2%（n=3）。

（3）脂质体稳定性考察将制备的羟基喜树碱脂质体在冰箱冷藏室放2个月后，外观没有发生明显改变，在0、10、20、30、60天时分别测定包封率为91.6%、89.4%、90.2%、88.3%、88.7%，实验表明，在此条件下脂质体稳定，可以在此条件下长期贮存。其长期稳定性试验中外观和复溶情况见表1所示。

实施例2：羟基喜树碱长循环脂质体的制备

处方组成为：羟基喜树碱0.3g，大豆卵磷脂3.0g，氢化大豆卵磷脂0.3g，胆固醇1.5g，TPGS1.5g，泊洛沙姆1882.0g。

制备工艺

（1）脂质薄膜的形成：称取羟基喜树碱0.3g，大豆卵磷脂3.0g，氢化大豆卵磷脂0.3g，胆固醇1.5g，TPGS1.5g，泊洛沙姆1882.0g于小烧杯中，加氯仿40ml，加入磁子轻轻搅拌至完全溶解得澄清溶液。将上述澄清混合溶液转入500ml圆底烧瓶中，加入玻璃珠少许，保持水溶温度为60℃，于旋转蒸发仪上缓慢旋转减压蒸发，至溶剂挥干后，继续真空蒸发3h，将烧瓶从旋转蒸发仪中取下放入真空干燥器中干燥过夜，直至完全除去有机溶剂。

（2）水化：在上述形成脂质薄膜的烧瓶中加入枸橼酸盐缓冲溶液40ml，在氮气流保护下，于60℃水浴中适当缓慢搅拌进行水化，间断超声处理，直至脂质薄膜全部脱落溶解，得到无不溶物呈半透明状的脂质体混悬液为止。然后将此脂质体混悬液依次通过0.8μm、0.45μm、0.22μm的微孔滤膜，得到粒径120~250nm的脂质体混悬液。

（3）冷冻干燥：将上述脂质体混悬液分装于西林瓶中，进行冷冻干燥，干燥后的固体为淡黄色疏松状，往西林瓶中通入氮气，压盖密封，于冰箱中保存，即得羟基喜树碱长循环脂质体固体。

按照实施例1所示的方法对实施例2制备所得的脂质体的进行质量评价，其粒径分布在120~250nm之间，平均粒径为160nm，三批样品的包封率为88.4%，RSD=1.8%（n=3）。其长期放置稳定性实验结果见表1所示。

实施例3：羟基喜树碱长循环脂质体的制备

处方组成为：羟基喜树碱1.0g，蛋黄卵磷脂19.0g，氢化大豆卵磷脂1.0g，胆固醇3.0g，TPGS5.0g，泊洛沙姆1882.5g。

制备工艺

（1）脂质薄膜的形成：称取羟基喜树碱1.0g，蛋黄卵磷脂19.0g，氢化大豆卵磷脂1.0g，胆固醇3.0g，TPGS5.0g，泊洛沙姆1882.5g于烧杯中，加无水乙醇100ml，加入磁子轻轻搅拌至完全溶解得澄清溶液。将上述澄清混合溶液转入1000ml圆底烧瓶中，以下步骤同实施例2中“脂质薄膜的形成”。

（2）水化：在上述形成脂质薄膜的烧瓶中加入磷酸盐缓冲溶液100ml，以下步骤同实施例2中“水化”。

（3）冷冻干燥：同实施例2中“冷冻干燥”。

按照实施例1所述方法对实施例3制备得到的脂质体进行质量评价，其粒径分布在90~180nm之间，平均粒径为160nm，平均包封率为90.2%，RSD=2.1%（n=3），其长期稳定性试验结果见表1所示。

表1羟基喜树碱长循环脂质体低温放置稳定性试验（2-10℃）

Claims (4)

1.一种羟基喜树碱长循环脂质体，其特征在于：所述羟基喜树碱长循环脂质体的制备原料按重量计由羟基喜树碱1份、磷脂5~30份、胆固醇1~5份、维生素E聚乙二醇1000琥珀酸酯（TPGS）1~20份和泊洛沙姆1881~8份组成。

2.如权利要求1所述的羟基喜树碱长循环脂质体，其特征在于制备所用原料按重量计优选为：羟基喜树碱1份，磷脂10~20份，胆固醇2~3份，TPGS3~5份，泊洛沙姆1882~3份。

3.如权利要求1所述的羟基喜树碱长循环脂质体，其中磷脂是大豆卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、氢化蛋黄卵磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇或烷基醚磷脂酰胆碱中的一种或任意几种的混合物。

4.如权利要求1所述的羟基喜树碱长循环脂质体，其特征在于所述羟基喜树碱长循环脂质体的制备包括如下步骤：

（1）脂质薄膜的形成：按处方比例称取适当重量的羟基喜树碱、磷脂、胆固醇、TPGS、泊洛沙姆188，加入适量有机溶剂至溶解完全，然后将混合溶液转移入圆底烧瓶中，于40~65℃水浴条件下缓慢旋转减压蒸发，直到完全除去有机溶剂，形成均匀透明的薄膜；

（2）水化：在上述形成脂质薄膜的烧瓶中加入适量缓冲溶液，在氮气流保护下于40~65℃水浴条件下进行水化至溶液透明无不溶物，然后将水化物高压均质或用微孔膜挤出的方式制备得到脂质体混悬液；

（3）冷冻干燥：将上述脂质体混悬液采用聚偏氟乙烯膜过滤后，分装于容器中，冷冻干燥后得羟基喜树碱长循环脂质体固体。