PT2828332T - Nanopartículas de quitosano duplamente derivado e métodos para produzir e utilizar as mesmas para transferência de gene in vivo - Google Patents

Nanopartículas de quitosano duplamente derivado e métodos para produzir e utilizar as mesmas para transferência de gene in vivo Download PDF

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Hsu Eric
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Description

DESCRIÇÃO
"NANOPARTÍCULAS DE QUITOSANO DUPLAMENTE DERIVADO E MÉTODOS PARA PRODUZIR E UTILIZAR AS MESMAS PARA TRANSFERÊNCIA DE GENE IN VIVO"
CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se, de modo geral, a nanopartículas que compreendem quitosano duplamente derivado e métodos para produzir e utilizar o mesmo para entrega de ácidos nucleicos, por exemplo, transferência de gene, in vivo.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 0 quitosano é um copolimero catiónico não tóxico de N-acetil-D-glucosamina e D-glucosamina. 0 quitosano pode formar um complexo com ácido nucleico e, como um polissacárido não tóxico e biocompativel, tem sido utilizado como um veiculo de entrega de ADN para transfetar células. Grande interesse tem sido focado na utilização de quitosano em entrega não virai de ácido nucleico devido às complexidades e toxicidade potencial do envelope virai. Vários complexos de quitosano/ADN, incluindo complexos entre ácidos nucleicos e quitosano modificado, têm sido examinados numa tentativa de identificar composições bem adequadas à transfeção de gene. Veja-se, por exemplo, os documentos sob os nos W02010/088565; W02008/082282.
Constatou-se que os complexos variam, entre outras propriedades, em solubilidade, propensão à agregação, estabilidade de complexo, tamanho de partícula, capacidade para libertar ADN e eficiência de transfeção. É fornecida no presente documento a constatação surpreendente de que a arginina e o ácido glucónico agem de modo sinérgico para aperfeiçoar a eficiência de transfeção de quitosano. A utilização de nanopartícuias à base de quitosano modificado com arginina para entrega de ácidos nucleicos é conhecida junto à Int. J. Pharmaceutics, 359, 2008, 241 a 246.
SUMARIO DA INVENÇÃO É revelada no presente documento a descoberta inesperada de que arginina e ácido glucónico aumentam de modo sinérgico a eficiência de transfeção de nanopartícuias de quitosano. Consequentemente, são fornecidas no presente documento composições inovadoras para facilitar a entrega de ácidos nucleicos a células, tecidos e órgãos, por exemplo, in vivo. Em particular, são fornecidas no presente documento nanopartículas à base de quitosano duplamente derivado, em que as referidas nanopartículas opcionalmente compreendem, ainda, ácido nucleico.
Numa modalidade, as nanopartículas compreendem quitosano que é acoplado pelo menos a um aminoácido. Numa modalidade preferencial, o aminoácido é positivamente carregado. Numa modalidade mais preferencial, o aminoácido é arginina.
Numa outra modalidade, as nanopartículas compreendem quitosano que é acoplado a um ácido orgânico, de preferência, a ácido glucónico.
Numa outra modalidade, as nanopartículas compreendem
quitosano que é acoplado tanto à arginina como ao ácido glucónico, veja-se, por exemplo, Fórmula I
em que n é um número inteiro de 1 a 2000, α é o grau de funcionalização de arginina, β é o grau de funcionalização de ácido glucónico; e cada R1 é independentemente selecionado a partir de hidrogénio, acetil, Fórmula (II) e Fórmula (III) .
O quitosano duplamente derivado, conforme descrito no presente documento, compreende arginina e ácido glucónico em percentagens de concentração inicial ou percentagem de funcionalização final variadas. A percentagem de concentração inicial é utilizada para quitosano modificado com ácido glucónico, que representa a razão molar do grupo carboxil em ácido glucónico dividido pelos grupos amina totais em quitosano ou quitosano modificado com arginina, enquanto que a percentagem de funcionalização final representa o grau de funcionalização de quitosano modificado final calculado a partir da razão de peso entre carbono e nitrogénio como resultado da análise elementar. Numa modalidade, o quitosano é acoplado com ácido glucónico a uma concentração inicial de cerca de 5% a cerca de 60%, por exemplo, cerca de 8% a cerca de 30%. Numa outra modalidade, de preferência, cerca de 30%. Numa outra modalidade, o quitosano é acoplado com arginina a uma concentração final de cerca de 10% a cerca de 55%.
Em particular, poliplexos de ácido nucleico de quitosano formados com tal quitosano duplamente derivado ("quitosano DD") exibem uma eficiência de transfeção maior do que os poliplexos de ácido nucleico formados com quitosano não funcionalizado ou quitosano que é conjugado a resíduos de aminoácidos únicos, polímeros de aminoácido ou resíduos de ácido glucónico isoladamente. Outras propriedades desejáveis conferidas pela utilização de quitosano duplamente funcionalizado em poliplexos descritos no presente documento incluem uma capacidade aperfeiçoada para penetrar na barreira mucosa, estabilidade de poliplexo otimizada, toxicidade celular reduzida e libertação intracelular de ácido nucleico otimizada. Adicionalmente, em algumas modalidades preferenciais, as presentes composições de poliplexo de quitosano DD podem ser administradas em pH fisiológico (por exemplo, administração sistémica).
Consequentemente, num aspeto, a invenção fornece poliplexos de ácido nucleico de quitosano DD. Os poliplexos de ácido nucleico de quitosano DD compreendem quitosano que é duplamente derivado com arginina e ácido glucónico.
Numa modalidade, o poliplexo de ácido nucleico de quitosano DD é formado num pH abaixo do pKa de quitosano DD.
Numa modalidade, o poliplexo de ácido nucleico de quitosano DD é formado num pH abaixo de 7.
Numa modalidade, o poliplexo de ácido nucleico de quitosano DD tem um grau combinado de funcionalização com arginina e ácido glucónico de 1 a 60%.
Numa modalidade, o poliplexo de ácido nucleico de quitosano DD tem um grau combinado de funcionalização com arginina e ácido glucónico de 1 a 30%.
Numa modalidade, a razão molar entre arginina e ácido glucónico no poliplexo de ácido nucleico de quitosano DD é entre 100:1 e 1:100.
Numa modalidade, a razão molar entre arginina e ácido glucónico no poliplexo de ácido nucleico de quitosano DD é entre 50:1 e 1:50.
Numa modalidade, a razão molar entre arginina e ácido glucónico no poliplexo de ácido nucleico de quitosano DD é entre 10:1 e 1:10.
Numa modalidade, a razão molar entre arginina e ácido glucónico no poliplexo de ácido nucleico de quitosano DD é entre 5:1 e 1:5.
Numa modalidade, a razão molar entre arginina e ácido glucónico no poliplexo de ácido nucleico de quitosano DD é entre 2:1 e 1:2.
Em modalidades preferenciais, a razão molar entre arginina e ácido glucónico é inversamente proporcional ao peso molecular do quitosano, isto é, um quitosano DD de peso molecular menor exige uma razão molar maior entre arginina e quitosano, e vice e versa.
Numa modalidade, o ácido nucleico do poliplexo de ácido nucleico de quitosano DD é ADN.
Numa modalidade, o ácido nucleico do poliplexo de ácido nucleico de quitosano DD é ARN.
Numa modalidade, o ácido nucleico do poliplexo de ácido nucleico de quitosano DD é um ácido nucleico artificial. Numa modalidade preferencial, o ácido nucleico artificial é selecionado do grupo que consiste em ácido nucleico de péptido (PNA), fosforodiamidato morfolino oligo (PMO), ácido nucleico bloqueado (LNA), ácido nucleico de glicol (GNA) e ácido nucleico de treose (TNA).
Numa modalidade, o ácido nucleico do poliplexo de ácido nucleico de quitosano DD é um ácido nucleico terapêutico. Numa modalidade, o ácido nucleico terapêutico é um ARN terapêutico. Numa modalidade preferencial, o ARN terapêutico é selecionado do grupo que consiste em ARN antissentido, siARN, ARN em grampo curto, micro ARN e ARN enzimático.
Numa modalidade, o ácido nucleico terapêutico é ADN.
Numa modalidade, o ácido nucleico terapêutico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína terapêutica.
Num aspeto, a invenção fornece uma composição que compreende uma pluralidade de poliplexos de ácido nucleico de quitosano DD.
Numa modalidade, a composição tem um pH entre 3,0 e 8,0, com mais preferência, entre 4,0 e 7,0, e com a máxima preferência, entre 4,5 e 6,5.
Num aspeto, a invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende um poliplexo de ácido nucleico de quitosano DD da invenção. Numa modalidade preferencial, o poliplexo de ácido nucleico de quitosano DD compreende um ácido nucleico terapêutico.
Num aspeto, a revelação fornece métodos para tratar doença, que compreendem a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica da invenção a um paciente.
Numa modalidade, a presente composição farmacêutica é administrada em pH fisiológico.
Numa modalidade, a presente composição farmacêutica é administrada de modo sistémico.
Numa modalidade, a presente composição farmacêutica é administrada localmente a um tecido alvo. Numa modalidade preferencial, a presente composição farmacêutica é administrada ao tecido mucoso. Numa modalidade, o tecido mucoso é tecido GI.
Num aspeto, a invenção fornece uma vacina, que compreende um poliplexo de ácido nucleico de quitosano DD, em que o ácido nucleico codifica um antigénio.
Num aspeto, a revelação fornece métodos para vacinação de um paciente. Os métodos compreendem a administração de uma vacina da invenção a um paciente.
Num aspeto, a invenção fornece uma composição imunogénica que compreende um poliplexo de ácido nucleico de quitosano DD, em que o ácido nucleico codifica um imunogénio.
Num aspeto, a revelação fornece métodos para iniciação ou aumento de uma resposta imunitária a uma molécula de interesse. Os métodos compreendem administrar uma composição imunogénica da invenção a um paciente, em que o ácido nucleico codifica um epítopo da molécula de interesse.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 é um fluxograma do processo de produção de quitosano duplamente derivado com arginina e ácido glucónico que leva a uma combinação ideal de graus de funcionalização entre dois componentes acoplados. A Figura 2 mostra a eficiência de transfeção (ng de SEAP/mg de proteína; eixo geométrico y) de quitosano de 24 mer acoplado com (A) ácido glucónico a uma concentração inicial (eixo geométrico x) de 10%, 30% ou 60% ou (B) arginina a um grau de funcionalização final (eixo geométrico x) de 9,7%, 12,3%, 26% ou 52%. A Figura 3 mostra a eficiência de transfeção (ng deS EAP/mg de proteína; eixo geométrico y) de poliplexos produzidos numa razão entre amina/fosfato (N/P) de 20 com quitosano de 24 mer que foi (A) duplamente acoplado com arginina e ácido glucónico a graus de funcionalização finais de 26% de arginina e 5% de ácido glucónico; (B) acoplado com arginina isoladamente ao grau de funcionalização final de 26% ou (C) acoplado com ácido glucónico isoladamente a uma concentração inicial de 30% de ácido glucónico em relação à amina total. A Figura 4 mostra a eficiência de transfeção (ng de SEAP/mg de proteína; eixo geométrico y) de poliplexos produzidos numa razão entre amina/fosfato (N/P) de 20 com quitosano de 24 mer acoplado com funcionalização final de 26% de arginina isoladamente (0%; eixo geométrico x) ou adicionalmente acoplado com ácido glucónico a graus de funcionalização finais de ácido glucónico de 3%, 5%, 6% e 9% (eixo geométrico x). A Figura 5 mostra o efeito de uma razão entre amina/fosfato (N/P) (eixo geométrico x) de 40 (N40), 20 (N20) ou 10 (N10) na eficiência de transfeção (ng de SEAP/mg de proteína; eixo geométrico y) de quitosano de 24 mer duplamente derivado com arginina e ácido glucónico em graus de funcionalização finais de 26% e 5%, respetivamente (caixas quadriculadas pequenas) ou quitosano acoplado com 26% de arginina isoladamente (caixas quadriculadas grandes). A Figura 6 mostra o efeito do pH da formulação (eixo geométrico x) na eficiência de transfeção (ng de SEAP/mg de proteína) de quitosano de 24 mer duplamente derivado com arginina e ácido glucónico em graus de funcionalização finais de 26% e 5%, respetivamente (caixas quadriculadas pequenas) ou quitosano acoplado com arginina apenas a um grau de funcionalização final de 26% (caixas quadriculadas grandes). A Figura 7 mostra o efeito da percentagem de funcionalização de arginina na eficiência de transfeção (ng de SEAP/mg de proteína; eixo geométrico y) por quitosano de 24 mer derivado com arginina a uma concentração final de 52% (A, B) ou 26% (C, D) isoladamente (A, C) ou também com ácido glucónico a uma concentração final de 8% (B) ou 6% (D) . 0 quitosano de 24 mer acoplado com ácido glucónico a 30% de concentração inicial isoladamente (E) também está incluído como uma referência. A Figura 8 mostra a eficiência de transfeção de quitosano de 24 mer duplamente derivado com arginina e ácido glucónico em graus de funcionalização finais de 26% e 5%, respetivamente (caixas quadriculadas pequenas) ou quitosano acoplado com 26% de arginina isoladamente (caixas quadriculadas grandes) em (A) células 293T, (B) linhagens de células humanas Hela ou HT1080 ou (C) linhagens de células NIH3T3 murinas ou VERO de macaco. A Figura 9 mostra a expressão de genes em músculo 2 dias após injeção intramuscular de quitosano (A) , quitosano funcionalizado com 26% de arginina (B) e quitosano duplamente funcionalizado com graus de funcionalização finais de 26% de arginina e 5% de ácido glucónico (C). A Figura 10 mostra a expressão de genes em cólon distai 2 dias após entrega colónica de quitosano (A) , quitosano funcionalizado com 26% de arginina (B) e quitosano duplamente funcionalizado com arginina e ácido glucónico em graus de funcionalização finais de 26% de arginina e 6% de ácido glucónico (C). A Figura 11 mostra eficiência de knockdown in vitro poliplexos de luciferase siRNA que compreendem quitosano de 24 mer produzido numa razão de amina/fosfato (N/P) de 40 e acoplado com (A) 26% de arginina isoladamente ou (B) duplamente derivado com 26% de arginina e ácido glucónico a um grau de funcionalização final de 5%. A Figura 12 mostra a propriedade fisico-quimica de poliplexos de ácido nucleico de quitosano DD liofilizado após reconstituição com água após 3 meses de armazenamento à temperatura ambiente.
DESCRIÇÃO DETALHADA O quitosano é a forma desacetilada de quitina, que é um polimero de N-acetil glucosamina que é o componente principal dos exosqueletos de crustáceos (por exemplo, camarão, caranguejo, lagosta). O quitosano é formado de quitina por meio de desacetilação, e como tal não é uma molécula polimérica única, mas uma classe de moléculas que têm diferentes pesos moleculares e graus diferentes de desacetilação. A percentagem de desacetilação em quitosanos comerciais é tipicamente entre 50 e 100%. Os derivados de quitosano descritos no presente documento são gerados por meio da funcionalização dos grupos amino livres resultantes com partes neutras ou positivamente carregadas, conforme descrito no presente documento. Os quitosanos derivados descritos no presente documento têm várias propriedades que são vantajosas para um veiculo de entrega de ácido nucleico incluindo: ligam e complexam de modo eficaz os ácidos nucleicos negativamente carregados, podem ser formados em nanoparticulas de um tamanho controlável, podem ser absorvidos pelas células e podem libertar os ácidos nucleicos no tempo apropriado dentro das células.
Os quitosanos com qualquer grau de desacetilação maior que 50% são utilizados na presente invenção, com funcionalização entre 1% e 50%. (A percentagem de funcionalização é determinada em relação ao número de partes de amino livre no polímero de quitosano.) Os graus de desacetilação e funcionalização conferem uma densidade de carga específica para o derivado de quitosano funcionalizado. A densidade de carga resultante afeta a solubilidade, ligação de ácido nucleico e libertação subsequente, e interação com membranas de célula de mamífero. Desse modo, de acordo com a presente invenção, essas propriedades precisam ser otimizadas para a eficácia ideal. Os derivados de quitosano exemplificadores são descritos em Baker et al; 11/657,382 depositado em 24 de janeiro de 2007, que está incorporado ao presente documento a título de referência. Numa modalidade, o quitosano duplamente derivado descrito no presente documento compreende quitosano que tem um grau de desacetilação de pelo menos 50%. Numa modalidade, o grau de desacetilação é de pelo menos 60%, com mais preferência, pelo menos 70%, com mais preferência, pelo menos 80%, com mais preferência, pelo menos 90%, e com a máxima preferência, pelo menos 95%. Numa modalidade preferencial, o quitosano duplamente derivado descrito no presente documento compreende quitosano que tem um grau de desacetilação de pelo menos 98%.
Os derivados de quitosano descritos no presente documento têm uma faixa de pesos moleculares médios que são solúveis em pH neutro e fisiológico, e incluem de acordo com os propósitos desta invenção pesos moleculares que se situa na faixa de 3 a 110 kDa. As modalidades descritas no presente documento apresentam peso molecular médio menor de quitosanos derivados (<25 kDa, por exemplo, de cerca de 5 kDa a cerca de 25 kDa) , que pode ter propriedades de transfeção e entrega desejáveis, e são pequenos em tamanho e têm solubilidades favoráveis. Um quitosano derivado de peso molecular médio menor é em geral mais solúvel que um com peso molecular maior, sendo que o primeiro produz assim um complexo de ácido nucleico/quitosano que irá libertar mais facilmente o ácido nucleico e fornecer transfeção aumentada de células. Bastante literatura tem sido dedicada à otimização de todos estes parâmetros para sistemas de entrega à base de quitosano.
Um perito na especialidade reconhecerá que quitosano refere-se a uma pluralidade de moléculas que têm uma estrutura da Fórmula I, em que n é qualquer número inteiro, e cada R1 é hidrogénio. Além disso, o quitosano mencionado como tendo um peso molecular médio, por exemplo, de 3 kD a 110 kD, em geral refere-se a uma pluralidade de moléculas de quitosano que têm um peso molecular médio ponderai de, por exemplo, 3 kD a 110 kD, respetivamente, em que cada uma das moléculas de quitosano pode ter comprimentos de cadeia diferentes (n+2). É facto reconhecido, também, que o quitosano mencionado como "quitosano de n-mer" não compreende necessariamente moléculas de quitosano da Fórmula I, em que cada molécula de quitosano tem um comprimento de cadeia de n+2. De preferência, "quitosano de n-mer", para utilização no presente documento, refere-se a uma pluralidade de moléculas de quitosano, cada uma das quais pode ter comprimentos de cadeia diferentes, em que a pluralidade tem um peso molecular médio substancialmente semelhante a ou igual a uma molécula de quitosano que tem um comprimento de cadeia de n. Por exemplo, quitosano de 24-mer pode compreender uma pluralidade de moléculas de quitosano, sendo que cada uma tem comprimentos de cadeia diferentes que se situam na faixa de, por exemplo, 7 a 50, mas que tem um peso molecular médio ponderai substancialmente semelhante ou equivalente a uma molécula de quitosano que tem um comprimento de cadeia de 24.
Os derivados de quitosano funcionalizados descritos no presente documento são compostos de quitosano duplamente derivados, por exemplo, compostos de quitosano-arginina-ácido glucónico. Em geral, os compostos de quitosano-arginina-ácido glucónico têm a seguinte estrutura da Fórmula I
em que n é um número inteiro de 1 a 2000, α é ο grau de funcionalização de arginina, β é o grau de funcionalização de ácido glucónico; e cada R1 é independentemente selecionado a partir de hidrogénio, acetil, Fórmula (II) e Fórmula (III) .
Um método preferencial para conjugação de quitosano com arginina ou ácido glucónico num meio aquoso, de acordo com a presente invenção, é descrito no presente documento, em que Boc-L-arginina (Boc-R) e ácido glucónico (Gluco) são utilizados. 0 método utiliza l-Etil--3-(3-
Dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) solúvel em água e N-hidroxi succinimida (NHS) bem conhecidos para catalisar a formação de amida entre uma amina na cadeia principal de quitosano e um ácido carboxilico em Boc-R ou ácido glucónico.
Em geral, quitosano em solução de HC1 diluída com um pH ajustado para um pH de acoplamento direcionado de, por exemplo, 6,0 ± 0,5 e, com mais preferência, 6,0 ± 0,2, é primeiramente acoplado a Boc-R ou Gluco, purificado e, então, acoplado com o segundo grupo funcional. Por exemplo, se o quitosano for primeiramente acoplado à arginina, o quitosano acoplado à arginina (R-quitosano) pode ser purificado e, então, acoplado ao ácido glucónico. Por outro lado, se o quitosano for primeiramente acoplado ao ácido glucónico, o ácido quitosano acoplado ao glucónico (gluco-quitosano) pode ser purificado e, então, acoplado à arginina. Independentemente da ordem de acoplamento, a arginina e o ácido glucónico podem ser acoplados ao quitosano com a utilização de métodos bem conhecidos.
Por exemplo, a arginina pode ser acoplada ao quitosano ou quitosano gluco-funcionalizado (gluco-quitosano) por meio da adição de uma mistura de Boc-R e solução aquosa de NHS de pH ajustado no quitosano em HC1 diluído seguido da adição de solução aquosa de EDC para iniciar o acoplamento à temperatura ambiente durante 24 horas. A concentração de amina de quitosano, pH da reação e as razões molares de R-COOH em relação a quitosano-amina e EDC:NHS:R-COOH podem ser pré-calculados e satisfeitos para ter grau de funcionalização final reproduzível de arginina. Boc-R-quitosano pode ser purificado antes da reação De-Boc. De-Boc pode prosseguir em meio de HC1 com uma concentração de HC1 e tempo de reação controlados. Qualquer despolimerização de quitosano durante de-Boc pode ser monitorada mediante a medição da viscosidade da solução de reação, que foi comprovada como sendo insignificante, e a eficiência de de-Boc pode ser verificada por RMN de protões em de-Boc-R-quitosano e Boc-R-quitosano. 0 grau de funcionalização pode ser determinado a partir da análise elementar de C, N do de-Boc-R-quitosano purificado. 0 ácido glucónico pode ser acoplado ao quitosano ou quitosano acoplado à arginina (R-quitosano) num pH de reação de 6,0 ± 0,3. Neste pH, o grupo ácido carboxílico de ácido glucónico pode ser atacado por aminas não acopladas na cadeia principal de quitosano de acordo com um mecanismo de reação de substituição nucleofílica. Um perito na especialidade reconhecerá que, mediante o acoplamento de ácido glucónico a R-quitosano, também é possível que uma pequena quantidade de ácido glucónico possa formar uma ligação covalente com o grupo amina de arginina através do mesmo mecanismo, embora seja provável que a reação de substituição nucleofílica ocorra predominantemente com o grupo amina da cadeia principal de quitosano. Como tal, em certas modalidades, R1 da Fórmula I também pode ser independentemente selecionado a partir de hidrogénio, acetil, Fórmula (II), Fórmula (III) e Fórmula (IV).
Boc-R-quitosano, de-Boc-R-quitosano, gluco-quitosano e/ou quitosano duplamente derivado pode ser purificado através de precipitação, tratamento de coluna, diálise regular, diálise de fluxo inverso contra água Milli-Q com a utilização de tubagem de diálise de celulose de corte de peso molecular adequado (MWCO) ou através de uma filtração de fluxo tangencial (TFF) e cartuchos de diafiltração.
Consequentemente, "quitosano duplamente derivado" ou "quitosano DD" também se refere a quitosano que foi duplamente funcionalizado ("quitosano duplamente funcionalizado" ou "quitosano DF"), por exemplo, acoplado tanto com arginina como com ácido glucónico, dos guais ambos são covalentemente fixados ao guitosano. A arginina pode ser covalentemente fixada ao guitosano como aminoácido único ou como um polipéptido.
Para utilização no presente documento, exceto onde indicado em contrário, o termo "péptido" e "polipéptido" são utilizados de forma intercambiável. 0 termo "polipéptido" é utilizado no seu sentido mais amplo para se referir a polipéptidos convencionais (isto é, polipéptidos curtos gue contêm L ou D-aminoácidos), bem como eguivalentes de péptido, análogos de péptido e peptidomiméticos que retêm a atividade funcional desejada. Os equivalentes de péptido podem diferir de péptidos convencionais pela substituição de um ou mais aminoácidos por ácidos orgânicos relacionados, aminoácidos ou semelhantes, ou pela substituição ou modificação de cadeias laterais ou grupos funcionais.
Os peptidomiméticos podem ter uma ou mais ligações de péptido substituídas por uma ligação alternativa, conforme é conhecido na técnica. Porções ou toda a cadeia principal de péptido também pode ser substituída por substituintes de aril ou alquil cíclico conformacionalmente constritos para restringir a mobilidade das cadeias laterais de aminoácido funcional, conforme é conhecido na técnica.
Os polipéptidos desta revelação podem ser produzidos por métodos reconhecidos, como métodos recombinantes e sintéticos que são bem conhecidos na técnica. As técnicas para a síntese de péptidos são bem conhecidas e incluem aquelas descritas em Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149 a 2456 (1963), Atherton, et al., Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press (1989) e Merrifield, Science 232:341 a 347 (1986).
Para utilização no presente documento, "polipéptido linear" refere-se a um polipéptido que é desprovido de grupos de ramificação covalentemente fixados a suas cadeias laterais de aminoácido constituinte. Para utilização no presente documento, "polipéptido ramificado" refere-se a um polipéptido que compreende grupos de ramificação covalentemente fixados a suas cadeias laterais de aminoácido constituinte.
Para utilização no presente documento, o termo "aminoácido" inclui aminoácidos de ocorrência natural, bem como aminoácidos de ocorrência não natural, como análogos de aminoácido. 0 termo "aminoácido" refere-se a (D) ou (L) aminoácidos de ocorrência natural, aminoácidos quimicamente modificados, aminoácidos de ocorrência natural, como norleucina e compostos quimicamente sintetizados que têm propriedades conhecidas na técnica como sendo caracteristicas de um aminoácido.
Os residuos de aminoácidos em péptidos são abreviados conforme é o padrão na técnica.
Em algumas modalidades, onde adequado, o quitosano DD inclui derivados de quitosano DD, por exemplo, quitosano DD que incorpora uma funcionalização adicional, por exemplo, quitosano DD com um ligante fixado. "Derivados" será entendido como incluindo a ampla categoria de polímeros à base de quitosano que compreendem unidades de N-acetil-D-glucosamina e/ou D-glucosamina covalentemente modificadas, bem como polímeros à base de quitosano que incorporam outras unidades, ou fixados a outras partes. Os derivados são frequentemente à base de uma modificação do grupo hidroxilo ou do grupo amina de glucosamina, como feito com quitosano funcionalizado com arginina. Os exemplos de derivados de quitosano incluem, porém sem limitação, quitosano trimetilado, quitosano PEGuilado, quitosano tiolado, quitosano galactosilado, quitosano alquilado, quitosano incorporado em PEI, quitosano modificado com ácido urónico, glicol quitosano e semelhantes. Para instrução adicional sobre derivados de quitosano veja-se, por exemplo, páginas 63 a 74 de "Non-viral Gene Therapy", K. Taira, K. Kataoka, T. Niidome (editores), Springer-Verlag Tokyo, 2005, ISBN 4-431-25122-7; Zhu et al., Chinese Science Bulletin, dezembro de 2007, vol. 52 (23), páginas 3207 a 3215; e Varma et al. , Carbohydrate Polymers 55 (2004) 77 a 93.
Os sistemas dispersos consistem em material particulado, conhecido como a fase dispersa, distribuído por todo um meio contínuo. Uma "dispersão" de poliplexos de ácido nucleico de quitosano DD é uma composição que compreende poliplexos de ácido nucleico de quitosano DD hidratados, em que os poliplexos são distribuídos por todo o meio.
Para utilização no presente documento, uma dispersão "pré-concentrada" é aquela que não foi submetida ao processo de concentração para formar uma dispersão concentrada.
Para utilização no presente documento, "substancialmente isento" de precipitado de poliplexo significa que a composição é essencialmente isenta de partículas que podem ser observadas em inspeção visual.
Para utilização no presente documento, pH fisiológico refere-se a um pH entre 6 e 8. 0 termo "poliplexo de ácido nucleico de quitosano DD" ou seus equivalentes gramáticos refere-se a um complexo que compreende uma pluralidade de moléculas de quitosano DD e uma pluralidade de moléculas de ácido nucleico. Numa modalidade preferencial, o quitosano duplamente derivado é complexado com o referido ácido nucleico.
Os poliplexos de ácido nucleico de quitosano DD compreendem um componente de ácido nucleico e um componente de quitosano DD. 0 quitosano e poliplexos de ácido nucleico de quitosano DD podem ser preparados por meio de qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, as concentrações de matéria-prima de nucleótido e quitosano funcionalizado podem ser ajustadas para acomodar diversas razões de amina-tofosfato (N/P), razões de mistura e concentrações de nucleótido alvo. Em algumas modalidades, lotes particularmente pequenos, por exemplo, lotes sob 2 mL, as matérias-primas de nucleótido e quitosano funcionalizado podem ser misturadas gotejando-se lentamente a matéria-prima de nucleótido na matéria-prima de quitosano funcionalizado mediante o vórtice no recipiente. Em outras modalidades, as matérias-primas de nucleótido e quitosano funcionalizado podem ser misturadas por meio de mistura em linha dos dois fluxos de fluido. Em outras modalidades, a dispersão de poliplexo resultante pode ser concentrada por TFF. Um método preferencial para a formação de poliplexo é revelado no documento sob o n° W02009/039657.
Um ácido nucleico da presente revelação irá conter, em geral, ligações de fosfodiéster, embora em alguns casos sejam incluídos análogos de ácido nucleico que têm cadeias principais alternativas ou outras modificações ou partes incorporadas para qualquer um de uma variedade de propósitos, por exemplo, estabilidade e proteção. Outros ácidos nucleicos análogos contemplados incluem aqueles com cadeias principais de não ribose. Além disso, as misturas de ácidos nucleicos de ocorrência natural, análogos e ambos podem ser feitas. Os ácidos nucleicos podem ser de filamento duplo ou filamento simples ou conter porções tanto de sequência de filamento duplo como filamento simples. Os ácidos nucleicos incluem, porém sem limitação, ADN, ARN e híbridos em que o ácido nucleico contém qualquer combinação de desoxirribo- e ribo-nucleótidos, e qualquer combinação de bases, incluindo uracilo, adenina, timina, citosina, guanina, inosina, xatanina hipoxatanina, isocitosina, isoguanina, etc. Os ácidos nucleicos incluem ADN em qualquer forma, ARN em qualquer forma, incluindo triplex, duplex ou de filamento simples, antissentido, siRNA, ribozimas, desoxirribozimas, polinucleótidos, oligonucleótidos, quimeras, microARN e derivados dos mesmos. Os ácidos nucleicos incluem ácidos nucleicos artificiais, incluindo, porém sem limitação, ácido nucleico de péptido (PNA), fosforodiamidato morfolino oligo (PMO), ácido nucleico bloqueado (LNA), ácido nucleico de glicol (GNA) e ácido nucleico de treose (TNA).
Numa modalidade, o componente de ácido nucleico compreende um ácido nucleico terapêutico. Os presentes poliplexos de ácido nucleico de quitosano DD são suscetíveis à utilização de qualquer ácido nucleico terapêutico conhecido na técnica. Os ácidos nucleicos terapêuticos incluem ARNs terapêuticos, que são moléculas de ARN com capacidade para exercer um efeito terapêutico numa célula de mamífero. Os ARNs incluem, porém sem limitação, ARNs antissentido, siARNs, ARNs em grampo curto, micro ARNs e ARNs enzimáticos. Os ácidos nucleicos terapêuticos incluem, porém sem limitação, ácidos nucleicos destinados a formar moléculas de triplex, ácidos nucleicos de ligação de proteína, ribozimas, desoxirribozimas e molécula de nucleótido pequenas.
Muitos tipos de ARNs terapêuticos são conhecidos na técnica. Por exemplo, veja-se Grimm et al., Therapeutic application of RNAi: is mRNA targeting finally ready for prime time? J. Clin. Invest., 117:3633 a 3641, 2007; Aagaard et al., RNAi therapeutics: Principles, prospects and challenges, Adv. Drug Deliv. Rev., 59:75 a 86, 2007; Dorsett et al., siARNs: Applications in functional genomics and potential as therapeutics, Nat. Rev. Drug Discov., 3:318 a 329, 2004. Estes incluem ARN de interferência curta de filamento duplo (siRNA).
Os ácidos nucleicos terapêuticos também incluem ácidos nucleicos que codificam proteínas terapêuticas, incluindo proteínas citotóxicas e pró-fármacos.
Numa modalidade preferencial, o componente de ácido nucleico compreende um constructo de ácido nucleico terapêutico. O constructo de ácido nucleico terapêutico é um constructo de ácido nucleico com capacidade para exercer um efeito terapêutico. Os constructos de ácido nucleico terapêutico podem compreender ácidos nucleicos que codificam proteínas terapêuticas, bem como ácidos nucleicos que produzem transcrições que são ARNs terapêuticos. Um ácido nucleico terapêutico pode ser utilizado para efetuar terapia genética servindo como uma substituição ou intensificação para um gene defeituoso ou para compensar a falta de um produto de gene particular, mediante a codificação de um produto terapêutico. Um ácido nucleico terapêutico também pode exibir a expressão de um gene endógeno. Um ácido nucleico terapêutico pode codificar todo ou uma porção de um produto de tradução, e pode funcionar por meio da recombinação com ADN já presente numa célula, substituindo, assim, uma porção defeituosa de um gene. Também pode codificar uma porção de uma proteína e exercer o seu efeito em virtude da cossupressão de um produto de gene. Numa modalidade preferencial, o ácido nucleico terapêutico é selecionado daqueles revelados em U.S.S.N. 11/694852.
Numa modalidade preferencial, o ácido nucleico terapêutico codifica uma proteína terapêutica que é selecionada do grupo que consiste em hormonas, enzimas, citocinas, quimocinas, anticorpos, fatores mitogénicos, fatores de crescimento, fatores de diferenciação, fatores que influenciam angiogénese, fatores que influenciam a formação de coágulo sanguíneo, fatores que influenciam níveis de glucose sanguíneo, fatores que influenciam o metabolismo de glucose, fatores que influenciam metabolismo de lípido, fatores que influenciam níveis de colesterol sanguíneo, fatores que influenciam níveis de LDL ou HDL sanguíneo, fatores que influenciam a apoptose celular, fatores que influenciam a ingestão de alimento, fatores que influenciam gasto de energia, fatores que influenciam o apetite, fatores que influenciam a absorção de nutriente, fatores que influenciam a inflamação e fatores que influenciam a formação de osso. São particularmente preferenciais os ácidos nucleicos terapêuticos que codificam insulina, leptina, antagonista de glucagom, GLP-1, GLP-2, grelina, colecistocinina, hormona do crescimento, fatores de coagulação, PYY, eritropoietina, inibidores de inflamação, antagonistas de IL-10, IL-17, antagonistas de TNFa, hormona de libertação de hormona do crescimento ou hormona paratiroide.
Regiões de Controlo de Expressão
Numa modalidade preferencial, um poliplexo da invenção compreende um ácido nucleico terapêutico, que é um constructo terapêutico, que compreende uma região de controlo de expressão ligada de maneira funcional a uma região de codificação. 0 construto terapêutico produz ácido nucleico terapêutico que pode ser terapêutico por si mesmo ou pode codificar uma proteína terapêutica.
Em algumas modalidades, a região de controlo de expressão de um constructo terapêutico possui atividade constitutiva. Em diversas modalidades preferenciais, a região de controlo de expressão de um constructo terapêutico não tem atividade constitutiva. Isto fornece a expressão dinâmica de um ácido nucleico terapêutico. 0 termo expressão "dinâmica" refere-se à expressão que se altera ao longo do tempo. A expressão dinâmica pode incluir vários períodos de expressão baixa ou ausente separados por períodos de expressão detetável. Em diversas modalidades preferenciais, o ácido nucleico terapêutico é funcionalmente ligado a um promotor regulável. Isto fornece a expressão regulável de ácidos nucleicos terapêuticos.
As regiões de controlo de expressão compreendem polinucleótidos reguladores (às vezes mencionados no presente documento como elementos), como promotores e intensificadores, que influenciam a expressão de um ácido nucleico terapêutico funcionalmente ligado.
Os elementos de controlo de expressão incluídos no presente documento podem ser a partir de bactérias, levedura, planta ou animal (mamífero ou não mamífero). As regiões de controlo de expressão incluem sequências de comprimento total, como elementos de intensificador e promotor nativo, bem como subsequências ou variantes de polinucleótido que retêm toda ou parte da função de não variante ou comprimento total (por exemplo, retêm alguma quantidade de regulação de nutriente ou expressão específica de célula/tecido). Para utilização no presente documento, o termo "funcional" e variantes gramaticais do mesmo, quando utilizado em referência a uma sequência, subsequência ou fragmento de ácidos nucleicos, significa que a sequência tem uma ou mais funções de sequência de ácidos nucleicos nativa (por exemplo, sequência não modificada ou não variante). Para utilização no presente documento, o termo "variante" significa uma substituição, deleção ou adição de sequência, ou outra modificação (por exemplo, derivados químicos como formas modificadas resistentes a nucleases).
Para utilização no presente documento, o termo "ligação funcional" refere-se a uma justaposição física dos componentes assim descritos para permitir que os mesmos funcionem em sua maneira pretendida. No exemplo de um elemento de controlo de expressão em ligação funcional com um ácido nucleico, a relação é de modo que o elemento de controlo module a expressão do ácido nucleico. Tipicamente, uma região de controlo de expressão que modula a transcrição é justaposta próximo à extremidade 5' do ácido nucleico transcrito (isto é, "a montante") . As regiões de controlo de expressão também podem estar situadas na extremidade 3' da sequência transcrita (isto é, "a jusante") ou dentro da transcrição (por exemplo, num intrão). Os elementos de controlo de expressão podem estar situados a uma distância da sequência transcrita (por exemplo, 100 a 500, 500 a 1000, 2000 a 5000, ou mais nucleótidos do ácido nucleico). Um exemplo especifico de um elemento de controlo de expressão é um promotor, que está normalmente situado 5' da sequência transcrita. Um outro exemplo de um elemento de controlo de expressão é um intensificador, que pode estar situado 5' ou 3' da sequência transcrita, ou dentro da sequência transcrita.
Algumas regiões de controlo de expressão conferem expressão regulável a um ácido nucleico terapêutico ligado de maneira funcional. Um sinal (às vezes mencionado como um estimulo) pode aumentar ou diminuir a expressão de um ácido nucleico terapêutico ligado de maneira funcional a tal região de controlo de expressão. Tais regiões de controlo de expressão que aumentam a expressão em resposta a um sinal são muitas vezes mencionadas como induziveis. Tais regiões de controlo de expressão que diminuem a expressão em resposta a um sinal são muitas vezes mencionadas como reprimíveis. Tipicamente, a quantidade de aumento ou diminuição conferida por tais elementos é proporcional à quantidade de sinal presente; quanto maior a quantidade de sinal, maior o aumento ou diminuição em expressão.
Inúmeros promotores reguláveis são conhecidos na técnica. As regiões de controlo de expressão induziveis preferenciais incluem aquelas que compreendem um promotor induzível que é estimulado com um composto químico de molécula pequena. Numa modalidade, uma região de controlo de expressão é responsiva a um produto químico que é oralmente passível de entrega, mas não é encontrado normalmente no alimento. Os exemplos particulares podem ser encontrados, por exemplo, nas patentes nos U.S. 5,989,910; 5,935,934; 6,015,709; e 6,004,941.
Numa modalidade, o constructo terapêutico compreende, adicionalmente, uma sequência de integração. Numa modalidade, o constructo terapêutico compreende uma única sequência de integração. Numa outra modalidade, o constructo terapêutico compreende uma primeira e uma segunda sequência de integração para integrar o ácido nucleico terapêutico ou uma porção do mesmo no genoma de uma célula alvo. Numa modalidade preferencial, a sequência (ou sequências) de integração é funcional em combinação com um meio para a integração que é selecionado do grupo que consiste em mariner, sleeping beauty, FLP, Cre, Φ031, R, lambda, e meios para integração a partir de vírus de integração como AAV, retrovirus e lentivírus.
Numa modalidade, a presente composição compreende, adicionalmente, um constructo não terapêutico em adição a um constructo terapêutico, em que o constructo não terapêutico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um meio para integração ligado de maneira funcional a uma segunda região de controlo de expressão. Esta segunda região de controlo de expressão e a região de controlo de expressão ligada de maneira funcional ao ácido nucleico terapêutico podem ser iguais ou diferentes. O meio codificado para integração é, de preferência, selecionado do grupo que consiste em mariner, sleeping beauty, FLP, Cre, Φ031, R, lambda, e meios para integração a partir de vírus de integração como AAV, retrovirus e lentivírus.
Para instrução adicional, veja-se o documento sob o n° W0200802031 8. Numa modalidade, o ácido nucleico do poliplexo de ácido nucleico de quitosano DD é um ácido nucleico artificial.
Os ácidos nucleicos artificiais preferenciais incluem, porém sem limitação, ácido nucleico de péptido (PNA), fosforodiamidato morfolino oligo (PMO), ácido nucleico bloqueado (LNA), ácido nucleico de glicol (GNA) e ácido nucleico de treose (TNA).
Numa modalidade, o ácido nucleico do poliplexo de ácido
nucleico de quitosano DD é um ácido nucleico terapêutico. Numa modalidade, o ácido nucleico terapêutico é um ARN terapêutico. Os ARNs terapêuticos preferenciais incluem, porém sem limitação, ARN antissentido, siARN, ARN em grampo curto, micro ARN e ARN enzimático.
Numa modalidade, o ácido nucleico terapêutico é ADN.
Numa modalidade, o ácido nucleico terapêutico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína terapêutica.
Poliplexos
Numa modalidade preferencial, os poliplexos das composições compreendem moléculas de quitosano que têm um peso molecular médio menor que 110 kDa, com mais preferência, menor que 65 kDa, com mais preferência, menor que 50 kDa, com mais preferência, menor que 40 kDa, e com a máxima preferência, menor que 30 kDa antes da funcionalização. Em algumas modalidades, os poliplexos das composições compreendem quitosano que tem um peso molecular médio menor que 15 kDa, menor que 10 kDa, menor que 7 kDa ou menor que 5 kDa antes da funcionalização.
Numa modalidade preferencial, os poliplexos compreendem moléculas de quitosano que têm em média menos que 680 unidades de monómero de glucosamina, com mais preferência, menos que 400 unidades de monómero de glucosamina, com mais preferência, menos que 310 unidades de monómero de glucosamina, com mais preferência, menos que 250 unidades de monómero de glucosamina, e com a máxima preferência, menos que 190 unidades de monómero de glucosamina. Em algumas modalidades, os poliplexos compreendem moléculas de quitosano que têm em média menos que 95 unidades de monómero de glucosamina, menos que 65 unidades de monómero de glucosamina, menos que 45 unidades de monómero de glucosamina ou menos que 35 unidades de monómero de glucosamina.
Numa modalidade preferencial, os presentes poliplexos têm razão entre amina e fosfato (N/P) de 2 a 100, por exemplo, 2 a 50, por exemplo, 2 a 40, por exemplo, 2 a 30, por exemplo, 2 a 20, por exemplo, 2 a 5. De preferência, a razão de N/P é inversamente proporcional ao peso molecular do quitosano, isto é, um quitosano DD de peso molecular menor exige uma razão de N/P maior, e vice e versa.
Numa modalidade preferencial, os presentes poliplexos têm um diâmetro hidrodinâmico médio menor que 1000 nm, com mais preferência, menor que 500 nm e com a máxima preferência, menor que 200 nm.
Numa modalidade, os poliplexos de ácido nucleico de quitosano DD têm um potencial zeta médio de pelo menos 0 mV num pH ácido, por exemplo, um pH abaixo de 7, com a máxima preferência, um pH entre cerca de 4 e 6.
Numa modalidade, os poliplexos de ácido nucleico de quitosano DD têm um potencial zeta médio entre +1 e +60 mV, com mais preferência, +1 e +40 mV, com mais preferência, +1 e +30 mV num pH ácido.
Numa modalidade preferencial, o polipéptido tem uma carga líquida positiva baixa, neutra ou líquida negativa em pH fisiológico e um pKa abaixo de 6. Tais poliplexos de ácido nucleico de quitosano DD exibem toxicidade celular reduzida e libertação intracelular de ácido nucleico intensificada.
Os poliplexos de ácido nucleico de quitosano DD da composição são, de preferência, homogéneos em relação ao tamanho de poliplexo. Consequentemente, numa modalidade preferencial, a composição tem um índice de polidispersidade média baixo ("PDI"). Numa modalidade especialmente preferencial, a dispersão de poliplexo de ácido nucleico de quitosano DD tem um PDI menor que 0,5, com mais preferência, menor que 0,4, com mais preferência, menor que 0,3, e com a máxima preferência, menor que 0,25.
Os poliplexos das presentes composições têm, de preferência, tamanho substancialmente estável na composição. Numa modalidade preferencial, uma composição da invenção compreende poliplexos que aumentam em diâmetro médio em menos que 100%, com mais preferência, menos que 50%, e com a máxima preferência, menos que 25%, à temperatura ambiente durante 6 horas, com mais preferência, 12 horas, com mais preferência, 24 horas, e com a máxima preferência, 48 horas.
Os poliplexos das presentes composições têm, de preferência, tamanho substancialmente estável sob condições arrefecidas. Numa modalidade preferencial, uma composição da invenção compreende poliplexos que aumentam em diâmetro médio em menos que 100%, com mais preferência, menos que 50%, e com a máxima preferência, menos que 25%, a 2 a 8 graus Celsius durante 6 horas, com mais preferência, 12 horas, com mais preferência, 24 horas, e com a máxima preferência, 48 horas.
Os poliplexos das presentes composições têm, de preferência, tamanho substancialmente estável sob condições de congelamento-descongelamento. Numa modalidade preferencial, uma composição da invenção compreende poliplexos que aumentam em diâmetro médio em menos que 100%, com mais preferência, menos que 50%, e com a máxima preferência, menos que 25%, à temperatura ambiente durante 6 horas, com mais preferência, 12 horas, com mais preferência, 24 horas, e com a máxima preferência, 48 horas após descongelamento a partir do congelamento a -20 a -80 graus Celsius.
Numa modalidade preferencial, a composição tem uma concentração de ácido nucleico maior que 0,5 mg/mL, e é substancialmente isenta de poliplexo precipitado. Com mais preferência, a composição tem uma concentração de ácido nucleico de pelo menos 0,6 mg/mL, com mais preferência, pelo menos 0,75 mg/mL, com mais preferência, pelo menos 1,0 mg/mL, com mais preferência, pelo menos 1,2 mg/mL, e com a máxima preferência, pelo menos 1,5 mg/mL, e é substancialmente isenta de poliplexo precipitado. As composições são hidratadas. Numa modalidade preferencial, a composição é substancialmente isenta de ácido nucleico não complexado.
Numa modalidade preferencial, a composição de poliplexo de ácido nucleico de quitosano DD é isotónica. A obtenção de isotonicidade, mantendo, ao mesmo tempo, a estabilidade de poliplexo, é altamente desejável na formulação de composições farmacêuticas e estas composições preferenciais são bem adequadas à formulação farmacêutica e aplicações terapêuticas.
Em geral, as composições que compreendem os poliplexos de ácido nucleico de quitosano DD são utilizadas para entrar em contacto com uma célula alvo. Tal contacto resulta, em geral, na entrega do ácido nucleico para a expressão pela célula alvo. As composições adequadas para os poliplexos de ácido nucleico de quitosano DD descritos no presente documento são bem conhecidas na técnica e são, em geral, descritas a seguir.
Formulações em pó
As composições de poliplexo de ácido nucleico de quitosano DD da invenção incluem pós. Numa modalidade preferencial, a invenção fornece uma composição de poliplexo de ácido nucleico de quitosano DD em pó seco. Numa modalidade preferencial, a composição de poliplexo de ácido nucleico de quitosano DD em pó seco é produzida através da desidratação de uma dispersão de poliplexo de ácido nucleico de quitosano da invenção.
Formulações Farmacêuticas A presente invenção também fornece formulações "farmaceuticamente aceitáveis" ou "fisiologicamente aceitáveis" que compreendem composições de poliplexo de ácido nucleico de quitosano DD da invenção. Tais formulações podem ser administradas in vivo a um indivíduo para praticar os métodos de tratamento.
Para utilização no presente documento, os termos "farmaceuticamente aceitável" e "fisiologicamente aceitável" referem-se a veículos, diluentes, excipientes e semelhantes que podem ser administrados a um indivíduo, de preferência, sem produzir efeitos secundários adversos excessivos (por exemplo, náusea, dor abdominal, dores de cabeça, etc.). Tais preparações para administração incluem emulsões, suspensões e soluções aquosas ou não aquosas estéreis.
As formulações farmacêuticas podem ser produzidas a partir de veículos, diluentes, excipientes, solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes de atraso de absorção e isotónico e semelhantes, compatíveis com a administração a um indivíduo. Tais formulações podem estar contidas num comprimido (revestido ou não revestido), cápsula (dura ou macia), microesfera, emulsão, pó, grânulo, cristal, suspensão, xarope ou elixir. Os compostos ativos suplementares e conservantes, entre outros aditivos, também podem estar presentes, por exemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes e gases inertes e semelhantes.
Os excipientes podem incluir um sal, um agente isotónico, uma proteína sérica, um tampão ou outro agente de controlo de pH, um antioxidante, um espessante, um polímero inalterado, um conservante ou um crioprotetor. Os excipientes utilizados nas composições da invenção podem incluir, também, um agente isotónico e um tampão ou outro agente de controlo de pH. Estes excipientes podem ser adicionados para a obtenção de faixas preferenciais de pH (cerca de 6,0 a 8,0) e osmolaridade (cerca de 50 a 300 mmol/L). Os exemplos de tampões adequados são tampão de acetato, borato, carbonato, citrato, fosfato e molécula orgânica sulfonatada. Tais tampões podem estar presentes numa composição em concentrações de 0,01 a 1,0% (p/v) . Um agente isotónico pode ser selecionado a partir de qualquer um daqueles conhecidos na técnica, por exemplo, manitol, dextrose, glucose e cloreto de sódio ou outros eletrólitos. De preferência, o agente isotónico é glucose ou cloreto de sódio. Os agentes isotónicos podem ser utilizados em quantidades que conferem para a composição uma pressão osmótica igual ou semelhante àquela do ambiente biológico no qual a mesma é introduzida. A concentração de agente isotónico na composição dependerá da natureza do agente isotónico particular utilizado e pode situar-se na faixa de cerca de 0,1 a 10%. Quando a glucose é utilizada, é, de preferência, utilizada numa concentração de 1 a 5% em p/v, mais particularmente 5% em p/v. Quando o agente isotónico é cloreto de sódio, é, de preferência, empregue em quantidades até 1% em p/v, em particular 0,9% em p/v. As composições da invenção podem conter, ainda, um conservante. Os exemplos de conservantes são poli-hexametileno-biguanida, cloreto de benzalcónio, complexos de oxicloro estabilizados (como aqueles conhecidos como
PuriteR), acetato de fenilmercúrio, clorobutanol, ácido sórbico, clorexidina, álcool benzilico, parabenos e timerosal. Tipicamente, tais conservantes estão presentes em concentrações de cerca de 0,001 a 1,0%. Adicionalmente, as composições da invenção também podem conter um agente crioconservante. Os crioconservantes preferenciais são glucose, sacarose, manitol, lactose, trealose, sorbitol, dióxido de silício coloidal, dextrano de peso molecular, de preferência, abaixo de 100,000 g/mol, glicerol e polietileno glicóis de pesos moleculares abaixo de 100,000 g/mol ou misturas dos mesmos. Da máxima preferência são glucose, trealose e polietileno glicol. Tipicamente, tais crioconservantes estão presentes em concentrações de cerca de 0,01 a 10%.
Uma formulação farmacêutica pode ser formulada para ser compatível com a sua via de administração pretendida. Por exemplo, para administração oral, uma composição pode ser incorporada com excipientes e utilizada sob a forma de comprimidos, trociscos, cápsulas, por exemplo, cápsulas de gelatina ou revestimentos, por exemplo, revestimentos entéricos (Eudragit® ou Sureteric®) . Os agentes de ligação farmaceuticamente compatíveis e/ou materiais adjuvantes podem ser incluídos em formulações orais. Os comprimidos, pílulas, cápsulas, trociscos e semelhantes podem conter qualquer um dos seguintes ingredientes ou compostos de uma natureza semelhante: um aglutinante, como celulose microcristalina, goma tragacanta ou gelatina; um excipiente, como amido ou lactose, um agente desintegrante, como ácido algínico, Primogel, ou amido de milho; um lubrificante, como estearato de magnésio ou Sterotes; um deslizante, como dióxido de silício coloidal; um agente adoçante, como sacarose ou sacarina; ou um agente aromatizante, como hortelã-pimenta, salicilato de metil ou aromatizante.
As formulações também podem incluir veículos para proteger a composição contra a degradação rápida ou eliminação do corpo, como uma formulação de libertação controlada, incluindo implantes e sistemas de entrega microencapsulados. Por exemplo, um material de atraso de tempo, como monoestearato de gliceril ou estearato de gliceril isoladamente, ou em combinação com uma cera, pode ser empregue.
Os supositórios e outras formulações administráveis por via retal (por exemplo, aquelas administráveis por enema) também são contemplados. Adicionalmente, em relação à entrega retal, veja-se, por exemplo, Song et al., Mucosal drug delivery: membranes, methodologies, and applications, Crit. Rev. Ther. Drug. Carrier Syst., 21:195 a 256, 2004; Wearley, Recent progress in protein and peptide delivery by noninvasive routes, Crit. Rev. Ther. Drug. Carrier Syst., 8:331 a 394, 1991.
As formulações farmacêuticas adicionais adequadas para a administração são conhecidas na técnica e são aplicáveis nos métodos e composições da invenção (veja-se, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) 18a edição, Mack Publishing Co., Easton, Pa.; The Merck Index (1996) 12a edição, Merck Publishing Group, Whitehouse, N.J.; e Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms, Technonic Publishing Co., Inc., Lancaster, Pa., (1993)).
Administração
Numa modalidade, a utilização de quitosano DD em poliplexos de ácido nucleico de quitosano DD fornece estabilidade prolongada de poliplexos em pH fisiológico. Isto fornece administração sistémica eficaz, bem como outros modos de administração.
Qualquer uma de várias vias de administração é possível e a escolha de uma via particular dependerá, em parte, do tecido alvo. Seringas, endoscópios, cânulas, tubos para entubação, cateteres e outros artigos podem ser utilizados para a administração.
As doses ou "quantidade eficaz" para o tratamento de um indivíduo são, de preferência, suficientes para melhorar um, vários ou todos os sintomas da afeção a uma extensão detetável ou mensurável, embora a prevenção ou inibição de uma progressão ou pioria do distúrbio ou afeção, ou um sintoma, seja um resultado satisfatório. Dessa forma, no caso de uma afeção ou distúrbio tratável pela expressão de um ácido nucleico terapêutico em tecido alvo, a quantidade de ARN terapêutico ou proteína terapêutica produzida para melhorar uma afeção tratável por um método da invenção dependerá da afeção e do resultado desejado e pode ser prontamente verificada pelo perito na especialidade. As quantidades adequadas dependerão da afeção tratada, do efeito terapêutico desejado, bem como do participante individual (por exemplo, da biodisponibilidade dentro do indivíduo, género, idade, etc.). A quantidade eficaz pode ser verificada mediante a medição de efeitos fisiológicos relevantes.
As aplicações veterinárias também são contempladas pela presente invenção. Consequentemente, numa modalidade, a invenção fornece métodos para tratamento de mamíferos não humanos, que envolvem a administração de uma nanopartícula à base de quitosano da invenção a um mamífero não humano que necessite de tratamento.
Administração Parentérica
Os compostos da invenção podem ser administrados diretamente na corrente sanguínea, no músculo ou num órgão interno. Os meios adequados para administração parentérica incluem intravenoso, intra-arterial, intraperitoneal, intratecal, intraventricular, intrauretral, intrasternal, intracraniano, intramuscular e subcutâneo. Os dispositivos adequados para a administração parentérica incluem injetores de agulha (incluindo microagulha), injetores livre de agulha e técnicas de infusão.
As formulações parentéricas são tipicamente soluções aquosas que podem conter excipientes como sais, hidratos de carbono e agentes tamponizantes, mas, para algumas aplicações, podem ser formuladas de maneira mais adequada como uma solução não aquosa estéril ou como uma forma seca a ser utilizada em conjunto com um veículo adequado, como água isenta de pirogénio estéril. A preparação de formulações parentéricas sob condições estéreis, por exemplo, por liofilização, pode ser prontamente realizada com a utilização de técnicas farmacêuticas padrão bem conhecidas pelos peritos na especialidade. A solubilidade dos compostos utilizados na preparação de soluções parentéricas pode ser aumentada mediante a utilização de técnicas de formulação adequadas, como a incorporação de agentes acentuadores de estabilidade.
As formulações para administração parentérica podem ser formuladas para serem de libertação modificada e/ou imediata. As formulações de libertação modificada incluem libertação retardada, prolongada, pulsada, controlada, dirigida e programada. Dessa forma, os compostos da invenção podem ser formulados como um sólido, semissólido ou liquido tixotrópico para a administração como um depot implantado que fornece libertação modificada do composto ativo.
Administração Oral
As presentes composições podem ser administradas por via oral. A administração oral pode envolver deglutição, de modo que o composto entre no trato gastrointestinal. As composições da invenção também podem ser administradas diretamente ao trato gastrointestinal.
As formulações adequadas para administração oral incluem formulações sólidas, como comprimidos, cápsulas, cápsulas revestidas que contêm particulados ou particulados revestidos, líquidos ou pós, pastilhas (incluindo preenchidas com líquido), gomas de mascar, multi- e nanoparticulados, géis, filmes, óvulos e aspersões.
As formulações líquidas incluem suspensões, soluções, xaropes e elixires. As formulações líquidas podem ser preparadas pela reconstituição de um sólido.
As formas de dosagem de comprimido geralmente contêm um desintegrador. Os exemplos de desintegradores incluem glicolato de amido de sódio, carboximetil celulose sódica, carboximetil celulose cálcica, croscarmelose sódica, crospovidona, polivinilpirrolidona, metil celulose, celulose microcristalina, hidroxipropil celulose substituída por alquil inferior, amido, amido pré-gelatinizado e alginato de sódio. Em geral, o desintegrador irá compreender de 1% em peso a 25% em peso, de preferência, de 5% em peso a 20% em peso da forma de dosagem.
Os aglutinantes são em geral utilizados para conferir qualidades coesivas para uma formulação de comprimido. Os aglutinantes adequados incluem celulose microcristalina, gelatina, açúcares, polietileno glicol, gomas naturais e sintéticas, polivinilpirrolidona, amido pré-gelatinizado, hidroxipropil celulose e hidroxipropil metilcelulose. Os comprimidos também podem conter diluentes, como lactose (mono-hidrato, mono-hidrato seco por aspersão, anidro e semelhantes), manitol, xilitol, dextrose, sacarose, sorbitol, celulose microcristalina, amido e di-hidrato de fosfato de cálcio dibásico.
Os comprimidos também podem compreender opcionalmente agentes ativos de superfície, como lauril sulfato de sódio e polissorbato 80, e deslizantes, como dióxido de silício e talco. Quando presentes, os agentes ativos de superfície podem compreender de 0,2% em peso a 5% em peso do comprimido, e os deslizantes podem compreender de 0,2% em peso a 1% em peso do comprimido.
Os comprimidos também contêm em geral lubrificantes, como estearato de magnésio, estearato de cálcio, estearato de zinco, estearil fumarato de sódio e misturas de estearato de magnésio com lauril sulfato de sódio. Os lubrificantes compreendem em geral de 0,25% em peso a 10% em peso, de preferência, de 0,5% em peso a 3% em peso do comprimido.
Outros ingredientes possíveis incluem antioxidantes, corantes, agentes aromatizantes, conservantes e agentes de ocultação de sabor.
As misturas de comprimido podem ser compactadas diretamente ou por meio do rolo para formar comprimidos. As misturas de comprimidos ou porções de misturas podem ser alternativamente granuladas a húmido, seco ou fundidas, congeladas fundidas ou extrudadas antes da formação de comprimido. A formulação final pode compreender uma ou mais camadas e pode ser revestida ou não revestida; pode ser até encapsulada. A formulação de comprimidos é discutida em Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Vol. 1, por H. Lieberman e L. Lachman (Marcel Dekker, Nova Iorque, 1980).
Os filmes orais consumíveis para utilização humana ou veterinária são tipicamente formas de dosagem de filme fino expansíveis em água ou solúveis em água flexíveis que podem ser rapidamente dissolvidas ou mucoadesivas e tipicamente compreendem um polímero formador de filme, um aglutinante, um solvente, um humectante, um plastificante, um estabilizante ou emulsificante, um agente de modificação de viscosidade e um solvente. Alguns componentes da formulação podem realizar mais de uma função.
Também estão incluídas na invenção microesferas multiparticuladas que compreendem uma composição da invenção.
Outros ingredientes possíveis incluem antioxidantes, corantes, aromatizantes e acentuadores de sabor, conservantes, agentes estimulantes de saliva, agentes arrefecedores, cossolventes (incluindo óleos), emolientes, agentes de volume, agentes antiespumantes, tensioativos e agentes de ocultação de sabor.
Os filmes de acordo com a invenção são tipicamente preparados por secagem evaporativa de filmes aquosos finos revestidos num papel ou suporte de apoio descartável. Isto pode ser feito num túnel ou forno de secagem, tipicamente um secador e revestidor combinados ou por secagem por congelamento ou aspiração.
As formulações sólidas para administração oral podem ser formuladas para serem de libertação modificada e/ou imediata. As formulações de libertação modificada incluem libertação retardada, prolongada, pulsada, controlada, dirigida e programada.
Outras tecnologias de libertação adequadas, como dispersões de alta energia e partículas revestidas e osmóticas são conhecidas.
Administração Tópica
Os compostos da invenção também podem ser administrados topicamente à pele ou mucosa, isto é, de maneira dérmica ou transdérmica. As formulações típicas para este propósito incluem géis, hidrogéis, loções, soluções, cremes, pomadas, pós de pulverização, curativos, espumas, filmes, emplastros de pele, pastilhas, implantes, esponjas, fibras, ligaduras e microemulsões.
Outros meios de administração tópica incluem entrega por eletroporação, iontoforese, fonoforese, sonoforese e injeção de microagulha ou isenta de agulha (por exemplo, Powderject”, Bioject”, etc.).
As formulações para administração tópica podem ser formuladas para serem de libertação modificada e/ou imediata. As formulações de libertação modificada incluem libertação retardada, prolongada, pulsada, controlada, dirigida e programada.
Administração Inalada/Intranasal
Os compostos da invenção também podem ser administrados de forma intranasal ou por inalação, tipicamente sob a forma de um pó seco (isoladamente, como uma mistura, por exemplo, numa mistura seca com lactose, ou como uma partícula de componente misto) a partir de um inalador de pó seco ou como uma aspersão de aerossol a partir de um recipiente pressurizado, bomba, aspersão, atomizador ou nebulizador, com ou sem a utilização de um propelente adequado.
As cápsulas, blisters e cartuchos para utilização num inalador ou insuflador podem ser formuladas para conter uma matriz de pó do composto da invenção, uma base de pó adequada, como lactose ou amido e um modificador de desempenho, como I-leucina, manitol ou estearato de magnésio.
As formulações para administração inalada/intranasal podem ser formuladas para serem de libertação modificada e/ou imediata. As formulações de libertação modificada incluem libertação retardada, prolongada, pulsada, controlada, dirigida e programada.
Administração Retal/Intravaginal
Os compostos da invenção podem ser administrados de forma retal ou vaginal, por exemplo, sob a forma de um supositório, pessário ou enema. A manteiga de cacau é uma base de supositório tradicional, mas diversas alternativas podem ser utilizadas conforme for adequado.
As formulações para administração retal/vaginal podem ser formuladas para serem de libertação modificada e/ou imediata. As formulações de libertação modificada incluem libertação retardada, prolongada, pulsada, controlada, dirigida e programada.
Administração ocular/aural
Os compostos da invenção também podem ser administrados diretamente aos olhos ou ouvidos, tipo sob a forma de gotas. Outras formulações adequadas para administração ocular e aural incluem pomadas, implantes biodegradáveis (por exemplo, esponjas de gel absorvível, colágeno) e não biodegradáveis (por exemplo, silicone), pastilhas, lentes e sistemas particulados. As formulações também podem ser entregues por iontoforese.
As formulações para administração ocular/aural podem ser formuladas para serem de libertação modificada e/ou imediata. As formulações de libertação modificada incluem libertação retardada, prolongada, pulsada, controlada, dirigida ou programada. Métodos de Utilização
Numa modalidade, as composições de poliplexo de ácido nucleico de quitosano DD da invenção podem ser utilizadas para tratamento terapêutico. Tais composições são às vezes mencionadas no presente documento como composições terapêuticas.
As proteínas terapêuticas da invenção, conforme discutido abaixo, são produzidas por poliplexos da invenção que compreendem ácidos nucleicos terapêuticos. A utilização das presentes proteínas conforme descrito a seguir refere-se à utilização dos presentes poliplexos para efetuar a utilização de tal proteína.
As proteínas terapêuticas contempladas para a utilização na invenção têm uma ampla variedade de atividades e encontram utilização no tratamento de uma ampla variedade de distúrbios. A seguinte descrição de atividades de proteína terapêutica, e indicações tratáveis com as proteínas terapêuticas da invenção, é exemplificadora e não se destina a ser exaustiva. 0 termo "indivíduo" refere-se a um animal, sendo que os mamíferos são preferenciais, e os seres humanos especialmente preferenciais.
Uma lista parcial de proteínas terapêuticas e doenças-alvo é mostrada na Tabela 1.
Tabela 1.
Numa outra modalidade, as composições terapêuticas da invenção compreendem ácidos nucleicos terapêuticos que não codificam proteínas terapêuticas, por exemplo, ARNs terapêuticos. Por exemplo, mediante a seleção de ARNs terapêuticos que direcionam genes envolvidos em mecanismos de doença e/ou condições fisiológicas ou celulares indesejáveis, as presentes composições podem ser utilizadas no tratamento de uma ampla variedade de doenças e afeções. As presentes composições têm um caráter de modo que os ARNs terapêuticos utilizados não sejam limitados em relação ao âmbito da seleção alvo. Consequentemente, as presentes composições encontram utilização em qualquer doença ou afeção que envolve um alvo adequado.
Os tecidos, doenças e afeções preferenciais incluem os seguintes, que são exemplificadores e de forma alguma limitadores:
Hiperglicemia e massa corporal
As proteínas terapêuticas incluem insulina e análogos de insulina. A diabetes mellitus é uma doença metabólica debilitante causada pela produção de insulina ausente (tipo 1) ou insuficiente (tipo 2) a partir de células β pancreáticas (Unger, R.H. et ai., Williams Textbook of Endocrinology Saunders, Filadélfia (1998)). As células beta são células endócrinas especializadas que fabricam e armazenam insulina para libertação após uma refeição (Rhodes, et. al. J. Cell Biol. 105:145(1987)) e a insulina é uma hormona que facilita a transferência de glucose do sangue para os tecidos onde a mesma é necessária. Os pacientes com diabetes precisam frequentemente monitorar os níveis de glucose sanguínea e muitos precisam de múltiplas injeções de insulina diariamente para sobreviver. No entanto, tais pacientes raramente alcançam níveis de glucose ideais através da injeção de insulina (Turner, R. C. et al. JAMA 281:2005(1999)). Adicionalmente, a elevação prolongada de níveis de insulina pode resultar em efeitos secundários prejudiciais, como choque hipoglicémico e dessensibilização da resposta do corpo à insulina. Consequentemente, os pacientes diabéticos ainda desenvolvem complicações em longo prazo, como doenças cardiovasculares, doença renal, cegueira, dano nervoso e distúrbios de cura de ferimentos (UK Prospective Diabetes Study (UKPDS) Group, Lancet 352, 837 (1998)).
Os distúrbios tratáveis por um método da revelação incluem uma condição hiperglicémica, como diabetes dependente de insulina (tipo 1) ou independente de insulina (tipo 2), bem como distúrbios ou condições fisiológicas associadas a ou que resultam da condição hiperglicémica. Dessa forma, as condições hiperglicémicas tratáveis por um método da invenção também incluem uma alteração histopatológica associada à hiperglicemia crónica ou aguda (por exemplo, diabetes). Os exemplos particulares incluem degeneração do pâncreas (destruição de célula β) , calcificação de túbulo renal, degeneração do fígado, dano ocular (retinopatia diabética), pé diabético, ulcerações em mucosa, como boca e gengivas, sangramento excessivo, coagulação sanguínea ou cura de ferimentos retardado e aumento do risco de doença cardíaca coronariana, acidente vascular cerebral, doença vascular periférica, dislipidemia, hipertensão e obesidade.
As presentes composições são úteis para diminuir glucose, aperfeiçoar tolerância à glucose, tratar uma condição hiperglicémica (por exemplo, diabetes) ou para tratar distúrbios fisiológicos associados a ou que resultam de uma condição hiperglicémica. Tais distúrbios incluem, por exemplo, neuropatia diabética (autónomo), nefropatia (dano renal), infeções de pele e outros distúrbios cutâneos, cicatrização lenta ou retardada de lesões ou ferimentos (por exemplo, que levam a carbúnculos diabéticos), dano ocular (retinopatia, catarata) que pode levar à cegueira, pé diabético e periodontite acelerada. Tais distúrbios também incluem aumento do risco de desenvolver doença cardíaca coronariana, acidente vascular cerebral, doença vascular periférica, dislipidemia, hipertensão e obesidade.
Para utilização no presente documento, o termo "hiperglicémico" ou "hiperglicemia", quando utilizado com referência a uma condição de um indivíduo, significa um nível de glucose anormalmente alto crónico ou transitório presente no sangue de um indivíduo. A afeção pode ser causada por um atraso na metabolização ou absorção de glucose de modo que o indivíduo exibe intolerância à glucose ou um estado de glucose elevada não encontrado tipicamente em indivíduos normais (por exemplo, em indivíduos subdiabéticos intolerantes à glucose em risco de desenvolver diabetes, ou em indivíduos diabéticos) . Os níveis de glucose plasmática em jejum (FPG) para normoglicemia são menores que cerca de 110 mg/dl, para metabolismo de glucose prejudicado, entre cerca de 110 e 126 mg/dl, e para diabéticos maior que cerca de 126 mg/dl.
Os distúrbios tratáveis por meio da produção de uma proteína num tecido da mucosa gastrointestinal também incluem obesidade ou uma massa corporal indesejável. Leptina, colecistocinina, PYY e GLP-1 diminuem a fome, aumento o gasto de energia, induzem a perda de peso ou fornecem homeostase de glucose normal. Dessa forma, em diversas modalidades, um método da invenção para o tratamento de obesidade ou uma massa corporal indesejável, ou hiperglicemia, envolve a utilização de um ácido nucleico terapêutico que codifica leptina, colecistocinina, PYY ou GLP-1. Numa outra modalidade, é utilizado um ARN terapêutico que direciona grelina. A grelina aumenta o apetite e fome. Dessa forma, em diversas modalidades, um método da invenção para o tratamento de obesidade ou uma massa corporal indesejável, ou hiperglicemia, envolve a utilização de um ARN terapêutico que direciona grelina para diminuir a expressão da mesma. Os distúrbios tratáveis também incluem aqueles tipicamente associados à obesidade, por exemplo, LDL sérico/plasmático anormalmente elevado, VLDL, triglicéridos, colesterol, formação de placa que leva ao estreitamento ou bloqueio de vasos sanguíneos, aumento do risco de hipertensão/acidente vascular cerebral, doença cardíaca coronariana, etc.
Para utilização no presente documento, o termo "obeso" ou "obesidade" refere-se a um indivíduo que tem pelo menos um aumento de 30% em massa corporal em comparação com um indivíduo normal com idade e género compatível. "Massa corporal indesejável" refere-se a indivíduos que têm 1% a 29% de massa corporal maior que um indivíduo normal compatível, bem como indivíduos que são normais em relação à massa corporal, mas que desejam diminuir ou prevenir um aumento em sua massa corporal.
Numa modalidade, uma proteína terapêutica é um antagonista de glucagom. O glucagom é uma hormona de péptido produzida por células β em ilhotas pancreáticas e é um regulador principal do metabolismo de glucose (Unger R. H. &amp; Orei L. N. Eng. J. Med. 304:1518(1981); Unger R. H. Diabetes 25:136 (1976)). Conforme com a insulina, a concentração de glucose sanguínea media a secreção de glucagom. No entanto, em contraste com a insulina, glucagom é secretado em resposta a uma diminuição em glucose sanguínea. Portanto, as concentrações circulantes de glucagom são mais altas durante períodos de jejum e mais baixas durante uma refeição. Os níveis de glucagom aumentam para impedir que a insulina promova armazenamento de glucose e estimulam o fígado a libertar glucose no sangue. Um exemplo específico de um antagonista de glucagom é [des-Hisl, des-Phe6, Glu9]glucagom-NH2. Em ratos diabéticos de estreptozotocina, os níveis de glucose sanguínea foram reduzidos em 37% dentro de 15 min. de um bolo intravenoso (0,75 mg/g de peso corporal) deste antagonista de glucagom (Van Tine B. A. et. al. Endocrinology 137:3316 (1996)). Numa outra modalidade, a invenção fornece um método para o tratamento de diabetes ou hiperglicemia, que compreende a utilização de um ARN terapêutico para diminuir os níveis de produção de glucagom a partir do pâncreas.
Numa outra modalidade, uma proteína terapêutica útil para o tratamento de condição hiperglicémica ou massa corporal indesejável (por exemplo, obesidade) é um péptido semelhante a glucagom 1 (GLP-1) . 0 GLP-1 é uma hormona libertada de células L no intestino durante uma refeição que estimula as células β pancreáticas a aumentar a secreção de insulina. GLP-1 tem atividades adicionais que o torna um agente terapêutico atraente para o tratamento de obesidade e diabetes. Por exemplo, GLP-1 reduz o esvaziamento gástrico, suprime o apetite, reduz a concentração de glucagom, aumenta a massa de célula β, estimula a biossíntese e secreção de insulina num modo dependente de glucose, e provavelmente aumenta a sensibilidade do tecido à insulina (Kieffer T. J., Habener J. F. Endocrin. Rev. 20:876 (2000)). Portanto, a libertação regulada de GLP-1 no intestino para coincidir com uma refeição pode fornecer benefício terapêutico para uma condição hiperglicémica ou uma massa corporal indesejável. Os análogos de GLP-1 que são resistentes a peptidato de dipeptidila IV (DPP IV) fornecem duração mais longa da ação e valor terapêutico aperfeiçoado. Dessa forma, os análogos de GLP-1 são polipéptidos terapêuticos preferenciais. Numa outra modalidade, a invenção fornece um método para o tratamento de diabetes ou hiperglicemia, que compreende a utilização de um ARN terapêutico para diminuir os níveis de DPP IV.
Numa outra modalidade, uma proteína terapêutica útil para o tratamento de uma condição hiperglicémica é um antagonista para a hormona resistina. A resistina é um fator derivado de adipócito para qual a expressão é elevada em formas de obesidade genéticas e induzidas por dieta. A neutralização de resistina circulante aperfeiçoa a glucose sanguínea e ação de insulina em ratinhos obesos. Por outro lado, a administração de resistina em ratinhos normais danifica a tolerância à glucose e ação de insulina (Steppan CM et. ai. Nature 409:307 (2001)). A produção de uma proteína que antagoniza os efeitos biológicos da resistina no intestino pode, portanto, fornecer uma terapia eficaz para resistência à insulina ligada à obesidade e condições hiperglicémicas. Numa outra modalidade, a invenção fornece um método para o tratamento de diabetes ou hiperglicemia, que compreende a utilização de um ARN terapêutico para diminuir os níveis de expressão de resistina em tecido adiposo.
Numa outra modalidade, um polipéptido terapêutico útil para o tratamento de condição hiperglicémica ou massa corporal indesejável (por exemplo, obesidade) é leptina. A leptina, embora produzida principalmente por células de gordura, também é produzida em quantidades menores num modo dependente de refeição no estômago. A leptina retransmite informações sobre o metabolismo de células de gordura e peso corporal para os centros de apetite no cérebro, em que o mesmo sinaliza a ingestão de alimento reduzida (promove a saciedade) e aumenta o gasto de energia do corpo.
Numa outra modalidade, um polipéptido terapêutico útil para o tratamento de uma condição hiperglicémica ou massa corporal indesejável (por exemplo, obesidade) é o domínio globular no terminal C de proteína relacionada com complemento de adipócito (Acrp30). Acrp30 é uma proteína produzida por adipócitos diferenciados. A administração de um produto de clivagem proteolítica de Acrp30 que consiste no domínio globular para ratinhos leva à perda de peso significativa (Fruebis J. et ai. Proc. NatL Acad. Sei USA 98:2005 (2001)) .
Numa outra modalidade, um polipéptido terapêutico útil para o tratamento de condição hiperglicémica ou massa corporal indesejável (por exemplo, obesidade) é colecistocinina (CCK) . A CCK é um péptido gastrointestinal secretado a partir do intestino em resposta a nutrientes particulares no intestino. A libertação de CCK é proporcional à quantidade de alimento consumido e acredita-se que sinalize o cérebro para terminar uma refeição (Schwartz M. W. et. ai. Nature 404:661-71(2000)). Consequentemente, a CCK elevada pode reduzir o tamanho da refeição e promover perda de peso ou estabilização de peso (isto é, prevenir ou inibir aumentos em ganho de peso).
Em relação a PYY, veja-se, por exemplo, le Roux et al., Proc Nutr Soc. maio de 2005; 64(2):213-6.
Distúrbios imunológicos
Numa modalidade, uma composição terapêutica da invenção possui atividade imunomodulatória. Por exemplo, um polipéptido terapêutico da presente invenção pode ser útil no tratamento de deficiências ou distúrbios do sistema imunológico, mediante a ativação ou inibição da proliferação, diferenciação ou mobilização (quimiotaxia) de células imunes. As células imunes desenvolvem-se através do processo de hematopoese, produzindo células mieloides (plaquetas, eritrócitos, neutrófilos e macrófagos) e linfoides (linfócitos B e T) a partir de células-tronco pluripotentes. A etiologia destas deficiências ou distúrbios imunes pode ser genética, somática, como cancro ou alguns distúrbios autoimunes, adquirida (por exemplo, por quimioterapia ou toxinas) ou infeciosa.
Uma composição terapêutica da presente invenção pode ser útil no tratamento de deficiências ou distúrbios de células hematopoiéticas. Por exemplo, um polipéptido terapêutico da presente invenção poderá ser utilizado para aumentar a diferenciação ou proliferação de células hematopoiéticas, incluindo as células-tronco pluripotentes, num esforço para tratar aqueles distúrbios associados a uma diminuição em certos (ou muitos) tipos de células hematopoiéticas. Os exemplos de sindromes de deficiência imunitária incluem, porém sem limitação: distúrbios de proteína sanguínea (por exemplo agamaglobulinemia, disgamaglobulinemia) , ataxia telangiectasia, imunodeficiência variável comum, síndrome de DiGeorge, infeção por VIH, infeção por HTLV-BLV, síndrome da deficiência de adesão de leucócito, linfopenia, disfunção bactericida de fagócito, imunodeficiência combinada severa (SCIDs), distúrbio de Wiskott-Aldrich, anemia, trombocitopenia ou hemoglobinuria.
Uma composição terapêutica da presente invenção também pode ser útil no tratamento de distúrbios autoimunes. Muitos distúrbios autoimunes resultam do reconhecimento inadequado de si mesmo como material estranho por células imunes. Este reconhecimento inadequado resulta numa resposta imunitária que leva à destruição do tecido hospedeiro. Consequentemente, a administração de uma composição terapêutica da presente invenção que inibe uma resposta imunitária, particularmente a proliferação, diferenciação ou quimiotaxia de células T, pode ser uma terapia eficaz na prevenção de distúrbios autoimunes.
Os exemplos de distúrbios autoimunes que podem ser tratados pela presente invenção incluem, porém sem limitação: doença de Addison, anemia hemolitica, sindrome do antifosfolipido, artrite reumatoide, dermatite, encefalomielite alérgica, glomerulonefrite, sindrome de Goodpasture, doença de Graves, esclerose múltipla, miastenia grave, neurite, oftalmia, penfigoide bolhoso, pênfigo, poliendocrinopatias, púrpura, doença de Reiter, sindrome de Stiff-Man, tiroidite autoimune, lúpus eritematoso sistémico, inflamação pulmonar autoimune, sindrome de Guillain-Barre, diabetes mellitis dependente de insulina, doença de Crohn, colite ulcerativa e doença ocular inflamatória autoimune.
De modo semelhante, as condições e reações alérgicas, como asma (particularmente asma alérgica) ou outros problemas respiratórios, também podem ser tratados por uma composição terapêutica da presente invenção. Ademais, estas moléculas podem ser utilizadas para tratar anafilaxia, hipersensibilidade a uma molécula antigénica ou incompatibilidade de grupo sanguíneo.
Uma composição terapêutica da presente invenção também pode ser utilizada para tratar e/ou prevenir a rejeição de órgão ou doença de enxerto-contra-hospedeiro (GVHD). A rejeição de órgão ocorre mediante a destruição de célula imune hospedeira do tecido transplantado através de uma resposta imunitária. De modo semelhante, uma resposta imunitária também está envolvida em GVHD, mas, neste caso, as células imunes transplantadas estranhas destroem os tecidos hospedeiros. A administração de uma composição terapêutica da presente invenção que inibe uma resposta imunitária, particularmente a proliferação, diferenciação ou quimiotaxia de células T, pode ser uma terapia eficaz na prevenção de rejeição de órgão ou GVHD.
De modo semelhante, uma composição terapêutica da presente invenção também pode ser utilizada para modular inflamação. Por exemplo, o polipéptido terapêutico pode inibir a proliferação e diferenciação de células envolvidas numa resposta inflamatória. Estas moléculas podem ser utilizadas para tratar condições inflamatórias, condições tanto crónicas como agudas, incluindo inflamação associada à infeção (por exemplo, choque séptico, sepsia ou sindrome de resposta inflamatória sistémica (SIRS)), lesões de isquemia-reperfusão, letalidade por endotoxina, artrite, pancreatite, rejeição hiperaguda mediada por complemento, nefrite, lesão pulmonar induzida por citocina ou quimocina, doença inflamatória intestinal (IBD), doença de Crohn ou resultante da superprodução de citocinas (por exemplo, TNF ou IL-1.) Numa modalidade, um ARN terapêutico direcionado contra TNFa é utilizado nas presentes composições para tratar inflamação. Numa outra modalidade preferencial, um ARN terapêutico direcionado contra IL-1 é utilizado nas presentes composições para tratar inflamação. Os ARNs terapêuticos de siARN são especialmente preferenciais. Os distúrbios inflamatórios de interesse para o tratamento na presente invenção incluem, porém sem limitação, distúrbio pulmonar obstrutivo crónico (COPD), cistite intersticial e doença inflamatória intestinal.
Distúrbios de coagulação
Em algumas modalidades, uma composição terapêutica da presente invenção também pode ser utilizada para modular a atividade hemostática (a parada do sangramento) ou trombolitica (formação de coágulo) . Por exemplo, mediante o aumento da atividade hemostática ou trombolitica, uma composição terapêutica da presente invenção poderá ser utilizada para tratar distúrbios de coagulação sanguínea (por exemplo, afibrinogenemia, deficiências de fator), distúrbios de plaquetas sanguíneas (por exemplo, trombocitopenia) ou ferimentos que resultam de trauma, cirurgia ou outras causas. Alternativamente, uma composição terapêutica da presente invenção que pode diminuir a atividade hemostática ou trombolitica poderá ser utilizada para inibir ou dissolver a coagulação. Estas composições terapêuticas poderão ser importantes no tratamento de ataques cardíacos (infarto), acidentes vasculares cerebrais ou cicatrização. Numa modalidade, um polipéptido terapêutico da invenção é um fator de coagulação, útil para o tratamento de hemofilia ou outros distúrbios de coagulação (por exemplo, Fator VIII, IX ou X)
Distúrbios de hiperproliferação
Numa modalidade, uma composição terapêutica da invenção tem capacidade para modular a proliferação celular. Tal polipéptido terapêutico pode ser utilizado para tratar distúrbios de hiperproliferação, incluindo neoplasmas.
Os exemplos de distúrbios de hiperproliferação que podem ser tratados por uma composição terapêutica da presente invenção incluem, porém sem limitação, neoplasmas situados no: abdómen, osso, mama, sistema digestivo, fígado, pâncreas, peritoneu, glândulas endócrinas (adrenal, paratiroide, pituitária, testículos, ovário, timo, tiroide), olho, cabeça e pescoço, sistema nervoso (central e periférico), sistema linfático, pélvis, pele, tecido mole, baço, torácico e urogenital.
De modo semelhante, outros distúrbios de hiperproliferação também podem ser tratados por uma composição terapêutica da presente invenção. Os exemplos de tais distúrbios de hiperproliferação incluem, porém sem limitação: hipergamaglobulinemia, distúrbios de linfoproliferação, paraproteinemias, púrpura, sarcoidose, sindrome de Sezary, macroglobulinemia de Waldenstron, doença de Gaucher, histiocitose, e qualquer outra doença de hiperproliferação, além de neoplasia, situada num sistema de órgãos interno listado acima. A entrega ao sistema circulatório fornece acesso da proteína terapêutica a uma ampla variedade de tecidos. Alternativamente, uma composição terapêutica da presente invenção pode estimular a proliferação de outras células que podem inibir o distúrbio de hiperproliferação.
Por exemplo, mediante o aumento de uma resposta imunitária, particularmente mediante o aumento das qualidades antigénicas do distúrbio de hiperproliferação ou por meio da proliferação, diferenciação ou mobilização de células T, os distúrbios de hiperproliferação podem ser tratados. Esta resposta imunitária pode ser aumentada por meio da intensificação de uma resposta imunitária existente ou por meio da iniciação de uma nova resposta imunitária. Alternativamente, a diminuição de uma resposta imunitária também pode ser um método para o tratamento de distúrbios de hiperproliferação, como com um agente quimioterápico.
Doença Infeciosa
Numa modalidade, uma composição terapêutica da presente invenção pode ser utilizada para tratar doença infeciosa. Por exemplo, mediante o aumento da resposta imunitária, particularmente mediante o aumento da proliferação e diferenciação de células B e/ou T, a doença infeciosa pode ser tratada. A resposta imunitária pode ser aumentada por meio da intensificação de uma resposta imunitária existente ou por meio da iniciação de uma nova resposta imunitária. Alternativamente, a composição terapêutica da presente invenção também pode diretamente inibir o agente infeccioso, sem necessariamente elicitar uma resposta imunitária.
Os vírus são um exemplo de um agente infeccioso que pode causar doença ou sintomas que podem ser tratados por uma composição terapêutica da presente invenção. Os exemplos de vírus incluem, porém sem limitação, as seguintes famílias virais de ADN e ARN: Arbovirus, Adenoviridae, Arenaviridae, Arterivirus, Birnaviridae, Bunyaviridae, Caliciviridae, Circoviridae, Coronaviridae, Flaviviridae, Hepadnaviridae (Hepatite), Herpesviridae (como, citomegalovírus, Herpes Simplex, Herpes Zoster), Mononegavirus (por exemplo, Paramyxoviridae, Morbilivírus, Rhabdoviridae), Orthomyxoviridae (por exemplo, Influenza), Papovaviridae, Parvoviridae, Picornaviridae, Poxviridae (como variola ou vaccinia), Reoviridae (por exemplo, Rotavirus), Retroviridae (HTLV-I, HTLV-II, Lentivirus) e Togaviridae (por exemplo, Rubivirus). Os vírus que estão incluídos nestas famílias podem causar uma variedade de doenças ou sintomas, incluindo, porém sem limitação: artrite, bronquiolite, encefalite, infeções oculares (por exemplo, conjuntivite, ceratite), síndrome de fadiga crónica, hepatite (A, B, C, E, ativa crónica, Delta), meningite, infeções oportunistas (por exemplo, SIDA), pneumonia, linfoma de Burkitt, varicela, febre hemorrágica, sarampo, parotidite, parainfluenza, raiva, constipação, pólio, leucemia, rubéola, doenças sexualmente transmitidas, doenças de pele (por exemplo, Kaposi's, verrugas) e viremia. Uma composição terapêutica da presente invenção pode ser utilizada para tratar qualquer um destes sintomas ou doenças.
De modo semelhante, os agentes bacterianos ou fúngicos que podem causar doença ou sintomas e que podem ser tratados por uma composição terapêutica da presente invenção incluem, porém sem limitação, as seguintes famílias bacterianas Gram-negativas e Gram-positivas e fungos: Actinomycetales (por exemplo, Corynebacterium, Mycobacterium, Norcardia), Aspergillosis, Bacillaceae (por exemplo, Anthrax, Clostridium), Bacteroidaceae, Blastomycosis, Bordetella, Borrelia, Brucellosis, candidiase, Campylobacter, Coccidioidomycosis, Cryptococcosis, Dermatocycoses, Enterobacteriaceae (Klebsiella, Salmonella, Serratia, Yersinia), Erysipelothrix, Helicobacter, Legionellosis, Leptospirosis, Listeria, Mycoplasmatales, Neisseriaceae (por exemplo, Acinetobacter, gonorreia, meningococos), infeções por Pasteurellacea (por exemplo, Actinobacillus, Heamophilus, Pasteurella), Pseudomonas, Rickettsiaceae, Chlamydiaceae, sífilis e estafilococos. Estas famílias bacterianas ou fúngicas podem causar as seguintes doenças ou sintomas, incluindo, porém sem limitação: bacteremia, endocardite, infeções oculares (conjuntivite, tuberculose, uveite), gengivite, infeções oportunistas (por exemplo, infeções relacionadas a SIDA), paroníquia, infeções relacionadas a prótese, doença de Reiter, infeções do trato respiratório, como tosse convulsiva ou empiema, sepsia, doença de Lyme, doença de arranhão de gato, disenteria, febre paratifóide, envenenamento alimentar, tifoide, pneumonia, gonorreia, meningite, clamidia, sífilis, difteria, lepra, paratuberculose, tuberculose, lúpus, botulismo, gangrena, tétano, impetigo, febre reumática, escarlatina, doenças sexualmente transmitidas, doenças de pele (por exemplo, celulite, dermatocicoses) , toxemia, infeções do trato urinário, infeções de ferimentos. Uma composição terapêutica da presente invenção pode ser utilizada para tratar qualquer um destes sintomas ou doenças.
Ademais, os agentes parasíticos que causam doença ou sintomas que podem ser tratados por uma composição terapêutica da presente invenção incluem, porém sem limitação, as seguintes famílias: Amebíase, Babesiose, Coccidiose, Criptosporidiose, Dientamoebíase, Dourina, Ectoparasitas, Giardíase, Helmintose, Leishmaniose, Teileriose, Toxoplasmose, Tripanossomose e Tricomonas. Estes parasitas podem causar uma variedade de doenças ou sintomas, incluindo, porém sem limitação: Sarna,
Trombiculíase, infeções oculares, doença intestinal (por exemplo, disenteria, giardíase), doença hepática, doença pulmonar, infeções oportunistas (por exemplo, relacionadas a SIDA), malária, complicações da gravidez e toxoplasmose. Uma composição terapêutica da presente invenção pode ser utilizada para tratar qualquer um destes sintomas ou doenças.
Regeneração
Uma composição terapêutica da presente invenção pode ser utilizada para diferenciar, proliferar e atrair células, estimulando a regeneração de tecidos. (Veja-se, Science 276:59-87 (1997).) A regeneração de tecidos poderá ser utilizada para reparar, substituir ou proteger tecido danificado por defeitos congénitos, trauma (ferimentos, queimaduras, incisões ou úlceras), idade, doença (por exemplo, osteoporose, osteoartrite, doença periodontal, insuficiência do fígado), cirurgia, incluindo cirurgia plástica cosmética, fibrose, lesão de reperfusão ou dano de citocina sistémica.
As composições terapêuticas da invenção podem promover a regeneração de uma variedade de tecidos, incluindo, porém sem limitação, órgãos (por exemplo, pâncreas, fígado, intestino, rim, pele, endotélio), músculo (liso, esquelético ou cardíaco), vascular (incluindo endotélio vascular), tecido nervoso, hematopoiético e esquelético (osso, cartilagem, tendão e ligamento). De preferência, a regeneração incorre numa pequena quantidade de cicatrização ou ocorre sem cicatrização. A regeneração também pode incluir angiogénese.
Ademais, uma composição terapêutica da presente invenção pode aumentar a regeneração de tecidos difíceis de curar. Por exemplo, a regeneração de tendão/ligamento aumentada iria acelerar o tempo de recuperação após dano. Uma composição terapêutica da presente invenção também poderá ser utilizada de forma profilática num esforço para evitar dano. As doenças específicas que poderão ser tratadas incluem tendinite, síndrome do túnel do carpo e outros defeitos de tendão ou ligamento. Um exemplo adicional de regeneração de tecido de ferimentos não cicatrizantes inclui úlceras de pressão, úlceras associadas à insuficiência vascular, ferimentos cirúrgicos e traumáticos.
De modo semelhante, o tecido nervoso e cerebral também poderá ser regenerado com a utilização de uma composição terapêutica da presente invenção para proliferar e diferenciar as células nervosas. As doenças que poderão ser tratadas com a utilização deste método incluem doenças do sistema nervoso periférico e central, neuropatias ou distúrbios mecânicos ou traumáticos (por exemplo, distúrbios da medula espinhal, trauma da cabeça, doença cerebrovascular e acidente vascular cerebral). Especificamente, as doenças associadas a lesões do nervo periférico, neuropatia periférica (por exemplo, que resulta da quimioterapia ou outras terapias médicas), neuropatias localizadas, e doenças do sistema nervoso central (por exemplo, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Huntington, esclerose lateral amiotrófica e sindrome de Shy-Drager), poderão ser todas tratadas com a utilização das composições terapêuticas da presente invenção. Em relação a distúrbios do SNC, inúmeros meios são conhecidos na técnica para facilitar o acesso terapêutico ao tecido cerebral, incluindo métodos para romper a barreira sangue-cérebro, e métodos de acoplamento de agentes terapêuticos a partes que fornecem transporte para o SNC. Numa modalidade, um ácido nucleico terapêutico é manipulado para codificar uma proteína de fusão, tal proteína de fusão compreende uma parte de transporte e uma proteína terapêutica. Alternativamente, as presentes composições podem ser entregues diretamente ao SNC.
Quimiotaxia
Numa modalidade, uma composição terapêutica da invenção pode modular a quimiotaxia. Por exemplo, numa modalidade, um polipéptido terapêutico da presente invenção possui uma atividade de quimiotaxia. Uma molécula quimiotáxica atrai ou mobiliza células (por exemplo, monócitos, fibroblastos, neutrófilos, células T, mastócitos, eosinófilos, células epiteliais e/ou endoteliais) num sítio particular no corpo, como inflamação, infeção ou sítio de hiperproliferação. As células mobilizadas podem, então, combater e/ou curar o trauma ou anormalidade particular.
Por exemplo, um polipéptido terapêutico pode aumentar a atividade quimiotáxica de células particulares. Estas moléculas quimiotáticas podem ser, então, utilizadas para tratar inflamação, infeção, distúrbios de hiperproliferação ou qualquer distúrbio do sistema imune mediante o aumento do número de células direcionadas a um local particular no corpo. Por exemplo, as moléculas quimiotáxicas podem ser utilizadas para tratar ferimentos e outros traumas para os tecidos atraindo-se as células imunes para o local lesionado. As moléculas quimiotáticas da presente invenção também podem atrair fibroblastos, que podem ser utilizados para tratar ferimentos.
Também é contemplado o facto de que uma composição terapêutica da presente invenção pode inibir a atividade quimiotática. Estas composições terapêuticas também poderão ser utilizadas para tratar distúrbios. Dessa forma, uma composição terapêutica da presente invenção poderá ser utilizada como um inibidor de quimiotaxia. São especialmente preferenciais para utilização as proteínas pró-terapêuticas que são ativadas nas proximidades de tecidos alvo.
Os polipéptidos terapêuticos adicionais contemplados para utilização incluem, porém sem limitação, fatores de crescimento (por exemplo, hormona do crescimento, fator de crescimento semelhante a insulina 1, fator de crescimento derivado de plaqueta, fator de crescimento epidérmico, fatores de crescimento de fibroblasto ácido e básico, fator de crescimento de transformação β, etc.), para tratar distúrbios de crescimento ou sindromes de desnutrição aguda; e anticorpos (por exemplo, humanos ou humanizados), para fornecer imunização passiva ou proteção de um indivíduo contra antigénios ou patógenos estranhos (por exemplo, H. Pylori), ou para fornecer tratamento de cancro, artrite ou doença cardiovascular; citocinas, interferons (por exemplo, interferon (IFN), IFN-a2b e 2a, IFN-α Nl, IFN~31b, IFN-gama), interleucinas (por exemplo, IL-1 a IL-10), fator de necrose de tumor (TNF-a TNF-β), quimiocinas, fator estimulador de colónia de macrófagos e granulócitos (GM-CSF), hormonas de polipéptido, polipéptidos antimicrobianos (por exemplo, polipéptidos antibacterianos, antifúngicos, antivirais e/ou antiparasíticos), enzimas (por exemplo, adenosina desaminase), gonadotrofinas, quimiotactinas, proteínas de ligação ao lípido, filgastim (Neupogen), hemoglobina, eritropoietina, insulinotropina, imiglucerase, sarbramostima, ativador de plasminogénio de tecido (tPA), uroquinase, estreptoquinase, fenilalanina amónia liase, fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), fator de crescimento de nervo (NGF), trombopoietina (TPO), superóxido dismutase (SOD), adenosina desamidase, catalase calcitonina, endotelial, L-asparaginase pepsina, uricase tripsina, quimotripsina elastase, carboxipeptidase lactase, fator intrínseco de sucrase, calcitonina, hormona semelhante a hormona paratiroide (PTH), CD4 solúvel, e anticorpos e/ou fragmentos de ligação ao antigénio (por exemplo, FAbs) dos mesmos (por exemplo, ortoclone OKT-e (anti-CD3), anticorpo monoclonal GPIIb/lIa). São adicionalmente contemplados os ARNs terapêuticos que direcionam ácidos nucleicos que codificam tais fatores.
Vacina
Numa modalidade, a revelação fornece métodos para vacinação de um paciente. Os métodos compreendem administrar uma composição da invenção com capacidade para produzir o epítopo desejado. Numa modalidade preferencial, a composição compreende um constructo de ácido nucleico terapêutico com capacidade para expressar uma proteína que compreende o epítopo.
Aplicações Cosméticas
Numa modalidade, a invenção fornece poliplexos de ácido nucleico de quitosano DD para utilização cosmética. Os presentes produtos cosméticos compreendem poliplexos de ácido nucleico de quitosano DD numa formulação adequada para a utilização cosmética.
EXEMPLOS
Formação de quitosano duplamente derivado e formação de poliplexos de ADN 0 quitosano foi duplamente derivado com arginina e ácido glucónico (quitosano DD) de acordo com os métodos bem conhecidos. 0 quitosano DD foi poliplexado com um vetor de ADN que codifica fosfatase alcalina secretada (SEAP) ou siRNA de luciferase.
Transfeção in vitro com poliplexo de ADN
Em geral, a transfeção in vitro de células 293T com formulações de poliplexo de ácido nucleico de quitosano DD foi realizada em duas etapas: preparação de células seguida de transfeção.
Manutenção de linhagens de células A linhagem de células 293T foi cortesia do laboratório do Dr. Kieffer em UBC e foram preparadas conforme exposto a seguir. As células de rim humano foram transformadas com o SV40 T-antigénio; cultivadas em meio de Eagle modificado com solução Dulbecco (DMEM) com alto teor de glucose que contém soro fetal bovino a 10% (FBS) e penicilina/estreptomicina; e mantidas abaixo de 80% de confluência. HT1080 (células epiteliais de tecido conjuntivo humano) e HeLa (células epiteliais cervicais humanas) são cultivadas em MEM (meio essencial mínimo) que contém FBS a 10% e penicilina/estreptomicina; e mantidas abaixo de 90% de confluência. VERO (células epiteliais de rim de macaco) são cultivadas em DMEM que contém FBS inativado por aquecimento a 10% (56 °C durante 30 min.), 1 mM de piruvato de sódio e 500 ug/mL de gentamicina; e mantidas abaixo de 90% de confluência. NIH3T3 (fibroblastos embrionários de ratinho) são cultivados em DMEM que contém FBS a 10% e penicilina/estreptomicina; e mantidos abaixo de 90% de confluência.
Preparação de células para transfeção
As células foram preparadas para transfeção conforme exposto a seguir. No dia antes da transfeção, as células 293T foram adicionadas às placas de cultura de tecido de 6 poços (4,5 x 105 células/poço) em 3 mL de meio completo (DMEM com alto teor de glucose + FBS a 10% + pen/estrep) . No dia da transfeção, a contagem de células foi determinada para dois poços selecionados por meio da lavagem das células 1 X com solução salina tamponada com fosfato (PBS), tripsinização das células com 0,5 mL de tripsina a 0,05%, adição de 0,5 mL de meio completo e contagem de 10 mL com a utilização de um hemocitómetro. Se as células forem -50% confluentes (-7 x 105 células/poço), então, a transfeção prossegue. (Se as células forem muito escassas ou confluentes demais, então, a transfeção não processegue.) De modo semelhante, no dia antes da transfeção, as células HeLa foram colocadas em placas em 1 x 105 células/poço, enquanto que as células HT1080, NIH3T3 e VERO foram colocadas em placas em 2 x 105 células/poço em 3 mL de seu respetivo meio completo e a transfeção foi feita no dia seguinte em -50% de confluência.
Transfeção de células A transfeção foi realizada conforme exposto a seguir. Primeiramente, o meio foi removido de cada poço seguido da adição de 1 mL de Opti-mem (pH 7,4) to a cada poço, agitando delicadamente e, então, remoção. (Seis poços foram lavados de uma vez para prevenir o deslocamento das células.) Então, outro 1 mL de Opti-mem (pH 7,4) foi adicionado cuidadosamente a cada poço para não deslocar as células. Em seguida, as amostras de poliplexo foram adicionadas a cada poço (alvo de 2 mg de ADN) , agitadas e incubadas a 37 °C durante 2 h. Após a incubação, o meio foi removido e substituído por 2 mL de meio completo e reincubado a 37 °C. Nos pontos no tempo exigidos, o sobrenadante foi removido e armazenado a -20 °C para o ensaio de SEAP subsequente.
Ensaio de proteína de SEAP O ensaio de SEAP foi realizado com a utilização do kit de ensaio quemiluminescente de SEAP. Todos os reagentes para o ensaio foram equilibrados a 25 °C durante 30 min. antes da utilização. Os padrões para o ensaio foram preparados mediante a dissolução de fosfatase alcalina placentária a 1 mg/mL em tampão de diluição 1 X a partir do kit fortificados com albumina sérica bovina a 0,1% e glicerol a 50% e, então, diluição por meio de diluições seriais de 10 vezes com DMEM a 0,01 pg/uL. Os padrões e amostras descongeladas foram, então, diluídos 1 em 4 com tampão de diluição, inativados por aquecimento a 65 °C durante 30 min., incubados em gelo durante 2 min., centrifugados (16100 x rcf durante 2 min. em RT) e os sobrenadantes transferidos para novos tubos. Após o equilíbrio a 25 °C durante 5 min., 50 uL das amostras e padrões foram adicionados a cada poço de uma placa Microlite-1 em duplicata. O tampão de inativação (50 uL) foi, então, adicionado a cada poço e pipetado para cima e para baixo delicadamente para misturar, sem a criação de bolhas e incubados durante 5 min. O substrato/reagente intensificador foi preparado durante a incubação de 5 min. numa razão para 1:19 de substrato e intensificador. O substrato/intensificador foi, então, adicionado a cada poço, incubado durante 20 min. e, então, a placa foi lida no luminómetro (Lmaxll384, Molecular Devices) com um tempo de integração de 1 s.
Ensaio de mARN de SEAP - Reação em cadeia de polimerase em tempo real quantitativo (Q-RT-PCR) A quantificação relativa da expressão de mARN de SEAP em diversas amostras foi determinada por Q-RT-PCR. Brevemente, mARN total foi extraído e purificado com a utilização do reagente TRIzol e Q-RT-PCR foi feita com a utilização de Superscript II. Os iniciadores de gene de SEAP e sonda fluorigénica foram projetados com a utilização de Primer Express (Versão 1.5) (Applied Biosystems, Foster City, Califórnia). 0 sistema de detecção de sequência ABI 7000 (Applied Biosystems) foi utilizado para realizar todas as reações em cadeia de polimerase (PCR) num volume total de 25 mL. Cada mistura de reação continha 1 x TaqMan Universal Master Mix, 20 mM de cada iniciador e 10 mM de sonda. Dez microlitros de cada ADN complementar (equivalente a 4,5 a 45 ng de ARN total transcrito reverso) foram utilizados em cada reação PCR. O processo PCR consistiu numa incubação inicial a 50 °C durante 2 min., seguida de uma incubação de 10 min. a 95 °C, 40 ciclos de PCR a 95 °C durante 15 segundos e 1 minuto a 60 °C. Cada placa de ensaio de 96 poços continha menos transcriptase reversa e menos controles de ADN complementares. Os resultados foram normalizados para o gene de manutenção GAPDH (gene de referência) e expressos como a razão de expressão de genes alvo relativa entre o tecido tratado e o tecido de controlo não tratado. O método é mencionado como método de Pfaffl (Pfaffl MW. Nucleic Acids Res (2001) 29:e45)
Transfeção por Knockdown de siRNA de células 0 knockdown da expressão de genes foi realizado primeiramente transfetando as células hospedeiras com siRNA/poliplexos de quitosano dd modificado, seguido da transfeção das mesmas células hospedeiras com ADN/Lipofectamina 2000.
No dia antes da transfeção, 9 x 104 células 293 T/poço de uma placa de 24 poços em 1 mL de meio completo foram colocadas em placas. No dia da transfeção, as células (50% confluentes) foram lavadas Opti-mem antes da transfeção. As células foram lavadas mediante a remoção do meio no poço, adição de volta de 0,25 mL de Opti-mem, agitação no lugar seguida da remoção do Opti-mem e substituição por 0,25 mL de Opti-mem fresco. A transfeção de siRNA foi realizada mediante a adição de 200 nM de siRNA/poliplexo de quitosano modificado a cada poço e a incubação a 37 °C num incubador de CO2 a 5%. Após 2 h, o Opti-mem foi removido e substituído por 0,5 mL de meio completo. A transfeção de ADN foi realizada por meio da adição de 0,4 ug de partículas de Lipofectamina que contêm luciferase a cada poço e da incubação a 37 °C num incubador de CO2 a 5%. Após 2 h, o meio foi removido e substituído por 0,5 mL de meio completo fresco e, então, as células foram retornadas para o incubador. Quarenta e oito horas após a transfeção com siRNA, o lisato celular foi recolhido para o ensaio de luciferase. Para a recolha, as células foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco e fortificadas com 500 ui de tampão de lise Glo, que contém inibidores de protease isentos de EDTA, recolhidas em tubos após 5 min. de incubação e analisadas imediatamente ou armazenadas a -80 °C.
Ensaio de Luciferase 0 ensaio de luciferase foi realizado com a utilização do sistema de ensaio de luciferase Bright-Glo. 0 tampão de lise Glo, tampão Bright- Glo e amostras para o ensaio foram equilibrados à temperatura ambiente antes da utilização. Os padrões para o ensaio foram preparados mediante a diluição de enzima luciferase recombinante QuantiLum em 1 X tampão de lise Glo que contém inibidor de protease isento de EDTA e 1 mg/mL de BSA a 90 ng/mL, então, a 30 ng/mL e, então, diluindo em diluições seriais de 10 vezes a 0,003 ng/mL. O substrato Bright- Glo foi reconstituído com tampão Bright-Glo para produzir o reagente para ensaio Bright-Glo durante pelo menos 10 min. antes da utilização. Cem uL das amostras e padrões foram adicionados a cada poço de uma placa Microlite-1 em duplicata. O reagente para ensaio Bright-Glo (100 uL) foi, então, adicionado a cada poço e incubado durante 2 min. no luminómetro e lido com um tempo de integração de 1 s.
Animais
Os protocolos cirúrgicos para os estudos de animal foram aprovados pelo University of British Columbia Committee for Animal Care. O trabalho de animal foi conduzido por equipe qualificada e treinada, os ratinhos C57BL/6 fêmeas com ~8 semanas de idade foram adquiridos junto à Jackson Laboratory (Bar Harbour, Maine). Os ratinhos foram alojados 2 a 4 animais por gaiola num ciclo de claro/escuro de 12 h e com uma semana para aclimatizarem, bem como alimentação para roedor padrão (Research Diets Inc., New Brunswick, NJ) e água ad libitum. Os ratinhos foram alojados numa instalação para animal no Department of Physiology, University of British Columbia (UBC).
Transfeção de cólon em ratinhos
Os ratinhos C57BL/6 virgens foram anestesiados (1,5 a 2,0% de inalante de isoflurano, Baxter CA2L9108) e receberam uma entrega de enema única de poliplexo de ADN de quitosano DD funcionalizado ou poliplexo de ADN de quitosano DD não funcionalizado carregando plasmídeo gWiz- SEAP em 0,25 mg/mL. Após 2 dias, os ratinhos foram sacrificados e os tecidos foram colhidos.
Transfeção de ratinho in vivo: Entrega de poliplexo no músculo
Para a entrega de marcador ao músculo de ratinho, o poliplexo de ADN de quitosano DD que compreende o vetor de expressão de SEAP é administrado por injeção no tendão medial. Os ratinhos são anestesiados e 50 uL de poliplexo são injetados através de seringa. Em diversos pontos no tempo, os ratinhos são sacrificados e seus tecidos musculares recolhidos e processados para a expressão de mARN de SEAP. ADN é injetado isoladamente como controlo. A liofilização e reconstituição de poliplexos de ácido nucleico de quitosano DD com água de poliplexos de ácido nucleico de quitosano DD congelados a -80 °C (280 ul cada) foram colocados num recipiente pré-arrefecido. O recipiente foi, então, ligado a um liofilizador (SAVANT-Modulyo D). Os poliplexos foram secos por congelamento sob pressão constante de 5 torr à temperatura < - 40 °C durante mais de 28 horas. Após a liofilização, os poliplexos de ácido nucleico de quitosano DD foram reconstituídos com água para a concentração original para os experimentos subsequentes.
Resultados
As Figuras 2 a 4 e 7 mostram as eficiências de transfeção de quitosano derivado com ácido glucónico apenas (Figura 2A) , arginina apenas (Figura 2B) ou quitosano duplamente derivado tanto com ácido glucónico como com arginina em comparação com o quitosano derivado com apenas arginina ou ácido glucónico (Figuras 3 e 7) . As Figuras 3 e 7 mostram um efeito sinérgico quando o quitosano é duplamente derivado tanto com arginina como com ácido glucónico. 0 efeito sinérgico pode ser visto quando o quitosano é duplamente funcionalizado com arginina a um grau de funcionalização final de 26% e ácido glucónico em graus de funcionalização final que se situam na faixa de 3% a 9%, embora o efeito maior fosse visto num grau de funcionalização final de ácido glucónico de cerca de 5% (Figura 4; veja-se também a Figura 7 que mostra um efeito sinérgico com o quitosano duplamente funcionalizado com arginina e ácido glucónico em graus de funcionalização finais de 26% e 6%, respetivamente) . As Figuras 5 e 6 mostram o efeito da razão de N/P e pH da formulação de poliplexo, respetivamente, na eficiência de transfeção. As eficiências de transfeção tanto do quitosano derivado com (1) arginina apenas como (2) arginina e ácido glucónico foram diretamente correlacionadas com a razão de N/P, embora o quitosano duplamente derivado tivesse uma eficiência de transfeção maior que o quitosano derivado com arginina isoladamente em todas as razões de N/P testadas (Figura 5). Em contrapartida, o pH não afetou a eficiência de transfeção (Figura 6) . 0 efeito sinérgico também pode ser visto através de linhagens de células diferentes ex vivo (Figura 8), para siRNA (Figura 11) e in vivo (Figuras 9 a 10) . A entrega intramuscular de poliplexo de ADN de quitosano DD resulta no aumento significativo da expressão de mARN de SEAP em células musculares in vivo (Figura 9). Adicionalmente, os aumentos relativos em mARN de SEAP em tecido de cólon dos ratinhos tratados em relação aos ratinhos virgens (não transfetados) são mostrados (Figura 10). Os poliplexos de ácido nucleico de quitosano DD tanto congelados como liofilizados mostraram estabilidade em propriedades fisico-quimicas após o armazenamento à temperatura ambiente durante 3 meses. Estes poliplexos também mantiveram sua estabilidade após a incubação de um dia para o outro, seguida por reconstituição com água (Figura 12) .
Certas modificações e aperfeiçoamentos irão ocorrer para aqueles peritos na especialidade mediante uma leitura da descrição mencionada anteriormente. Deve-se compreender que todas as modificações e aperfeiçoamentos foram deletadas no presente documento por uma questão de concisão e legibilidade, mas são adequadamente abrangidas pelo âmbito das reivindicações a seguir.

Claims (17)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Nanopartícuia de derivado de quitosano caracterizada por compreender quitosano acoplado com ácido glucónico e arginina.
  2. 2. Nanopartícuia, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o referido quitosano ser acoplado com ácido glucónico a uma concentração inicial de 5% a 60%, opcionalmente 8% a 30% e ainda opcionalmente 3% a 10%.
  3. 3. Nanopartícuia, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada por o referido quitosano ser acoplado com ácido glucónico a uma concentração final de 5%.
  4. 4. Nanopartícuia, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada por o referido quitosano ser acoplado com arginina a uma concentração de 10% a 55%.
  5. 5. Composição caracterizada por compreender a nanopartícula, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que o referido quitosano é complexado com um ácido nucleico para formar um poliplexo de ácido nucleico de quitosano duplamente derivado (DD) .
  6. 6. Composição, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada por o referido ácido nucleico ser selecionado do grupo que consiste em ácido nucleico de péptido (PNA), fosforodiamidato morfolino oligo (PMO), ácido nucleico bloqueado (LNA), ácido nucleico de glicol (GNA) e ácido nucleico de treose (TNA).
  7. 7. Composição, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada por o referido ácido nucleico ser ADN ou ARN.
  8. 8. Composição, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por o referido ARN ser selecionado do grupo que consiste em ARN antissentido, siARN, ARN em grampo curto, micro ARN e ARN enzimático.
  9. 9. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, caracterizada por a razão entre amina e fosfato do referido poliplexo de ácido nucleico de quitosano DD ser entre 2 e 100, e ser opcionalmente entre 2 e 50, e ser ainda opcionalmente entre 2 e 30 e ser ainda opcionalmente entre 2 e 15.
  10. 10. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 5 a 9, caracterizada por o referido poliplexo de ácido nucleico de quitosano DD ter um grau combinado de funcionalização com a referida arginina e o referido ácido glucónico de 1 a 60%, e ter opcionalmente um grau combinado de funcionalização com a referida arginina e o referido ácido glucónico de 1 a 30%.
  11. 11. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 5 a 10, caracterizada por o referido poliplexo de ácido nucleico de quitosano DD compreender moléculas de quitosano que têm um peso molecular médio menor que 110 kDa, opcionalmente menor que 65 kDa, ainda opcionalmente menor que 50 kDa, ainda opcionalmente menor que 30 kDa, ainda opcionalmente menor que 10 kDa ou ainda opcionalmente menor que 5 kDa antes do acoplamento com o referido ácido glucónico e a referida arginina.
  12. 12. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 5 a 11, caracterizada por o referido poliplexo de ácido nucleico de quitosano DD ter um índice de polidispersidade média (PDI) menor que 0,5, opcionalmente menor que 0,4, ainda opcionalmente menor que 0,3 ou ainda opcionalmente menor que 0,25.
  13. 13. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 5 a 12, caracterizada por o referido poliplexo de ácido nucleico de quitosano DD ter uma razão molar entre a referida arginina e o referido ácido glucónico entre 100:1 e 1:100, opcionalmente entre 50:1 e 1:50, ainda opcionalmente entre 10:1 e 1:10, ainda opcionalmente entre 5:1 e 1:5 ou ainda opcionalmente entre 2:1 e 1:2
  14. 14. Método in vitro de entregar uma molécula de ácido nucleico a uma célula caracterizado por compreender colocar a referida célula em contacto com uma composição que compreende uma nanopartícuia de derivado de quitosano, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13.
  15. 15. Composição caracterizada por compreender uma nanopartícula de derivado de quitosano, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, para utilização no tratamento de diabetes, em que a nanopartícula é complexada com uma molécula de ácido nucleico que codifica insulina, um antagonista de glucagom, GLP-1 ou leptina para formar um poliplexo de ácido nucleico de quitosano duplamente derivado (DD).
  16. 16. Composição caracterizada por compreender uma nanopartícula de derivado de quitosano, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, para utilização no tratamento de doença inflamatória intestinal, em que a nanopartícula é complexada com uma molécula de ácido nucleico que codifica IL-10, um antagonista de TNFa ou um antagonista de IL-17 para formar um poliplexo de ácido nucleico de quitosano duplamente derivado (DD).
  17. 17. Composição caracterizada por compreender uma nanopartícula de derivado de quitosano, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, para utilização no tratamento de obesidade, em que a nanopartícula é complexada com uma molécula de ácido nucleico que codifica leptina, colecistoquinina, PYY ou GLP-1 para formar um poliplexo de ácido nucleico de quitosano duplamente derivado (DD).
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