CN116693708B - 一种高活性鲍鱼内脏多糖及其低共熔溶剂提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高活性鲍鱼内脏多糖及其低共熔溶剂提取方法，涉及海洋动物废弃物的深加工技术领域，包括如下步骤：S01：将鲍鱼内脏废弃物进行粉碎并进行脱脂处理；S02：以氯化胆碱为氢键受体，乙二醇为氢键供体，制备低共熔溶剂DES；S03：将制备的低共熔溶剂DES与脱脂后的鲍鱼内脏混合，并在超声波辅助的条件下提取鲍鱼内脏中的粗多糖，并过滤取得DES提取液；S04：对DES提取液进行醇沉处理得到鲍鱼内脏粗多糖；S05：采用大孔吸附树脂和葡聚糖凝胶层析技术对鲍鱼内脏粗多糖进行纯化处理，并收集多糖洗脱液；S06：对多糖洗脱液进行冷冻干燥得到鲍鱼内脏多糖。本发明使鲍鱼内脏多糖提取绿色、高效、简单、能耗低、成本低，且多糖的提取率与活性都高。
Description
技术领域
本发明涉及海洋动物废弃物的深加工技术领域，具体涉及一种高活性鲍鱼内脏多糖及其低共熔溶剂提取方法。
背景技术
近年来，随着鲍鱼人工养殖技术的不断成熟，世界鲍鱼产业发展迅速，我国鲍鱼总产量稳居世界第一。根据2020年中国渔业统计数据显示，截至2019年，我国鲍鱼总产量达18万吨，约占全球总产量的87%。随着养殖业和加工业规模的不断扩大，在鲍鱼加工过程中也随之产生了大量的鲍鱼内脏废弃物。经研究发现，约占鲍鱼总质量20%的内脏废弃物中含有丰富的生物活性组分，如多糖、蛋白质、氨基酸和脂肪酸等，然而，目前除小部分内脏废弃物被加工为低价值饲料外，绝大多数的鲍鱼内脏会被直接丢弃而未得到有效利用，不仅造成宝贵资源的浪费，也对生态环境造成了严重负担。
海洋特殊的生长环境导致海洋动物多糖往往具有特殊的分子结构和生物活性。经研究发现，海洋动物多糖通常为酸性多糖，富含有硫酸基团和糖醛酸基团，多糖支链结构复杂，一般具有较高的生物活性。目前，海洋动物多糖的提取方法主要有水提法、碱提法和酶解法，其中，传统水提法不仅提取时间长、能源消耗大，而且多糖提取率较低；碱提法虽然可以破坏糖肽键的稳定性而提高多糖提取率，但易引发多糖脱硫或分子降解；酶解法提取条件温和，但反应时间长，且成本相对较高，难以进行产业化。
低共熔溶剂（DES）提取是近年来发展起来的绿色提取方法。低共熔溶剂DES作为一类新型绿色介质，是由一定摩尔比的氢键供体和氢键受体通过分子间氢键所形成的在室温条件下呈液态的均一混合物。低共熔溶剂DES可通过提供或接受外部电子或质子形成氢键而具有较高的溶解性，且低共熔溶剂DES成本低、制备简单、无污染。目前，采用低共熔溶剂DES从海洋动物中提取多糖的研究与相关方法尚未见报道。因此，提供一种高效、绿色的提取鲍鱼内脏中活性多糖的方法已成为鲍鱼内脏废弃物乃至海洋动物废弃物资源开发与利用亟待解决的首要问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种高活性鲍鱼内脏多糖及其低共熔溶剂提取方法，以解决上述技术问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种高活性鲍鱼内脏多糖的低共熔溶剂提取方法，包括如下步骤：
S01：将鲍鱼内脏废弃物进行粉碎，并对粉碎后的鲍鱼内脏进行脱脂处理得到鲍鱼内脏脱脂物；
S02：以氯化胆碱为氢键受体，乙二醇为氢键供体，制备低共熔溶剂DES；本发明方法所采用的低共熔溶剂DES具有性质稳定，多糖提取率高、成本低、绿色安全等优点；
S03：将制备的低共熔溶剂DES与鲍鱼内脏脱脂物混合，并在超声波辅助的条件下提取鲍鱼内脏中的粗多糖，并过滤取得DES提取液；低共熔溶剂DES在超声波辅助的条件下提取鲍鱼内脏脱脂物，有效提高溶剂对多糖的提取能力；
S04：对DES提取液进行醇沉处理后收集沉淀物，得到鲍鱼内脏粗多糖；
S05：采用大孔吸附树脂和葡聚糖凝胶层析技术对鲍鱼内脏粗多糖进行纯化处理，并收集多糖洗脱液；
S06：对多糖洗脱液进行冷冻干燥得到鲍鱼内脏多糖。
进一步地，步骤S01中的脱脂溶剂为沸程60℃～90℃的石油醚，且鲍鱼内脏的脱脂方法为：将料、液以1:40 g/mL的比例进行混合得到混合物，对混合物磁力搅拌4h后静置，然后弃去上层石油醚，如此重复脱脂处理3次后收集鲍鱼内脏脱脂物，最后烘干脱脂物至石油醚被完全去除，即得鲍鱼内脏脱脂粉。
进一步地，步骤S02中的所述低共熔溶剂DES的制备方法为：将混合后的氯化胆碱和乙二醇在85℃条件下磁力搅拌2～3h，直至溶液呈均一透明状态，其中，所述低共熔溶剂DES中氯化胆碱和乙二醇的摩尔比为1：3，且所述低共熔溶剂DES中的水含量为25%（w/w）。
进一步地，步骤S03中，鲍鱼内脏脱脂物与低共熔溶剂DES的料液比为1:30 g/mL～1:50 g/mL，提取时间为30min～50min，提取温度为70℃～80℃，超声波功率为总功率的80%～100%，其中，超声波功率总功率为300W。
更进一步地，鲍鱼内脏脱脂物与低共熔溶剂DES的料液比为1:40 g/mL，提取时间为40min，提取温度为73℃，超声波功率为总功率的90%。
进一步地，步骤S04中采用无水乙醇进行醇沉，使乙醇终浓度为80%。
进一步地，步骤S05中，大孔吸附树脂可采用AB-8、D101、S-8、NKA-9，葡聚糖凝胶可采用Sephadex G-100。
进一步地，步骤S06中的冷冻干燥处理过程在-80℃的真空条件下进行。
本发明的另一种技术方案公开了：
一种高活性鲍鱼内脏多糖，该高活性鲍鱼内脏多糖使用上述所述的高活性鲍鱼内脏多糖的低共熔溶剂提取方法制得。
本发明采用氯化胆碱-乙二醇制备的低共熔溶剂作为萃取剂，提取鲍鱼内脏中多糖组分，多糖提取率为16.84±1.32%，较常规水提法提高了57.5%。
同时，上述高活性鲍鱼内脏多糖在制备具有抗氧化功能和/或增强免疫力的产品方面的应用也属于本发明的保护范围。
相关研究表明，该发明制备的鲍鱼内脏多糖对活性氧自由基具有较高的清除能力，即具有较强的抗氧化能力；且该发明制备的鲍鱼内脏多糖对RAW264.7巨噬细胞的吞噬能力及一氧化氮（NO）释放能力具有一定调节作用，即具有良好的免疫调节活性。
从上述的技术方案可以看出，本发明的优点是：
（1）本发明的氯化胆碱-乙二醇低共熔溶剂使本发明方法具有绿色、高效、操作简单、能耗低、成本低、且多糖提取率与活性高等优点，本发明方法的应用对鲍鱼内脏及其它海洋动物废弃物的开发与高值化利用具有重要的推动作用；
（2）本发明采用单因素试验及响应面优化设计等方法对低共熔溶剂提取鲍鱼内脏多糖的提取参数条件进行优化，可为实际生产提供可靠的参考，为鲍鱼内脏废弃物的变废为宝提供科学指导；
（3）本发明采用低共熔溶剂法提取所得鲍鱼内脏活性多糖，具有较强的抗氧化能力和良好的免疫调节活性，可为鲍鱼内脏多糖作为功能性食品或营养强化剂的研发提供理论基础和技术支撑。
除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将参照图，对本发明作进一步详细的说明。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为不同DES对鲍鱼内脏多糖提取率的影响。
图2为HBA（氯化胆碱）与HBD（乙二醇）摩尔比不同对多糖提取率的影响。
图3为氯化胆碱-乙二醇制备DES的红外图谱。
图4为不同含水量对DES多糖提取率的影响。
图5为料液比对多糖提取率的影响。
图6为提取时间对多糖提取率的影响。
图7为提取温度对多糖提取率的影响。
图8为超声波功率对多糖提取率的影响。
图9a为料液比与提取时间对多糖提取率相互作用的等高线图。
图9b为料液比与提取温度对多糖提取率相互作用的等高线图。
图9c为料液比与超声波功率对多糖提取率相互作用的等高线图。
图9d为提取时间与提取温度对多糖提取率相互作用的等高线图。
图9e为提取时间与超声波功率对多糖提取率相互作用的等高线图。
图9f为提取温度与超声波功率对多糖提取率相互作用的等高线图。
图10为鲍鱼内脏多糖对DPPH自由基的清除率。
图11为鲍鱼内脏多糖对羟基自由基的清除率。
图12为鲍鱼内脏多糖对RAW264.7巨噬细胞活力的影响。
图13为鲍鱼内脏多糖对RAW264.7巨噬细胞吞噬率的影响。
图14为鲍鱼内脏多糖对RAW264.7巨噬细胞NO含量的影响。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下列实施例中所用的材料和试剂等，如无特殊说明，均为商业途径获得。
下列实施例中的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，按本领域内的文献所描述的技术或条件或按照产品说明进行。
实施例一
一种高活性鲍鱼内脏多糖的低共熔溶剂提取方法，包括如下步骤：
S01：将冷冻鲍鱼内脏废弃物进行粉碎后并过100目筛，并将过筛后的鲍鱼内脏粉碎物置于1000mL烧杯中待用，取20g粉碎后的鲍鱼内脏废弃物并加入800mL石油醚（沸程60℃～90℃）混合得到混合物，将混合物在室温下磁力搅拌4h，搅拌完成后的混合物静置6～8h等待固液分离，固液分离后弃去上层石油醚，按照上述步骤如此重复脱脂处理3次后使用4000 g离心力离心处理20min，然后收集沉淀的鲍鱼内脏脱脂物，并使鲍鱼内脏脱脂物在60℃环境下烘干至石油醚被完全去除，待鲍鱼内脏脱脂物恒重后即得鲍鱼内脏脱脂粉；
S02：以氯化胆碱（ChCl）为氢键受体，乙二醇(EG)为氢键供体，将混合后的氯化胆碱和乙二醇在85℃条件下磁力搅拌2～3h，直至溶液呈均一透明状态，制得低共熔溶剂DES，其中，所述低共熔溶剂DES中氯化胆碱和乙二醇的摩尔比为1：3，所述低共熔溶剂DES中的水含量为25%（w/w）；本发明方法所采用的低共熔溶剂DES具有性质稳定，多糖提取率高、成本低、绿色安全等优点；
S03：称取10g鲍鱼内脏脱脂粉置于烧杯中，加入400mL上述制备的低共熔溶剂DES，盖好保鲜膜后置于超声波仪器中进行提取，提取温度为70℃，提取时间为40min，超声波功率为总功率的90%（270W），得到含有鲍鱼内脏粗多糖的提取液；
S04：向提取液中加入4倍体积的无水乙醇进行醇沉处理，使乙醇终浓度为80%，在4℃的环境下醇沉过夜后，以7000g的离心力离心15min后收集沉淀物，对沉淀物冷冻干燥后即得鲍鱼内脏粗多糖（CAVP）；
S05：取质量浓度为25mg/mL的CAVP溶液采用大孔吸附树脂AB-8或D101或S-8或NKA-9进行静态吸附纯化处理，大孔树脂质量与CAVP溶液体积比为1:8，吸附过夜后，抽滤收集滤液，对沉淀物进行冷冻干燥；
S06：将步骤S05中所得的干燥样品以去离子水制备成30mg/mL溶液，采用葡聚糖凝胶进行柱层析纯化处理，并以0.15mol/L氯化钠溶液洗脱，收集洗脱液后浓缩至原体积的1/4，并对浓缩后的洗脱液进行透析除盐处理得到鲍鱼内脏多糖洗脱液，其中，葡聚糖凝胶采用Sephadex G-100；
S07：对步骤S06中所得的多糖洗脱液在-80℃的真空条件下进行冷冻干燥得到纯化后的鲍鱼内脏多糖AVP。
实施例二
鲍鱼内脏多糖的提取方法与实施例1中的高活性鲍鱼内脏多糖的低共熔溶剂提取方法的过程相同，其中，步骤S02中，将氯化胆碱分别与苹果酸（1:1）、乳酸（1:1）、草酸（1:1）、柠檬酸（1:1）、1,2-丙二醇（1:2）、1,4-丁二醇（1:2）、甘油（1:2）、尿素（1:2）、脯氨酸&苹果酸（1:1:1）、1,2-丙二醇&甘油（1:1:1）制成不同的低共熔溶剂DES，不同低共熔溶剂DES的含水量均为30%。步骤S03中，料液比（鲍鱼内脏脱脂粉质量与DES的体积比）取1：30g/mL，在提取温度80℃，超声波功率80%（240W）的条件下超声提取时间30min后，以常规水提法为对照组，各组低共熔溶剂DES对鲍鱼内脏多糖的提取率如图1所示（注：ChCl-氯化胆碱，MA-苹果酸，LA-乳酸，OA-草酸，CA-柠檬酸，EG-乙二醇，PG-1,2-丙二醇，Gl-甘油，But-1,4-丁二醇，Urea-尿素，Pro-羟脯氨酸，Water-水）。
如图1所示，低共熔溶剂DES中氢键供体的类型直接影响了低共熔溶剂DES的多糖提取效果，其中以氯化胆碱为氢键受体，以乙二醇为氢键供体制备而成的低共熔溶剂DES对鲍鱼内脏多糖的提取率最高，显著优于其他各低共熔溶剂DES提取组。
实施例三
鲍鱼内脏多糖的提取方法与实施例1中的高活性鲍鱼内脏多糖的低共熔溶剂提取方法的过程相同，其中，步骤S02中，将氯化胆碱与乙二醇分别按摩尔比1:1、1:2、1:3、1:4和1:5制成不同的DES，不同的DES含水量均为30%。步骤S03中，料液比（鲍鱼内脏脱脂粉质量与DES的体积比）取1：30g/mL，在提取温度80℃，超声波功率80%的条件下超声提取时间30min。各组DES对鲍鱼内脏多糖的提取率的影响如图2所示。
如图2所示，鲍鱼内脏多糖的提取率随乙二醇摩尔含量的增加出现先上升后下降的趋势，这主要由于在一定范围内氢键供体的增加可以促进分子间氢键的形成而有利于多糖提取，但当这种作用力达到饱和以后，继续增加氢键供体无法加速多糖提取且会影响DES的黏度及流动性等，因而DES提取率开始下降。因此，鲍鱼内脏多糖提取过程中采用氯化胆碱与乙二醇的摩尔比1:3为宜。
氯化胆碱与乙二醇在不同摩尔比条件下制备的DES的红外光谱如图3所示。由图可知，不同摩尔比制备的DES的FT-IR图谱与氯化胆碱或乙二醇的FT-IR图谱均有所不同，且兼具有二者特征峰，说明DES制备成功。其中，ChCl中O-H的伸缩振动峰为3259.88 cm-1，而在ChCl-EG中O-H的伸缩振动峰在3300～3303 cm-1，其吸收峰发生蓝移，表明EG与ChCl之间形成了分子间的氢键作用，削弱了ChCl分子内的氢键作用。
实施例四
鲍鱼内脏多糖的提取方法与实施例1中的高活性鲍鱼内脏多糖的低共熔溶剂提取方法的过程相同，其中，步骤S02中，将氯化胆碱与乙二醇按摩尔比1:3制成DES，DES的含水量分别选取0%、10%、15%、20%、25%、30%、35%和40%。步骤S03中，料液比（鲍鱼内脏脱脂粉质量与DES的体积比）取1：30g/mL，在提取温度80℃，超声波功率80%的条件下超声提取时间30min。各组DES对鲍鱼内脏多糖的提取率的影响如图4所示。
如图4所示，DES含水量在25%时多糖提取率最高，且溶液的黏度、极性和表面张力适宜，如表1所示，含水量在25%的DES不会对后续多糖纯化造成困难，因而鲍鱼内脏多糖提取过程中采用含水量25%的DES最宜。
表1 水含量对DES的理化性质及多糖提取率的影响
实施例五
鲍鱼内脏多糖的提取方法与实施例1中的高活性鲍鱼内脏多糖的低共熔溶剂提取方法的过程相同，其中，步骤S02中，将氯化胆碱与乙二醇按摩尔比1:3制成低共熔溶剂DES，且低共熔溶剂DES含水量选取25%；步骤S03中，提取温度80℃，超声波功率80%（240W）的条件下，料液比分别选取1:10g/mL、1:20g/mL、1:30g/mL、1:40g/mL、1:50g/mL和1:60g/mL，超声提取时间为30min。料液比对鲍鱼内脏多糖的提取率的影响如图5所示。
如图5所示，当料液比由1:10g/mL增加1:40g/mL，多糖提取率显著增加，而当料液为1:40g/mL时，原料中多糖组分充分溶解在低共熔溶剂DES体系中，多糖提取率最高。因而，鲍鱼内脏多糖提取过程中料液比以1:40g/mL为宜。
实施例六
鲍鱼内脏多糖的提取方法与实施例1中的高活性鲍鱼内脏多糖的低共熔溶剂提取方法的过程相同，其中，步骤S02中，将氯化胆碱与乙二醇按摩尔比1:3制成DES，DES含水量选取25%；步骤S03中，在料液比1:30g/mL、提取温度80℃，超声波功率80%的条件下，分别超声提取时间10min、20min、30min、40min、50min和60min。提取时间对鲍鱼内脏多糖的提取率的影响如图6所示。
如图6所示，在提取10min～40 min范围内，多糖提取率与提取时间呈正相关，但当提取时间超过40 min后，多糖提取率基本趋于稳定，因此从提取率和成本等方面考虑，鲍鱼内脏多糖提取过程中提取时间40 min为宜。
实施例七
鲍鱼内脏多糖的提取方法与实施例1中的高活性鲍鱼内脏多糖的低共熔溶剂提取方法的过程相同，其中，步骤S02中，将氯化胆碱与乙二醇按摩尔比1:3制成DES，含水量选取25%；步骤S03中，在料液比1:30g/mL、超声波功率80%的条件下，分别在40℃、50℃、60℃、70℃、80℃和90℃的条件下超声提取时间30min。提取温度对鲍鱼内脏多糖的提取率的影响如图7所示。
如图7所示，提取温度的升高在一定范围内也可以加速DES对多糖的提取效果，但当温度达到70℃后，多糖提取率的增加会不显著，综合考虑能耗因素，鲍鱼内脏多糖提取过程中DES提取多糖的温度选择70℃为宜。
实施例八
鲍鱼内脏多糖的提取方法与实施例1中的高活性鲍鱼内脏多糖的低共熔溶剂提取方法的过程相同，其中，步骤S02中，将氯化胆碱与乙二醇按摩尔比1:3制成DES，DES含水量选取25%；步骤S03中，在料液比1:40g/mL、提取温度80℃的条件下，并分别在超声波功率50%、60%、70%、80%、90%和100%的条件下超声提取时间30min。超声波功率对鲍鱼内脏多糖的提取率的影响如图8所示。
如图8所示，超声波的辅助提取作用与超声波功率密切相关，超声波功率较低时，多糖提取率较低，提取功率从50%增加至80%过程中，多糖提取率显著提高，然而当功率超过总功率80%时，尽管多糖提取率也略有提高，但并不显著，提取率趋于稳定。因此考虑到能耗等因素，鲍鱼内脏多糖提取过程中超声波功率选取80%为宜。
实施例九
在单因素试验的基础上，确定了各独立变量的水平设置（-1、0、1）：因素A-料液比（1:30、1:40、1:50g/mL），因素B-提取时间（30、40、50 min），因素C-提取温度（60℃、70℃、80℃），因素D-超声波功率（70%、80%、90%）。以鲍鱼内脏多糖提取率为响应值Y，对低共熔溶剂DES提取鲍鱼内脏多糖的条件进行四因素三水平的Box-Behnken响应面优化设计，共29组实验，如表2所示。
表2响应面实验结果
响应面分析结果如表3所示，各因素对鲍鱼内脏多糖提取率的影响顺序为D（超声波功率）>C（提取温度）>B（提取时间）>A（料液比），低共熔溶剂DES对鲍鱼内脏多糖的提取率的回归模型为：
y=16.60+0.36*A+0.48*B+1.13*C+1.37*D-0.033*A*B+0.15*A*C+0.065*A*D+0.040*B*C-0.13*B*D+0.153*C*D-0.43*A2-0.48*B2-1.20*C2-1.00*D2。如表3所示，该模型的F值为78.54，p<0.001，说明该回归模型是显著的。模型的失拟项不显著（p=0.0583），R2=0.9874，且Pred R2与Adj R2的差值小于0.05，表明该模型可适用于预测低共熔溶剂DES提取鲍鱼内脏多糖的提取率。
表3不同因素方差分析表
如图9a、图9b、图9c、图9d、图9e和图9f所示，料液比与提取温度、提取时间与提取温度存在弱交互作用。
该模型所预测的最佳料液比为40 g/mL，提取时间40.41 min，提取温度73.2 ℃，超声波功率85.1%，理论最大多糖提取率为17.32%。根据实际情况修订后，采用料液比为40g/mL，提取时间40 min，提取温度73 ℃，超声波功率90%，所得的实际最大提取率为16.84±1.32%，显著高于常规水提法的多糖提取率（8.47±0.95%）。
对比例1、
鲍鱼内脏多糖的提取方法与实施例1中的高活性鲍鱼内脏多糖的低共熔溶剂提取方法的过程相同，其中，将低共熔溶剂替换成传统水提法，采用传统水提法提取多糖。S01：将冷冻鲍鱼内脏废弃物粉碎后置于1000mL烧杯中，取20g鲍鱼内脏废弃物粉加入800mL石油醚（沸程60℃～90℃），室温下磁力搅拌4h后，静置6～8h待固液分离后，弃去上层石油醚，按照上述步骤如此重复脱脂处理3次后使用4000g离心力离心20min，收集沉淀的鲍鱼内脏脱脂物，并使鲍鱼内脏脱脂物在60℃环境下烘干至石油醚被完全去除，待鲍鱼内脏脱脂物恒重后即得鲍鱼内脏脱脂粉；S02：采用热水在90℃下提取鲍鱼内脏脱脂粉3h，提取过程中每15min搅拌一次；S03：提取结束后，以4000g的离心力离心20min，收集提取液；S04：将提取液浓缩至原体积1/3后，加入4倍体积的无水乙醇，使乙醇终浓度为80%，在4℃条件下醇沉过夜后，以7000g的离心力离心15min后收集沉淀物；S05：冷冻干燥步骤04中的沉淀物后即得鲍鱼内脏粗多糖,经过实施例1中纯化步骤后可得鲍鱼内脏多糖AVP-Con。
根据响应面分析结果，采用DES法提取鲍鱼内脏多糖AVP-DES，并对其与常规水提法AVP-Con的活性进行比较，以谷胱甘肽GSH或维生素C作为阳性对照。
图10和图11为低共熔溶剂法与常规水提法制备的鲍鱼内脏多糖的抗氧化活性比较。如图10所示，AVP-DES与AVP-Con两种多糖都表现出DPPH自由基清除能力，且与多糖浓度呈正相关。但AVP-Con的DPPH自由基清除能力明显低于本发明的DES法所制备的AVP-DES。如图11所示，AVP-DES与AVP-Con两种多糖也都有能力清除羟基自由基，且呈现剂量依赖关系，在任一相同浓度下，AVP-DES的羟基自由基清除率都显著高于AVP-Con，说明低共熔溶剂法所制备的鲍鱼内脏多糖的抗氧化活性相比常规水提法所制备的鲍鱼内脏多糖的抗氧化活性大幅度提高。
通过研究发现，DES法制备的鲍鱼内脏多糖AVP-DES与常规水提法所得的AVP-Con也都具有一定的免疫调节活性，如图12-14所示。
如图12所示，分别将25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL和200μg/mL的AVP-DES和AVP-Con作用于RAW264.7巨噬细胞，孵育24h后加入MTT溶液，继续孵育4h后，检测细胞活力。如图12所示，各浓度AVP-DES和AVP-Con对巨噬细胞都是无毒的，细胞增殖活力没有发生显著变化。
如图13所示，分别采用25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL和200μg/mL的AVP-DES和AVP-Con作用于RAW264.7巨噬细胞，孵育24h后加入0.1%中性红染液，继续孵育30min后，测定各组细胞吞噬率，以LPS作为阳性对照组。如图13所示，AVP-DES和AVP-Con都可以提高巨噬细胞的吞噬率，其中采用DES法制备的AVP-DES处理后的细胞吞噬能力优于常规水提法制备的AVP-Con。
如图14所示，分别将25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL和200μg/mL的AVP-DES和AVP-Con作用于RAW264.7巨噬细胞，孵育24h后，采用细胞裂解液裂解细胞后，离心取上清液，并测定上清液中NO含量。如图14所示，AVP-DES和AVP-Con都可以提高巨噬细胞分泌NO的含量，且呈现剂量依赖关系，其中采用DES法制备的AVP-DES处理后的细胞NO含量远高于常规水提法制备的AVP-Con处理后的细胞NO含量，表明低共熔溶剂法所提取的鲍鱼内脏多糖具有优良的免疫调节能力。
本发明最佳提取方案下制备的鲍鱼内脏多糖具有较高的抗氧化活性和免疫调节功能，具有作为功能性食品或天然营养强化剂应用于食品加工产业的潜力。
本发明的氯化胆碱-乙二醇低共熔溶剂不仅具有绿色、安全，符合产业发展方向和环保要求，同时采用本发明的低共熔溶剂可有效提取鲍鱼内脏多糖，本申请的多糖提取率比传统水提法提高了57.5%。经本发明实验验证，本发明方法提取的鲍鱼内脏多糖具有较高的抗氧化活性和免疫调节功能，可作为一种具有生物活性的功能食品或营养强化剂应用于食品加工产业。
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种高活性鲍鱼内脏多糖的低共熔溶剂提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
S01：将鲍鱼内脏废弃物进行粉碎，并对粉碎后的鲍鱼内脏进行脱脂处理得到鲍鱼内脏脱脂物；
S02：以氯化胆碱为氢键受体，乙二醇为氢键供体，制备低共熔溶剂DES，其中，所述低共熔溶剂DES的制备方法为：将混合后的氯化胆碱和乙二醇在85℃条件下磁力搅拌2～3h，直至溶液呈均一透明状态，所述低共熔溶剂DES中氯化胆碱和乙二醇的摩尔比为1：3，且所述低共熔溶剂DES中的水含量为25%（w/w）；
S03：将制备的低共熔溶剂DES与鲍鱼内脏脱脂物混合，并在超声波辅助的条件下提取鲍鱼内脏中的粗多糖，并过滤取得DES提取液；
S04：对DES提取液使用无水乙醇进行醇沉，使乙醇终浓度为80%，在醇沉处理后收集沉淀物，得到鲍鱼内脏粗多糖；
S05：采用大孔吸附树脂和葡聚糖凝胶层析技术对鲍鱼内脏粗多糖进行纯化处理，并收集多糖洗脱液；
S06：对多糖洗脱液进行冷冻干燥得到鲍鱼内脏多糖。
2.如权利要求1所述的高活性鲍鱼内脏多糖的低共熔溶剂提取方法，其特征在于，步骤S01中的脱脂溶剂为沸程60℃～90℃的石油醚，且鲍鱼内脏的脱脂方法为：将料、液以1:40g/mL的比例进行混合得到混合物，对混合物磁力搅拌4h后静置，然后弃去上层石油醚，如此重复脱脂处理3次后收集鲍鱼内脏脱脂物，最后烘干脱脂物至石油醚被完全去除，即得鲍鱼内脏脱脂粉。
3.如权利要求1所述的高活性鲍鱼内脏多糖的低共熔溶剂提取方法，其特征在于，步骤S03中，鲍鱼内脏脱脂物与低共熔溶剂DES的料液比为1:30 g/mL～1:50 g/mL，提取时间为30min～50min，提取温度为70℃～80℃，超声波功率为总功率的80%～100%，其中，超声波功率总功率为300W。
4.如权利要求3所述的高活性鲍鱼内脏多糖的低共熔溶剂提取方法，其特征在于，鲍鱼内脏脱脂物与低共熔溶剂DES的料液比为1:40 g/mL，提取时间为40min，提取温度为73℃，超声波功率为总功率的90%。
5.如权利要求1所述的高活性鲍鱼内脏多糖的低共熔溶剂提取方法，其特征在于，步骤S05中，大孔吸附树脂可采用AB-8、D101、S-8、NKA-9，葡聚糖凝胶可采用Sephadex G-100。
6.如权利要求1所述的高活性鲍鱼内脏多糖的低共熔溶剂提取方法，其特征在于，步骤S06中的冷冻干燥处理过程在-80℃的真空条件下进行。
7.一种高活性鲍鱼内脏多糖，其特征在于，该高活性鲍鱼内脏多糖使用权利要求1所述的高活性鲍鱼内脏多糖的低共熔溶剂提取方法制得。
8.权利要求7所述的高活性鲍鱼内脏多糖在制备具有抗氧化功能和/或增强免疫力的产品方面的应用。
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