CN112010993A - 一种银耳多糖的提取方法 - Google Patents

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吕国军
陈立
耿少特
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Abstract

本发明提供了一种银耳多糖的提取方法，其主要步骤为，将银耳经冷冻粉碎后，分散于水中，采用纤维素酶和果胶酶酶解提取，提取液以一定体积比加入乙醇/无机盐双水相溶液，进行超声辅助萃取，经相分离后，收集下相，经超滤脱盐后，冷冻干燥得到银耳多糖。使用本方法提取的银耳多糖提取率高，蛋白脱除率较高，提取条件较温和，使用的有机溶剂较少，能较好保留多糖的生物活性。

Description

一种银耳多糖的提取方法
技术领域
本发明属于天然活性多糖提取领域，特别涉及酶法结合超声辅助双水相萃取银耳多糖的方法。
背景技术
银耳是药食两用食物，具有多种药理活性，银耳多糖是银耳子实体中与其生理活性相关的重要成分。银耳多糖是主要以α-（1→3）-D-甘露糖为主链的杂多糖，具有免疫调节、抗氧化、抗肿瘤、抗血栓、抗病毒、降血脂、降血糖、诱导体内产生抗体和干扰素，提升免疫力等功效，银耳多糖具有重要药用价值和广阔的应用前景。
目前常用的多糖提取方法包括热水浸提法、酸碱浸提法、复合酶解法等，热水浸提法操作简单，但是热水浸取法主要浸取到胞外多糖，效率较低。酸浸提法和碱浸提法虽然效率高，但易使部分多糖发生水解，破坏了多糖的活性结构。复合酶解法提取效率较高，且条件温和，对多糖活性影响较小，但是后续需进一步对蛋白和多糖进行分离。银耳多糖的脱蛋白处理，Savege法最为常用，利用蛋白质在氯仿和正丁醇中变性生成凝胶物质而沉淀出来，与多糖溶液分层，从而将其分离除去，操作较复杂，且用到较多有机溶剂，过程中会对多糖活性造成影响。
发明内容
本发明为了解决现有银耳多糖提取、纯化技术中提取效率低、多糖生物活性维持差等问题，提供了一种酶解提取结合超声辅助双水相萃取的方法，条件温和、有机溶剂残留少、多糖活性维持良好的银耳多糖提取方法。
本发明的技术方案如下：
一种银耳多糖的提取方法，包含如下步骤：
（1）鲜银耳经清洗、晾干后，进行冷冻粉碎，过200目筛得到银耳粉；
（2）将步骤（1）制得的银耳粉加入水中，浓度为1-10%（w/w），分别加入0.5%-5%（w/w）的果胶酶和纤维素酶，20-50℃下，50-100rpm搅拌30-60min，离心，收集上清液；
（3）20-50℃下，配制乙醇/无机盐双水相溶液，在总体系中，无机盐的浓度为20-40%（w/w），乙醇的浓度为10-30%（w/w），其余为水，混合均匀。
（4）将步骤（2）制得的上清液以体积比1:2-1:5加入到上述乙醇/无机盐双水相溶液中，20-50℃下，功率50-200W，频率40kHz，超声提取10-30min后静置10-30min相分离，收集下相。
（5）将步骤（4）中收集的无机盐下相，用3-6kD截留分子量超滤膜进行超滤脱盐，收集截留液，进行冷冻干燥，得到银耳多糖冻干粉。
进一步地，步骤（2）中银耳粉在水中的浓度，优选为5%（w/w），果胶酶和纤维素酶浓度优选为1%（w/w），提取温度优选40℃。
进一步地，步骤（3）中采用的无机盐包括磷酸氢二钠或磷酸氢二钾等弱碱性缓冲物质。
进一步地，其特征在于，步骤（4）中温度优选40℃。
与现有提取方法比较，本发明的优点有：采用复合酶提取，条件温和，避免高温、酸碱等条件对银耳多糖的活性破坏，多糖提取效率高；采用超声辅助双水相萃取纯化分离去除银耳多糖的杂蛋白，条件温和，减少有机溶剂残留和多糖生物活性损失，采用中性偏碱的无机盐水相，有利于中性、酸性的银耳多糖的提取。双水相萃取工艺效率高且成本低，便于工业放大，同时分离产品纯度较高。
具体实施方式
实施例1
将鲜银耳洗净晾干后在-45℃，真空度小于40Pa冷冻干燥48h，粉碎后过200目筛，得银耳粉；取50g银耳粉，加入950g去离子水中，搅拌混匀，分别加入1g纤维素酶和果胶酶，40℃下，50rpm搅拌60min，1000rpm离心60min，收集上清液。将200g无水乙醇加入到800g质量分数为50%的磷酸氢二钠水溶液中，充分混匀后得到乙醇/磷酸氢二钠双水相溶液。将酶解后收集的上清液与上述乙醇/磷酸氢二钠双水相溶液以体积比1:5混合，40℃下，功率100W，频率40kHz，超声提取30min后静置30min相分离，收集下相。用3kD截留分子量超滤膜进行超滤脱盐，收集截留液，进行冷冻干燥，得到银耳多糖冻干粉。
多糖提取率采用苯酚一硫酸法测定，多糖提取率为最终产物银耳多糖冻干粉中多糖含量/起始银耳粉质量，本实施例中多糖提取率为46.8%。
蛋白质含量采用考马斯亮蓝法测定，蛋白质含量为最终产物银耳多糖冻干粉中蛋白质含量/起始银耳粉质量，本实施例中蛋白质含量为0.06%。
自由基清除率采用DPPH自由基清除率：将1mL DPPH（10-4 mol/L）与质量浓度为1mg/mL的银耳多糖样品和VC阳性对照溶液混匀后于波长520nm测定吸光度，本实施例中DPPH自由基清除率为88.2%。
实施例2
将鲜银耳洗净晾干后在-45℃，真空度小于40Pa冷冻干燥48h，粉碎后过200目筛，得银耳粉；取100g银耳粉，加入900g去离子水中，搅拌混匀，分别加入0.5g纤维素酶和果胶酶，20℃下，50rpm搅拌30min，1000rpm离心10min，收集上清液。将100g无水乙醇加入到900g质量分数为25%的磷酸氢二钠水溶液中，充分混匀后得到乙醇/磷酸氢二钠双水相溶液。将酶解后收集的上清液与上述乙醇/磷酸氢二钠双水相溶液以体积比1:2混合，20℃下，功率50W，频率40kHz，超声提取10min后静置30min相分离，收集下相。用6kD截留分子量超滤膜进行超滤脱盐，收集截留液，进行冷冻干燥，得到银耳多糖冻干粉。
多糖提取率采用苯酚一硫酸法测定，多糖提取率为最终产物银耳多糖冻干粉中多糖含量/起始银耳粉质量，本实施例中多糖提取率为30.5%。
蛋白质含量采用考马斯亮蓝法测定，蛋白质含量为最终产物银耳多糖冻干粉中蛋白质含量/起始银耳粉质量，本实施例中蛋白质含量为0.8%。
自由基清除率采用DPPH自由基清除率：将1mL DPPH（10-4 mol/L）与质量浓度为1mg/mL的银耳多糖样品和VC阳性对照溶液混匀后于波长520nm测定吸光度，本实施例中DPPH自由基清除率为76.2%。
实施例3
将鲜银耳洗净晾干后在-45℃，真空度小于40Pa冷冻干燥48h，粉碎后过200目筛，得银耳粉；取10g银耳粉，加入990g去离子水中，搅拌混匀，分别加入5g纤维素酶和果胶酶，20℃下，200rpm搅拌60min，1000rpm离心10min，收集上清液。将300g无水乙醇加入到700g质量分数为30%的磷酸氢二钠水溶液中，充分混匀后得到乙醇/磷酸氢二钠双水相溶液。将酶解后收集的上清液与上述乙醇/磷酸氢二钠双水相溶液以体积比1:3混合，50℃下，功率200W，频率40kHz，超声提取20min后静置30min相分离，收集下相。用3kD截留分子量超滤膜进行超滤脱盐，收集截留液，进行冷冻干燥，得到银耳多糖冻干粉。
多糖提取率采用苯酚一硫酸法测定，多糖提取率为最终产物银耳多糖冻干粉中多糖含量/起始银耳粉质量，本实施例中多糖提取率为45.2%。
蛋白质含量采用考马斯亮蓝法测定，蛋白质含量为最终产物银耳多糖冻干粉中蛋白质含量/起始银耳粉质量，本实施例中蛋白质含量为0.16%。
自由基清除率采用DPPH自由基清除率：将1mL DPPH（10-4 mol/L）与质量浓度为1mg/mL的银耳多糖样品和VC阳性对照溶液混匀后于波长520nm测定吸光度，本实施例中DPPH自由基清除率为84.6%。
实施例4
将鲜银耳洗净晾干后在-45℃，真空度小于40Pa冷冻干燥48h，粉碎后过200目筛，得银耳粉；取20g银耳粉，加入980g去离子水中，搅拌混匀，分别加入2g纤维素酶和果胶酶，20℃下，200rpm搅拌60min，1000rpm离心10min，收集上清液。将200g无水乙醇加入到800g质量分数为25%的磷酸氢二钠水溶液中，充分混匀后得到乙醇/磷酸氢二钠双水相溶液。将酶解后收集的上清液与上述乙醇/磷酸氢二钠双水相溶液以体积比1:4混合，50℃下，功率200W，频率40kHz，超声提取30min后静置30min相分离，收集下相。用3kD截留分子量超滤膜进行超滤脱盐，收集截留液，进行冷冻干燥，得到银耳多糖冻干粉。
多糖提取率采用苯酚一硫酸法测定，多糖提取率为最终产物银耳多糖冻干粉中多糖含量/起始银耳粉质量，本实施例中多糖提取率为44.6%。
蛋白质含量采用考马斯亮蓝法测定，蛋白质含量为最终产物银耳多糖冻干粉中蛋白质含量/起始银耳粉质量，本实施例中蛋白质含量为0.1%。
自由基清除率采用DPPH自由基清除率：将1mL DPPH（10-4 mol/L）与质量浓度为1mg/mL的银耳多糖样品和VC阳性对照溶液混匀后于波长520nm测定吸光度，本实施例中DPPH自由基清除率为80.6%。
实施例5
将鲜银耳洗净晾干后在-45℃，真空度小于40Pa冷冻干燥48h，粉碎后过200目筛，得银耳粉；取50g银耳粉，加入950g去离子水中，搅拌混匀，分别加入1g纤维素酶和果胶酶，40℃下，200rpm搅拌60min，1000rpm离心10min，收集上清液。将100g无水乙醇加入到900g质量分数为25%的磷酸氢二钠水溶液中，充分混匀后得到乙醇/磷酸氢二钠双水相溶液。将酶解后收集的上清液与上述乙醇/磷酸氢二钠双水相溶液以体积比1:2混合，40℃下，功率200W，频率40kHz，超声提取30min后静置30min相分离，收集下相。用3kD截留分子量超滤膜进行超滤脱盐，收集截留液，进行冷冻干燥，得到银耳多糖冻干粉。
多糖提取率采用苯酚一硫酸法测定，多糖提取率为最终产物银耳多糖冻干粉中多糖含量/起始银耳粉质量，本实施例中多糖提取率为43.4%。
蛋白质含量采用考马斯亮蓝法测定，蛋白质含量为最终产物银耳多糖冻干粉中蛋白质含量/起始银耳粉质量，本实施例中蛋白质含量为0.15%。
自由基清除率采用DPPH自由基清除率：将1mL DPPH（10-4 mol/L）与质量浓度为1mg/mL的银耳多糖样品和VC阳性对照溶液混匀后于波长520nm测定吸光度，本实施例中DPPH自由基清除率为82.8%。
实施例6
将鲜银耳洗净晾干后在-45℃，真空度小于40Pa冷冻干燥48h，粉碎后过200目筛，得银耳粉；取50g银耳粉，加入950g去离子水中，搅拌混匀，分别加入1g纤维素酶和果胶酶，40℃下，200rpm搅拌60min，1000rpm离心10min，收集上清液。将200g无水乙醇加入到800g质量分数为50%的磷酸氢二钠水溶液中，充分混匀后得到乙醇/磷酸氢二钠双水相溶液。将酶解后收集的上清液与上述乙醇/磷酸氢二钠双水相溶液以体积比1:5混合，20℃下，功率100W，频率40kHz，超声提取30min后静置10min相分离，收集下相。用3kD截留分子量超滤膜进行超滤脱盐，收集截留液，进行冷冻干燥，得到银耳多糖冻干粉。
多糖提取率采用苯酚一硫酸法测定，多糖提取率为最终产物银耳多糖冻干粉中多糖含量/起始银耳粉质量，本实施例中多糖提取率为42.8%。
蛋白质含量采用考马斯亮蓝法测定，蛋白质含量为最终产物银耳多糖冻干粉中蛋白质含量/起始银耳粉质量，本实施例中蛋白质含量为0.16%。
自由基清除率采用DPPH自由基清除率：将1mL DPPH（10-4 mol/L）与质量浓度为1mg/mL的银耳多糖样品和VC阳性对照溶液混匀后于波长520nm测定吸光度，本实施例中DPPH自由基清除率为84.5%。

Claims (7)

1.一种银耳多糖的提取方法，其特征在于：所述提取方法包含如下步骤：
（1）取鲜银耳经清洗、晾干后，进行冷冻粉碎，过筛得到银耳粉；
（2）将步骤（1）制得的银耳粉加入水中，加入果胶酶和纤维素酶，得混合体系；将所述混合体系在20-50℃下，50-100rpm搅拌30-60min，离心，收集上清液；
（3）20-50℃下，配制乙醇/无机盐双水相溶液；
（4）将步骤（2）制得的上清液以体积比1:2-1:5加入到上述乙醇/无机盐双水相溶液中，其中无机盐包括磷酸氢二钠或磷酸氢二钾，温度为20-50℃，以功率50-200W，频率40kHz，超声提取10-30min后静置10-30min相分离，收集下相；
（5）将步骤（4）中收集的下相，用截留分子量超滤膜进行超滤脱盐，收集截留液，进行冷冻干燥，得到银耳多糖冻干粉。
2.根据权利要求1所述的银耳多糖的提取方法，其特征在于，步骤（2）中银耳粉在水中的浓度为5%（w/w），果胶酶和纤维素酶浓度为1%（w/w），提取温度40℃。
3.根据权利要求1所述的一种银耳多糖的提取方法，其特征在于：步骤（1）中所用筛网的孔径为200目。
4.根据权利要求1所述的银耳多糖的提取方法，其特征在于：步骤（2）中混合体系中银耳粉浓度为1%-10%（w/w），果胶酶和纤维素酶浓度均为0.5%-5%（w/w）。
5.根据权利要求1所述的银耳多糖的提取方法，其特征在于：步骤（3）中所配制乙醇/无机盐双水相溶液，其中无机盐的浓度为20%-40%（w/w），乙醇的浓度为10%-30%（w/w），其余为水，混合均匀；配置温度为20-50℃。
6.根据权利要求1所述的一种银耳多糖的提取方法，其特征在于：步骤（4）中温度为40℃。
7.根据权利要求1所述的银耳多糖的提取方法，其特征在于：步骤（5）中所使用的截留分子量超滤膜孔径为3-6kD。
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