CN110343156B - 黑豆糖蛋白的提取纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种黑豆糖蛋白的提取纯化方法,具体为:取黑豆,去皮,粉碎为粉末状;取1000g黑豆粉末,按照固液比1:5‑1:7g/mL加入无水乙醇,置于索氏提取器中,70‑80℃加热1.5‑2h,进行回流脱脂处理;将脱脂后的滤渣用8‑10倍体积的蒸馏水在70‑80℃条件下提取2‑3h,抽滤;滤液浓缩,乙醇沉淀,获取粗糖蛋白;DEAE‑52纤维素离子柱层析初步分离,获取洗脱液;采用葡聚糖凝胶柱G‑100分别对各组洗脱液进行分离纯化,得到五种纯黑豆糖蛋白的干粉。本发明获得五种纯黑豆糖蛋白,保留其生物活性,纯度高、收率高;充分利用原料,增加糖蛋白产率和种类,便于大批量工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于多糖修饰技术领域,涉及一种黑豆糖蛋白的提取纯化方法。
背景技术
多糖又名多聚糖,是由多个单糖通过两种不同的糖苷键聚合成的非常复杂的生物大分子物质,有天然的和人工合成之分,广泛存在于自然界中,存在形式多样且来源广泛,它的相对分子质量一般为数万甚至高达数百万,具有丰富且良好的生物活性,能够与细胞表面的蛋白质结合成糖蛋白,使得细胞膜具有特异性的识别功能。最近几年来,随着人们对多糖的研究越来越深入,发现许多植物多糖都具有特殊的生物活性,很多中药多糖的产品已经开始投入临床使用。研究表明,多糖有多种调节人体内平衡的功能,药理研究发现,部分多糖还可以清除人体自由基。
糖蛋白是蛋白质的糖基化之后生成的一种复合蛋白,由糖链和蛋白两部分组成。研究表明糖链部分的构型决定着,糖蛋白的功能及其与其它蛋白的相互作用能力。糖蛋白的稳定性和不易受pH影响使它在食品领域应用广泛。同时发现糖蛋白糖部分和蛋白部分具有良好的清除自由基的作用。虽然糖蛋白作用广大,但是提取率低、结构及构效的不稳定性直接影响着它的发展。所以在保留糖蛋白生物活性的前提下有效的提取糖蛋白,是人们研究糖蛋白的的一个巨大挑战。
黑豆为豆科植物大豆的黑色种子,目前,已有人从黑豆中提取纯化得到了黑豆多糖组分,通过研究发现黑豆多糖可以用于防治白血病,因为它可以抑制白细胞的吞噬作用并且可以修复白血球,而且可以促进骨髓细胞的生成和抗氧化。所以黑豆多糖可以用于新药研究和食品加工等方向。无论是黑豆还是其它豆类,人们所熟知的还是它们有十分丰富的蛋白质和油脂,但是对于黑豆多糖的生物活性功能还是不甚了解,所以,研究黑豆糖蛋白的纯化过程对进一步充分开发糖蛋白的应用是非常有必要的。
发明内容
为了解决上述问题,本发明提供一种黑豆糖蛋白的提取纯化方法,获得五种纯黑豆糖蛋白,保留其生物活性,纯度高、收率高;充分利用原料,增加糖蛋白产率和种类,操作简单、成本低,便于大批量工业化生产,为黑豆糖蛋白的研究和应用提供便利,解决了现有技术中的问题。
本发明所采用的技术方案是,一种黑豆糖蛋白的提取纯化方法,具体按照以下步骤进行:
S1,取黑豆,去皮,粉碎为粉末状;
S2,取1000g黑豆粉末,按照固液比1:5-1:7g/mL加入无水乙醇,置于索氏提取器中,70-80℃加热1.5-2h,进行回流脱脂处理,脱脂处理重复2-3次;
S3,将脱脂后的滤渣用8-10倍体积的蒸馏水在70-80℃条件下提取2-3h,抽滤;
S4,获取粗糖蛋白:
将步骤S3所得滤液用旋转蒸发仪浓缩10-15倍,在0-4℃下加4-5倍体积的无水乙醇,完全沉淀至少24小时,将沉淀抽滤,收集滤渣,经蒸馏水溶解,冻干,即得黑豆水提粗糖蛋白;
同时,向步骤S3所得滤渣中加入5-10倍体积0.1-0.5mol/L的NaOH溶液,在40-50℃下提取2-3h,离心后取上清液抽滤,滤液用0.1-0.2mol/L的乙酸中和,中和后出现沉淀,进行二次抽滤,减压浓缩滤液,在0-4℃下加入4-5倍体积无水乙醇,完全沉淀至少24小时,将沉淀抽滤,收集滤渣,经蒸馏水溶解,冻干,即得黑豆碱提粗糖蛋白;
S5,获取洗脱液:
将黑豆水提粗糖蛋白、黑豆碱提粗糖蛋白分别用蒸馏水完全溶解,经透析、旋转蒸发仪浓缩至刚好不析出糖蛋白沉淀,离心后取上清液,分别经Cl-型DEAE-52纤维素柱层析,用不同浓度的NaCl溶液进行洗脱;分离得到黑豆水提粗糖蛋白的蒸馏水洗脱组分和0.2mol/L NaCl洗脱组分,黑豆碱提粗糖蛋白的0.2mol/L NaCl洗脱组分和0.5mol/L NaCl洗脱组分;洗脱组分经透析、冻干;
S6,用蒸馏水溶解,采用葡聚糖凝胶柱G-100分别对四组洗脱液进行分离纯化,从黑豆水提粗糖蛋白的蒸馏水洗脱组分中得到纯黑豆糖蛋白,命名为HDW;从黑豆水提粗糖蛋白的0.2mol/L NaCl洗脱组分中得到纯黑豆糖蛋白,命名为HDS0.2;从黑豆碱提粗糖蛋白的0.2mol/L NaCl洗脱组分中得到纯黑豆糖蛋白,命名为HDJ-0.2;从黑豆碱提粗糖蛋白的0.5mol/L NaCl洗脱组分中得到两种纯黑豆糖蛋白,分别命名为HDJ-0.5-1和HDJ-0.5-2;将以上五种纯黑豆糖蛋白分别经浓缩、冻干,即得。
进一步的,所述S4中,减压浓缩具体为:采用旋转蒸发仪,在60-65℃、0.08-0.09Mpa条件下,减压浓缩滤液两次,均没有糖蛋白沉淀析出。
进一步的,所述S6中,从黑豆水提粗糖蛋白的洗脱组分中得到纯黑豆糖蛋白,具体为:采用葡聚糖凝胶柱G-100分别对两组洗脱液进行分离纯化,绘制洗脱曲线;蒸馏水洗脱组分、0.2mol/L NaCl洗脱组分的洗脱曲线分别有两个峰,收集吸光度值较大的峰两端对称试管中的洗脱液,每组洗脱液收集4-5管,分别浓缩至7-8mL,放入-40℃冰箱冷冻1天,然后在冻干机中-50℃抽真空干燥,即得纯黑豆糖蛋白HDW和HDS0.2的干粉。
进一步的,所述S6中,从黑豆碱提粗糖蛋白的洗脱组分中得到纯黑豆糖蛋白,具体为:采用葡聚糖凝胶柱G-100分别对两组洗脱液进行分离纯化,绘制洗脱曲线;0.2mol/LNaCl洗脱组分的洗脱曲线有一个峰,0.5mol/L NaCl洗脱组分的洗脱曲线有两个峰,收集峰两端对称试管中的洗脱液,每个峰对应洗脱液收集4-5管,分别浓缩至7-8mL,放入-40℃冰箱冷冻1天,然后在冻干机中-50℃抽真空干燥,即得纯黑豆糖蛋白HDJ-0.2、HDJ-0.5-1和HDJ-0.5-2的干粉。
进一步的,所述S6中,葡聚糖凝胶柱G-100的分离范围4000-150000Da。
进一步的,所述S4中透析选用截留量为500-1000Da、直径为34-44mm的透析袋。
进一步的,所述S5中,Cl-型DEAE-52纤维素柱的处理方法:先用0.1-0.2mol/L的氢氧化钠浸泡DEAE-52纤维素填料两个小时,蒸馏水洗到中性,使纤维素接上OH-,然后再加入0.1-0.2mol/L的盐酸浸泡两小时,蒸馏水洗到中性,即得。
进一步的,所述S5中,离心速率为7000-8000r/min、离心时间为10min。
进一步的,所述S4、S5、S6中,冻干具体为:-40至-20℃低温冷冻1天,然后于-40至-50℃抽真空干燥。
本发明的有益效果是,将黑豆粉末用乙醇脱脂后,用蒸馏水和碱提取,浓缩收集提取液,透析除去盐类和小分子,冻干,得到黑豆粗多糖,黑豆粗多糖进一步通过DEAE-52纤维素柱和葡聚糖凝胶柱G-100进行分离纯化,首次从黑豆中获得五种新结构纯黑豆糖蛋白,保留其生物活性,尤其具有优异的抗氧化活性。
本发明同时使用的水提醇沉和碱提醇沉法,充分利用原料,增加糖蛋白产率和种类,提取纯化方法简单、可操作性强、成本低、便于大批量工业化生产,采用本发明提取纯化方法得到的糖蛋白纯度高、收率高;在提取纯化过程中加入的试剂无毒无害,安全性高,能够应用于保健品和化妆品领域,为黑豆糖蛋白的研究和应用提供新的思路。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1中凝胶柱层析分离HDW的洗脱曲线。
图2是本发明实施例1中凝胶柱层析分离HDS0.2的洗脱曲线。
图3是本发明实施例1中凝胶柱层析分离HDJ-0.2的洗脱曲线。
图4是本发明实施例1中凝胶柱层析分离HDJ-0.5的洗脱曲线。
图5是本发明实施例2中的HDW的高效液相凝胶色谱(GPC)图。
图6是本发明实施例2中HDS0.2的高效液相凝胶色谱图。
图7是本发明实施例2中HDJ-0.2的高效液相凝胶色谱图。
图8是本发明实施例2中HDJ-0.5-1的高效液相凝胶色谱图。
图9是本发明实施例2中HDJ-0.5-2的高效液相凝胶色谱图。
图10是本发明实施例1中HDW的红外图谱。
图11是本发明实施例1中HDS0.2的红外图谱。
图12是本发明实施例1中HDJ-0.2的红外图谱。
图13是本发明实施例1中HDJ-0.5-1的红外光谱图。
图14是本发明实施例1中HDJ-0.5-2的红外光谱图。
图15是本发明实施例1中HDW的紫外扫描图。
图16是本发明实施例1中HDS0.2的紫外扫描图。
图17是单糖混标的高效液相色谱(HPLC)图谱。
图18是本发明实施例2中HDW单糖组成的高效液相色谱(HPLC)图谱。
图19是本发明实施例2中HDS0.2单糖组成的高效液相色谱(HPLC)图谱。
图20是本发明实施例2中HDJ-0.2单糖组成的高效液相色谱(HPLC)图谱。
图21是本发明实施例2中HDJ-0.5-1单糖组成的高效液相色谱(HPLC)图谱。
图22是本发明实施例2中HDJ-0.5-2单糖组成的高效液相色谱(HPLC)图谱。
图23是本发明实施例中五种糖蛋白的还原力曲线图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1,
本发明黑豆糖蛋白的提取纯化方法,具体按照以下步骤进行:
S1,取黑豆,去皮,粉碎为粉末状,粉末粒径0.1-1mm;
S2,取1000g黑豆粉末,按照固液比1:5g/mL加入无水乙醇,置于索氏提取器中,80℃加热2h,进行回流脱脂处理,脱脂处理重复2-3次;
S3,将脱脂后的滤渣用8倍体积的蒸馏水在80℃条件下提取2h,抽滤;
S4,获取粗糖蛋白:
将步骤S3所得滤液用旋转蒸发仪浓缩10倍,在4℃下加4倍体积的无水乙醇,完全沉淀24小时,将沉淀抽滤,收集滤渣,经蒸馏水溶解,-40℃低温冷冻1天,然后于-50℃抽真空干燥(冻干),即得黑豆水提粗糖蛋白;提取率达到15.97%;
同时,向步骤S3所得滤渣中加入5倍体积0.2mol/L的NaOH溶液,在50℃下提取2h,离心后取上清液抽滤,滤液用0.2mol/L的乙酸中和,中和后出现沉淀,进行二次抽滤,减压浓缩滤液,在4℃下加入4倍体积无水乙醇,完全沉淀24小时,将沉淀抽滤,收集滤渣,经蒸馏水溶解,-40℃低温冷冻1天,然后于-50℃抽真空干燥(冻干),即得黑豆碱提粗糖蛋白;提取率可达到10.45%,现有文献中植物多糖蛋白的提取率仅为2%-8%。
S5,获取洗脱液:
分别取2g黑豆水提粗糖蛋白和黑豆碱提粗糖蛋白,蒸馏水完全溶解,经透析、旋转蒸发仪浓缩至刚好不析出糖蛋白沉淀,离心后取上清液,分别经Cl-型DEAE-52纤维素柱层析,用不同浓度的NaCl溶液进行洗脱;分离得到黑豆水提粗糖蛋白的蒸馏水洗脱组分和0.2mol/L NaCl洗脱组分,得到黑豆碱提粗糖蛋白的蒸馏水洗脱组分、0.2mol/L NaCl洗脱组分和0.5mol/L NaCl洗脱组分;洗脱组分经透析,在-40℃冷冻1天,然后于-50℃抽真空干燥(冻干);
S6,从黑豆水提粗糖蛋白的洗脱组分中得到纯黑豆糖蛋白:用蒸馏水溶解,采用葡聚糖凝胶柱G-100分别对两组洗脱液进行分离纯化,绘制洗脱曲线;如图1所示,蒸馏水洗脱组分的洗脱曲线有两个峰,收集吸光度值较大的峰两端对称试管中的洗脱液,为主要多糖组分,洗脱液收集4-5管,命名为HDW,浓缩至7-8mL,放入-40℃冰箱冷冻1天,然后在冻干机中-50℃抽真空干燥,得纯黑豆糖蛋白干粉,收率为3.69%;同样,如图2所示,0.2mol/LNaCl洗脱组分的洗脱曲线有两个峰,收集吸光度值较大的峰两端对称试管中的洗脱液,为主要多糖组分,洗脱液收集4-5管,命名为HDS0.2,浓缩至7-8mL,放入-40℃冰箱冷冻1天,然后在冻干机中-50℃抽真空干燥(防止冻干的过程中部分融解,液体直接抽走,降低收率),得纯黑豆糖蛋白干粉,收率为5.38%。
从黑豆碱提粗糖蛋白的洗脱组分中得到纯黑豆糖蛋白:用蒸馏水溶解,采用葡聚糖凝胶柱G-100分别对三组洗脱液进行分离纯化,绘制洗脱曲线;蒸馏水洗脱组分得到纯糖蛋白HDJW含量少舍弃;如图3,0.2mol/L NaCl洗脱组分的洗脱曲线有一个峰,收集峰两端对称试管中的洗脱液,命名为HDJ-0.2;每个峰对应洗脱液收集4-5管,分别浓缩至7-8mL,放入-40℃冰箱冷冻1天,然后在冻干机中-50℃抽真空干燥,得纯黑豆糖蛋白干粉,收率为4.36%;
如图4,0.5mol/L NaCl洗脱组分的洗脱曲线有两个主要峰峰,说明含有两种不同的糖蛋白,分别收集两个峰两端对称试管中的洗脱液,分别命名为HDJ-0.5-1和HDJ-0.5-2;每个峰对应洗脱液收集4-5管,分别浓缩至7-8mL,放入-40℃冰箱冷冻1天,然后在冻干机中-50℃抽真空干燥,得纯黑豆糖蛋白干粉,HDJ-0.5-1和HDJ-0.5-2的收率分别为8.96%和5.47%。
葡聚糖凝胶柱G-100为分子筛原理,因此分子量大的糖蛋白不能通过较小的凝胶孔径,走过的路径短,先流出来,所以我们根据洗脱曲线追踪收集到的第一个主要组分的分子量更大;收集洗脱液4-5管,试管数量太少容易造成纯糖蛋白损失量大,产率低,收集试管数太多,容易造成得到的多糖纯度降低,峰型不对称;冻干之前低温冷冻,防止冻干的过程中部分融解,降低收率。
实施例2,
本发明黑豆糖蛋白的提取纯化方法,具体按照以下步骤进行:
S1,取黑豆,去皮,粉碎为粉末状,粉末粒径0.1-1mm;
S2,取1000g黑豆粉末,按照固液比1:7g/mL加入无水乙醇,置于索氏提取器中,70℃加热1.5h,进行回流脱脂处理,脱脂处理重复2-3次;
S3,将脱脂后的滤渣用10倍体积的蒸馏水在70℃条件下提取3h,抽滤;
S4,获取粗糖蛋白:
将步骤S3所得滤液用旋转蒸发仪浓缩15倍,在0℃下加5倍体积的无水乙醇,完全沉淀30小时,将沉淀抽滤,收集滤渣,经蒸馏水溶解,-20℃低温冷冻1天,然后于-40℃抽真空干燥(冻干),即得黑豆水提粗糖蛋白,收率为16.46%;
同时,向步骤S3所得滤渣中加入10倍体积0.2mol/L的NaOH溶液,在40℃下提取3h,离心后取上清液抽滤,滤液用0.1mol/L的乙酸中和,中和后出现沉淀,进行二次抽滤,减压浓缩滤液,在0℃下加入5倍体积无水乙醇,完全沉淀30小时,将沉淀抽滤,收集滤渣,经蒸馏水溶解,-20℃低温冷冻1天,然后于-40℃抽真空干燥(冻干),即得黑豆碱提粗糖蛋白,收率为13.98%;
S5和S6与实施例1相同。
实施例3,
本发明黑豆糖蛋白的提取纯化方法,具体按照以下步骤进行:
S1,取黑豆,去皮,粉碎为粉末状,粉末粒径0.1-1mm;
S2,取1000g黑豆粉末,按照固液比1:6g/mL加入无水乙醇,置于索氏提取器中,75℃加热1.8h,进行回流脱脂处理,脱脂处理重复2-3次;
S3,将脱脂后的滤渣用12倍体积的蒸馏水在75℃条件下提取2.5h,抽滤;
S4,获取粗糖蛋白:
将步骤S3所得滤液用旋转蒸发仪浓缩12倍,在2℃下加4.5倍体积的无水乙醇,完全沉淀24小时,将沉淀抽滤,收集滤渣,经蒸馏水溶解,-30℃低温冷冻1天,然后于-50℃抽真空干燥(冻干),即得黑豆水提粗糖蛋白,收率为17.20%;
同时,向步骤S3所得滤渣中加入7倍体积0.2mol/L的NaOH溶液,在45℃下提取2.5h,离心后取上清液抽滤,滤液用0.15mol/L的乙酸中和,中和后出现沉淀,进行二次抽滤,减压浓缩滤液,在2℃下加入4.5倍体积无水乙醇,完全沉淀24小时,将沉淀抽滤,收集滤渣,经蒸馏水溶解,-30℃低温冷冻1天,然后于-50℃抽真空干燥(冻干),即得黑豆碱提粗糖蛋白,收率为12.50%;
S5和S6与实施例1相同。
实施例4,
本发明黑豆糖蛋白的提取纯化方法:
向步骤S3所得滤渣中加入5倍体积0.3mol/L的NaOH溶液,在50℃下提取2h,离心后取上清液抽滤,滤液用0.2mol/L的乙酸中和,中和后出现沉淀,进行二次抽滤,减压浓缩滤液,在4℃下加入4倍体积无水乙醇,完全沉淀24小时,将沉淀抽滤,收集滤渣,经蒸馏水溶解,-20℃低温冷冻1天,然后于-40℃抽真空干燥,即得黑豆碱提粗糖蛋白;其余步骤与实施例1相同,碱提粗糖蛋白收率为10.05%。
实施例5,
本发明黑豆糖蛋白的提取纯化方法:
向步骤S3所得滤渣中加入5倍体积0.4mol/L的NaOH溶液,在50℃下提取2h,离心后取上清液抽滤,滤液用0.2mol/L的乙酸中和,中和后出现沉淀,进行二次抽滤,减压浓缩滤液,在4℃下加入4倍体积无水乙醇,完全沉淀24小时,将沉淀抽滤,收集滤渣,经蒸馏水溶解,-20℃低温冷冻1天,然后于-40℃抽真空干燥,即得黑豆碱提粗糖蛋白;其余步骤与实施例1相同,碱提粗糖蛋白收率为8.64%。
实施例6,
本发明黑豆糖蛋白的提取纯化方法:
向步骤S3所得滤渣中加入5倍体积0.1mol/L的NaOH溶液,在50℃下提取2h,离心后取上清液抽滤,滤液用0.2mol/L的乙酸中和,中和后出现沉淀,进行二次抽滤,减压浓缩滤液,在4℃下加入4倍体积无水乙醇,完全沉淀24小时,将沉淀抽滤,收集滤渣,经蒸馏水溶解,-20℃低温冷冻1天,然后于-40℃抽真空干燥,即得黑豆碱提粗糖蛋白;其余步骤与实施例1相同,碱提粗糖蛋白收率为8.05%。
实施例7,
本发明黑豆糖蛋白的提取纯化方法:
向步骤S3所得滤渣中加入5倍体积0.5mol/L的NaOH溶液,在50℃下提取2h,离心后取上清液抽滤,滤液用0.2mol/L的乙酸中和,中和后出现沉淀,进行二次抽滤,减压浓缩滤液,在4℃下加入4倍体积无水乙醇,完全沉淀24小时,将沉淀抽滤,收集滤渣,经蒸馏水溶解,-20℃低温冷冻1天,然后于-40℃抽真空干燥,即得黑豆碱提粗糖蛋白;其余步骤与实施例1相同,碱提粗糖蛋白收率为5.47%。
根据实施例1和实施例4-7可知,NaOH的浓度以0.2mol/L为最佳,使用0.1mol/LNaOH提取得到的糖蛋白产率较低,使用0.5mol/L NaOH提取会很大程度降解断裂糖蛋白,最终得到的糖蛋白分子量较小,透析过程中会大量损失,最终产率也很低,NaOH的加入体积为滤渣体积的5倍,因为碱提多糖处理抽滤过程更为复杂,滤液不容易直接抽滤下来,需要进行离心后取上清液过滤处理,NaOH用量过大,耗时耗力。在40-50℃下提取2-3h就可以很好的破坏黑豆细胞壁,将糖蛋白溶出,温度太低糖蛋白的溶出速度缓慢,提取率低,温度太高会破坏糖蛋白结构,影响生物活性。
本发明实施例的S2中,乙醇用量太小,脱脂不完全,影响后续的分离纯化,乙醇用量太大,造成浪费,增加成本,后续抽滤处理耗时耗力。温度低于70℃,脱脂不充分,超过80℃乙醇会快速挥发,达不到脱脂效果。时间控制在1.5-2h,也是起到充分脱去脂溶性成分的作用,超过该范围脱脂不完全。
S3中,蒸馏水起到溶解多糖成分的作用,加入量要合适,太少提取率比较低,太多会增加后续浓缩步骤的工作量,增加成本。提取温度过高,会对多糖的结构造成破会,提取时间控制2-3h即可将大部分多糖蛋白成分溶出,超过3h,增加提取时间提取率并不会持续大量增高。
S4中,浓缩程度太大会造成糖蛋白直接析出,糖蛋白被长时间加热之后不易溶解,影响收率;浓缩程度太小,乙醇沉淀过程中需要消耗更多体积的乙醇,造成浪费;
减压浓缩滤液,具体为:采用旋转蒸发仪,在60-65℃、0.08-0.09Mpa条件下,减压浓缩滤液两次,均没有糖蛋白沉淀析出,在此温度下糖蛋白结构、生物活性不会受到破坏,压力太低水溶液不容易蒸出,浓缩控制没有糖蛋白沉淀析出,浓缩程度太大,不利于后续处理时溶解。
S5中,透析选用截留量为500-1000Da、直径为34-44mm的透析袋,孔径太大得到的多糖产率降低;透析袋直径太小,每次可装入透析的体积小,直径太大透析不充分,小分子残留多;对粗糖透析作用是初步除去小分子杂质,对洗脱液进行透析的作用是进一步除去小分子和纤维素DEAE-52洗脱液中引入的氯化钠盐。
采用旋转蒸发仪浓缩至刚好不析出糖蛋白沉淀,浓缩程度太大过柱子时不能充分溶解;离心速率为7000-8000r/min、离心时间10min,去掉沉淀;洗脱液在分离纯化前冻干,作用是便于定量,确定葡聚糖凝胶柱G-100的上样量。
Cl-型DEAE-52纤维素柱处理方法:先用0.1-0.2mol/L的氢氧化钠浸泡DEAE-52纤维素填料两个小时,蒸馏水洗到中性,使纤维素接上OH-,然后再加入0.1-0.2mol/L的盐酸浸泡两小时,蒸馏水洗到中性,最终纤维素携带Cl-离子。
DEAE-52纤维素柱属于离子交换层析,根据多糖蛋白所含的离子性能可以选择不同的柱型,本发明中选择吸附性较弱的Cl-型能够很好的将不同的糖蛋白组分分离开,如果选择强阴离子吸附OH-型,由于纤维素对糖蛋白的吸附性更强,所以洗脱过程更长,并且糖蛋白的不容易洗脱下来,产率降低。另外,层析过程中对柱子的紧实度也有一定要求,柱子装的不好,吸附效果差,分离效果也达不到要求。葡聚糖凝胶柱(Sephadex)G-100属于凝胶柱层析,在本发明所起作用是根据凝胶颗粒大小的不同,可以分离不同分子量大小的糖蛋白,分子量大的糖蛋白不能进入到凝胶内部,优先洗脱下来,分子量小的糖蛋白可以进入凝胶内部,通过的总路程长,后洗脱下来;葡聚糖凝胶柱G-100分离范围4000-150000Da适合对本发明糖蛋白进行分离,如果选用更小的凝胶颗粒类型,分离效果会变差,不能够将比较大的糖蛋白分离开。
黑豆中的脂溶性物质和色素成分较多,难以去除,本发明按照固液比1:5-1:7(g/mL)加入无水乙醇,并且使用索氏提取器多次提取,彻底去除油脂和色素。另外,黑豆中蛋白含量高,提取纯化糖蛋白过程中直接使用水提醇沉法或碱提醇沉法将全部的蛋白和多糖成分沉淀出来,需要将游离的糖和蛋白部分去除,处理过程包括直接脱蛋白,以及DEAE-52纤维素柱层析过程会将部分吸附能力强的游离蛋白和多糖去除,糖蛋白的分离过程中跟踪检测不仅需要检测糖的含量,还需要检测蛋白的含量,保证同一组分中能够同时检测到两种物质存在。
本发明在提取黑豆糖蛋白时,同时使用了水提醇沉法与碱提醇沉法,水提醇沉法主要用来提取分离水溶性的糖蛋白,对水提之后的残渣进一步利用碱提醇沉法获得更多的糖蛋白种类,充分利用原料,增加了糖蛋白的总产率和利用率,并且碱提法获得的糖蛋白更多的带有酸碱基团,生物活性更好,具有更高应用价值。碱提过程中对残渣的溶解更透彻,所以抽滤的时候不容易直接分离滤液和残渣,需要离心辅助,并且得到的糖蛋白溶液需要立即中和,中和后盐浓度增大,会有部分物质析出,需要进行二次抽滤分离。
本发明提取分离的条件温和,使用的碱液浓度不大,柱层析不会对糖蛋白的结构进行破坏,保留对应的生物活性;对实施例1、2得到的纯黑豆糖蛋白的结构和生物活性的性能指标测定结果如下:
1、高效凝胶渗透色谱法(HPGPC):
色谱条件选择:选用waters 515色谱柱,waters 2414示差检测器,用质量浓度0.05%的叠碳化钠溶液作为流动相,设置流速为0.5mL/min,50μL进样量。
分子量测定方法:用三种葡聚糖标准品(Mw分别为5200、148000和410000)先做出标准曲线,得到的线性回归方程是:Log10Mw=-0.1719t+11.585(1)
其中,Mw表示分子量,t表示色谱峰的保留时间;
分别取浓度为0.5mg/mL的五种糖蛋白样品20μL,进行测定;如图5、图6、图7和图8、图9所示,由对应色谱峰的保留时间,根据公式(1)分别求得水提糖蛋白HDW和HDS0.2的相对分子质量分别为23.88kDa、201.84kDa,碱提糖蛋白HDJ-0.2、HDJ-0.5-1、HDJ-0.5-2的相对分子量分别为35.833kDa、377.654kDa和80.441kDa。分子量的大小是糖蛋白结构性质的一个重要指标,分子量的大小与其生物活性密切相关,本发明测定分子量GPC图谱,一方面可以确定糖蛋白的纯度,如单一对称峰说明是一种纯的糖蛋白,并且糖链和蛋白是链接在一起的,并不是分开的两种物质;另一方面可以和生物活性关系进行对应,分析构效关系。
2、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量:
根据蛋白质标准曲线计算蛋白质含量,HDW和HDS0.2中蛋白质含量为26.73%和32.29%,HDJ-0.2、HDJ-0.5-1、HDJ-0.5-2中蛋白质的含量分别为60.86%±1.26%、64.54%±3.50%和66.13%±7.19%。
3、黑豆糖蛋白的中性糖含量的测定:
通过硫酸-苯酚法测定黑豆糖蛋白中的中性糖含量:
以葡萄糖为标准品,绘制标准曲线测得水提多糖HDW和HDS0.2中性糖含量分别为61.12%和46.08%,碱提多糖HDJ-0.2、HDJ-0.5-1、HDJ-0.5-2中性糖含量分别为3.49%±2.67%、12.27%±3.23%和8.79%±11.18%。
4、黑豆糖蛋白中糖醛酸含量的测定
用间羟基联苯比色法测定糖醛酸的含量:
糖醛酸标准曲线测得HDW和HDS0.2中糖醛酸含量分别为8.06%和22.82%,HDJ-0.2、HDJ-0.5-1、HDJ-0.5-2中糖醛酸含量分别为0.00%±0.00%、5.64%±3.89%和2.82%±8.02%。
计算蛋白质、中性糖和糖醛酸含量在本发明的作用是对不同的纯糖蛋白主要组成部分进行表征,糖链、蛋白和糖醛酸部分所发挥的生物活性功能不一样,比例的多少决定哪一部分起到主要功能,根据所含不同成分的多少可以确定构效关系。
5、黑豆糖蛋白的红外光谱分析
如图10所示,HDW的红外光谱图中,3436cm-1处有较强的吸收峰,为-OH的伸缩振动。1655cm-1处的峰,说明存在羰基,应为肽链上酰胺健的特征吸收。如图11所示,HDS0.2的红外光谱图中,3410cm-1处有较强的吸收峰,为-OH的伸缩振动。1654cm-1处的峰,说明存在羰基,应为肽链上酰胺健的特征吸收。1402cm-1处有吸收峰,应为蛋白质中芳香族氨基酸的苯环的特征吸收;1077cm-1处有峰,应为吡喃糖的特征吸收。
如图12、13、14所示,在3300cm-1左右处存在一个较宽的吸收峰,这个峰属于多糖-OH官能团的吸收峰,在2960cm-1处的峰是-CH键的伸缩振动,说明在糖蛋白HDJ-0.2、HDJ-0.5-1和HDJ-0.5-2中存在糖类化合物。在1650cm-1处的峰属于酰胺键的伸缩振动,说明含有蛋白质,并且随着样品蛋白含量的增加,1650cm-1处的吸收峰越大,结果与糖蛋白组成分析结果相符;1000-1200cm-1附近的吸收峰显示有吡喃糖环。
6、糖肽键的确定:
糖肽键有两种连接类型:N-型糖苷键和O-型糖苷键;其中构成O-糖肽键的氨基酸经过碱处理会发生β-消除反应,240nm处出现特征吸收,而N-型糖肽键不会发生β-消除反应,如图15,16所示,水提黑豆糖蛋白HDW和HDS0.2经加氢氧化钠处理后在240nm处有特征吸收峰增强,说明均为O-型连接糖蛋白。HDJ-0.2和HDJ-0.5-2两个糖蛋白反应前后吸光度值也发生了明显变化,说明也是O-糖肽键连接。
7、单糖组成分析
使用PMP衍生化高效液相色谱对糖蛋白糖链部分进行单糖组成分析:
称取2-4mg多糖样品于鸡心瓶中,加入1ml H2O预溶,再加入1ml 4mol/L的TFA(三氟乙酸),橡皮膏封闭瓶口,置110℃烘箱中水解4-6h;冷却至室温后,加甲醇多次除去多余的TFA至无酸味;水解的多糖样品复溶于200μL H2O。称取各单糖标准品(D-Man;L-Rha;D-GalA;D-Glc;D-Gal;L-Xyl;L-Ara;L-Fuc)溶于去离子水中,配成1mg/mL以待分析。多糖是否彻底水解以及TFA是否去除完全会影响液相检测,110℃的高温和水解4-6h才能够保证完全水解成单糖,甲醇旋蒸需每次蒸干,在加入甲醇多次蒸干去除剩余的TFA。
取50μL多糖水解液或50μL混合单糖标准品溶液于2ml EP管中,分别与50μL的0.6mol/L的NaOH溶液充分混合,加入100μL 0.5mol/L的PMP(1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮)(0.2613g/3ml)甲醇溶液,塞紧塞子封紧后,漩涡振荡仪混匀;在70℃水浴中反应100min,取出冷却至室温。加入100μL 0.3mol/L的HCl中和,再加700μL去离子水以及1ml氯仿萃取,漩涡振荡2-3min,静置1-2h。吸取上层水相900μl,再加入900μL的氯仿萃取一次,静置1h,再去上层水相800μL,再加入800μL的氯仿萃取一次,或用低速离心代替静置处理。用带有0.22μm微孔滤膜的注射器过滤后,装入液相瓶中待HPLC进样分析。氯仿萃取PMP需彻底,否则液相检测过程中会出现很高的PMP的峰值,覆盖相近的单糖出峰。萃取过程需使劲震荡2-3min,氯仿和水相两相充分混合,才能尽可能出去多余PMP,静止分层不明显时,需要进行高速离心,两相完全分层,吸取上层水相时不要接触到下层氯仿相。
HPLC分析糖组成:
Agilent 1260高效液相色谱系统
色谱柱:ZORBAX Eclipse XDB-C18,250mm×4.6mm,5μm;
流动相:Buffer A:15%乙腈+85%磷酸盐缓冲液(体积比),
Buffer B:40%乙腈+60%磷酸盐缓冲液(体积比);
磷酸盐缓冲液:0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液(pH 6.7)
KH2PO4 13.6g及NaOH1.8g溶液2L水中;
乙腈(HPLC级);柱温:20℃;紫外检测波长:254nm;流速:1ml/min;进样体积:20μl。
表1流动相配置
时间(min) | Buffer A(%) | Buffer B(%) |
0 | 100 | 0 |
10 | 90 | 10 |
15 | 80 | 20 |
25 | 70 | 30 |
30 | 60 | 40 |
45 | 100 | 0 |
55 | 100 | 0 |
流动相的配置,完全按照上述体积比例进行配置,磷酸缓冲液的pH值会影响出峰时间的快慢,所以配好后需要调整pH值到6.7,硫酸缓冲液与已经混合配成A、B两种流动相时,需要充分颠倒混匀,并且超声30min,否则会出现标准单糖出峰缺失,只有个别单糖可以出峰,整体出峰时间延迟等现象,导致样品无法检测。柱温设定20℃为宜,太高会导致部分单糖重叠,分不开。
图17、18、19、20、21和22分别为单糖混标、HDW、HDS0.2、HDJ-0.2、HDJ-0.5-1、和HDJ-0.5-2的高效液相色谱图,结果表明不同的糖蛋白中单糖的组成是完全不一样的,比如HDW主要由葡萄糖组成,含有少量甘露糖;而HDS0.2主要由葡萄糖、半乳糖、木糖组成,并且含量相当,另外含有一些甘露糖和半乳糖醛酸,之前组成分析也显示HDS0.2含有一定量的糖醛酸。三种碱提多糖HDJ-0.2、HDJ-0.5-1、和HDJ-0.5-2中的甘露糖含量占远远高于水提多糖,另外单糖组成比较复杂,各种单糖都有,比例不同;含有甘露糖残基的糖蛋白容易和免疫细胞表明的甘露糖受体结合,进而激活免疫细胞,产生免疫反应,所以这一类糖蛋白的免疫活性更强,另外多糖成分复杂,活性功能多样,一般比单一成分的多糖活性更好。
8、抗氧化活性测定
初步测定了五种糖蛋白的抗氧化活性(总还原力),图23结果显示不同结构的糖蛋白的还原能力不一样,水提糖蛋白中HDS0.2的还原力明显强于HDW;碱提糖蛋白的还原能力比水提糖蛋白更强,同时也说明本发明提取纯化方法保证了糖蛋白的抗氧化活性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等,均包含在本发明的保护范围内。
Claims (8)
1.一种黑豆糖蛋白的提取纯化方法,其特征在于,具体按照以下步骤进行:
S1,取黑豆,去皮,粉碎为粉末状;
S2,取1000g黑豆粉末,按照固液比1:5-1:7g/mL加入无水乙醇,置于索氏提取器中,70-80℃加热1.5-2h,进行回流脱脂处理,脱脂处理重复2-3次;
S3,将脱脂后的滤渣用8-10倍体积的蒸馏水在70-80℃条件下提取2-3h,抽滤;
S4,获取粗糖蛋白:
将步骤S3所得滤液用旋转蒸发仪浓缩10-15倍,在0-4℃下加4-5倍体积的无水乙醇,完全沉淀至少24小时,将沉淀抽滤,收集滤渣,经蒸馏水溶解,冻干,即得黑豆水提粗糖蛋白;
同时,向步骤S3所得滤渣中加入5-10倍体积0.1-0.5mol/L的NaOH溶液,在40-50℃下提取2-3h,离心后取上清液抽滤,滤液用0.1-0.2mol/L的乙酸中和,中和后出现沉淀,进行二次抽滤,减压浓缩滤液,在0-4℃下加入4-5倍体积无水乙醇,完全沉淀至少24小时,将沉淀抽滤,收集滤渣,经蒸馏水溶解,冻干,即得黑豆碱提粗糖蛋白;
S5,获取洗脱液:
将黑豆水提粗糖蛋白、黑豆碱提粗糖蛋白分别用蒸馏水完全溶解,经透析、旋转蒸发仪浓缩至刚好不析出糖蛋白沉淀,所述透析选用截留量为500-1000Da、直径为34-44mm的透析袋;离心后取上清液,分别经Cl-型DEAE-52纤维素柱层析,用不同浓度的NaCl溶液进行洗脱;分离得到黑豆水提粗糖蛋白的蒸馏水洗脱组分和0.2mol/L NaCl洗脱组分,黑豆碱提粗糖蛋白的0.2mol/L NaCl洗脱组分和0.5mol/L NaCl洗脱组分;洗脱组分经透析、冻干;
S6,用蒸馏水溶解,采用葡聚糖凝胶柱G-100分别对四组洗脱液进行分离纯化,从黑豆水提粗糖蛋白的蒸馏水洗脱组分中得到纯黑豆糖蛋白,命名为HDW;从黑豆水提粗糖蛋白的0.2mol/L NaCl洗脱组分中得到纯黑豆糖蛋白,命名为HDS0.2;从黑豆碱提粗糖蛋白的0.2mol/L NaCl洗脱组分中得到纯黑豆糖蛋白,命名为HDJ-0.2;从黑豆碱提粗糖蛋白的0.5mol/L NaCl洗脱组分中得到两种纯黑豆糖蛋白,分别命名为HDJ-0.5-1和HDJ-0.5-2;将以上五种纯黑豆糖蛋白分别经浓缩、冻干,即得。
2.根据权利要求1所述的一种黑豆糖蛋白的提取纯化方法,其特征在于,所述S4中,减压浓缩具体为:采用旋转蒸发仪,在60-65℃、0.08-0.09Mpa条件下,减压浓缩滤液两次,均没有糖蛋白沉淀析出。
3.根据权利要求1所述的一种黑豆糖蛋白的提取纯化方法,其特征在于,所述S6中,从黑豆水提粗糖蛋白的洗脱组分中得到纯黑豆糖蛋白,具体为:
采用葡聚糖凝胶柱G-100分别对两组洗脱液进行分离纯化,绘制洗脱曲线;蒸馏水洗脱组分、0.2mol/L NaCl洗脱组分的洗脱曲线分别有两个峰,收集吸光度值较大的峰两端对称试管中的洗脱液,每组洗脱液收集4-5管,分别浓缩至7-8mL,放入-40℃冰箱冷冻1天,然后在冻干机中-50℃抽真空干燥,即得纯黑豆糖蛋白HDW和HDS0.2的干粉。
4.根据权利要求1所述的一种黑豆糖蛋白的提取纯化方法,其特征在于,所述S6中,从黑豆碱提粗糖蛋白的洗脱组分中得到纯黑豆糖蛋白,具体为:
采用葡聚糖凝胶柱G-100分别对两组洗脱液进行分离纯化,绘制洗脱曲线;0.2mol/LNaCl洗脱组分的洗脱曲线有一个峰,0.5mol/L NaCl洗脱组分的洗脱曲线有两个峰,收集峰两端对称试管中的洗脱液,每个峰对应洗脱液收集4-5管,分别浓缩至7-8mL,放入-40℃冰箱冷冻1天,然后在冻干机中-50℃抽真空干燥,即得纯黑豆糖蛋白HDJ-0.2、HDJ-0.5-1和HDJ-0.5-2的干粉。
5.根据权利要求1所述的一种黑豆糖蛋白的提取纯化方法,其特征在于,所述S6中,葡聚糖凝胶柱G-100的分离范围4000-150000Da。
6.根据权利要求1所述的一种黑豆糖蛋白的提取纯化方法,其特征在于,所述S5中,Cl-型DEAE-52纤维素柱的处理方法:先用0.1-0.2mol/L的氢氧化钠浸泡DEAE-52纤维素填料两个小时,蒸馏水洗到中性,使纤维素接上OH-,然后再加入0.1-0.2mol/L的盐酸浸泡两小时,蒸馏水洗到中性,即得。
7.根据权利要求1所述的一种黑豆糖蛋白的提取纯化方法,其特征在于,所述S5中,离心速率为7000-8000r/min、离心时间为10min。
8.根据权利要求1所述的一种黑豆糖蛋白的提取纯化方法,其特征在于,所述S4、S5、S6中,冻干具体为:-40至-20℃低温冷冻1天,然后于-40至-50℃抽真空干燥。
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