EA032034B1 - Наночастицы двукратно дериватизованного хитозана и способы их получения и применения для переноса генов in vivo - Google Patents

Наночастицы двукратно дериватизованного хитозана и способы их получения и применения для переноса генов in vivo Download PDF

Info

Publication number
EA032034B1
EA032034B1 EA201401041A EA201401041A EA032034B1 EA 032034 B1 EA032034 B1 EA 032034B1 EA 201401041 A EA201401041 A EA 201401041A EA 201401041 A EA201401041 A EA 201401041A EA 032034 B1 EA032034 B1 EA 032034B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
chitosan
nucleic acid
polyplex
arginine
therapeutic
Prior art date
Application number
EA201401041A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201401041A1 (ru
Inventor
Дзун Гао
Эрик Хсу
Энтони Чеун
Original Assignee
Энджин, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Энджин, Инк. filed Critical Энджин, Инк.
Publication of EA201401041A1 publication Critical patent/EA201401041A1/ru
Publication of EA032034B1 publication Critical patent/EA032034B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H5/00—Compounds containing saccharide radicals in which the hetero bonds to oxygen have been replaced by the same number of hetero bonds to halogen, nitrogen, sulfur, selenium, or tellurium
    • C07H5/04—Compounds containing saccharide radicals in which the hetero bonds to oxygen have been replaced by the same number of hetero bonds to halogen, nitrogen, sulfur, selenium, or tellurium to nitrogen
    • C07H5/06—Aminosugars
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6927—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores
    • A61K47/6929—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle
    • A61K47/6931—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle the material constituting the nanoparticle being a polymer
    • A61K47/6939—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle the material constituting the nanoparticle being a polymer the polymer being a polysaccharide, e.g. starch, chitosan, chitin, cellulose or pectin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H13/00—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids
    • C07H13/02—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids by carboxylic acids
    • C07H13/04—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids by carboxylic acids having the esterifying carboxyl radicals attached to acyclic carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/0006—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid
    • C08B37/0024—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid beta-D-Glucans; (beta-1,3)-D-Glucans, e.g. paramylon, coriolan, sclerotan, pachyman, callose, scleroglucan, schizophyllan, laminaran, lentinan or curdlan; (beta-1,6)-D-Glucans, e.g. pustulan; (beta-1,4)-D-Glucans; (beta-1,3)(beta-1,4)-D-Glucans, e.g. lichenan; Derivatives thereof
    • C08B37/0027—2-Acetamido-2-deoxy-beta-glucans; Derivatives thereof
    • C08B37/003—Chitin, i.e. 2-acetamido-2-deoxy-(beta-1,4)-D-glucan or N-acetyl-beta-1,4-D-glucosamine; Chitosan, i.e. deacetylated product of chitin or (beta-1,4)-D-glucosamine; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L5/00—Compositions of polysaccharides or of their derivatives not provided for in groups C08L1/00 or C08L3/00
    • C08L5/08—Chitin; Chondroitin sulfate; Hyaluronic acid; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A61K9/5161—Polysaccharides, e.g. alginate, chitosan, cellulose derivatives; Cyclodextrin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
    • Y10S424/13—Burn treatment

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

В документе представлен хитозан, двукратно дериватизованный аргинином и глюконовой кислотой; а также способы его получения и применения, например, для доставки гена in vivo.

Description

Область техники
Настоящее изобретение относится, главным образом, к наночастицам, содержащим двукратно дериватизованный хитозан, и к способам их получения и применения для доставки нуклеиновых кислот, например переноса генов, in vivo.
Уровень техники
Хитозан представляет собой нетоксичный катионный сополимер N-ацетил-В-глюкозамина и Dглюкозамина. Хитозан может образовывать комплекс с нуклеиновой кислотой и как биосовместимый и нетоксичный полисахарид используется в качестве носителя для доставки ДНК для трансфекции клеток. Большой интерес сосредоточен на использовании хитозана для невирусной доставки нуклеиновой кислоты из-за сложностей и потенциальной токсичности вирусной оболочки.
Было исследовано множество комплексов хитозана/ДНК, в том числе комплексов между модифицированным хитозаном и нуклеиновыми кислотами, в попытках идентифицировать композиции, хорошо подходящие для генной трансфекции. См., например, WO 2010/088565; WO 2008/082282. Было обнаружено, что эти комплексы варьируются, помимо других свойств, по растворимости, склонности к агрегации, стабильности комплекса, размеру частиц, способности высвобождать ДНК и эффективности трансфекции.
В настоящем документе представлено неожиданное открытие, что аргинин и глюконовая кислота действуют синергетически для улучшения эффективности трансфекции хитозана.
Краткое описание изобретения
В настоящем документе представлено неожиданное открытие, что аргинин и глюконовая кислота синергетически увеличивают эффективность трансфекции хитозановых наночастиц. Соответственно, в настоящем документе представлены новые композиции для облегчения доставки нуклеиновых кислот в клетки, ткани и органы, например, in vivo.
В частности, в настоящем документе представлена наночастица производного хитозана для доставки нуклеиновых кислот в клетку, содержащая хитозан, связанный с глюконовой кислотой и аргинином.
В одном варианте реализации наночастицы содержат хитозан, который связан с аргинином и глюконовой кислотой, см., например, формулу I
где n представляет собой целое число от 1 до 2000, α представляет собой степень функционализации аргинина, β представляет собой степень функционализации глюконовой кислоты;
каждый R1 независимо выбран из водорода, ацетила, формулы (II) и формулы (III)
Двукратно дериватизованный хитозан, описанный в настоящем документе, содержит аргинин и глюконовую кислоту в различных первоначальных процентных концентрациях или конечных процентах функционализации. Первоначальная процентная концентрация используется для хитозана, модифицированного глюконовой кислотой, которая представляет собой молярное отношение карбоксильной группы у глюконовой кислоты, деленное на общее количество аминогрупп у хитозана или аргининмодифицированного хитозана, тогда как конечный процент функционализации представляет собой степень функционализации конечного модифицированного хитозана, рассчитанную по весовому отношению углерода и азота в результате элементного анализа. В одном варианте реализации хитозан связан с глюконовой кислотой в первоначальной концентрации от около 5 до около 60%, например от около 8 до около 30%. В другом варианте реализации предпочтительно около 30%. В другом варианте реализации хитозан связан с аргинином в конечной концентрации от около 10 до около 55%.
В частности, полиплексы хитозана и нуклеиновой кислоты, образованные с таким двукратно дериватизованным хитозаном (ДД-хитозаном) демонстрируют более высокую эффективность трансфекции, чем полиплексы нуклеиновой кислоты, образованные с не функционализированным хитозаном или хитозаном, который сопряжен либо только с остатками одной аминокислоты, либо только с аминокислот- 1 032034 ными полимерами, либо только с остатками глюконовой кислоты. Другие желательные свойства, сообщаемые за счет применения двукратно функционализированного хитозана в полиплексах, описанных в настоящем документе, включают улучшенную способность проникать через слизистый барьер, улучшенную стабильность полиплекса, сниженную клеточную токсичность и улучшенное внутриклеточное высвобождение нуклеиновой кислоты. Кроме того, в некоторых предпочтительных вариантах реализации рассматриваемые композиции полиплекса ДД-хитозана могут быть введены при физиологическом pH (например, системное введение).
Соответственно, в одном аспекте настоящего изобретения представлена композиция для доставки нуклеиновых кислот в клетку, содержащая наночастицу, в которой указанный хитозан связан в комплекс с нуклеиновой кислотой с образованием полиплекса двукратно дериватизованного (ДД) хитозана и нуклеиновой кислоты.
Нуклеиновая кислота может представлять собой ДНК или РНК.
Отношение амина к фосфату в указанном полиплексе ДД-хитозана и нуклеиновой кислоты составляет от 2 до 100, более предпочтительно от 2 до 50, еще более предпочтительно от 2 до 30, еще более предпочтительно от 2 до 15.
В одном варианте реализации полиплекс ДД-хитозана и нуклеиновой кислоты образуется при pH ниже pKa ДД-хитозана.
В одном варианте реализации полиплекс ДД-хитозана и нуклеиновой кислоты образуется при pH ниже 7.
В одном варианте реализации полиплекс ДД-хитозана и нуклеиновой кислоты имеет комбинированную степень функционализации аргинином и глюконовой кислотой, составляющую 1-60%.
В одном варианте реализации полиплекс ДД-хитозана и нуклеиновой кислоты имеет комбинированную степень функционализации аргинином и глюконовой кислотой, составляющую 1-30%.
В одном варианте реализации молярное отношение аргинина к глюконовой кислоте в полиплексе ДД-хитозана и нуклеиновой кислоты составляет от 100:1 до 1:100.
В одном варианте реализации молярное отношение аргинина к глюконовой кислоте в полиплексе ДД-хитозана и нуклеиновой кислоты составляет от 50:1 до 1:50.
В одном варианте реализации молярное отношение аргинина к глюконовой кислоте в полиплексе ДД-хитозана и нуклеиновой кислоты составляет от 10:1 до 1:10.
В одном варианте реализации молярное отношение аргинина к глюконовой кислоте в полиплексе ДД-хитозана и нуклеиновой кислоты составляет от 5:1 до 1:5.
В одном варианте реализации молярное отношение аргинина к глюконовой кислоте в полиплексе ДД-хитозана и нуклеиновой кислоты составляет от 2:1 до 1:2.
В предпочтительных вариантах реализации молярное отношение аргинина к глюконовой кислоте обратно пропорционально молекулярной массе хитозана, т.е. для ДД-хитозана с более низкой молекулярной массой необходимо более высокое молярное отношение аргинина к хитозану и наоборот.
В одном варианте реализации нуклеиновая кислота в полиплексе ДД-хитозана и нуклеиновой кислоты представляет собой ДНК.
В одном варианте реализации нуклеиновая кислота в полиплексе ДД-хитозана и нуклеиновой кислоты представляет собой РНК.
В одном варианте реализации нуклеиновая кислота в полиплексе ДД-хитозана и нуклеиновой кислоты представляет собой искусственную нуклеиновую кислоту. В предпочтительном варианте реализации искусственная нуклеиновая кислота выбрана из группы, состоящей из пептидной нуклеиновой кислоты (ПНА), фосфородиамидат-морфолино-олигомера (ФМО), запертой нуклеиновой кислоты (ЗНК), гликолевой нуклеиновой кислоты (ГНК) и треозо-нуклеиновой кислоты (ТНК).
В одном варианте реализации нуклеиновая кислота в полиплексе ДД-хитозана и нуклеиновой кислоты представляет собой терапевтическую нуклеиновую кислоту. В одном варианте реализации терапевтическая нуклеиновая кислота представляет собой терапевтическую РНК. В предпочтительном варианте реализации терапевтическая РНК выбрана из группы, состоящей из антисмысловой РНК, миРНК, короткой шпилечной РНК, микроРНК и ферментной РНК.
В одном варианте реализации терапевтическая нуклеиновая кислота представляет собой ДНК.
В одном варианте реализации терапевтическая нуклеиновая кислота содержит последовательность нуклеиновых кислот, кодирующую терапевтический белок.
В одном аспекте настоящего изобретения представлена композиция, содержащая множество полиплексов ДД-хитозана и нуклеиновой кислоты.
В одном варианте реализации указанная композиция имеет pH в диапазоне 3,0-8,0, более предпочтительно в диапазоне 4,0-7,0 и наиболее предпочтительно в диапазоне 4,5-6,5.
Композиция по изобретению в одном воплощении может содержать молекулу хитозана имеющую среднюю молекулярную массу менее 110 кДа до функционализации указанной глюконовой кислотой и указанным аргинином.
В другом воплощении полиплекс ДД-хитозана и нуклеиновой кислоты в композиции имеет средний коэффициент полидисперсности (PDI), выбранный из группы, включающей менее 0,5, менее 0,4, менее
- 2 032034
0,3 и менее 0,25.
В одном аспекте настоящего изобретения представлена фармацевтическая композиция, содержащая подиндекс ДД-хитозана и нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением. В предпочтительном варианте реализации полиплекс ДД-хитозана и нуклеиновой кислоты содержит терапевтическую нуклеиновую кислоту.
В одном аспекте настоящего изобретения композиция содержит полиплекс ДД-хитозана и нуклеиновой кислоты, в котором нуклеиновая кислота кодирует терапевтический белок, выбранный из группы, состоящей из инсулина, лептина, антагониста глюкагона, GLP-1, GLP-2, GLP-1, GLP-2, грелина, холецистокинина, гормона роста, факторов свертываемости, PYY, эритропоэтина, ингибиторов воспаления, IL10, антагонистов IL-17, антагонистов TNFa, гормона, высвобождающего гормон роста, или гормона паращитовидной железы, более предпочтительно терапевтический белок, выбранный из группы, состоящей из инсулина, антагониста глюкагона, GLP-1 или лептина, либо из IL-10, антагониста TNFa или антагониста IL-17, либо из лептина, холецистокинина, PYY или GLP-1, либо нуклеиновая кислота кодирует IL10.
В одном аспекте настоящего изобретения представлен способ доставки молекулы нуклеиновой кислоты в клетку, включающий контакт указанной клетки с полиплексом ДД-хитозана и нуклеиновой кислоты. Указанная клетка в одном варианте осуществления может находиться in vivo.
Использование фармацевтической композиции настоящего изобретения предусматривает введение терапевтически эффективного количества указанной композиции пациенту.
В одном варианте реализации рассматриваемую фармацевтическую композицию вводят при физиологическом pH.
В одном варианте реализации рассматриваемую фармацевтическую композицию вводят системно.
В одном варианте реализации рассматриваемую фармацевтическую композицию вводят локально в ткань-мишень. В предпочтительном варианте реализации рассматриваемую фармацевтическую композицию вводят в слизистую ткань. В одном варианте реализации слизистая ткань представляет собой ЖК ткань.
В одном аспекте настоящего изобретения представлена вакцина, содержащая полиплекс ДДхитозана и нуклеиновой кислоты, при этом нуклеиновая кислота кодирует антиген.
Краткое описание графических материалов
Фиг. 1 представляет собой блок-схему способа получения хитозана, двукратно дериватизованного аргинином и глюконовой кислотой, в результате которого образуется оптимальная комбинация степеней функционализации между двумя связанными компонентами.
Фиг. 2 иллюстрирует эффективность трансфекции (нг SEAP/мг белка; ось у) 24-мерного хитозана, связанного (А) с глюконовой кислотой в первоначальной концентрации (ось х) 10%, 30% или 60%, или (В) с аргинином в конечной степени функционализации (ось х) 9,7%, 12,3%, 26% или 52%.
Фиг. 3 иллюстрирует эффективность трансфекции (нг SEAP/мг белка; ось у) полиплексов, полученных при соотношении амина/фосфата (N/P), равным 20, с 24-мерным хитозаном, который был (А) двукратно связан с аргинином и глюконовой кислотой до конечной степени функционализации 26% аргинина и 5% глюконовой кислоты; (В) связан только с аргинином до конечной степени функционализации 26%, или (С) связан только с глюконовой кислотой при первоначальной концентрации 30% глюконовой кислоты к общему амину.
Фиг. 4 иллюстрирует эффективность трансфекции (нг SEAP/мг белка; ось у) полиплексов, полученных при соотношении амина/фосфата (N/P), равным 20, с 24-мерным хитозаном, связанным только с аргинином с конечной функционализацией 26% (0%; ось х), или дополнительно связанным с глюконовой кислотой до конечной степени функционализации глюконовой кислоты 3%, 5%, 6% и 9% (ось х).
Фиг. 5 иллюстрирует влияние соотношения амина/фосфата (N/P) (ось х), равного 40 (N40), 20 (N20) или 10 (N10) на эффективность трансфекции (нг SEAP/мг белка; ось у) 24-мерного хитозана, двукратно дериватизованного аргинином и глюконовой кислотой с конечной степенью функционализации 26% и 5% соответственно (прямоугольники в мелкую клетку), или хитозана, связанного только с 26% аргинина (прямоугольники в крупную клетку).
Фиг. 6 иллюстрирует влияние pH препарата (ось х) на эффективность трансфекции (нг SEAP/мг белка) 24-мерного хитозана, двукратно дериватизованного аргинином и глюконовой кислотой с конечной степенью функционализации 26% и 5% соответственно (прямоугольники в мелкую клетку), или хитозана, связанного только с аргинином, с конечной степенью функционализации 26% (прямоугольники в крупную клетку).
Фиг. 7 иллюстрирует влияние процентной функционализации аргинина на эффективность трансфекции (нг SEAP/мг белка; ось у) 24-мерного хитозана, дериватизованного аргинином с конечной концентрацией 52% (А, В) или 26% (С, D) отдельно (А, С), или также глюконовой кислотой с конечной концентрацией 8% (В) или 6% (D). В качестве эталона включен также 24-мерный хитозан, связанный только с глюконовой кислотой в первоначальной концентрации 30% (Е).
Фиг. 8 иллюстрирует эффективность трансфекции 24-мерного хитозана, двукратно дериватизован- 3 032034 ного аргинином и глюконовой кислотой с конечной степенью функционализации 26% и 5% соответственно (прямоугольники в мелкую клетку), или хитозана, связанного только с 26% аргинина (прямоугольники в крупную клетку) (А) в клетках 293Т, (В) в клеточных линиях НТ1080 или Hela человека, или (С) в клеточных линиях обезьян VERO или мышей NIH3T3.
Фиг. 9 иллюстрирует генную экспрессию в мышце через 2 дня после внутримышечной инъекции хитозана (А), хитозана, функционализированного 26% аргинина (В), и хитозана, двукратно функционализированного с конечной степенью функционализации 26% аргинина и 5% глюконовой кислоты (С).
Фиг. 10 иллюстрирует генную экспрессию в дистальном отделе толстой кишки через 2 дня после толстокишечной доставки хитозана (А), хитозана, функционализированного 26% аргинина (В), и хитозана, двукратно функционализированного аргинином и глюконовой кислотой с конечной степенью функционализации 26% аргинина и 6% глюконовой кислоты (С).
Фиг. 11 иллюстрирует in vitro нокдаун-эффективность полиплексов люциферазы и миРНК, содержащих 24-мерный хитозан, полученный с соотношением амина/фосфата (N/P), равным 40, и связанным (А) с 26% только аргинина или (В) двукратно дериватизованным 26% аргинина и глюконовой кислотой с конечной степенью функционализации 5%.
Фиг. 12 иллюстрирует физико-химические свойства лиофилизированных полиплексов ДД-хитозана и нуклеиновой кислоты после восстановления в воде через 3 месяца хранения при комнатной температуре.
Подробное описание
Хитозан представляет собой деацетилированную форму хитина, который представляет собой полимер N-ацетилглюкозамина, который является основным компонентом внешнего скелета ракообразных (например, креветок, крабов, омаров). Хирозан образуется из хитина посредством деацетилирования, и поэтому представляет собой не одну полимерную молекулу, а класс молекул, имеющих различные молекулярные массы и различные степени деацетилирования. Процент деацетилирования в промышленных хитозанах обычно находится в диапазоне 50-100%.
Производные хитозана, описанные в настоящем документе, получают функционализацией образующихся свободных аминокислотных групп положительно заряженными или нейтральными фрагментами, описанными в настоящем документе. Дериватизованные хитозаны, описанные в настоящем документе, обладают рядом свойств, которые являются преимущественными для средства доставки нуклеиновой кислоты, в том числе они эффективно связываются и образуют комплексы с отрицательно заряженными нуклеиновыми кислотами, они могут быть сформированы в виде наночастиц контролируемого размера, они могут поглощаться клетками, и они могут высвобождать нуклеиновые кислоты в клетках в соответствующее время.
В настоящем документе используются хитозаны с любой степенью деацетилирования более 50%, с функционализацией от 1 до 50% (процент функционализации определен относительно количества свободных аминофрагментов в хитозановом полимере). Степени деацетилирования и функционализации сообщают определенную плотность заряда функционализированному производному хитозана. Полученная плотность заряда влияет на растворимость, связывание нуклеиновой кислоты и последующее ее высвобождение, взаимодействие с клеточными мембранами млекопитающих. Следовательно, в соответствии с настоящим изобретением эти свойства должны быть оптимизированы для оптимальной эффективности. Иллюстративные производные хитозана описаны в заявке Baker et al. 11/657382, поданной 24 января 2007 г., которая включена в настоящий документ посредством ссылки. В одном варианте реализации двукратно дериватизованный хитозан, описанный в настоящем документе, содержит хитозан, имеющий степень деацетилирования по меньшей мере 50%. В одном варианте реализации степень деацетилирования составляет по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 90% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 95%. В предпочтительном варианте реализации двукратно дериватизованный хитозан, описанный в настоящем документе, содержит хитозан, имеющий степень деацетилирования по меньшей мере 98%.
Производные хитозана, описанные в настоящем документе, имеют диапазон средних молекулярных масс, растворимых при нейтральном и физиологическом pH, и включают для целей настоящего изобретения молекулярные массы в диапазоне от 3 до 110 кДа. Варианты реализации, описанные в настоящем документе, представляют собой характерно более низкие средние молекулярные массы дериватизованных хитозанов (<25 кДа, например от около 5 и до около 25 кДа), которые имеют заданные свойства доставки и трансфекции и являются небольшими по размеру, а также обладают благоприятной растворимостью. Дериватизованный хитозан с более низкой средней молекулярной массой, как правило, более растворим, чем дериватизованный хитозан с более высокой молекулярной массой, при этом первый из них образует за счет этого комплекс нуклеиновой кислоты/хитозана, который легче высвобождает нуклеиновую кислоту и обеспечивает повышенную трансфекцию клеток. Оптимизации всех этих параметров для систем доставки на основе хитозана посвящено большое количество литературных источников.
Специалистам в данной области понятно, что хитозан относится к множеству молекул, имеющих структуру формулы I, где n представляет собой любое целое число, и каждый R1 представляет собой во- 4 032034 дород. Кроме того, хитозан, имеющий среднюю молекулярную массу, например, от 3 до 110 кД, относится, как правило, к множеству молекул хитозана, имеющих средневесовую молекулярную массу, например, от 3 до 110 кД, соответственно, при этом каждая из молекул хитозана может иметь различную длину цепи (n+2). Понятно также, что хитозан, упоминаемый как n-мерный хитозан, не обязательно включает молекулы хитозана формулы I, где каждая молекула хитозана имеет длину цепи n+2. Скорее n-мерный хитозан при использовании в настоящем документе означает множество молекул хитозана, каждая из которых может иметь различную длину цепи, при этом указанное множество имеет среднюю молекулярную массу, по существу, равную или эквивалентную молекуле хитозана, имеющей длину цепи n. Например, 24-мерный хитозан может содержать множество молекул хитозана, каждая из которых имеет различную длину цепи, например в диапазоне 7-50, но которые имеют среднюю молекулярную массу, по существу, равную или эквивалентную молекуле хитозана, имеющей длину цепи 24.
Функционализированные производные хитозана, описанные в настоящем документе, представляют собой двукратно дериватизованные соединения хитозана, например соединения хитозан-аргининглюконовой кислоты. В общем, соединения хитозан-аргинин-глюконовой кислоты имеют следующую структуру формулы I:
где n представляет собой целое число от 1 до 2000, α представляет собой степень функционализации аргинина, β представляет собой степень функционализации глюконовой кислоты;
каждый R1 независимо выбран из водорода, ацетила, формулы (II) и формулы (III)
Предпочтительный способ сопряжения хитозана с аргинином или глюконовой кислотой в водной среде в соответствии с настоящим изобретением описан в настоящем документе, в котором используют Boc-L-аргинин (Boc-R) и глюконовую кислоту (Gluco). В указанном способе используют хорошо известный водорастворимый 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (EDC) и N-гидроксисукцинимид (NHS) для катализирования образования амида между амином в хитозановом скелете и карбоновой кислотой в Boc-R или глюконовой кислоте.
Как правило, хитозан в разбавленном растворе HCl с pH, доведенным до pH заданного связывания, например до 6,0+0,5 и более предпочтительно 6,0+0,2, сначала связывают с Boc-R или Gluco, очищают, а затем связывают со второй функциональной группой. Например, если хитозан сначала связывают с аргинином, то аргининсвязанный хитозан (R-хитозан) может быть очищен, а затем связан с глюконовой кислотой. И наоборот, если хитозан сначала связан с глюконовой кислотой, то хитозан, связанный с глюконовой кислотой (глюко-хитозан), может быть очищен, а затем связан с аргинином. Независимо от порядка связывания, аргинин и глюконовая кислота могут быть связаны с хитозанам общеизвестными способами.
Например, аргинин может быть связан с хитозаном или глюко-функционализированным хитозаном (глюко-хитозаном) добавлением смеси Boc-R и водного раствора NHS с отрегулированным pH в хитозан в разбавленном растворе HCl, с последующим добавлением водного раствора EDC для инициации связывания при комнатной температуре в течение 24 ч. Концентрация хитозан-амина, pH реакции и молярные соотношения R-COOH и хитозан-амина и EDC:NHS:R-COOH могут быть предварительно рассчитаны и проверены для обеспечения воспроизводимой конечной степени функционализации аргинина. BocR-хитозан может быть очищен до реакции де-Boc. Реакция де-Вос может быть выполнена в среде HCl с контролируемой концентрацией HCl и временем реакции. Любая деполимеризация хитозана во время деВос может контролироваться измерением вязкости реакционного раствора, которая признана незначительной, а эффективность де-Вос может быть подтверждена протонным ЯМР де- Boc-R-хитозана и BocR-хитозана. Степень функционализации может быть определена по элементному анализу С, N очищенного де-Вос-Е-хитозана.
Глюконовая кислота может быть связана с хитозаном или аргининсвязанным хитозаном (R
- 5 032034 хитозаном) при pH реакции 6,0+0,3. При этом pH карбоксильная группа глюконовой кислоты может подвергаться атаке несвязанных аминов в хитозановом скелете в соответствии с механизмом реакции нуклеофильного замещения. Специалистам в данной области техники понятно, что при связывании глюконовой кислоты с R-хитозаном возможно также, что небольшое количество глюконовой кислоты может образовывать ковалентную связь с аминогруппой аргинина по тому же механизму, хотя вероятно, что реакция нуклеофильного замещения будет происходить преимущественно с аминогруппой хитозанового скелета. Следовательно, в некоторых вариантах реализации R1 формулы I также может быть независимо выбран из водорода, ацетила, формулы (II), формулы (III) и формулы (IV)
NH2
Boc-R-хитозан, де-Вос-Е-хитозан, глюко-хитозан и/или двукратно дериватизованный хитозан может быть очищен осаждением, или колоночной очисткой, или обычным диализом, или диализом с обратным потоком относительно воды Milli-Q с использованием целлюлозной диализной трубки с соответствующим отсечением по молекулярной массе (MWCO), или с помощью фильтрования тангенциальным потоком (TFF) и картриджей для диафильтрации.
Соответственно, двукратно дериватизованный хитозан или ДД-хитозан относится также к хитозану, который был двукратно функционализирован (двукратно функционализированный хитозан или ДФ-хитозан), например связан с аргинином и глюконовой кислотой, которые ковалентно присоединены к хитозану. Аргинин может быть ковалентно присоединен к хитозану как в виде одной аминокислоты, так и в виде полипептида.
При использовании в настоящем документе, если не указано иное, термин пептид и полипептид используются взаимозаменяемо.
Термин полипептид используется в самом широком смысле для обозначения обычных полипептидов (т.е. коротких полипептидов, содержащих L- или D-аминокислоты), а также пептидных эквивалентов, пептидных аналогов и пептидомиметиков, которые сохраняют заданную функциональную активность. Пептидные эквиваленты могут отличаться от обычных пептидов заменой одной или более аминокислот на родственные органические кислоты, аминокислоты или тому подобные, или заменой или модификацией боковых цепей или функциональных групп.
Пептидомиметики могут иметь одну или более пептидных связей, замененных альтернативной связью, как известно в данной области техники. Части или полный пептидный скелет также может быть заменен конформационно затрудненными циклическими алкильными или арильными заместителями для ограничения подвижности функциональных аминокислотных боковых цепей, как известно в данной области техники.
Полипептиды настоящего изобретения могут быть получены известными способами, такими как рекомбинантные и синтетические способы, хорошо известные в данной области техники. Приемы синтеза пептидов общеизвестны и включают методики, описанные в публикациях Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-2456 (1963), Atherton, et al., Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press (1989) и Merrifield, Science 232:341-347(1986).
Используемый в настоящем документе термин линейный полипептид относится к полипептиду, который не содержит разветвляющихся групп, ковалентно присоединенных к его составным аминокислотным боковым цепям. Используемый в настоящем документе термин разветвленный полипептид относится к полипептиду, который содержит разветвляющиеся группы, ковалентно присоединенные к его составным аминокислотным боковым цепям.
Используемый в настоящем документе термин аминокислота включает природные аминокислоты, а также не встречающиеся в природе аминокислоты, такие как аминокислотные аналоги. Термин аминокислота относится к природным (D) или (L) аминокислотам, химически модифицированным аминокислотам, природным аминокислотам, таким как норлейцин, и к химически синтезированным соединениям, которые обладают такими свойствами, которые, как известно в данной области техники, являются характерными для аминокислот.
Аминокислотные остатки в пептидах имеют сокращения, общепринятые в данной области техники.
В некоторых вариантах реализации, где это уместно, ДД-хитозан включает производные ДДхитозана, например ДД-хитозан, который содержит дополнительную функционализацию, например ДДхитозан с присоединенным лигандом. Следует понимать, что производные включают широкую категорию полимеров на основе хитозана, содержащих ковалентно модифицированные Н-ацетил-Dглюкозаминовые и/или D-глюкозаминовые звенья, а также полимеры на основе хитозана, содержащие
- 6 032034 другие звенья, или присоединенные к другим фрагментам. Производные часто основаны на модификации гидроксильной группы или аминогруппы глюкозамина, как в случае аргининфункционализированного хитозана. Примеры производных хитозана включают, но не ограничиваясь этим, триметилированный хитозан, ПЭГилированный хитозан, тиолированный хитозан, галактозилированный хитозан, алкилированный хитозан, хитозан с внедренным ПЭИ, хитозан, модифицированный уроновой кислотой, гликоль-хитозан и тому подобные. Дополнительные указания о хитозановых производных представлены, например, на cc. 63-74 публикации Non-viral Gene Therapy, K. Taira, K. Kataoka, T. Niidome (редакторы), Springer-Verlag, Токио, 2005, ISBN 4-431-25122-7; Zhu et al., Chinese Science Bulletin, декабрь 2007 г., т. 52 (23), cc. 3207-3215; и Varma et al., Carbohydrate Polymers 55 (2004) 77-93.
Диспергированные системы состоят из дисперсного вещества, известного как диспергированная фаза, распределенного в непрерывной среде. Дисперсия полиплексов ДД-хитозана и нуклеиновой кислоты представляет собой композицию, содержащую гидратированные полиплексы ДД-хитозана и нуклеиновой кислоты, при этом указанные полиплексы распределены в среде.
Используемый в настоящем документе термин предварительно концентрированная дисперсия представляет собой дисперсию, которая не была подвергнута процессу концентрирования для формирования концентрированной дисперсии.
Используемый в настоящем документе термин по существу, чистый осадок полиплекса означает, что указанная композиция, по существу, не содержит частиц, которые можно наблюдать при визуальном осмотре.
Используемый в настоящем документе физиологический pH относится к pH от 6 до 8.
Под полиплексом ДД-хитозана и нуклеиновой кислоты или его грамматическими эквивалентами подразумевается комплекс, содержащий множество молекул ДД-хитозана и множество молекул нуклеиновой кислоты. В предпочтительном варианте реализации двукратно дериватизованный хитозан связан в комплекс с указанной нуклеиновой кислотой.
Полиплексы ДД-хитозана и нуклеиновой кислоты содержат компонент нуклеиновой кислоты и компонент ДД-хитозана. Хитозан и полиплексы ДД-хитозана и нуклеиновой кислоты могут быть получены по любому способу, известному в данной области техники. Например, концентрации функционализированного хитозана и нуклеотидного сырья могут быть подобраны для обеспечения различных соотношений амина к фосфату (N/P), пропорций смешивания и концентраций заданного нуклеотида. В некоторых вариантах реализации, особенно в малых партиях, например в партиях менее 2 мл, функционализированный хитозан и нуклеотидное сырье могут быть смешаны медленным капельным добавлением нуклеотидного сырья в сырьевой функционализированный хитозан при перемешивании контейнера на вортексе. В других вариантах реализации сырьевой функционализированный хитозан и нуклеотид могут быть смешаны поточным смешиванием двух потоков жидкости. В других вариантах реализации полученная дисперсия полиплекса может быть концентрирована с помощью фильтрования тангенциальным потоком (TFF). Предпочтительный способ образования полиплекса описан в публикации WO 2009/039657, которая в явной форме включена в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме.
Нуклеиновая кислота настоящего изобретения обычно содержит фосфодиэфирные связи, хотя в некоторых случаях включены аналоги нуклеиновых кислот, которые могут иметь альтернативные скелеты или другие модификации или фрагменты, внедренные для какой-либо из многочисленных целей, например для стабильности и защиты. Другие предполагаемые аналоги нуклеиновых кислот включают аналоги с нерибозными скелетами. Кроме того, могут быть получены смеси природных нуклеиновых кислот, аналогов и обоих вариантов. Нуклеиновые кислоты могут быть одноцепочечными или двухцепочечными или содержать части двухцепочечной или одноцепочечной последовательности. Нуклеиновые кислоты включают, но не ограничиваясь этим, ДНК, РНК и гибриды, в которых нуклеиновая кислота содержит любую комбинацию дезоксирибо- и рибонуклеотидов и любую комбинацию оснований, включая урацил, аденин, тимин, цитозин, гуанин, инозин, ксатанина гипоксатанин, изоцитозин, изогуанин и так далее. Нуклеиновые кислоты включают ДНК в любой форме, РНК в любой форме, в том числе триплексные, дуплексные или одноцепочечные, антисмысловые, миРНК, рибозимы, дезоксирибозимы, полинуклеотиды, олигонуклеотиды, химеры, микроРНК и их производные. Нуклеиновые кислоты включают искусственные нуклеиновые кислоты, включая, но не ограничиваясь этим, пептидную нуклеиновую кислоту (ПНА), фосфородиамидат-морфолино-олигомер (ФМО), запертую нуклеиновую кислоту (ЗНК), гликолевую нуклеиновую кислоту (ГНК) и треозо-нуклеиновую кислоту (ТНК).
В одном варианте реализации компонент нуклеиновой кислоты содержит терапевтическую нуклеиновую кислоту. Рассматриваемые полиплексы ДД-хитозана и нуклеиновой кислоты могут быть пригодны для использования любой терапевтической нуклеиновой кислоты, известной в данной области. Терапевтические нуклеиновые кислоты включают терапевтические РНК, которые представляют собой молекулы РНК, способные вызывать терапевтический эффект в клетке млекопитающего. Терапевтические РНК включают, но не ограничиваясь этим, антисмысловые РНК, миРНК, короткие шпилечные РНК, микроРНК и ферментные РНК. Терапевтические нуклеиновые кислоты включают, но не ограничиваясь этим, нуклеиновые кислоты, предназначенные для образования триплексных молекул, белок- 7 032034 связывающие нуклеиновые кислоты, рибозимы, дезоксирибозимы и небольшие нуклеотидные молекулы.
В данной области техники известно много типов терапевтических РНК. См., например, Grimm et al., Therapeutic application of RNAi: is mRNA targeting finally ready for prime time? J. Clin. Invest., 117:36333641, 2007; Aagaard et al., RNAi therapeutics: Principles, prospects and challenges, Adv. Drug Deliv. Rev., 59:75-86, 2007; Dorsett et al., siRNAs: Applications in functional genomics and potential as therapeutics, Nat. Rev. Drug Discov., 3:318-329, 2004. Сюда входят двухцепочечные малые интерферирующие РНК (миРНК).
Терапевтические нуклеиновые кислоты включают также нуклеиновые кислоты, кодирующие терапевтические белки, включая цитотоксические белки и пролекарства.
В предпочтительном варианте реализации компонент нуклеиновой кислоты содержит терапевтический конструкт нуклеиновой кислоты. Терапевтический конструкт нуклеиновой кислоты представляет собой конструкт нуклеиновой кислоты, способный вызывать терапевтический эффект. Терапевтические конструкты нуклеиновых кислот могут включать нуклеиновые кислоты, кодирующие терапевтические белки, а также нуклеиновые кислоты, которые создают транскрипты, которые представляют собой терапевтические РНК. Терапевтическая нуклеиновая кислота может быть использована для воздействия на генетическую терапию, действуя для замены или для усиления дефектного гена или для компенсации недостатка определенного генного продукта, кодируя терапевтический продукт. Терапевтическая нуклеиновая кислота также может ингибировать экспрессию эндогенного гена. Терапевтическая нуклеиновая кислота может кодировать весь или часть продукта трансляции и может действовать за счет рекомбинации с ДНК, уже существующей в клетке, посредством этого заменяя дефектную часть гена. Она также может кодировать часть белка и влиять на его эффект посредством совместного подавления генного продукта. В предпочтительном варианте реализации терапевтическая нуклеиновая кислота выбрана из кислот, описанных в публикации U.S.S.N. 11/694852, которая в явной форме включена в настоящий документ посредством ссылки.
В предпочтительном варианте реализации терапевтическая нуклеиновая кислота кодирует терапевтический белок, который выбран из группы, состоящей из гормонов, ферментов, цитокинов, хемокинов, антител, митогенных факторов, факторов роста, факторов дифференцировки, факторов, влияющих на ангиогенез, факторов, влияющих на образование сгустков крови, факторов, влияющих на содержание глюкозы в крови, факторов, влияющих на метаболизм глюкозы, факторов, влияющих на метаболизм липидов, факторов, влияющих на уровни холестерина в крови, факторов, влияющих на уровни ЛПНП или ЛПВП в крови, факторов, влияющих на клеточный апоптоз, факторов, влияющих на потребление пищи, факторов, влияющих на расход энергии, факторов, влияющих на аппетит, факторов, влияющих на абсорбцию питательных веществ, факторов, влияющих на воспаление, и факторов, влияющих на остеогенез. Особенно предпочтительны терапевтические нуклеиновые кислоты, кодирующие инсулин, лептин, антагонист глюкагона, GLP-1, GLP-2, грелин, холецистокинин, гормон роста, факторы свертываемости, PYY, эритропоэтин, ингибиторы воспаления, IL-10, антагонисты IL-17, антагонисты TNFa, гормон, высвобождающий гормон роста, или гормон паращитовидной железы.
Области контроля экспрессии.
В предпочтительном варианте реализации полиплекс настоящего изобретения содержит терапевтическую нуклеиновую кислоту, которая представляет собой терапевтический конструкт, содержащий область контроля экспрессии, функционально связанную с кодирующей областью. Терапевтический конструкт создает терапевтическую нуклеиновую кислоту, которая может быть терапевтической сама по себе или может кодировать терапевтический белок.
В некоторых вариантах область контроля экспрессии терапевтического конструкта обладает конститутивной активностью. В ряде предпочтительных вариантов реализации область контроля экспрессии терапевтического конструкта не обладает конститутивной активностью. Это обеспечивает возможность динамической экспрессии терапевтической нуклеиновой кислоты. Под динамической экспрессией подразумевается экспрессия, которая изменяется с течением времени. Динамическая экспрессия может включать несколько таких периодов с низкой экспрессией или без экспрессии, разделенные периодами с заметной экспрессией. В ряде предпочтительных вариантов реализации терапевтическая нуклеиновая кислота функционально связана с регулируемым промотором. Это обеспечивает возможность регулируемой экспрессии терапевтической нуклеиновой кислоты.
Области контроля экспрессии содержат регуляторные полинуклеотиды (иногда упоминаемые в настоящем документе как элементы), такие как промоторы и энхансеры, которые влияют на экспрессию функционально связанной терапевтической нуклеиновой кислоты.
Элементы контроля экспрессии, включенные в настоящий документ, могут быть из бактерий, дрожжей, растений или животных (млекопитающих или не млекопитающих). Области контроля экспрессии включают последовательности промоторов полной длины, такие как элементы нативного промотора или энхансера, а также последовательности или полинуклеотидные варианты, которые сохраняют полную или часть функции полной длины или не вариантной функции (например, сохраняют некоторое регулирование питательных веществ или некоторое количество клеточно/тканеспецифичной экспрессии). При использовании в настоящем документе термин функциональная или его грамматические варианты
- 8 032034 при использовании в отношении последовательности, подпоследовательности или фрагмента нуклеиновой кислоты, означает, что указанная последовательность имеет одну или более функций нативной последовательности нуклеиновых кислот (например, не вариантной или не модифицированной последовательности). Используемый в настоящем документе термин вариант означает замещение, делецию или добавление последовательности или другую модификацию (например, химические производные, такие как модифицированные формы, устойчивые к нуклеазам).
Используемый в настоящем документе термин функциональная связь относится к физическому соединению компонентов описанным образом для обеспечения их функции заданным образом. В примере элемента контроля экспрессии в функциональной связи с нуклеиновой кислотой, указанная взаимосвязь осуществлена так, чтобы контролирующий элемент модулировал экспрессию нуклеиновой кислоты. Как правило, область контроля экспрессии, которая модулирует транскрипцию, соединена возле 5' конца транскрибированной нуклеиновой кислоты (т.е. против хода транскрипции). Области контроля экспрессии также могут быть расположены на 3'-конце транскрибированной последовательности (т.е. по ходу транскрипции) или внутри транскрипта (например, в интроне). Элементы контроля экспрессии могут быть расположены на некотором расстоянии от транскрибированной последовательности (например, 100-500, 500-1000, 2000-5000 или более нуклеотидов от указанной нуклеиновой кислоты). Конкретный пример элемента контроля экспрессии представляет собой промотор, который обычно расположен в 5'-транскрибированной последовательности. Другой пример элемента контроля экспрессии представляет собой энхансер, который может быть расположен в 5'- или 3'-транскрибированной последовательности или внутри транскрибированной последовательности.
Некоторые области контроля экспрессии сообщают свойство регулируемой экспрессии функционально связанной терапевтической нуклеиновой кислоте. Сигнал (иногда упоминаемый как стимул) может увеличивать или снижать экспрессию терапевтической нуклеиновой кислоты, функционально связанной с такой областью контроля экспрессии. Такие области контроля экспрессии, которые повышают экспрессию в ответ на сигнал, зачастую упоминаются как индуцибельные. Такие области контроля экспрессии, которые снижают экспрессию в ответ на сигнал, зачастую упоминаются как репрессируемые. Как правило, степень увеличения или снижения, сообщаемая такими элементами, пропорциональна количеству существующего сигнала; чем больше уровень сигнала, тем больше увеличение или снижение экспрессии.
В данной области техники известны многие регулируемые промоторы. Предпочтительные индуцибельные области контроля экспрессии включают те, которые содержат индуцибельный промотор, который стимулируется низкомолекулярным химическим соединением. В одном варианте реализации область контроля экспрессии чувствительна к химическому соединению, которое доставляется перорально, но обычно не встречается в пищевых продуктах. Конкретные примеры представлены, например, в патентах США№№ 5989910; 5935934; 6015709 и 6004941.
В одном варианте реализации терапевтический конструкт дополнительно содержит интегрирующую последовательность. В одном варианте реализации терапевтический конструкт содержит одну интегрирующую последовательность. В другом варианте реализации терапевтический конструкт содержит первую и вторую интегрирующую последовательности для интегрирования терапевтической нуклеиновой кислоты или ее части в геном клетки-мишени. В предпочтительном варианте реализации интегрирующая последовательность(и) является функциональной в комбинации со средствами интеграции, которые выбраны из группы, состоящей из mariner, sleeping beauty, FLP, Cre, ФС31, R, лямбда и средств для интеграции из интегрирующих вирусов, таких как AAV, ретровирусы и лентивирусы.
В одном варианте реализации рассматриваемая композиция дополнительно содержит не терапевтический конструкт в дополнение к терапевтическому конструкту, при этом не терапевтический конструкт содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей средства для интеграции, функционально связанные со второй областью контроля экспрессии. Эта вторая область контроля экспрессии и область контроля экспрессии, функционально связанная с терапевтической нуклеиновой кислотой, могут быть одинаковыми или различными. Кодируемые средства интеграции предпочтительно выбраны из группы, состоящей из mariner, sleeping beauty, FLP, Cre, ФС31, R, лямбда и средств для интеграции из интегрирующих вирусов, таких как AAV, ретровирусы и лентивирусы.
Дополнительные указания представлены в публикации WO 2008020318, которая в явной форме включена в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме. В одном варианте реализации нуклеиновая кислота в полиплексе ДД-хитозана и нуклеиновой кислоты представляет собой искусственную нуклеиновую кислоту.
Предпочтительные искусственные нуклеиновые кислоты включают, но не ограничиваясь этим, пептидную нуклеиновую кислоту (ПНА), фосфородиамидат-морфолино-олигомер (ФМО), запертую нуклеиновую кислоту (ЗНК), гликолевую нуклеиновую кислоту (ГНК) и треозо-нуклеиновую кислоту (ТНК).
В одном варианте реализации нуклеиновая кислота в полиплексе ДД-хитозана и нуклеиновой кислоты представляет собой терапевтическую нуклеиновую кислоту. В одном варианте реализации терапевтическая нуклеиновая кислота представляет собой терапевтическую РНК. Предпочтительные тера- 9 032034 певтические РНК включают, но не ограничиваясь этим, антисмысловые РНК, миРНК, короткие шпилечные РНК, микроРНК и ферментные РНК.
В одном варианте реализации терапевтическая нуклеиновая кислота представляет собой ДНК.
В одном варианте реализации терапевтическая нуклеиновая кислота содержит последовательность нуклеиновых кислот, кодирующую терапевтический белок.
Полиплексы.
В предпочтительном варианте реализации полиплексы рассматриваемых композиций содержат молекулы хитозана, имеющие до функционализации средний молекулярный вес менее 110 кДа, более предпочтительно менее 65 кДа, более предпочтительно менее 50 кДа, более предпочтительно менее 40 кДа и наиболее предпочтительно менее 30 кДа. В некоторых вариантах реализации полиплексы композиций содержат хитозан, имеющий до функционализации средний молекулярный вес менее 15 кДа, менее 10 кДа, менее 7 кДа или менее 5 кДа.
В предпочтительном варианте реализации полиплексы содержат молекулы хитозана, имеющие в среднем менее 680 глюкозаминовых мономерных звеньев, более предпочтительно менее 400 глюкозаминовых мономерных звеньев, более предпочтительно менее 310 глюкозаминовых мономерных звеньев, более предпочтительно менее 250 глюкозаминовых мономерных звеньев и наиболее предпочтительно менее 190 глюкозаминовых мономерных звеньев. В некоторых вариантах реализации полиплексы содержат молекулы хитозана, имеющие в среднем менее 95 глюкозаминовых мономерных звеньев, менее 65 глюкозаминовых мономерных звеньев, менее 45 глюкозаминовых мономерных звеньев или менее 35 глюкозаминовых мономерных звеньев.
В предпочтительном варианте реализации рассматриваемые полиплексы имеют отношение амина к фосфату (N/P) от 2 до 100, например от 2 до 50, например от 2 до 40, например от 2 до 30, например от 2 до 20, например от 2 до 5. Предпочтительно отношение N/P обратно пропорционально молекулярному весу хитозана, т.е. для более низкого молекулярного веса ДД-хитозана необходимо более высокое отношение N/P и наоборот.
В предпочтительном варианте реализации рассматриваемые полиплексы имеют средний гидродинамический диаметр менее 1000 нм, более предпочтительно менее 500 нм и наиболее предпочтительно менее 200 нм.
В одном варианте реализации полиплексы ДД-хитозана и нуклеиновой кислоты имеют средний дзета-потенциал по меньшей мере 0 мВ при кислотном pH, например при pH менее 7, наиболее предпочтительно при pH от около 4 до 6.
В одном варианте реализации полиплексы ДД-хитозана и нуклеиновой кислоты имеют средний дзета-потенциал от +1 до +60 мВ, более предпочтительно от +1 до +40 мВ, более предпочтительно от +1 до +30 мВ при кислотном pH.
В предпочтительном варианте реализации полипептид имеет низкий нетто положительный, нейтральный или нетто отрицательный заряд при физиологическом pH и pKa менее 6. Такие полиплексы ДД-хитозана и нуклеиновой кислоты демонстрируют сниженную клеточную токсичность и улучшенное внутриклеточное высвобождение нуклеиновой кислоты.
Полиплексы ДД-хитозана и нуклеиновой кислоты в рассматриваемой композиции предпочтительно являются однородными в отношении размера полиплекса. Соответственно, в предпочтительном варианте реализации композиция имеет низкий средний коэффициент полидисперсности (КПД). В особенно предпочтительном варианте реализации дисперсия полиплекса ДД-хитозана и нуклеиновой кислоты имеет КПД менее 0,5, более предпочтительно менее 0,4, более предпочтительно менее 0,3 и наиболее предпочтительно менее 0,25.
Полиплексы рассматриваемых композиций предпочтительно являются, по существу, стабильными по размеру в указанной композиции. В предпочтительном варианте реализации композиция настоящего изобретения содержит полиплексы, которые увеличиваются по среднему диаметру менее чем на 100%, более предпочтительно менее чем на 50% и наиболее предпочтительно менее чем на 25% при комнатной температуре в течение 6 ч, более предпочтительно 12 ч, более предпочтительно 24 ч и наиболее предпочтительно 48 ч.
Полиплексы рассматриваемых композиций предпочтительно являются, по существу, стабильными по размеру в охлажденном состоянии. В предпочтительном варианте реализации композиция настоящего изобретения содержит полиплексы, которые увеличиваются по среднему диаметру менее чем на 100%, более предпочтительно менее чем на 50% и наиболее предпочтительно менее чем на 25% при 2-8°C в течение 6 ч, более предпочтительно 12 ч, более предпочтительно 24 ч и наиболее предпочтительно 48 ч.
Полиплексы рассматриваемых композиций предпочтительно являются, по существу, стабильными по размеру в условиях замораживания-оттаивания. В предпочтительном варианте реализации композиция настоящего изобретения содержит полиплексы, которые увеличиваются по среднему диаметру менее чем на 100%, более предпочтительно менее чем на 50% и наиболее предпочтительно менее чем на 25% при комнатной температуре в течение 6 ч, более предпочтительно 12 ч, более предпочтительно 24 ч и наиболее предпочтительно 48 ч, после оттаивания из замороженного состояния при температуре от -20
- 10 032034 до -80°C.
В предпочтительном варианте реализации композиция имеет концентрацию нуклеиновой кислоты более 0,5 мг/мл и, по существу, не содержит осажденного полиплекса. Более предпочтительно композиция имеет концентрацию нуклеиновой кислоты по меньшей мере 0,6 мг/мл, предпочтительно по меньшей мере 0,75 мг/мл, более предпочтительно по меньшей мере 1,0 мг/мл, более предпочтительно по меньшей мере 1,2 мг/мл и наиболее предпочтительно по меньшей мере 1,5 мг/мл и, по существу, не содержит осажденный полиплекс. Композиции являются гидратированными. В предпочтительном варианте реализации композиция, по существу, не содержит не связанной в комплекс нуклеиновой кислоты.
В предпочтительном варианте реализации композиция полиплекса ДД-хитозана и нуклеиновой кислоты является изотоничной. При составлении фармацевтических композиций очень желательно достигать изотоничность с сохранением стабильности полиплекса, и эти предпочтительные композиции хорошо подходят для фармацевтических препаратов и терапевтических применений.
Как правило, композиции, содержащие полиплексы ДД-хитозана и нуклеиновой кислоты, используют для контакта с клеткой-мишенью. Такой контакт обычно приводит к доставке нуклеиновой кислоты для экспрессии клеткой-мишенью. Композиции, пригодные для полиплексов ДД-хитозана и нуклеиновой кислоты, описанные в настоящем документе, общеизвестны в данной области техники и в общих чертах описаны ниже.
Порошкообразные препараты.
Композиции полиплекса ДД-хитозана и нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению включают порошки. В предпочтительном варианте реализации в настоящем изобретении представлена сухая порошкообразная композиция полиплекса ДД-хитозана и нуклеиновой кислоты. В предпочтительном варианте реализации сухая порошкообразная композиция полиплекса ДД-хитозана и нуклеиновой кислоты получена дегидратацией дисперсии полиплекса хитозана и нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением.
Фармацевтические препараты.
В настоящем изобретении представлены также фармацевтически приемлемые или физиологически приемлемые препараты, содержащие композиции полиплекса ДД-хитозана и нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению. Такие препараты могут быть введены субъекту in vivo для практического осуществления способов лечения.
Используемые в настоящем документе термины фармацевтически приемлемые и физиологически приемлемые относятся к носителям, разбавителям, вспомогательным веществам и тому подобным, которые могут быть введены субъекту, предпочтительно не вызывая избыточных неблагоприятных побочных эффектов (например, тошноты, боли в животе, головной боли и так далее). Такие препараты для введения включают стерильные водные или неводные растворы, суспензии и эмульсии.
Фармацевтические препараты могут быть приготовлены из носителей, разбавителей, вспомогательных веществ, растворителей, дисперсионных сред, покрытий, антибактериальных и противогрибковых агентов, изотонических агентов и агентов для замедления абсорбции и тому подобных, которые совместимы с введением субъекту. Такие препараты могут содержаться в таблетке (с покрытием или без покрытия), капсуле (твердой или мягкой), микрогрануле, эмульсии, порошке, грануле, кристалле, суспензии, сиропе или эликсире. Помимо других добавок могут содержаться также вспомогательные активные соединения и консерванты, например антимикробные агенты, антиоксиданты, хелатирующие агенты и инертные газы и тому подобные.
Вспомогательные вещества могут включать соль, изотонический агент, сывороточный белок, буфер или другой агент для контроля pH, антиоксидант, загуститель, незаряженный полимер, консервант или криопротектор. Вспомогательные вещества, используемые в композициях настоящего изобретения, могут дополнительно включать изотонический агент и буфер или другой агент для контроля pH. Эти вспомогательные вещества могут быть добавлены для сохранения предпочтительных диапазонов pH (около 6,0-8,0) и осмолярности (около 50-300 ммоль/л). Примеры подходящих буферов представляют собой ацетатный, боратный, карбонатный, цитратный, фосфатный и сульфонатный органический молекулярный буфер. Такие буферы могут содержаться в композиции в концентрациях от 0,01 до 1,0% (вес./об.). Изотонический агент может быть выбран из любых агентов, известных в данной области техники, например маннита, декстрозы, глюкозы и хлорида натрия или других электролитов. Предпочтительно изотонический агент представляет собой глюкозу или хлорид натрия. Изотонические агенты могут быть использованы в количествах, которые сообщают композиции такое же или похожее осмотическое давление, что и давление в биологической среде, в которую ее вводят. Концентрация изотонического агента в композиции зависит от природы конкретного используемого изотонического агента и может варьироваться от около 0,1 до 10%. При использовании глюкозы предпочтительно использовать ее в концентрации от 1 до 5% вес./об., более конкретно 5% вес./об. Если изотонический агент представляет собой хлорид натрия, предпочтительно использовать его в количествах до 1% вес./об., в частности 0,9 вес./об. Композиции настоящего изобретения могут дополнительно содержать консервант. Примеры консервантов представляют собой полигексаметилен-бигуанидин, бензалкония хлорид, стабилизированные оксихлоридные комплексы (такие как комплексы, известные как PuriteR), фенилртути ацетат, хлорбутанол, сорбиновую
- 11 032034 кислоту, хлоргексидин, бензиловый спирт, парабены и тимеросал. Как правило, такие консерванты содержатся в концентрациях от около 0,001 до 1,0%. Кроме того, композиции настоящего изобретения могут содержать также криозащитный агент. Предпочтительные криозащитные агенты представляют собой глюкозу, сахарозу, маннит, лактозу, трегалозу, сорбит, коллоидный диоксид кремния, декстран с предпочтительной молекулярной массой менее 100000 г/моль, глицерин и полиэтиленгликоли с молекулярной массой менее 100000 г/моль или их смеси. Наиболее предпочтительны глюкоза, трегалоза и полиэтиленгликоль. Как правило, такие криозащитные агенты содержатся в концентрациях от около 0,01 до 10%.
Фармацевтическая композиция может быть составлена так, чтобы быть совместимой с заданным способом введения. Например, для перорального введения композиция может быть смешана со вспомогательными веществами и может быть использована в форме таблеток, пастилок, капсул, например желатиновых капсул, или покрытий, например энтеросолюбильных покрытий (Eudragit® или Sureteric®). В пероральные препараты могут быть включены фармацевтически совместимые связующие агенты и/или вспомогательные материалы. Таблетки, пилюли, капсулы, пастилки и тому подобные могут содержать любой из следующих ингредиентов или соединений такой же природы: связующее вещество, такое как микрокристаллическая целлюлоза, трагакантовая камедь или желатин; вспомогательное вещество, такое как крахмал или лактоза, агент для улучшения распадаемости таблеток, такой как альгиновая кислота, Primogel или кукурузный крахмал; смазывающее вещество, такое как стеарат магния или Sterotes; скользящее вещество, такое как коллоидный диоксид кремния; подсластитель, такой как сахароза или сахарин; или ароматизатор, такой как перечная мята, метилсалицилат, или вкусовая добавка.
Композиции также могут содержать носители для защиты композиции от быстрого разложения или вывода из организма, такие как препараты с контролируемым высвобождением, включая имплантаты и микроинкапсулированные системы доставки. Например, может быть использован такой материал для временной задержки, как глицерилмоностеарат или глицерилстеарат, отдельно или в комбинации с воском.
Предусмотрены также суппозитории и другие ректально вводимые композиции (например, те, которые вводят с помощью клизмы). Дополнительно о средствах ректальной доставки см., например, Song et al., Mucosal drug delivery: membranes, methodologies, and applications, Crit. Rev. Ther. Drug. Carrier Syst, 21:195-256, 2004; Wearley, Recent progress in protein and peptide delivery by noninvasive routes, Crit. Rev. Ther. Drug. Carrier Syst., 8:331-394, 1991.
Дополнительные фармацевтические препараты, пригодные для введения, известны в данной области техники и применимы в способах и композициях настоящего изобретения (см., например, Remington, Pharmaceutical Sciences (1990) 18-е изд., Mack Publishing Co., Истон, штат Пенсильвания; The Merck Index (1996) 12-e изд., Merck Publishing Group, Уайтхаус, штат Нью-Джерси; и Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms, Technonic Publishing Co., Inc., Ланкастер, штат Пенсильвания (1993)).
Введение.
В одном варианте реализации применение ДД-хитозана в полиплексах ДД-хитозана и нуклеиновой кислоты обеспечивает продолжительную стабильность полиплексов при физиологическом pH. Это обеспечивает возможность эффективного системного введения, а также других способов введения.
Возможно любое количество способов введения, а выбор конкретного способа отчасти зависит от целевой ткани. Для введения могут быть использованы шприцы, эндоскопы, канюли, трубки для интубации, катетеры и другие изделия.
Дозы или эффективное количество для лечения субъекта предпочтительно являются достаточными для улучшения одного, нескольких или всех симптомов состояния, до измеримой или заметной степени, хотя удовлетворительным результатом является предотвращение или замедление прогрессирования или ухудшения расстройства, или состояния, или симптома. Следовательно, в случае состояния или расстройства, которое можно лечить экспрессией терапевтической нуклеиновой кислоты в целевой ткани, количество терапевтической РНК или терапевтического белка, вырабатываемого для улучшения состояния, которое можно лечить по способу настоящего изобретения, зависит от состояния и заданного результата, и может быть легко определено опытным специалистом. Подходящие количества зависят от состояния, подлежащего лечению, заданного терапевтического эффекта, а также от отдельного субъекта (например, биодоступности в организме субъекта, пола, возраста и так далее). Эффективное количество может быть установлено измерением релевантных физиологических эффектов.
В настоящем изобретении предусмотрены также ветеринарные применения. Соответственно, в одном варианте реализации настоящего изобретения представлены способы лечения млекопитающих, не являющихся человеком, которые включают введение наночастиц на основе хитозана в соответствии с настоящим изобретением указанному млекопитающему, не являющемуся человеком, нуждающемуся в лечении.
Парентеральное введение.
Соединения настоящего изобретения могут быть введены непосредственно в кровеносную систему, в мышцу или во внутренний орган. Пригодные способы парентерального введения включают внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное, интратекальное, внутрижелудочковое, интрауретральное,
- 12 032034 интрастернальное, внутричерепное, внутримышечное и подкожное введение. Пригодные устройства для парентерального введения включают игловые (включая микроигловые) шприцы, безыгловые шприцы и устройства для инфузии.
Парентеральные препараты обычно представляют собой водные растворы, которые могут содержать вспомогательные вещества, такие как соли, углеводы и буферные агенты, но для некоторых применений они могут быть более подходящим образом составлены в композицию в виде стерильного неводного раствора или в высушенной форме для использования вместе с подходящим носителем, таким как стерильная апирогенная вода.
Приготовление парентеральных препаратов в стерильных условиях, например лиофилизацией, может быть легко осуществлено по стандартным фармацевтическим методикам, хорошо известным специалистам в данной области.
Растворимость соединений, используемых для получения парентеральных растворов, может быть увеличена за счет использования соответствующих методик составления композиций, таких как введение агентов для улучшения растворимости.
Препараты для парентерального введения могут быть составлены для незамедлительного и/или модифицированного высвобождения. Препараты с модифицированным высвобождением включают препараты замедленного, устойчивого, импульсного, контролируемого, целевого и программируемого высвобождения. Следовательно, соединения настоящего изобретения могут быть составлены в композиции в виде твердого вещества, полутвердого вещества или тиксотропной жидкости для введения в виде имплантированного депо, обеспечивающего модифицированное высвобождение активного соединения.
Пероральное введение.
Рассматриваемые композиции могут быть введены перорально. Пероральное введение может включать проглатывание так, что соединение попадает в желудочно-кишечный тракт. Композиции настоящего изобретения также могут быть введены непосредственно в желудочно-кишечный тракт.
Препараты, пригодные для перорального введения, включают твердые препараты, такие как таблетки, капсулы, капсулы с покрытиями, содержащие дисперсные частицы или дисперсные частицы с покрытиями, жидкости или порошки, пастилки для рассасывания (включая наполненные жидкостью), жевательные резинки, мульти- и нанодисперсные частицы, гели, пленки, суппозитории и спреи.
Жидкие препараты включают суспензии, растворы, сиропы и эликсиры. Жидкие препараты могут быть получены разбавлением твердого вещества.
Таблеточные лекарственные формы обычно содержат средство для улучшения распадаемости. Примеры средств для улучшения распадаемости включают натрия крахмалгликолят, натрия карбоксиметилцеллюлозу, кальция карбоксиметилцеллюлозу, кроскармеллозу натрия, кросповидон, поливинилпирролидон, метилцеллюлозу, микрокристаллическую целлюлозу, низший алкил-замещенную гидроксипропилцеллюлозу, крахмал, пептизированный крахмал и альгинат натрия. Как правило, средство для улучшения распадаемости составляет от 1 до 25 вес.%, предпочтительно от 5 до 20 вес.% лекарственной формы.
Связующие вещества обычно используют для сообщения когезивных свойств таблеточному препарату. Пригодные связующие включают микрокристаллическую целлюлозу, желатин, сахара, полиэтиленгликоль, природные и синтетические смолы, поливинилпирролидон, пептизированный крахмал, гидроксипропилцеллюлозу и гидроксипропилметилцеллюлозу. Таблетки могут также содержать разбавители, такие как лактоза (моногидрат, высушенный распылением моногидрат, безводная и тому подобные), маннит, ксилит, декстроза, сахароза, сорбит, микрокристаллическая целлюлоза, крахмал и дигидрат двухосновного фосфата кальция.
Таблетки могут также необязательно содержать поверхностно-активные агенты, такие как натрия лаурилсульфат и полисорбат 80, и скользящие вещества, такие как диоксид кремния и тальк. При их наличии, поверхносто-активные агенты могут составлять от 0,2 до 5 вес.% таблетки, а скользящие вещества могут составлять от 0,2 до 1 вес.% таблетки.
Таблетки также обычно содержат смазывающие вещества, такие как стеарат магния, стеарат кальция, стеарат цинка, натрия стеарилфумарат и смеси стеарата магния и натрия лаурилсульфата. Как правило, смазывающие вещества составляют от 0,25 до 10 вес.%, предпочтительно от 0,5 до 3 вес.% таблетки.
Другие возможные ингредиенты включают антиоксиданты, красители, ароматизаторы, консерванты и агенты для маскирования вкуса.
Таблеточные смеси могут прессоваться напрямую или вальцеванием для формирования таблеток. Таблеточные смеси или порции смесей могут быть альтернативно гранулированы во влажном виде, в сухом виде или из расплава, заморожены из расплава или экструдированы перед таблетированием. Конечный препарат может содержать один или более слоев и может иметь или не иметь покрытие; он может быть даже инкапсулированным.
Составление таблеток рассмотрено в публикации Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, т. 1, авторы Н. Lieberman и L. Lachman (Marcel Dekker, Нью-Йорк, 1980).
Съедобные пероральные пленки для медицинского или ветеринарного применения обычно пред- 13 032034 ставляют собой гибкие водорастворимые или набухающие в воде тонкопленочные лекарственные формы, которые могут быстро растворяться или прилипать к слизистой оболочке, и обычно содержат пленкообразующий полимер, связующее вещество, растворитель, увлажнитель, пластификатор, стабилизатор или эмульгатор, агент для модификации вязкости и растворитель. Некоторые компоненты препарата могут выполнять более одной функции.
В настоящее изобретение включены также многочастичные гранулы, содержащие композицию настоящего изобретения.
Другие возможные ингредиенты включают антиоксиданты, красители, ароматизаторы и усилители вкуса, консерванты, средства стимуляции слюноотделения, охлаждающие агенты, совместные растворители (включая масла), мягчители, наполнители, противопенные агенты, поверхностно-активные вещества и средства маскировки вкуса.
Пленки в соответствии с настоящим изобретением обычно получают испарительным высушиванием тонких водных пленок, нанесенных на легкоотслаивающуюся подложку или бумагу. Это может быть высушиванием в печи или в туннеле, как правило, в комбинированной сушильной машине для покрытий, или высушиванием замораживанием или вакуумированием.
Твердые препараты для перорального введения могут быть составлены для незамедлительного и/или модифицированного высвобождения. Препараты с модифицированным высвобождением включают препараты замедленного, устойчивого, импульсного, контролируемого, целевого и программируемого высвобождения.
Известны и другие подходящие технологии высвобождения, такие как высокоэнергетические дисперсии, а также осмотические и частицы с покрытиями.
Местное введение.
Соединения настоящего изобретения также могут быть введены местно на кожу или слизистую оболочку, т.е. дермально или трансдермально. Типичные препараты для этой цели включают гели, гидрогели, лосьоны, растворы, кремы, мази, пылящие порошки, перевязочные материалы, пены, пленки, кожные пластыри, пластины, имплантаты, губки, волокна, бандажи и микроэмульсии.
Другие средства местного введения включают доставку электропорацией, ионтофорезом, фонофорезом, сонофорезом и микроигловыми или безыгловыми (например, Powderject™, Bioject™) инъекциями.
Препараты для местного введения могут быть составлены для незамедлительного и/или модифицированного высвобождения. Препараты с модифицированным высвобождением включают препараты замедленного, устойчивого, импульсного, контролируемого, целевого и программируемого высвобождения.
Введение ингаляцией/интраназально.
Соединения настоящего изобретения также могут быть введены интраназально или ингаляцией, обычно в форме сухого порошка (отдельно, в виде смеси, например в сухой смеси с лактозой, или в виде частицы из смешанных компонентов) из ингалятора сухого порошка или в виде аэрозольного спрея из аэрозольной тары, насоса, разбрызгивателя, распылителя или небулайзера, с использованием подходящего газа-вытеснителя или без него.
Капсулы, блистеры и картриджи для применения в ингаляторе и инсуфляторе могут быть составлены в композиции, содержащие порошковую смесь соединения настоящего изобретения, соответствующей порошковой основы, такой как лактоза или крахмал, и модификатора свойств, такого как I-лейцин, маннит или стеарат магния.
Препараты для ингаляции/интраназального введения могут быть составлены для незамедлительного и/или модифицированного высвобождения. Препараты с модифицированным высвобождением включают препараты замедленного, устойчивого, импульсного, контролируемого, целевого и программируемого высвобождения.
Ректальное/внутривагинальное введение.
Соединения настоящего изобретения могут быть введены ректально или вагинально, например, в форме суппозиториев, пессариев или клизм. Масло какао является традиционной основой суппозиториев, но при необходимости могут быть использованы различные альтернативы.
Препараты для ректального/вагинального введения могут быть составлены для незамедлительного и/или модифицированного высвобождения. Препараты с модифицированным высвобождением включают препараты замедленного, устойчивого, импульсного, контролируемого, целевого и программируемого высвобождения.
Глазное/ушное введение.
Соединения настоящего изобретения также могут быть введены непосредственно в глаз или ухо, обычно в форме капель. Другие препараты, пригодные для введения в глаза и уши, включают мази, биоразлагаемые (например, абсорбирующиеся гелевые губки, коллаген) и бионеразлагаемые (например, силикон) имплантаты, пластины, линзы и дисперсные системы. Препараты также могут быть доставлены ионтофорезом.
Препараты для глазного/ушного введения могут быть составлены для незамедлительного и/или модифицированного высвобождения. Препараты с модифицированным высвобождением включают препа- 14 032034 раты замедленного, устойчивого, импульсного, контролируемого, целевого или программируемого высвобождения.
Способы применения.
В одном варианте реализации композиции полиплекса ДД-хитозана и нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению могут быть использованы для терапевтического лечения. Такие композиции иногда упоминаются в настоящем документе как терапевтические композиции.
Терапевтические белки настоящего изобретения, рассмотренные ниже, образуются за счет полиплексов настоящего изобретения, содержащих терапевтические нуклеиновые кислоты. Применение рассматриваемых белков, описанных ниже, относится к применению рассматриваемых полиплексов для осуществления использования такого белка.
Терапевтические белки, предполагаемые для применения в настоящем изобретении, имеют широкий ряд функций и находят применение при лечении широкого спектра расстройств. Следующее описание терапевтического действия белков и показания, которые можно лечить с помощью терапевтических белков настоящего изобретения, является иллюстративным и не подразумевается исчерпывающим. Термин субъект относится к животному, при этом предпочтительны млекопитающие и особенно предпочтительны люди.
Частичный перечень терапевтических белков и целевых заболеваний представлен в таблице.
Основные соединения Целевое заболевание Функция Терапевтический эффект
Инсулин Диабет Замена инсулина Улучшение переноснмостн глюкозы. Отсрочка/предупрежденне диабета.
Антагонисты глюкагона Диабет Снижение эндогенной выработки глюкозы Улучшение переносимости глюкозы
GLP-1 Диабет Ожирение Стимулирование роста В-клеток, улучшение чувствительности к инсулину, подавление аппетита Улучшение переносимости глюкозы. Инициация снижения веса
Лептин Ожирение Диабет Подавление аппетита и улучшение чувствительности к инсулину Инициация снижения веса. Улучшение переносимости глюкозы
сск Ожирение Подавление аппетита Инициация снижения веса
Гормон роста (GH) Дефицит GH, истощение и антивозрастная медицина Замена GH Улучшение роста
Факторы свертываемости Гемофилия Замена факторов свертываемости Улучшение времени свертывания
Терапевтические антитела и фрагменты/части антител Инфекции Рак Нейтрализация патогенов или иммунное модулирование Предупреждение инфекций или отторжения трансплантата
Ингибиторы воспаления, например, IL-10, антагонисты TNFa, антагонисты IL-17 Воспаление желудочнокишечных органов, например, воспалительная Иммунное модулирование Предупреждение воспаления в желудочнокишечных органах
болезнь кишечника (ВБК)
В другом варианте реализации терапевтические композиции настоящего изобретения содержат терапевтические нуклеиновые кислоты, которые не кодируют терапевтические белки, например терапевтические РНК. Например, за счет выбора терапевтических РНК, которые действуют на гены, участвующие в механизмах заболевания и/или нежелательных клеточных или физиологических состояний, рассматриваемые композиции могут быть использованы при лечении широкого ряда заболеваний и состояний. Рассматриваемые композиции имеют такую особенность, что используемые терапевтические РНК не ограничены в отношении рамок для выбора мишени. Соответственно, рассматриваемые композиции находят применения при лечении любых заболеваний или состояний, затрагивающих соответствующую мишень.
Предпочтительные ткани, заболевания и состояния включают следующие, которые являются иллюстративными и никоим образом не ограничивающими:
- 15 032034
Целевой орган Целевое заболевание
Желудочно-кишечные (ЖК) органы Диабет Ожирение Воспалительная болезнь кишечника Синдром раздраженного кишечника ЖК инфекция Пептическая язва Гастроэзофагеальный рефлюкс Г астропарез Г еморрой Нарушение всасывания питательных веществ Раковые заболевания ЖК (рак толстой и прямой кишок, рак поджелудочной железы, рак желудка, рак пищевода, рак желчного прохода, рак желчного пузыря) Панкреатит Г емохроматоз Глютеновая болезнь Пищевая аллергия Инициация иммунной толерантности
Глаза Дегенерация желтого пятна Возрастная дегенерация желтого пятна Увеит Пигментный ретинит Ирит Склерит Глаукома Кератит Ретинопатия
Инфекция глаз (например, кератомикоз)
Матка, влагалище, яичники и шейка матки Раковые заболевания Инфекции Эндометриоз цервицит Урологическая боль Полипы Фибромы Эндометриальная гиперплазия
Мочевой пузырь и мочевыводящие пути Недержание мочи Инфекция мочевого пузыря и мочевыводящих путей Гиперактивность мочевого пузыря Эректильная дисфункция Диабетическая невропатия
Почки Диабетическая нефропатия Мембранная нефропатия Г ипертензия Рак почек Г ипертензия Поликистозная болезнь почек Г ломерулонефрит
Печень Дислипидемия/гиперхолестеринемия Диабет Метаболический синдром Г епатома Гепатит А/В/С Г емохроматоз Цирроз Стеатогепатит Болезни накопления гликогена
Кожа Псориаз Угри Розовые угри Гранулематозный дерматит Против морщин Депигментация
Легкие / органы дыхания Рак легких Хроническая обструктивная болезнь легких Инфекция дыхательных путей Кистозный фиброз Сосудистые болезни легких Миастения гравис Фиброз Астма
Головной мозг Болезнь Хантингтона Болезнь Альцгеймера Болезнь Паркинсона Рак головного мозга Ожирение Неврологические расстройства
- 16 032034
Кровяные клетки Раковые заболевания Инфекционные заболевания Аутоиммунные заболевания
Мышцы Метаболический синдром Атеросклероз Диабет Саркома Воспаление (например, полимиозит) Болезни накопления гликогена Миопатия
Сердце Инфаркт миокарда Атеросклероз Ангина Кардиомиопатия Ишемия Гипертензивная кардиопатия Тромбоз Аневризм
Жировая ткань Диабет Ожирение Метаболический синдром Атеросклероз Дислипидемия
Гипергликемия и масса тела.
Терапевтические белки включают инсулин и аналоги инсулина. Сахарный диабет представляет собой изнуряющее метаболическое заболевание, обусловленное отсутствием (тип 1) или недостаточностью (тип 2) выработки инсулина панкреатическими β-клетками (Unger, R.H. et al., Williams Textbook of Endocrinology Saunders, Филадельфия (1998)). β-клетки представляют собой специализированные эндокринные клетки, которые вырабатывают и запасают инсулин для высвобождения после приема пищи (Rhodes, et al., J. Cell Biol. 105:145(1987)), а инсулин представляет собой гормон, который облегчает перенос глюкозы из крови в ткани, где она необходима. Пациенты с диабетом должны часто контролировать содержание глюкозы в крови, и многим из них для выживания необходимы многократные ежедневные инъекции инсулина. Однако такие пациенты редко достигают идеальных концентраций глюкозы за счет инъекции инсулина (Turner, R.C. et al., JAMA 281:2005 (1999)). Более того, длительное повышение концентраций инсулина может привести к пагубным побочным эффектам, таким как гипогликемический шок и десенсибилизация реакции организма на инсулин. Следовательно, у диабетических пациентов продолжают развиваться долгосрочные осложнения, такие как сердечно-сосудистые заболевания, болезнь почек, слепота, поражение нервов и расстройства заживления ран (UK Prospective Diabetes Study (UKPDS) Group, Lancet 352, 837 (1998)).
Расстройства, которые можно лечить по способу настоящего изобретения, включают гипергликемическое состояние, такое как инсулинозависимый (тип 1) или -независимый (тип 2) диабет, а также физиологические состояния или расстройства, связанные или обусловленные гипергликемическим состоянием. Следовательно, гипергликемические состояния, которые можно лечить по способу настоящего изобретения, включают также гистопатологическое изменение, связанное с хронической или острой гипергликемией (например, диабетом). Конкретные примеры включают дегенерацию поджелудочной железы (разрушение β-клеток), кальциноз почечных канальцев, дегенерацию печени, повреждение глаз (диабетическая ретинопатия), синдром диабетической стопы, изъязвление слизистой оболочки, такой как рот и десна, избыточное кровотечение, отсроченное свертывание крови или заживление ран и повышенный риск коронарной болезни сердца, инсульта, болезни периферических сосудов, дислипидемии, гипертонии и ожирения.
Рассматриваемые композиции применимы для снижения глюкозы, улучшения толерантности к глюкозе, лечения гипергликемического состояния (например, диабета) или для лечения физиологических расстройств, связанных или вызванных гипергликемическим состоянием. Такие расстройства включают, например, диабетическую невропатию (вегетативную), нефропатию (поражение почек), кожные инфекции и другие кожные расстройства, медленное или отсроченное заживление травм или ран (например, приводящих к диабетическим карбункулам), повреждения глаз (ретинопатия, катаракта), которые могут привести к слепоте, синдрома диабетической стопы и ускоренного периодонтита. Такие расстройства включают также повышенный риск развития коронарной болезни сердца, инсульта, болезни периферических сосудов, дислипидемии, гипертонии и ожирения.
Используемый в настоящем документе термин гипергликемический или гипергликемии, при использовании в отношении состояния субъекта, означает временный или хронический патологически высокий уровень глюкозы, содержащейся в крови субъекта. Это состояние может быть обусловлено отсрочкой метаболизма или абсорбции глюкозы, так что субъект демонстрирует непереносимость глюкозы или состояние с повышенным уровнем глюкозы, обычно не встречающимся у здоровых субъектов (например, у субдиабетических субъектов с непереносимостью глюкозы, имеющих риск развития диабета, или у диабетических субъектов). Уровни глюкозы в плазме натощак (ГПН) для нормогликемии составляют менее чем около 110 мг/дл, для ухудшенного метаболизма глюкозы от около 110 до 126 мг/дл, а для пациентов с диабетом более чем около 126 мг/дл.
- 17 032034
Расстройства, которые можно лечить выработкой белка в слизистой ткани кишечника, включают также ожирение или нежелательную массу тела. Лептин, холецистокинин, PYY и GLP-1 снижают чувство голода, повышают расход энергии, вызывают снижение веса или обеспечивают нормальный гомеостаз глюкозы. Следовательно, в различных вариантах реализации способ настоящего изобретения для лечения ожирения или нежелательной массы тела или гипергликемии включает использование терапевтической нуклеиновой кислоты, кодирующей лептин, холецистокинин, PYY или GLP-1. В другом варианте реализации используют терапевтическую РНК, направленную на грелин. Грелин повышает аппетит и чувство голода. Следовательно, в различных вариантах реализации способ настоящего изобретения для лечения ожирения или нежелательной массы тела или гипергликемии включает использование терапевтической РНК, направленной на грелин, для снижения его экспрессии. Расстройства, которые можно лечить, включают также расстройства, обычно связанные с ожирением, например патологически повышенные концентрации в плазме/сыворотке ЛПНП, ЛПОНП, триглицеридов, холестерина, тромбообразования, приводящего к сужению или закупорке кровеносных сосудов, повышенного риска гипертонии/инсульта, коронарной болезни сердца и так далее.
Используемый в настоящем документе термин тучный или ожирение относится к субъекту, имеющему по меньшей мере 30% увеличение массы тела по сравнению с нормальным субъектом того же возраста и пола. Нежелательная масса тела относится к субъектам, имеющим на 1-29% более высокую массу тела, чем соответствует нормальным субъектам, а также к субъектам, которые являются нормальными в отношении массы тела, но желают снизить или предупредить увеличение массы своего тела.
В одном варианте реализации терапевтический белок настоящего изобретения представляет собой антагонист глюкагона. Глюкагон представляет собой пептидный гормон, вырабатываемый β-клетками в панкреатических островках, и является главным регулятором метаболизма глюкозы (Unger И.Н. & Orci L.N. Eng. J. Med. 304:1518 (1981); Unger R.H. Diabetes 25:136 (1976)). Как и в случае с инсулином, концентрация глюкозы в крови опосредует секрецию глюкагона. Однако в отличие от инсулина глюкагон секретируется в ответ на снижение глюкозы в крови. Следовательно, циркулирующие концентрации глюкагона являются наивысшими во время периодов голодания и минимальными во время приема пищи. Уровни глюкагона повышаются для ограничения промотирования накопления глюкозы под действием инсулина и для стимуляции высвобождения глюкозы из печени в кровь. Конкретный пример антагониста глюкагона представляет собой [дез-His1, дез-Phe6, Glu9]глюкагон-NH2. У крыс с диабетом, вызванным стрептозотоцином, концентрации глюкозы в крови снизились на 37% за 15 мин после внутривенного болюса (0,75 мкг/г веса тела) этого антагониста глюкагона (Van Tine В.Л. et al., Endocrinology 137:3316 (1996)). В другом варианте реализации настоящего изобретения представлен способ лечения диабета или гипергликемии, включающий использование терапевтической РНК для снижения уровней выработки глюкагона поджелудочной железой.
В другом варианте реализации терапевтический белок по настоящему изобретению, пригодный для лечения гипергликемического состояния или нежелательной массы тела (например, ожирения), представляет собой глюкагонподобный пептид-1 (GLP-1). GLP-1 представляет собой гормон, высвобождаемый из L-клеток в кишечнике во время приема пищи, который стимулирует увеличение секреции инсулина панкреатическими β-клетками. GLP-1 обладает дополнительными функциями, что делает его привлекательным терапевтическим агентом для лечения ожирения и диабета. Например, GLP-1 снижает опорожнение желудка, подавляет аппетит, снижает концентрацию глюкагона, повышает массу β-клеток, стимулирует биосинтез и секрецию инсулина глюкозозависимым образом и вероятно увеличивает чувствительность ткани к инсулину (Kieffer T.J., Habener J.F. Endocrin. Rev. 20:876 (2000)). Следовательно, регулируемое высвобождение GLP-1 в кишечнике для соответствия с приемом пищи может обеспечивать терапевтическое преимущество для гипергликемического состояния или нежелательной массы тела. Аналоги GLP-1, которые устойчивы к дипептидил-пептидату IV (DPP IV), обеспечивают более продолжительное действие и улучшенную терапевтическую ценность. Поэтому аналоги GLP-1 представляют собой предпочтительные терапевтические полипептиды. В другом варианте реализации настоящего изобретения представлен способ лечения диабета или гипергликемии, включающий использование терапевтической РНК для снижения уровней DPP IV.
В другом варианте реализации терапевтический белок настоящего изобретения, пригодный для лечения гипергликемического состояния, представляет собой антагонист к гормону резистину. Резистин представляет собой производный от адипоцитов фактор, экспрессия которого повышается в вызванной питанием и генетической формах ожирения. Нейтрализация циркулирующего резистина улучшает содержание глюкозы в крови и действие инсулина у мышей с ожирением. И наоборот, введение резистина нормальным мышам ухудшает переносимость глюкозы и действие инсулина (Steppan C.M. et al., Nature 409:307 (2001)). Следовательно, выработка белка, который антагонизирует биологические эффекты резистина в кишечнике, может обеспечивать эффективное лечение связанной с ожирением резистентности к инсулину и гипергликемических состояний. В другом варианте реализации настоящего изобретения представлен способ лечения диабета или гипергликемии, включающий использование терапевтической РНК для снижения уровней экспрессии резистина в жировой ткани.
- 18 032034
В другом варианте реализации терапевтический полипептид по настоящему изобретению, пригодный для лечения гипергликемического состояния или нежелательной массы тела (например, ожирения), представляет собой лептин. Хотя лептин вырабатывается преимущественно жировыми клетками, в небольших количествах он образуется также в желудке зависимым от приема пищи образом. Лептин передает информацию о клеточном метаболизме жира и весе тела в центры аппетита в головном мозге, где он сигнализирует о снижении потребления пищи (ускоряет насыщение) и повышает расход энергии организмом.
В другом варианте реализации терапевтический полипептид по настоящему изобретению, пригодный для лечения гипергликемического состояния или нежелательной массы тела (например, ожирения), представляет собой С-концевой глобулярный головной домен комплемента родственного белка адипоцитов (Acrp30). Acrp30 представляет собой белок, вырабатываемый дифференцированными адипоцитами. Введение мышам продукта протеолитического расщепления Acrp30, состоящего из глобулярного головного домена, приводит к существенному снижению веса (Fruebis J. et al., Proc. NatL Acad. Sci USA 98:2005 (2001)).
В другом варианте реализации терапевтический полипептид по настоящему изобретению, пригодный для лечения гипергликемического состояния или нежелательной массы тела (например, ожирения), представляет собой холецистокинин (CCK). CCK представляет собой желудочно-кишечный пептид, секретируемый в кишечнике в ответ на определенные питательные вещества в кишечнике. Высвобождение CCK пропорционально количеству потребленной пищи и предположительно сигнализирует головной мозг о прекращении приема пищи (Schwartz M.W. et al., Nature 404:661-71(2000)). Следовательно, повышенное содержание CCK может снижать объем потребления пищи и ускорять снижение веса или стабилизацию веса (т.е. предотвращать или замедлять повышение прироста веса).
В отношении PYY, см., например, le Roux et al., Proc Nutr Soc. 2005, май; 64(2):213-6.
Иммунологические расстройства.
В одном варианте реализации терапевтическая композиция настоящего изобретения обладает иммуномодулирующей активностью. Например, терапевтический полипептид настоящего изобретения может быть полезен при лечении недостатков или расстройств иммунной системы за счет активации или ингибирования пролиферации, дифференцировки или мобилизации (хемотаксиса) иммунных клеток. Иммунные клетки развиваются в процессе гепатопоэза, вырабатывая лимфоидные (тромбоциты, красные кровяные клетки, нейтрофилы и макрофаги) и лимфоидные (В- и Т-лимфоциты) клетки из полипотенциальных стволовых клеток. Этиология этих иммунодефицитных состояний или расстройств может быть генетической, соматической, такой как раковые или некоторые аутоиммунные заболевания, приобретенной (например, под действием химиотерапии или токсинов) или инфекционной.
Терапевтическая композиция настоящего изобретения может быть полезна при лечении недостатков или расстройств гематопоэтических клеток. Например, терапевтический полипептид настоящего изобретения может быть использован для увеличения дифференцировки или пролиферации гематопоэтических клеток, включая полипотенциальные стволовые клетки, в попытках лечения расстройств, связанных с снижением некоторых (или многих) типов гематопоэтических клеток. Примеры синдромов иммунологического дефицита включают, но не ограничиваясь этим, нарушения белков крови (например, агаммаглобулинемия, дисгаммаглобулинемия), атаксия-телеангиэктазия, вариабельный неклассифицируемый иммунодефицит, синдром Диджорджи, ВИЧ-инфекцию, инфекцию HTLV-BLV, синдром дефицита адгезии лейкоцитов, лимфопению, бактерицидную дисфункцию фагоцитов, тяжелый комбинированный иммунодефицит (ТКИД), расстройство Вискотта-Олдрича, анемию, тромбоцитопению или гемоглобинурию.
Терапевтическая композиция настоящего изобретения также может быть полезна при лечении аутоиммунных расстройств. Многие аутоиммунные расстройства возникают из-за неправильного распознавания иммунными клетками собственного материала как чужеродного. Такое неправильное распознавание вызывает иммунный ответ, приводящий к разрушению организма хозяина. Соответственно, введение терапевтической композиции настоящего изобретения, которая ингибирует иммунный ответ, в частности пролиферацию, дифференцировку или хемотаксис Т-клеток, может быть эффективной терапией для предупреждения аутоиммунных расстройств.
Примеры аутоиммунных расстройств, которые можно лечить с помощью настоящего изобретения, включают, но не ограничиваясь этим, болезнь Аддисона, гемолитическую анемию, антифосфолипидный синдром, ревматоидный артрит, дерматит, аллергический энцефаломиелит, гломерулонефрит, синдром Гудпасчера, болезнь Грейвса, рассеянный склероз, миастению гравис, неврит, офтальмию, буллезный пемфигоид, пемфигус, полиэндокринопатию, пурпуру, болезнь Рейтера, синдром скованного человека, аутоиммунный тиреоидит, системную красную волчанку, аутоиммунное воспаление легких, синдром Гийена-Барре, инсулинозависимый сахарный диабет, болезнь Крона, неспецифический язвенный колит и аутоиммунное воспалительное заболевание глаз.
Точно так же с помощью терапевтической композиции настоящего изобретения можно лечить аллергические реакции и состояния, такие как астма (в частности, аллергическая астма), или другие респираторные заболевания. Кроме того, эти молекулы могут быть использованы для лечения анафилаксии,
- 19 032034 гиперчувствительности к антигенным молекулам или несовместимости групп крови.
Терапевтическая композиция настоящего изобретения также может быть использована для лечения и/или предупреждения отторжения органа или болезни трансплантат против хозяина (GVHD). Отторжение органа возникает за счет разрушения иммунными клетками хозяина трансплантированной ткани из-за иммунного ответа. Точно так же иммунный ответ участвует в GVHD, но в этом случае чужеродные трансплантированные иммунные клетки разрушают ткани хозяина. Введение терапевтической композиции настоящего изобретения, которая ингибирует иммунный ответ, в частности пролиферацию, дифференцировку или хемотаксис Т-клеток, может быть эффективной терапией для предупреждения отторжения органа или GVHD.
Точно так же терапевтическая композиция настоящего изобретения может быть использована для модулирования воспаления. Например, терапевтический полипептид может ингибировать пролиферацию и дифференцировку клеток, участвующих в воспалительной реакции. Эти молекулы могут быть использованы для лечения воспалительных состояний как хронических, так и острых состояний, включая воспаление, связанное с инфекцией (например, септический шок, сепсис или синдром системной воспалительной реакции (ССВР)), ишемически-реперфузионное повреждение, летальность из-за эндотоксинов, артрит, панкреатит, сверхострый комплемент-опосредованное отторжение, нефрит, повреждение легких, вызванное цитокинами или хемокинами, воспалительная болезнь кишечника (ВБК), болезнь Крона или состояния, возникшие в результате чрезмерной выработки цитокинов (например, TNF или IL-1). В одном варианте реализации в рассматриваемых композициях для лечения воспаления используют терапевтическую РНК, направленную против TNFa. В другом предпочтительном варианте реализации в рассматриваемых композициях для лечения воспаления используют терапевтическую РНК, направленную против IL-1. Особенно предпочтительны терапевтические РНК, представляющие собой миРНК. Представляющие интерес воспалительные расстройства для лечения в соответствии с настоящим изобретением включают, но не ограничиваясь этим, хроническую обструктивную болезнь легких (ХОБЛ), интерстициальный цистит и воспалительную болезнь кишечника.
Нарушения свертываемости.
В некоторых вариантах реализации терапевтическая композиция настоящего изобретения также может быть использована для модулирования гемостатической (остановка кровотечения) или тромболитической активности (образование тромбов). Например, за счет увеличения гемостатической или тромболитической активности терапевтическая композиция настоящего изобретения может быть использована для лечения нарушений свертываемости крови (например, афибриногенемии, дефицита фактора), тромбоцитарных нарушений (например, тромбоцитопении) или ран из-за травмы, операции или других причин. Альтернативно, терапевтическая композиция настоящего изобретения, которая может снижать гемостатическую или тромболитическую активность, может быть использована для замедления образования или растворения тромба. Эти терапевтические композиции могут быть важны при лечении сердечных приступов (инфаркта), инсультов или рубцевания. В одном варианте реализации терапевтический полипептид настоящего изобретения представляет собой фактор свертываемости, пригодный для лечения гемофилии или других нарушений коагуляции/свертываемости (например, фактор VIII, IX или X).
Гиперпролиферативные расстройства.
В одном варианте реализации терапевтическая композиция настоящего изобретения может модулировать клеточную пролиферацию. Такой терапевтический полипептид может быть использован для лечения гиперпролиферативных расстройств, включая неоплазмы.
Примеры гиперпролиферативных расстройств, которые можно лечить терапевтической композицией настоящего изобретения, включают, но не ограничиваясь этим, неоплазмы, расположенные в брюшной полости, кости, молочной железе, пищеварительной системе, печени, поджелудочной железе, перитонеальной полости, эндокринных железах (надпочечной, паращитовидной, гипофизе, яичках, яичниках, тимусе, щитовидной железе), глазах, голове и шее, нервной системе (центральной и периферической), лимфатической системе, тазовой области, коже, мягкой ткани, селезенке, груди и мочеполовой системе.
Точно так же терапевтической композицией настоящего изобретения можно лечить другие гиперпролиферативные расстройства. Примеры таких гиперпролиферативных расстройств включают, но не ограничиваясь этим, гипергаммаглобулинемию, лимфопролиферативные расстройства, парапротеинемию, пурпуру, саркоидоз, синдром Сезари, макроглобулинемию Вальденстрема, болезнь Гоше, гистиоцитоз и любые другие гиперпролиферативные заболевания, помимо неоплазии, расположенной в системах органов, перечисленных выше.
Доставка в систему кровообращения обеспечивает доступ терапевтического белка к широкому ряду тканей. Альтернативно, терапевтическая композиция настоящего изобретения может стимулировать пролиферацию других клеток, которые могут подавлять гиперпролиферативное расстройство.
Например, гиперпролиферативные расстройства можно лечить за счет увеличения иммунной реакции, в частности усиления антигенных характеристик гиперпролиферативного расстройства, или за счет пролиферации, дифференцировки или мобилизации Т-клеток. Такой иммунный ответ может быть увеличен за счет усиления существующего иммунного ответа или за счет инициации нового иммунного ответа. Альтернативно, снижение иммунного ответа также может представлять собой способ лечения гипер
- 20 032034 пролиферативных расстройств, как в случае с химиотерапевтическим агентом.
Инфекционные заболевания.
В одном варианте реализации терапевтическая композиция настоящего изобретения может быть использована для лечения инфекционных заболеваний. Например, за счет увеличения иммунного ответа, в частности увеличения пролиферации и дифференцировки В- и/или Т-клеток, можно лечить инфекционные заболевания. Иммунный ответ может быть увеличен за счет усиления существующего иммунного ответа или за счет инициации нового иммунного ответа. Альтернативно, терапевтическая композиция настоящего изобретения также может непосредственно подавлять инфекционный агент, без необходимости в инициации иммунной реакции.
Вирусы представляют собой один из примеров инфекционного агента, который может вызывать заболевание или симптомы, которые можно лечить с помощью терапевтической композиции настоящего изобретения. Примеры вирусов включают, но не ограничиваясь этим, следующие ДНК и РНК вирусные семейства: арбовирус, аденовирусы, аренавирусы, артеривирус, бирнавирусы, буньявирусы, калицивирусы, цирковирусы, коронавирусы, флавивирусы, гепаднавирусы (гепатит), герпесвирусы (такие как цитомегаловирус, вирус простого герпеса, опоясывающего герпеса), мононегавирус (например, парамиксовирусы, морбилливирус, рабдовирусы), ортомиксовирусы (например, грипп), паповавирусы, пикорнавирусы, поксвирусы (например, вирус или вакцина оспы), реовирусы (например, ротавирус), ретровирусы (HTLV-I, HTLV-II, лентивирус) и тогавирусы (например, рубивирус). Вирусы, входящие в эти семейства, могут вызывать различные заболевания или симптомы, включая, но не ограничиваясь этим, артрит, бронхиолит, энцефалит, глазные инфекции (например, конъюнктивит, кератит), синдром хронической усталости, гепатит (А, В, С, Е, хронический активный, дельта), менингит, оппортунистические инфекции (например, СПИД), пневмонию, лимфому Беркитта, ветряную оспу, геморрагическую лихорадку, корь, паротит, парагрипп, гидрофобию, простуду, полиомиелит, лейкоз, коревую краснуху, заболевания, передающиеся половым путем, кожные заболевания (например, Капоши, бородавки) и виремию. Терапевтическая композиция настоящего изобретения может быть использована для лечения любого из этих симптомов или заболеваний.
Точно так же бактериальные или грибковые агенты, которые могут вызывать заболевание или симптомы, и которые можно лечить терапевтической композицией настоящего изобретения, включают, но не ограничиваясь этим, следующие грамотрицательные и грамположительные бактериальные семейства и грибки: актиномицеты (например, коринбактерии, микобактерии, нокардии), аспергиллез, бациллы (например, антракс, клостридий), бактероиды, бластомикоз, бордетелла, боррелии, бруцеллез, кандидоз, кампилобактеры, кокцидиоидомикоз, криптококкоз, дерматомикоз, энтеробактерии (клебсиелла, сальмонелла, серратия, иерсиния), эризипелотрикс, хеликобактер, легионеллез, лептоспироз, листерия, микоплазмовые, нейссерии (например, акинетобактерии, гонорея, менингококковые), пастереллезные инфекции (например, актинобациллы, гемофильные, пастереллезные), псевдомонады, риккетсии, хламидии, сифилис и стафилококк. Эти бактериальные или грибковые семейства могут вызывать следующие заболевания или симптомы, включая, но не ограничиваясь этим: бактериемию, эндокардит, глазные инфекции (конъюнктивит, туберкулез, увеит), гингивит, оппортунистические инфекции (например, инфекции, связанные со СПИДом), паронихию, инфекции, связанные с протезированием, болезнь Рейтера, инфекции дыхательных путей, такие как судорожный кашель или эмпиема, сепсис, болезнь Лайма, болезнь от кошачьих царапин, дизентерию, паратифозную лихорадку, пищевые отравления, тиф, пневмонию, гонорею, менингит, хламидию, сифилис, дифтерию, проказу, паратуберкулез, туберкулез, волчанку, ботулизм, гангрену, тетанус, импетиго, ревматическую лихорадку, скарлатину, болезни, передающиеся половым путем, кожные заболевания (например, целлюлит, дерматомикоз), токсемию, инфекции мочевыводящих путей, раневые инфекции. Терапевтическая композиция настоящего изобретения может быть использована для лечения любого из этих симптомов или заболеваний.
Кроме того, паразитарные агенты, вызывающие заболевание или симптомы, которые можно лечить с помощью терапевтической композиции настоящего изобретения, включают, но не ограничиваясь этим, следующие семейства: амебиаз, бабезиоз, кокцидиоз, криптоспоридиоз, диэнтамебиаз, дурину, эктопаразитарные заболевания, гиардиоз, гельминтоз, лейшманиоз, тейлериоз, токсоплазмоз, трипаносомоз и трихомонадные заболевания. Эти паразиты могут вызывать различные заболевания или симптомы, включая, но не ограничиваясь этим, чесотку, тромбикулез, глазные инфекции, кишечные заболевания (например, дизентерию, гиардиоз), болезни печени, болезни легких, оппортунистические инфекции (например, связанные со СПИДом), малярию, осложнения при беременности и токсоплазмоз. Терапевтическая композиция настоящего изобретения может быть использована для лечения любого из этих симптомов или заболеваний.
Регенерация.
Терапевтическая композиция настоящего изобретения может быть использована для дифференцировки, пролиферации и привлечения клеток, способствующих регенерации тканей. (См. Science 276:5987 (1997)). Регенерация тканей может быть использована для заживления, замены или защиты ткани, поврежденной врожденной патологией, травмой (раны, ожоги, порезы или язвы), возрастом, заболеванием (например, остеопорозом, остеоартритом, периодонтозом, печеночной недостаточностью), хирурги- 21 032034 ческой операцией, включая косметическую пластическую хирургию, фиброзом, реперфузионным повреждением или системным цитокиновым повреждением.
Терапевтические композиции настоящего изобретения могут ускорять регенерацию различных тканей, включая, но не ограничиваясь этим, ткани органов (например, поджелудочной железы, печени, кишечника, почек, кожи, эндотелия), мышечную (гладкую, скелетную или сердечную), сосудистую (включая сосудистый эндотелий), нервную, гематопоэтическую и скелетную (кости, хрящи, сухожилия и связки) ткань. Предпочтительно регенерация влечет за собой небольшое рубцевание или происходит без рубцевания. Регенерация также может включать ангиогенез.
Кроме того, терапевтическая композиция настоящего изобретения может улучшать регенерацию труднозаживляемых тканей. Например, улучшенная регенерация сухожилий/связок ускорит выздоровление после травмы. Терапевтическая композиция настоящего изобретения также может быть использована профилактически, чтобы попытаться предотвратить травму. Конкретные заболевания, которые можно лечить, включают тендинит, туннельный синдром запястья и другие нарушения сухожилий или связок. Дополнительный пример регенерации тканей в незаживающих ранах включает пролежневые язвы, язвы, связанные с сосудистой недостаточностью, хирургические и травматические раны.
Точно так же, используя терапевтическую композицию настоящего изобретения для пролиферации и дифференцировки нервных клеток, можно регенерировать также нервную ткань и ткань головного мозга. Заболевания, которые можно лечить с помощью этого способа, включают заболевания центральной и периферической нервной системы, невропатию или механические и травматические нарушения (например, нарушения спинного мозга, травмы головы, нарушения мозгового кровообращения и инсульт). В частности, с помощью терапевтических композиций настоящего изобретения можно лечить все заболевания, связанные с периферическими нервными повреждениями, периферическую невропатию (например, в результате химиотерапии или другой лекарственной терапии), локализованную невропатию и заболевания центральной нервной системы (например, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона, амиотрофический латеральный склероз и синдром Шая-Дрейджера). В отношении расстройств ЦНС в данной области техники известны многочисленные способы облегчения терапевтического доступа к ткани головного мозга, включая способы разрушения гематоэнцефалического барьера и способы связывания терапевтических агентов с фрагментами, обеспечивающими доставку в ЦНС. В одном варианте реализации терапевтическая нуклеиновая кислота разработана так, что она кодирует гибридный белок, который содержит транспортный фрагмент и терапевтический белок. Альтернативно, рассматриваемые композиции могут быть доставлены непосредственно в ЦНС.
Хемотаксис.
В одном варианте реализации терапевтическая композиция настоящего изобретения может модулировать хемотаксис. Например, в одном варианте реализации терапевтический полипептид настоящего изобретения обладает хемотаксической активностью. Хемотаксическая молекула привлекает или мобилизует клетки (например, моноциты, фибробласты, нейтрофилы, Т-клетки, мастоциты, эозинофилы, эпителиальные и/или эндотелиальные клетки) к конкретному очагу в организме, такому как очаг воспаления, инфекции или гиперпролиферации. Затем мобилизованные клетки могут побороть и/или излечить конкретную травму или патологию.
Например, терапевтический полипептид настоящего изобретения может увеличивать хемотаксическую активность определенных клеток. Эти хемотаксические молекулы затем могут быть использованы для лечения воспалительных, инфекционных, гиперпролиферативных расстройств или любого расстройства иммунной системы за счет увеличения количества клеток, направленных в определенное место организма. Например, хемотаксические молекулы могут быть использованы для лечения ран и других повреждений ткани за счет привлечения иммунных клеток к поврежденному месту. Хемотаксические молекулы настоящего изобретения также могут привлекать фибробласты, которые могут быть использованы для лечения ран.
Предусматривается также, что терапевтическая композиция настоящего изобретения может ингибировать хемотаксическую активность. Эти терапевтические композиции также могут быть использованы для лечения расстройств. Следовательно, терапевтическая композиция настоящего изобретения может быть использована как ингибитор хемотаксиса.
Особенно предпочтительны для применения протерапевтические белки, которые активируются вблизи тканей-мишеней.
Дополнительные терапевтические полипептиды, предполагаемые для применения, включают, но не ограничиваясь этим, факторы роста (например, гормон роста, инсулиноподобный фактор роста 1, фактор роста из тромбоцитов, эпидермальный фактор роста, кислотный и основной фибробластные факторы роста, трансформирующий фактор роста β и так далее) для лечения нарушений роста или синдромов атрофии; и антитела (например, человеческие или гуманизированные) для обеспечения пассивной иммунизации или защиты субъекта от чужеродных антигенов или патогенов (например, Хеликобактер пилори), или для обеспечения лечения рака, артрита или сердечно-сосудистого заболевания; цитокины, интерфероны (например, интерферон (IFN), IFN-a2b и 2α, IFN-α N1, IFN-β 1b, IFN-γ), интерлейкины (например, с
- 22 032034
IL-1 по IL-10), фактор некроза опухоли (TNF-α, TNF-β), хемокины, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), полипептидные гормоны, антимикробные полипептиды (например, антибактериальные, противогрибковые, противовирусные и/или антипаразитарные полипептиды), ферменты (например, аденозиндезаминаза), гонадотропины, хемотактины, липид-связывающие белки, филгастим (Neupogen), гемоглобин, эритропоэтин, инсулинотропин, имиглюцеразу, сарбрамостим, тканевой активатор плазминогена (tPA), урокиназу, стрептокиназу, фенилаланин-аммиаклиазу, нейротрофический фактор головного мозга (BDNF), фактор роста нервов (NGF), тромбопоэтин (ТРО), супероксид-дисмутазу (SOD), аденозиндезаминазу, каталазу, кальцитонин, эндотелии, пепсин L-аспарагиназы, уриказу, трипсин, химотрипсин-эластазу, карбоксипептидазу, лактазу, сахаразу, внутренний фактор, кальцитонин, гормон, подобный гормону паращитовидной железы (РТН), растворимый CD4 и антитела, и/или их антигенсвязывающие фрагменты (например, FAb) (например, ортоклон ОКТ-е (анти-CD3), моноклональное антитело GPIIb/IIa). Дополнительно предусмотрены терапевтические РНК, направленные на нуклеиновые кислоты, кодирующие такие факторы.
Вакцины.
В одном варианте реализации настоящего изобретения представлены способы вакцинации пациента. Указанные способы включают введение композиции настоящего изобретения, способной вырабатывать заданный эпитоп. В предпочтительном варианте реализации указанная композиция содержит терапевтический конструкт нуклеиновой кислоты, способный экспрессировать белок, содержащий указанный эпитоп.
Косметическое применение.
В одном варианте реализации настоящего изобретения представлены полиплексы ДД-хитозана и нуклеиновой кислоты для косметического применения. Рассматриваемые косметические средства содержат полиплексы ДД-хитозана и нуклеиновой кислоты в препарате, пригодном для косметического применения.
Примеры
Образование двукратно дериватизованного хитозана и образование ДНК полиплексов.
Хитозан двукратно дериватизовали аргинином и глюконовой кислотой (ДД-хитозан) в соответствии с общеизвестными способами. Полиплексы ДД-хитозана получили с вектором ДНК, кодирующим для секретируемой щелочной фосфатазы (SEAP) или миРНК люциферазы.
In vitro трансфекция полиплексом ДНК.
В общих чертах, in vivo трансфекцию клеток 293Т композициями полиплекса ДД-хитозана и нуклеиновой кислоты выполнили в две стадии: приготовление клеток с последующей трансфекцией.
Поддерживание клеточных линий.
Клеточная линия 293Т была любезно предоставлена лабораторией д-ра Киффера (Dr. Kieffer) Университета Британской Колумбии и была подготовлена следующим образом.
Человеческие клетки почек трансформировали с помощью SV40 Т-антигена; выращивали в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (DMEM) с высоким содержанием глюкозы, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и пенициллин/стрептомицин; и поддерживали при слиянии менее 80%. НТ1080 (эпителиальные клетки из человеческой соединительной ткани) и HeLa (человеческие цервикальные эпителиальные клетки) выращивали в MEM (минимальной эссенциальной среде), содержащей 10% FBS и пенициллин/стрептомицин; и выдерживали при слиянии менее 90%. VERO (эпителиальные клетки почек обезьян) выращивали в DMEM, содержащей 10% инактивированной нагреванием FBS (56°C в течение 30 мин), 1 мМ пирувата натрия и 500 мкг/мл гентамицина; и поддерживали при слиянии менее 90%. NIH3T3 (эмбриональные фибробласты мышей) выращивали в DMEM, содержащей 10% FBS и пенициллин/стрептомицин; и поддерживали при слиянии менее 90%.
Подготовка клеток для трансфекции.
Клетки приготовили для трансфекции следующим образом.
За один день до трансфекции клетки 293Т добавили в 6-луночные тканевые культуральные планшеты (4,5х 105 клеток/лунка) в 3 мл полной среды (DMEM с высоким содержанием глюкозы + 10% FBS + пенициллин/стрептомицин). В день трансфекции определили количество клеток для двух выбранных лунок путем промывания клеток 1X фосфатно-солевым буферным раствором (PBS), трипсинизации клеток с помощью 0,5 мл 0,05% трипсина, добавления 0,5 мл полной среды и подсчета 10 мкл с помощью гемоцитометра. Если слияние клеток составило ~50% (~7х105 клеток/лунка), то приступили к трансфекции (если клетки были слишком рассеянными или слишком конфлюентыми, то трансфекцию не выполняли). Точно так же за один день до трансфекции клетки HeLa поместили на планшет в количестве 1х 105 клеток/лунка, тогда как клетки НТ1080, NIH3T3 и VERO поместили на планшет в количестве 2х105 клеток/лунка в 3 мл их соответствующей полной среды, а на следующий день выполнили трансфекцию при слиянии ~50%.
Трансфекция клеток.
Трансфекцию выполнили следующим образом.
Сначала из каждой лунки удалили среду, затем в каждую лунку при осторожном поворачивании
- 23 032034 добавили 1 мл Opti-mem (pH 7,4), которую затем удалили (одновременно промывали шесть лунок для предотвращения смещения клеток). Затем в каждую лунку осторожно добавили еще 1 мл Opti-mem (pH 7,4), чтобы не сдвинуть клетки. Затем в каждую клетку добавили образцы полиплекса (целевое значение 2 мкм ДНК), вращали и инкубировали при 37°C в течение 2 ч. После выращивания среду удалили и заменили на 2 мл полной среды и предварительно инкубировали при 37°C. В заданные временные точки удалили надосадочную жидкость и хранили при -20°C для последующего анализа SEAP.
Анализ белка SEAP.
Анализ SEAP выполнили с использованием хемилюминесцентного аналитического набора SEAP. Все реагенты для анализа уравновешивали при 25°C в течение 30 мин перед использованием. Стандарты для анализа приготовили растворением плацентарной щелочной фосфатазы до 1 мг/мл в 1X разбавляющем буфере из указанного набора, закрепленном 0,1% бычьего сывороточного альбумина и 50% глицерина, а затем разбавлением 10-кратными серийными разбавлениями в DMEM до 0,01 пг/мл. Стандарты и оттаянные образцы затем разбавили 1 к 4 в разбавляющем буфере, инактивировали нагреванием при 65°C в течение 30 мин, инкубировали на льду в течение 2 мин, центрифугировали (16100 x rcf в течение 2 мин при комнатной температуре), а надосадочные жидкости перенесли в новые пробирки. После уравновешивания при 25°C в течение 5 мин 50 мкл образцов и стандартов добавили в каждую лунку планшета Microlite-1 в двух экземплярах. Затем в каждую лунку добавили инактивирующий буфер (50 мкл) и осторожно пипетировали вверх и вниз для перемешивания, не создавая пузырьков, и инкубировали в течение 5 мин. Во время 5-минутного инкубирования приготовили реагент субстрата/энхансера с соотношением субстрата к энхансеру 1:19. Затем субстрат/энхансер добавили к каждой лунке, инкубировали в течение 20 мин, а затем считывали планшет в люминометре (Lmax11384, Molecular Devices) с временем интегрирования 1 с.
Анализ мРНК SEAP - количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени (К-ПЦРРВ).
Относительную количественную экспрессию мРНК SEAP в различных образцах определили с помощью К-ПЦР-РВ. Вкратце, общую мРНК экстрагировали и очистили с помощью реагента TRIzol и выполнили К-ПЦР-РВ с помощью Superscript II. Генные праймеры SEAP и флуоригенный зонд были разработаны с использованием Primer Express (версия 1.5) (Applied Biosystems, Фостер Сити, штат Калифорния). Систему обнаружения последовательностей ABI 7000 (Applied Biosystems) использовали для выполнения всех полимеразных цепных реакций (ПЦР) в общем объеме 25 мкл. Каждая реакционная смесь содержала 1х универсального мастер-микса TaqMan, 20 мкМ каждого праймера и 10 мкМ зонда. В каждой ПЦР реакции использовали 10 мкл каждой комплементарной ДНК (эквивалент 4,5-45 нг обратно транскрибированной общей РНК). Процесс ПЦР состоял из первоначальной инкубации при 50°C в течение 2 мин, с последующей 10-минутной инкубацией при 95°C, 40 циклов ПЦР при 95°C в течение 15 с и 1 мин при 60°C. Каждый 96-луночный планшет содержал контрольные образцы без обратной транскриптазы и без комплементарной ДНК. Результаты нормализовали к конститутивному гену GAPDH (эталонный ген) и выразили как отношение относительной экспрессии гена-мишени между обработанной тканью и не обработанной контрольной тканью. Этот способ упоминается как способ Пфаффла (Pfaffl MW. Nucleic Acids Res (2001) 29:e45) миРНК нокдаун-трансфекция клеток.
Нокдаун генной экспрессии выполнили первоначальной трансфекции клеток-хозяев миРНК/модифицированными ДД-хитозановыми полиплексами, с последующей трансфекцией тех же клеток-хозяев ДНК/липофектамином 2000.
За один день до трансфекции на планшет поместили 9х104 293Т клеток/лунка в 24-луночном планшете в 1 мл полной среды. В день трансфекции клетки (слияние 50%) промыли Opti-mem до трансфекции. Клетки промыли удалением среды из лунки, повторным добавлением 0,25 мл Opti mem при поворачивании на месте, затем удалением Opti mem и заменой на 0,25 мл свежей Opti mem. миРНК трансфекцию выполнили добавлением 200 нМ миРНК/модифицированного хитозанового полиплекса в каждую лунку и инкубацией при 37°C в инкубаторе с 5% CO2. Через 2 ч Opti-mem удалили и заменили на 0,5 мл полной среды. ДНК трансфекцию выполнили добавлением 0,4 мкг содержащих люциферазу частиц липофектамина в каждую лунку, и инкубировали при 37°C в инкубаторе с 5% CO2. Через 2 ч среду удалили и заменили на 0,5 мл свежей полной среды, а затем клетки вернули в инкубатор. Через 48 ч после трансфекции с миРНК собрали клеточный лизат для люциферазного анализа. Для сбора клетки промыли фосфатно-солевым буферным раствором Дульбекко и закрепили с помощью 500 мкл лизисного буфера Glo, который содержал не содержащие ЭДТА ингибиторы протеазы, собрали в пробирки через 5 мин инкубации и сразу анализировали или хранили при -80°C.
Люциферазный анализ.
Люциферазный анализ выполнили с помощью люциферазной аналитической системы Bright-Glo. Лизисный буфер Glo, буфер Bright-Glo и образцы для анализа уравновесили до комнатной температуры перед использованием. Стандарты для анализа приготовили разбавлением рекомбинантного люциферазного фермента QuantiLum в 1X лизисном буфере Glo, который содержал не содержащий ЭДТА ингибитор протеазы и 1 мг/мл BSA, до 90 нг/мл, затем до 30 нг/мл, а затем разбавили 10-кратными серийными
- 24 032034 разбавлениями до 0,003 нг/мл. Субстрат Bright-Glo разбавили буфером Bright-Glo с получением аналитического реагента Bright-Glo по меньшей мере за 10 мин до использования. 100 мкл образцов и стандартов добавили в каждую лунку планшета Microlite-1 в двух экземплярах. Затем в каждую лунку добавили аналитический реагент Bright-Glo (100 мкл) и инкубировали в течение 2 мин в люминометре, и считывали со временем интегрирования 1 с.
Животные.
Хирургические протоколы для исследований на животных были одобрены комитетом по содержанию животных Университета Британской Колумбии. Работы с животными проводил квалифицированный и опытный персонал, самок мышей C57BL/6 возрастом ~8 недель приобрели в лаборатории Jackson Laboratory (Бар-Харбор, штат Мэн).
Мышей разместили по 2-4 животных на клетку с циклом освещения/темноты по 12 ч и оставили на одну неделю для акклиматизации, обеспечивая их стандартным рационом для грызунов (Research Diets Inc., Нью-Брансуик, штат Нью-Джерси) и водой ad libitum. Мышей содержали в виварии кафедры физиологии Университета Британской Колумбии (UBC).
Трансфекция мышей через толстую кишку.
Не обработанных мышей C57BL/6 анестезировали (ингаляция 1,5-2,0% изофлурана, Baxter CA2L9108) и ввели однократную клизму для доставки полиплекса функционализированного ДДхитозана-ДНК или полиплекса не функционализированного хитозана-ДНК, содержащего плазмиды gWiz-SEAP в концентрации 0,25 мг/мл. Через 2 дня мышей умертвили и собрали ткани.
In vivo трансфекция мышей: доставка полиплекса в мышцу.
Для доставки маркера в мышцу мыши, полиплекс ДД-хитозана-ДНК, содержащий вектор экспрессии SEAP, ввели инъекцией в середину задней поверхности бедра. Мышей анестезировали и через шприц ввели инъекцию 50 мкл полиплекса. В различные временные точки мышей умертвили и собрали их мышечные ткани, и анализировали на мРНК экспрессию SEAP. ДНК вводили инъекцией отдельно, в качестве контроля.
Лиофилизация и разбавление полиплексов ДД-хитозана и нуклеиновой кислоты водой.
Полиплексы ДД-хитозана и нуклеиновой кислоты, замороженные при -80°C (280 мкл каждого), поместили в предварительно охлажденный сосуд. Затем сосуд соединили с лиофилизатором (SAVANTModulyo D). Полиплексы высушили замораживанием при постоянном давлении 5 торр при температуре <-40°C в течение более 28 ч. После лиофилизации полиплексы ДД-хитозана и нуклеиновой кислоты разбавили водой до первоначальной концентрации для выполнения последующих экспериментов.
Результаты.
Фиг. 2-4 и 7 иллюстрируют эффективность трансфекции хитозана, дериватизованного только глюконовой кислотой (фиг. 2А), только аргинином (фиг. 2В) или хитозана, двукратно дериватизованного глюконовой кислотой и аргинином, по сравнению с хитозаном, дериватизованным только аргинином или глюконовой кислотой (фиг. 3 и 7). Фиг. 3 и 7 иллюстрируют синергетический эффект при двукратной дериватизации хитозана аргинином и глюконовой кислотой. Синергетический эффект можно наблюдать при двукратной функционализации хитозана аргинином при конечной степени функционализации 26% и глюконовой кислотой при конечной степени функционализации в диапазоне от 3 до 9%, хотя наивысший эффект виден при конечной степени функционализации глюконовой кислотой около 5% (фиг. 4; см. также фиг. 7, иллюстрирующую синергетический эффект с хитозаном, двукратно функционализованным аргинином и глюконовой кислотой при конечной степени функционализации 26 и 6% соответственно). Фиг. 5 и 6 иллюстрируют влияние соотношения N/P и pH композиции полиплекса, соответственно, на эффективность трансфекции. Эффективности трансфекции хитозана, дериватизованного (1) только аргинином или (2) аргинином и глюконовой кислотой, прямо коррелировали с соотношением N/P, хотя двукратно дериватизованный хитозан имел более высокую эффективность трансфекции, чем хитозан, дериватизованный только аргинином, при всех испытанных соотношениях N/P (фиг. 5). Напротив, pH не оказал влияния на эффективность трансфекции (фиг. 6). Синергетический эффект можно видеть также в различных клеточных линиях ex vivo (фиг. 8), для миРНК (фиг. 11) и in vivo (фиг. 9-10). Внутримышечная доставка полиплекса ДД-хитозана-ДНК привела к существенно повышенной экспрессии мРНК SEAP в мышечных клетках in vivo (фиг. 9). Кроме того, показано относительное увеличение мРНК SEAP в ткани прямой кишки обработанных мышей по сравнению с не обработанными мышами (не трансфицированными) (фиг. 10). Замороженные и лиофилизированные полиплексы ДД-хитозана и нуклеиновой кислоты продемонстрировали стабильность физико-химических свойств после хранения при комнатной температуре в течение 3 месяцев. Эти полиплексы сохранили также стабильность после инкубации в течение ночи с последующим разбавлением водой (фиг. 12).
Все цитаты в явной форме включены в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме.
Все патенты и патентные публикации, упомянутые в настоящем документе, включены в настоящий документ посредством ссылки.
Некоторые модификации и улучшения станут понятными специалистам в данной области техники при прочтении изложенного выше описания. Следует понимать, что все такие модификации и улучшения удалены из настоящего описания для краткости и удобства чтения, но они в достаточной мере входят
- 25 032034 в рамки следующей формулы изобретения.

Claims (33)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Наночастица производного хитозана для доставки нуклеиновых кислот в клетку, содержащая хитозан, связанный с глюконовой кислотой и аргинином.
  2. 2. Наночастица по п.1, отличающаяся тем, что указанный хитозан содержит глюконовую кислоту в первоначальной концентрации от около 5 до около 60%.
  3. 3. Наночастица по п.2, отличающаяся тем, что указанный хитозан содержит глюконовую кислоту в первоначальной концентрации от около 8 до около 30%.
  4. 4. Наночастица по п.3, отличающаяся тем, что указанный хитозан содержит глюконовую кислоту в конечной степени фукционализации от около 3 до около 10%.
  5. 5. Наночастица по п.4, отличающаяся тем, что указанный хитозан содержит глюконовую кислоту в конечной степени функционализации около 5%.
  6. 6. Наночастица по любому из пп.1-5, отличающаяся тем, что указанный хитозан содержит аргинин в концентрации от около 10 до около 55%.
  7. 7. Композиция для доставки нуклеиновых кислот в клетку, содержащая наночастицу по любому из пп.1-6, в которой указанный хитозан связан в комплекс с нуклеиновой кислотой с образованием полиплекса двукратно дериватизованного (ДД) хитозана и нуклеиновой кислоты.
  8. 8. Композиция по п.7, отличающаяся тем, что указанная нуклеиновая кислота представляет собой ДНК или РНК.
  9. 9. Композиция по любому из пп.7, 8, отличающаяся тем, что отношение амина к фосфату в указанном полиплексе ДД-хитозана и нуклеиновой кислоты составляет от 2 до 100.
  10. 10. Композиция по любому из пп.7-9, отличающаяся тем, что отношение амина к фосфату в указанном полиплексе ДД-хитозана и нуклеиновой кислоты составляет от 2 до 50.
  11. 11. Композиция по любому из пп.7-10, отличающаяся тем, что отношение амина к фосфату в указанном полиплексе ДД-хитозана и нуклеиновой кислоты составляет от 2 до 30.
  12. 12. Композиция по любому из пп.7-11, отличающаяся тем, что отношение амина к фосфату в указанном полиплексе ДД-хитозана и нуклеиновой кислоты составляет от 2 до 15.
  13. 13. Способ доставки молекулы нуклеиновой кислоты в клетку, включающий контакт указанной клетки с полиплексом ДД-хитозана и нуклеиновой кислоты по любому из пп.7-12.
  14. 14. Способ по п.13, отличающийся тем, что указанная клетка находится in vivo.
  15. 15. Композиция по любому из пп.7-12, отличающаяся тем, что указанный полиплекс ДД-хитозана и нуклеиновой кислоты имеет комбинированную степень функционализации указанным аргинином и указанной глюконовой кислотой, составляющую 1-60%.
  16. 16. Композиция по любому из пп.7-12, отличающаяся тем, что указанный полиплекс ДД-хитозана и нуклеиновой кислоты имеет комбинированную степень функционализации указанным аргинином и указанной глюконовой кислотой, составляющую 1-30%.
  17. 17. Композиция по п.7, отличающаяся тем, что нуклеиновая кислота выбрана из группы, состоящей из запертой нуклеиновой кислоты (ЗНК), гликолевой нуклеиновой кислоты (ГНК) и треозо-нуклеиновой кислоты (ТНК).
  18. 18. Композиция по п.8, отличающаяся тем, что указанная РНК выбрана из группы, состоящей из антисмысловой РНК, миРНК, короткой шпилечной РНК, микроРНК и ферментной РНК.
  19. 19. Композиция по любому из пп.7-12 или 15-18, отличающаяся тем, что указанный полиплекс ДДхитозана и нуклеиновой кислоты содержит молекулу хитозана, имеющую среднюю молекулярную массу менее 110 кДа до функционализации указанной глюконовой кислотой и указанным аргинином.
  20. 20. Композиция по любому из пп.7-12 или 15-19, отличающаяся тем, что указанный полиплекс ДДхитозана и нуклеиновой кислоты имеет средний коэффициент полидисперсности (PDI), выбранный из группы, включающей менее 0,5, менее 0,4, менее 0,3 и менее 0,25.
  21. 21. Композиция по любому из пп.7-12 или 15-20, отличающаяся тем, что указанный полиплекс ДДхитозана и нуклеиновой кислоты имеет молярное отношение аргинина к глюконовой кислоте от 100:1 до 1:100.
  22. 22. Композиция по любому из пп.7-12 или 15-20, отличающаяся тем, что указанный полиплекс ДДхитозана и нуклеиновой кислоты имеет молярное отношение аргинина к глюконовой кислоте от 50:1 до 1:50.
  23. 23. Композиция по любому из пп.7-12 или 15-20, отличающаяся тем, что указанный полиплекс ДДхитозана и нуклеиновой кислоты имеет молярное отношение аргинина к глюконовой кислоте от 10:1 до 1:10.
  24. 24. Композиция по любому из пп.7-12 или 15-20, отличающаяся тем, что указанный полиплекс ДДхитозана и нуклеиновой кислоты имеет молярное отношение аргинина к глюконовой кислоте от 5:1 до 1:5.
  25. 25. Композиция по любому из пп.7-12 или 15-20, отличающаяся тем, что указанный полиплекс ДД-
    - 26 032034 хитозана и нуклеиновой кислоты имеет молярное отношение аргинина к глюконовой кислоте от 2:1 до
    1:2.
  26. 26. Фармацевтическая композиция, содержащая наночастицу производного хитозана по любому из пп.1-6, для лечения диабета, где наночастица связана в комплекс с нуклеиновой кислотой, кодирующей инсулин, антагонист глюкагона, GLP-1 или лептин, с образованием полиплекса двукратно дериватизованного (ДД) хитозана и нуклеиновой кислоты.
  27. 27. Фармацевтическая композиция, содержащая наночастицу производного хитозана по любому из пп.1-6, для лечения воспалительной болезни кишечника, где наночастица связана в комплекс с нуклеиновой кислотой, кодирующей IL-10, антагонист TNFa или антагонист IL-17, с образованием полиплекса двукратно дериватизованного (ДД) хитозана и нуклеиновой кислоты.
  28. 28. Фармацевтическая композиция, содержащая наночастицу производного хитозана по любому из пп.1-6, для лечения ожирения, где наночастица связана в комплекс с нуклеиновой кислотой, кодирующей лептин, холецистокинина, PYY или GLP-1, с образованием полиплекса двукратно дериватизованного (ДД) хитозана и нуклеиновой кислоты.
  29. 29. Композиция по любому из пп.7-12 или 15-28, в которой указанная нуклеиновая кислота кодирует терапевтический белок, выбранный из группы, состоящей из инсулина, лептина, антагониста глюкагона, GLP-1, GLP-2, грелина, холецистокинина, гормона роста, факторов свертываемости, PYY, эритропоэтина, ингибиторов воспаления, IL-10, антагонистов IL-17, антагонистов TNFa, гормона, высвобождающего гормон роста, или гормона паращитовидной железы.
  30. 30. Композиция по п.29, в которой указанная нуклеиновая кислота кодирует инсулин, антагонист глюкагона, GLP-1 или лептин.
  31. 31. Композиция по п.29, в которой указанная нуклеиновая кислота кодирует IL-10, антагонист TNFa или антагонист IL-17.
  32. 32. Композиция по п.29, где указанная нуклеиновая кислота кодирует лептин, холецистокинин, PYY или GLP-1.
  33. 33. Композиция по п.31, где указанная нуклеиновая кислота кодирует IL-10.
EA201401041A 2012-03-21 2013-03-15 Наночастицы двукратно дериватизованного хитозана и способы их получения и применения для переноса генов in vivo EA032034B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261613885P 2012-03-21 2012-03-21
PCT/CA2013/050218 WO2013138930A1 (en) 2012-03-21 2013-03-15 Dually derivatized chitosan nanoparticles and methods of making and using the same for gene transfer in vivo

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201401041A1 EA201401041A1 (ru) 2015-03-31
EA032034B1 true EA032034B1 (ru) 2019-03-29

Family

ID=49221759

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201401041A EA032034B1 (ru) 2012-03-21 2013-03-15 Наночастицы двукратно дериватизованного хитозана и способы их получения и применения для переноса генов in vivo

Country Status (20)

Country Link
US (4) US9623112B2 (ru)
EP (1) EP2828332B1 (ru)
JP (1) JP6247276B2 (ru)
KR (2) KR102064142B1 (ru)
CN (1) CN104395391B (ru)
AU (1) AU2013234795B2 (ru)
BR (1) BR112014023405B1 (ru)
CA (1) CA2867888C (ru)
DK (1) DK2828332T3 (ru)
EA (1) EA032034B1 (ru)
ES (1) ES2635990T3 (ru)
HK (1) HK1206378A1 (ru)
IL (1) IL234682A (ru)
MX (1) MX353705B (ru)
PL (1) PL2828332T3 (ru)
PT (1) PT2828332T (ru)
SG (1) SG11201405902PA (ru)
SI (1) SI2828332T1 (ru)
WO (1) WO2013138930A1 (ru)
ZA (1) ZA201407600B (ru)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT2828332T (pt) 2012-03-21 2017-08-10 Engene Inc Nanopartículas de quitosano duplamente derivado e métodos para produzir e utilizar as mesmas para transferência de gene in vivo
US20160130606A1 (en) * 2013-06-10 2016-05-12 Polyvalor, Société En Commandite Freeze-dried polyelectrolyte complexes that maintain size and biological activity
PL3049473T3 (pl) 2013-09-25 2022-02-07 Engene, Inc. Podwójnie derywatyzowane nanocząstki chitozanu i sposoby ich wytwarzania i stosowania do transferu genów in vivo
US10786527B2 (en) * 2015-03-19 2020-09-29 University Of Massachusetts Nanoparticle-stabilized nanocapsules and methods of preparation and use for nucleic acid delivery
AU2016346703B2 (en) 2015-10-30 2020-07-02 Hirofumi Takeuchi Composition stably containing single-stranded nucleic acid molecule that suppresses expression of TGF-β1 gene
KR101741977B1 (ko) 2016-04-26 2017-05-31 한국교통대학교산학협력단 경구 투여용 유전자 전달을 위한 나노입자 및 이를 포함하는 약학 조성물
AU2017356350B2 (en) * 2016-11-09 2024-02-29 Engene, Inc. Intestinal expression of programmed death ligand 1
US20200069594A1 (en) * 2016-12-09 2020-03-05 Board Of Regents, The University Of Texas System Hybrid exosomal-polymeric (hexpo) nano-platform for delivery of rnai therapeutics
CN111343970A (zh) 2017-09-13 2020-06-26 北卡罗莱纳州立大学 微针贴片局部诱导脂肪组织褐变治疗肥胖症
WO2019152889A1 (en) * 2018-02-02 2019-08-08 John Mansell Compositions and methods for treatment of obesity and obesity-related disorders
EP3543325A1 (en) * 2018-03-19 2019-09-25 Green Impact Holding AG Organic disinfecting agent
CN108773831B (zh) * 2018-06-11 2019-07-02 南京师范大学 L-精氨酸纳米粒子和一氧化氮为动力源的可降解型纳米马达及其制备方法
WO2020013265A1 (ja) * 2018-07-11 2020-01-16 学校法人常翔学園 高分子化合物及びそれを用いた細胞内化合物導入促進剤
WO2020102166A1 (en) * 2018-11-12 2020-05-22 Massachusetts Institute Of Technology Organelle-selective gene delivery and expression in the chloroplast in planta using chitosan-complexed single-walled carbon nanotube carriers
CN109358191B (zh) * 2018-12-07 2021-07-09 上海荣盛生物药业有限公司 用于免疫试剂的组合物及其制备方法
AU2020234067A1 (en) * 2019-03-14 2021-10-07 Engene, Inc. Reversible coating of chitosan-nucleic acid nanoparticles and methods of their use
GB202116867D0 (en) * 2021-11-23 2022-01-05 Highersteaks Ltd Methods and compositions for protein expression and cell differentiation

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008082282A1 (en) * 2007-01-05 2008-07-10 Biopolymed Inc. A chitosan based polymer conjugate and a method for producing the same

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1226054C (zh) * 2003-09-02 2005-11-09 天津大学 壳聚糖－精氨酸缀合物抗凝血材料的制备方法
US8119780B2 (en) 2006-06-02 2012-02-21 Synedgen, Inc. Chitosan-derivative compounds and methods of controlling microbial populations
KR101761289B1 (ko) * 2007-09-28 2017-08-04 엔진 인코포레이티드 고농도 키토산-핵산 폴리플렉스 조성물
CN101195031B (zh) * 2007-12-20 2011-04-20 上海交通大学 葡萄糖酸改性壳聚糖亲核no供体及其合成方法
WO2010088565A1 (en) 2009-01-29 2010-08-05 Synedgen, Inc. Nucleic acid delivery using modified chitosans
CN101759812A (zh) * 2009-12-28 2010-06-30 中国药科大学 一种新型仿穿膜肽结构的壳聚糖衍生物
JP5907489B2 (ja) 2011-02-04 2016-04-26 国立大学法人 鹿児島大学 キトサン誘導体から得られるヒドロゲル
PT2828332T (pt) 2012-03-21 2017-08-10 Engene Inc Nanopartículas de quitosano duplamente derivado e métodos para produzir e utilizar as mesmas para transferência de gene in vivo

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008082282A1 (en) * 2007-01-05 2008-07-10 Biopolymed Inc. A chitosan based polymer conjugate and a method for producing the same

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GAO, Y. et al., "Arginine-chitosan/DNA self assembly nanoparticle for gene delivery: In vitro characteristics and transfection efficiency". International Journal of Pharmaceutics, vol. 359, 2008, pages 241-246. Published online 1 April 2008 *
MAO, S. et al., "Chitosan-based formulations for delivery of DNA and siRNA". Advanced Drug Delivery Reviews, vol. 62, 2010, pages 12-27. Published online 29 September 2009 *
PARK, J.H. et al., "Synthesis and characterization of sugar bearing chitosan derivatives: aqueous solubility and biodegradability". Biomacromolecules, vol. 4, 2003, pages 1087-1091. Published online 18.06.2003 *
ZHU, D. et al., "Enhancement of transfection effeciency for HeLa cells via incorporating arginine moiety into chitosan". Chinese Science Bulletin, Vol. 52, no. 23, December 2007, pages 3207-3215 *

Also Published As

Publication number Publication date
ZA201407600B (en) 2017-04-26
US20230414769A1 (en) 2023-12-28
KR102223224B1 (ko) 2021-03-08
BR112014023405A2 (pt) 2017-06-20
EA201401041A1 (ru) 2015-03-31
AU2013234795B2 (en) 2016-12-22
CN104395391B (zh) 2017-09-01
JP6247276B2 (ja) 2017-12-13
WO2013138930A1 (en) 2013-09-26
SI2828332T1 (sl) 2017-09-29
US10456478B2 (en) 2019-10-29
EP2828332A4 (en) 2015-12-09
US11623011B2 (en) 2023-04-11
PL2828332T3 (pl) 2017-10-31
AU2013234795A1 (en) 2014-11-06
IL234682A (en) 2017-06-29
KR102064142B1 (ko) 2020-01-09
EP2828332B1 (en) 2017-05-10
CA2867888A1 (en) 2013-09-26
KR20150021022A (ko) 2015-02-27
PT2828332T (pt) 2017-08-10
CN104395391A (zh) 2015-03-04
HK1206378A1 (en) 2016-01-08
JP2015512372A (ja) 2015-04-27
CA2867888C (en) 2021-06-01
MX353705B (es) 2018-01-24
EP2828332A1 (en) 2015-01-28
ES2635990T3 (es) 2017-10-05
SG11201405902PA (en) 2014-10-30
US20180008720A1 (en) 2018-01-11
US20150051265A1 (en) 2015-02-19
US20200054759A1 (en) 2020-02-20
US9623112B2 (en) 2017-04-18
KR20200004468A (ko) 2020-01-13
DK2828332T3 (en) 2017-08-28
MX2014011216A (es) 2015-03-10
BR112014023405B1 (pt) 2021-08-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11623011B2 (en) Dually derivatized chitosan nanoparticles and methods of making and using the same for gene transfer in vivo
JP7244582B2 (ja) 二重誘導体化キトサンナノ粒子、並びに生体内での遺伝子導入のためのその製造、及び使用方法
JP2022524859A (ja) キトサン－核酸ナノ粒子の可逆的コーティング及びその使用方法