JP2022524859A - キトサン－核酸ナノ粒子の可逆的コーティング及びその使用方法 - Google Patents

キトサン－核酸ナノ粒子の可逆的コーティング及びその使用方法 Download PDF

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Abstract

可逆的に結合しているポリマーコートを含有するポリプレックス組成物が本明細書に記載されている。いくつかの場合では、組成物は、コーティングされていない粒子と比較して、驚くほど改善された安定性及び／または粘膜拡散を示す。いくつかの場合では、可逆的に結合したポリマーコートは、コーティングされていない粒子と比較して、標的細胞または組織のトランスフェクションを妨害しないか、または増強する。【選択図】図１

Description

関連出願との相互参照
本出願は、２０１９年３月１４日に出願された米国仮出願第６２／８１８，４２５号、２０１９年１０月１８日に出願された同第６２／９２３，４０３号、及び２０１９年１０月２１日に出願された同第６２／９２４，１３１号の優先権の利益を主張し、全体が参照により及びあらゆる目的のために本明細書に組み込まれる。
キトサンは、キチンの脱アセチル化された形態である。キトサンは、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン及びＤ－グルコサミンの非毒性カチオンポリマーである。キトサンは核酸と複合体を形成し得、生体適合性のある非毒性多糖類として、細胞をトランスフェクトするためのＤＮＡ送達媒体として使用されている。ウイルスベクターの複雑さ及び潜在的な毒性のために、核酸の非ウイルス性送達におけるキトサンの使用に多くの関心が集中している。
遺伝子トランスフェクションによく適する組成物を特定するために、修飾キトサンと核酸の複合体を含む多数のキトサン／ＤＮＡ複合体が検討されている。例えば、ＷＯ２０１０／０８８５６５；ＷＯ２００８／０８２２８２を参照のこと。これらの複合体は、他の特性、溶解性、凝集傾向、複合体の安定性、粒径、ＤＮＡを放出する能力、及びトランスフェクション効率と共に、重要な物理化学的及び生物学的特性が異なることがわかっている。
トランスフェクション効率が改善されたキトサン－核酸ポリプレックスは、キトサン骨格をアルギニン及び親水性ポリオールで官能基化することにより開発されている。例えば、米国特許第１０，０４６，０６６号及び同第９，６２３，１１２号を参照のこと。特に、これらのポリプレックスは、腸の微小環境で顕著な安定性を示しており、これは、大幅なｐＨ変化、酵素活性、及び複雑な粘膜相互作用のために、体循環と比較して独特の課題を提示する。
粘着性及び立体相互作用を介して異物粒子を効率的にトラップし、続いて、急速にクリアランスする、ムチン繊維の密なネットワークのために、粘膜バリアは、ナノ粒子送達システムに対する特定の課題を表す。実に、特に、経口薬物送達の場合、腸粘膜は、わずか５０分でターンオーバーし得、これは、投与された粒子の非常に効率的なクリアランスをもたらす。例えば、Ｌｅｈｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ Ｊ．Ｐｈａｒｍ．７０：２３５－４０（１９９１）を参照のこと。ムチン繊維は、正荷電粒子に対して高い親和性を有する高度にグリコシル化されたセグメント、及び、ポリ－（乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）などの多くの一般に使用される薬物送達材料を含む、疎水性材料を高い結合力で結合し得る周期的な疎水性ドメインを含有する。立体障害と組み合わされたこれらの複雑な電荷相互作用は、ナノ粒子薬物送達形態が何らかの形態の遮蔽なしに克服することは困難であることが証明されている。しかし、逆に、従来の遮蔽アプローチでは、多くの場合、トランスフェクション能力が大幅に低下したナノ粒子が得られる。
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、少なくとも最初は相互侵入ネットワーク効果を介して粘膜付着を増加させ、それにより、薬物送達を延長するその実証された能力に基づく、幅広い遮蔽方策の主な要素として出現している。例えば、Ｈｕｃｋａｂｙ ａｎｄ Ｌａｉ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ １２４：１２５－３９（２０１８）を参照のこと。しかし、残念ながら、これらの粘膜付着方策は、核酸などの細胞内送達を必要とする治療には機能しない。その理由は、粘膜付着の強化により、粒子が下にある上皮または他の関連する標的組織に到達するのを妨げるためである。逆説的に、おそらく、ＰＥＧコーティングは、また、粒子拡散を増強しようとする粘膜不活性なアプローチにおける使用が見出されている。しかし、特に、これらのタイプのシステムに関する最近の知見及び結論は、ムチン親和性を最小限に抑え、粘液浸透を増強するよりも、高いＰＥＧグラフト密度の重要性を強調している。Ｉｄ．，Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｌａｉ，Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ ４７：９７２６－９７２９（２００８）。これらの例外的に高密度で共有結合しているＰＥＧ化方策は、効率的な遺伝子トランスフェクションにとって問題がある。
従って、粘膜浸透特性が改善されたｉｎ ｖｉｖｏでの遺伝子導入のための新しい組成物及び方法の必要性が残っている。
負荷電アンカー領域及び少なくとも１つの（例えば、親水性）非荷電尾部領域を有する、複数の線状ブロックコポリマーを含む可逆的（すなわち、非共有結合的に結合している）ポリマーコーティングを用いる粘膜付着を減少させ、キトサン－核酸ナノ粒子の粘液浸透を増強するための組成物及び方法が本明細書で提供される。好ましい実施形態では、線状ブロックコポリマーは、少なくとも１つのポリアニオンアンカー領域及び少なくとも１つのＰＥＧ尾部領域を含む二元ブロックまたは三元ブロックコポリマーである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物は、驚くべきことに、以前に企図されたよりも低い表面コーティング密度で、粘膜付着の低減及び粘液浸透の増強を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、驚くべきことに、ポリアニオンの存在にもかかわらず、一貫した物理的及び／または化学的安定性を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、驚くべきことに、可逆的ポリマーコーティングを含むにもかかわらず、一貫した及び／または同等のトランスフェクション効率を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、驚くべきことに、バルク形態及び／またはコーティングまたはカプセル化された形態での長期（例えば、数ヶ月）の貯蔵中に安定している。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、驚くべきことに、粘膜バリア及び／または粘液関連液（例えば、尿、または胃液もしくは腸液）と接触した時に安定している。
一態様では、本発明は、複数のポリアニオン含有ブロックコポリマー、例えば、線状二元ブロック及び／または三元ブロックコポリマーと複合体化したキトサン誘導体核酸ナノ粒子（ポリプレックス）を含むキトサン組成物を提供し、各コポリマーは、少なくとも１つのポリアニオンアンカー領域及び少なくとも１つの親水性（例えば、非荷電）尾部領域を含む。通常は、ポリプレックスは、コアを形成し、ポリアニオン親水性ポリマーは、例えば、少なくとも部分的な外膜を形成する。ポリプレックス及びポリアニオン含有ブロックコポリマー間の複合体は、通常、ポリマーのポリアニオンアンカー領域及びコーティングされていないポリプレックスの正味の正電荷間の可逆的且つ非共有結合的な静電相互作用により形成される。いくつかの場合では、ポリプレックス及びポリマーのポリアニオンアンカー領域間の静電相互作用の強度を低減させるためのイオン強度の増加、ならびに／またはポリマーのポリアニオン領域のアニオン部分をプロトン化するためのｐＨの減少により、ポリアニオン親水性ポリマーの全部または一部を複合体から放出させることができるという点で、複合体は可逆的である。
本発明の方法及び組成物に有用な例示的な二元ブロックコポリマー分子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）尾部領域及びポリアニオン（ＰＡ）アンカー領域を含む「ＰＥＧ－ＰＡ」コポリマー分子である。本発明の方法及び組成物に有用な例示的な三元ブロックコポリマー分子は、２つのＰＥＧ尾部領域に隣接する中央のＰＡアンカー領域［ＰＥＧ－ＰＡ－ＰＥＧ］、または中央のＰＥＧ尾部領域の側方にある２つのＰＡアンカー領域［ＰＡ－ＰＥＧ－ＰＡ］を含む「ＰＥＧ－ＰＡ」コポリマー分子である。
いくつかの実施形態では、本発明は、アミノ官能基化キトサン及び少なくとも１つの核酸分子を含むキトサン誘導体ナノ粒子を含む複合体を提供し、少なくとも１つの核酸分子は、３：１より大きいアミノ対リン（Ｎ：Ｐ）モル比でキトサン誘導体ナノ粒子に非共有結合的に結合しており、それにより、正電荷を有する誘導体化キトサン核酸複合体を形成し；複数の線状ブロックコポリマーは、キトサン誘導体ナノ粒子に非共有結合的に結合しており、ブロックコポリマーは、少なくとも１つのポリアニオン（ＰＡ）アンカー領域及び少なくとも１つのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）尾部領域を有し、組成物は、約１：１００超且つ約１０：１未満である、アミノ対アニオンの（Ｎ：Ａ）モル比を含む。
いくつかの実施形態では、線状ブロックコポリマーは、ＰＡアンカー領域及びＰＥＧ尾部領域を含む二元ブロックコポリマーである。いくつかの実施形態では、線状ブロックコポリマーは、２つのＰＥＧ尾部領域に隣接する中央のＰＡアンカー領域、または、代わりに、２つのＰＡアンカー領域に隣接する中央のＰＥＧ尾部領域を含む三元ブロックコポリマーである。
いくつかの実施形態では、ＰＡアンカー領域は、ポリペプチドを含み、ポリペプチドは、負荷電である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ－ＰＡ分子のＰＡアンカー領域は、炭水化物を含み、炭水化物は、負荷電である。いくつかの実施形態では、炭水化物は、複数のリン酸塩及び／または硫酸塩部分を含む。いくつかの実施形態では、炭水化物は、複数のカルボキシラート部分を含む。いくつかの実施形態では、炭水化物は、複数のカルボキシラート部分ならびに複数のリン酸塩及び／または硫酸塩部分を含む。いくつかの実施形態では、炭水化物は、リン酸塩及び／または硫酸塩部分よりも高い割合または数のカルボン酸塩部分を含む。例示的な実施形態では、炭水化物は、グリコサミノグリカンである。
特定の実施形態では、ＰＥＧ－ＰＡ分子は、ＰＥＧ－ポリグルタミン酸（ＰＥＧ－ＰＧＡ）分子；ＰＥＧ－ポリアスパラギン酸（ＰＥＧ－ＰＡＡ）分子；またはＰＥＧ－ヒアルロン酸（ＰＥＧ－ＨＡ）分子、またはそれらの組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ－ＰＡ分子のＰＥＧ尾部領域は、約５００Ｄａ～約５０，０００Ｄａ、好ましくは、約１，０００Ｄａ～約１０，０００Ｄａ、より好ましくは、約１，５００Ｄａ～約７，５００Ｄａ、さらにより好ましくは、約３，０００Ｄａ～約５，０００Ｄａ、最も好ましくは、約５，０００Ｄａの重量平均分子量（Ｍｗ）を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ－ＰＡ分子のＰＡ尾部領域は、約５００Ｄａ～約３，０００Ｄａ、より好ましくは、約１，０００Ｄａ～約２，５００Ｄａ、より好ましくは、約１，５００Ｄａの重量平均分子量（Ｍｗ）を含む。
いくつかの実施形態では、Ｎ：Ｐモル比は、約３：１超且つ約１００：１未満、より好ましくは、約５：１超且つ約５０：１未満、さらにより好ましくは、約５：１超且つ約３０：１未満、さらにより好ましくは、約５：１超且つ約２０：１未満、さらにより好ましくは約５：１且つ約１０：１未満である。いくつかの場合では、Ｎ：Ｐモル比は、約３：１～約３０：１である。いくつかの場合では、Ｎ：Ｐモル比は、約３：１～約２０：１である。いくつかの場合では、Ｎ：Ｐモル比は、約３：１～約１０：１である。いくつかの場合では、Ｎ：Ｐモル比は、約７：１である。
いくつかの実施形態では、Ｎ：Ａモル比は、約１：７５超及び約８：１未満、より好ましくは、約１：５０超及び約６：１未満、さらにより好ましくは、約１：２５超及び約６：１未満、さらにより好ましくは、約１：１０超及び約６：１未満、さらにより好ましくは、約１：５超及び約６：１未満である。
いくつかの実施形態では、Ｎ：Ｐモル比は、約１：８～約８：１であり、Ｐ：Ａモル比は、約０．０２～約０．２であり、より好ましくは、Ｎ：Ａモル比は、約０．１～約５、より好ましくは、約０．２～約２、より好ましくは、約０．３～約１．５、より好ましくは、約０．４～約１であり、さらにより好ましくは、Ｎ：Ｐ：Ａ比は、約７：１：７、約７：１：１２、または約７：１：１７である。
いくつかの実施形態では、Ｎ：Ｐモル比は、約１：８～約３０：１であり、Ｐ：Ａモル比は、約１：５０～約１：５であり、より好ましくは、Ｎ：Ａモル比は、約１：１０～約５、より好ましくは、約１：５～約２、より好ましくは、約１：３～約１．５、さらにより好ましくは、約１：２．５～約１である。いくつかの実施形態では、Ｎ：Ｐモル比は、約１：５～約２０：１であり、Ｐ：Ａモル比は、約１：５０～約１：５であり、より好ましくは、Ｎ：Ａモル比は、約１：１０～約５、より好ましくは、約１：５～約２、より好ましくは、約１：３～約１．５、さらにより好ましくは、約１：２．５～約１である。いくつかの実施形態では、Ｎ：Ｐモル比は、約１：２～約１０：１であり、Ｐ：Ａモル比は、約１：５０～約１：５であり、より好ましくは、Ｎ：Ａモル比は、約１：１０～約５、より好ましくは、約１：５～約２、より好ましくは、約１：３～約１．５、さらにより好ましくは、約１：２．５～約１である。
いくつかの実施形態では、Ｎ：Ｐモル比は、約１：１～約３０：１であり、Ｐ：Ａモル比は、約１：５０～約１：５であり、より好ましくは、Ｎ：Ａモル比は、約１：１０～約５、より好ましくは、約１：５～約２、より好ましくは、約１：３～約１．５、さらにより好ましくは、約１：２．５～約１である。いくつかの実施形態では、Ｎ：Ｐモル比は、約１：１～約２０：１であり、Ｐ：Ａモル比は、約１：５０～約１：５であり、より好ましくは、Ｎ：Ａモル比は、約１：１０～約５、より好ましくは、約１：５～約２、より好ましくは、約１：３～約１．５、さらにより好ましくは、約１：２．５～約１である。いくつかの実施形態では、Ｎ：Ｐモル比は、約１：１～約１５：１であり、Ｐ：Ａモル比は、約１：５０～約１：５であり、より好ましくは、Ｎ：Ａモル比は、約１：１０～約５、より好ましくは、約１：５～約２、より好ましくは、約１：３～約１．５、さらにより好ましくは、約１：２．５～約１である。いくつかの実施形態では、Ｎ：Ｐモル比は、約１：１～約１０：１であり、Ｐ：Ａモル比は、約１：５０～約１：５であり、より好ましくは、Ｎ：Ａモル比は、約１：１０～約５、より好ましくは、約１：５～約２、より好ましくは、約１：３～約１．５、さらにより好ましくは、約１：２．５～約１である。
いくつかの実施形態では、Ｎ：Ｐモル比は、約２：１～約３０：１であり、Ｐ：Ａモル比は、約１：５０～約１：５であり、より好ましくは、Ｎ：Ａモル比は、約１：１０～約５、より好ましくは、約１：５～約２、より好ましくは、約１：３～約１．５、さらにより好ましくは、約１：２．５～約１である。いくつかの実施形態では、Ｎ：Ｐモル比は、約２：１～約２０：１であり、Ｐ：Ａモル比は、約１：５０～約１：５であり、より好ましくは、Ｎ：Ａモル比は、約１：１０～約５、より好ましくは、約１：５～約２、より好ましくは、約１：３～約１．５、さらにより好ましくは、約１：２．５～約１である。いくつかの実施形態では、Ｎ：Ｐモル比は、約２：１～約１５：１であり、Ｐ：Ａモル比は、約１：５０～約１：５であり、より好ましくは、Ｎ：Ａモル比は、約１：１０～約５、より好ましくは、約１：５～約２、より好ましくは、約１：３～約１．５、さらにより好ましくは、約１：２．５～約１である。いくつかの実施形態では、Ｎ：Ｐモル比は、約２：１～約１０：１であり、Ｐ：Ａモル比は、約１：５０～約１：５であり、より好ましくは、Ｎ：Ａモル比は、約１：１０～約５、より好ましくは、約１：５～約２、より好ましくは、約１：３～約１．５、さらにより好ましくは、約１：２．５～約１である。
いくつかの実施形態では、アミノ官能基化キトサンは、アルギニン、リジン、またはオルニチン官能基化され、好ましくは、アルギニン官能基化される。いくつかの実施形態では、アミノ官能基化キトサン誘導体ナノ粒子は、さらに、ポリオールを含む。いくつかの実施形態では、アミノ官能基化キトサンは、さらに、ポリオールを含む。いくつかの実施形態では、アミノ官能基化キトサン誘導体ナノ粒子は、また、ポリオールで官能基化される。いくつかの実施形態では、アミノ官能基化キトサンは、また、ポリオールで官能基化される。
いくつかの実施形態では、組成物は、空腹時人工腸液中で、１時間、２４時間、４８時間、１週間、または１ヶ月間もしくは２ヶ月間、あるいは、少なくとも１時間、２４時間、４８時間、１週間、または１ヶ月間もしくは２ヶ月間、安定である。いくつかの実施形態では、組成物は、精製水中の組成物の分散液などの水性分散液中、４℃で、１時間、２４時間、４８時間、１週間、または１ヶ月間もしくは２ヶ月間、あるいは、少なくとも１時間、２４時間、４８時間、１週間、または１ヶ月間もしくは２ヶ月間、安定である。いくつかの実施形態では、組成物は、精製水中、４℃で、１時間、２４時間、４８時間、１週間、または１ヶ月もしくは２ヶ月間、あるいは、少なくとも１時間、２４時間、４８時間、１週間、または１ヶ月もしくは２ヶ月間、安定である。いくつかの実施形態では、組成物は、尿中、４℃で、１時間、２４時間、４８時間、１週間、または１ヶ月間もしくは２ヶ月間、あるいは、少なくとも１時間、２４時間、４８時間、１週間、または１ヶ月間もしくは２ヶ月間、安定である。いくつかの実施形態では、組成物は、所定の時間の後、例えば、２４時間後、４８時間後、１週間後、または１ヶ月後もしくは２ヶ月後に、人工腸液及び／または水性分散液及び／または尿及び／または精製水中で、沈殿凝集物が実質的にない（１０％未満）という点で安定である。
いくつかの実施形態では、組成物は、凍結／解凍及び／または凍結乾燥／再水和後に水性分散液中で安定である。いくつかの実施形態では、組成物は、水溶液中４℃で、４８時間、１週間、または１ヶ月もしくは２ヶ月後に、あるいは少なくとも４８時間、１週間、または１ヶ月もしくは２ヶ月後に、０．２未満の多分散指数を示す。いくつかの実施形態では、組成物は、乾燥（例えば、凍結乾燥、噴霧乾燥、蒸発、超臨界乾燥、噴霧凍結乾燥など）させ、次に、再水和させた後に水性分散液中で安定である。
いくつかの実施形態では、組成物は、哺乳動物の尿中で少なくとも１時間安定である。いくつかの実施形態では、組成物は、室温または３７℃で哺乳動物の尿中で少なくとも１時間安定である。いくつかの実施形態では、組成物は、哺乳動物の尿中で（例えば、３７℃で）少なくとも１時間後に、０．２未満の多分散指数を示す。
いくつかの実施形態では、組成物は、治療用核酸で細胞をトランスフェクトする。いくつかの実施形態では、治療用核酸は、治療用タンパク質に転写される。いくつかの実施形態では、治療用核酸は、内因性タンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制する。いくつかの実施形態では、治療用核酸は、内因性遺伝子の発現を抑制する。
いくつかの実施形態では、組成物は、さらに、界面活性剤、賦形剤、及び／または貯蔵安定剤を含む。いくつかの実施形態では、貯蔵安定剤は、単糖、二糖、多糖、またはそれらの還元アルコールであり、さらにより好ましくは、貯蔵安定剤は、トレハロース及びマンニトールから選択される。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、ポロキサマーを含み、より好ましくは、ポロキサマーは、ポロキサマー４０７である。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの核酸は、ＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの核酸は、ＤＮＡを含む。
ポリプレックス：ポリマー組成物及び組成物の作製方法を示す。
本明細書に記載の特定のポリプレックス：ポリマー組成物のゼータ電位及びＰＥＧ化度間の逆の関係を示す。ポリアニオン－ＰＥＧ（Ａ） 対 アミノ官能基化キトサン（Ｎ）のモル比が増加すると、より高いＰＥＧ密度で、ゼータ電位が低下して、ほぼ中性からわずかに負の値に達する。
凍結融解後のポリプレックス：ポリマー組成物の安定性を示す。［Ｎ＋］対［Ａ－］の試験された比でＰＥＧ化されているポリプレックスは、凍結融解後も安定したままであった。
異なる体積：体積比での人工腸液中のポリプレックス：ポリマー組成物の安定性を示す。ＦａＳＳＩＦ－Ｖ２＝空腹時人工腸液Ｖ２。
人工腸液中で複合体化された核酸を保持するポリプレックス：ポリマー組成物の能力を示す。ＦａＳＳＩＦ－Ｖ１＝空腹時人工腸液Ｖ１。ＦａＳＳＩＦ－Ｖ２＝空腹時人工腸液Ｖ２。ＰＰ＝ポリプレックス。
ＰＥＧ化ＤＤ－キトサン－核酸ポリプレックスを用いるｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクションを示す。
蛍光顕微鏡を使用して、本明細書に記載のポリプレックス：ポリマー組成物に対する粘液凝集アッセイの方法及び結果を示す。
Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ拡散アッセイを使用して、本明細書に記載のポリプレックス：ポリマー組成物に対して粘液浸透アッセイを実施する方法を示す。
本明細書に記載のポリプレックス：ポリマー組成物のＴｒａｎｓｗｅｌｌ拡散アッセイの結果を示す。
ポロキサマー４０７の存在下での、本明細書に記載のポリプレックス：ポリマー組成物のＴｒａｎｓｗｅｌｌ拡散アッセイの結果を示す。
本明細書に記載のポリプレックス：ポリマー組成物を作製するスケーラブルな方法を示す。
凍結乾燥及び再水和、ならびに高濃度条件下での本明細書に記載のポリプレックス：ポリマー組成物の安定性を示す。
室温及び４℃での４週間までの、凍結乾燥されたＰＥＧ化ポリプレックスの安定性を示す。
賦形剤の非存在下で凍結乾燥させ、４℃で最大４週間保存された本明細書に記載のポリプレックス：ポリマー組成物の安定性を示す。
マウスの膀胱に投与され、収集された尿中で回収された、本明細書に記載のポリプレックス：ポリマー組成物の安定性を示す。
（導入遺伝子のｍＲＮＡ発現により測定）結腸内点滴注入（ＩＣＩ）により送達された場合の、本明細書に記載のポリプレックス：ポリマー組成物の著しく改善されたｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子送達を示す。投与されたポリプレックス製剤は、１５０μｇ／ｍＬの核酸を含有し、３ｘ１５０μＬの結腸内点滴注入として投与され；結腸切片を投与の２４時間後に採取し、細胞溶解物を使用してヒトＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ ｍＲＮＡを定量した。
（導入遺伝子のタンパク質発現により測定）結腸内注入（ＩＣＩ）により送達された場合の、本明細書に記載のポリプレックス：ポリマー組成物の著しく改善されたｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子送達を示す。投与されたポリプレックス製剤は、１５０μｇ／ｍＬの核酸を含有し、３ｘ１５０μＬの結腸内点滴注入として投与され；結腸切片を投与の２４時間後に採取し、特注のＭｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙイムノアッセイを使用して、ヒトＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ タンパク質を定量した。
（導入遺伝子のタンパク質発現により測定）結腸内注入（ＩＣＩ）により送達された場合の、本明細書に記載のポリプレックス：ポリマー組成物の著しく改善されたｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子送達を示す。投与されたポリプレックス製剤は、１０００μｇ／ｍＬの核酸を含有し、３ｘ１５０μＬの結腸内点滴注入として投与され；結腸切片を投与の２４時間後に採取し、特注のＭｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙイムノアッセイを使用して、ヒトＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ タンパク質を定量した。
ＰＥＧ化されていないＤＤＸポリプレックスと比較した、ＰＥＧ化ＤＤＸポリプレックスの％スーパーコイルＤＮＡ含有量の改善を示す。
ＰＥＧ化ＤＤＸポリプレックスの保存安定性を示す。
ＰＥＧ化及びＰＥＧ化されていないＤＤＸポリプレックス製剤の再水和性を示す。ＰＥＧ化ＤＤＸポリプレックスは、ＰＥＧ化されていないＤＤＸポリプレックス（２ｍｇ／ｍＬ）と比較して、より高い最終濃度（１０ｍｇ／ｍＬ）で安定して再水和させることが可能であった。
哺乳動物の膀胱中でインキュベートされた場合の、示されたＤＤＸポリプレックス製剤の安定性を示す。
小規模で試験された場合の、示された条件での示されたＤＤＸポリプレックス製剤の濾過性を示す。
中規模で試験された場合の、示された条件での示されたＤＤＸポリプレックス製剤の濾過性を示す。
ナノ粒径（ｎｍ）、ゼータ電位（ｍＶ）、及び％スーパーコイル含有量（％ＳＣ）で示される、凍結融解（ＦＴ）及び凍結乾燥／再水和（ＦＤ）後の指定されたＤＤＸポリプレックス製剤の安定性を示す。
ＰＥＧ化二重誘導体化（ＤＤＸ）キトサンＤＮＡポリプレックスを小腸に直接送達することによるイヌ小腸のｉｎ ｖｉｖｏトランスフェクションを示す。
水性ポリプレックス製剤を低ｐＨの酢酸塩緩衝液と、ｐＨをＰＥＧ－ポリグルタミン酸ポリマーのｐＫａ（約４．２５）未満に下げるのに十分な比で混合する場合の、ゼータ電位（ｍｖ）の大幅な増加（これは、４未満のｐＨでのＰＥＧ化ポリプレックスの脱コートを示す）を示す。
示される様々なＮ：Ｐ：Ａ比で形成された可逆的にＰＥＧ化されているポリプレックスの粒径を示す。異なるポリグルタミン酸（ＰＬＥ）ポリアニオンアンカー領域を試験した：ＰＬＥ５（５グルタミン酸ポリグルタミン酸領域）、ＰＬＥ１０（１０のグルタミン酸ポリグルタミン酸領域）、及びＰＬＥ２５（２５のグルタミン酸ポリグルタミン酸領域）。
示された可逆的にＰＥＧ化されているポリプレックスの水性分散液のｐＨを示す。
示された可逆的にＰＥＧ化されているポリプレックスのゼータ電位測定の結果を示す。
可逆的にＰＥＧ化されているポリプレックスのポリアスパラギン酸（ＰＡＡ）誘発の結果を示す。核酸放出は、ＰＡＡ濃度の関数として監視された。ＰＥＧ－ＰＬＥの異なるポリグルタミン酸（ＰＬＥ）ポリアニオンアンカー領域を試験した：異なるＮＰＡ比のＰＬＥ５（５グルタミン酸ポリグルタミン酸領域）、ＰＬＥ１０（１０のグルタミン酸ポリグルタミン酸領域）、及びＰＬＥ２５（２５のグルタミン酸ポリグルタミン酸領域）。
ＰＥＧ化ポリプレックスのＤＮＡ放出に必要なＰＡＡのレベルを示す。ＰＥＧ－ＰＬＥ２５を使用して作成されたＰＥＧ化ポリプレックスの核酸は、ＰＥＧ－ＰＬＥ５またはＰＥＧ－ＰＬＥ１０を用いて作成されたポリプレックスの核酸よりも緩く結合していた。
示されたＰＥＧ化ポリプレックスの粒径及び多分散度指数（ＰＤＩ）に対する空腹時人工腸液（ＦａＳＳＩＦ ｖ２）の影響を示す。
示されたＰＥＧ化ポリプレックスの得られた水性分散液の粒子のゼータ電位及びｐＨに対する空腹時人工腸液（ＦａＳＳＩＦ ｖ２）の影響を示す。
凍結融解後のＰＥＧ化ポリプレックス（ＰＬＥ１０、ＰＬＤ１０、及びＰＬＤ５０）の安定性（粒径で測定）を示す。７：１：３０のＮ：Ｐ：ＡのＰＥＧ－ＰＬＤ５０ポリプレックスは、凍結融解後の粒径の増加を示した。
凍結融解後のＰＥＧ化ポリプレックス（ＰＬＥ１０、ＰＬＤ１０、及びＰＬＤ５０）の安定性（粒径（上）及びゼータ電位（中央）で測定）を示す。７：１：３０のＮ：Ｐ：ＡのＰＥＧ－ＰＬＤ５０ポリプレックスは、凍結融解後、粒径の増加及びゼータ電位の低下を示した。示されたポリプレックスは、Ｐ：Ａ比が減少する（Ａが増加する）につれて且つアニオンサブユニットの数が増加するにつれて、水性分散液として、漸増するｐＨを示した（下）。
アガロースゲル電気泳動により可逆的にＰＥＧ化されているポリプレックスを分析して、複合体を形成していない核酸を検出した結果を示す。
異なるｐＨでの可逆的にＰＥＧ化されている（上段）及び共有結合的にＰＥＧ化されているポリプレックス（下段）の予想される挙動の概略図を示す。
ポリアスパラギン酸（ＰＡＡ）誘発に応答した、２つのｐＨ２及び６で、可逆的にＰＥＧ化されているポリプレックス（上段）ならびに２つの異なる共有結合的にＰＥＧ化されているポリプレックス（中段及び下段）の溶液挙動を示す。
ＰＥＧ化されていないポリプレックスと比較した、可逆的にＰＥＧ化されているポリプレックスのトランスフェクション効率を示す。
共有結合的にＰＥＧ化されているポリプレックスと比較した、可逆的にＰＥＧ化されているポリプレックスのトランスフェクション効率を示す。
マウスへの結腸内送達後に１段階法または２段階の方法で作成された可逆的にＰＥＧ化されているポリプレックスのトランスフェクション効力を示す。
マウスへの小胞内投与後に１段階法または２段階の方法で作成された可逆的にＰＥＧ化されているポリプレックスのトランスフェクション効力を示す。
１．定義
別途定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語、表記法、及び他の科学用語は、本発明が関係する当業者らにより一般に理解される意味を有することを意図する。いくつかの場合では、一般に理解される意味を有する用語は、明確にするために及び／またはすぐに参照できるように本明細書中で定義され、本明細書にそのような定義の包含は、必ずしも、当該技術分野において一般に理解されているものを超える差を表すように解釈されるべきではない。本明細書に記載または参照される手法及び手順は、一般によく理解され、当業者らにより、従来の方法論、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ．（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹに記載の広く利用される分子クローニング方法論、を使用して一般に用いられる。必要に応じて、市販のキット及び試薬の使用を含む手順は、別途記載のない限り、一般に、製造者が定義したプロトコール及び／またはパラメーターに従って実施される。
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が別途明示しない限り、複数の指示対象を含む。
「約」という用語は、示された値及びその値の上下範囲を示し、包含する。特定の実施形態では、「約」という用語は、指定された値±１０％、±５％、または±１％を示す。特定の実施形態では、示されている場合、「約」という用語は、指定された値±その値の１標準偏差を示す。
「それらの組み合わせ」という用語は、その用語が参照する要素の全ての可能な組み合わせを含む。
任意の疾患または障害の「処置すること」または「処置」は、特定の実施形態では、対象に存在する疾患または障害を改善することを指す。別の実施形態では、「処置すること」または「処置」は、対象により識別できない可能性がある少なくとも１つの物理的パラメーターを改善することを含む。さらに別の実施形態では、「処置すること」または「処置」は、物理的（例えば、識別可能な症状の安定化）または生理学的（例えば、物理的パラメーターの安定化）あるいはその両方のいずれかで、疾患または障害を和らげることを含む。さらに別の実施形態では、「処置すること」または「処置」は、疾患または障害の発症を遅延または予防することを含む。
本明細書で使用される場合、「治療的有効量」または「有効量」という用語は、対象に投与される場合に、疾患または障害を処置するのに有効である抗体または組成物の量を指す。
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、哺乳動物対象を意味する。例示的な対象としては、ヒト、サル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ラクダ、トリ、ヤギ、及びヒツジが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、対象は、ヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、がん、自己免疫疾患もしくは状態、及び／または本明細書で提供される抗体で処置することができる感染症を有する。いくつかの実施形態では、対象は、がん、自己免疫疾患もしくは状態、及び／または感染症を有することが疑われるヒトである。
「キトサン」は、Ｎ－アセチルグルコサミンのポリマーである、キチンの部分的または完全に脱アセチル化された形態である。脱アセチル化度が５０％を超えるキトサンが本発明では使用される。
キトサンは、脱アセチル化部位の遊離アミノ基を官能基化することにより誘導体化されてもよい。本明細書に記載の誘導体化キトサンは、以下を含む、核酸送達ビヒクルに有利な多数の特性を有する：負荷電核酸に効果的に結合及び複合体化すること、制御可能なサイズのナノ粒子に形成することができること、細胞により取り込まれ得ること、ならびに、細胞内に適切な時間で核酸を放出し得ること。１％～５０％の任意の最終官能基化度を有するキトサン。（官能基化前のまたは官能基化がないキトサンポリマー上の遊離アミノ部分の数に対して、パーセント官能基化を決定する。）脱アセチル化度及び最終官能基化度は、官能基化キトサン誘導体に特定の電荷密度を与える。
本発明によるポリオールは、３、４、５、６、または７つの炭素骨格を有してもよく、少なくとも２つのヒドロキシル基を有してもよい。そのようなポリオール、またはそれらの組み合わせは、カチオン部分（例えば、リジン、オルニチンなどのアミノ基を含む分子、グアニジニウム基、アルギニンを含む分子、またはそれらの組み合わせ）で官能基化されているキトサンなどのキトサン骨格へのコンジュゲートに有用であり得る。
本明細書で使用される「Ｃ２－Ｃ６アルキレン」という用語は、任意に１つ以上の炭素－炭素多重結合を含有する線状または分枝状の二価炭化水素ラジカルを指す。誤解を避けるために、本明細書で使用される「Ｃ２－Ｃ６アルキレン」という用語は、アルカン、アルケン、及びアルキンの二価ラジカルを包含する。
本明細書で使用される場合、別途指示のない限り、「ペプチド」及び「ポリペプチド」という用語は、交換可能に使用される。
「ポリペプチド」という用語は、従来のポリペプチド（すなわち、ＬまたはＤ－アミノ酸を含有する短いポリペプチド）、ならびに所望の機能的活性を保持するペプチド同等物、ペプチドアナログ、及びペプチド模倣物を指すように最も広い意味で使用される。ペプチド同等物は、１つ以上のアミノ酸を関連有機酸、アミノ酸などで置き換えること、または側鎖もしくは官能基を置換または修飾することにより、従来のペプチドとは異なり得る。
「酸性アミノ酸」という用語は、ｐＨ７の水性緩衝液中で負電荷を持つ側鎖を有する天然に存在するかまたは天然に存在しないアミノ酸を指す。酸性アミノ酸の非限定例は、アスパラギン酸及びグルタミン酸である。
ペプチド模倣物は、当該技術分野で知られているように、代替の結合により置き換えられた１つ以上のペプチド結合を有してもよい。当該技術分野で知られているように、ペプチド骨格の一部または全部は、機能的アミノ酸側鎖の可動性を制限するために、立体配座的に拘束された環状アルキルまたはアリール置換基で置き換えることもできる。
本発明のポリペプチドは、当該技術分野で周知である組み換え及び合成方法などの認識された方法により生成されてもよい。ペプチド合成の手法は周知であり、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９－２４５６（１９６３），Ａｔｈｅｒｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９８９），ａｎｄ Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：３４１－３４７（１９８６）に記載されるものが挙げられる。
本明細書で使用される場合、「線状ポリペプチド」は、構成アミノ酸側鎖に共有結合している分岐基を欠くポリペプチドを指す。本明細書で使用される場合、「分岐ポリペプチド」は、構成アミノ酸側鎖に共有結合している分岐基を含むポリペプチドを指す。
本明細書で使用されるカチオンまたはポリオールの「最終的官能基化度」は、それぞれ、カチオン（例えば、アミノ）基またはポリオールで官能基化されたキトサン骨格上のカチオン（例えば、アミノ）基のパーセンテージを指す。従って、「α：β比」、「最終官能基化度比」（例えば、Ａｒｇの最終官能基化度：ポリオールの最終官能基化度の比）などは、「モル比」または「数比」という用語と互換的に使用され得る。
分散系は、連続媒体全体に分布した分散相として知られる粒子物質で構成される。キトサン核酸ポリプレックスの「分散液」は、水和キトサン核酸ポリプレックスを含む組成物であり、ポリプレックスは媒体全体に分布している。
本明細書で使用される場合、「予備濃縮された」分散液は、濃縮された分散液を形成するための濃縮プロセスを受けていないものである。
本明細書で使用される場合、ポリプレックス沈殿物を「実質的に含まない」は、組成物が、目視検査で観察することができる粒子を本質的に含まないことを意味する。
本明細書で使用される場合、生理学的ｐＨは、６～８のｐＨを指す。
「キトサン核酸ポリプレックス」またはその文法上の同等物は、複数のキトサン分子及び複数の核酸分子を含む複合体を意味する。好ましい実施形態では、（例えば、二重）誘導体化キトサンは、該核酸と複合体化される。
本明細書で使用される「ポリエチレングリコール」（「ＰＥＧ」）という用語は、－（ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ）－の繰り返し単位及びＨＯ－（ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ）ｎ－Ｈの一般式を有するエチレンオキシドのポリマーを意味することが意図される。
本明細書で使用される「モノメトキシポリエチレングリコール」（「ｍＰＥＧ」）という用語は、－（ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ）－の繰り返し単位及びＣＨ３Ｏ－（ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ）ｎ－Ｈの一般式を有するエチレンオキシド、例えば、一端がメトキシ基でキャップされたＰＥＧ、のポリマーを意味することが意図される。
２．組成物
二元ブロック及び／または三元ブロックコポリマーコーティングと複合体化されたキトサン誘導体核酸ナノ粒子（ポリプレックス）を含むキトサン組成物が本明細書で提供され、個々のポリマー分子は、負荷電アンカー領域及び１つ以上の非荷電親水性尾部領域を含む。例示的な負荷電アンカー領域としては、繰り返し単位を含むポリアニオンアンカー領域が挙げられ、繰り返し単位は、１つ以上の負荷電サブユニット、例えば、１つ以上の酸性アミノ酸を含む。例示的な親水性尾部領域としては、ＰＥＧ尾部領域及びその誘導体、ポリビニルアルコール尾部領域及びその誘導体、ポリオキサゾリン尾部領域及びその誘導体、ポリサルコシン尾部領域及びその誘導体、ポリ（Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド）（ｐＨＰＭＡ）尾部領域及びその誘導体、ならびにそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の方法及び組成物において有用な例示的なポリマー分子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分及びポリアニオン（ＰＡ）部分を含む「ＰＥＧ－ＰＡ」ポリマー分子である。
２．１．キトサン
キトサン誘導体核酸ナノ粒子のキトサン構成成分は、カチオン官能基及び／または親水性部分で官能基化することができる。２つの異なる官能基で官能基化されたキトサンは、二重誘導体化キトサン（ＤＤ－キトサン）と呼ばれる。例示的なＤＤ－キトサンは、親水性部分（例えば、ポリオール）及びカチオン官能基（例えば、アミノ基）の両方で官能基化される。例示的なキトサン誘導体は、例えば、米国特許第２００７／０２８１９０４号、及び米国特許第２０１２／０２３５８６３号（それぞれ、参照により本明細書に組み込まれる）にも記載される。
一実施形態では、本明細書に記載の二重誘導体化キトサンは、脱アセチル化度が少なくとも５０％であるキトサンを含む。一実施形態では、脱アセチル化度は、少なくとも６０％、より好ましくは、少なくとも７０％、より好ましくは、少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも９０％、最も好ましくは、少なくとも９５％である。好ましい実施形態では、本明細書に記載の二重誘導体化キトサンは、脱アセチル化度が少なくとも９８％であるキトサンを含む。
本明細書に記載のキトサン誘導体は、中性及び生理学的ｐＨで可溶性である幅広い平均分子量を有し、本発明の目的のために、３～１１０ｋＤａの範囲の分子量を含む。本明細書に記載の実施形態は、誘導体化キトサンのより低い平均分子量（２５ｋＤａ未満、例えば、約５ｋＤａ～約２５ｋＤａ）を特徴とし、これは、望ましい送達及びトランスフェクション特性を有し得、サイズが小さく、良好な溶解性を有する。低平均分子量の誘導体化キトサンは、一般に、ポリマー量のものよりも溶解性が高く、前者は、核酸をより容易に放出し、細胞のトランスフェクションを増加させる核酸／キトサン複合体を生成する。多くの文献が、キトサンベースのデリバリーシステムのためのこれらパラメーターの全ての最適化に専念している。
キトサンが、式Ｉの構造（式中、ｎは、任意の整数であり、各Ｒ１は、独立して、アセチルまたは水素から選択され、水素から選択されるＲ１の程度は、５０％～１００％である）を有する複数の分子を指すことを、通常の当業者は、理解するであろう。また、例えば、３ｋＤ～１１０ｋＤの平均分子量を有するものと呼ばれるキトサンは、一般に、例えば、それぞれ、３ｋＤ～１１０ｋＤの重量平均分子量を有する複数のキトサン分子を指し、キトサン分子のそれぞれは、異なる鎖長であってよい（ｎ＋２）。「ｎ－ｍｅｒキトサン」と呼ばれるキトサンは、必ずしも、式Ｉのキトサン分子（式中、各キトサン分子は、ｎ＋２の鎖長を有する）を含むとは限らないこともよく認識される。むしろ、本明細書で使用される「ｎ－ｍｅｒキトサン」は、複数のキトサン分子を指し、これらのそれぞれは、異なる鎖長を有してもよく、多くは、鎖長がｎであるキトサン分子と実質的に同等または等しい平均分子量を有する。例えば、２４－ｍｅｒのキトサンは、複数のキトサン分子を含んでもよく、それぞれは、例えば、７～５０、の範囲に及ぶ異なる鎖長を有するが、これは、鎖長が２４のキトサン分子と実質的な同等または等しい重量平均分子量を有する。
本発明の二重誘導体化キトサンは、また、ポリオール、またはポリオールなどの親水性官能基で官能基化されてもよい。理論に拘束されることを望むものではないが、ポリオールなどの親水性基による官能基化が、キトサン（Ａｒｇ－キトサンを含む）の親水性を増加させるのに役立ち得、及び／またはヒドロキシル基を供与し得ると仮定される。いくつかの実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子の親水性官能基は、グルコン酸であるか、またはそれを含む。例えば、ＷＯ２０１３／１３８９３０を参照のこと。いくつかの実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子の親水性官能基は、グルコースであるか、またはそれを含む。追加的または代替的に、親水性官能基は、ポリオールを含むことができる。例えば、ＵＳ２０１６／０２３５８６３を参照のこと。キトサンの官能基化のための例示的なポリオールは、さらに、以下に記載される。
本明細書に記載の官能基化キトサン誘導体は、二重誘導体化キトサン化合物、例えば、カチオン－キトサン－ポリオール化合物、を含む。一般に、カチオン－キトサン－ポリオール化合物は、アミノ含有部分、例えば、アルギニン、リジン、オルニチン、もしくはグアニジニウムを含む分子、またはそれらの組み合わせ、で官能基化される。特定の実施形態では、カチオン－キトサン－ポリオール化合物は、式Ｉの以下の構造を有する：
Figure 2022524859000002
 式中、ｎは、１～６５０の整数であり、
αは、カチオン部分（例えば、リジン、オルニチン、グアニジニウム基を含む分子、アルギニン、またはそれらの組み合わせなどのアミノ基を含む分子）の最終官能基化度であり、
βは、ポリオールの最終官能基化度であり、
各Ｒ１は、独立して、水素、アセチル、カチオン（例えば、アルギニン）、及びポリオールから独立して選択される。
好ましくは、本発明の二重誘導体化キトサンは、カチオンアミノ酸であるアルギニンで官能基化されてもよい。
一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、１％、２％、４％、７％、８％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、またはそれ以上の最終官能基化度でグルコン酸と結合したキトサンを含む。一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、１％、２％、４％、７％、８％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、またはそれ以上の最終官能基化度でグルコースと結合したキトサンを含む。一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約１％～約２５％の最終官能基化度でカチオン部分（例えば、アルギニン）と結合したキトサンを含む。一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約１０％～約４０％の最終官能基化度でカチオン部分（例えば、アルギニン）と結合したキトサンを含む。
一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約１０％～約３５％の最終官能基化度でカチオン部分（例えば、アルギニン）と結合したキトサンを含む。一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約２０％～約３５％の最終官能基化度でカチオン部分（例えば、アルギニン）と結合したキトサンを含む。一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約２５％～約３５％の最終官能基化度でカチオン部分（例えば、アルギニン）と結合したキトサンを含む。一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約２５％～約３０％、好ましくは、２８％、の最終官能基化度でカチオン部分（例えば、アルギニン）と結合したキトサンを含む。
一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約１５％～約４０％の最終官能基化度でカチオン部分（例えば、アルギニン）と結合したキトサンを含む。一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約１５％～約３５％の最終官能基化度でカチオン部分（例えば、アルギニン）と結合したキトサンを含む。一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約１５％～約３０％の最終官能基化度でカチオン部分（例えば、アルギニン）と結合したキトサンを含む。一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約１５％～約２８％の最終官能基化度でカチオン部分（例えば、アルギニン）と結合したキトサンを含む。
一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約１０％～約３５％の最終官能基化度でカチオン部分（例えば、アルギニン）と結合したキトサンを含む。一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約１０％～約３０％の最終官能基化度でカチオン部分（例えば、アルギニン）と結合したキトサンを含む。一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約１０％～約２８％の最終官能基化度でカチオン部分（例えば、アルギニン）と結合したキトサンを含む。一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約２８％の最終官能基化度でカチオン部分（例えば、アルギニン）と結合したキトサンを含む。
一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約２％～約３０％、約５％～約３０％、約７．５％～約３０％、約５％～約２５％、約５％～約２２％、約５％～約２０％、約５％～約１５％、または約５％～約１０％の最終官能基化度でグルコン酸と結合したキトサンを含む。一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約７．５％～約２５％、約７．５％～約２０％、約７．５％～約１５％、または約７．５％～約１２％の最終官能基化度でグルコン酸と結合したキトサンを含む。一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約１０％の最終官能基化度でグルコン酸と結合したキトサンを含む。
一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約２％～約３０％、約５％～約３０％、約７．５％～約３０％、約５％～約２５％、約５％～約２２％、約５％～約２０％、約５％～約１５％、または約５％～約１０％の最終官能基化度で親水性ポリオールと結合したキトサンを含む。一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約７．５％～約２５％、約７．５％～約２０％、約７．５％～約１５％、または約７．５％～約１２％の最終官能基化度で親水性ポリオールと結合したキトサンを含む。一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約１０％の最終官能基化度で親水性ポリオールと結合したキトサンを含む。
一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約２％～約３０％、約５％～約３０％、約７．５％～約３０％、約５％～約２５％、約５％～約２２％、約５％～約２０％、約５％～約１５％、または約５％～約１０％の最終官能基化度でグルコースと結合したキトサンを含む。一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約７．５％～約２５％、約７．５％～約２０％、約７．５％～約１５％、または約７．５％～約１２％の最終官能基化度でグルコースと結合したキトサンを含む。一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約１０％の最終官能基化度でグルコースと結合したキトサンを含む。
一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約２％～約４０％の最終官能基化度でカチオン（例えば、アルギニン）と結合したキトサン及び約２％～約３０％の最終官能度で親水性ポリオール（例えば、グルコースまたはグルコン酸）と結合したキトサンを含む。一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約５％～約４０％の最終官能基化度でカチオン（例えば、アルギニン）と結合したキトサン及び約５％～約２５％の最終官能度で親水性ポリオール（例えば、グルコースまたはグルコン酸）と結合したキトサンを含む。一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約７．５％～約４０％の最終官能基化度でカチオン（例えば、アルギニン）と結合したキトサン及び約７．５％～約２０％の最終官能度で親水性ポリオール（例えば、グルコースまたはグルコン酸）と結合したキトサンを含む。一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約１０％～約４０％の最終官能基化度でカチオン（例えば、アルギニン）と結合したキトサン及び約７．５％～約１５％、または約１０％の最終官能度で親水性ポリオール（例えば、グルコースまたはグルコン酸）と結合したキトサンを含む。
一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約２％～約３５％の最終官能基化度でカチオン（例えば、アルギニン）と結合したキトサン及び約２％～約３０％の最終官能度で親水性ポリオール（例えば、グルコースまたはグルコン酸）と結合したキトサンを含む。一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約５％～約３５％の最終官能基化度でカチオン（例えば、アルギニン）と結合したキトサン及び約５％～約２５％の最終官能度で親水性ポリオール（例えば、グルコースまたはグルコン酸）と結合したキトサンを含む。一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約７．５％～約３５％の最終官能基化度でカチオン（例えば、アルギニン）と結合したキトサン及び約７．５％～約２０％の最終官能度で親水性ポリオール（例えば、グルコースまたはグルコン酸）と結合したキトサンを含む。一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約１０％～約３５％の最終官能基化度でカチオン（例えば、アルギニン）と結合したキトサン及び約７．５％～約１５％、または約１０％の最終官能度で親水性ポリオール（例えば、グルコースまたはグルコン酸）と結合したキトサンを含む。
一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約１０％～約３０％の最終官能基化度でカチオン（例えば、アルギニン）と結合したキトサン及び約２％～約３０％の最終官能度で親水性ポリオール（例えば、グルコースまたはグルコン酸）と結合したキトサンを含む。一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約１２％～約３０％の最終官能基化度でカチオン（例えば、アルギニン）と結合したキトサン及び約５％～約２５％の最終官能度で親水性ポリオール（例えば、グルコースまたはグルコン酸）と結合したキトサンを含む。一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約１４％～約３０％の最終官能基化度でカチオン（例えば、アルギニン）と結合したキトサン及び約７．５％～約２０％の最終官能度で親水性ポリオール（例えば、グルコースまたはグルコン酸）と結合したキトサンを含む。一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約１５％～約３０％の最終官能基化度でカチオン（例えば、アルギニン）と結合したキトサン及び約７．５％～約１５％、または約１０％の最終官能度で親水性ポリオール（例えば、グルコースまたはグルコン酸）と結合したキトサンを含む。
一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約２５％の最終官能基化度でカチオン（例えば、アルギニン）と結合したキトサン及び約７．５％～約１５％の最終官能度で親水性ポリオール（例えば、グルコースまたはグルコン酸）と結合したキトサンを含む。一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約２８％の最終官能基化度でカチオン（例えば、アルギニン）と結合したキトサン及び約７．５％～約１５％の最終官能度で親水性ポリオール（例えば、グルコースまたはグルコン酸）と結合したキトサンを含む。一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約２５％の最終官能基化度でカチオン（例えば、アルギニン）と結合したキトサン及び約５％～約２０％の最終官能度で親水性ポリオール（例えば、グルコースまたはグルコン酸）と結合したキトサンを含む。一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約２８％の最終官能基化度でカチオン（例えば、アルギニン）と結合したキトサン及び約５％～約２０％の最終官能度で親水性ポリオール（例えば、グルコースまたはグルコン酸）と結合したキトサンを含む。
好ましい実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約１４％の最終官能基化度でカチオン（例えば、アルギニン）と結合したキトサン及び約１０％の最終官能度で親水性ポリオール（例えば、グルコースまたはグルコン酸）と結合したキトサンを含む。好ましい実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約１５％の最終官能基化度でカチオン（例えば、アルギニン）と結合したキトサン及び約１２％の最終官能度で親水性ポリオール（例えば、グルコースまたはグルコン酸）と結合したキトサンを含む。別の好ましい実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約１４％の最終官能基化度でアルギニンと結合したキトサン及び約１０％の最終官能度でグルコースと結合したキトサンを含む。別の好ましい実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約１５％の最終官能基化度でアルギニンと結合したキトサン及び約１２％の最終官能度でグルコースと結合したキトサンを含む。
好ましい実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約２８％の最終官能基化度でカチオン（例えば、アルギニン）と結合したキトサン及び約１０％の最終官能度で親水性ポリオール（例えば、グルコースまたはグルコン酸）と結合したキトサンを含む。別の好ましい実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約２８％の最終官能基化度でアルギニンと結合したキトサン及び約１０％の最終官能度でグルコースと結合したキトサンを含む。
いくつかの実施形態では、必要に応じて、ＤＤ－キトサンは、ＤＤ－キトサン誘導体、例えば、追加の官能基化を組み込んだＤＤキトサン、例えば、結合したリガンドを有するＤＤ－キトサン、を含む。「誘導体」は、共有結合的に修飾されたＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン及び／またはＤ－グルコサミンユニットを含むキトサン系ポリマー、ならびに他のユニットを組み込むかまたは他の部分に結合したキトサン系ポリマー、の幅広い分類を含むと理解されるであろう。誘導体は、多くの場合、アルギニン官能基化キトサンで行われるように、グルコサミンのヒドロキシル基またはアミン基の修飾に基づく。キトサン誘導体の例としては、トリメチル化キトサン、ＰＥＧ化キトサン、チオール化キトサン、ガラクトシル化キトサン、アルキル化キトサン、ＰＥＩ組み込みキトサン、ウロン酸修飾キトサン、グリコールキトサンなどが挙げられるが、これらに限定されない。キトサン誘導体に関するさらなる教示について、例えば、ｐｐ．６３－７４ ｏｆ “Ｎｏｎ－ｖｉｒａｌ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ”，Ｋ．Ｔａｉｒａ，Ｋ．Ｋａｔａｏｋａ，Ｔ．Ｎｉｉｄｏｍｅ（ｅｄｉｔｏｒｓ），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ Ｔｏｋｙｏ，２００５，ＩＳＢＮ ４－４３１－２５１２２－７；Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２００７，ｖｏｌ．５２（２３），ｐｐ．３２０７－３２１５；及びＶａｒｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ５５（２００４）７７－９３を参照のこと。
２．２．キトサン核酸ポリプレックス
キトサン誘導体ナノ粒子組成物は、一般に、少なくとも１つの核酸分子、好ましくは、複数のそのような核酸分子を含む。代表的な核酸分子は、例えば、複数のホスホジエステルまたはその誘導体（例えば、ホスホロチオアート）の形態で、核酸骨格の構成成分としてリンを含む。カチオン官能基化キトサン誘導体対核酸の比は、カチオン（＋）対リン（Ｐ）モル比を特徴とすることができ、（＋）は、カチオン官能基化キトサン誘導体のカチオンを指し、（Ｐ）は、核酸骨格のリンを指す。通常、（＋）：（Ｐ）モル比は、キトサン－誘導体－核酸複合体が、ＰＥＧ－ＰＡポリマー分子の不存在下で正電荷を有するように選択される。従って、（＋）：（Ｐ）モル比は、一般に、１より大きい。好ましい実施形態では、（＋）：（Ｐ）モル比は、１．５超、少なくとも２、または２超である。特定の好ましい実施形態では、（＋）：（Ｐ）モル比は、２より大きい。
一部の場合では、（＋）：（Ｐ）モル比は、３：１であるか、または約３：１である。一部の場合では、（＋）：（Ｐ）モル比は、４：１であるか、または約４：１である。一部の場合では、（＋）：（Ｐ）モル比は、５：１であるか、または約５：１である。一部の場合では、（＋）：（Ｐ）モル比は、６：１であるか、または約６：１である。一部の場合では、（＋）：（Ｐ）モル比は、７：１であるか、または約７：１である。一部の場合では、（＋）：（Ｐ）モル比は、８：１であるか、または約８：１である。一部の場合では、（＋）：（Ｐ）モル比は、９：１であるか、または約９：１である。一部の場合では、（＋）：（Ｐ）モル比は、１０：１であるか、または約１０：１である。
一部の場合では、（＋）：（Ｐ）モル比は、１超～約２０：１以下、約２～約２０：１以下、または約２～約１０：１以下である。一部の場合では、（＋）：（Ｐ）モル比は、約２超～約２０：１以下、または約２超～約１０：１以下である。一部の場合では、（＋）：（Ｐ）モル比は、約３～約２０：１以下、約３～約１０：１以下、約３～約８：１以下、または約３～約７：１以下である。一部の場合では、（＋）：（Ｐ）モル比は、約３～２０：１以下、約３～１０：１以下、約３～８：１以下、または約３～７：１以下である。
特定の実施形態では、（＋）：（Ｐ）モル比は、１００：１、好ましくは、１００：１未満である。例えば、特定の実施形態では、（＋）：（Ｐ）モル比は、１超～１００：１以下であり得る。一部の場合では、（＋）：（Ｐ）モル比は、２超～１００：１以下であり得る。一部の場合では、（＋）：（Ｐ）モル比は、３以上～１００：１以下であり得る。一部の場合では、（＋）：（Ｐ）モル比は、５以上～１００：１以下であり得る。一部の場合では、（＋）：（Ｐ）モル比は、７以上～１００：１以下であり得る。一部の場合では、（＋）：（Ｐ）モル比は、２超～５０：１以下であり得る。一部の場合では、（＋）：（Ｐ）モル比は、３以上～５０：１以下であり得る。一部の場合では、（＋）：（Ｐ）モル比は、５以上～５０：１以下であり得る。一部の場合では、（＋）：（Ｐ）モル比は、７以上～５０：１以下であり得る。一部の場合では、（＋）：（Ｐ）モル比は、２超～２５：１以下であり得る。一部の場合では、（＋）：（Ｐ）モル比は、３以上～２５：１以下であり得る。一部の場合では、（＋）：（Ｐ）モル比は、５以上～２５：１以下であり得る。一部の場合では、（＋）：（Ｐ）モル比は、７以上～２５：１以下であり得る。
いくつかの実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子のカチオン官能基は、アミノ基であるか、またはアミノ基を含む。そのようなアミノ官能基化キトサン誘導体ナノ粒子の例としては、グアニジニウムもしくはグアニジニウム基を含む分子、リジン、オルニチン、アルギニン、またはそれらの組み合わせで官能基化されるキトサンを含有するものが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、カチオン官能基は、アルギニンである。アミノ官能基化キトサン誘導体対核酸の比は、アミノ（Ｎ）対リン（Ｐ）モル比を特徴とすることができ、（Ｎ）は、アミノ官能基化キトサン誘導体中のアミノ基の窒素原子を指し、（Ｐ）は、アミノ酸骨格のリンを指す。通常は、Ｎ：Ｐモル比は、キトサン誘導体－核酸複合体が、ＰＥＧ－ＰＡポリマー分子の不存在下で、生理学的に関連するｐＨで正電荷を有するように選択される。従って、Ｎ：Ｐモル比は、一般に、１より大きくなる。好ましい実施形態では、Ｎ：Ｐモル比は、１．５超、少なくとも２、または２超である。特定の好ましい実施形態では、Ｎ：Ｐモル比は、２より大きい。
一部の場合では、Ｎ：Ｐモル比は、３：１であるか、または約３：１である。一部の場合では、Ｎ：Ｐモル比は、４：１であるか、または約４：１である。一部の場合では、Ｎ：Ｐモル比は、５：１であるか、または約５：１である。一部の場合では、Ｎ：Ｐモル比は、６：１であるか、または約６：１である。一部の場合では、Ｎ：Ｐモル比は、７：１であるか、または約７：１である。一部の場合では、Ｎ：Ｐモル比は、８：１であるか、または約８：１である。一部の場合では、Ｎ：Ｐモル比は、９：１であるか、または約９：１である。一部の場合では、Ｎ：Ｐモル比は、１０：１であるか、または約１０：１である。
一部の場合では、Ｎ：Ｐモル比は、１超～約２０：１以下、約２～約２０：１以下、または約２～約１０：１以下である。一部の場合では、Ｎ：Ｐモル比は、約２超～約２０：１以下、または約２超～約１０：１以下である。一部の場合では、Ｎ：Ｐモル比は、約３～約２０：１以下、約３～約１０：１以下、約３～約８：１以下、または約３～約７：１以下である。一部の場合では、Ｎ：Ｐモル比は、約３～２０：１以下、約３～１０：１以下、約３～８：１以下、または約３～７：１以下である。
特定の実施形態では、Ｎ：Ｐモル比は、１００：１、好ましくは、１００：１未満である。例えば、特定の実施形態では、Ｎ：Ｐモル比は、１超～１００：１以下であり得る。一部の場合では、Ｎ：Ｐモル比は、２超～１００：１以下であり得る。一部の場合では、Ｎ：Ｐモル比は、３以上～１００：１以下であり得る。一部の場合では、Ｎ：Ｐモル比は、５以上～１００：１以下であり得る。一部の場合では、Ｎ：Ｐモル比は、７以上～１００：１以下であり得る。一部の場合では、Ｎ：Ｐモル比は、２超～５０：１以下であり得る。一部の場合では、Ｎ：Ｐモル比は、３以上～５０：１以下であり得る。一部の場合では、Ｎ：Ｐモル比は、５以上～５０：１以下であり得る。一部の場合では、Ｎ：Ｐモル比は、７以上～５０：１以下であり得る。一部の場合では、Ｎ：Ｐモル比は、２超～２５：１以下であり得る。一部の場合では、Ｎ：Ｐモル比は、３以上～２５：１以下であり得る。一部の場合では、Ｎ：Ｐモル比は、５以上～２５：１以下であり得る。一部の場合では、Ｎ：Ｐモル比は、７以上～２５：１以下であり得る。
好ましい実施形態では、本ポリプレックスは、２～１００、例えば、２～５０、例えば、２～４０、例えば、２～３０、例えば、２～２０、例えば、２～５、のアミン対リン酸塩（Ｎ／Ｐ）比を有する。好ましくは、Ｎ／Ｐ比は、キトサンの分子量に反比例し、すなわち、小さい分子量の（例えば、二重）誘導体化キトサンは、より高いＮ／Ｐ比を必要とし、逆もまた同様である。
本発明の核酸は、一般に、ホスホジエステル結合を含有することになるが、いくつかの場合では、様々な目的、例えば、安定性及び保護、のいずれかのために組み込まれる代替の骨格または他の修飾または部分を有し得る核酸アナログが含まれる。企図される他のアナログ核酸は、非リボース骨格を有するものを含む。加えて、天然に存在する核酸、アナログ、及びその両方の混合物を作成することができる。核酸は、一本鎖または二本鎖であっても、二本鎖または一本鎖配列の両方の部分を含有してもよい。核酸としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びハイブリッドが挙げられるが、これらに限定されず、核酸は、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドの任意の組み合わせ、ならびにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンタニン、ヒポキサンタニン、イソシトシン、イソグアニンなどを含む塩基の任意の組み合わせを含有する。核酸は、任意の形態のＤＮＡ、三重鎖、二本鎖、または一本鎖、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、デオキシリボザイム、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、キメラ、マイクロＲＮＡ、及びそれらの誘導体を含む任意の形態のＲＮＡを含む。核酸は、限定されないが、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロジアミダートモルホリノオリゴ（ＰＭＯ）、ロックされた核酸（ＬＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、及びトレオース核酸（ＴＮＡ）を含む人工核酸を含む。リンを含まない人工核酸の場合、（＋）：ＰまたはＮ：Ｐ比の同等の測定値は、ヌクレオチド（またはヌクレオチドアナログ）塩基の数により近似することができることが理解されるであろう。
好ましい実施形態では、組成物のポリプレックスは、官能基化前の１１０ｋＤａ未満、より好ましくは、６５ｋＤａ未満、より好ましくは、５０ｋＤａ未満、より好ましくは、４０ｋＤａ未満、最も好ましくは、３０ｋＤａ未満の平均分子量を有するキトサン分子を含む。いくつかの実施形態では、組成物のポリプレックスは、官能基化前の１５ｋＤａ未満、１０ｋＤａ未満、７ｋＤａ未満、または５ｋＤａ未満の平均分子量を有するキトサンを含む。
好ましい実施形態では、ポリプレックスは、平均して、６８０グルコサミンモノマー単位未満、より好ましくは、４００グルコサミンモノマー単位未満、より好ましくは、３１０グルコサミンモノマー単位未満、より好ましくは、２５０グルコサミンモノマー単位未満、最も好ましくは、１９０グルコサミンモノマー単位未満を有するキトサン分子を含む。いくつかの実施形態では、ポリプレックスは、平均して、９５グルコサミンモノマー単位未満、６５グルコサミンモノマー単位未満、４５グルコサミンモノマー単位未満、または３５グルコサミンモノマー単位未満を有するキトサン分子を含む。
キトサン、及び（例えば、二重）誘導体化キトサン核酸ポリプレックスは、限定されないが、本明細書に記載のものを含む、当該技術分野で既知の任意の方法で調製されてもよい。
２．２．１．核酸
上記のように、キトサンポリプレックスは、複数の核酸を含有し得る。一実施形態では、核酸構成成分は、治療用核酸を含む。本（例えば、二重に）誘導体化キトサン核酸ポリプレックスは、当該技術分野で既知の任意の治療用核酸の使用に適する。治療用核酸は、哺乳動物細胞において治療効果を発揮することが可能なＲＮＡ分子である治療用ＲＮＡを含む。治療用ＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ショートヘアピンＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、及び酵素ＲＮＡを含むが、これらに限定されない。治療用核酸は、三重分子を形成するように意図される核酸、タンパク質結合核酸、リボザイム、デオキシリボザイム、及び小さいヌクレオチド分子を含むが、これらに限定されない。
多くのタイプの治療用ＲＮＡが、当該技術分野で既知である。例えば、Ｍｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｎｅｗ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｃｌａｓｓ ｏｆ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ：ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ－ｂａｓｅｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｂｉｏｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．，５，２３８１－２３９２，２０１７；Ｇｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡｉ ｉｓ ｍＲＮＡ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｆｉｎａｌｌｙ ｒｅａｄｙ ｆｏｒ ｐｒｉｍｅ ｔｉｍｅ ？ Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１１７：３６３３－３６４１，２００７；Ａａｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡｉ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．，５９：７５－８６，２００７；Ｄｏｒｓｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，ｓｉＲＮＡｓ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｓ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．，３：３１８－３２９，２００４を参照のこと。これらは、二本鎖低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含む。
治療用核酸は、細胞毒性タンパク質及びプロドラッグを含む治療用タンパク質をコードする核酸も含む。
好ましい実施形態では、核酸構成成分は、治療用核酸構築物を含む。治療用核酸構築物は、治療効果を発揮することが可能な核酸構築物である。治療用核酸構築物は、治療用タンパク質をコードする核酸、ならびに治療用ＲＮＡである転写物を産生する核酸を含んでもよい。治療用核酸は、欠損遺伝子の置き換えもしくは増強として役立つことによる遺伝子治療を行うために、または、治療用産物をコードすることにより、特定の遺伝子産物の欠如を補償するために、使用されてもよい。治療用核酸は、また、内因性遺伝子の発現を阻害してもよい。治療用核酸は、翻訳産物の全てまたは一部をコードしてもよく、細胞中にすでに存在するＤＮＡと再結合して、それにより、遺伝子の欠陥部分を置換することにより機能してもよい。それは、また、タンパク質の一部をコードし、遺伝子産物の共抑制によりその効果を発揮してもよい。好ましい実施形態では、治療用核酸は、ＵＳ２０１１／０１７１３１４（参照により本明細書に明示的に組み込まれる）に開示されているものから選択される。
好ましい実施形態では、治療用核酸は、ホルモン、酵素、サイトカイン、ケモカイン、抗体、マイトジェン因子、成長因子、分化因子、血管新生に影響を与える因子、血餅形成に影響を与える因子、血中グルコースレベルに影響を与える要因、グルコース代謝に影響を与える要因、脂質代謝に影響を与える要因、血中コレステロールレベルに影響を与える要因、血中ＬＤＬまたはＨＤＬレベルに影響を与える要因、細胞アポトーシスに影響を与える要因、食物摂取に影響を与える要因、エネルギー消費に影響を与える要因、食欲に影響を与える要因、栄養素の吸収に影響を与える要因、炎症に影響を与える要因、及び骨形成に影響を与える要因からなる群より選択される治療タンパク質をコードする。インスリン、レプチン、グルカゴンアンタゴニスト、ＧＬＰ－１、ＧＬＰ－２、グレリン、コレシストキニン、成長ホルモン、凝固因子、ＰＹＹ、エリスロポイエチン、炎症阻害剤、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１７アンタゴニスト、ＴＮＦαアンタゴニスト、成長ホルモン放出ホルモン、または副甲状腺ホルモンをコードする治療用核酸が特に好ましい。
２．２．１．１．発現制御領域
好ましい実施形態では、本発明のポリプレックスは、コード領域に作動可能に連結された発現制御領域を含む治療構築物である治療用核酸を含む。治療用構築物は、治療用核酸を生成し、これは、それ自体で治療的であっても、治療用タンパク質をコードしてもよい。
いくつかの実施形態では、治療構築物の発現制御領域は、構成的活性を有する。多くの好ましい実施形態では、治療構築物の発現制御領域は、構成的活性を有さない。これは、治療用核酸の動的発現を提供する。「動的」発現とは、経時的に変化する発現を意味する。動的発現は、検出可能な発現の期間で隔てられた発現が低いまたは存在しない、いくつかのそのような期間を含んでもよい。多くの好ましい実施形態では、治療用核酸は、調節可能なプロモーターに作動可能に連結される。これは、治療用核酸の調節可能な発現を提供する。
発現制御領域は、プロモーター及びエンハンサーなどの調節ポリヌクレオチド（場合により、本明細書ではエレメントと呼ばれる）を含み、これらは、作動可能に連結された治療用核酸の発現に影響を及ぼす。
本明細書に含まれる発現制御エレメントは、細菌、酵母、植物、または動物（哺乳動物もしくは非哺乳動物）由来であり得る。発現制御領域は、全長プロモーター配列、例えば、ネイティブプロモーター及びエンハンサーエレメント、ならびに完全なまたは非変異体機能の全部または一部を保持する（例えば、ある程度の栄養調節または細胞／組織特異的発現を保持する）部分配列またはポリヌクレオチド変異体を含む。本明細書で使用される場合、「機能的」及びその文法的変形という用語は、核酸配列、部分配列、またはフラグメントに関して使用される場合、その配列が、天然の核酸配列の１つ以上の機能（例えば、非変異体または非修飾配列）を有することを意味する。本明細書で使用される場合、「変異体」という用語は、配列の置換、欠失、もしくは付加、または他の修飾（例えば、ヌクレアーゼに耐性のある修飾形態などの化学誘導体）を意味する。
本明細書で使用される場合、「作動可能な連結」という用語は、それらが意図された方法で機能することを可能にするように記載された構成要素の物理的並置を指す。核酸と作動可能に連結された発現制御エレメントの例では、関係は、制御エレメントが核酸の発現を調節するようなものである。通常、転写を調節する発現制御領域は、転写された核酸の５’末端付近（すなわち、「上流」）に並置される。発現制御領域は、また、転写された配列の３’末端（すなわち、「下流」）または転写物内（例えば、イントロン内）に位置することができる。発現制御エレメントは、転写された配列から離れた距離に位置することができる（例えば、核酸から１００～５００、５００～１０００、２０００～５０００以上のヌクレオチド）。発現制御エレメントの具体例は、プロモーターであり、これは、通常、転写された配列の５’に位置する。発現制御エレメントの別の例は、転写された配列の５’もしくは３’、または転写された配列内に位置することができるエンハンサーである。
いくつかの発現制御領域は、動作可能に連結された治療用核酸に調節可能な発現を与える。シグナル（場合により、刺激と呼ばれる）は、そのような発現制御領域に作動可能に連結された治療用核酸の発現を増加または減少させ得る。シグナルに応答して発現を増加させるそのような発現制御領域は、多くの場合、誘導性と呼ばれる。シグナルに応答して発現を減少させるそのような発現制御領域は、多くの場合、抑制性と呼ばれる。通常、そのようなエレメントにより与えられる増加または減少の量は、存在するシグナルの量に比例し、シグナルの量が多い程、発現の増加または減少が大きくなる。
多数の調節可能なプロモーターが、当該技術分野で既知である。好ましい誘導性発現制御領域には、小分子化学化合物で刺激される誘導性プロモーターを含むものを含む。一実施形態では、発現制御領域は、経口的に送達可能であるが、通常は、食品には見られない化学物質に応答する。特定例は、例えば、米国特許第５，９８９，９１０号；同第５，９３５，９３４号；同第６，０１５，７０９号；及び同第６，００４，９４１号に見出すことができる。
一実施形態では、治療構築物は、さらに、組み込み配列を含む。一実施形態では、治療構築物は、単一の組み込み配列を含む。別の実施形態では、治療用構築物は、標的細胞のゲノムに治療用核酸またはその一部を組み込む第１及び第２の組み込み配列を含む。好ましい実施形態では、組み込み配列（複数可）は、マリナー、スリーピング・ビューティー、ＦＬＰ、Ｃｒｅ、ФＣ３１、Ｒ、ラムダからなる群より選択される組み込み手段、ならびに、ＡＡＶ、レトロウイルス、及びレンチウイルスなどの組み込みウイルス由来の組み込み手段と組み合わせて機能的である。
一実施形態では、本組成物は、さらに、治療構築物に加えて非治療構築物を含み、非治療構築物は、第２の発現制御領域に作動可能に連結された組み込み手段をコードする核酸配列を含む。この第２の発現制御領域及び治療用核酸に作動可能に連結された発現制御領域は、同じであっても、異なっていてもよい。組み込みのためにコード化される手段は、好ましくは、マリナー、スリーピング・ビューティー、ＦＬＰ、Ｃｒｅ、ФＣ３１、Ｒ、ラムダ、ならびに、ＡＡＶ、レトロウイルス、及びレンチウイルスなどの組み込みウイルス由来の組み込み手段からなる群より選択される。
さらなる教示については、ＷＯ２００８／０２０３１８（全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる）を参照のこと。一実施形態では、（例えば、二重）誘導体化キトサン核酸ポリプレックスの核酸は、人工核酸である。
好ましい人工核酸としては、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロジアミダートモルホリノオリゴ（ＰＭＯ）、ロックされた核酸（ＬＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、及びトレオース核酸（ＴＮＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態では、ＤＤ－キトサン核酸ポリプレックスの核酸は、治療用核酸である。一実施形態では、治療用核酸は、治療用ＲＮＡである。好ましい治療用ＲＮＡとしては、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ショートヘアピンＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、及び酵素ＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態では、治療用核酸は、ＤＮＡである。
一実施形態では、治療用核酸は、治療用タンパク質をコードする核酸配列を含む。
２．３．ポリオール
キトサン誘導体ナノ粒子は、ポリオールで官能基化することができる。一般に、本発明で有用なポリオールは、通常、親水性である。いくつかの場合では、キトサン誘導体ナノ粒子は、アミノ基などのカチオン構成成分及びポリオールで官能基化される。アミノ基及びポリオールなどのカチオン部分で官能基化されたそのようなキトサン誘導体ナノ粒子は、「二重誘導体化キトサンナノ粒子」と呼ばれる。
いくつかの実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、式ＩＩのポリオールを含む：
Figure 2022524859000003
 （式中、
Ｒ２は、Ｈ及びヒドロキシルから選択され、
Ｒ３は、Ｈ及びヒドロキシルから選択され、
Ｘは、１つ以上のヒドロキシル置換基で任意に置換されたＣ２－Ｃ６アルキレンから選択される）。
いくつかの実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、式ＩＩのポリオール（式中、Ｒ２は、Ｈ及びヒドロキシルから選択され；Ｒ３は、Ｈ及びヒドロキシルから選択され；Ｘは、１つ以上のヒドロキシル置換基で任意に置換されたＣ２－Ｃ６アルキレンから選択される）で官能基化される。
いくつかの実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、式ＩＩＩのポリオールを含む：
Figure 2022524859000004
 （式中、
－－－－－Ｙは、＝Ｏまたは－Ｈ２であり、
Ｒ２は、Ｈ及びヒドロキシルから選択され、
Ｒ３は、Ｈ及びヒドロキシルから選択され、
Ｘは、１つ以上のヒドロキシル置換基で任意に置換されたＣ２－Ｃ６アルキレンから選択され、
Figure 2022524859000005
 は、ポリオール及び誘導体化キトサン間の結合を示す）。
一実施形態では、３～７つの炭素を有する本発明によるポリオールは、１つ以上の炭素－炭素多重結合を有し得る。好ましい実施形態では、本発明によるポリオールは、カルボキシル基を含む。さらに好ましい実施形態では、本発明によるポリオールは、アルデヒド基を含む。本発明によるポリオールがアルデヒド基を含む場合、そのようなポリオールが、開鎖コンフォメーション（アルデヒド）及び環状コンフォメーション（ヘミアセタール）の両方を包含することを、当業者は認識するであろう。
ポリオールの非限定例としては、グルコン酸、トレオン酸、グルコース、及びスレオースが挙げられる。カルボキシル基及び／またはアルデヒド基を有し得るか、または糖類もしくはその酸形態であり得るそのような他のポリオールの例は、米国特許第１０，０４６，０６６号でさらに詳細に記載されており、その開示は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。ポリオールが特定の立体化学に限定されないことを、当業者は認識するであろう。
好ましい実施形態では、ポリオールは、２，３－ジヒドロキシルプロパン酸、２，３，４，５，６，７－ヘキサヒドロキシルヘプタナール；２，３，４，５，６－ペンタヒドロキシルヘキサナール；２，３，４，５－テトラヒドロキシルヘキサナール；及び２，３－ジヒドロキシルプロパナールからなる群より選択されてもよい。
好ましい実施形態では、ポリオールは、Ｄ－グリセリン酸、Ｌ－グリセリン酸、Ｌ－グリセロ－Ｄ－マンノヘプトース、Ｄ－グリセロ－Ｌ－マンノヘプトース、Ｄ－グルコース、Ｌ－グルコース、Ｄ－フコース、Ｌ－フコース、Ｄ－グリセルアルデヒド、及びＬ－グリセルアルデヒドからなる群より選択され得る。
いくつかの実施形態では、ポリオールは、式ＩＶまたは式Ｖの化合物であってよい。
Figure 2022524859000006
好ましい実施形態では、ポリオールは、式ＩＶの化合物である。いくつかの場合では、式ＩＶのポリオールは、還元的アミノ化によりキトサンに結合されている。
カルボキシル基を有する親水性ポリオールは、キトサンまたはアミン官能基化キトサンなどのカチオン官能基化キトサン（例えば、Ａｒｇ結合キトサン（Ａｒｇ－キトサン））に結合されてもよい。いくつかの実施形態では、ポリオールは、６．０±０．３の反応ｐＨで結合される。このｐＨでは、求核置換反応機構に従って、親水性ポリオールのカルボン酸基が、キトサン骨格上の非結合アミンにより攻撃され得る。
天然糖である親水性ポリオールは、還元的アミノ化とそれに続くＮａＣＢＨ３またはＮａＢＨによる還元を使用して、キトサン、例えば、カチオン官能基化キトサン、例えば、アミン官能基化キトサン（例えば、Ａｒｇ結合キトサン（Ａｒｇ－キトサン））に結合されてもよい。
２．４．ポリマー：ポリプレックス組成物
キトサンポリプレックスは、複数のポリマーと混合することができ、ポリマーは、親水性非荷電部分、及び負荷電（アニオン）部分を含む。上記のように、キトサンポリプレックスは、アニオン部分含有ポリマーとの複合体化がない、または複合体化前に正電荷を有するように製剤化される。従って、好適な条件下で、ポリマー構成成分は、キトサン誘導体核酸ポリプレックスと可逆的な電荷：電荷複合体を形成するであろう。いくつかの実施形態では、ポリマー構成成分のポリマーは、非分岐状である。いくつかの実施形態では、ポリマーは、分岐状である。一部の場合では、ポリマー構成成分は、分岐ポリマー及び非分岐ポリマーの混合物を含む。
いくつかの実施形態では、ポリマー構成成分は、投与後、細胞に入った後、及び／またはエンドサイトーシス後に、キトサンポリプレックスから放出される。理論に拘束されることを望むものではないが、ポリプレックス及びアニオン部分含有ポリマーの複合体化することにより、このように形成されたポリプレックス：ポリマー組成物は、トランスフェクション効率を実質的に妨げることなく、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、溶液中、及び／またはｉｎ ｖｉｖｏ安定性の改善を提供し得ると仮定される。いくつかの実施形態では、このように形成されたポリプレックス：ポリマー組成物は、例えば、別途、ポリマー構成成分のない同一のポリプレックスと比較して、粘膜接着特性の低減を提供し得る。
好ましい実施形態では、ポリプレックス：ポリマー組成物は、生理学的ｐＨで、低い正味の正のゼータ電位、正味の中性のゼータ電位、または正味の負のゼータ電位を有する（約＋１０ｍＶ～約－２０ｍＶ）。そのような組成物は、生理学的条件での凝集の減少、及びｉｎ ｖｉｖｏでの遍在するアニオン構成成分への非特異的結合の低減を示し得る。該特性は、細胞と接触して核酸の細胞内放出の増強をもたらすように、そのような組成物の移動を増強（例えば、粘液で拡散の増強）させ得る。
好ましい実施形態では、ポリプレックス：ポリマー粒子組成物は、１０００ｎｍ未満、より好ましくは、５００ｎｍ未満、最も好ましくは、２００ｎｍ未満の平均流体力学的直径を有する。特定の実施形態では、ポリプレックス：ポリマー粒子組成物は、５０ｎｍ～１０００ｎｍ以下、好ましくは、５０ｎｍ～５００ｎｍ以下、最も好ましくは、５０ｎｍ～２００ｎｍ以下の平均流体力学的直径を有する。特定の実施形態では、ポリプレックス：ポリマー粒子組成物は、５０ｎｍ～１７５ｎｍ以下、好ましくは、５０ｎｍ～１５０ｎｍ以下の平均流体力学的直径を有する。特定の実施形態では、ポリプレックス：ポリマー粒子組成物は、７５ｎｍ～１０００ｎｍ以下、好ましくは、７５ｎｍ～５００ｎｍ以下、最も好ましくは、７５ｎｍ～２００ｎｍ以下の平均流体力学的直径を有する。特定の実施形態では、ポリプレックス：ポリマー粒子組成物は、７５ｎｍ～１７５ｎｍ以下、好ましくは、７５ｎｍ～１５０ｎｍ以下の平均流体力学的直径を有する。特定の実施形態では、ポリプレックス：ポリマー粒子組成物は、１００ｎｍ超且つ１７５ｎｍ未満の平均流体力学的直径を有する。
一実施形態では、ポリプレックス：ポリマー組成物は、８０％、少なくとも８０％、または好ましくは９０％、より好ましくは、少なくとも９０％のスーパーコイルＤＮＡ含有量を有する。
一実施形態では、ポリプレックス：ポリマー組成物は、生理学的ｐＨで＋１０ｍＶ～－１０ｍＶ、最も好ましくは、生理学的ｐＨで＋５ｍＶ～－５ｍＶの平均ゼータ電位を有する。
ポリプレックス：ポリマー組成物は、好ましくは、粒径に関して均質である。従って、好ましい実施形態では、組成物は、低い平均多分散度指数（「ＰＤＩ」）を有する。特に好ましい実施形態では、ポリプレックス：ポリマー組成物の分散液は、０．５未満、より好ましくは、０．４未満、より好ましくは、０．３未満、さらにより好ましくは、０．２５未満、最も好ましくは、０．２未満のＰＤＩを有する。
いくつかの場合では、ポリプレックス：ポリマー組成物の分散液は、１回以上の凍結融解サイクル後の上述のＰＤＩ、平均ゼータ電位、％スーパーコイルＤＮＡ、または平均粒径（ｎｍ）もしくはサイズ範囲のうちの１つ以上を示す。いくつかの場合では、ポリプレックス：ポリマー組成物の分散液は、溶液中４℃少なくとも４８時間保存した後の上述のＰＤＩ、平均ゼータ電位、％スーパーコイルＤＮＡ、または平均粒径（ｎｍ）もしくはサイズ範囲のうちの１つ以上を示す。いくつかの場合では、ポリプレックス：ポリマー組成物の分散液は、溶液中、４℃で少なくとも１または２週間以上保存した後の上述のＰＤＩ、平均ゼータ電位、％スーパーコイルＤＮＡ、または平均粒径（ｎｍ）もしくはサイズ範囲のうちの１つ以上を示す。
いくつかの場合では、ポリプレックス：ポリマー組成物の分散液は、凍結乾燥及び再水和後の上述のＰＤＩ、平均ゼータ電位、％スーパーコイルＤＮＡ、または平均粒径（ｎｍ）もしくはサイズ範囲のうちの１つ以上を示す。いくつかの場合では、ポリプレックス：ポリマー組成物の分散液は、噴霧乾燥及び再水和後の上述のＰＤＩ、平均ゼータ電位、％スーパーコイルＤＮＡ、または平均粒径（ｎｍ）もしくはサイズ範囲のうちの１つ以上を示す。いくつかの場合では、ポリプレックス：ポリマー組成物の分散液は、少なくとも２５０μｇ／ｍＬの核酸濃度に（例えば、タンジェンシャルフロー濾過などの限外濾過で）濃縮された場合の上述のＰＤＩ、平均ゼータ電位、％スーパーコイルＤＮＡ、または平均粒径（ｎｍ）もしくはサイズ範囲のうちの１つ以上を示す。いくつかの場合では、ポリプレックス：ポリマー組成物の分散液は、１２５μｇ／ｍＬ～約１，０００μｇ／ｍＬの核酸濃度に濃縮された場合の上述のＰＤＩ、平均ゼータ電位、％スーパーコイルＤＮＡ、または平均粒径（ｎｍ）もしくはサイズ範囲のうちの１つ以上を示す。いくつかの場合では、ポリプレックス：ポリマー組成物の分散液は、１２５μｇ／ｍＬ～約２５，０００μｇ／ｍＬの核酸濃度に濃縮された場合の上述のＰＤＩ、平均ゼータ電位、％スーパーコイルＤＮＡ、または平均粒径（ｎｍ）もしくはサイズ範囲のうちの１つ以上を示す。いくつかの場合では、ポリプレックス：ポリマー組成物の分散液は、１２５μｇ／ｍＬ～約２，０００μｇ／ｍＬの核酸濃度に濃縮された場合の上述のＰＤＩ、平均ゼータ電位、％スーパーコイルＤＮＡ、または平均粒径（ｎｍ）もしくはサイズ範囲のうちの１つ以上を示す。いくつかの場合では、ポリプレックス：ポリマー組成物の分散液は、１２５μｇ／ｍＬ～約５，０００μｇ／ｍＬの核酸濃度に濃縮された場合の上述のＰＤＩ、平均ゼータ電位、％スーパーコイルＤＮＡ、または平均粒径（ｎｍ）もしくはサイズ範囲のうちの１つ以上を示す。いくつかの場合では、ポリプレックス：ポリマー組成物の分散液は、１２５μｇ／ｍＬ～約１０，０００μｇ／ｍＬの核酸濃度に濃縮された場合の上述のＰＤＩ、平均ゼータ電位、％スーパーコイルＤＮＡ、または平均粒径（ｎｍ）もしくはサイズ範囲のうちの１つ以上を示す。
一般に、本明細書に記載のポリプレックス：ポリマー組成物は、まさに、賦形剤、例えば、凍結保護剤、抗凍結剤、界面活性剤、再水和または湿潤剤などがない状態での、良好な溶液の挙動（例えば、安定性及び／または非凝集）（ＰＤＩまたは平均粒径で測定）を示す。いくつかの場合では、本明細書に記載のポリプレックス：ポリマー組成物は、生理液または人工生理液中で、好ましい溶液挙動（例えば、安定性及び／または非凝集（ＰＤＩまたは平均粒径で測定）を示す。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリプレックス：ポリマー組成物は、哺乳動物膀胱内で（例えば、尿と接触して）インキュベートされた場合、及び／または、腸（例えば、結腸、小腸、または大腸、好ましくは、結腸）内でインキュベートされた場合、人工腸液、腸液、人工尿、哺乳動物尿中で安定である。いくつかの実施形態では、ポリプレックス：ポリマー組成物は、本明細書に記載の条件のうちの１つ以上で（例えば、人工腸液中で）、少なくとも約１０分間、または約１０分～約１時間、または少なくとも約１時間、または１時間～約２時間安定である。
上記のように、本明細書に記載のポリプレックス：ポリマー組成物は、好ましくは、組成物において実質的にサイズ安定である。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、平均直径が、６時間、より好ましくは、１２時間、より好ましくは、２４時間、最も好ましくは、４８時間室温で、１００％未満、より好ましくは、５０％未満、最も好ましくは、２５％未満増加するポリプレックス：ポリマー粒子を含む。特に好ましい実施形態では、本発明の組成物は、平均直径が少なくとも２４時間または少なくとも４８時間室温で、２５％未満増加するポリプレックス：ポリマー粒子を含む。
本組成物のポリプレックス：ポリマー粒子は、好ましくは、冷却条件下で実質的にサイズ安定である。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、平均直径が、６時間、より好ましくは、１２時間、より好ましくは、２４時間、最も好ましくは、４８時間、２～８℃で、１００％未満、より好ましくは、５０％未満、最も好ましくは、２５％未満増加するポリプレックス：ポリマー粒子を含む。
本組成物のポリプレックス：ポリマー粒子は、好ましくは、凍結融解条件下で実質的にサイズ安定である。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、平均直径が、－２０～－８０℃で解凍後６時間、より好ましくは、１２時間、より好ましくは、２４時間、最も好ましくは、４８時間室温で、１００％未満、より好ましくは、５０％未満、最も好ましくは、２５％未満増加するポリプレックスを含む。
好ましい実施形態では、組成物は、０．５ｍｇ／ｍｌを超える核酸濃度を有し、沈殿ポリプレックスを実質的に含まない。より好ましくは、組成物は、少なくとも０．６ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは、少なくとも０．７５ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは、少なくとも１．０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは、少なくとも１．２ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは、少なくとも１．５ｍｇ／ｍｌの核酸濃度を有し、沈殿ポリプレックスを実質的に含まない。別の好ましい実施形態では、組成物は、２ｍｇ／ｍｌを超える核酸濃度を有し、沈殿ポリプレックスを実質的に含まない。より好ましくは、組成物は、少なくとも２．５ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは、少なくとも５ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは、少なくとも１５ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは、約２５ｍｇ／ｍｌの核酸濃度を有し、沈殿ポリプレックスを実質的に含まない。いくつかの実施形態では、組成物は、０．５ｍｇ／ｍＬ～約２５ｍｇ／ｍＬの核酸濃度を有し、沈殿ポリプレックスを実質的に含まない。いくつかの実施形態では、組成物は、約２５ｍｇ／ｍＬ以下の核酸濃度を有し、沈殿ポリプレックスを実質的に含まない。組成物を水和させることができる。好ましい実施形態では、組成物は、複合体を形成していない核酸を実質的に含まない。
好ましい実施形態では、ポリプレックス：ポリマー粒子の組成物は、等張である。ポリプレックスの安定性を維持しながら等張性を達成することは、医薬組成物を製剤化するのに非常に望ましく、これらの好ましい組成物は、医薬製剤及び治療用途に十分に適する。
特定の実施形態では、ポリプレックス：ポリマー粒子組成物は、ｐＨを低下させることにより、例えば、ＰＥＧの全部または一部を放出させるためにポリマーコートを脱コートすることが可能である。特定の実施形態では、ポリマーコートは、ポリマーのポリアニオンアンカー領域のｐＫａよりも低いｐＨ条件下で粒子をインキュベートすることにより放出される。例えば、ポリマーコートがポリグルタマートである場合、ポリマーコートは、粒子をポリグルタマートのｐＫａより低いｐＨ、例えば、約４．２５未満のｐＨ、でインキュベートすることにより放出することができる。特定の実施形態では、ポリマーコートは、ポリマーコートのポリアニオンアンカー領域のｐＫａより低い、少なくとも０．２５ｐＨ単位または少なくとも０．５ｐＨ単位下であるｐＨ条件下で粒子をインキュベートすることにより放出することができる。
特定の実施形態では、ポリプレックス：ポリマー粒子組成物は、粒子を高いイオン強度にかけることにより、例えば、ＰＥＧの全部または一部を放出させるためにポリマーコートを脱コートすることが可能である。
理論に拘束されることを望むものでないが、特定の生理学的条件が、本明細書に記載の可逆的にＰＥＧ化されているキトサンＤＮＡポリプレックスの部分的な（例えば、５％超）、実質的な（５０％超）、広範囲の（例えば、９０％超）、または完全な脱コートを促進し得ると仮定される。例えば、特定の細胞内区画（例えば、エンドソーム、初期エンドソーム、後期エンドソーム、またはリソソーム）の低ｐＨ条件は、ポリマーコートの放出を促進し得る。別の例として、特定の細胞外条件は、本明細書に記載の可逆的にＰＥＧ化されているキトサンＤＮＡポリプレックスの部分的な（例えば、５％超）、実質的な（５０％超）、広範囲の（例えば、９０％超）、または完全な（１００％）脱コートを促進し得る。いくつかの場合では、消化管の特定の位置で通常生じる高いイオン強度及び／または酸性ｐＨ条件は、本明細書に記載の可逆的にＰＥＧ化されているキトサンＤＮＡポリプレックスの部分的な（例えば、５％超）、実質的な（５０％超）、広範囲の（例えば、９０％超）、または完全な（１００％）脱コートを促進し得る。
特定の実施形態では、本明細書に記載のＰＥＧ化ポリプレックスは、細胞、組織、または身体区画（例えば、腸、小腸、大腸、結腸、肺、または膀胱）への送達のために製剤化され、その結果、ポリプレックスがＰＥＧ化されているままであり、それにより、標的細胞へのトランスフェクションを容易にする。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＰＥＧ化ポリプレックスは、細胞内環境への侵入後または侵入中に、部分的に（例えば、５％超）、実質的に（５０％超）、広範囲に（例えば、９０％超）、または完全に（１００％）ポリマーコートを放出する。特定の実施形態では、本明細書に記載のＰＥＧ化ポリプレックスは、細胞、組織、または身体区画（例えば、腸、小腸、大腸、結腸、肺、または膀胱）への送達のために製剤化され、その結果、本明細書に記載のＰＥＧ化ポリプレックスは、細胞、組織、または身体区画（例えば、腸、小腸、大腸、結腸、肺、または膀胱）への送達時に、ポリマーコートを、部分的に（例えば、５％超）、実質的に（５０％超）、広範囲に（例えば、９０％超）、または完全に（１００％）放出する。
ポリマーのアニオンアンカー領域のアニオン電荷密度及び／またはｐＫａは、意図された条件下で放出を促進または阻害するように調整することができることができることが理解されるであろう。同様に、ｐＨ、容積、及びイオン強度、ならびに製剤の他の条件は、意図された条件下での放出を促進または抑制するように調整することができると理解されるであろう。例えば、低ｐＨの胃の環境を介して腸に送達するために、ペグ化ポリプレックス製剤は、胃の環境のｐＨを増強させるために、緩衝剤中で腸溶コーティング及び／または送達することができる。最適化された可逆的にＰＥＧ化されている粒子の組成物及び製剤は、本明細書に記載のアッセイを使用して安定性及びトランスフェクション効率をアッセイすることにより同定することができる。
アニオン部分含有ポリマーと複合体化されたキトサンポリプレックスを含む組成物は、「（＋）：（－）モル比」と称される、（例えば、二重）誘導体化キトサンポリプレックス（＋）のカチオン官能基 対 ポリマー（－）のアニオン部分の比を特徴とすることができる。この（＋）：（－）モル比は、約１：１００～約１０：１未満で変化し得る。
特定の実施形態では、（＋）：（－）モル比は、約１：７５超～約８：１未満であり得る。いくつかの場合では、（＋）：（－）モル比は、１：１０超～１０：１未満であり得る。いくつかのケースでは、（＋）：（－）モル比は、１：１０または約１：１０～１０：１または約１０：１であり得る。いくつかのケースでは、（＋）：（－）モル比は、１：８または約１：８～８：１または約８：１であり得る。特定の実施形態では、（＋）：（－）モル比は、１：５０超～約１０：１未満であり得る。いくつかの場合では、（＋）：（－）モル比は、１：２５超～約１０：１未満であり得る。いくつかの場合では、（＋）：（－）モル比は、１：１０超～約７：１未満であり得る。いくつかの場合では、（＋）：（－）モル比は、１：８超～約７：１未満であり得る。いくつかの場合では、（＋）：（－）モル比は、１：８超～約６：１未満であり得る。
カチオン官能基（例えば、二重）誘導体化キトサンポリプレックスがアミノ部分である特定の実施形態では、アニオン部分含有ポリマーと複合体化されたキトサンポリプレックスを含む組成物は、「Ｎ：Ａモル比」と呼ばれる、（例えば、二重）誘導体化キトサンポリプレックスのアミノ基（Ｎ） 対 ポリマーのアニオン（Ａ）部分の比を特徴とすることができる。このＮ：Ａモル比は、約１：１００超～約１０：１未満で変化し得る。
特定の実施形態では、Ｎ：Ａモル比は、約１：７５超～約８：１未満であり得る。いくつかの場合では、Ｎ：Ａモル比は、１：１０超～１０：１未満であり得る。いくつかのケースでは、Ｎ：Ａモル比は、１：１０または約１：１０～１０：１または約１０：１であり得る。いくつかのケースでは、Ｎ：Ａモル比は、１：８または約１：８～８：１または約８：１であり得る。特定の実施形態では、Ｎ：Ａモル比は、１：５０超～約１０：１未満であり得る。いくつかの場合では、Ｎ：Ａモル比は、１：２５超～約１０：１未満であり得る。いくつかの場合では、Ｎ：Ａモル比は、１：１０超～約７：１未満であり得る。いくつかの場合では、Ｎ：Ａモル比は、１：８超～約７：１未満であり得る。いくつかの場合では、Ｎ：Ａモル比は、１：８超～約６：１未満であり得る。
追加的または代替的に、アニオン部分含有ポリマーと複合体化されたキトサンポリプレックスを含む組成物は、「（＋）：Ｐ：（－）モル比」と呼ばれる、（例えば、二重）誘導体化キトサンポリプレックスのカチオン官能基（＋） 対 核酸のリン原子（Ｐ） 対 ポリマーのアニオン部分（－）の３構成成分比を特徴とすることができる。
（＋）：Ｐが少なくとも２：１～２０：１以下である特定の実施形態では、（＋）：（－）のモル比は、少なくとも１：４０～約４０：１で変化し得る。（＋）：Ｐが少なくとも２：１～２０：１以下である特定の実施形態では、（＋）：（－）のモル比は、少なくとも１：４０～約１：１０で変化し得る。（＋）：Ｐが少なくとも２：１～２０：１以下であるいくつかの実施形態では、（＋）：（－）のモル比は、少なくとも１：２５～約２５：１で変化し得る。（＋）：Ｐが少なくとも２：１～２０：１以下であるいくつかの実施形態では、（＋）：（－）のモル比は、少なくとも１：２５～約１：１０で変化し得る。（＋）：Ｐが少なくとも２：１～２０：１以下であるいくつかの場合では、（＋）：（－）のモル比は、少なくとも１：２０～約２０：１で変化し得る。（＋）：Ｐが少なくとも２：１～２０：１以下であるいくつかの場合では、（＋）：（－）のモル比は、少なくとも１：２０～約１：１０で変化し得る。（＋）：Ｐが少なくとも２：１～２０：１以下であるいくつかの場合では、（＋）：（－）のモル比は、少なくとも１：１０～約１０：１で変化し得る。（＋）：Ｐが少なくとも２：１～２０：１以下であるいくつかの場合では、（＋）：（－）のモル比は、少なくとも１：２５～約２：１で変化し得る。（＋）：Ｐが少なくとも２：１～２０：１以下であるいくつかの場合では、（＋）：（－）のモル比は、少なくとも１：２０～約１：１で変化し得る。
特定の好ましい実施形態では、（＋）：Ｐ：（－）は、３：１：３．５～３：１：１７．５である。特定の好ましい実施形態では、（＋）：Ｐ：（－）は、５：１：３．５～５：１：１７．５である。特定の好ましい実施形態では、（＋）：Ｐ：（－）は、７：１：３．５～７：１：１７．５である。特定の好ましい実施形態では、（＋）：Ｐ：（－）は、約３：１：３．５、３：１：７、３：１：１０、３：１：１５、３：１：１７．５、または３：１：２０である。特定の好ましい実施形態では、（＋）：Ｐ：（－）は、約５：１：３．５、５：１：７、５：１：１０、５：１：１５、５：１：１７．５、または５：１：２０である。特定の好ましい実施形態では、（＋）：Ｐ：（－）は、約７：１：３．５、７：１：７、７：１：１０、７：１：１５、７：１：１７．５、または７：１：２０である。特定の好ましい実施形態では、（＋）：Ｐ：（－）は、約１０：１：１０、１０：１：１５、１０：１：２０、１０：１：２５、１０：１：３０、または１０：１：４０である。
アニオン部分含有ポリマーと複合体化したアミノ官能基化キトサンポリプレックス粒子が、「Ｎ：Ｐ：Ａモル比」と称される、（例えば、二重）誘導体化キトサンポリプレックス（Ｎ）のアミノ官能基 対 核酸（Ｐ）のリン原子 対 ポリマー（Ａ）のアニオン部分の３構成成分比を特徴とすることができることを、当業者は理解するであろう。Ｎ：Ｐが少なくとも２：１～２０：１以下である特定の実施形態では、Ｐ：Ａのモル比は、少なくとも１：４０～約４０：１で変化し得る。
Ｎ：Ｐが少なくとも２：１～２０：１以下である特定の実施形態では、Ｐ：Ａのモル比は、少なくとも１：４０～約１：１０で変化し得る。Ｎ：Ｐが少なくとも２：１～２０：１以下である特定の実施形態では、Ｐ：Ａのモル比は、少なくとも１：２５～約２５：１で変化し得る。Ｎ：Ｐが少なくとも２：１～２０：１以下である特定の実施形態では、Ｐ：Ａのモル比は、少なくとも１：２５～約１：１０で変化し得る。Ｎ：Ｐが少なくとも２：１～２０：１以下であるいくつかの場合では、Ｐ：Ａのモル比は、少なくとも１：２０～約２０：１で変化し得る。Ｎ：Ｐが少なくとも２：１～２０：１以下であるいくつかの場合では、Ｐ：Ａのモル比は、少なくとも１：２０～約１：１０で変化し得る。Ｎ：Ｐが少なくとも２：１～２０：１以下であるいくつかの場合では、Ｐ：Ａのモル比は、少なくとも１：１０～約１０：１で変化し得る。Ｎ：Ｐが少なくとも２：１～２０：１以下であるいくつかの場合では、Ｐ：Ａのモル比は、少なくとも１：２５～約２：１で変化し得る。Ｎ：Ｐが少なくとも２：１～２０：１以下であるいくつかの場合では、Ｐ：Ａのモル比は、少なくとも１：２０～約１：１で変化し得る。
特定の好ましい実施形態では、Ｎ：Ｐ：Ａは、３：１：３．５～３：１：１７．５である。特定の好ましい実施形態では、Ｎ：Ｐ：Ａは、５：１：３．５～５：１：１７．５である。特定の好ましい実施形態では、Ｎ：Ｐ：Ａは、７：１：３．５～７：１：１７．５である。特定の好ましい実施形態では、Ｎ：Ｐ：Ａは、１０：１：１０～１０：１：４０である。特定の好ましい実施形態では、Ｎ：Ｐ：Ａは、約３：１：３．５、３：１：７、３：１：１０、３：１：１５、３：１：１７．５、または３：１：２０である。特定の好ましい実施形態では、Ｎ：Ｐ：Ａは、約５：１：３．５、５：１：７、５：１：１０、５：１：１５、５：１：１７．５、または５：１：２０である。特定の好ましい実施形態では、Ｎ：Ｐ：Ａは、約７：１：３．５、７：１：７、７：１：１０、７：１：１５、７：１：１７．５、または７：１：２０である。特定の実施形態では、Ｎ：Ｐ：Ａは、約１０：１：１０、１０：１：１５、１０：１：２０、１０：１：２５、１０：１：３０、または１０：１：４０である。
２．４．１．親水性非荷電部分
ポリマーの親水性非荷電部分は、ポリアルキレンポリオールもしくはポリアルキレンオキシポリオール部分、またはそれらの組み合わせであり得るか、またはそれらを含み得る。ポリマーの親水性非荷電部分は、ポリアルキレングリコールまたはポリアルキレンオキシグリコール部分であり得るか、またはそれらを含み得る。特定の実施形態では、ポリアルキレングリコール部分は、ポリエチレングリコール部分及び／またはモノメトキシポリエチレングリコール部分であるか、またはそれらを含む。特定の好ましい実施形態では、ポリマーの非荷電部分は、ポリエチレングリコールであるか、またはそれを含む。ポリマーの親水性非荷電部分は、ポリ乳酸などの他の生物学的に適合性のあるポリマー（複数可）であり得るか、またはそれを含み得る。
ＰＥＧに加えて、いくつかの親水性の非荷電実体が当該技術分野で既知である。例えば、Ｌｏｗｅ ｅｔ．ａｌ．，Ａｎｔｉｂｉｏｆｏｕｌｉｎｇ ｐｏｌｙｍｅｒ ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ：ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ，Ｐｏｌｙｍ．Ｃｈｅｍ．，６，１９８－２１２，２０１５、及びＫｎｏｐ ｅｔ．ａｌ．，Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ：Ｐｒｏｓ ａｎｄ Ｃｏｎｓ ａｓ Ｗｅｌｌ ａｓ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｓ．Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，４９（３６），６２８８－６３０８，２０１０を参照のこと。ポリマーの親水性非荷電部分の例は、ポリ（グリセロール）、ポリ（２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）、ポリ（スルホベタインメタクリラート）、及びポリ（カルボキシベタインメタクリラート）、ポリ（２－メチル－２－オキサゾリン）、ポリ（２－エチル－２－オキサゾリン）、及びポリ（ビニルピロリドン）であるが、これらに限定されない。
親水性部分は、約５００Ｄａ～約５０，０００Ｄａの重量平均分子量を有し得る。いくつかの実施形態では、親水性部分は、約１，０００Ｄａ～約１０，０００Ｄａの重量平均分子量を有する。特定の実施形態では、親水性部分は、約１，５００Ｄａ～約７，５００Ｄａの重量平均分子量を有する。特定の実施形態では、親水性部分は、約３，０００Ｄａ～約５，０００Ｄａの重量平均分子量を有する。いくつかの場合では、親水性部分は、５，０００Ｄａまたは約５，０００Ｄａの重量平均分子量を有する。
２．４．２．アニオンポリマー部分
ポリマーのアニオンポリマー部分は、生理学的ｐＨで負電荷を有する複数の官能基を含み得る。多種多様なアニオンポリマーは、本明細書に記載の方法及び組成物での使用に適する。但し、そのようなアニオンポリマーは、親水性非荷電ポリマー部分を有するポリマーの構成成分として提供することができ、正荷電（例えば、二重）誘導体化キトサン－核酸ナノ粒子との（例えば、可逆的）電荷：電荷複合体を形成可能である。
例示的なアニオンポリマーとしては、生理学的ｐＨで正味の負電荷を有するポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの場合では、ポリペプチドまたはその一部は、生理学的ｐＨで負荷電側鎖を有するアミノ酸からなる。例えば、ポリマーのアニオンポリマー部分は、ポリグルタマートポリペプチド、ポリアスパラタートポリペプチド、またはそれらの混合物であり得る。追加のアミノ酸またはその模倣物は、ポリアニオンポリペプチドに組み込むことができる。例えば、グリシン及び／またはセリンアミノ酸は、柔軟性を増加させるか、または２次構造を低減させるために組み込むことができる。
いくつかの場合では、アニオンポリマーは、アニオン炭水化物ポリマーであるか、またはそれを含み得る。例示的なアニオン炭水化物ポリマーとしては、生理学的ｐＨで負電荷を有するグリコサミノグリカンが挙げられるが、これらに限定されない。例示的なアニオングリコサミノグリカンとしては、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパリン硫酸、ヒアルロン酸、またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、ポリマーのアニオンポリマー部分は、ヒアルロン酸であるか、またはヒアルロン酸を含む。
追加または代替のアニオン炭水化物ポリマーは、デキストラン硫酸を含むポリマーを含み得る。
いくつかの場合では、ポリアニオン部分は、ポリメタクリル酸及びその塩、ポリアクリル酸及びその塩、メタクリル酸のコポリマー及びその塩、ならびにアクリル酸及び／またはメタクリル酸のコポリマー及びその塩、例えば、ポリアルキレンオキシド、ポリアクリル酸コポリマーからなる群より選択されるポリアニオンであるか、またはそれを含む。
いくつかの場合では、ポリアニオン部分は、アルギナート、カラギーナン、ファーセレラン、ペクチン、キサンタン、ヒアルロン酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、セルロース、酸化セルロース、カルボキシメチルセルロース、クロスマルメロース、ペンダントカルボキシル基を含有する合成ポリマー及びコポリマー、リン酸基または硫酸基、主に負電荷のポリアミノ酸、ならびに生体適合性ポリフェノール材料からなる群より選択されるポリアニオンであるか、またはそれらを含む。
ポリマーのアニオン部分は、約５００Ｄａ～約５，０００Ｄａの重量平均分子量を有し得る。いくつかの実施形態では、アニオン部分は、約５００Ｄａ～約３，０００Ｄａの重量平均分子量を有する。特定の実施形態では、アニオン部分は、約５００Ｄａ～約２，５００Ｄａの重量平均分子量を有する。特定の実施形態では、アニオン部分は、約５００Ｄａ～約２，０００Ｄａの重量平均分子量を有する。特定の実施形態では、アニオン部分は、約５００Ｄａ～約１，５００Ｄａの重量平均分子量を有する。いくつかの実施形態では、アニオン部分は、約１，０００Ｄａ～約５，０００Ｄａの重量平均分子量を有する。いくつかの実施形態では、アニオン部分は、約１，０００Ｄａ～約３，０００Ｄａの重量平均分子量を有する。特定の実施形態では、アニオン部分は、約１，０００Ｄａ～約２，５００Ｄａの重量平均分子量を有する。特定の実施形態では、アニオン部分は、約１，０００Ｄａ～約２，０００Ｄａの重量平均分子量を有する。いくつかの場合では、アニオン部分は、１，５００Ｄａまたは約１，５００Ｄａの重量平均分子量を有する。
本明細書で使用される場合、「ブロックコポリマー」、「ブロックコ－ポリマー」などは、別個のホモポリマー領域を含有するコポリマーを指す。二元ブロックコポリマーは、２つの異なるホモポリマー領域を含有する。三元コポリマーは、３つの異なるホモポリマー領域を含有する。３つの異なる領域が、それぞれ、異なり（例えば、ＡＡＡＡ－ＢＢＢＢ－ＣＣＣＣ）得るか、または２つの領域が、同じ（例えば、ＡＡＡＡ－ＢＢＢＢ－ＡＡＡＡ）、類似（例えば、ＡＡＡＡ－ＢＢＢＢ－ＡＡＡ）であり得、「Ａ」、「Ｂ」、及び「Ｃ」は、コポリマーを形成する異なるモノマーサブユニットが含まれることを表す。例えば、「Ａ」は、ポリエチレングリコールのホモポリマーのエチレングリコールモノマーサブユニットを表し得、Ｂは、ポリグルタミン酸ホモポリマーのグルタミン酸サブユニットを表し得る。ブロックコポリマーは、線状（例えば、二元または三元）ブロックコポリマーであり得る。本発明で使用される線状二元ブロック及び三元ブロックコポリマーの例示的な実施形態としては、以下の限定的なリストに列挙されているものが挙げられる。
Figure 2022524859000007
Figure 2022524859000008
一実施形態では、ブロックコポリマーは、以下の構造を有するＰＥＧ－ポリグルタミン酸ポリマーであるか、またはそれを含む。
Figure 2022524859000009
一実施形態では、ブロックコポリマーは、以下の構造を有するＰＥＧ－ポリアスパラギン酸ポリマーであるか、またはそれを含む。
Figure 2022524859000010
一実施形態では、ブロックコポリマーは、以下の構造を有するＰＥＧ－ヒアルロン酸ポリマーであるか、またはそれを含む。
Figure 2022524859000011
２．５．作成方法
上記のように、本発明のポリプレックス：ポリマー粒子が、様々な方法で生成され得ることを、当業者は理解するであろう。例えば、ポリプレックス粒子を生成し、その後、ポリマーと接触させることができる。例示的な非限定的な実施形態では、ポリプレックス粒子は、官能基化キトサン及びヌクレオチド原料を提供及び組み合わせることにより調製される。原料濃度は、様々なアミノ対リン酸塩（Ｎ／Ｐ）比、混合比、及び標的ヌクレオチド濃度に適応するように調整されてもよい。いくつかの実施形態、特に小さなバッチ、例えば、２ｍＬ未満のバッチでは、官能基化キトサン、及びヌクレオチド原料は、容器をボルテックスしながら、官能基化キトサン原料にヌクレオチド原料を徐々に滴下することにより混合されてもよい。他の実施形態では、官能基化キトサン及びヌクレオチド原料は、２つの流体流をインライン混合することにより混合されてもよい。他の実施形態では、得られるポリプレックス分散液は、限外濾過（例えば、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ））または溶媒蒸発（例えば、凍結乾燥または噴霧乾燥）などの当該技術分野で既知の手段で濃縮されてもよい。ポリプレックス形成のための好ましい方法は、ＷＯ２００９／０３９６５７（全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる）に開示される。
同様に、ポリプレックス粒子原料（例えば、ポリプレックス組成物を含む水溶液）は、提供し（例えば、上記の反応混合物から単離し）、ポリマー原料（例えば、ポリマーを含む水溶液）と混合することができる。原料濃度は、様々なアミノ対アニオン比（Ｎ／Ａ）、アミノ対リン比（Ｎ：Ｐ）、Ｎ：Ｐ：Ａ比、混合比、及び標的ヌクレオチド濃度に適応するように調整されてもよい。いくつかの実施形態、特に小さなバッチ、例えば、２ｍＬ未満のバッチでは、原料は、容器をボルテックスしながら、第２の原料（例えば、ポリマー）に第１の原料（例えば、ポリプレックス）を徐々に滴下することにより、混合されてもよい。他の実施形態では、原料は、２つの流体流をインライン混合することにより混合されてもよい。他の実施形態では、得られるポリプレックス：ポリマー複合体分散液は、限外濾過（例えば、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ））または溶媒蒸発（例えば、凍結乾燥または噴霧乾燥）などの当該技術分野で既知の手段により濃縮されてもよい。
いくつかの実施形態では、ポリプレックス：ポリマー組成物は、コアシェルタイプの粒子組成物を含み、粒子は、ポリプレックスコア及び非共有結合的に結合している（例えば、放出可能な）ポリマーシェルを含む。理解されるように、そのようなコアシェルタイプの組成物を作製するための１つの方法は、ポリプレックスを形成し、その後、上記のようにポリマー原料と組み合わせることを含む。
あるいは、ポリプレックス：ポリマー組成物は、核酸、誘導体化キトサン、及び少なくとも１つのポリアニオン（ＰＡ）アンカー領域及び少なくとも１つの親水性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）尾部領域を含む複数の線状ブロックコポリマーが、ポリプレックス：ポリマー組成物を形成するために適切な比で混合される１段階法で行うことができる。理論に拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、そのような１段階法が、ｉｎ ｖｉｖｏ粘膜拡散が制限される特定の適応症において有利であり得るより小さな粒径を生成し得る。
３．粉末製剤
本発明のポリプレックス：ポリマー組成物は、粉末を含む。好ましい実施形態では、本発明は、乾燥粉末ポリプレックス：ポリマー組成物を提供する。好ましい実施形態では、乾燥粉末ポリプレックス：ポリマー組成物は、本発明のキトサン－核酸ポリプレックス分散液の脱水（例えば、噴霧乾燥または凍結乾燥）により生成される。
４．医薬製剤
本発明は、また、本発明のポリプレックス：ポリマー組成物を含む「薬学的に許容される」または「生理学的に許容される」製剤を提供する。そのような製剤は、処置方法を実施するために、対象にｉｎ ｖｉｖｏで投与することができる。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」及び「生理学的に許容される」という用語は、好ましくは、過度の有害な副作用（例えば、悪心、腹痛、頭痛など）を生じさせることなく、対象に投与することができる担体、希釈剤、賦形剤などを指す。投与のためのそのような調製物は、滅菌水溶液または非水溶液、懸濁液、及び乳濁液を含む。液体製剤は、懸濁剤、溶剤、シロップ剤、及びエリキシル剤を含む。液体製剤は、固体の再構成により調製されてもよい。
医薬製剤は、対象への投与と適合性のある担体、希釈剤、賦形剤、溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などから作製することができる。そのような製剤は、錠剤（コーティングされたまたはコーティングされていない）、カプセル剤（ハードまたはソフト）、マイクロビーズ、エマルション剤、散剤、顆粒剤、結晶剤、懸濁剤、シロップ剤、またはエリキシル剤に含有することができる。他の添加剤の中で、補助的な活性化合物及び防腐剤もまた、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、及び不活性ガスなどが存在し得る。
賦形剤は、塩、等張剤、血清タンパク質、緩衝剤もしくは他のｐＨ調整剤、酸化防止剤、増粘剤、非荷電ポリマー、防腐剤、または抗凍結剤を含み得る。本発明の組成物に使用される賦形剤は、さらに、等張剤及び緩衝液または他のｐＨ制御剤を含んでもよい。これらの賦形剤は、好ましい範囲のｐＨ（約６．０～８．０）及び浸透圧（約５０～４００ｍｍｏｌ／Ｌ）を得るために添加されてもよい。好適な緩衝液の例は、酢酸塩、ホウ酸塩、炭酸塩、クエン酸塩、リン酸塩、及びスルホン化有機分子緩衝液である。そのような緩衝液は、０．０１～１．０％（ｗ／ｖ）の濃度で組成物中に存在し得る。等張剤は、当該技術分野で既知のもの、例えば、マンニトール、デキストロース、グルコース、及び塩化ナトリウム、または他の電解質のいずれかから選択されてもよい。好ましくは、等張剤は、グルコースまたは塩化ナトリウムである。等張剤は、それが導入される生物学的環境の浸透圧と同じまたは同様の浸透圧を組成物に与える量で使用されてもよい。組成物中の等張剤の濃度は、使用される特定の等張剤の性質に依存し、約０．１～１０％の範囲であってよい。グルコースが使用される場合、それは、好ましくは、１～５％ｗ／ｖ、より詳細には、５％ｗ／ｖ、の濃度で使用される。等張剤が塩化ナトリウムである場合、それは、好ましくは、最大１％ｗ／ｖ、特に、０．９％ｗ／ｖの量で用いられる。本発明の組成物は、さらに、防腐剤を含有してもよい。防腐剤の例としては、ポリヘキサメチレン－ビグアニジン、塩化ベンザルコニウム、安定したオキシクロロ錯体（Ｐｕｒｉｔｅ（登録商標）として知られているもの）、フェニル酢酸塩、クロロブタノール、ソルビン酸、クロルヘキシジン、ベンジルアルコール、パラベン、及びチメロサールである。通常は、そのような防腐剤は、約０．００１～１．０％の濃度で存在する。さらに、本発明の組成物は、凍結保存剤も含んでもよい。好ましい凍結保存剤は、１００，０００ｇ／モル未満の好ましい分子量のデキストラン、グルコース、スクロース、マンニトール、ラクトース、トレハロース、ソルビトール、コロイド状二酸化ケイ素、１００，０００ｇ／モル未満の分子量のグリセロール及びポリエチレングリコール、またはそれらの混合物である。最も好ましいのは、グルコース、トレハロース、及びポリエチレングリコールである。通常は、そのような凍結保存剤は、約０．０１～１０％の濃度で存在する。
医薬製剤は、意図された投与経路と適合性のあるように製剤化することができる。例えば、経口投与のために、組成物は、賦形剤とともに組み込まれ、錠剤、トローチ剤、カプセル剤、例えば、ゼラチンカプセル剤、またはコーティング、例えば、腸溶性コーティング（Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）またはＳｕｒｅｔｅｒｉｃ（登録商標））の形態で使用される。医薬的に適合性のある結合剤、及び／または補助材料は、経口製剤に含まれ得る。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、以下の成分のいずれか、もしくは同様の性質の化合物を含有し得る：結合剤、例えば、微結晶性セルロース、トラガカントガム、もしくはゼラチン；賦形剤、例えば、デンプンもしくはラクトース；崩壊剤、例えば、アルギン酸、プリモゲル、もしくはコーンスターチ；潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウムもしくは他のステアリン酸塩；滑剤、例えば、コロイド状二酸化ケイ素；甘味料、例えば、スクロースもしくはサッカリン；または、着香剤、例えば、ペパーミント、サリチル酸メチル、もしくは香味料。
製剤は、インプラント及びマイクロカプセル化送達システムを含む制御放出製剤など、身体からの急速な分解または排除から組成物を保護するための担体も含み得る。例えば、モノステアリン酸グリセリルまたはステアリン酸グリセリルなどの時間遅延材料を単独で、またはワックスと組み合わせて用いられてもよい。
坐剤及び他の直腸投与可能な製剤（例えば、浣腸により投与可能なもの）もまた企図される。さらに、直腸送達に関して、例えば、Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｕｃｏｓａｌ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ：ｍｅｍｂｒａｎｅｓ，ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｅｓ，ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ．Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．，２１：１９５－２５６，２００４；Ｗｅａｒｌｅｙ，Ｒｅｃｅｎｔ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｂｙ ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ ｒｏｕｔｅｓ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ．Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．，８：３３１－３９４，１９９１を参照のこと。
投与のための適切な追加の医薬製剤は、当該技術分野で既知のであり、本発明の方法及び組成物に適用可能である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９０）１８ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．；Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ（１９９６）１２ｔｈ ｅｄ．，Ｍｅｒｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ，Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ，Ｎ．Ｊ．；及びＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｓｏｌｉｄ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｔｅｃｈｎｏｎｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，Ｐａ．，（１９９３））。
５．投与
一実施形態では、ポリプレックス：ポリマー組成物の使用は、生理学的ｐＨでのポリプレックスの長期安定性を提供する。これは、有効な粘膜投与を提供する。
粘膜細胞または組織に接触させる多数の投与経路のうちのいずれかが可能であり、特定の経路の選択は、部分的に標的粘膜細胞または組織に依存するであろう。注射器、内視鏡、カニューレ、挿管チューブ、カテーテル、及び他の物品は、投与に使用されてもよい。
対象を処置するための用量または「有効量」は、好ましくは、測定可能または検出可能な範囲に状態の症状のうちの１つ、いくつか、または全てを改善させるのに十分である。但し、障害もしくは状態または症状の進行または悪化の予防または抑制は、申し分のない転帰である。従って、標的組織において治療用核酸を発現することにより処置可能な状態または障害の場合、本発明の方法により治療可能な状態を改善するための治療用ＲＮＡまたは産生される治療用タンパク質の量は、状態及び所望の転帰に依存することになり、当業者により容易に確認することができる。適切量は、処置される状態、望まれる治療効果、及び個々の対象（例えば、対象内の生物学的利用能、性別、年齢など）に依存するであろう。有効量は、関連する生理学的効果を測定することで確認することができる。
獣医の用途もまた、本発明により企図される。従って、一実施形態では、本発明は、処置を必要とする非ヒト哺乳動物に本発明のポリプレックス：ポリマー組成物を投与することを含む、非ヒト哺乳動物を処置する方法を提供する。
５．１．経口投与
本組成物は、経口投与されてもよい。経口投与は、化合物が胃腸管に入るような嚥下を伴ってもよい。本発明の組成物は、また、胃腸管に直接投与されてもよい。
経口投与に適する製剤としては、固体製剤、例えば、錠剤、カプセル剤、粒子またはコーティングされた粒子を含有するコーティングされたカプセル剤、液剤、または散剤、甜剤（液剤充填を含む）、チュー、多粒子及びナノ粒子、ゲル剤、フィルム剤、胚珠、ならびに噴霧剤が挙げられる。
錠剤剤形は、一般に、崩壊剤を含有する。崩壊剤の例としては、デンプングリコール酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルシウムカルボキシメチルセルロース、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、微結晶性セルロース、低級アルキル置換ヒドロキシプロピルセルロース、デンプン、アルファ化デンプン、及びアルギン酸ナトリウムが挙げられる。一般に、崩壊剤は、剤形の１重量％～２５重量％、好ましくは、５重量％～２０重量％を含むであろう。
結合剤は、一般に、錠剤製剤に凝集性を与えるために使用される。好適な結合剤としては、微結晶性セルロース、ゼラチン、糖、ポリエチレングリコール、天然及び合成ガム、ポリビニルピロリドン、アルファ化デンプン、ヒドロキシプロピルセルロース、及びヒドロキシプロピルメチルセルロースが挙げられる。錠剤は、希釈剤、例えば、ラクトース（一水和物、噴霧乾燥一水和物、無水物など）、マンニトール、キシリトール、デキストロース、スクロース、ソルビトール、微結晶性セルロース、デンプン、及び第二リン酸カルシウム二水和物も含有してもよい。
錠剤は、任意に、ラウリル硫酸ナトリウム及びポリソルベート８０などの界面活性剤、ならびに二酸化ケイ素及びタルクなどの流動促進剤も含んでもよい。存在する場合、界面活性剤は、錠剤の０．２重量％～５重量％を含んでもよく、流動促進剤は、錠剤の０．２重量％～１重量％を含んでもよい。
錠剤は、一般に、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、フマル酸ステアリルナトリウム、及びラウリル硫酸ナトリウムとのステアリン酸マグネシウムの混合物などの潤滑剤も含有する。潤滑剤は、一般に、錠剤の０．２５重量％～１０重量％、好ましくは、０．５重量％～３重量％を含む。
他の可能な成分としては、酸化防止剤、着色剤、着香剤、防腐剤、及び矯味剤が挙げられる。
錠剤ブレンドは、錠剤を形成するために直接またはローラーにより圧縮されてもよい。錠剤ブレンドまたはブレンドの一部は、打錠前に、代替的に、湿式、乾式、もしくは溶融造粒、溶融凝固、または押し出されてもよい。最終製剤は、１つ以上の層を含んでもよく、コーティングされてもコーティングされていなくてもよく、さらに、カプセル化されてもよい。
錠剤の製剤化は、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ，Ｖｏｌ．１，ｂｙ Ｈ．Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ ａｎｄ Ｌ．Ｌａｃｈｍａｎ（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８０）に考察される。
ヒトまたは獣医用の使用のための消費可能な経口フィルムは、通常、柔軟な水溶性または水膨潤性の薄膜剤形であり、これは、迅速な溶解または粘膜付着性であってよく、通常、フィルム形成ポリマー、結合剤、溶剤、保湿剤、可塑剤、安定剤または乳化剤、粘度改質剤、及び溶剤を含む。製剤のいくつかの構成成分は、複数の機能を実施し得る。
また、本発明の組成物を含む多粒子ビーズも本発明に含まれる。
他の可能な成分としては、酸化防止剤、着色剤、香味剤及び風味増強剤、防腐剤、唾液刺激剤、冷却剤、共溶媒（油を含む）、皮膚軟化剤、増量剤、消泡剤、界面活性剤、及び矯味剤を含む。
本発明によるフィルムは、通常、剥離可能なバッキング支持体または紙上にコーティングされた水性薄膜の蒸発乾燥により調製される。これは、乾燥オーブンもしくはトンネル、通常は、複合コータードライヤーで、または凍結乾燥もしくは真空化で行われてもよい。
経口投与用の固体製剤は、即時放出及び／または調節放出になるように製剤化されてもよい。放出調節製剤は、遅延放出、徐放性、パルス放出、制御放出、標的放出、及びプログラム放出を含む。
高エネルギー分散液及び浸透圧及びコーティングされた粒子などの他の好適な放出技術が既知である。
５．２．粘膜投与
本発明の組成物は、また、粘膜に投与されてもよい。例えば、組成物は、限定されないが、小腸及び／または大腸及び／または結腸の粘膜細胞または組織を含む胃腸管の粘膜細胞または組織に投与することができる。他の標的粘膜細胞または組織としては、眼、気道上皮、肺、膣、及び膀胱の細胞または組織が挙げられるが、これらに限定されない。
この目的のための代表的な製剤としては、液剤、ゲル剤、ヒドロゲル剤、溶剤、クリーム剤、フォーム剤、フィルム剤、インプラント、スポンジ、繊維剤、散剤、及びマイクロエマルション剤を含む。
本発明の化合物は、鼻腔内または吸入により、通常は、好適な噴射剤の使用に関係なく、ドライパウダー吸入器からの乾燥粉末の形態で（単独で、混合物として、例えば、ラクトースとの乾燥ブレンドで、もしくは混合構成成分粒子として）、または加圧容器、ポンプ、スプレー、アトマイザー、もしくはネブライザーからのエアロゾルスプレー噴霧として、粘膜に投与することができる。
吸入器または通気器で使用されるカプセル剤、発泡剤、及びカートリッジは、本発明の化合物、ラクトースまたはデンプンなどの好適な粉末ベース、及びＩ－ロイシン、マンニトール、またはステアリン酸マグネシウムなどの性能修飾剤の粉末混合物を含有するように製剤化されてもよい。
吸入／鼻腔内投与用の製剤は、即時放出及び／または調節放出になるように製剤化されてもよい。放出調節製剤は、遅延放出、徐放性、パルス放出、制御放出、標的放出、及びプログラム放出を含む。
本発明の化合物は、例えば、坐剤、ペッサリー、または浣腸の形態で、直腸または膣に投与されてもよい。ココアバターは、従来の坐剤ベースであるが、様々な代替品が必要に応じて使用されてもよい。
直腸／膣内投与用の製剤は、即時放出及び／または調節放出になるように製剤化されてもよい。放出調節製剤は、遅延放出、徐放性、パルス放出、制御放出、標的放出、及びプログラム放出を含む。
本発明の化合物は、また、通常は、滴の形態で、眼または耳に直接投与されてもよい。眼及び耳投与に適する他の製剤としては、軟膏剤、生分解性（例えば、吸収性ゲルスポンジ、コラーゲン）及び非生分解性（例えば、シリコーン）インプラント、ウェーハ、レンズ、及び粒子系が挙げられる。製剤は、また、イオントフォレーゼで送達されてもよい。
眼／耳投与用の製剤は、即時放出及び／または調節放出になるように製剤化されてもよい。放出調節製剤は、遅延放出、徐放性、パルス放出、制御放出、標的放出、またはプログラム放出を含む。
６．治療用途
一実施形態では、本発明のポリプレックス：ポリマー組成物は、治療的処置に使用されてもよい。そのような組成物は、本明細書では、場合により、治療用組成物と呼ばれる。
以下で考察されるように、本発明の治療用タンパク質は、治療用核酸を含む本発明のポリプレックス：ポリマー組成物により生成される。以下に記載される本タンパク質の使用は、そのようなタンパク質の使用に影響を与える本ポリプレックス：ポリマー組成物の使用を指す。
本発明での使用が企図される治療用タンパク質は、多種多様な活性を有し、多種多様な障害の処置での使用を見出す。本発明の治療用タンパク質の活性化の以下の記載、及び治療用タンパク質で治療可能な適応は、例示的であり、網羅的であることが意図されない。「対象」という用語は、哺乳動物が好ましく、ヒトが特に好ましい、動物を指す。
治療用タンパク質及び標的疾患の部分的なリストが表４に示される。
Figure 2022524859000012
Figure 2022524859000013
別の実施形態では、本発明の治療用組成物は、治療用タンパク質をコードしない治療用核酸、例えば、治療用ＲＮＡを含む。例えば、疾患及び／または望ましくない細胞または生理学的状態の機序に関与する遺伝子を標的とする治療用ＲＮＡを選択することにより、本組成物は、幅広い疾患及び状態の処置に使用されてもよい。本組成物は、使用される治療用ＲＮＡが標的選択の範囲に関して限定されないような特徴のものである。従って、本組成物は、好適な標的粘膜組織が関与する任意の疾患または状態での使用を見出す。
治療用の実施形態の特定の非限定例が以下に記載される。いくつかの場合では、治療的実施形態は、非粘膜標的組織、細胞、または器官に作用することが意図される。治療効果が非粘膜である場合、本明細書に記載のポリプレックス：ポリマー組成物が接触する細胞または組織は粘膜であり、治療作用は、粘膜標的の遠位にあることが理解される。例えば、粘膜細胞は、ホルモンまたは他の治療薬を産生及び分泌するためにトランスフェクトすることができる。
６．１．高血糖症及び体重
治療用タンパク質は、インスリン及びインスリンアナログを含む。真性糖尿病は、膵臓β細胞からのインスリン産生の欠如（１型）または不十分（２型）により引き起こされる衰弱性代謝性疾患である（Ｕｎｇｅｒ，Ｒ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（１９９８））。ベータ細胞は、食事後の放出のためにインスリンを製造及び貯蔵する特殊な内分泌細胞であり（Ｒｈｏｄｅｓ，ｅｔ．ａｌ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０５：１４５（１９８７））、インスリンは、血液から必要とされる組織へのグルコースの移動を促進するホルモンである。糖尿病患者は、頻繁に血糖レベルを監視しなければならず、多くは、存続するために毎日複数回のインスリン注射を必要とする。しかし、そのような患者がインスリン注射により理想的な血糖値に達することはめったにない（Ｔｕｒｎｅｒ，Ｒ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．ＪＡＭＡ ２８１：２００５（１９９９））。さらに、インスリンレベルの長期上昇は、低血糖ショック及びインスリンに対する身体の応答の脱感作などの有害な副作用をもたらし得る。従って、糖尿病患者は、依然として、心血管疾患、腎疾患、失明、神経損傷、及び創傷治癒障害などの長期合併症を発症する（ＵＫ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｓｔｕｄｙ（ＵＫＰＤＳ）Ｇｒｏｕｐ，Ｌａｎｃｅｔ ３５２，８３７（１９９８））。
本発明の方法により治療可能な障害は、インスリン依存性（１型）または非依存性（２型）糖尿病などの高血糖状態、及び高血糖状態と関連するか、またはそれに起因する生理学的状態または障害を含む。従って、本発明の方法により治療可能な高血糖状態は、また、慢性または急性高血糖症（例えば、糖尿病）と関連する組織病理学的変化を含む。特定例としては、膵臓の変性（β細胞破壊）、腎尿細管石灰化、肝臓の変性、眼の損傷（糖尿病性網膜症）、糖尿病足、口及び歯茎などの粘膜の潰瘍、過剰な出血、血液凝固または創傷治癒の遅延、ならびに冠状動脈性心臓病、脳卒中、末梢血管疾患、脂質異常症、高血圧、及び肥満症のリスクの増加が挙げられる。
本組成物は、グルコースの減少、耐糖能を改善、高血糖状態の処置（例えば、糖尿病）、または高血糖状態と関連するか、もしくはそれに起因する生理学的障害の処置に有用である。そのような障害としては、例えば、糖尿病性ニューロパシー（自律性）、腎症（腎障害）、皮膚感染症及び他の皮膚障害、（例えば、糖尿病性カルブンケルにつながる）傷害または創傷の治癒の減速または遅延、失明につながる可能性がある眼の損傷（網膜症、白内障）、糖尿病足、及び加速性歯周炎が挙げられる。そのような障害としては、冠状動脈性心臓病、脳卒中、末梢血管疾患、脂質異常症、高血圧、及び肥満症を発症するリスクの増加も挙げられる。
本明細書で使用される場合、「高血糖性」または「高血糖症」という用語は、対象の状態に関して使用される場合、対象の血液中に存在する一過性または慢性の異常に高いレベルのグルコースを意味する。状態は、対象が、正常な対象に通常見出されない耐糖能異常または上昇したグルコースの状態（例えば、糖尿病を発症するリスクのある耐糖能異常の亜糖尿病対象、または糖尿病対象）を示すように、グルコース代謝または吸収の遅延により引き起こされる可能性がある。空腹時血漿中グルコース（ＦＰＧ）レベルは、正常血糖の場合、約１１０ｍｇ／ｄｌ未満、グルコース代謝の悪化の場合、１１０～１２６ｍｇ／ｄｌ、糖尿病患者の場合、約１２６ｍｇ／ｄｌ超である。
腸粘膜組織でタンパク質を産生することで治療可能な障害は、肥満症または望ましくない体重も含む。レプチン、コレシストキニン、ＰＹＹ、及びＧＬＰ－１は、空腹感を低減させるか、エネルギー消費を増加させるか、体重減少を誘導するか、または正常なグルコース恒常性を提供する。従って、様々な実施形態では、肥満症または望ましくない体重、または高血糖症を処置する本発明の方法は、レプチン、コレシストキニン、ＰＹＹ、またはＧＬＰ－１をコードする治療用核酸の使用を含む。別の実施形態では、グレリンを標的とする治療用ＲＮＡが使用される。グレリンは、食欲及び空腹感を増加させる。従って、様々な実施形態では、肥満症または望ましくない体重、または高血糖症を処置するための本発明の方法は、グレリンを標的としてその発現を減少させる、治療用ＲＮＡの使用を含む。処置可能な障害は、通常は、肥満症と関連するもの、例えば、血清中／血漿中ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、トリグリセリド、コレステロールの異常な上昇、血管の狭窄または閉塞につながるプラーク形成、高血圧症／脳卒中、冠状動脈性心臓病などのリスクの増加、も含む。
本明細書で使用される場合、「肥満」または「肥満症」という用語は、年齢及び性別が一致する正常な対象と比較して、体重が少なくとも３０％増加する対象を指す。「望ましくない体重」は、一致する正常な対象よりも体重が１％～２９％多い対象、及び体重を減少させるか、または体重の増加を予防することを望む体重に関して正常である対象を指す。
一実施形態では、本発明の治療用タンパク質は、グルカゴンアンタゴニストである。グルカゴンは、膵島におけるβ細胞により産生されるペプチドホルモンであり、グルコース代謝の主要調節因子である（Ｕｎｇｅｒ Ｒ．Ｈ．＆ Ｏｒｃｉ Ｌ．Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３０４：１５１８（１９８１）；Ｕｎｇｅｒ Ｒ．Ｈ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ ２５：１３６（１９７６））。インスリンと同様に、血糖濃度は、グルカゴン分泌を媒介する。しかし、インスリンとは対照的に、グルカゴンは、血糖値の低下に応答して分泌される。それ故、グルカゴンの循環濃度は、空腹時に最も高く、食事中に最も低い。グルカゴンレベルが上昇して、インスリンがグルコース貯蔵を促進するのを抑制し、血中にグルコースを放出するように肝臓を刺激する。グルカゴンアンタゴニストの具体例は、［ｄｅｓ－Ｈｉｓ１、ｄｅｓ－Ｐｈｅ６、Ｇｌｕ９］グルカゴン－ＮＨ２である。ストレプトゾトシン糖尿病ラットは、このグルカゴン拮抗薬の静脈内ボーラス（０．７５μｇ／ｇ体重）から１５分以内に血糖レベルが３７％低下した（Ｖａｎ Ｔｉｎｅ Ｂ．Ａ．ｅｔ．ａｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３７：３３１６（１９９６））。別の実施形態では、本発明は、膵臓からのグルカゴン産生のレベルを減少させる治療用ＲＮＡの使用を含む、糖尿病または高血糖症を処置するための方法を提供する。
別の実施形態では、高血糖状態または望ましくない体重（例えば、肥満）を処置するために有用な本発明の治療用タンパク質は、グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）である。ＧＬＰ－１は、食事中に腸内のＬ細胞から放出されるホルモンであり、これは、インスリン分泌を増加させるために膵臓のβ細胞を刺激する。ＧＬＰ－１は、肥満症及び糖尿病を処置するための魅力的な治療薬となる追加の活性を有する。例えば、ＧＬＰ－１は、胃内容物排出を低減させ、食欲を抑制し、グルカゴン濃度を低減し、β細胞量を増加させ、グルコース依存的にインスリン生合成及び分泌を刺激し、組織のインスリンに対する感受性を増加させる可能性がある（Ｋｉｅｆｆｅｒ Ｔ．Ｊ．，Ｈａｂｅｎｅｒ Ｊ．Ｆ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．Ｒｅｖ．２０：８７６（２０００））。それ故、食事と一致するように腸内のＧＬＰ－１の調節された放出は、高血糖状態または望ましくない体重に対して治療上の利益を提供し得る。ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ ＩＶ）に耐性のあるＧＬＰ－１アナログは、より長い作用期間及び改善された治療効果を提供する。従って、ＧＬＰ－１アナログは、好ましい治療用ポリペプチドである。別の実施形態では、本発明は、ＤＰＰ ＩＶのレベルを減少させる治療用ＲＮＡの使用を含む、糖尿病または高血糖症を処置するための方法を提供する。
別の実施形態では、高血糖状態を処置するのに有用な本発明の治療用タンパク質は、ホルモンレジスチンに対するアンタゴニストである。レジスチンは、食事誘導性及び遺伝的形態の肥満症において発現が上昇する脂肪細胞由来因子である。循環レジスチンの中和は、肥満マウスの血糖値及びインスリン作用を改善する。逆に、正常なマウスにレジスチンを投与すると、耐糖能及びインスリン作用が損なわれる（Ｓｔｅｐｐａｎ ＣＭ ｅｔ．ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４０９：３０７（２００１））。それ故、腸内のレジスチンの生物学的効果に拮抗するタンパク質の産生は、肥満症に関連するインスリン抵抗性及び高血糖状態の効果的な治療法を提供し得る。別の実施形態では、本発明は、脂肪組織におけるレジスチン発現のレベルを減少させる、治療用ＲＮＡの使用を含む、糖尿病または高血糖症を処置するための方法を提供する。
別の実施形態では、高血糖状態または望ましくない体重（例えば、肥満症）を処置するのに有用な本発明の治療用ポリペプチドは、レプチンである。レプチンは、主に脂肪細胞により産生されるが、胃の中で食事に応じて少量も産生される。レプチンは、脂肪細胞の代謝及び体重に関する情報を脳内の食欲センターに伝え、食物摂取量の低減をシグナル伝達し（満腹感を促進し）、身体のエネルギー消費量を増加させる。
別の実施形態では、高血糖状態または望ましくない体重（例えば、肥満症）を処置するのに有用な本発明の治療用ポリペプチドは、脂肪細胞補体関連タンパク質（Ａｃｒｐ３０）のＣ末端球状頭部ドメインである。Ａｃｒｐ３０は、分化した脂肪細胞により産生されるタンパク質である。球状頭部ドメインからなるＡｃｒｐ３０のタンパク質分解切断産物をマウスに投与すると、大幅な体重減少につながる（Ｆｒｕｅｂｉｓ Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９８：２００５（２００１））。
別の実施形態では、高血糖状態または望ましくない体重（例えば、肥満症）を処置するのに有用な本発明の治療用ポリペプチドは、コレシストキニン（ＣＣＫ）である。ＣＣＫは、腸内の特定の栄養素に応答して腸から分泌される胃腸ペプチドである。ＣＣＫ放出は、消費された食物量に比例し、食事を終了することを脳にシグナル伝達をすると考えられる（Ｓｃｈｗａｒｔｚ Ｍ．Ｗ．ｅｔ．ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４０４：６６１－７１（２０００））。従って、ＣＣＫの上昇は、食事のサイズを低減し、体重減少または体重安定化を促進し得る（すなわち、体重増加の増加を防止または抑制する）。
ＰＹＹに関しては、例えば、ｌｅ Ｒｏｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎｕｔｒ Ｓｏｃ．２００５ Ｍａｙ；６４（２）：２１３－６。
６．２．免疫障害
一実施形態では、本発明の治療用組成物は、免疫調節活性を有する。例えば、本発明の治療用ポリペプチドは、免疫細胞の増殖、分化、もしくは動員（走化性）を活性化または抑制することにより、免疫系の欠損または障害を処置するのに有用であり得る。免疫細胞は、造血のプロセスを通して発達し、これは、多能性幹細胞から骨髄性（血小板、赤血球、好中球、及びマクロファージ）ならびにリンパ系（Ｂ及びＴリンパ球）細胞を産生する。これらの免疫不全または障害の病因は、遺伝性、体細胞性、例えば、がんもしくはいくつかの自己免疫障害、（化学療法または毒素による）後天性、または感染性であってよい。
本発明の治療用組成物は、造血細胞の欠損または障害を処置するのに有用であり得る。例えば、本発明の治療用ポリペプチドは、特定の（または多くの）タイプの造血細胞の減少と関連する疾患を処置する目的で、多能性幹細胞を含む造血細胞の分化または増殖を増加させるために使用することができる。免疫不全症候群の例としては、血液タンパク質障害（例えば、無ガンマグロブリン血症、異常ガンマグロブリン血症）、毛細血管拡張性運動失調症、分類不能型免疫不全、ディジョージ症候群、ＨＩＶ感染症、ＨＴＬＶ－ＢＬＶ感染症、白血球接着不全症候群、リンパ球減少症、食細胞の殺菌機能障害、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、ウィスコット－アルドリッチ障害、貧血、血小板減少症、またはヘモグロビン尿症が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の治療用組成物は、また、自己免疫障害を処置するのに有用であり得る。多くの自己免疫疾患は、免疫細胞による異物としての自己の不適切な認識に起因する。この不適切な認識は、宿主組織の破壊につながる免疫応答をもたらす。従って、免疫応答、特に、Ｔ細胞の増殖、分化、または走化性を阻害する本発明の治療用組成物の投与は、自己免疫障害を予防するのに効果的な治療法であってよい。
本発明で処置することができる自己免疫障害の例としては、アディソン病、溶血性貧血、抗リン脂質症候群、関節リウマチ、皮膚炎、アレルギー性脳脊髄炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、多発性硬化症、重症筋無力症、神経炎、眼炎、水疱性類天疱瘡、天疱瘡、多腺性内分泌障害、紫斑病、ライター病、スチィッフマン症候群、自己免疫性甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、自己免疫性肺炎症、ギランバール症候群、インスリン依存性糖尿病、クローン病、潰瘍性大腸炎、及び自己免疫性炎症性眼疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
同様に、喘息（特にアレルギー性喘息）または他の呼吸器系の問題などのアレルギー反応及び状態もまた、本発明の治療用組成物により処置され得る。さらに、これらの分子は、アナフィラキシー、抗原分子に対する過敏症、または血液型の不適合性を処置するために使用することができる。
本発明の治療用組成物は、また、臓器拒絶反応または移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を処置及び／または予防するために使用さてもよい。臓器拒絶反応は、免疫応答を介した移植組織の宿主免疫細胞破壊により生じる。同様に、免疫応答もＧＶＨＤに関与するが、この場合、外来移植された免疫細胞は、宿主組織を破壊する。免疫応答、特にＴ細胞の増殖、分化、または走化性を阻害する本発明の治療用組成物の投与は、臓器拒絶またはＧＶＨＤを予防するのに効果的な治療法であってよい。
同様に、本発明の治療用組成物は、また、炎症を調節するために使用されてもよい。例えば、治療用ポリペプチドは、炎症応答に関与する細胞の増殖及び分化を抑制し得る。これらの分子は、感染症と関連する炎症（例えば、敗血症性ショック、敗血症、または全身性炎症応答症候群（ＳＩＲＳ））、虚血再潅流障害、エンドトキシン致死性、関節炎、膵炎、補体媒介性超急性拒絶反応、腎炎、サイトカインもしくはケモカイン誘発性肺損傷、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病を含む、または、サイトカイン（例えば、ＴＮＦもしくはＩＬ－１）の過剰産生に起因する、慢性及び急性状態の両方の炎症状態を処置するために使用することができる。一実施形態では、ＴＮＦαを標的とする治療的ＲＮＡは、炎症を処置するために、本組成物中で使用される。別の好ましい実施形態では、ＩＬ－１を標的とする治療用ＲＮＡは、炎症を処置するために本組成物において使用される。ｓｉＲＮＡ治療用ＲＮＡが特に好ましい。本発明における処置のための目的の炎症性障害としては、慢性閉塞性肺障害（ＣＯＰＤ）、間質性膀胱炎、及び炎症性腸疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
６．３．凝固障害
いくつかの実施形態では、本発明の治療用組成物は、また、止血（出血の停止）または血栓溶解活性（血栓形成）を調節するために使用されてもよい。例えば、止血または血栓溶解活性を増大させることにより、本発明の治療用組成物は、血液凝固障害（例えば、無フィブリノゲン血症、因子欠損）、血小板障害（例えば、血小板減少症）、または外傷、手術、あるいはその他の原因から生じる創傷を処置するために使用することができる。あるいは、止血または血栓溶解活性を減少させ得る本発明の治療用組成物は、凝固を抑制または溶解するために使用することができる。これらの治療用組成物は、心臓発作（梗塞）、脳卒中、または瘢痕の処置に重要であり得る。一実施形態では、本発明の治療用ポリペプチドは、血友病または他の凝固／凝固障害（例えば、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、または第Ｘ因子）の処置に有用な血栓形成因子である。
６．４．過剰増殖性障害
一実施形態では、本発明の治療用組成物は、細胞増殖を調節することが可能である。そのような治療用ポリペプチドは、新生物を含む過剰増殖性障害を処置するために使用することができる。
本発明の治療組成物により処置することができる過剰増殖性障害の例としては、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭頸部）、神経（中枢及び末梢系）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸郭、及び泌尿生殖器が挙げられるが、これらに限定されない。
同様に、他の過剰増殖性障害は、本発明の治療用組成物で処置することもできる。そのような過剰増殖性障害の例としては、上記の臓器系に位置する新生物に加えて、高ガンマグロブリン血症、リンパ球増殖性障害、異常蛋白血症、紫斑病、サルコイドーシス、セザリー症候群、ワルデンストレームマクログロブリン血症、ゴーチャー病、組織球症、及び他の任意の過剰増殖性疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
循環器系への送達は、多種多様な組織への治療用タンパク質のアクセスを提供する。あるいは、本発明の治療用組成物は、過剰増殖性障害を抑制し得る他の細胞の増殖を刺激してもよい。
例えば、免疫応答を増加させることにより、特に、過剰増殖性障害の抗原特性を増加させることにより、またはＴ細胞を増殖、分化、もしくは動員させることにより、過剰増殖性障害を処置することができる。この免疫応答は、既存の免疫応答を増強するか、または新しい免疫応答を開始することにより、増加し得る。あるいは、免疫応答を減少させることは、また、例えば、化学療法剤を用いて、過剰増殖性障害を処置する方法であってよい。
６．５．感染症
一実施形態では、本発明の治療用組成物は、感染症を処置するために使用することができる。例えば、免疫応答を増加させることにより、特に、Ｂ細胞及び／またはＴ細胞の増殖及び分化を増加させることにより、感染症が処置されてもよい。免疫応答は、既存の免疫応答を増強させることにより、または新しい免疫応答を開始することにより、増加し得る。あるいは、本発明の治療用組成物は、また、直接、必ずしも免疫応答を誘発することなく、感染因子を阻害してもよい。
ウイルスは、本発明の治療用組成物により処置することができる疾患または症状を引き起こす可能性がある感染性因子の一例である。ウイルスの例としては、以下のＤＮＡ及びＲＮＡウイルス科：アルボウイルス科、アデノウイルス科、アルテリウイルス科、ビルナウイルス科、ブニヤウイルス科、カリシウイルス科、サーコウイルス科、コロナウイルス科、フラビウイルス科、ヘパドナウイルス科（肝炎）、ヘルペスウイルス科（例えば、サイトメガロウイルス科、単純ヘルペス、帯状疱疹）、モノネガウイルス科（例えば、パラミクソウイルス科、麻疹ウイルス属、ラブドウイルス科）、オルトミクソウイルス科（例えば、インフルエンザ）、パポバウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、ポックスウイルス科（例えば、天然痘または痘疹）、レオウイルス科（例えば、ロタウイルス）、レトロウイルス科（例えば、ＨＴＬＶ－Ｉ、ＨＴＬＶ－ＩＩ、レンチウイルス）、及びトガウイルス科（例えば、ルビウイルス）が挙げられるが、これらに限定されない。これらのファミリー内に入るウイルスは、限定されないが、関節炎、細気管支炎脳炎、脳炎、眼感染症（例えば、結膜炎、角膜炎）、慢性疲労症候群、肝炎（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅ、慢性活動性、デルタ）、髄膜炎、日和見感染症（例えば、ＡＩＤＳ）、肺炎、バーキットリンパ腫、水痘、出血熱、麻疹、おたふく風邪、パラインフルエンザ、狂犬病、感冒、ポリオ、白血病、風疹、性感染症、皮膚病（例えば、カポジ、疣）、及びウイルス血症を含む、様々な疾患または症状を引き起こし得る。本発明の治療用組成物は、これらの症状または疾患のいずれかを処置するために使用することができる。
同様に、疾患または症状を引き起こす可能性があり、本発明の治療組成物で処置することができる細菌または真菌病原微生物としては、以下のグラム陰性及びグラム陽性細菌科ならびに真菌が挙げられるが、これらに限定されない：放線菌目（例えば、コリネバクテリウム属、マイコバクテリウム属、ノカルディア属）、バシラス科（例えば、炭疽菌、クロストリジウム属）、バクテロイデス科、ブラストマイコーシス、ボルデテラ属、ボレリア属、ブルセラ菌、カンジダ症、カンピロバクター、コクシジオイデス症、クリプトコッカス症、皮膚真菌症、腸内細菌科（クレブシエラ菌、サルモネラ菌、セラシア属、エルシニア属）、エリジペロスリックス属、ヘリコバクター属、レジオネラ症、レプトスピラ症、リステリア菌、マイコプラズマ目、ナイセリア科、（例えば、アシネトバクター、淋病、髄膜炎菌）、パスツレラ症（例えば、アクチノバシラス属、ヘモフィルス属、パスツレラ属）、シュードモナス属、リケッチア科、クラミジア科、梅毒、及びブドウ球菌。これらの細菌または真菌科は、以下の疾患または症状を引き起こす可能性がある：限定されないが、菌血症、心内膜炎、眼感染症（結膜炎、結核、ブドウ膜炎）、歯肉炎、日和見感染症（例えば、ＡＩＤＳ関連感染症）、爪甲周囲炎、プロテーゼ関連感染症、ライター病、気道感染症、例えば、百日咳または蓄膿、敗血症、ライム病、猫引っかき病、赤痢、パラチフス、食中毒、腸チフス、肺炎、淋病、髄膜炎、クラミジア、梅毒、ジフテリア、ハンセン病、ヨーネ病、結核、狼瘡、ボツリヌス中毒症、壊疽、破傷風、膿痂疹、リウマチ熱、猩紅熱、性感染症、皮膚疾患（例えば、蜂巣炎、皮膚真菌症）、毒血症、尿路感染症、創傷感染症など。本発明の治療用組成物は、これらの症状または疾患のいずれかを処置するために使用することができる。
さらに、本発明の治療組成物で処置することができる疾患または症状を引き起こす寄生性病原体としては、以下の科が挙げられるが、これらに限定されない：アメーバ症、バベシア症、コクシジウム症、クリプトスポリジウム症、ジエンタモエビア症、媾疫、外部寄生虫、ジアルジア症、蠕虫症、リーシュマニア症、タイレリア症、トキソプラズマ症、トリパノソーマ症、及びトリコモナス属。これらの寄生虫は、限定されないが、疥癬、トキソプラズマ症、眼感染症、腸疾患（例えば、赤痢、ランブル鞭毛虫症）、肝臓病、肺疾患、日和見感染症（例えば、ＡＩＤＳ関連）、マラリア、妊娠合併症、及びトキソプラズマ症を含む様々な病気または症状を引き起こす可能性がある。本発明の治療用組成物は、これらの症状または疾患のいずれかを処置するために使用することができる。
６．６．再生
本発明の治療用組成物は、細胞を分化、増殖、及び誘引して、粘膜組織または標的粘膜細胞もしくは組織に隣接する組織の再生を促進するために使用することができる。（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６：５９－８７（１９９７）を参照のこと。）組織の再生は、先天性の欠陥、外傷（創傷、火傷、切開、または潰瘍）、年齢、疾患（例えば、骨粗鬆症、変形性関節症、歯周病、肝不全）、美容整形手術を含む手術、線維化、再潅流障害、または全身性サイトカイン損傷により損傷した組織を修復、置換、または保護するために使用することができる。
本発明の治療用組成物は、限定されないが、臓器（例えば、膵臓、肝臓、腸、腎臓、皮膚、内皮）、筋肉（平滑筋、骨格筋、または心筋）、血管（血管内皮を含む）、神経、造血、及び骨格（骨、軟骨、腱、及び靭帯）組織を含む、様々な組織の再生を促進し得る。好ましくは、再生は、少量の瘢痕を生じるか、または瘢痕なしで起こる。再生は、血管新生も含み得る。
さらに、本発明の治療用組成物は、治癒が困難な組織の再生を増加させ得る。例えば、腱／靭帯の再生が増えると、損傷後の回復時間が短縮されるであろう。本発明の治療用組成物は、損傷を回避するために予防的に使用することもできる。処置することができる特定の疾患としては、腱炎、手根管症候群、及び他の腱または靭帯の欠陥が挙げられる。非治癒性創傷の組織再生のさらなる例としては、褥瘡潰瘍、血管不全と関連する潰瘍、外科的及び外傷性創傷が挙げられる。
同様に、神経及び脳組織は、また、本発明の治療用組成物を使用して神経細胞を増殖及び分化させることにより再生することができる。本方法を使用して処置することができる疾患としては、中枢及び末梢神経系疾患、神経障害、または機械的及び外傷性障害（例えば、脊髄障害、頭部外傷、脳血管疾患、及び発作）が挙げられる。具体的には、末梢神経損傷、末梢神経障害（例えば、化学療法または他の医学的治療に起因）、限局性神経障害、及び中枢神経系疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、及びシャイドレーガー症候群）と関連する疾患は、全て、本発明の治療用組成物を使用して処置することができる。ＣＮＳ障害に関して、血液脳関門を破壊する方法、及びＣＮＳへの輸送を提供する部分に治療薬を結合させる方法を含む、脳組織への治療的アクセスを容易にするための多くの手段が当該技術分野で既知である。一実施形態では、治療用核酸は、融合タンパク質をコードするように操作され、この融合タンパク質は、輸送部分及び治療用タンパク質を含む。
６．７．走化性
一実施形態では、本発明の治療用組成物は、走化性を調節し得る。例えば、一実施形態では、本発明の治療用ポリペプチドは、走化性活性を有する。走化性分子は、体内の特定の部位に、例えば、炎症、感染症、または過剰増殖部位に、細胞（例えば、単球、線維芽細胞、好中球、Ｔ細胞、肥満細胞、好酸球、上皮細胞、及び／または内皮細胞）を誘引または動員する。次に、動員された細胞は、特定の外傷または異常を撃退及び／または治癒することができる。
例えば、本発明の治療用ポリペプチドは、特定の細胞の走化性活性を増加させ得る。次に、これらの走化性分子は、体内の特定の場所を標的とする細胞数を増加させることにより、炎症、感染症、過剰増殖性障害、または任意の免疫系障害を処置するために使用することができる。例えば、走化性分子は、損傷した場所に免疫細胞を誘引することにより、組織への創傷及び他の外傷を処置するために使用することができる。本発明の走化性分子は、創傷を処置するために使用することができる線維芽細胞も誘引し得る。
本発明の治療用組成物が走化性活性を阻害し得ることもまた企図される。これらの治療用組成物は、また、障害を処置するために使用することができる。従って、本発明の治療用組成物は、走化性の阻害剤として使用することができる。
標的組織の付近で活性化されるプロ（ｐｒｏ－）治療用タンパク質が、特に、使用に好ましい。
使用が企図される追加の治療用ポリペプチドとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：成長障害または消耗症候群を処置する成長因子（例えば、成長ホルモン、インスリン様成長因子－１、血小板由来成長因子、上皮成長因子、酸性及び塩基性線維芽細胞成長因子、形質転換成長因子－βなど）；ならびに外来抗原もしくは病原体（例えば、Ｈ．Ｐｙｌｏｒｉ）に対して対象の受動免疫もしくは保護を提供するか、またはがん、関節炎、もしくは心血管疾患の処置を提供する抗体（例えば、ヒトもしくはヒト化）；サイトカイン、インターフェロン（例えば、インターフェロン（ＩＦＮ）、ＩＦＮ－α２ｂ及び２α、ＩＦＮ－αＮ１、ＩＦＮ－β１ｂ、ＩＦＮ－ガンマ）、インターロイキン（例えば、ＩＬ－１～ＩＬ－１０）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ－αＴＮＦ－β）、ケモカイン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、ポリペプチドホルモン、抗菌性ポリペプチド（例えば、抗菌性、抗真菌性、抗ウイルス性、及び／または抗寄生虫ポリペプチド）、酵素（例えば、アデノシンデアミナーゼ）、ゴナドトロフィン、ケモタクチン、脂質結合タンパク質、フィルガスチム（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ）、ヘモグロビン、エリスロポイエチン、インスリントロピン、イミグルセラーゼ、サルブラモスティム、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、フェニルアラニンホルモンリアーゼ、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、アデノシンデアミダーゼ、カタラーゼ、カルシトニン、エンドセリン、Ｌ－アスパラギナーゼペプシン、ウリカーゼ、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、カルボキシペプチダーゼ、ラクターゼ、スクラーゼ、内因性因子、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）様ホルモン、可溶性ＣＤ４、ならびに抗体及び／またはその抗原結合フラグメント（例えば、ＦＡｂ）（例えば、オルソクローンＯＫＴ－ｅ（抗ＣＤ３）、ＧＰＩＩｂ／ＩＩａモノクローナル抗体）。さらに、そのような因子をコードする核酸を標的とする治療用ＲＮＡが企図される。
６．８．ワクチン
一実施形態では、本発明は、患者にワクチン接種するための方法を提供する。方法は、所望のエピトープを生成することが可能な本発明の組成物を投与することを含む。好ましい実施形態では、組成物は、エピトープを含むタンパク質を発現することが可能な治療用核酸構築物を含む。
６．９．化粧品用途
一実施形態では、本発明は、美容用途のためのＤＤ－キトサン核酸ポリプレックスを提供する。本化粧品は、美容用途に適する製剤中にＤＤ－キトサン核酸ポリプレックスを含む。
実施例１：
１．一般材料
１．１ プラスミドＤＮＡベクター
Figure 2022524859000014
１．２ 試薬
Figure 2022524859000015
１．３ 消耗品
Figure 2022524859000016
１．４ 機器
Figure 2022524859000017
２．一般的な手順
２．１ 二重誘導体化キトサンの調製
ＵＳ９６２３１１２Ｂ２に従って、アルギニン及びグルコン酸で、キトサンを二重誘導体化（ＤＤ－キトサン、ＤＤ－Ｘ）した。
２．２ 二重誘導体化キトサン及びＤＮＡポリプレックスの調製
ＵＳ９６２３１１２Ｂ２及びＵＳ８７２２６４６Ｂ２に従って、必要に応じて、様々なアミン対リン酸（Ｎ：Ｐ）モル比でプラスミドＤＮＡベクターとともに、ＤＤ－キトサンをポリプレックス化した。必要に応じて、スクロース、トレハロース、またはマンニトールなどの追加の賦形剤が含まれていた。本明細書に示されるように、様々なプラスミドＤＮＡベクターを試験した。
２．３ ＰＥＧ－ポリグルタミン酸（ＰＥＧ－ＰＧＡ）溶液の調製
一般に、必要に応じて最大４０ｍｇ／ｍＬの濃度で水または賦形剤溶液に、ＰＥＧ－ＰＧＡを溶解した。得られたＰＥＧ－ＰＧＡ溶液を、後続の製剤化のためのアミン対リン酸塩対アニオンのモル比（Ｎ：Ｐ：Ａ）の望ましい最終比を得るために、必要なアニオン種（Ａ、すなわち、グルタミン酸）の必要なモル濃度に希釈した。
２．４ ＰＥＧ－ヒアルロン酸（ＰＥＧ－ＨＡ）溶液の調製
一般に、ＰＥＧ－ＨＡを、４０～１００ｍｇ／ｍＬの濃度で水に分配し、１０分間超音波処理した。後続の製剤化のために、アミン対リン酸塩対アニオンモル比（Ｎ：Ｐ：Ａ）の望ましい最終比を得るために、及びトレハロースの最終濃度が５％になるように、得られたＰＥＧ－ＨＡ溶液を、必要な１０％のトレハロース中のアニオン種（Ａ、すなわち、ヒアルロン酸）の必要濃度に希釈した。
２．５ ＰＥＧ－ポリアスパラギン酸（ＰＥＧ－ＰＡＡ）溶液の調製
一般に、ＰＥＧ－ＰＡＡを、４０～１００ｍｇ／ｍＬの濃度で５％のトレハロースに分注し、１０～１５分間超音波処理した。必要に応じて、後続の製剤化のために、アミン対リン酸塩対アニオンモル比（Ｎ：Ｐ：Ａ）の望ましい最終比を得るために、及びトレハロースの最終濃度が５％になるように、得られたＰＥＧ－ＰＡＡ溶液を、必要な５％のトレハロース中のアニオン種（Ａ、すなわち、アスパラギン酸）の必要濃度に希釈した。
２．６ トレハロース溶液の調製
一般に、必要に応じて、トレハロースを、最大０．２ｇ／ｍＬの濃度で水に溶解させた。０．２ｕｍのフィルターを使用して、得られたトレハロースを濾過した。必要に応じて、トレハロース溶液を、後続の製剤化に必要な濃度に希釈した。
２．７ ５０ｍＭのトリス（ｐＨ８）中のＰＡＡ溶液の調製
一般に、必要に応じて、ＰＡＡを、１００ｍｇ／ｍＬまたは２０ｍｇ／ｍＬの濃度で５０ｍＭのトリス（ｐＨ８）に溶解させた。必要に応じて、ＰＡＡ溶液を５０ｍＭのトリス（ｐＨ８）で、その後の必要に応じた必要濃度に希釈した。
２．８ ２０ｍＭのＮａＣｌの調製
４６．７５ｍｇのＮａＣｌを４０ｍＬの水に溶解させる。０．２ｕｍのフィルターで溶液を濾過する。
２．９ 模擬腸液（ＳＩＦ）の調製
２．２４ｍｇ／ｍＬの濃度で水にＦａＳＳＩＦ Ｖ１粉末を溶解させることにより、ＦａＳＳＩＦ Ｖ１溶液を調製した。ｐＨが約６．６であることを確認した。１．７９ｍｇ／ｍＬの濃度で水にＦａＳＳＩＦＶ２粉末を溶解させることにより、ＦａＳＳＩＦＶ２溶液を調製した。ｐＨが約６．６であることを確認した。
２．１０ ＰＥＧ－ポリアニオン（ＰＥＧ－ＰＡ）
ＰＥＧ－ＰＡは、ＰＥＧ－ポリグルタミン酸、ＰＥＧ－ヒアルロン酸、またはＰＥＧ－ポリアスパラギン酸などのポリアニオンにコンジュゲートされたＰＥＧの一般用語である。
２．１１ 滴下によるＰＥＧ化ポリプレックスの調製
等量のポリプレックス溶液（０．１ｍＬ）を希釈ＰＥＧ－ＰＡ溶液（０．１ｍＬ）に滴下することにより、ＰＥＧ化ポリプレックスを調製する。
２．１２ インライン混合によるＰＥＧ化ポリプレックスの調製
ＵＳ９６２３１１２Ｂ２及びＵＳ８７２２６４６Ｂ２に記載されているようなインライン混合装置を使用して、等量の希釈ＰＥＧ－ＰＡ溶液をポリプレックス溶液と混合することにより、ＰＥＧ化ポリプレックスを調製する。
２．１３ １５０ｍｍｏｌのＰＢＳ中のＰＥＧ化ポリプレックスの安定性
１５０ｍｍｏｌのＰＢＳ ３００ｕＬに、１００ｕＬのＰＥＧ化ポリプレックスを混合する。混合の０時間及び２時間で、粒径の直径を測定する。ＰＥＧ化されていないポリプレックス対照と比較する。
２．１４ パーセントスーパーコイルＤＮＡ
スーパーコイルＤＮＡの割合を測定する前に、過剰なＰＡＡにさらすことにより、全ＤＮＡは、ポリプレックスまたはＰＥＧ化ポリプレックスから放出されなければならない。１μＬの試料アリコート（０．１ｍｇ／ｍＬのＤＮＡの標的）を、１０μＬのＰＡＡ（５０ｍＭのトリス中１００ｍｇ／ｍＬ）と混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。放出後、ＤＮＡをアガロースゲル電気泳動にかける。
２．１５ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎによる製剤中の全ＤＮＡ
ＰｉｃｏＧｒｅｅｎアッセイを使用してＤＮＡを測定する前に、全ＤＮＡは、過剰なＰＡＡを使用してポリプレックスまたはＰＥＧ化ポリプレックスから放出されなければならない。１０μＬの試料アリコート（２ｕｇ／ｍＬのＤＮＡの標的）を、１０μＬのＰＡＡ（５０ｍＭのトリス中２０ｍｇ／ｍＬ）と混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。放出後、スーパーコイル状のＤＮＡプラスミドを線状にするために、好適な制限酵素（ＲＥ）を使用して、ＤＮＡを消化する。ＰｉｃｏＧｒｅｅｎアッセイでは、ＲＥ消化試料の１０μＬのアリコートは、１９０μＬのＰｉｃｏＧｒｅｅｎワーキング溶液（Ｑｕｂｉｔ ｄｓ ＤＮＡ緩衝液：Ｑｕｂｉｔ ｄｓ ＤＮＡ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ試薬 １９９：１）と混合され、２分間インキュベートされ、蛍光について測定される（励起：４８５、発光カットオフ：５１５ｎｍ、発光：５３５ｎｍ）。結果は、参照ＤＮＡ標準曲線に対して定量化される。
２．１６ 遊離ＤＮＡ
ポリプレックスへのＤＮＡ捕捉を検証するために、１０μＬの試料アリコート（１０００ｎｇのＤＮＡの標的）を、２μＬの６Ｘのローディングバッファーと混合し、ゲル電気泳動にかけた。
２．１７ ゲル電気泳動
試料レーンに、記載の準備試料を入れた。標準レーンに、スーパーコイルＤＮＡラダーを入れた。参照レーンに、２μＬの参照ＤＮＡ（２００ｎｇのＤＮＡ）＋８μＬの水＋２μの６Ｘのローディングバッファーを入れた。１ＸのＳＹＢＲＳａｆｅ ＤＮＡ Ｓｔａｉｎを含有する０．８％のアガロースゲル上、１００Ｖで７５分間、試料を分離させた。ゲルをＧｅｌＤｏｃイメージングシステムでイメージングした。
２．１８ ポリプレックス及びＰＥＧ化ポリプレックスのナノ粒子サイジング
Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ光散乱装置を使用して、粒径の測定を行った。一般に、試料を希釈しないか、または１０ｍＭのＮａＣｌで最大２０倍希釈し、使い捨てキュベットまたはＺｅｔａｓｉｚｅｒフォールドキャピラリーセル（最小値０．８ｍＬ）に入れた。３分間の測定を３回行う前に、試料を２５℃で最大３分間インキュベートするように、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒをプログラムした。Ｚ平均直径及び多分散度（ＰＤＩ）を、標準偏差（ｎ＝３）で報告した。また、粘度及び屈折率に関する試料の組成物を考慮するように、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒをプログラムした。
２．１９ ポリプレックス及びＰＥＧ化ポリプレックスのゼータ電位
Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ光散乱装置を使用して、ゼータ電位測定を行った。一般に、１０ｍＭのＮａＣｌで希釈したＰＥＧ化ポリプレックスを除いて、希釈されていない試料を、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒフォールドキャピラリーセル（最小０．８ｍＬ）に入れた。測定を反復する前に、試料を２５℃で最大３分間インキュベートするように、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒをプログラムした（反復数をＺｅｔａｓｉｚｅｒソフトウェアで自動的に決定した）。ゼータ電位値を標準偏差（ｎ＝３）で報告した。また、粘度及び誘電率に関する試料の最終組成物を考慮するように、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒをプログラムした。
２．２０ 短期安定性
短期安定性研究のために、製剤を記載の通り凍結乾燥、適切な温度（－２０℃、４℃、または室温）で保存した。適切な時に、試料を再水和させ、記載の通り分析した。
３．ＰＥＧ－ＰＧＡ（ｍＰＥＧ１Ｋ－ｂ－ＰＬＥ１０）を使用したポリプレックスのＰＥＧ化
３．１ 手順
以下に示されるＮ：Ｐ比及び上述の５％のトレハロースを有するＤＮＡのＤＮＡ濃度０．１ｍｇ／ｍＬのＤＤ－Ｘ－ＤＮＡ（ｐＶＡＸ）ポリプレックスを作製した。
Figure 2022524859000018
次に、滴下混合を用いて、ＰＥＧ－ＰＧＡ溶液をＤＤ－Ｘ－ＤＮＡポリプレックスと１：１の体積比で混合し、以下に示されるように０．０５ｍｇ／ｍＬのＤＮＡのＰＥＧ化ポリプレックスを得た。試料を粒径、ＰＤＩ、及びゼータ電位について試験した（試験された製剤は、凍結されていなかった）。
Figure 2022524859000019
３．２ 結果
ｍＰＥＧ１Ｋ－ｂ－ＰＬＥ１０で作成された凍結融解されていないＰＥＧ化ポリプレックスは、以下に示す特定のＮ：Ｐ：Ａ比の安定製剤（示されている場合を除く）を生じた。
Figure 2022524859000020
４．ＰＥＧ－ＰＧＡ（ｍＰＥＧ１Ｋ－ｂ－ＰＬＥ１０及びｍＰＥＧ５Ｋ－ｂ－ＰＬＥ１０）ならびにＰＥＧ－ＨＡ（ＨＡ－２０２）を使用したポリプレックスのＰＥＧ化
４．１ 手順
以下に示されるＮ：Ｐ比及び上述の５％のトレハロースを有するＤＮＡのＤＮＡ濃度０．２５ｍｇ／ｍＬのＤＤ－Ｘ－ＤＮＡ（ｐＶａｘ－ｏｐｔ－ｈＩＬ１０）ポリプレックスを作製した。
Figure 2022524859000021
次に、滴下混合を用いて、ＰＥＧ－ＰＧＡ溶液またはＰＥＧ－ＨＡ溶液をＤＤ－Ｘ－ＤＮＡポリプレックスと１：１の体積比で混合し、以下に示されるように０．１２５ｍｇ／ｍＬのＤＮＡのＰＥＧ化ポリプレックスを得た。試料を凍結及び解凍し、粒径、ＰＤＩ、及びゼータ電位について試験した。
Figure 2022524859000022
４．２ 結果
凍結融解した試料の物理化学的結果が以下の表に提供される。ｍＰＥＧ１Ｋ－ｂ－ＰＬＥ１０またはＨＡ－２０２で作成されたＰＥＧ化ポリプレックスでは、凍結融解に対して安定な製剤が得られなかった。ｍＰＥＧ５Ｋ－ｂ－ＰＬＥ１０で作成されたＰＥＧ化ポリプレックスは、凍結融解に対して安定であった。
Figure 2022524859000023
５．ＰＥＧ－ＨＡを用いるポリプレックスのＰＥＧ化
５．１ 手順
以下に示されるＮ：Ｐ比及び上述の５％のトレハロースを有するＤＮＡのＤＮＡ濃度０．２５ｍｇ／ｍＬのＤＤ－Ｘ－ＤＮＡ（ｐＶａｘ－ｏｐｔ－ｈＩＬ１０）ポリプレックスを作製した。
Figure 2022524859000024
次に、滴下混合を用いて、５％のトレハロース中のＰＥＧ－ＨＡ溶液を、ＤＤ－Ｘ－ＤＮＡポリプレックスと１：１の体積比で混合し、以下に示されるように０．１２５ｍｇ／ｍＬのＤＮＡのＰＥＧ化ポリプレックスを得た。試料を粒径、ＰＤＩ、及びゼータ電位について試験した。
Figure 2022524859000025
Figure 2022524859000026
５．２ 結果
ＨＡ－２０１（ＨＡ １０ｋ－ＰＥＧ２ｋ）は、水に溶けなかった。それはヒドロゲルを形成し、さらには使用されなかった。ＨＡ－２０２（ＨＡ ５０ｋ－ＰＥＧ ２ｋ）により、水中で粘稠溶液が形成された。ポリプレックスは、ＰＥＧ化後に目に見える凝集を示し、さらなる試験は、実施されなかった。
６．ＰＥＧ－ＰＧＡポリプレックスの調製
６．１ 手順
ＰＥＧ化ポリプレックスの調製
本明細書に記載されるように、ＰＥＧ－ＰＧＡを使用して、Ｎ：Ｐ ７ポリプレックス（ＣＭＣ－ＩＮＴ０６－０９８Ａ）のアリコートをＰＥＧ化した。得られたＰＥＧ化ポリプレックスを、物理化学的特性及びＤＮＡ捕捉について試験した。Ｎ：Ｐ ７ポリプレックスに加えて得られた製剤を生成した。
Figure 2022524859000027
６．２ 結果
試験試料の外観、ｐＨ、粒径、ＰＤＩ、ゼータ電位、及び導電率は以下の通りである：
Figure 2022524859000028
遊離ＤＮＡ及び％スーパーコイルは、以下の通りである：
Figure 2022524859000029
７．ＰＥＧ－ＰＧＡとのインライン混合とそれに続くＴＦＦ濃縮による濃縮ＰＥＧ化ポリプレックス
７．１ 手順
ＰＥＧ－ＰＧＡとのインライン混合とそれに続くＴＦＦ濃縮による濃縮ＰＥＧ化ポリプレックス
Ｎ：Ｐ比７：１及び上述の５％のトレハロースを有するＤＮＡのＤＮＡ濃度０．２５ｍｇ／ｍＬのＤＤ－Ｘ－ＤＮＡ（ｐＶａｘ－ＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ）ポリプレックスを作製した。次に、５％のトレハロース中のＰＥＧ－ＰＧＡ溶液をＤＤ－Ｘ－ＤＮＡポリプレックスと１：１の体積比でインライン混合し（各流体の流れは７ｍＬ／分である）、０．１２５ｍｇ／ｍＬのＤＮＡ及び７：１：１７．５のＮ：Ｐ：Ａ比のＰＥＧ化ポリプレックスを得た。室温で６０分間インキュベートした後、ＰＥＧ化ポリプレックスを、ＵＳ８７２２６４６Ｂ２に以前に記載されたプロセスを使用して、ＴＦＦ（再生セルロースメンブレン、ＭＷＣＯ １０ｋＤａ、入口圧力１５ｐｓｉｇ）により濃縮した。ＴＦＦ中に、アリコートを０．２５ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬの公称ＤＮＡ濃度で採取した。最終生成物は、約１ｍｇ／ｍＬの公称ＤＮＡ濃度まで収集した。試料を等分し、－８０℃で保存した。解凍後、試料を粒径、ＰＤＩ、ゼータ電位、遊離ＤＮＡ、及び％スーパーコイルＤＮＡについて試験した。概略図は図１１に提示される。
Figure 2022524859000030
７．２ 結果
解凍された試験試料の粒径、ＰＤＩ、ゼータ電位、遊離ＤＮＡ、及び％スーパーコイルは以下であることがわかった：
Figure 2022524859000031
７．３ 結論
ＰＥＧ化ポリプレックスは、ＴＦＦ濃縮プロセスにより０．１２５ｍｇ／ｍＬＤＮＡ～１ｍｇ／ｍＬＤＮＡに濃縮することが可能であり、コロイド的に安定したナノ粒子を維持する。
８．事前に濃縮されたポリプレックスのＰＥＧ化によるＰＥＧ化ポリプレックスの濃縮
８．１ 手順
以前にＵＳ８７２２６４６Ｂ２に記載されているように、Ｎ：Ｐ比７：１及び９％のスクロースを有するＤＮＡのＤＮＡ濃度１ｍｇ／ｍＬの濃縮ＤＤ－Ｘ－ＤＮＡ（ｐＶａｘ－ＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ）ポリプレックスを作製した。次に、水中のＰＥＧ－ＰＧＡ溶液をＤＤ－Ｘ－ＤＮＡポリプレックスと１：１の体積比でインライン混合し（各流体の流れは７ｍＬ／分である）、０．５ｍｇ／ｍＬのＤＮＡ及び７：１：７のＮ：Ｐ：Ａ比または７：１：１７．５のＮ：Ｐ：Ａ比のＰＥＧ化ポリプレックスを得た。室温で６０分間インキュベートした後、ＰＥＧ化ポリプレックスを等分し、－８０℃で保存した。
解凍後、試料を粒径、ＰＤＩ、ゼータ電位、遊離ＤＮＡ、及び％スーパーコイルＤＮＡについて試験した。
Figure 2022524859000032
８．２ 結果
元のポリプレックス及びＰＥＧ化ポリプレックスの物理化学的特性
Figure 2022524859000033
８．３ 結論
１ｍｇ／ｍＬのＤＮＡでＤＤ－Ｘ－ＤＮＡポリプレックスを、７：１：７及び７：１：１７．５のＮ：Ｐ：Ａ比でＰＥＧ化して、最終ＤＮＡ濃度を０．５ｍｇ／ｍＬにし、目に見える凝集はなかった。
９．ＰＥＧ－ＰＧＡまたはＰＥＧ－ＰＡＡを用いるポリプレックスのＰＥＧ化
９．１ 手順
本明細書に記載されるように、ＰＥＧ－ＰＧＡまたはＰＥＧ－ＰＡＡを使用して、Ｎ：Ｐ ７ポリプレックス（ＣＭＣ－ＩＮＴ０６－２４Ｃ）のアリコートをＰＥＧ化した。得られたＰＥＧ化ポリプレックスを、物理化学的特性及びＤＮＡ捕捉について試験した。Ｎ：Ｐ ７ポリプレックスに加えて、得られた製剤を生成した。
Figure 2022524859000034
９．２ 結果
Figure 2022524859000035
 試料Ａ～Ｆを、本明細書に記載されているように遊離ＤＮＡについて試験した。得られたゲルは、目に見える遊離ＤＮＡを示さなかった。
９．３ 結論
ＰＥＧ－ＰＧＡ（ｍＰＥＧ５Ｋ－ｂ－ＰＬＥ１０）またはＰＥＧ－ＰＡＡ（ｍＰＥＧ５Ｋ－ｂ－ＰＬＤ１０）のいずれかを用いたＰＥＧ化ポリプレックスにより、遊離ＤＮＡのない安定したナノ粒子が形成された。
１０．人工腸液中のＰＥＧ化ポリプレックスの安定性
１０．１ 手順
試験物品
本明細書に記載されるように、ＰＥＧ－ＰＧＡを使用して、Ｎ：Ｐ ７ポリプレックス（ＣＭＣ－ＩＮＴ０６－２４Ｃ）のアリコートをＰＥＧ化した。得られたＰＥＧ化ポリプレックスをＦａＳＳＩＦ緩衝液中の安定性について試験した。
Figure 2022524859000036
ＳＩＦ１：３、ｖ／ｖでのＰＥＧ化ポリプレックスの安定性の試験
１５０ｕＬの人工腸液に、５０ｕＬのポリプレックスを添加する。十分に混合する。直ちに、懸濁液のアリコート５０ｕＬをＤＬＳキュベットに分注し、３５０ｕＬの水を加え、記載されているようにＤＬＳで粒径を測定する。残りの試料溶液を３本のチューブに分ける。適切な時点で、３５０ｕＬの水をチューブに添加し、完全に混合して、ＤＬＳで粒径を測定する。
ＳＩＦ３：１、ｖ／ｖでのＰＥＧ化ポリプレックスの安定性の試験
２５ｕＬの人工腸液に、７５ｕＬのポリプレックスを添加する。十分に混合する。直ちに、懸濁液のアリコート５０ｕＬをＤＬＳキュベットに分注し、３５０ｕＬの水を添加し、記載のように粒径をＤＬＳで測定する。残りの試料溶液を３本のチューブに分ける。適切な時点で、３５０ｕＬの水をチューブに添加し、完全に混合して、ＤＬＳで粒径を測定する。
１０．２ 結果
ＰＥＧ化されていないポリプレックス（７－１－０として表される）は、緩衝液と混合するとすぐに凝集した（スケールで最大）。ＰＥＧ化ポリプレックス（ＰＥＧ－ＰＧＡ、ｍＰＥＧ５Ｋ－ｂ－ＰＬＥ１０を用いる）は、１：３（ＦａＳＳＩＦ：ＰＥＧ化ポリプレックス、ｖ／ｖ）比で２４時間にわたって安定したままであった。ＰＥＧ化ポリプレックス（ＰＥＧ－ＰＧＡ、ｍＰＥＧ５Ｋ－ｂ－ＰＬＥ１０を用いる）は、３：１（ＦａＳＳＩＦ：ＰＥＧ化ポリプレックス、ｖ／ｖ）比で１時間にわたって安定したままであった。
１１．ＦａＳＳＩＦ緩衝液不含ＤＮＡにおけるＰＥＧ化ポリプレックスの安定性
参照：ＣＭＣ－ＩＮＴ０６－ＥＸＰ－０７２
１１．１ 手順
以下の表の目標Ｎ：Ｐ：Ａ比を得るために、本明細書に記載されるように、ＰＥＧ－ＰＧＡ（５％のトレハロース中）を使用して、Ｎ：Ｐ ７ポリプレックス（ＣＭＣ－ＩＮＴ０６－０２４Ｃ、ＤＤ－Ｘ－ＤＮＡ（ｐＶａｘ－ｏｐｔ－ｈＩＬ１０）ポリプレックス、５％のトレハロース、０．２５ｍｇ／ｍＬ）のアリコートをＰＥＧ化した。得られたＰＥＧ化ポリプレックスを、以下の表の比に従って、ＦａＳＳＩＦ緩衝液での安定性について試験した。２時間後、以下の物理化学的特性を決定した：遊離ＤＮＡ、ｐＨ、直径、及びＰＤＩ。
Figure 2022524859000037
１１．２ 結果
Figure 2022524859000038
 ＦａＳＳＩＦ－ポリプレックス試料の遊離ＤＮＡアッセイ。図５に示されるように、遊離ＤＮＡが観察されなかった。
レーンの説明が以下に示される。
Figure 2022524859000039
１２．ＰＥＧ化ポリプレックスの調製及びｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクション
１２．１ ｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクション試薬
Figure 2022524859000040
１２．２ ｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクション消耗品
Figure 2022524859000041
１２．３ ｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクション機器
Figure 2022524859000042
１２．４ 手順
試験物品
以下の表の目標Ｎ：Ｐ：Ａ比を得るために、本明細書に記載されるように、ＰＥＧ－ＰＧＡ（ｍＰＥＧ５Ｋ－ｂ－ＰＬＥ１０、５％のトレハロース中）を使用して、Ｎ：Ｐ ７ポリプレックス（ＣＭＣ－ＩＮＴ０６－０２４Ｃ、ＤＤ－Ｘ－ＤＮＡ（ｐＶａｘ－ｏｐｔ－ｈＩＬ１０）ポリプレックス、５％のトレハロース、０．２５ｍｇ／ｍＬ）のアリコートをＰＥＧ化した。得られたＰＥＧ化ポリプレックスを、凍結／解凍の前後で、粒径、ＰＤＩ、ゼータ電位について試験した。解凍した試料を、ｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクションについて試験した。
Figure 2022524859000043
１２．５ ｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクション手順
細胞の調製
１９継代のＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）を通過させ、遠心分離してトリプシンを除去し、その後、１０％のＦＢＳが補充されたＤＭＥＭに２回再懸濁させた。Ｖｉ－Ｃｅｌｌ生死細胞オートアナライザーで、細胞生存率及び計数を実行し、細胞数及び生存率を検証した。１０％のＦＢＳが補充されたＤＭＥＭ中で１．２５Ｘ１０５細胞／ｍＬの濃度まで細胞を希釈し、９６ウェル透明底ＴＣプレート（２００ｕＬ、１ウェル当たり２５，０００細胞）に分注した。３７℃／５％のＣＯ２で一晩インキュベートする前に、プレートを室温で１５～２０分間インキュベートし、その後、トランスフェクションのために使用した。
ポリプレックスの希釈
目標濃度で別段の提供されない限り、試験試料を０．１２５ｍｇ／ｍＬのＤＮＡに希釈した。対照試料（ＣＭＣ－ＩＮＴ０６－０２４及びＣＭＣ－ＪＡＮ０１－０１０）により、水で０．１４ｍｇ／ｍＬに希釈された０．２５ｍｇ／ｍＬのＤＮＡが提供された。次に、全ての試験及び対照試料を水で連続希釈し、１／１．３５で合計１０倍に希釈した。これらの連続希釈液を、さらに、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ中で１７．７倍希釈し、この希釈されたポリプレックス３５．６ｕＬを、２回ずつ各ウェルに添加した（対照資料の場合、２８２ｎｇのポリプレックス～１９ｎｇのポリプレックス、試験資料の場合、２５１ｎｇのポリプレックス～１７ｎｇのポリプレックスの最終用量範囲を与える）。
細胞のトランスフェクション
トランスフェクションを以下のように実施した。最初に、培地を各ＨＥＫ２９３Ｔウェルから除去し、続いて、０．１ｍＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（ｐＨ７．４）を添加して、その後、除去した。Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（前のセクションを参照）で希釈されたポリプレックス試料を各ウェルに添加し、３７℃で３時間インキュベートした。インキュベーション後、培地を除去し、０．２ｍＬの完全培地と交換し、３７℃で再インキュベートした。４８時間後、上清を除去し、直ちに、ＭＳＤアッセイに使用した。残りの細胞を溶解させて総タンパク質を測定した。
総タンパク質の定量化
標準曲線のためにＢＳＡを使用するＤＣ（商標）タンパク質アッセイを使用して、各ウェルの総タンパク質を決定した。ＥＬＩＳＡのために上清を除去すると、残りの細胞層を溶解緩衝液中４℃で１０分間溶解させた。（気泡の形成を最小限に抑えながら）溶解物を数回ピペッティングした後、Ｖ底９６ウェルプレートに移した。次に、溶解物を、４℃、１０００ｇで５分間遠心分離することにより清澄化させた。
タンパク質標準曲線の調製
タンパク質アッセイ標準ＩＩ（ウシ血清アルブミン）ストックを、ｍｉｌｌｉ－Ｑ水中５ｍｇ／ｍｌで調製し、４℃で保存した。溶解緩衝液（試料が調製されるのと同じ緩衝液）でタンパク質標準の１：２段階希釈を実施することにより、標準曲線を調製した。
Ｌｏｗｒｙ／ＤＣＴＭタンパク質アッセイ
各１ｍｌの試薬Ａに２０μｌの試薬Ｓを添加することにより、ワーキング試薬Ａ’を調製した。９６ウェルプレートの１ウェル当たり２５μｌのワーキング試薬Ａ’を移した。１ウェル当たり５μｌの細胞溶解物または標準液を添加した。次に、２００μｌの試薬Ｂを各ウェルに添加した。プレートを５秒間振とうし、室温で１５分間インキュベートして、発色させた。ＳｐｅｃｔｒａＭＡＸプレートリーダーで７５０ｎｍにおける吸光度を測定した。標準の吸光度を標準濃度に対してプロットした。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘソフトウェアカーブフィッティング分析を使用して、４つのパラメーターアルゴリズムにより、標準曲線に最適なカーブフィットが提供された。また、ソフトウェアにより、タンパク質標準曲線の試料のタンパク質濃度が補間された。
ＭＳＤアッセイによるｈＩＬ－１０タンパク質の定量
上清を１０分間１０００ｘｇで遠心分離し、その後、適切に希釈した。使用前に、アッセイ用の全ての試薬を室温に平衡化させた。特定の濃度に希釈液２中でｈＩＬ－１０を再構成することにより、アッセイのための標準液を調製し、室温で１５分間インキュベートし、その後、希釈液２で４倍連続希釈して、標準曲線の７用量を調製した。５０μＬの標準液を、ＭＳＤプレートの２列に２回ずつ添加する。２５μＬの希釈液２及び２５μＬの試料を残りのウェルに添加する。プレートを覆い、３００ｒｐｍで２時間振とうしながら室温でインキュベートする。プレートを洗浄し、その後、２５μＬの希釈された検出抗体を添加した。３００ｒｐｍで２時間振とうしながら、室温でインキュベートする。プレートを洗浄し、その後、１５０μＬの２ＸのＲｅａｄ Ｂｕｆｆｅｒ Ｔを添加する。バーコードを使用するＭｅｓｏ Ｓｃａｌｅを使用して読み取る（ＶＰＬＥＸシングルスポットは自動的に割り当てられる）。標準の吸光度を標準の濃度に対してプロットし、４パラメーターアルゴリズムを備えるＰｒｉｓｍ ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアを使用して、試料のｈＩＬ－１０の量を補間した。各ウェルでｈＩＬ－１０の量を決定すると、ＤＣ（商標）タンパク質アッセイ（すなわち、総タンパク質１ｍｇ当たりｎｇ ｈＩＬ－１０）から決定された総タンパク質に対して、それを正規化した。総タンパク質１ｍｇ当たりのｎｇ ｈＩＬ－１０ 対 トランスフェクトされたＤＮＡ量（ｎｇ）をプロットすることにより、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍにおいて用量反応曲線を作成した。ＥＣ５０及び総タンパク質１ｍｇ当たりのｈＩＬ－１０の予測最大量を決定した。
１２．６ 結果
全ての粒子は、安定しており、凝集はなかった。ＰＥＧ化後の全試料のゼータ電位は、－３ｍＶに低減した。凍結融解後、ポリプレックスは、同じ特性を示した。ｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクションの結果は、ＰＥＧ化されていない試料及びＰＥＧ化試料で同様であった（図６）。
Figure 2022524859000044
１３．ポリスチレンビーズのＰＥＧ化
参照：ＣＭＣ－ＩＮＴ０６－ＥＸＰ－０３９及びＣＭＣ－ＩＮＴ０６－ＥＸＰ－０５５
１３．１ 手順
橙色のポリスチレンビーズのＰＥＧ化
一般に：電磁撹拌棒を含む７ｍＬのガラス瓶に、１ｍＬのアミン修飾ポリスチレンビーズを移す。１ＭのＨＣｌ ５ｕＬを添加する。１．５ｍＬのエッペンドルフチューブ中、透明な溶液を形成するまで、７０ｍｇのＰＥＧ ＮＨＳ及び８ｍｇのＥＤＣ－ＨＣｌを１ｍＬの水に溶解させた。この溶液０．７ｍＬをポリスチレンの懸濁液に徐々に添加する。光から保護しながら、溶液を室温で一晩撹拌する。以下に記載されるように、ＰＥＧ化されている橙色の粒子を精製及び濃縮した。粒子サイジング及びゼータ電位測定を使用して、ＰＳ粒子のＰＥＧ化を確認した。
緑色ポリスチレンビーズのＰＥＧ化
一般に：電磁撹拌棒を含む７ｍＬのガラス瓶に、２ｍＬの緑色アミン修飾ポリスチレンビーズを移す。１ＭのＨＣｌ １０ｕＬを添加する。１．５ｍＬのエッペンドルフチューブ中、透明な溶液を形成するまで、１００ｍｇのＰＥＧ ＮＨＳ及び５ｍｇのＥＤＣ－ＨＣｌを１ｍＬの水に溶解させた。この溶液０．９ｍＬをポリスチレンの懸濁液に徐々に添加する。光から保護しながら、溶液を室温で一晩撹拌する。以下に記載されるように、ＰＥＧ化されている緑色粒子を精製及び濃縮した。粒子サイジング及びゼータ電位測定を使用して、ＰＳ粒子のＰＥＧ化を確認した。
青色ポリスチレンビーズのＰＥＧ化
一般に：電磁撹拌棒を含む７ｍＬのガラス瓶に、１ｍＬの青色アミン修飾ポリスチレンビーズを移す。２ｍＬの水を添加する。１．５ｍＬのエッペンドルフチューブ中、透明な溶液を形成するまで、２７０ｍｇのＰＥＧ ＮＨＳ及び１０．３４ｍｇのＥＤＣ－ＨＣｌを１ｍＬの水に溶解させた。この溶液０．９ｍＬをポリスチレンの懸濁液に徐々に添加する。光から保護しながら、溶液を室温で一晩撹拌する。以下に記載されるように、ＰＥＧ化されている青色粒子を精製及び濃縮した。粒子サイジング及びゼータ電位測定を使用して、ＰＳ粒子のＰＥＧ化を確認した。
ＰＥＧ化ポリスチレンの精製及び濃縮
以下のように、ＰＥＧ化されているＰＳ粒子を精製及び濃縮した。３００ｕＬの反応混合物をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａフィルターに等分する。５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。底部から液体を除去し、フィルターの上部に３００μＬの水を追加する（ビーズがフィルター上に保持される）。遠心分離及び洗浄を４回繰り返して、ビーズを洗浄する。ビーズを異なるフィルターから単一フィルター上にプールする。３００ｕＬの水を添加し、再度遠心分離する。緑色ビーズ及び橙色ビーズを約１．５ｍＬまで水に懸濁させた。
１０ｕＬの懸濁液を３９０ｕＬの水に混合することにより、ポリスチレン粒子の流体力学的直径を測定する。２０ｕＬの粒子懸濁液を１０ｍＭのＮａＣｌ ７８０ｕＬに混合することにより、ポリスチレン粒子のゼータ電位を測定する。
１３．２ 結果
反応の終わりに、ゼータ電位が大幅に減少した場合、これは、ＰＥＧ化が生じたことを示していた。
Figure 2022524859000045
１４．ＲＩＴＣ－ＤＤＸ＋ＤＮＡポリプレックス及びＰＥＧ化ＲＩＴＣ－ＤＤ－Ｘ＋ＤＮＡポリプレックスの調製
参考資料：以下に提示
１４．１ＲＩＴＣ－ＤＤ－Ｘ試薬
Figure 2022524859000046
１４．２ ＲＩＴＣ－ＤＤ－Ｘ機器
Figure 2022524859000047
１４．３ 手順
ＲＩＴＣ標識ＤＤ－Ｘ
Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ７２（２００８）６１６－６２４から派生した方法に基づいて、ＲＩＴＣをＤＤ－Ｘにコンジュゲートした。要約すると、ＤＤ－Ｘストック（ロットＪＡＮ０３－００９）を水に溶解させて、４０ｍＭの濃度及びｐＨ５．８を得た。ＤＤ－Ｘ溶液を等量のＤＭＳＯと混合させ、室温で１時間撹拌し、続いて、窒素ガスで１５分間バブリングした。別の容器において、ＲＩＴＣをＤＭＳＯに溶解させ（目標３．７ｍｇ／ｍＬ）、ＤＤ－Ｘ／ＤＭＳＯ混合物に滴下した（ＲＩＴＣ／ＤＭＳＯ：ＤＤ－Ｘ／ＤＭＳＯ １：８、ｖ／ｖ）。得られた混合物を室温で６５時間撹拌し、光から保護した。水に対する透析により、ＲＩＴＣ標識ＤＤ－Ｘを精製し、その後、凍結乾燥した。未反応のＲＩＴＣをメタノールで抽出し、濾液が無色になるまで、メタノールを用いてブフナー漏斗上で洗浄した。洗浄された粉末を回収し、室温で一晩真空乾燥させた。最終的に収集された粉末は、外観が桃色であった。ＲＩＴＣのＤＤ－ＸへのコンジュゲーションをＨ－ＮＭＲ分光法で確認した：ＲＩＴＣ－ＤＤ－ＸをＤ２Ｏ＋ＤＣｌ／Ｄ２Ｏに溶解させて（８ｍｇ／ｍＬ）、ｐＨ約２．５を得た。
ＲＩＴＣ－ＤＤ－Ｘ＋ＤＮＡポリプレックス
ＲＩＴＣ－ＤＤ－Ｘ（上記）及び非標識ＤＤ－Ｘの５０／５０ブレンドを調製し、その後、本明細書に記載のドリップ法の手順に従い、ＧＷｉｚ－ＧＦＰプラスミドＤＮＡを含む５％のトレハロースでＮ：Ｐ ２０ポリプレックス（０．１ｍｇ／ｍＬのＤＮＡ）を作成するために使用した。
ＲＩＴＣ－ＤＤ－Ｘ＋ＤＮＡポリプレックス
ＲＩＴＣ－ＤＤ－Ｘ（上記）及び非標識ＤＤ－Ｘの３３／６７ブレンドを調製し、その後、本明細書に記載のインライン混合の手順に従い、ｐＶａｘ－ｏｐｔ－ｈＩＬ１０プラスミドＤＮＡを含む５％のトレハロースでＮ：Ｐ ７ポリプレックス（０．２５ｍｇ／ｍＬのＤＮＡ）を作成するために使用した。
ＰＥＧ化ＲＩＴＣ－ＤＤ－Ｘ＋ＤＮＡポリプレックス
本明細書に記載されるように、ＰＥＧ－ＰＧＡを使用して、Ｎ：Ｐ ７ポリプレックスのアリコートをＰＥＧ化した。得られたＰＥＧ化ポリプレックスを、粒径、ＰＤＩ、及びゼータ電位について試験した。Ｎ：Ｐ ７ポリプレックスに加えて得られた製剤を生成した。
Figure 2022524859000048
１４．４ 結果
粒径、ＰＤＩ、及びゼータ電位の結果
Figure 2022524859000049
 ポリプレックスＣＭＣ－ＩＮＴ０６－０７５ Ｄ、Ｅ、及びＦが凝集した。
１５．タイプＩＩＩムチン内の様々なＰＳビーズの凝集の評価、ならびに、１及び３μｍのＴｒａｎｓｗｅｌｌを通した拡散の定量化
参照：ＣＭＣ－ＩＮＴ０６－ＥＸＰ－０４２
１５．１ ムチン拡散材料
Figure 2022524859000050
１５．２ 粘液拡散装置
Figure 2022524859000051
１５．３ 手順
タイプＩＩＩムチン懸濁液の調製
必要に応じて、タイプＩＩＩムチンを５％ｗ／ｗ～０．１％ｗ／ｗの目標濃度まで水中に分注することにより、タイプＩＩＩムチン懸濁液を調製した。
ムチン中の凝集試験
試験試料（ＲＩＴＣ標識ポリプレックス、アミン修飾ＰＳビーズ、またはＰＥＧ化ＰＳビーズ）をマイクロチューブ中でタイプＩＩＩムチン懸濁液と様々な濃度で混合して、試験試料及びムチンの最終目標濃度を得た。試料－ムチン試料を光から保護し、室温、３０ｒｐｍで混合した。３０及び６０分で、混合物をＩｂｉｄｉマイクロスライドに等分し、目に見える凝集についてＥＶＯＳ顕微鏡下で観察した。
ムチンを入れたＴｒａｎｓｗｅｌｌを通した拡散の評価
試料調製。
試験試料（ＲＩＴＣ標識ポリプレックス、アミン変性ＰＳビーズ、またはＰＥＧ化ＰＳビーズ）をタイプＩＩＩムチン懸濁液とマイクロチューブ中で混合して、試験試料の最終目標濃度及び０．４％の最終ムチン濃度を得た。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌインサートに入れる前に、試料を光から保護し、４０ｒｐｍで１時間混合した。
Ｔｒａｎｓｗｅｌｌの調製及び試料の拡散
Ｔｒａｎｓｗｅｌｌの底に、０．６ｍＬの０．４％のタイプＩＩＩムチンを充填した。ＨＴＳ Ｔｒａｎｓｗｅｌｌインサート（１ｕｍまたは３ｕｍのＰＥＴメンブレンを備える）に、０．１ｍＬの事前混合試料＋ムチンを入れた。０．４％のムチンのみがない状態で、対照を入れた。参照（１００％の拡散を模倣する）は、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌインサート（０．７ｍＬ）なしで事前に混合された試料＋ムチンであった。３７℃で２０時間インキュベートした後、下部ウェルへの試験試料の拡散を蛍光プレートリーダー（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ）で評価した。
１５．４ 結果
ムチン中の凝集試験
図７に示されるように、ＲＩＴＣ標識ポリプレックス及びアミン修飾ＰＳビーズの両方が、１時間のインキュベーション後にムチン中で凝集を示した。ＰＥＧ化されているＰＳビーズには、目に見える凝集はなかった。
ムチンを入れたＴｒａｎｓｗｅｌｌを通した拡散の評価
図８に示されるように、０．４％のムチンでは、ＰＥＧ化ＰＳビーズには、アミン修飾ＰＳビーズ及びＲＩＴＣ標識ポリプレックスと比較して、３ｕｍまたは１ｕｍのＰＥＴメンブレンのいずれかを通して、２０時間のインキュベーション後に最高レベルの拡散があった。これは、ムチン中のＰＥＧ化ＰＳビーズの凝集が少ないことに起因する。
１６．Ｔｒａｎｓｗｅｌｌリピートを使用したタイプＩＩＩムチンを介したＰＥＧ化ポリプレックス製剤の拡散及びＰｌｕｒｏｎｉｃｓ Ｆ１２７の効果。
１６．１ 材料
Figure 2022524859000052
１６．２ 機器
Figure 2022524859000053
１６．３ 手順
４％のＰｌｕｒｏｎｉｃｓ Ｆ１２７溶液の調製
Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ Ｆ１２７を水に溶解させて、４％ｗ／ｗを得、０．２２ｕｍで濾過した。
タイプＩＩＩムチン懸濁液の調製
本明細書に記載されるように、タイプＩＩＩムチン懸濁液を調製した。
ムチン中の凝集試験
試験試料（ＰＥＧ化ＲＩＴＣ－ＤＤ－Ｘ＋ＤＮＡポリプレックス、ＲＩＴＣ標識ポリプレックス、アミン修飾ＰＳビーズ、またはＰＥＧ化ＰＳビーズ）をマイクロチューブ中でタイプＩＩＩムチン懸濁液と様々な濃度で混合して、試験試料及びムチンの最終目標濃度を得た。試料－ムチン試料を光から保護し、室温、３０ｒｐｍで混合した。３０及び６０分で、混合物をＩｂｉｄｉマイクロスライドに等分し、目に見える凝集についてＥＶＯＳ顕微鏡下で観察した。
ムチンを入れたＴｒａｎｓｗｅｌｌを通した拡散の評価
試料調製。
試験試料（ＰＥＧ化ＲＩＴＣ－ＤＤ－Ｘ＋ＤＮＡポリプレックス、ＲＩＴＣ標識ポリプレックス）を、マイクロチューブ中で、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ Ｆ１２７溶液を含むかまたは含まないタイプＩＩＩムチン懸濁液と混合して、試験試料の最終目標濃度及び０．５％の最終ムチン濃度を得た。対照（アミン修飾ＰＳビーズ、ＰＥＧ化ＰＳビーズ）をムチンのみと混合して、最終ムチン濃度を０．５％にした。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌインサートに入れる前に、試料を光から保護し、４０ｒｐｍで１時間混合した。
Ｔｒａｎｓｗｅｌｌの調製及び試料の拡散
Ｔｒａｎｓｗｅｌｌの底に、０．６ｍＬの０．５％のタイプＩＩＩムチンを充填した。３ｕｍのＰＥＴメンブレンを備えたＨＴＳ Ｔｒａｎｓｗｅｌｌインサートに、０．１ｍＬの事前混合試料＋ムチンを入れた。参照（１００％の拡散を模倣する）は、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌインサート（０．７ｍＬ）なしで事前に混合された試料＋ムチンであった。３７℃で２０時間インキュベートした後、下部ウェルへの試験試料の拡散を蛍光プレートリーダー（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ）で評価した。
１６．４ 結果
ＰＳビーズのＰＥＧ化
アミン修飾ＰＳビーズのＰＥＧ化により、ムチン拡散がほぼ１０倍改善された（図９）。蛍光顕微鏡は、ＰＥＧ化ＰＳビーズがムチンで凝集しなかったが、ＰＥＧ化されていないＰＳビーズが同じ条件下で大幅に凝集したことを示した。
ムチンにおけるＰＥＧ化ポリプレックス拡散
ポリプレックス（Ｎ：Ｐ ７）のＰＥＧ化により、ムチン拡散が、３２％から５０～５２％に増加し、これにより、ＰＥＧ化されていないポリプレックスよりも拡散が約６０％向上する（図９）。試験されたＮ：Ｐ：Ａ比を、ムチン拡散に対して同様に実施した。蛍光顕微鏡は、ＰＥＧ化ポリプレックス及びＰＥＧ化されていないポリプレックス間に有意な形態学的差異を示さなかった。
ムチン拡散に対するＰｌｕｒｏｎｉｃｓ Ｆ１２７の効果
Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ Ｆ１２７の存在により、ＰＥＧ化されていないポリプレックス及びＰＥＧ化ポリプレックスのムチン拡散が（１０～１５％）改善された（図１０）。
１７．ｃ１２５、様々なＮＰＡ比で、２．５または５％トレハロース中で調製されたＰＥＧ化ポリプレックスの凍結乾燥
参照：ＣＭＣ－ＩＮＴ０６－ＥＸＰ－１０３
１７．１ 凍結乾燥材料
Figure 2022524859000054
１７．２ 凍結乾燥装置
Figure 2022524859000055
１７．３ 手順
Ｎ：Ｐ比７：１及び上述の５％のトレハロースを有するＤＮＡのＤＮＡ濃度０．２５ｍｇ／ｍＬのＤＤ－Ｘ－ＤＮＡ（ｐＶａｘ－ＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ）ポリプレックスを作製した。次に、ポリプレックスのアリコートを上述のようにＰＥＧ化した（ｍＰＥＧ５Ｋ－ｂ－ＰＬＥ１０）。Ｎ：Ｐ ７ポリプレックスに加えて、得られた製剤を生成し、２ｍＬのガラスバイアルに充填した（１ｍＬ及び０．１ｍＬの充填量を試験した）。
Figure 2022524859000056
以下の制御された凍結乾燥サイクルを使用して、試料を凍結乾燥した。
凍結：＋２０～－４０℃（１℃／分）、次に、－４０℃で１２０分。
１次乾燥：－３２℃及び６３ｍＴｏｒｒで３８００分
２次乾燥：Ｐ＝６３ｍＴｏｒｒ、シェルフＴ －３２～３０℃（０．２℃／分）、次に、３０℃で３６０分。
２次乾燥の終了時に、バイアルを、窒素ガスでパージし、栓をし、室温に平衡化させた。短期間の安定性を、室温（周囲湿度）、デシケーター内の室温、及び４℃で実施した。選択された時点で、１ｍＬの試料を水で再水和させ、分析前に１５分間インキュベートした。試料を本明細書に記載されているように、粒径、ＰＤＩ、ゼータ電位、及び遊離ＤＮＡについて分析した。
１７．４ 結果
フリーズドライ固形物には、崩壊または亀裂の兆候はなかった。固形物を形成するには容量が不十分なため、０．１ｍＬの試料をリングのように成形した。再水和試料では、遊離ＤＮＡは、観察されなかった。
図１３は、室温及び４℃で４週間までの、凍結乾燥されたＰＥＧ化ポリプレックスの安定性を示す。試料を再水和させて、凍結乾燥前の容量にした。
１８．凍結融解によるインライン混合ＰＥＧ－ＰＰの潜在的な凍結乾燥賦形剤のスクリーニング
１８．１ 賦形剤スクリーニング材料
Figure 2022524859000057
１８．２ 手順
マンニトール溶液の調製
一般に、マンニトールを水に０．１２５ｇ／ｍＬの濃度で溶解させた。０．２μｍフィルターを使用して、得られた溶液を濾過した。必要に応じて、マンニトール溶液を、後続の製剤化に必要な濃度に希釈した。
Ｋｏｌｌｉｄｏｎ １２（ＰＶＰ２）溶液の調製
一般に、ＰＶＰ２を水に０．０５ｇ／ｍＬの濃度で溶解させた。０．２μｍフィルターを使用して、得られた溶液を濾過した。必要に応じて、ＰＶＰ２溶液を、後続の製剤化に必要な濃度に希釈した。
ＰＥＧ ４ｋＤａ溶液の調製
一般に、ＰＥＧ ４ｋＤａを、水に０．０５ｇ／ｍＬの濃度で溶解させた。０．２μｍフィルターを使用して、得られた溶液を濾過した。必要に応じて、ＰＥＧ ４ｋＤａ溶液を、後続の製剤化に必要な濃度に希釈した。
製剤の調製
Ｎ：Ｐ比７：１及び上述の他の賦形剤を全く含まないＤＮＡのＤＮＡ濃度０．２５ｍｇ／ｍＬのＤＤ－Ｘ－ＤＮＡ（ｐＶａｘ－ＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ）ポリプレックスを作製した。次に、ポリプレックスのアリコートを、本明細書に記載されるようにＰＥＧ化した（ｍＰＥＧ５Ｋ－ｂ－ＰＬＥ１０）。
Figure 2022524859000058
ＰＥＧ化されていないポリプレックス（ＣＭＣ－ＩＮＴ０６－１１２Ａ）またはＰＥＧ化ポリプレックス（ＣＭＣ－ＩＮＴ０６－１１２Ｂ）のアリコートを、様々な濃度で水または様々な賦形剤のいずれかと混合して、以下に記載の最終目標賦形剤濃度及び最終ＤＮＡ濃度０．１ｍｇ／ｍＬを得た。
Figure 2022524859000059
得られた製剤を等分し、クライオバイアルに充填して－８０℃で凍結するか、または本明細書に記載されるように凍結乾燥した。解凍された試料を、本明細書に記載されているように、粒径、ＰＤＩ、ゼータ電位、ｐＨ、％スーパーコイルＤＮＡ、及び遊離ＤＮＡについて分析した。以下に提示されるように、凍結乾燥試料を、別々の試料ＩＤを割り当てた。
Figure 2022524859000060
凍結乾燥試料を水で乾燥前の初期濃度に再水和させ、本明細書に記載されるように、粒径、ＰＤＩ、ゼータ電位、ｐＨ、％スーパーコイルＤＮＡ、及び遊離ＤＮＡについて分析した。
１８．３ 結果
水単独中でのＰＥＧ化されていないポリプレックス（ＣＭＣ－ＩＮＴ０６－１１２ Ａ１）は、凍結融解後に大幅に凝集した。従って、この試料において、さらなる試験を実施しなかった。
水もしくは賦形剤のうちのいずれかまたは試験された濃度中のＰＥＧ化ポリプレックス製剤は、半透明であり、他の物理化学的特性は、凍結融解前から不変であった。
Figure 2022524859000061
凍結乾燥固形物の外観。
水単独中でのＰＥＧ化されていないポリプレックスの凍結乾燥固形物（ＣＭＣ－ＩＮＴ０６－１１６Ａ１）は、外観に一貫性がなく、崩壊していた。水または賦形剤のうちのいずれかまたは試験された濃度中のＰＥＧ化ポリプレックス製剤（ＣＭＣ－ＩＮＴ０６－１１６ Ｂ１～ＣＭＣ－ＩＮＴ０６－１１６ Ｂ１１）の凍結乾燥固形物は、均一であり、収縮がわずかで亀裂がなかった。
再水和後の凍結乾燥試料の物理化学的性質
水単独中でのＰＥＧ化されていないポリプレックス（ＣＭＣ－ＩＮＴ０６－１１６ Ａ１）は、再水和後に大幅に凝集した。従って、この試料において、さらなる試験を実施しなかった。水もしくは賦形剤のうちのいずれかまたは試験された濃度中のＰＥＧ化ポリプレックス製剤は、半透明であり、他の物理化学的特性は、凍結乾燥前から不変であった。
Figure 2022524859000062
Figure 2022524859000063
１８．４ 結論
ＰＧＡ（１．３ｋ）－ＰＥＧ（５ｋ）を使用したＮ：Ｐ：Ａ比＝７：１：１７．５のＰＥＧ化ポリプレックスは、賦形剤の不存在下での凍結融解または凍結乾燥後のポリプレックスの凝集を防いだ。トレハロース、マンニトール、ＰＥＧ ４ｋＤａまたはＰＶＰ ２ｋＤａは、凍結融解または凍結乾燥時にＰＥＧ化ポリプレックス凝集を防ぐために必要ではなく、それらは、試験された濃度で凝集を引き起こさない。
１９． ５％のトレハロース中での濃縮及び希釈ＰＥＧ化ポリプレックスの凍結乾燥
参照：ＣＭＣ－ＩＮＴ０６－ＥＸＰ－１１０及びＣＭＣ－ＩＮＴ０６－１２８
１９．１ 手順
Ｎ：Ｐ比７：１及び上述の５％のトレハロースを有するかまたは有さないＤＮＡのＤＮＡ濃度０．２５ｍｇ／ｍＬのＤＤ－Ｘ－ＤＮＡ（ｐＶａｘ－ＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ）ポリプレックスを作製した。次に、ポリプレックスのアリコートをＰＥＧ化（ｍＰＥＧ５Ｋ－ｂ－ＰＬＥ１０）し、上述のようにＴＦＦプロセスを使用して濃縮した。Ｎ：Ｐ ７ポリプレックスに加えて、得られた製剤を生成し、２または１０ｍＬのガラスバイアルに充填した（０．３ｍＬ、１ｍＬ、及び２ｍＬの充填量を試験した）。
Figure 2022524859000064
以下の制御された凍結乾燥サイクルを使用して、試料を凍結乾燥した。
凍結：＋２０～－４０℃（１℃／分）、次に、－４０℃で１２０分。
１次乾燥：－３２℃及び６３ｍＴｏｒｒで３８００分
２次乾燥：Ｐ＝６３ｍＴｏｒｒ、シェルフＴ －３０～３０℃（０．２℃／分）、その後３０℃で６時間。
２次乾燥の終了時に、バイアルを、窒素ガスでパージし、栓をし、室温に平衡化させた。試料を水で再水和させて、様々な倍濃度（１倍または１０倍）を得た。本明細書に記載されるように、試料を、粒径、ＰＤＩについて分析した。
１９．２ 結果
凍結乾燥試料は、１ｍＬの充填量で、堅固な外観、軽い収縮、及び亀裂がある固形物であった。１ｍｇ／ｍＬ及び１０ｍｇ／ｍＬに再水和させた凍結乾燥試料は、外観が半透明で、目に見える凝集物はなかった。２５ｍｇ／ｍＬに再水和させた凍結乾燥試料は、懸濁液を形成するのに十分な量の水がないので、粘性のあるゲルを形成した（図１２）。５０ｍｇ／ｍＬに再水和させた凍結乾燥試料は、懸濁液を形成するのに十分な量の水がないので、ペーストを形成した。
１０ｍｇ／ｍＬ及び２５ｍｇ／ｍＬに再水和された凍結乾燥試料を、ナノ粒径、ＰＤＩ、及びゼータ電位について試験し、４℃で少なくとも４８時間は、いずれかの条件でも明らかな凝集は見られなかった（図１２）。
２０．４．５％のスクロースまたは水中で調製されたＰＥＧ－ＰＰ（様々なＮＰＡ比）の凍結乾燥
参照：ＣＭＣ－ＩＮＴ０６－１２９
２０．１ 手順
Ｎ：Ｐ比７：１及び上述の他の賦形剤を全く含まないＤＮＡのＤＮＡ濃度０．１２５ｍｇ／ｍＬのＤＤ－Ｘ－ＤＮＡ（ｐＶａｘ－ＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ）ポリプレックスを作製した。次に、ポリプレックスのアリコートを、本明細書に記載されるようにＰＥＧ化した（ｍＰＥＧ５Ｋ－ｂ－ＰＬＥ１０）。追加の試験試料ＣＭＣ－ＩＮＴ０６－１２４Ａ及びＣＭＣ－ＩＮＴ０６－１２４Ｂは、すでに本明細書に記載されている。
Figure 2022524859000065
得られた製剤を、２ｍＬのガラスバイアルに充填し（０．３ｍＬ及び１ｍＬの充填量で試験し）、以下の制御された凍結乾燥サイクルを使用して凍結乾燥した。
凍結：２０～－４０℃（１℃／分）、次に、－４０℃で１２０分。
１次乾燥：－３５℃及び６３ｍＴｏｒｒで３６６０分
２次乾燥：Ｐ＝６３ｍＴｏｒｒ、シェルフＴ －３５～３０℃（０．２℃／分）、次に、３０℃で３６０分。
２次乾燥の終了時に、バイアルを、窒素ガスでパージし、栓をし、室温に平衡化させ、使用するまで４℃で保存した。
短期間の安定性を、賦形剤を含まない試料（ＣＭＣ－ＩＮＴ０６－１２９Ａ、ＣＭＣ－ＩＮＴ０６－１２９Ｂ、ＣＭＣ－ＩＮＴ０６－１２９Ｃ）に対して４℃で実施した。４．５％のスクロース試料（ＣＭＣ－ＩＮＴ０６－１２９Ｄ及びＣＭＣ－ＩＮＴ０６－１２９Ｅ）を時間０で試験した。選択された時点で、試料を水で再水和させて、凍結乾燥前の濃度を得た。本明細書に記載されているように、再水和試料を、粒径、ＰＤＩ、及びゼータ電位について分析した。
２０．２ 結果
全ての製剤を効率よく凍結乾燥させた。凍結保護剤を含まない製剤は、収縮／径方向収縮を示した：ＮＰＡ比が低く（すなわち、ＮＰＡ＝７：１：７）、充填量が少ない（０．３ｍＬ）ものは、静電気の影響をより受けやすかった（固形物が上、横に移動する、壊れるなど）。４．５％のスクロースを含有する製剤は、限られた収縮のみを示し、光沢のある表面を有していた。
凍結乾燥試料の説明
Figure 2022524859000066
時間０での再水和試料の外観、粒径、ＰＤＩ、及びゼータ電位。
Figure 2022524859000067
賦形剤の不存在下での４℃で最大４週間の凍結乾燥試料の安定性（再水和試料の粒径、ＰＤＩ、及びゼータ電位）が図１４に示される。結果は、粒径及びゼータ電位の変化を全く示さず、ＰＤＩの乏しい増加を示すかまたは増加を全く示さなかった。
以下の表は、現在の知見の要旨を提示する：
Figure 2022524859000068
実施例２：
一般的な方法、組成物、及び手順は、別途記載のない限り、上記の実施例１に記載されている通りである。
ＰＥＧがポリグルタミン酸尾部を含み且つポリプレックスが７：１：７（中ＰＥＧ化）または７：１：１７．５（高ＰＥＧ化）のＮＰＡ比を含む、８０μＬの可逆的にＰＥＧ化されている二重誘導体化キトサンポリプレックス（ＤＤＸ）を２５０μｇ／ｍＬのマウス膀胱に投与した。対照として、７：１のＮＰ比のＰＥＧ化されていないポリプレックス８０μＬをマウス膀胱に投与した。投与された製剤を、１時間膀胱中でインキュベートし、その後、膀胱の内容物を分析のために収集した。図１５に示されるように、膀胱内でのインキュベーションは、ＰＥＧ化されていないポリプレックスの高度な凝集を引き起こした。対照的に、高及び中ＰＥＧ化ポリプレックスはともに、膀胱内でのインキュベーション後に検出可能な凝集を示さなかった。
実施例３：
可逆的ＰＥＧ化及びＰＥＧ化されていないＤＤＸ粒子のｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子導入効率を比較した。ＮＰ７、ＮＰ１５、及びＮＰ２０のＰＥＧ化されていないＤＤＸ粒子、ならびに、ＮＰＡ ７：１：３．５（低ＰＥＧ化）及びＮＰＡ ７：１：１７．５（高ＰＥＧ化）のＰＥＧ化ＤＤＸを試験した。実施例１及び２に記載されるように、可逆的ＰＥＧ化ＤＤＸ粒子を、ＰＥＧ－ポリグルタミン酸でコーティングした。ＤＤＸ製剤のそれぞれを、２つの異なる濃度（１２５μｇ／ｍＬ及び１，０００μｇ／ｍＬ）で試験した。製剤を、結腸内点滴注入（ＩＣＩ）により３ｘ１５０μＬの用量として注射した。２４時間後、結腸試料を収集し、導入遺伝子のｍＲＮＡ発現を分析した。図１６に示されるように、ＰＥＧ化ＤＤＸ粒子は、コピー数の発現の増加（１０ｘ超）により検出されるように、著しく改善された遺伝子送達を達成した。ＰＥＧ化ＤＤＸ製剤中の検出可能な遺伝子発現を伴う％試料も大幅に改善した。
ｍＲＮＡの発現に加えて、導入遺伝子がコードしたタンパク質の発現も評価した。ＮＰ１５（Ｇｒ．２）及びＮＰ２０（Ｇｒ．３）のＰＥＧ化されていないＤＤＸ粒子、ならびにＮＰＡ ７：１：３．５（Ｇｒ．７）及びＮＰＡ ７：１：１７．５（Ｇｒ．５及び６）のＰＥＧ化ＤＤＸを試験した。実施例１及び２に記載されるように、可逆的ＰＥＧ化ＤＤＸ粒子を、ＰＥＧ－ポリグルタミン酸でコーティングした。ＤＤＸ製剤のそれぞれを１２５μｇ／ｍＬで試験した。製剤を、結腸内点滴注入（ＩＣＩ）により３ｘ１５０μＬの用量として注射した。２４時間後、細胞試料を収集し、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙイムノアッセイを使用して、導入遺伝子のタンパク質発現について分析した。図１７に示されるように、ＰＥＧ化されていないＤＤＸ粒子と比較して、ＰＥＧ化ＤＤＸ粒子で処置されたマウス結腸で、導入遺伝子がコードしたタンパク質発現を大幅に増加させた。
それぞれを１０００μｇ／ｍＬで製剤化した、７：１のＮＰ比を有するＰＥＧ化されていないＤＤＸ粒子及び７：１：１７．５のＮＰＡ比を有するＰＥＧ化ＤＤＸ粒子を用いて、タンパク質発現実験を繰り返した。３ｘ１５０μＬのＩＣＩ手順を使用して製剤を投与した、結腸切片を投与の２４時間後に採取し、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙイムノアッセイを用いて、タンパク質溶解物を使用して、ヒトＰＤ－Ｌ１－Ｆｃタンパク質を定量化した。図１８に示されるように、ＰＥＧ化されていないＤＤＸ粒子と比較して、ＰＥＧ化ＤＤＸ粒子で処置されたマウス結腸で、導入遺伝子がコードしたタンパク質発現を大幅に増加させた。
実施例４：
上述の実施例で概説した一般的な方法及びアッセイされた物理化学的パラメーターを使用して、ＰＥＧ化ＤＤＸナノ粒子を生成した。２５％のカチオン（アルギニン（Ｒ））の最終官能基化度及び１０％のポリオール（グルコース（Ｇ））の最終官能基化度を有する二重誘導体化ポリプレックスをＮＰ ２０：１（ＰＥＧ化されていない）及びＮＰＡ １０：１：５（ＰＥＧ化）比で調製した。それぞれのＰＥＧ化されていない及びＰＥＧ化ポリプレックスに提供される凍結保護の改善に基づいて、凍結保護剤（５％のトレハロースまたは１％のマンノース）を選択した。製剤を凍結または凍結乾燥し、その後、必要に応じて解凍または再水和させた。試料を、％スーパーコイルＤＮＡ、外観、粒径、ＰＤＩ、ゼータ電位、及びｐＨについて試験した。
図１９に示されるように、非ＰＥＧ凍結乾燥の場合、ｔ＝０、％スーパーコイルＤＮＡは、同等のＰＥＧ化製剤よりも有意に低かった。％スーパーコイルＤＮＡは、核酸送達材料の品質を示し、好ましくは、８０％超、より好ましくは、９０％超であるべきである。
ポリプレックスを、１０：１：５のＮＰＡ（ＰＥＧ化）比で調製した。これらのポリプレックスでは、カチオン／ポリオールの最終官能基化度は、２８％のＲ及び１０％のＧであり、ＤＮＡ濃度は、１２５μｇ／ｍＬであった。凍結保護剤は、１％のマンニトールであった。製剤を凍結乾燥させ、４℃及び室温で最大１２週間保存した。ｔ＝０（初期）、２週、４週、８週、及び１２週に、試料を元のＤＮＡ濃度に再水和させ、％スーパーコイルＤＮＡ、粒径、及びＰＤＩについて試験した。図２０に示されるように、凍結乾燥ＰＥＧ化ＤＤＸ製剤は、４℃または室温（ＲＴ）で保存された場合、最大１２週間安定であった。
ポリプレックスを、１０：１：５のＮＰＡ（ＰＥＧ化）比及び２０：１のＮＰ（ＰＥＧ化されていない）比で調製した。これらのポリプレックスでは、カチオン／ポリオールの最終官能基化度は、２８％のＲ及び１０％のＧであり、ＤＮＡ濃度は、１０００μｇ／ｍＬであった。それぞれのＰＥＧ化されていない及びＰＥＧ化ポリプレックスに提供される凍結保護の改善に基づいて、凍結保護剤（５％のトレハロースまたは１％のマンニトール）を選択した。製剤を凍結乾燥し、その後、示された目標ＤＮＡ濃度（ｃ１０００＝１ｍｇ／ｍＬ、ｃ２０００＝２ｍｇ／ｍＬ、ｃ５０００＝５ｍｇ／ｍＬ、ｃ１０，０００＝１０ｍｇ／ｍＬ）に再水和させた。試料を粒径及びＰＤＩについて試験した。図２１に示されるように、凍結乾燥ＰＥＧ化製剤は、最大１０ｍｇ／ｍＬの濃度に安定的に再水和させたが、ＰＥＧ化されていない製剤は、２ｍｇ／ｍＬに安定して再水和させることが可能であった。２ｍｇ／ｍＬの再水和濃度は有用な遺伝子送達製剤を提供したが、ＰＥＧ化製剤の達成可能に安定したＤＮＡ濃度（１０ｍｇ／ｍＬ）が予想外に大幅に増加することより、治療または臨床的に関連する効果を達成するのに必要とされる投与量の観点で大きな利益が提供される。
ポリプレックスを、１０：１：５のＮＰＡ（ＰＥＧ化）比及び１０：１のＮＰ（ＰＥＧ化されていない）比で調製した。これらのポリプレックスの場合、カチオン／ポリオールの最終官能基化度は、２８％のＲ及び１０％のＧであった。１％のマンニトール（ＰＥＧ化ポリプレックス）または５％のトレハロース（ＰＥＧ化されていないポリプレックス）を含有する製剤を１２５／ｍｌのＤＮＡ濃度でマウスの膀胱に投与し、１時間インキュベートし、膀胱の内容物を分析のために収集した。外観及び動的光散乱によるナノ粒子のサイジングについて試料を試験した。図２２に示されるように、ＰＥＧ化ポリプレックスは、検出可能な凝集を示さないが、ＰＥＧ化されていないポリプレックスは、サイズ及び多分散指数（ＰＤＩ）の増加（左に示される）により、ならびに、収集される尿試料の画像の白色塊の出現（右に示される）により、高度な凝集を示した。
ポリプレックスを、１０：１：５のＮＰＡ（ＰＥＧ化）比及び２０：１のＮＰ（ＰＥＧ化されていない）比で調製した。これらのポリプレックスの場合、カチオン／ポリオールの最終官能基化度は、２８％のＲ及び１０％のＧであった。１％のマンニトール（ＰＥＧ化ポリプレックス）または５％のトレハロース（ＰＥＧ化されていないポリプレックス）を含有する製剤を、滅菌濾過の適合性についてアッセイした。１ｍｇのＤＮＡ／ｍＬでの、０．５ｍＬのＰＥＧ化されていない（ＮＰＡ ２０：１）及びＰＥＧ化（ＮＰＡ １０：１：５）ＤＤＸポリプレックス製剤を、様々なメンブレンタイプ：ＰＥＳ（ポリエーテルスルホン）、ＰＶＤＦ（ポリフッ化ビニリデン）、ＰＴＦＥ（ポリテトラフルオロエチレン）、及びナイロンからなる０．２μｍの細孔フィルター（１３ｍｍの直径、１ｃｍ２の表面積）に通して濾過した。ナノ粒子のサイジング、ゼータ電位、導電率、ｐＨ、カチオン（アルギニン）、ポリオール（グルコース）含有量、及びＤＮＡ含有量について、試料を試験した。図２３に示されるように、ＤＮＡ濃度は、ＰＥＧ化ポリプレックス製剤（１０％未満）と比較して、ＰＥＧ化されていないポリプレックス製剤の濾過後に、有意に大きな減少（１５～３２％）を示した。これらの結果は、ＰＥＧ化されていないポリプレックスがアッセイ条件下で凝集することを示唆する。
図２３に示される結果を確認するために、ＰＥＧ化及びＰＥＧ化されていないＤＤＸキトサン－ＤＮＡポリプレックスの生成をスケールアップし、製剤を大量の濾過性について試験した。これらのポリプレックスの場合、カチオン／ポリオールの最終官能基化度は、２８％のＲ及び１０％のＧであった。１％のマンニトール（ＰＥＧ化ポリプレックス）または５％のトレハロース（ＰＥＧ化されていないポリプレックス）を含有する製剤を、滅菌濾過の適合性についてアッセイした。１ｍｇのＤＮＡ／ｍＬのＤＮＡ濃度の５～１５ｍＬのＰＥＧ化されていない（ＮＰＡ ２０：１：０）及びＰＥＧ化（ＮＰＡ１０：１：５）ＤＤＸ ＤＮＡポリプレックス製剤を、０．８／０．２μｍの細孔ＰＥＳフィルタースタック（直径２５ｍｍ、表面積２．８ｃｍ２、各フィルター）に通して濾過した。濾過は、３０ｐｓｉｇの定圧Ｖｍａｘ濾過セットアップによるものであった（図２４に示される概略図）。表面積当たりの収集された濾液の質量として、濾過性を決定した。ナノ粒子のサイジング、ゼータ電位、導電率、ｐＨ、カチオン／ポリオール含有量、及びＤＮＡ含有量について、濾過前及び濾過後の試料を試験した。
図２４に示されるように、ＤＮＡ濃度は、ＰＥＧ化ポリプレックス製剤（１０％未満）と比較して、ＰＥＧ化されていないポリプレックス製剤の濾過後に、有意に大きな減少（１９％）を示した。さらに、ＰＥＧ化されていないポリプレックス製剤は、１．３７５ｇのポリプレックス／ｃｍ２（メンブレン表面積）の最大濃度で供給される場合に、濾過装置を目詰まりさせた。対照的に、ＰＥＧ化ポリプレックスは、試験された全てのポリプレックス濃度（最大５．３５ｇのポリプレックス／ｃｍ２（表面積））でフィルターを目詰まりさせなかった。これは、５．３５ｇ／ｃｍ２を超えるＰＥＧ化ポリプレックス製剤が、濾過可能のままであることを示唆する。
図２５に示されるＮＰＡ（ＰＥＧ化）またはＮＰ（ＰＥＧ化されていない）比及び０．１２５ｍｇ／ｍＬのＤＮＡ濃度（ｃ１２５）でポリプレックスを調製した。カチオン／ポリオール数比は、２５％のＲ及び１０％のＧであった。凍結保護剤は、１％のマンニトール（１％のＭａｎ）であった。製剤を、凍結融解（ＦＴ）または凍結乾燥及び再水和（ＦＤ）させた。試料を％スーパーコイルＤＮＡナノ粒径及びゼータ電位について試験した。図２５に示されるように、ＰＥＧ化されていないＤＤＸ製剤は、凍結／解凍及び凍結乾燥／再水和後に沈殿した。沈殿試料において、％スーパーコイルＤＮＡを測定することができなかった。対照的に、ＰＥＧ化ＤＤＸ製剤（ＮＰＡ １０：１：５及び１０：１：２．５）は、凍結／解凍後に凝集しなかったが、１０：１：１製剤は、凍結／解凍後に若干の凝集を示したが、ＰＥＧ化されていない材料よりも著しく少ない。凍結乾燥／再水和後、試験された全てのＰＥＧ化ＤＤＸ製剤（ＮＰＡ １０：１：５～１０：１：１）は、検出可能な凝集を示さなかった。
ＰＥＧ化ＤＤＸポリプレックスを調製し、直接点滴注入によりイヌ小腸に送達した。図２６に示されるように、イヌにおける遺伝子送達を示すｍＲＮＡコピー数を、送達の２４時間後に検出した。
ＰＥＧ化ポリプレックスを、様々な比の酢酸塩緩衝液と混合して、低ｐＨ環境をシミュレートし、得られた溶液のｐＨを測定した。粒子のゼータ電位も監視した。ｐＨがポリマーコートのアニオンアンカー領域のｐＫａ未満に低下すると（約４．２５）、ゼータ電位が劇的に増加し、ポリマーコートの放出を示す。図２７を参照のこと。
実施例５：
異なるサイズのポリグルタミン酸アンカー領域を有する、二重誘導体化キトサン（Ａｒｇ：グルコン酸）を含有する可逆的にＰＥＧ化されているポリプレックスを、７：１：ＸのＮ：Ｐ：Ａ比（式中、Ｘは３．５、９、または１４．５である）で調製した。ＰＬＥ５は、ＰＥＧ－ポリグルタミン酸（ＰＥＧ－ＰＬＥ）ポリマーを含むポリプレックスを指し、ポリグルタミン酸アンカー領域は、長さが５グルタミン酸アミノ酸である。ＰＬＥ１０は、１０グルタミン酸アミノ酸の長さを指し、ＰＬＥ２５は、２５グルタミン酸アミノ酸長を指す。得られたＰＥＧ化ポリプレックスの物理化学的パラメーターは、以下の表に示される。
Figure 2022524859000069
得られたＰＥＧ化ポリプレックスを粒径についてアッセイし、調製されたポリプレックス間に、サイズの有意な変化は確認されなかった。図２８。ポリプレックスを水に分散させ、ｐＨを測定した。これにより、より大きなＰＬＥ長及び漸減するＮ：Ａ比はともに、水性分散液の高いｐＨに寄与することが示された。図２９。同様に、ゼータ電位測定により、より長いＰＬＥアンカー領域及び漸減するＮ：Ａ比はともに、ゼータ電位を減少させることが示された。図３０（左）。さらに、本発明者らは、Ｎ：Ｐ：Ａ（７：１：Ｘ（Ｘ＝９）～７：１：Ｘ（Ｘ＝１４．５）に調整される）としてのＰＬＥ２５ポリプレックスのゼータ電位を減少させるこの傾向の安定状態を観察し、これにより、最大のＰＥＧ化は、より少ない量のポリマーで達成される。図３０（右）。
ＰＥＧ化ポリプレックスをポリアスパラギン酸（ＰＡＡ）競合アッセイでアッセイし、ＰＡＡを様々な濃度で、ＰＥＧ化ポリプレックスを含有する水性緩衝液中で混合し、核酸の接近可能性を観察した。核酸の接近可能性は、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎアッセイで測定される。接近可能な核酸が、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎに結合し、結合することにより引き起こされる蛍光シグナルの増加が検出される。完全に放出された及び／または完全に接近可能な核酸は、最大の蛍光シグナルを提供する。最大半分のシグナルを達成するために必要とされるＰＡＡ濃度のＥＣ５０は、いかに容易に粒子組成物がＰＡＡ接触により破壊されるか、つまり、試験されたポリプレックスの安定性の尺度である。結果は、ＰＬＥ２５ ＰＥＧ化ポリプレックスが他のポリプレックスよりもいくらか安定性が低いことを示す。図３１～３２。
ＰＥＧ化されているポリプレックスをｃ１２５（１２５μｇ／ｍＬのＤＮＡ）反応混合物として調製し、その後、１：２の体積比（過剰ＦａＳＳＩＦ）でＦａＳＳＩＦ－Ｖ２と混合した。ＦａＳＳＩＦ－Ｖ２と混合された後、ＤＬＳ測定を、３７℃、時間ゼロ（Ｔ０）及び３０分（Ｔ＝３０）で行って、粒径及び多分散度を測定し（図３３）、試料をゼータ電位及びｐＨについてもアッセイした（図３４）。試験された条件下で、ポリアニオン鎖長がより長い（例えば、ＰＬＥ２５が最も安定性が高く、ＰＬＥ５が最も安定性が低い）及びキトサンのアミノ官能基化がより高い（例えば、Ｎ：Ｐ：Ａ １４．５が最も安定性が高く、Ｎ：Ｐ：Ａ ３．５が最も安定性が低い）ポリプレックスは、より安定性が高い。
実施例６：
ＰＥＧ化ポリプレックスに対するポリアニオン種及び分子量（ＭＷ）の影響を試験した。ＰＬＥ（ポリグルタミン酸）、ＰＬＤ（ポリアスパラギン酸、すなわち、ＰＡＡ）、及びＨＡ（ヒアルロン酸）を研究した。４．５１％のトレハロース溶液を、貯蔵安定剤として使用した。ＰＥＧポリアニオンワーキング溶液を調製した。
ＰＥＧ－ＨＡ２５は、トレハロース希釈液に溶解せずに、ゲル状種になった。１００ｘに希釈すると、ゲルは、溶解しなかった。ＰＥＧ－ＨＡ２５は、さらなる分析から除外された。得られたｃ２５０溶液を、ボルテックスしながら、ＰＥＧポリアニオン溶液をｃ２５０溶液に添加することにより、１：１ｖ／ｖ比でＰＥＧポリアニオンと混合した。ＰＥＧポリアニオンを添加した後、ボルテックスを１０秒間続けた。以下のＰＥＧ化ポリプレックスを生成した。
Figure 2022524859000070
上記の組成物を周囲温度で１時間インキュベートした後、さらに分析した。
別々に、二重誘導体化キトサン核酸ポリプレックスの溶液を、４．５１％のトレハロース溶液中で１０００μｇ／ｍＬ（ｃ１０００）の核酸濃度から１２５μｇ／ｍＬ（ｃ１２５）の核酸濃度に希釈した。凍結融解（Ｆ／Ｔ）後、外観、ｐＨ、サイズ、ゼータ電位、及び遊離ＤＮＡ含有量について全ての試料を試験した。結果は、以下の表及び図３５～３６に示される。
Figure 2022524859000071
Figure 2022524859000072
Figure 2022524859000073
Figure 2022524859000074
ポリプレックス試料をアガロースゲル電気泳動で分析して、複合体を形成していない核酸を検出した。図３７。ＰＥＧ－ＰＬＤ５０を用いてＰＥＧ化されている７：１：３０ Ｎ：Ｐ：Ａポリプレックス（図３７、下段の６～８）を除いて、試験された全ての試料は、検出可能な複合体を形成していない核酸を示さなかった。
結果は、以下を示唆する。ＰＥＧ－ＰＬＥ１０、ＰＥＧ－ＰＬＤ１０、及びＰＥＧ－ＰＬＤ５０は、ＰＥＧ化の７：１のＮＰ比でＤＤＸポリプレックスと相溶性がある。Ｆ／Ｔ後、ｃ１２５ ＰＥＧ化ポリプレックス溶液のいずれにも、沈殿物が観察されなかった。ＰＥＧ－ＰＬＥ１０及びＰＥＧ－ＰＬＤ１０は、ポリプレックスと混合した場合は同様に挙動する。ポリプレックスのサイズは、ＰＥＧ化後に１４０ｎｍから１６０ｎｍに増加した。サイズは、７：１：３．５、７：１：５、７：１：９、７：１：１５、及び７：１：３０のＮＰＡ比で、１６０ｎｍの安定水準に達した。ゼータ電位は、ＰＥＧポリアニオン比が増加するにつれて減少するが、減少は、７：１：９を超えると遅くなり、ＰＥＧ化が飽和に達し得ることが示唆される。ＰＥＧ－ＰＬＤ５０の場合、ＰＥＧ化後に、ＮＰＡ比が７：１：１５まで、ポリプレックスのサイズは、ＰＥＧ化前のポリプレックス（７：１：０）と同等である。７：１：３０のＮＰＡで、ポリプレックスサイズは、ＰＥＧ化後に４４０ｎｍに増加した。ＰＥＧ－ＰＬＤ５０ＰＥＧ化ポリプレックスのゼータ電位は、ＰＥＧ－ＰＬＤ５０比が増加するにつれて減少する。７：１：３０のＰＥＧ－ＰＬＤ５０で、遊離ＤＮＡは観察されたが、他の製剤では、遊離ＤＮＡは見られなかった。これは、７：１：３０のＰＥＧ－ＰＬＤ５０のポリプレックス内の核酸が、緩く包まれ、及び／またはＰＬＤ－５０が誘導体化キトサンの核酸への結合を破壊することを示唆する。
実施例６：
非共有結合的な可逆的ＰＥＧ化の効果を共有結合的なＰＥＧ化と比較した。図３８に示すように、滴定可能なポリアニオンアンカー領域を有する非共有結合的にＰＥＧ化されているポリプレックス及び共有結合的にＰＥＧ化されているポリプレックスはともに、ポリアニオンアンカー領域の負電荷を維持するｐＨ条件下で中性に近いゼータ電位を有すると予想される。ポリアニオンアンカー領域を低ｐＨ（例えば、ｐＨ２）で中性または正電荷に滴定すると、非共有結合的にＰＥＧ化されているポリプレックスのゼータ電位が検出可能に増加するはずである。対照的に、共有結合しているＰＥＧは、放出することができず、ゼータ電位は、それほど変化しないはずである。
図３９に示されるように、２つの異なる共有結合的なＰＥＧ化方策を研究した。最初に、ＰＥＧ－ＰＬＥを二重誘導体化（ＤＤＸ）キトサンに架橋して、架橋ＰＥＧ－キトサン原料を形成し、ＤＮＡを添加してポリプレックス（キトサンに架橋されたＰＥＧ）を形成した。（図３９、中段）。次に、可逆的にＰＥＧ化されているポリプレックスを形成し、ＥＤＣ／ＮＨＳを添加して、ＰＥＧ－ＰＡポリマーをポリプレックスと共有結合的に架橋した（ポリプレックスに架橋されたＰＥＧ）。（図３９、下）。共有結合的にＰＥＧ化されているポリプレックスはともに、ｐＨを６～２に調整した後、ゼータ電位において微小変化を示した。対照的に、可逆的にＰＥＧ化されているポリプレックスのゼータ電位は、大幅に増加した。遊離ポリアスパラギン酸（ＰＡＡ）で誘発することにより、安定性についてもポリプレックスを試験した。ＰＡＡ誘発により、ポリプレックス中の核酸を、可逆的にＰＥＧ化されているポリプレックス及びキトサンポリプレックスに架橋したＰＥＧから放出させた。対照的に、ポリプレックス形成後の架橋は、試験された条件下でＰＡＡ誘発後に核酸を放出しないポリプレックスを提供した。
７：１：Ｘ（Ｘは、９、３、または１である）のＮ：Ｐ：Ａで可逆的にＰＥＧ化されているポリプレックスについて、トランスフェクション効率をアッセイし、ＰＥＧ化されていないポリプレックス（７：１：０）と比較した。結果は、トランスフェクション効率が可逆的ＰＥＧ化により低下しなかったことを示した。図４０。
可逆的にＰＥＧ化されているポリプレックス及び共有結合的にＰＥＧ化されているポリプレックスのトランスフェクション効率を比較した。図４１に示されるように、可逆的にＰＥＧ化されているポリプレックスは、高いトランスフェクション効率を維持したが、両方のタイプの共有結合的にＰＥＧ化されているポリプレックスは、低いトランスフェクション効率を示した。
実施例７：
核酸、キトサン、及びＰＥＧ－ポリアニオンポリマーの１段階混合により形成された可逆的にＰＥＧ化されているポリプレックス（１段階）のトランスフェクション効率を、予め形成されたキトサンＤＮＡポリプレックスをＰＥＧ－ポリアニオンポリマーと混合することにより形成された可逆的にＰＥＧ化されているポリプレックス（２段階）と比較した。１段階または２段階のＰＥＧ化ポリプレックスの結腸内送達の２４時間後に結腸組織で、ｍＲＮＡ発現を検出した。１段階または２段階のＰＥＧ化ポリプレックスの膀胱内送達の２４時間後に膀胱組織で、ｍＲＮＡ及びタンパク質を検出した。図４２～４３に示される結果は、１段階ポリプレックス及び２段階ポリプレックスの両方が、試験された条件下で同様のトランスフェクション効率を示すことを示す。理論に拘束されることを望むものではないが、通常は、サイズが小さい１段階ポリプレックスは、高粘度の粘膜において優れた拡散特性を示し得ると仮定される。
均等物
本明細書に記載の全ての刊行物、特許、及び特許出願は、全体が、あらゆる目的のために、それぞれ個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により組み込まれることが具体的且つ個別に示されるのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。上記の開示は、独立した有用性を有する複数の別個の発明を包含し得る。これらの発明のそれぞれが、好ましい形態（複数可）で開示されているが、本明細書に開示及び例示されたその特定の実施形態は、多数の変形が可能であるので、限定的な意味で考慮されるべきではない。本発明の主題は、本明細書に開示の様々な要素、特徴、機能、及び／または特性の全ての新規且つ非自明な組み合わせ及び副組み合わせを含む。以下の特許請求の範囲は、特に、新規且つ非自明であるとみなされる特定の組み合わせ及び副組み合わせを指摘する。特徴、機能、要素、及び／または特性の他の組み合わせ及び副組み合わせで実行される発明は、本出願で、本出願の優先権を主張する出願で、または関連出願で特許請求されてもよい。そのような特許請求の範囲もまた、異なる発明に関するものであれ、同じ発明に関するものであれ、元の特許請求の範囲と比較して範囲が広くとも、狭くとも、等しくとも、または異なっていてようとも、本開示の発明の主題内に含まれるものとみなされる。

Claims (39)

  1. 組成物であって、
    （ａ）アミノ官能基化キトサン及び少なくとも１つの核酸分子を含むキトサン誘導体ナノ粒子を含む複合体を含み、前記少なくとも１つの核酸分子が、前記キトサン誘導体ナノ粒子に、３：１を超えるアミノ酸対リン（Ｎ：Ｐ）モル比で、非共有結合的に結合しており、それにより、正電荷を有する誘導体化キトサン核酸複合体を形成し、さらに、前記組成物が、
    （ｂ）前記キトサン誘導体ナノ粒子に非共有結合的に結合している複数の線状ブロックコポリマーを含み、前記線状ブロックコポリマーが、少なくとも１つのポリアニオン（ＰＡ）アンカー領域及び少なくとも１つのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）尾部領域を含み、前記ＰＥＧ－ＰＡ分子が、前記キトサン誘導体ナノ粒子に非共有結合的に結合しており、
    前記組成物が、約１：１００超且つ約１０：１未満であるアミノ酸対アニオン（Ｎ：Ａ）モル比を含む、前記組成物。
  2. 前記線状ブロックコポリマーが、ＰＡアンカー領域及びＰＥＧ尾部領域を含む二元ブロックコポリマーである、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記線状ブロックコポリマーが、２つのＰＥＧ尾部領域に隣接する中央のＰＡアンカー領域、または、代わりに、２つのＰＡアンカー領域に隣接する中央のＰＥＧ尾部領域を含む三元ブロックコポリマーである、請求項１に記載の組成物。
  4. 前記ＰＡ尾部領域が、ポリペプチドを含み、前記ポリペプチドが、負荷電である、請求項１に記載の組成物。
  5. 前記ＰＡ尾部領域が、炭水化物を含み、前記炭水化物が、負荷電である、請求項１に記載の組成物。
  6. 前記炭水化物は、複数のカルボン酸、リン酸、及び／または硫酸部分を含む、請求項５に記載の組成物。
  7. 前記炭水化物が、グリコサミノグリカンである、請求項６に記載の組成物。
  8. ＰＥＧ－ＰＡ分子が、
    （ａ）ＰＥＧ－ポリグルタミン酸（ＰＥＧ－ＰＧＡ）分子、
    （ｂ）ＰＥＧ－ポリアスパラギン酸（ＰＥＧ－ＰＡＡ）分子、もしくは
    （ｃ）ＰＥＧ－ヒアルロン酸（ＰＥＧ－ＨＡ）分子、
    または（ａ）～（ｃ）のうちの１つ、もしくは２つ、もしくは全ての組み合わせ
    を含む、請求項１に記載の組成物。
  9. 前記ＰＥＧ－ＰＡ分子の前記ＰＥＧ部分が、約５００Ｄａ～約５０，０００Ｄａ、好ましくは、約１，０００Ｄａ～約１０，０００Ｄａ、好ましくは、約１，５００Ｄａ～約７，５００Ｄａ、さらにより好ましくは、約３，０００Ｄａ～約５，０００Ｄａ、最も好ましくは、約５，０００Ｄａの重量平均分子量（Ｍｗ）を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の組成物。
  10. 前記ＰＥＧ－ＰＡ分子の前記ＰＡ部分が、約５００Ｄａ～約３，０００Ｄａ、より好ましくは、約１，０００Ｄａ～約２，５００Ｄａ、より好ましくは、１，５００Ｄａの重量平均分子量（Ｍｗ）を含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の組成物。
  11. 前記ＰＥＧ－ＰＡ分子の前記ＰＡ部分が、例えば、約５～約２５の酸性アミノ酸を含む線状ポリペプチドを含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の組成物。
  12. 前記Ｎ：Ｐモル比が、約３：１超且つ約１００：１未満、より好ましくは、約５：１超且つ約５０：１未満、さらにより好ましくは、約５：１超且つ約３０：１未満、さらにより好ましくは、約５：１超且つ約２０：１未満、さらにより好ましくは、約５：１且つ約１０：１未満、最も好ましくは、約７：１である、請求項１～１１のいずれか１項に記載の組成物。
  13. 前記Ｎ：Ａモル比が、約１：７５超及び約８：１未満、より好ましくは、約１：５０超及び約６：１未満、さらにより好ましくは、約１：２５超及び約６：１未満、さらにより好ましくは、約１：１０超及び約６：１未満、さらにより好ましくは、約１：５超及び約６：１未満である、請求項１～１２のいずれか１項に記載の組成物。
  14. 前記Ｎ：Ｐモル比が、約１：８～約３０：１（例えば、～約２０：１、１５：１、１０：１、８：１、または７：１）であり、前記Ｐ：Ａモル比が、約１：５０～約１：５であり、より好ましくは、前記Ｎ：Ａモル比が、約１：１０～約５、より好ましくは、約１：５～約２、より好ましくは、約１：３～約１．５、より好ましくは、約１：２．５～約１であり、さらにより好ましくは、前記Ｎ：Ｐ：Ａ比が、約７：１：７、約７：１：１２、または約７：１：１７である、請求項１～１１のいずれか１項に記載の組成物。
  15. 前記キトサン誘導体ナノ粒子が、式ＩＩのポリオールを含むか、または式ＩＩのポリオールで官能基化されている、請求項１～１４のいずれか１項に記載の組成物：
    Figure 2022524859000075
     （式中、
    （ａ）Ｒ２は、Ｈ及びヒドロキシルから選択され、
    （ｂ）Ｒ３は、Ｈ及びヒドロキシルから選択され、
    （ｃ）Ｘは、１つ以上のヒドロキシル置換基で任意に置換されたＣ２－Ｃ６アルキレンから選択される）。
  16. 前記キトサン誘導体ナノ粒子が、式ＩＩＩのポリオールを含む、請求項１～１４のいずれか１項に記載の組成物：
    Figure 2022524859000076
     （式中、
    －－－－－Ｙは、＝Ｏまたは－Ｈ２であり、
    Ｒ２は、Ｈ及びヒドロキシルから選択され、
    Ｒ３は、Ｈ及びヒドロキシルから選択され、
    Ｘは、１つ以上のヒドロキシル置換基で任意に置換されたＣ２－Ｃ６アルキレンから選択され、
    Figure 2022524859000077
     が、前記ポリオール及び前記誘導体化キトサン間の結合を表す）。
  17. アミノ官能基化キトサンが、アルギニン、リジン、またはオルニチンで官能基化され、好ましくは、アルギニンで官能基化される、請求項１～１６のいずれか１項に記載の組成物。
  18. 前記組成物が、
    （ａ）空腹時人工腸液中で少なくとも２４時間、または
    （ｂ）３７℃で哺乳動物の尿中に分散させて、少なくとも１時間、
    安定である、請求項１～１７のいずれか１項に記載の組成物。
  19. 前記組成物が、さらに、界面活性剤、賦形剤、及び／または貯蔵安定剤を含む、請求項１～１８のいずれか１項に記載の組成物。
  20. 前記組成物が、前記貯蔵安定剤を含み、好ましくは、前記貯蔵安定剤が、単糖、二糖、多糖、またはその還元アルコールであり、さらにより好ましくは、前記貯蔵安定剤が、トレハロース及びマンニトールから選択される、請求項１９に記載の組成物。
  21. 前記組成物が、前記界面活性剤を含み、好ましくは、前記界面活性剤が、ポロキサマーを含み、より好ましくは、前記ポロキサマーが、ポロキサマー４０７である、請求項１９または２０に記載の組成物。
  22. 前記少なくとも１つの核酸が、ＲＮＡを含む、請求項１～２１のいずれか１項に記載の組成物。
  23. 前記少なくとも１つの核酸が、ＤＮＡを含む、請求項１～２１のいずれか１項に記載の組成物。
  24. 前記組成物が、精製水中に分散させた前記組成物を含む水性分散液中、４℃で、４８時間、もしくは少なくとも４８時間、または１週間安定である、請求項１～２３のいずれか１項に記載の組成物。
  25. 前記組成物が、凍結／解凍及び／または乾燥／再水和後に前記水性分散液中で安定であり、好ましくは、前記乾燥が、噴霧乾燥、凍結乾燥、噴霧凍結乾燥、蒸発、または超臨界乾燥を含み、より好ましくは、前記乾燥が、凍結乾燥または噴霧乾燥を含む、請求項２４に記載の組成物。
  26. 前記組成物が、例えば、前記水性分散液中、４℃で、少なくとも４８時間、または１週間後に、０．２未満の多分散指数を示す、請求項２４または２５に記載の組成物。
  27. 請求項１～２６に記載の組成物のいずれか１つを作成するための方法であって、前記方法が、
    （ａ）アミノ官能基化キトサン及び前記少なくとも１つの核酸を含む前記キトサン誘導体ナノ粒子を含む複合体を提供すること、ならびに
    （ｂ）前記複合体を、ＰＥＧ－ＰＡ分子を含む溶液と混合し、それにより、前記組成物を含む反応混合物を形成すること、
    を含む、前記方法。
  28. （ａ）の前記複合体が、０．０１ｍｇ／ｍＬ～２５ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは、０．０５～１０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは、０．１０～５ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは、０．１０～２ｍｇ／ｍＬのヌクレオチドの濃度で提供される、請求項２７に記載の方法。
  29. （ａ）及び（ｂ）が、１：１０～１０：１、好ましくは、１：５～５：１、より好ましくは、１：２～２：１の（ｖ／ｖ）比で、さらにより好ましくは、約１：１の比で混合される、請求項２７または２８に記載の方法。
  30. 前記方法が、さらに、前記反応混合物を濃縮することを含み、好ましくは、前記濃縮が、限外濾過、溶媒昇華、及び／または溶媒蒸発を含み、より好ましくは、前記限外濾過が、タンジェンシャルフロー濾過を含む、請求項２７、２８、または２９に記載の方法。
  31. 前記アミノ官能基化キトサンが、親水性ポリオールを含むか、またはそれで官能基化される、請求項２７に記載の方法。
  32. 前記方法が、アミノ官能基化キトサン、少なくとも１つの核酸、及びＰＥＧ－ＰＡ分子を同時または逐次的に混合し、それにより、前記組成物を含む反応混合物を形成すること、を含む、請求項１～２６の組成物のいずれか１つを作製するための方法。
  33. 前記方法が、同時に、前記アミノ官能基化キトサン、少なくとも１つの核酸、及び前記ＰＥＧ－ＰＡ分子を組み合わせ、それにより、前記組成物を含む反応混合物を形成することを含む、請求項３２に記載の方法。
  34. 核酸を細胞にトランスフェクトする方法であって、前記細胞を、請求項１～２２のいずれか１項による組成物、または、請求項２３～３３に記載の方法のいずれかにより生成された組成物と接触させることを含む、前記方法。
  35. 前記細胞が、粘膜組織を含むか、またはそれに由来する細胞である、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記粘膜組織が、肺組織、鼻組織、眼組織、膣組織、膀胱組織、または胃腸管組織である、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記細胞が、対象の腸細胞であり、前記接触が、前記対象に前記組成物を経口または直腸内投与することを含む、請求項３５に記載の方法。
  38. 前記細胞が、前記膀胱の細胞であり、前記接触が、前記対象への前記組成物の膀胱内投与を含む、請求項３５に記載の方法。
  39. 前記方法が、ＰＥＧ－ＰＡを含む前記ポリマー構成成分を含まない粒子と比較して、粘膜付着の減少を提供する、請求項２７～３３のいずれか１項に記載の方法。
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