KR20210151822A - 키토산-핵산 나노입자의 가역성 코팅 및 이의 사용 방법 - Google Patents

키토산-핵산 나노입자의 가역성 코팅 및 이의 사용 방법 Download PDF

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KR20210151822A
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다니엘 베이뢰
페이 롄 마
문 탐 나탈리 친
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Abstract

다중음이온 앵커 영역 및 적어도 하나의 폴리에틸렌 글리콜 꼬리 영역을 갖는 선형 블록 공중합체를 포함하는 가역적으로 결합된 중합체 코트를 함유하는 키토산-핵산 폴리플렉스 조성물이 본원에 기재되어 있다. 일부 경우에, 조성물은 언코팅된 입자와 비교하여 향상된 안정성 및/또는 점막 확산을 나타낸다. 일부 경우에, 가역적으로 결합된 중합체 코트는 언코팅된 입자와 비교하여 표적 세포 또는 조직의 형질감염을 방해하지 않거나 향상시킨다.

Description

키토산-핵산 나노입자의 가역성 코팅 및 이의 사용 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 3월 14일에 출원된 미국 임시 출원 번호 62/818,425; 2019년 10월 18일에 출원된 62/923,403; 및 2019년 10월 21일에 출원된 62/924,131에 대한 우선권을 주장하며, 그 내용이 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로 본원에 포함된다.
키토산은 키틴의 탈아세틸화된 형태이다. 키토산은 N-아세틸-D-글루코사민 및 D-글루코사민의 무독성 양이온성 중합체이다. 키토산은 핵산과 복합체를 형성할 수 있으며 생체적합성 무독성 다당류로서 세포를 형질감염시키기 위한 DNA 전달 비히클로서 사용되어 왔다. 바이러스 벡터의 복잡성과 잠재적인 독성으로 인해 핵산의 비-바이러스 전달에 키토산을 사용하는 데 많은 관심이 집중되었다.
유전자 형질감염에 적합한 조성물을 확인하기 위한 시도로 변형된 키토산 및 핵산 사이의 복합체를 포함하는 다수의 키토산/DNA 복합체가 조사되어 왔다(WO 2010/088565; WO 2008/082282). 이러한 복합체는 중요한 물리화학적 및 생물학적 특성, 다른 특성 중에서 용해도, 응집 경향, 복합체 안정성, 입자 크기, DNA 방출 능력 및 형질감염 효율이 다양한 것으로 밝혀졌다.
키토산 골격을 아르기닌 및 친수성 폴리올로 작용성화함으로써 형질감염 효율이 향상된 키토산-핵산 폴리플렉스가 개발되었다(미국 특허 번호 10,046,066 및 9,623,112). 특히, 이러한 폴리플렉스는 전신 순환과 비교하여 상당한 pH 변화, 효소 활성 및 복잡한 점막 상호작용으로 인해 독특한 도전을 제시하는 장 미세환경에서 현저한 안정성을 입증했다.
점막 장벽은 접착적 및 입체적 상호작용을 통해 외부 미립자를 효율적으로 포획한 후, 이어서 신속하게 제거하는 뮤신 섬유의 조밀한 네트워크로 인해, 나노입자 전달 시스템에 대한 특별한 도전을 대표한다. 실제로, 특히 경구 약물 전달의 경우, 장 점막은 오십(50)분 만에 뒤집힐 수 있으므로 투여된 입자를 매우 효율적으로 제거할 수 있다(Lehr 등, Int'l J. Pharm. 70:235-40(1991)). 뮤신 섬유는 양전하를 띤 입자에 대해 높은 친화력을 갖는 고도로 글리코실화된 부분 뿐만 아니라 폴리-(락틱-코-글리콜산)(PLGA)과 같은 많은 통상적으로 사용되는 약물 전달 물질을 포함하여 높은 결합력으로 소수성 물질을 결합할 수 있는 주기적 소수성 도메인을 함유한다. 입체 장애와 결합된 이러한 복잡한 전하 상호작용은 나노입자 약물 전달 형태가 어떤 형태의 차폐 없이 극복하기 어려운 것으로 입증되었다. 그러나 반대로, 기존의 차폐 접근법은 종종 형질감염 능력이 크게 감소된 나노입자를 생성한다.
폴리에틸렌 글리콜(PEG)은 적어도 초기에 상호 침투 네트워크 효과를 통해 점막접착을 증가시켜 약물 전달을 연장시키는 입증된 능력에 근거하여 광범위한 차폐 전략에서 주요 구성성분으로 등장했다(Huckaby 및 Lai, Advanced Drug Delivery Reviews 124:125-39(2018)). 그러나 불행하게도, 향상된 점막접착은 입자가 기저 상피 또는 다른 관련 표적 조직에 도달하는 것을 방지하기 때문에, 이러한 점막접착 전략은 핵산과 같은 세포내 전달을 필요로 하는 치료제에는 효과를 갖지 않는다. 역설적이게도, 아마도 PEG 코팅은 입자 확산을 향상시키 위한 점액-불활성 접근법에서도 사용되는 것으로 나타났다. 그러나 특히 이러한 유형의 시스템에 대한 최근 발견 및 결론은 뮤신 친화도를 최소화하고 점액 침투를 향상시키는 데 높은 PEG 이식 밀도의 중요성을 강조했다(Id., Wang 및 Lai, Angew Chem 47:9726-9729(2008)). 이러한 예외적으로 조밀하고 공유적으로-결합된 PEG화 전략은 효율적인 유전자 형질감염에 문제가 있다.
따라서, 개선된 점막 침투 특성을 갖는 생체내 유전자 전달을 위한 새로운 조성물 및 방법이 여전히 필요하다.
개요
본원에서는 음으로 하전된 앵커 영역 및 적어도 하나의 (예: 친수성)비-하전 꼬리 영역을 갖는 다수의 선형 블록 공중합체를 포함하는 가역성(즉, 비-공유적으로 결합된) 중합체 코팅을 사용하여 키토산-핵산 나노입자의 점막접착을 감소시키고 점액 침투를 향상시키기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 바람직한 구현양태에서, 선형 블록 공중합체는 적어도 하나의 다중음이온 앵커 영역 및 적어도 하나의 PEG 꼬리 영역을 포함하는 이블록 또는 삼블록 공중합체이다. 일부 구현양태에서, 본원에 기재된 조성물은 놀랍게도 이전에 고려된 것보다 더 낮은 표면 코팅 밀도에서 감소된 점막접착 및 증진된 점액 침투를 제공한다. 일부 구현양태에서, 본원에 기재된 조성물은 놀랍게도 다중음이온의 존재에도 불구하고 일관된 물리적 및/또는 화학적 안정성을 제공한다. 일부 구현양태에서, 본원에 기재된 조성물은 놀랍게도 가역성 중합체 코팅의 포함에도 불구하고 일관되고/되거나 필적하는 형질감염 효율을 제공한다. 일부 구현양태에서, 본원에 기재된 조성물은 놀랍게도 벌크 및/또는 코팅 또는 캡슐화된 형태로 장기간(예를 들어, 수개월) 저장하는 동안 안정하다. 일부 구현양태에, 본원에 기재된 조성물은 점막 장벽 및/또는 점액 관련 유체(예를 들어, 소변, 또는 위액 또는 장액)와 접촉할 때 놀랍게도 안정하다.
한 측면에서, 본 발명은 다수의 다중음이온-함유 블락 공중합체, 예를 들어각각의 공중합체가 적어도 하나의 다중음이온성 앵커 영역 및 하나 이상의 친수성(예를 들어, 비-하전된) 꼬리 영역을 포함하는 선형 이블락 및/또는 삼블락공중합체와 복합체에서 키토산-유도체 핵산 나노입자(폴리플렉스)를 포함하는 키토산 조성물을 제공한다. 전형적으로, 폴리플렉스는 코어 및 다중음이온-친수성 중합체 형태, 예를 들어 적어도 부분적인 외부 코트를 형성한다. 폴리플렉스 및 다중음이온-함유 블록 공중합체 사이의 복합체는 일반적으로 중합체의 다중음이온 앵커 영역 및 언코팅된(uncoated) 폴리플렉스의 순-양전하 사이의 가역적 및 비-공유 정전기적 상호작용에 의해 형성된다. 일부 경우에, 복합체는 폴리플렉스 및 중합체의 다중음이온 앵커 영역 사이의 정전기적 상호작용의 강도를 감소시키기 위한 이온 강도의 증가 및/또는 중합체의 다중음이온 영역에서 음이온성 모이어티를 양성자화하기 위한 pH의 감소에 의해 다중음이온-친수성 중합체의 전부 또는 일부가 복합체로부터 방출될 수 있다는 점에서 가역적이다.
본 발명의 방법 및 조성물에 유용한 예시적인 이블록 공중합체 분자는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 꼬리 영역 및 다중음이온(PA) 앵커 영역을 포함하는 "PEG-PA" 공중합체 분자이다. 본 발명의 방법 및 조성물에 유용한 예시적인 삼블록 공중합체 분자는 2개의 PEG 꼬리 영역이 측면에 위치된 중앙 PA 앵커 영역[PEG-PA-PEG], 또는 2개의 PA 앵커 영역이 측면에 위치된 중앙 PEG 꼬리 영역[PA-PEG-PA]을 포함하는 "PEG-PA" 공중합체 분자이다.
일부 구현양태에서, 본 발명은 아미노-작용화된 키토산 및 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 키토산-유도체 나노입자를 포함하는 복합체를 제공하며, 여기서 적어도 하나의 핵산 분자는 3:1 초과의 아미노 대 인(N:P) 몰비로 키토산-유도체 나노입자에 비-공유적으로 결합되어서, 이에 의해 양전하를 갖는 유도체화된 키토산 핵산 복합체를 형성하고; 및 다수의 선형 블록 공중합체는 키토산-유도체 나노입자에 비-공유적으로 결합되고, 여기서 블록 공중합체는 적어도 하나의 다중음이온(PA) 앵커 영역 및 적어도 하나의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 꼬리 영역을 포함하고, 조성물은 약 1:100 초과 및 약 10:1 미만의 아미노 대 음이온(N:A) 몰비를 포함한다.
일부 구현양태에서, 선형 블록 공중합체는 PA 앵커 영역 및 PEG 꼬리 영역을 포함하는 이블록 공중합체이다. 일부 구현양태에서, 선형 블록 공중합체는 2개의 PEG 꼬리 영역이 측면에 위치된 중앙 PA 앵커 영역, 또는 대안적으로 2개의 PA 앵커 영역이 측면에 위치된 중앙 PEG 꼬리 영역을 포함하는 삼블록 공중합체이다.
일부 구현양태에서, PA 앵커 영역은 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 폴리펩티드는 음으로 하전된다. 일부 구현양태에서, PEG-PA 분자의 PA 앵커 영역은 탄수화물을 포함하고, 여기서 탄수화물은 음으로 하전된다. 일부 구현양태에서, 탄수화물은 다수의 포스페이트 및/또는 설페이트 모이어티를 포함한다. 일부 구현양태에서, 탄수화물은 다수의 카르복실레이트 모이어티를 포함한다. 일부 구현양태에서, 탄수화물은 다수의 카르복실레이트 모이어티 및 다수의 포스페이트 및/또는 설페이트 모이어티를 포함한다. 일부 구현양태에서, 탄수화물은 포스페이트 및/또는 설페이트 모이어티보다 더 높은 비율 또는 수의 카르복실레이트 모이어티를 포함한다. 예시적인 구현양태에서, 탄수화물은 글리코스아미노글리칸이다.
특정 구현양태에서, PEG-PA 분자는 PEG-폴리글루탐산(PEG-PGA) 분자; PEG-폴리아스파르트산(PEG-PAA) 분자; 또는 PEG-히알루론산(PEG-HA) 분자, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 구현양태에서, PEG-PA 분자의 PEG 꼬리 영역은 약 500 Da 내지 약 50,000 Da, 바람직하게는 약 1,000 Da 내지 약 10,000 Da, 더욱 바람직하게는 약 1,500 Da 내지 약 7,500 Da, 더욱 더 바람직하게는 약 3,000 Da 내지 약 5,000 Da, 가장 바람직하게는 약 5,000 Da의 중량 평균 분자량(Mw)을 포함한다. 일부 구현양태에서, PEG-PA 분자의 PA 꼬리 영역은 약 500 Da 내지 약 3,000 Da, 더욱 바람직하게는 약 1,000 Da 내지 약 2,500 Da, 더욱 바람직하게는 약 1,500 Da의 중량 평균 분자량(Mw)을 포함한다.
일부 구현양태에서, N:P 몰비는 약 3:1 초과 및 약 100:1 미만, 더욱 바람직하게는 약 5:1 초과 및 약 50:1 미만, 더욱 더 바람직하게는 약 5:1 초과 및 약 30:1 미만, 더욱 더 바람직하게는 약 5:1 초과 및 약 20:1 미만, 더욱 더 바람직하게는 약 5:1 초과 및 약 10:1 미만이다. 일부 경우에, N:P 몰비는 약 3:1 내지 약 30:1이다. 일부 경우에, N:P 몰비는 약 3:1 내지 약 20:1이다. 일부 경우에, N:P 몰비는 약 3:1 내지 약 10:1이다. 일부 경우에, N:P 몰 비는 약 7:1이다.
일부 구현양태에서, N:A 몰비는 약 1:75 초과 및 약 8:1 미만, 더욱 바람직하게는 약 1:50 초과 및 약 6:1 미만, 더욱 더 바람직하게는 약 1:25 초과 및 약 6:1 미만, 더욱 더 바람직하게는 약 1:10 초과 및 약 6:1 미만, 더욱 더 바람직하게는 약 1:5 초과 및 약 6:1 미만이다.
일부 구현양태에서, N:P 몰비는 약 1:8 내지 약 8:1이고, P:A 몰비는 약 0.02 내지 약 0.2이며, 더욱 바람직하게는 N:A 몰비는 약 0.1 내지 약 5, 더욱 바람직하게는 약 0.2 내지 약 2, 더욱 바람직하게는 약 0.3 내지 약 1.5, 더욱 바람직하게는 약 0.4 내지 약 1이고, 더욱 더 바람직하게는 N:P:A 비율이 약 7:1:7; 약 7:1:12; 또는 약 7:1:17이다.
일부 구현양태에서, N:P 몰비는 약 1:8 내지 약 30:1이고, P:A 몰비는 약 1:50 내지 약 1:5이며, 더욱 바람직하게는 N:A 몰비는 약 1:10 내지 약 5, 더욱 바람직하게는 약 1:5 내지 약 2, 더욱 바람직하게는 약 1:3 내지 약 1.5, 더욱 바람직하게는 약 1:2.5 내지 약 1이다. 일부 구현양태에서, N:P 몰비는 약 1:5 내지 약 20:1이고, P:A 몰비는 약 1:50 내지 약 1:5이며, 더욱 바람직하게는 N:A 몰비는 약 1:10 내지 약 5, 더욱 바람직하게는 약 1:5 내지 약 2, 더욱 바람직하게는 약 1:3 내지 약 1.5, 특히 더욱 바람직하게는 약 1:2.5 내지 약 1이다. 일부 구현양태에서, N:P 몰비는 약 1:2 내지 약 10:1이고, P:A 몰비는 약 1:50 내지 약 1:5이고, 더욱 바람직하게는 N:A 몰비는 약 1:10 내지 약 5, 더욱 바람직하게는 약 1:5 내지 약 2, 더욱 바람직하게는 약 1:3 내지 약 1.5, 더욱 바람직하게는 약 1:2.5 내지 약 1이다.
일부 구현양태에서, N:P 몰비는 약 1:1 내지 약 30:1이고, P:A 몰비는 약 1:50 내지 약 1:5이고, 더욱 바람직하게는 N:A 몰비는 약 1:10 내지 약 5, 더욱 바람직하게는 약 1:5 내지 약 2, 더욱 바람직하게는 약 1:3 내지 약 1.5, 가장 바람직하게는 약 1:2.5 내지 약 1이다. 일부 구현양태에서 N:P 몰비는 약 1:1 내지 약 20:1이고, P:A 몰비는 약 1:50 내지 약 1:5이고, 더욱 바람직하게는 N:A 몰비는 약 1:10 내지 약 5, 더욱 바람직하게는 약 1:5 내지 약 2, 더욱 바람직하게는 약 1:3 내지 약 1.5, 가장 바람직하게는 약 1:2.5 내지 약 1이다. 일부 구현양태에서, N:P 몰 비는 약 1:1 내지 약 15:1이고, P:A 몰비는 약 1:50 내지 약 1:5이고, 더욱 바람직하게는 N:A 몰비는 약 1:10 내지 약 5, 더욱 바람직하게는 약 1:5 내지 약 2, 더욱 바람직하게는 약 1:3 내지 약 1.5, 더욱 더 바람직하게는 약 1:2.5 내지 약 1이다. 일부 구현양태에서, N:P 몰비는 약 1:1 내지 약 10:1이고, P:A 몰비는 약 1:50 내지 약 1:5이고, 더욱 바람직하게는 N:A 몰비는 약 1:10 내지 약 5, 더욱 바람직하게는 약 1:5 내지 약 2, 더욱 바람직하게는 약 1:3 내지 약 1.5, 특히 더욱 바람직하게는 약 1:2.5 약 1이다.
일부 구현양태에서, N:P 몰비는 약 2:1 내지 약 30:1이고, P:A 몰비는 약 1:50 내지 약 1:5이며, 더욱 바람직하게는 N:A 몰비는 약 1:10 내지 약 5, 더욱 바람직하게는 약 1:5 내지 약 2, 더욱 바람직하게는 약 1:3 내지 약 1.5, 가장 바람직하게는 약 1:2.5 내지 약 1이다. 일부 구현양태에서 N:P 몰비는 약 2:1 내지 약 20:1이고, P:A 몰비는 약 1:50 내지 약 1:5이며, 더욱 바람직하게는 N:A 몰비는 약 1:10 내지 약 5, 더욱 바람직하게는 약 1:5 내지 약 2, 더욱 바람직하게는 약 1:3 내지 약 1.5, 가장 바람직하게는 약 1:2.5 내지 약 1이다. 일부 구현양태에서, N:P 몰 비는 약 2:1 내지 약 15:1이고, P:A 몰비는 약 1:50 내지 약 1:5이고, 더욱 바람직하게는 N:A 몰비는 약 1:10 내지 약 5, 더욱 바람직하게는 약 1:5 내지 약 2, 더욱 바람직하게는 약 1:3 내지 약 1.5, 특히 더욱 바람직하게는 약 1:2.5 내지 약 1이다. 일부 구현양태에서, N:P 몰비는 약 2:1 내지 약 10:1이고, P:A 몰비는 약 1:50 내지 약 1:5이고, 더욱 바람직하게는 N:A 몰비는 약 1:10 내지 약 5, 더욱 바람직하게는 약 1:5 내지 약 2, 더욱 바람직하게는 약 1:3 내지 약 1.5, 더욱 더 바람직하게는 약 1:2.5 약 1이다.
일부 구현양태에서, 아미노-작용화된 키토산은 아르기닌, 라이신, 또는 오르니틴 작용화된, 바람직하게는 아르기닌 작용화된다. 일부 구현양태에서, 아미노-작용화된 키토산-유도체 나노입자는 폴리올을 추가로 포함한다. 일부 구현양태에서, 아미노-작용화된 키토산은 폴리올을 추가로 포함한다. 일부 구현양태에서, 아미노-작용화된 키토산-유도체 나노입자는 또한 폴리올로 작용화된다. 일부 구현양태에서, 아미노-작용화된 키토산은 또한 폴리올로 작용화된다.
일부 구현양태에서, 조성물은 공복 상태 모의 장액에서 적어도 1시간, 24시간, 48시간, 1주, 또는 1 또는 2개월 동안 안정하다. 일부 구현양태에서, 조성물은 정제수 중의 조성물의 분산액과 같은 수성 분산액에서 4℃에서 적어도 1시간, 24시간, 48시간, 1주, 또는 1 또는 2개월 이상 동안 안정하다. 일부 구현양태에서, 조성물은 정제수 중 4℃에서 적어도 1시간, 24시간, 48시간, 1주, 또는 1 또는 2개월 동안 안정하다. 일부 구현양태에서, 조성물은 소변 중 4℃에서 적어도 1시간, 24시간, 48시간, 1주, 또는 1 또는 2개월 동안 안정하다. 일부 구현양태에서, 조성물은 지정된 시간, 예를 들어 24시간, 48시간, 1주 또는 1 또는 2개월 후 모의 장액 및/또는 수성 분산액 및/또는 소변 및/또는 정제수에서 침전되는 응집체가 실질적으로 없다는 점에서(< 10%) 안정하다.
일부 구현양태에서, 조성물은 동결/해동 및/또는 동결건조/재수화 후 수성 분산액에서 안정하다. 일부 구현양태에서, 조성물은 수용액에서 4℃에서 후에, 또는 적어도 48시간, 1주, 또는 1 또는 2개월 후 0.2 미만의 다분산 지수를 나타낸다. 일부 구현양태에서, 조성물은 건조(예를 들어, 동결건조, 분무-건조, 증발, 초임계 건조, 분무 동결 건조 등) 후 재수화 후 수성 분산액에서 안정하다.
일부 구현양태에서, 조성물은 포유동물 소변에서 적어도 1시간 동안 안정하다. 일부 구현양태에서, 조성물은 실온 또는 37℃에서 포유동물 소변에서 적어도 1시간 동안 안정하다. 일부 구현양태에서, 조성물은 포유동물 소변(예를 들어, 37℃에서)에서 적어도 1시간 후 0.2 미만의 다분산 지수를 나타낸다.
일부 구현양태에서, 조성물은 치료적 핵산으로 세포를 형질감염시킨다. 일부 구현양태에서, 치료적 핵산은 치료적 단백질로 전사된다. 일부 구현양태에서, 치료적 핵산은 내인성 단백질-코딩 유전자의 발현을 억제한다. 일부 구현양태에서, 치료적 핵산은 내인성 유전자의 발현을 억제한다.
일부 구현양태에서, 조성물은 계면활성제, 부형제, 및/또는 저장 안정화제를 추가로 포함한다. 일부 구현양태에서, 저장 안정화제는 단당류, 이당류, 다당류, 또는 이들의 환원된 알코올이고, 더욱 더 바람직하게는 저장 안정화제는 트레할로스 및 만니톨로부터 선택된다. 일부 구현양태에서, 계면활성제는 폴록사머를 포함하며, 보다 바람직하게는 폴록사머는 폴록사머 407이다.
일부 구현양태에서, 적어도 하나의 핵산은 RNA를 포함한다. 일부 구현양태에서, 적어도 하나의 핵산은 DNA를 포함한다.
도 1은 폴리플렉스:중합체 조성물 및 조성물의 제조 방법을 도시한다.
도 2는 본원에 기재된 특정 폴리플렉스:중합체 조성물에 대한 제타 전위와 PEG화도 사이의 역 관계를 도시한다. 아미노-작용화된 키토산(N)에 대한 다중음이온-PEG(A)의 몰비가 증가함에 따라 제타 전위가 감소하여 더 높은 PEG 밀도에서 거의 중성 내지 약간 음의 값에 도달한다.
도 3은 동결 해동 후 폴리플렉스:중합체 조성물의 안정성을 도시한다. [N+] 대 [A-]의 테스트된 비율에서 PEG화된 폴리플렉스는 동결 해동 후에도 안정하게 유지되었다.
도 4는 상이한 부피:부피 비에서 모의 장액에서 폴리플렉스:중합체 조성물의 안정성을 도시한다. FaSSIF-V2= 공복 상태 모의 장액 V2.
도 5는 모의 장액에서 복합체화된 핵산을 보유하는 폴리플렉스:중합체 조성물의 능력을 도시한다. FaSSIF-V1= 공복 상태 모의 장액 V1. FaSSIF-V2= 공복 상태 모의 장액 V2. PP = 폴리플렉스.
도 6은 PEG화된 DD-키토산-핵산 폴리플렉스를 사용한 시험관내 형질감염을 나타낸다.
도 7은 형광 현미경을 사용하여 본원에 기재된 폴리플렉스:중합체 조성물에 대한 점액 응집 검정의 방법 및 결과를 도시한다.
도 8은 트랜스웰 확산 검정을 사용하여 본원에 기재된 폴리플렉스:중합체 조성물에 대해 점액 침투 검정을 수행하는 방법을 도시한다.
도 9는 본원에 기재된 폴리플렉스:중합체 조성물의 트랜스웰 확산 검정의 결과를 도시한다.
도 10은 폴록사머 407의 존재 하에 본원에 기재된 폴리플렉스:중합체 조성물의 트랜스웰 확산 검정의 결과를 도시한다.
도 11은 본원에 기재된 폴리플렉스:중합체 조성물을 제조하는 확장가능한 방법을 도시한다.
도 12는 동결건조 및 재수화, 및 고농도 조건 하에 본원에 기재된 폴리플렉스:중합체 조성물의 안정성을 도시한다.
도 13은 실온 및 4℃에서 최대 4주까지 동결건조된 PEG화 폴리플렉스의 안정성을 도시한다.
도 14는 부형제의 부재 하에 동결건조되고 4℃에서 최대 4주 동안 보관된 본원에 기재된 폴리플렉스:중합체 조성물의 안정성을 도시한다.
도 15는 마우스 방광에 투여되고 후속적으로 수집된 소변에서 회수될 때 본원에 기재된 폴리플렉스:중합체 조성물의 안정성을 도시한다.
도 16은 이식유전자 mRNA 발현에 의해 측정된 바와 같이, 결장내 점적(ICI)에 의해 전달될 때 본원에 기재된 폴리플렉스:중합체 조성물의 현저하게 개선된 생체내 유전자 전달을 도시한다. 투여된 폴리플렉스 제형은 150μg/mL 핵산을 함유하고 3 x 150μL 결장내 점적 주입으로 투여되었다; 투여 후 24시간에 결장 절편을 수확하고 세포 용해물을 사용하여 인간 PD-L1-Fc mRNA를 정량화하였다.
도 17은 이식유전자 단백질 발현에 의해 측정된 바와 같이, 결장내 점적(ICI)에 의해 전달될 때 본원에 기재된 폴리플렉스:중합체 조성물의 현저하게 개선된 생체내 유전자 전달을 도시한다. 투여된 폴리플렉스 제형은 150μg/mL 핵산을 함유하고 3 x 150μL 결장내 점적 주입으로 투여되었다; 투여 후 24시간에 결장 절편을 수확하고 단백질 용해물을 사용하여 맞춤형 중규모 발견(Mesoscale Discovery) 면역검정을 사용하여 인간 PD-L1-Fc 단백질을 정량화하였다.
도 18은 이식유전자 단백질 발현에 의해 측정된 바와 같이, 결장내 점적(ICI)에 의해 전달될 때 본원에 기재된 폴리플렉스:중합체 조성물의 현저하게 개선된 생체내 유전자 전달을 도시한다. 투여된 폴리플렉스 제형은 1000μg/mL 핵산을 함유하고 3 x 150μL 결장내 점적 주입으로 투여되었다; 투여 후 24시간에 결장 절편을 수확하고 단백질 용해물을 사용하여 맞춤형 중규모 발견 면역검정을 사용하여 인간 PD-L1-Fc 단백질을 정량화했다.
도 19는 비-PEG화된 DDX 폴리플렉스와 비교하여 PEG화된 DDX 폴리플렉스의 %슈퍼코일 DNA 함량)의 개선을 보여준다.
도 20은 PEG화된 DDX 폴리플렉스의 저장 안정성을 도시한다.
도 21은 PEG화 및 비-PEG화 DDX 폴리플렉스 제형의 재수화성을 도시한다. PEG화 DDX 폴리플렉스는 비-PEG화 DDX 폴리플렉스(2mg/mL)와 비교하여 더 높은 최종 농도(10mg/mL)에서 안정적으로 재수화될 수 있었다.
도 22는 포유동물 방광에서 배양될 때 표시된 DDX 폴리플렉스 제형의 안정성을 도시한다.
도 23은 소규모에서 테스트될 때 표시된 조건에서 표시된 DDX 폴리플렉스 제형의 여과성을 보여준다.
도 24는 중간 규모에서 테스트될 때 표시된 조건에서 표시된 DDX 폴리플렉스 제형의 여과성을 보여준다.
도 25는 나노입자 크기(nm), 제타 전위(mV) 및 % 슈퍼코일 함량(%SC)으로 표시되는 바와 같이 동결 해동(FT) 및 동결건조/재수화(FD) 후 특정 DDX 폴리플렉스 제형의 안정성을 도시한다.
도 26은 PEG화 이중 유도체화된(DDX) 키토산 DNA 폴리플렉스를 소장으로 직접 전달함으로써 개 소장의 생체내 형질감염을 도시한다.
도 27은 수성 폴리플렉스 제형이 PEG-폴리글루타메이트 중합체의 pKa(~4.25) 미만으로 pH를 낮추기에 충분한 비율로 낮은 pH 아세테이트 완충제와 혼합될 때 제타 전위(mv)의 상당한 증가를 도시하고, 이는 4 미만의 pH에서 PEG화된 폴리플렉스의 언코팅을 나타낸다.
도 28은 표시된 바와 같이 다양한 N:P:A 비율에서 형성된 가역적으로 PEG화된 폴리플렉스의 입자 크기를 도시한다. 상이한 폴리글루타메이트(PLE) 다중음이온 앵커 영역이 테스트되었다: PLE5(5개의 글루타메이트 폴리글루타메이트 영역), PLE10(10개의 글루타메이트 폴리글루타메이트 영역) 및 PLE25(25개의 글루타메이트 폴리글루타메이트 영역).
도 29는 표시된 가역적으로 PEG화된 폴리플렉스의 수성 분산액의 pH를 도시한다.
도 30은 표시된 가역적으로 PEG화된 폴리플렉스의 제타 전위 측정 결과를 도시한다.
도 31은 가역적으로 PEG화된 폴리플렉스의 폴리아스파르트산(PAA) 챌린지의 결과를 도시한다. 핵산 방출은 PAA 농도의 함수로 모니터링되었다. PEG-PLE의 상이한 폴리글루타메이트(PLE) 다중음이온 앵커 영역을 상이한 NPA 비율에서 테스트했다: PLE5(5개의 글루타메이트 폴리글루타메이트 영역), PLE10(10개의 글루타메이트 폴리글루타메이트 영역) 및 PLE25(25개의 글루타메이트 폴리글루타메이트 영역).
도 32는 PEG화 폴리플렉스의 DNA 방출에 필요한 PAA의 수준을 도시한다. PEG-PLE25를 사용하여 제조된 PEG화 폴리플렉스에서의 핵산은 PEG-PLE5 또는 PEG-PLE10으로 제조된 폴리플렉스에서의 핵산보다 더 느슨하게 결합되었다.
도 33은 표시된 PEG화 폴리플렉스의 입자 크기 및 다분산 지수(PDI)에 대한 공복 상태 모의 장액(FaSSIF v2)의 효과를 도시한다.
도 34는 표시된 PEG화된 폴리플렉스의 입자의 제타 전위 및 생성된 수성 분산액의 pH에 대한 공복 상태 모의 장액(FaSSIF v2)의 효과를 도시한다.
도 35는 입자 크기로 측정한 바와 같이 동결 해동 후 PEG화 폴리플렉스(PLE10, PLD10 및 PLD50)의 안정성을 도시한다. 7:1:30의 N:P:A에서 PEG-PLD50 폴리플렉스는 동결 해동 후 증가된 입자 크기를 나타냈다.
도 36은 입자 크기(상부) 및 제타 전위(중간)로 측정한 바와 같이 동결 해동 후 PEG화 폴리플렉스(PLE10, PLD10, 및 PLD50)의 안정성을 도시한다. 7:1:30의 N:P:A에서 PEG-PLD50 폴리플렉스는 동결 해동 후 입자 크기가 증가하고 제타 전위가 낮아졌다. 표시된 폴리플렉스는 P:A 비율이 감소함에 따라(A 증가) 및 음이온성 서브유닛의 수가 증가함에 따라(하단) 수성 분산액으로서 증가하는 pH를 나타냈다.
도 37은 가역적으로 PEG화된 폴리플렉스를 아가로스 겔 전기영동으로 분석하여 비복합체화된 핵산을 검출한 결과를 나타낸다.
도 38은 상이한 pH에서 가역적으로 PEG화된(상단 행) 및 공유적으로 PEG화된 폴리플렉스(하단 행)의 예상되는 거동의 도식적 표현을 도시한다.
도 39는 2개의 pH 2 및 6에서 및 폴리아스파르트산(PAA) 챌린지에 대한 반응으로 가역적으로 PEG화된 폴리플렉스(상단 행) 및 2개의 상이한 공유적으로 PEG화된 폴리플렉스(중앙 및 하단 행)의 용액 거동을 도시한다.
도 40은 비-PEG화 폴리플렉스와 비교하여 가역적으로 PEG화된 폴리플렉스의 형질감염 효율을 도시한다.
도 41은 공유적으로 PEG화된 폴리플렉스와 비교하여 가역적으로 PEG화된 폴리플렉스의 형질감염 효율을 도시한다.
도 42는 마우스로의 결장내 전달 후 1-단계 또는 2-단계 방법으로 제조된 가역적으로 PEG화된 폴리플렉스의 형질감염 효능을 도시한다
도 43은 마우스에 방광내 투여한 후 1-단계 또는 2-단계 방법으로 제조된 가역적으로 PEG화된 폴리플렉스의 형질감염 효능을 도시한다.
1. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 용어, 표기법 및 기타 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는 것으로 의도된다. 일부 경우에, 일반적으로 이해되는 의미를 갖는 용어는 명확성 및/또는 용이한 참조를 위해 본원에 정의되며, 본원에 이러한 정의를 포함하는 것이 반드시 당업계에서 일반적으로 이해되는 것과의 차이를 나타내는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본원에 기술되거나 참조된 기술 및 절차는 일반적으로 잘 이해되고 당업자에 의해 통상적인 방법론에 기술된 널리 이용되는 분자 클로닝 방법론을 사용하여 일반적으로 사용된다(Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd ed.(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). 적절한 경우, 상업적으로 이용가능한 키트 및 시약의 사용을 포함하는 절차는 일반적으로 달리 명시되지 않는 한 제조업체가 정의한 프로토콜 및/또는 매개변수에 따라 수행된다.
본원에 사용된 바와 같이, 단수 형태 "하나", 및 "그"는 문맥이 명백하게 달리 나타내지 않는 한 복수 지시 대상을 포함한다.
용어 "약"은 표시된 값 및 그 값의 위 및 아래 범위를 나타내고 포함한다. 특정 구현양태에서, 용어 "약"은 지정된 값 ±10%, ±5%, 또는 ±1%를 나타낸다. 특정 구현양태에서, 표시된 경우, 용어 "약"은 지정된 값 ± 그 값의 1 표준 편차를 나타낸다.
"이들의 조합들"이라는 용어는 그 용어가 지칭하는 요소들의 모든 가능한 조합을 포함한다.
임의의 질병 또는 장애의 "치료하는" 또는 "치료"는 특정 구현양태에서 대상체에 존재하는 질병 또는 장애를 개선하는 것을 지칭한다. 다른 구현양태에서, "치료하는" 또는 "치료"는 대상체에 의해 식별할 수 없는 적어도 하나의 물리적 매개변수를 개선하는 것을 포함한다. 또 다른 구현양태에서, "치료하는" 또는 "치료"는 물리적으로(예를 들어, 식별가능한 증상의 안정화) 또는 생리학적으로(예를 들어, 물리적 매개변수의 안정화) 또는 둘 모두에서 질병 또는 장애를 조절하는 것을 포함한다. 또 다른 구현양태에서, "치료하는" 또는 "치료"는 질병 또는 장애의 발병을 지연시키거나 예방하는 것을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "치료적 유효량" 또는 "유효량"은 대상체에게 투여될 때 질병 또는 장애를 치료하는데 효과적인 항체 또는 조성물의 양을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "대상체"는 포유동물 대상체를 의미한다. 예시적인 대상체는 인간, 원숭이, 개, 고양이, 마우스, 래트, 소, 말, 낙타, 조류, 염소 및 양을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 특정 구현양태에서, 대상체는 인간이다. 일부 구현양태에서, 대상체는 본원에 제공된 항체로 치료될 수 있는 암, 자가면역 질환 또는 병태, 및/또는 감염을 갖는다. 일부 구현양태에서, 대상체는 암, 자가면역 질환 또는 병태, 및/또는 감염이 있는 것으로 의심되는 인간이다.
"키토산"은 N-아세틸글루코사민의 중합체인 키틴의 부분적으로 또는 전체적으로 탈아세틸화된 형태이다. 50% 초과의 탈아세틸화 정도를 갖는 키토산이 본 발명에서 사용된다.
키토산은 탈아세틸화 부위에서 유리 아미노기를 작용화함으로써 유도체화될 수 있다. 본원에 기술된 유도체화된 키토산은 다음을 포함하여 핵산 전달 비히클용으로 유리한 다수의 특성을 갖고 있다: 음전하를 띤 핵산을 효과적으로 결합하고 복합체를 형성하고, 제어가능한 크기의 나노 입자로 형성될 수 있으며, 세포에 의해 흡수될 수 있고, 세포 내에서 적절한 시간에 핵산을 방출할 수 있다. 최종 작용화도가 1% 및 50% 사이인 키토산. (퍼센트 작용화는 작용화 전 또는 부재하에 키토산 중합체의 유리 아미노 모이어티의 수에 따라 결정된다.) 탈아세틸화 및 최종 작용화도는 작용화된 키토산 유도체에 특정 전하 밀도를 부여한다.
본 발명에 따른 폴리올은 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 탄소 골격을 가질 수 있고 적어도 2개의 히드록실 기를 가질 수 있다. 이러한 폴리올, 또는 이들의 조합은 양이온성 모이어티(예를 들어, 라이신, 오르니틴과 같은 아미노기를 포함하는 분자, 구아니디늄 기를 포함하는 분자, 아르기닌, 또는 이들의 조합)로 작용화된 키토산과 같은 키토산 골격에 대한 접합에 유용할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "C2-C6 알킬렌"은 하나 이상의 탄소-탄소 다중 결합을 임의로 함유하는 선형 또는 분지형 2가 탄화수소 라디칼을 지칭한다. 의심의 여지를 피하기 위해, 본원에 사용된 용어 "C2-C6알킬렌"은 알칸, 알켄 및 알킨의 2가 라디칼을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 달리 지시되지 않는 한, 용어 "펩티드" 및 "폴리펩티드"는 상호교환적으로 사용된다.
용어 "폴리펩티드"는 목적하는 작용성 활성을 유지하는 펩티드 등가물, 펩티드 유사체 및 펩티드모방체 뿐만 아니라 통상적인 폴리펩티드(즉, L 또는 D-아미노산을 함유하는 짧은 폴리펩티드)를 지칭하기 위해 가장 넓은 의미로 사용된다. 펩티드 등가물은 하나 이상의 아미노산을 관련 유기산, 아미노산 등으로 대체하거나 측쇄 또는 작용기의 치환 또는 변형에 의해 통상적인 펩티드와 상이할 수 있다.
용어 "산성 아미노산"은 pH 7의 수성 완충액에서 음으로 하전된 측쇄를 갖는 천연 또는 비-천연 발생 아미노산을 지칭한다. 산성 아미노산의 비제한적 예는 아스파르테이트 및 글루타메이트이다.
펩티드모방체는 당업계에 공지된 바와 같이 대안적인 연결로 대체된 하나 이상의 펩티드 연결을 가질 수 있다. 펩티드 골격의 일부 또는 전부는 또한 당업계에 공지된 바와 같이 작용성 아미노산 측쇄의 이동성을 제한하기 위해 형태적으로 구속된 사이클릭 알킬 또는 아릴 치환기로 대체될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 당업계에 잘 알려진 재조합 및 합성 방법과 같은 인식된 방법에 의해 생산될 수 있다. 펩타이드 합성 기술은 잘 알려져 있으며 문헌 Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-2456(1963), Atherton, 등, Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press (1989), 및 Merrifield, Science 232:341-347(1986)에 기술된 기술을 포함한다.
본원에 사용된 "선형 폴리펩티드"는 이의 구성 아미노산 측쇄에 공유적으로 부착된 분지기가 없는 폴리펩티드를 지칭한다. 본원에 사용된 "분지형 폴리펩티드"는 이의 구성 아미노산 측쇄에 공유 부착된 분지형 기를 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다.
본원에 사용된 양이온 또는 폴리올의 "최종 작용화도"는 각각 양이온(예를 들어, 아미노) 또는 폴리올로 작용화된 키토산 골격 상의 양이온(예를 들어, 아미노)기의 백분율을 지칭한다. 따라서, "α:β 비율", "최종 작용화도 비율"(예를 들어, Arg 최종 작용화도:폴리올 최종 작용화도 비율) 등은 용어 "몰비" 또는 "숫자비"와 혼용될 수 있다.
분산 시스템은 연속 매질 전체에 분포된 분산상으로 알려진 미립자 물질로 구성된다. 키토산 핵산 폴리플렉스의 "분산액"은 수화된 키토산 핵산 폴리플렉스를 포함하는 조성물이며, 여기서 폴리플렉스는 매질 전체에 분포되어 있다.
본원에 사용된 "농축 전" 분산액은 농축된 분산액을 형성하기 위한 농축 공정을 거치지 않은 분산액이다.
본원에 사용된 바와 같이, 폴리플렉스 침전물이 "실질적으로 없는"은 육안 검사에서 관찰될 수 있는 입자가 조성물에 본질적으로 없음을 의미한다.
본원에 사용된 생리학적 pH는 6 내지 8의 pH를 지칭한다.
"키토산 핵산 폴리플렉스" 또는 그의 문법적 등가물은 다수의 키토산 분자 및 다수의 핵산 분자를 포함하는 복합체를 의미한다. 바람직한 구현양태에서, (예를 들어, 이중-) 유도체화된-키토산은 상기 핵산과 복합체를 형성한다.
본원에 사용된 용어 "폴리에틸렌 글리콜"("PEG")은 -(CH2CH2-O)-의 반복 단위 및 HO-(CH2CH2-O)n-H의 일반식을 갖는 에틸렌 옥사이드의 중합체를 의미하는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 용어 "모노메톡시 폴리에틸렌 글리콜"("mPEG")은 -(CH2CH2-O)-의 반복 단위 및 CH3O-(CH2CH2-O)n-H의 일반식을 갖는 에틸렌 옥사이드의 중합체를 의미하도록 의도되며, 예를 들어 한쪽 끝이 메톡시기로 덮인 PEG를 의미한다.
2. 조성물
이블록 및/또는 삼블록 공중합체 코팅과 복합체화된 키토산-유도체 핵산 나노입자(폴리플렉스)를 포함하는 키토산 조성물이 본원에 제공되며, 여기서 개별 중합체 분자는 음으로 하전된 앵커 영역 및 하나 이상의 비-하전된 친수성 꼬리 영역을 포함한다. 예시적인 음으로 하전된 앵커 영역은 반복 단위를 포함하는 다중음이온성 앵커 영역을 포함하고, 여기서 반복 단위는 하나 이상의 산성 아미노산과 같은 하나 이상의 음으로 하전된 서브유닛을 포함한다. 예시적인 친수성 꼬리 영역에는 PEG 꼬리 영역 및 이의 유도체, 폴리비닐 알코올 꼬리 영역 및 이의 유도체, 폴리옥사졸린 꼬리 영역 및 이의 유도체, 폴리사르코신 꼬리 영역 및 이의 유도체, 폴리(N-(2-히드록시프로필)메타크릴아미드)(pHPMA) 꼬리 영역 및 이의 유도체, 및 이의 조합을 포함하나 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 방법 및 조성물에 유용한 예시적인 중합체 분자는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 부분 및 다중음이온(PA) 부분을 포함하는 "PEG-PA" 중합체 분자이다.
2.1. 키토산
키토산-유도체 핵산 나노입자의 키토산 성분은 양이온성 작용기 및/또는 친수성 모이어티로 작용화될 수 있다. 2개의 상이한 작용기로 작용화된 키토산은 이중 유도체화된 키토산(DD-키토산)으로 지칭된다. 예시적인 DD-키토산은 친수성 모이어티(예를 들어, 폴리올) 및 양이온성 작용기(예를 들어, 아미노기) 모두로 작용화된다. 예시적인 키토산 유도체는 또한, 예를 들어 U.S. 2007/0281904; 및 U.S. 2016/0235863에 기술되어 있으며, 이들은 각각 참조로 본원에 포함된다.
한 구현양태에서, 본원에 기재된 이중 유도체화된 키토산은 적어도 50%의 탈아세틸화도를 갖는 키토산을 포함한다. 한 구현양태에서, 탈아세틸화도는 적어도 60%, 더욱 바람직하게는 적어도 70%, 더욱 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95%이다. 바람직한 구현양태에서, 본원에 기재된 이중 유도체화된 키토산은 적어도 98%의 탈아세틸화도를 갖는 키토산을 포함한다.
본원에 기재된 키토산 유도체는 중성 및 생리학적 pH에서 가용성인 평균 분자량 범위를 가지며, 본 발명의 목적을 위해 3 내지 110kDa 범위의 분자량을 포함한다. 본원에 기술된 구현양태는 바람직한 전달 및 형질감염 특성을 가질 수 있고 크기가 작고 유리한 용해도를 갖는 유도체화된 키토산의 더 낮은 평균 분자량(< 25kDa, 예를 들어, 약 5kDa 내지 약 25kDa)을 특징으로 한다. 더 낮은 평균 분자량의 유도체화된 키토산은 일반적으로 더 높은 분자량을 갖는 것보다 더 가용성이며, 따라서 더 쉽게 핵산을 방출하고 세포의 증가된 형질감염을 제공하는 핵산/키토산 복합체를 생성한다. 많은 문헌이 키토산 기반 전달 시스템에 대한 이러한 모든 매개변수의 최적화에 전념해 왔다.
통상의 기술자는 키토산이 화학식 I의 구조를 갖는 다수의 분자를 지칭함을 인지하며, 여기서 n은 임의의 정수이고, 각각의 R1은 아세틸 또는 수소로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 선택된 R1의 정도는 수소가 50% 내지 100%이다. 또한, 평균 분자량 3kD 내지 110kD을 갖는다고 지칭된 키토산은 일반적으로 중량 평균 분자량이 각각 3kD 내지 110kD인 다수의 키토산 분자를 의미하며, 여기서 각각의 키토산 분자는 사슬 길이가 상이하다(n+2). "n-량체 키토산"으로 지칭되는 키토산이 반드시 화학식 I의 키토산 분자를 포함할 필요는 없으며, 여기서 각각의 키토산 분자는 n+2의 사슬 길이를 갖는 것으로 잘 알려져 있다. 오히려, 본원에 사용된 "n-량체 키토산"은 각각이 상이한 사슬 길이를 가질 수 있는 다수의 키토산 분자를 지칭하며, 여기서 다수는 n의 사슬 길이를 갖는 키토산 분자와 실질적으로 유사하거나 동일한 평균 분자량을 갖는다. 예를 들어, 24량체 키토산은, 예를 들어 7-50 범위의 상이한 사슬 길이를 갖는 다수의 키토산 분자를 포함하지만, 24의 사슬 길이를 갖는 키토산 분자와 실질적으로 유사하거나 동일한 평균 분자량을 갖는다.
본 발명의 이중 유도체화된 키토산은 또한 폴리올, 또는 폴리올과 같은 친수성 작용기로 작용화될 수 있다. 이론에 얽매이지 않고, 폴리올과 같은 친수성 기로 작용화하면 키토산(Arg-키토산 포함)의 친수성을 증가시키는 데 도움이 될 수 있고/있거나 히드록실 기를 제공할 수 있다고 가정된다. 일부 구현양태에서, 키토산-유도체 나노입자의 친수성 작용기는 글루콘산이거나 글루콘산을 포함한다(WO 2013/138930). 일부 구현양태에서, 키토산-유도체 나노입자의 친수성 작용기는 글루코스이거나 이를 포함한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 친수성 작용기는 폴리올을 포함할 수 있다(U.S. 2016/0235863). 키토산의 작용화를 위한 예시적인 폴리올은 하기에 추가로 기술된다.
본원에 기재된 작용화된 키토산 유도체는 이중 유도체화된 키토산 화합물, 예를 들어 양이온-키토산-폴리올 화합물을 포함한다. 일반적으로, 양이온-키토산-폴리올 화합물은 아르기닌, 라이신, 오르니틴, 또는 구아니디늄을 포함하는 분자, 또는 이들의 조합과 같은 아미노-함유 모이어티로 작용화된다. 특정 구현양태에서, 양이온-키토산-폴리올 화합물은 하기 화학식 I의 구조를 갖는다:
Figure pct00001
(I)
여기서 n은 1 내지 650의 정수이고,
α는 양이온 모이어티(예: 라이신, 오르니틴과 같은 아미노기를 포함하는 분자, 구아니디늄기를 포함하는 분자, 아르기닌, 또는 이들의 조합)의 최종 작용화도이고,
β는 폴리올의 최종 작용화도이고; 및
각각의 R1은 수소, 아세틸, 양이온(예를 들어, 아르기닌) 및 폴리올로부터 독립적으로 선택된다.
바람직하게는, 본 발명의 이중 유도체화된 키토산은 양이온성 아미노산인 아르기닌으로 작용화될 수 있다.
한 구현양태에서, 키토산-유도체 나노입자는 1%, 2%, 4%, 7%, 8%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 또는 이상의 최종 작용화도에서 글루콘산과 커플링된 키토산을 포함한다. 한 구현양태에서, 키토산-유도체 나노입자는 1%, 2%, 4%, 7%, 8%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 또는 그 이상의 최종 작용화도에서 글루코스와 커플링된 키토산을 포함한다. 한 구현양태에서, 키토산 유도체 나노입자는 약 1% 내지 약 25%의 최종 작용화도에서 양이온성 모이어티(예를 들어, 아르기닌)와 커플링된 키토산을 포함한다. 한 구현양태에서, 키토산 유도체 나노입자는 약 10% 내지 약 40%의 최종 작용화도에서 양이온성 모이어티(예를 들어, 아르기닌)와 커플링된 키토산을 포함한다.
한 구현양태에서, 키토산 유도체 나노입자는 약 10% 내지 약 35%의 최종 작용화도에서 양이온성 모이어티(예를 들어, 아르기닌)와 커플링된 키토산을 포함한다. 한 구현양태에서, 키토산 유도체 나노입자는 약 20% 내지 약 35%의 최종 작용화도에서 양이온성 모이어티(예를 들어, 아르기닌)와 커플링된 키토산을 포함한다. 한 구현양태에서, 키토산 유도체 나노입자는 약 25% 내지 약 35%의 최종 작용화도에서 양이온성 모이어티(예를 들어, 아르기닌)와 커플링된 키토산을 포함한다. 한 실시양태에서, 키토산 유도체 나노입자는 약 25% 내지 약 30%, 바람직하게는 28%의 최종 작용화도에서 양이온성 모이어티(예를 들어, 아르기닌)와 커플링된 키토산을 포함한다.
한 구현양태에서, 키토산 유도체 나노입자는 약 15% 내지 약 40%의 최종 작용화도에서 양이온성 모이어티(예를 들어, 아르기닌)와 커플링된 키토산을 포함한다. 한 구현양태에서, 키토산 유도체 나노입자는 약 15% 내지 약 35%의 최종 작용화도에서 양이온성 모이어티(예를 들어, 아르기닌)와 커플링된 키토산을 포함한다. 한 구현양태에서, 키토산 유도체 나노입자는 약 15% 내지 약 30%의 최종 작용화도에서 양이온성 모이어티(예를 들어, 아르기닌)와 커플링된 키토산을 포함한다. 한 구현양태에서, 키토산 유도체 나노입자는 약 15% 내지 약 28%의 최종 작용화도에서 양이온성 모이어티(예를 들어, 아르기닌)와 커플링된 키토산을 포함한다.
한 구현양태에서, 키토산 유도체 나노입자는 약 10% 내지 약 35%의 최종 작용화도에서 양이온성 모이어티(예를 들어, 아르기닌)와 커플링된 키토산을 포함한다. 한 구현양태에서, 키토산 유도체 나노입자는 약 10% 내지 약 30%의 최종 작용화도에서 양이온성 모이어티(예를 들어, 아르기닌)와 커플링된 키토산을 포함한다. 한 구현양태에서, 키토산 유도체 나노입자는 약 10% 내지 약 28%의 최종 작용화도에서 양이온성 모이어티(예를 들어, 아르기닌)와 커플링된 키토산을 포함한다. 한 구현양태에서, 키토산 유도체 나노입자는 약 28%의 최종 작용화도에서 양이온성 모이어티(예를 들어, 아르기닌)와 커플링된 키토산을 포함한다.
한 구현양태에서, 키토산-유도체 나노입자는 약 2% 내지 약 30%, 약 5% 내지 약 30%, 약 7.5% 내지 약 30%, 약 5% 내지 약 25%, 약 5% 내지 약 22%, 약 5% 내지 약 20%, 약 5% 내지 약 15%, 또는 약 5% 내지 약 10%의 최종 작용화도에서 글루콘산과 커플링된 키토산을 포함한다. 한 구현양태에서, 키토산-유도체 나노입자는 약 7.5% 내지 약 25%, 약 7.5% 내지 약 20%, 약 7.5% 내지 약 15%, 약 7.5% 내지 약 12%의 최종 작용화도에서 글루콘산과 커플링된 키토산을 포함한다. 한 구현양태에서, 키토산-유도체 나노입자는 약 10%의 최종 작용화도에서 글루콘산과 커플링된 키토산을 포함한다.
한 구현양태에서, 키토산-유도체 나노입자는 약 2% 내지 약 30%, 약 5% 내지 약 30%, 약 7.5% 내지 약 30%, 약 5% 내지 약 25%, 약 5% 내지 약 22%, 약 5% 내지 약 20%, 약 5% 내지 약 15%, 또는 약 5% 내지 약 10%의 최종 작용화도에서 친수성 폴리올과 커플링된 키토산을 포함한다. 한 구현양태에서, 키토산-유도체 나노입자는 약 7.5% 내지 약 25%, 약 7.5% 내지 약 20%, 약 7.5% 내지 약 15%, 또는 약 7.5% 내지 약 12%의 최종 작용화도에서 친수성 폴리올과 커플링된 키토산을 포함한다. 한 구현양태에서, 키토산-유도체 나노입자는 약 10%의 최종 작용화도에서 친수성 폴리올과 커플링된 키토산을 포함한다.
한 구현양태에서, 키토산-유도체 나노입자는 약 2% 내지 약 30%, 약 5% 내지 약 30%, 약 7.5% 내지 약 30%, 약 5% 내지 약 25%, 약 5% 내지 약 22%, 약 5% 내지 약 20%, 약 5% 내지 약 15%, 또는 약 5% 내지 약 10%의 최종 작용화도에서 글루코스와 커플링된 키토산을 포함한다. 한 구현양태에서, 키토산-유도체 나노입자는 약 7.5% 내지 약 25%, 약 7.5% 내지 약 20%, 약 7.5% 내지 약 15%, 또는 약 7.5% 내지 약 12%의 최종 작용화도에서 글루코스와 커플링된 키토산을 포함한다. 한 구현양태에서, 키토산-유도체 나노입자는 약 10%의 최종 작용화도에서 글루코스와 커플링된 키토산을 포함한다.
한 구현양태에서, 키토산-유도체 나노입자는 약 2% 내지 약 40%의 최종 작용화도에서 양이온(예를 들어, 아르기닌) 및 약 2% 내지 약 30%의 최종 작용화도에서 친수성 폴리올(예를 들어, 글루코스 또는 글루콘산)과 커플링된 키토산을 포함한다. 한 구현양태에서, 키토산-유도체 나노입자는 약 5% 내지 약 40%의 최종 작용화도에서 양이온(예를 들어, 아르기닌) 및 약 5% 내지 약 25%의 최종 작용화도에서 친수성 폴리올(예를 들어, 글루코스 또는 글루콘산)과 커플링된 키토산을 포함한다. 한 구현양태에서, 키토산-유도체 나노입자는 약 7.5% 내지 약 40%의 최종 작용화도에서 양이온(예를 들어, 아르기닌) 및 약 7.5% 내지 약 20%의 최종 작용화도에서 친수성 폴리올(예를 들어, 글루코스 또는 글루콘산)과 커플링된 키토산을 포함한다. 한 구현양태에서, 키토산-유도체 나노입자는 약 10% 내지 약 40%의 최종 작용화도에서 양이온(예를 들어, 아르기닌) 및 약 7.5% 내지 약 15%, 또는 약 10%의 최종 작용화도에서 친수성 폴리올(예를 들어, 글루코스 또는 글루콘산)과 커플링된 키토산을 포함한다.
한 구현양태에서, 키토산-유도체 나노입자는 약 2% 내지 약 35%의 최종 작용화도에서 양이온(예를 들어, 아르기닌) 및 약 2% 내지 약 30%의 최종 작용화도에서 친수성 폴리올(예를 들어, 글루코스 또는 글루콘산)과 커플링된 키토산을 포함한다. 한 구현양태에서, 키토산-유도체 나노입자는 약 5% 내지 약 35%의 최종 작용화도에서 양이온(예를 들어, 아르기닌) 및 약 5% 내지 약 25%의 최종 작용화도에서 친수성 폴리올(예를 들어, 글루코스 또는 글루콘산)과 커플링된 키토산을 포함한다. 한 구현양태에서, 키토산-유도체 나노입자는 약 7.5% 내지 약 35%의 최종 작용화도에서 양이온(예를 들어, 아르기닌) 및 약 7.5% 내지 약 20%의 최종 작용화도에서 친수성 폴리올(예를 들어, 글루코스 또는 글루콘산)과 커플링된 키토산을 포함한다. 한 구현양태에서, 키토산-유도체 나노입자는 약 10% 내지 약 35%의 최종 작용화도에서 양이온(예를 들어, 아르기닌) 및 약 7.5% 내지 약 15%, 또는 약 10%의 최종 작용화도에서 친수성 폴리올(예를 들어, 글루코스 또는 글루콘산)과 커플링된 키토산을 포함한다.
한 구현양태에서, 키토산-유도체 나노입자는 약 10% 내지 약 30%의 최종 작용화도에서 양이온(예를 들어, 아르기닌) 및 약 2% 내지 약 30%의 최종 작용화도에서 친수성 폴리올(예를 들어, 글루코스 또는 글루콘산)과 커플링된 키토산을 포함한다. 한 구현양태에서, 키토산-유도체 나노입자는 약 12% 내지 약 30%의 최종 작용화도에서 양이온(예를 들어, 아르기닌) 및 약 5% 내지 약 25%의 최종 작용화도에서 친수성 폴리올(예를 들어, 글루코스 또는 글루콘산)과 커플링된 키토산을 포함한다. 한 구현양태에서, 키토산-유도체 나노입자는 약 14% 내지 약 30%의 최종 작용화도에서 양이온(예를 들어, 아르기닌) 및 약 7.5% 내지 약 20%의 최종 작용화도에서 친수성 폴리올(예를 들어, 글루코스 또는 글루콘산)과 커플링된 키토산을 포함한다. 한 구현양태에서, 키토산-유도체 나노입자는 약 15% 내지 약 30%의 최종 작용화도에서 양이온(예를 들어, 아르기닌) 및 약 7.5% 내지 약 15%, 또는 약 10%의 최종 작용화도에서 친수성 폴리올(예를 들어, 글루코스 또는 글루콘산)과 커플링된 키토산을 포함한다.
한 구현양태에서, 키토산-유도체 나노입자는 약 25%의 최종 작용화도에서 양이온(예를 들어, 아르기닌) 및 약 7.5% 내지 약 15%의 최종 작용화도에서 친수성 폴리올(예를 들어, 글루코스 또는 글루콘산)과 커플링된 키토산을 포함한다. 한 구현양태에서, 키토산-유도체 나노입자는 약 28%의 최종 작용화도에서 양이온(예를 들어, 아르기닌) 및 약 7.5% 내지 약 15%의 최종 작용화도에서 친수성 폴리올(예를 들어, 글루코스 또는 글루콘산)과 커플링된 키토산을 포함한다. 한 구현양태에서, 키토산-유도체 나노입자는 약 25%의 최종 작용화도에서 양이온(예를 들어, 아르기닌) 및 약 5% 내지 약 20%의 최종 작용화도에서 친수성 폴리올(예를 들어, 글루코스 또는 글루콘산)과 커플링된 키토산을 포함한다. 한 구현양태에서, 키토산-유도체 나노입자는 약 28%의 최종 작용화도에서 양이온(예를 들어, 아르기닌) 및 약 5% 내지 약 20%의 최종 작용화도에서 친수성 폴리올(예를 들어, 글루코스 또는 글루콘산)과 커플링된 키토산을 포함한다.
한 바람직한 구현양태에서, 키토산-유도체 나노입자는 약 14%의 최종 작용화도에서 양이온(예를 들어, 아르기닌) 및 약 10%의 최종 작용화도에서 친수성 폴리올(예를 들어, 글루코스 또는 글루콘산)과 커플링된 키토산을 포함한다. 한 바람직한 구현양태에서, 키토산-유도체 나노입자는 약 15%의 최종 작용화도에서 양이온(예를 들어, 아르기닌) 및 약 12%의 최종 작용화도에서 친수성 폴리올(예를 들어, 글루코스 또는 글루콘산)과 커플링된 키토산을 포함한다. 또 다른 바람직한 구현양태에서, 키토산-유도체 나노입자는 약 14%의 최종 작용화도에서 아르기닌 및 약 10%의 최종 작용화도에서 글루코스와 커플링된 키토산을 포함한다. 또 다른 바람직한 구현양태에서, 키토산-유도체 나노입자는 약 15%의 최종 작용화도에서 아르기닌 및 약 12%의 최종 작용화도에서 글루코스와 커플링된 키토산을 포함한다.
한 바람직한 구현양태에서, 키토산-유도체 나노입자는 약 28%의 최종 작용화도에서 양이온(예를 들어, 아르기닌) 및 약 10%의 최종 작용화도에서 친수성 폴리올(예를 들어, 글루코스 또는 글루콘산)과 커플링된 키토산을 포함한다. 또 다른 바람직한 구현양태에서, 키토산-유도체 나노입자는 약 28%의 최종 작용화도에서 아르기닌 및 약 10%의 최종 작용화도에서 글루코스와 커플링된 키토산을 포함한다.
일부 구현양태에서, 적절한 경우, DD-키토산은 DD-키토산 유도체, 예를 들어, 리간드가 부착된 DD-키토산과 같은 추가 작용화를 포함하는 DD 키토산을 포함한다. "유도체"는 공유적으로 변형된 N-아세틸-D-글루코사민 및/또는 D-글루코사민 단위를 포함하는 키토산-기반 중합체뿐만 아니라 다른 단위를 혼입하거나, 다른 모이어티에 부착된 키토산-기반 중합체의 넓은 범주를 포함하는 것으로 이해될 것이다. 유도체는 종종 아르기닌-작용화된 키토산으로 수행되는 것과 같이 글루코사민의 히드록실기 또는 아민기의 변형을 기반으로 한다. 키토산 유도체의 예는 트리메틸화 키토산, PEG화 키토산, 티올화 키토산, 갈락토실화 키토산, 알킬화 키토산, PEI-포함 키토산, 우론산 변형 키토산, 글리콜 키토산 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 키토산 유도체에 대한 추가 교시에 대해서는 pp.63-74 of "Non-viral Gene Therapy", K. Taira, K. Kataoka, T. Niidome (editors), Springer-Verlag Tokyo, 2005, ISBN 4-431-25122-7; Zhu 등, Chinese Science Bulletin, December 2007, vol. 52(23), pp. 3207-3215; 및 Varma 등, Carbohydrate Polymers 55(2004)77-93을 참고한다.
2.2. 키토산 핵산 폴리플렉스
키토산-유도체 나노입자 조성물은 일반적으로 적어도 하나의 핵산 분자, 바람직하게는 다수의 이러한 핵산 분자를 함유한다. 전형적인 핵산 분자는, 예를 들어, 다수의 포스포디에스테르 또는 그의 유도체(예를 들어, 포스포로티오에이트)의 형태로 핵산 골격의 성분으로서 인을 포함한다. 핵산에 대한 양이온-작용화된 키토산-유도체의 비율은 양이온(+) 대 인(P) 몰비를 특징으로 할 수 있으며, 여기서 (+)는 양이온 작용화된 키토산-유도체의 양이온을 나타내고 (P)는 핵산 골격의 인을 나타낸다. 전형적으로, (+):(P) 몰비는 키토산-유도체-핵산 복합체가 PEG-PA 중합체 분자의 부재 하에 양전하를 갖도록 선택된다. 따라서, (+):(P) 몰비는 일반적으로 1보다 크다. 바람직한 구현양태에서, (+):(P) 몰비는 1.5보다 크거나, 적어도 2, 또는 2보다 크다. 특정 바람직한 구현양태에서, (+):(P) 몰비는 2보다 크다.
일부 경우에, (+):(P) 몰비는 3:1이거나 약 3:1이다. 일부 경우에, (+):(P) 몰비는 4:1이거나 약 4:1이다. 일부 경우에, (+):(P) 몰비는 5:1이거나 약 5:1이다. 일부 경우에, (+):(P) 몰비는 6:1이거나 약 6:1이다. 일부 경우에, (+):(P) 몰비는 7:1이거나 약 7:1이다. 일부 경우에, (+):(P) 몰비는 8:1이거나 약 8:1이다. 일부 경우에, (+):(P) 몰비는 9:1이거나 약 9:1이다. 일부 경우에, (+):(P) 몰비는 10:1이거나 약 10:1이다.
일부 경우에, (+):(P) 몰비는 1 초과 내지 약 20:1 이하, 약 2 내지 약 20:1 이하, 또는 약 2 내지 약 10:1 이하이다. 일부 경우에, (+):(P) 몰비는 약 2 초과 내지 약 20:1 이하, 약 2 초과 내지 약 10:1 이하이다. 일부 경우에, (+):(P) 몰비는 약 3 내지 약 20:1 이하, 약 3 내지 약 10:1 이하, 약 3 내지 약 8:1 이하, 또는 약 3 내지 약 7:1 이하이다. 일부 경우에, (+):(P) 몰비는 약 3 내지 약 20:1 이하, 약 3 내지 약 10:1 이하, 약 3 내지 약 8:1 이하, 또는 약 3 내지 약 7:1 이하이다.
특정 구현양태에서, (+):(P) 몰비는 100:1, 바람직하게는 100:1 미만이다. 예를 들어, 특정 구현양태에서, (+):(P) 몰비는 1 초과 내지 100:1 이하일 수 있다. 일부 경우에, (+):(P) 몰비는 2 초과 내지 100:1 이하일 수 있다. 일부 경우에, (+):(P) 몰비는 3 이상 내지 100:1 이하일 수 있다. 일부 경우에, (+):(P) 몰비는 5 이상 내지 100:1 이하일 수 있다. 일부 경우에, (+):(P) 몰비는 7 이상 내지 100:1 이하일 수 있다. 일부 경우에, (+):(P) 몰비는 2 초과 내지 50:1 이하일 수 있다. 일부 경우에, (+):(P) 몰비는 3 이상 내지 50:1 이하일 수 있다. 일부 경우에, (+):(P) 몰비는 5 이상 내지 50:1 이하일 수 있다. 일부 경우에, (+):(P) 몰비는 7 이상 내지 50:1 이하일 수 있다. 일부 경우에, (+):(P) 몰비는 2 초과 내지 25:1 이하일 수 있다. 일부 경우에, (+):(P) 몰비는 3 이상 내지 25:1 이하일 수 있다. 일부 경우에, (+):(P) 몰비는 5 이상 내지 25:1 이하일 수 있다. 일부 경우에, (+):(P) 몰비는 7 이상 내지 25:1 이하일 수 있다.
일부 구현양태에서, 키토산-유도체 나노입자의 양이온성 작용기는 아미노기이거나 이를 포함한다. 이러한 아미노-작용화된 키토산-유도체 나노입자의 예는 구아니디늄 또는 구아니디늄 기를 포함하는 분자, 라이신, 오르니틴, 아르기닌, 또는 이들의 조합으로 작용화된 키토산을 함유하는 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 바람직한 구현양태에서, 양이온성 작용기는 아르기닌이다. 핵산에 대한 아미노-작용화된 키토산-유도체의 비율은 아미노(N) 대 인(P) 몰비를 특징으로 할 수 있으며, 여기서 (N)은 아미노-작용화된 키토산-유도체 내의 아미노기의 질소 원자를 의미하고 (P)는 핵산 골격의 인을 의미한니다. 전형적으로, N:P 몰비는 PEG-PA 중합체 분자의 부재 하에 키토산-유도체-핵산 복합체가 생리학적으로 적절한 pH에서 양전하를 갖도록 선택된다. 따라서, N:P 몰비는 일반적으로 1보다 크다. 바람직한 구현양태에서, N:P 몰비는 1.5보다 크거나, 적어도 2, 또는 2보다 크다. 특정 바람직한 구현양태에서, N:P 몰비는 2보다 크다.
일부 경우에, N:P 몰비는 3:1이거나 약 3:1이다. 일부 경우에, N:P 몰비는 4:1이거나 약 4:1이다. 일부 경우에, N:P 몰비는 5:1이거나 약 5:1이다. 일부 경우에, N:P 몰비는 6:1이거나 약 6:1이다. 일부 경우에, N:P 몰비는 7:1이거나 약 7:1이다. 일부 경우에, N:P 몰비는 8:1이거나 약 8:1이다. 일부 경우에, N:P 몰비는 9:1이거나 약 9:1이다. 일부 경우에, N:P 몰비는 10:1이거나 약 10:1이다.
일부 경우에, N:P 몰비는 1 초과 내지 약 20:1 이하, 약 2 내지 약 20:1 이하, 또는 약 2 내지 약 10:1 이하이다. 일부 경우에, N:P 몰비는 약 2 초과 내지 약 20:1 이하, 약 2 초과 내지 약 10:1 이하이다. 일부 경우에, N:P 몰비는 약 3 내지 약 20:1 이하, 약 3 내지 약 10:1 이하, 약 3 내지 약 8:1 이하, 또는 약 3 내지 약 7:1 이하이다. 일부 경우에, N:P 몰비는 3 내지 약 20:1 이하, 약 3 내지 약 10:1 이하, 약 3 내지 약 8:1 이하, 또는 약 3 내지 약 7:1 이하이다.
특정 구현양태에서, N:P 몰비는 100:1, 바람직하게는 100:1 미만이다. 예를 들어, 특정 구현양태에서, N:P 몰비는 1 초과 내지 100:1 이하일 수 있다. 일부 경우에, N:P 몰비는 2 초과 내지 100:1 이하일 수 있다. 일부 경우에, N:P 몰비는 3 이상 내지 100:1 이하일 수 있다. 일부 경우에, N:P 몰비는 5 이상 내지 100:1 이하일 수 있다. 일부 경우에, N:P 몰비는 7 이상 내지 100:1 이하일 수 있다. 일부 경우에, N:P 몰비는 2 초과 내지 50:1 이하일 수 있다. 일부 경우에, N:P 몰비는 3 이상 내지 50:1 이하일 수 있다. 일부 경우에, N:P 몰비는 5 이상 내지 50:1 이하일 수 있다. 일부 경우에, N:P 몰비는 7 이상 내지 50:1 이하일 수 있다. 일부 경우에, N:P 몰비는 2 초과 내지 25:1 이하일 수 있다. 일부 경우에, N:P 몰비는 3 이상 내지 25:1 이하일 수 있다. 일부 경우에, N:P 몰비는 5 이상 내지 25:1 이하일 수 있다. 일부 경우에, N:P 몰비는 7 이상 내지 25:1 이하일 수 있다.
바람직한 구현양태에서, 본 발명의 폴리플렉스는 2 내지 100, 예를 들어 2 내지 50, 예를 들어 2 내지 40, 예를 들어 2 내지 30, 예를 들어 2 내지 20, 예를 들어, 2 내지 5의 아민 대 포스페이트(N/P) 비를 갖는다. 바람직하게는, N/P 비는 키토산의 분자량에 반비례하며, 즉 더 작은 분자량(예를 들어, 이중) 유도체화된-키토산은 더 높은 N/P 비를 필요로 하고 그 반대도 마찬가지이다.
본 발명의 핵산은 일반적으로 포스포디에스테르 결합을 함유할 것이지만, 어떤 경우에는 다른 골격 또는 다양한 목적, 예를 들어 안정성 및 보호를 위해 혼입된 다른 변형 또는 모이어티를 가질 수 있는 핵산 유사체가 포함될 수 있다. 고려되는 다른 유사체 핵산은 비-리보오스 골격을 갖는 것들을 포함한다. 또한 자연 발생 핵산, 유사체 및 둘 모두의 혼합물을 만들 수 있다. 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있거나 모두 이중 가닥 또는 단일 가닥 서열의 일부를 함유할 수 있다. 핵산은 DNA, RNA 및 하이브리드를 포함하나 이에 제한되지는 않으며, 여기서 핵산은 데옥시리보- 및 리보-뉴클레오티드의 임의의 조합, 및 우라실, 아데닌, 티민, 시토신, 구아닌, 이노신, 크산타닌, 하이포크산타닌, 이소시토신, 이소구아닌 등을 포함하는 염기의 임의의 조합을 함유한다. 핵산은 삼중, 이중 또는 단일 가닥, 안티센스, siRNA, 리보자임, 데옥시리보자임, 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 키메라, 마이크로RNA 및 이들의 유도체를 포함하는 임의의 형태의 DNA, 임의의 형태의 RNA를 포함한다. 핵산에는 펩티드 핵산(PNA), 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고(PMO), 잠금 핵산(LNA), 글리콜 핵산(GNA) 및 트레오스 핵산(TNA)을 포함하나 이에 제한되지 않는 인공 핵산이 포함된다. 인을 포함하지 않는 인공 핵산의 경우, (+):P 또는 N:P 비율의 등가 척도는 뉴클레오티드(또는 뉴클레오티드 유사체) 염기의 수에 의해 근사화될 수 있음이 이해될 것이다.
바람직한 구현양태에서, 조성물의 폴리플렉스는 작용화 전에 평균 분자량이 110kDa 미만, 보다 바람직하게는 65kDa 미만, 더욱 바람직하게는 50kDa 미만, 더욱 바람직하게는 40kDa 미만, 가장 바람직하게는 30kDa 미만인 키토산 분자를 포함한다. 일부 구현양태에서, 조성물의 폴리플렉스는 작용화 전에 15kDa 미만, 10kDa 미만, 7kDa 미만, 또는 5kDa 미만의 평균 분자량을 갖는 키토산을 포함한다.
바람직한 구현양태에서, 폴리플렉스는 평균 680개 미만의 글루코사민 단량체 단위, 보다 바람직하게는 400개 미만의 글루코사민 단량체 단위, 더욱 바람직하게는 310개 미만의 글루코사민 단량체 단위, 더욱 바람직하게는 250개 미만의 글루코사민 단량체 단위, 가장 바람직하게는 190개 미만의 글루코사민 단량체 단위를 갖는 키토산 분자를 포함한다. 일부 구현양태에서, 폴리플렉스는 평균 95개 미만의 글루코사민 단량체 단위, 65개 미만의 글루코사민 단량체 단위, 45개 미만의 글루코사민 단량체 단위, 또는 35개 미만의 글루코사민 단량체 단위를 갖는 키토산 분자를 포함한다.
키토산, 및 (예를 들어, 이중) 유도체화된-키토산 핵산 폴리플렉스는 본원에 기재된 것을 포함하나 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다.
2.2.1. 핵산
상기 기재된 바와 같이, 키토산 폴리플렉스는 다수의 핵산을 함유할 수 있다. 한 구현양태에서, 핵산 성분은 치료적 핵산을 포함한다. 대상(예를 들어, 이중) 유도체화된-키토산 핵산 폴리플렉스는 당업계에 공지된 임의의 치료적 핵산을 사용할 수 있다. 치료적 핵산은 포유동물 세포에서 치료 효과를 발휘할 수 있는 RNA 분자인 치료적 RNA를 포함한다. 치료적 RNA는 메신저 RNA, 안티센스 RNA, siRNA, 짧은 헤어핀 RNA, 마이크로 RNA, 및 효소 RNA를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 치료적 핵산에는 삼중 분자, 단백질 결합 핵산, 리보자임, 데옥시리보자임 및 작은 뉴클레오티드 분자를 형성하도록 의도된 핵산이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
많은 유형의 치료적 RNA가 당업계에 공지되어 있다(Meng 등, A new developing class of gene delivery: messenger RNA-based therapeutics, Biomater. Sci.,5, 2381-2392, 2017; Grimm 등, Therapeutic application of RNAi is mRNA targeting finally ready for prime time? J. Clin. Invest., 117:3633-3641, 2007; Aagaard 등, RNAi therapeutics: Principles, prospects and challenges, Adv. Drug Deliv. Rev., 59:75-86, 2007; Dorsett 등, siRNAs: Applications in functional genomics and potential as therapeutics, Nat. Rev. Drug Discov., 3:318-329, 2004). 여기에는 이중-가닥 짧은 간섭 RNA(siRNA)가 포함된다.
치료적 핵산은 또한 세포독성 단백질 및 전구약물을 포함하는 치료적 단백질을 코딩하는 핵산을 포함한다.
바람직한 구현양태에서, 핵산 성분은 치료적 핵산 구조체를 포함한다. 치료적 핵산 구조체는 치료적 효과를 발휘할 수 있는 핵산 구조체이다. 치료적 핵산 구조체는 치료적 단백질을 코딩하는 핵산 뿐만 아니라 치료적 RNA인 전사체를 생성하는 핵산을 포함할 수 있다. 치료적 핵산은 결함이 있는 유전자에 대한 대체 또는 향상의 역할을 함으로써 유전 치료법을 수행하거나 치료적 생성물을 코딩함으로써 특정 유전자 생성물의 결핍을 보상하는 데 사용될 수 있다. 치료적 핵산은 또한 내인성 유전자의 발현을 억제할 수 있다. 치료적 핵산은 번역 생성물의 전부 또는 일부를 코딩할 수 있고, 세포에 이미 존재하는 DNA와 재조합함으로써 기능할 수 있으며, 이로써 유전자의 결함 부분을 대체할 수 있다. 그것은 또한 단백질의 일부를 코딩하고 유전자 생성물의 공동-억제 덕분에 그 효과를 발휘할 수 있다. 바람직한 구현양태에서, 치료적 핵산은 본원에 참조로 명백히 포함되는 U.S. 2011/0171314에 개시된 것들로부터 선택된다.
바람직한 구현양태에서, 치료적 핵산은 호르몬, 효소, 사이토카인, 케모카인, 항체, 유사분열 인자, 성장 인자, 분화 인자, 혈관신생에 영향을 미치는 인자, 혈액혈전 형성에 영향을 미치는 인자, 혈당 수치에 영향을 미치는 인자, 글루코스 대사에 영향을 미치는 인자, 지질 대사에 영향을 미치는 인자, 혈중 콜레스테롤 수치에 영향을 미치는 인자, 혈중 LDL 또는 HDL 수치에 영향을 미치는 인자, 세포 아폽토시스에 영향을 미치는 인자, 음식 섭취에 영향을 미치는 인자, 에너지 소비에 영향을 미치는 인자, 식욕에 영향을 미치는 인자, 영양소 흡수에 영향을 미치는 인자, 염증에 영향을 미치는 인자, 골 형성에 영향을 미치는 인자로 이루어진 군으로부터 선택되는 치료적 단백질을 코딩한다. 인슐린, 렙틴, 글루카곤 길항제, GLP-1, GLP-2, 그렐린, 콜레시스토키닌, 성장 호르몬, 응고 인자, PYY, 에리트로포이에틴, 염증 억제제, IL-10, IL-12, IL-17 길항제, TNFα 길항제, 성장 호르몬 방출 호르몬 또는 부갑상선 호르몬를 코딩하는 치료적 핵산이 특히 바람직하다.
2.2.1.1. 발현 조절 영역
바람직한 구현양태에서, 본 발명의 폴리플렉스는 코딩 영역에 작동가능하게 연결된 발현 조절 영역을 포함하는 치료적 구조체인 치료적 핵산을 포함한다. 치료적 구조체는 그 자체로 치료적일 수 있거나 치료적 단백질을 코딩할 수 있는 치료적 핵산을 생산한다.
일부 구현양태에서, 치료적 구조체의 발현 조절 영역은 구성적 활성을 보유한다. 다수의 바람직한 구현양태에서, 치료적 구조체의 발현 조절 영역은 구성적 활성을 갖지 않는다. 이것은 치료적 핵산의 동적 발현을 제공한다. "동적" 발현은 시간이 지남에 따라 변하는 발현을 의미한다. 동적 발현은 검출가능한 발현 기간에 의해 분리된 발현이 낮거나 부재하는 여러 기간을 포함할 수 있다. 다수의 바람직한 구현양태에서, 치료적 핵산은 조절가능한 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 이것은 치료적 핵산의 조절가능한 발현을 제공한다.
발현 조절 영역은 작동가능하게 연결된 치료적 핵산의 발현에 영향을 미치는 프로모터 및 인핸서와 같은 조절 폴리뉴클레오티드(본원에서 때때로 요소로 지칭된다)를 포함한다.
본원에 포함된 발현 조절 요소는 박테리아, 효모, 식물 또는 동물(포유류 또는 비포유류)로부터 유래할 수 있다. 발현 조절 영역은 천연 프로모터 및 인핸서 요소와 같은 전장 프로모터 서열뿐만 아니라 하위서열 또는 전장 또는 비-변이 기능(예: 영양소 조절 또는 세포/조직-특이적 발현의 어느 정도의 양을 보유하는)의 전부 또는 일부를 유지하는 폴리뉴클레오티드 변이체를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "기능적" 및 그의 문법적 변이체는 핵산 서열, 하위서열 또는 단편과 관련하여 사용될 때 서열이 천연 핵산 서열의 하나 이상의 기능(예를 들어, 비-변이체 또는 비변형 서열)을 가짐을 의미한다. 본원에 사용된 용어 "변이체"는 서열 치환, 결실 또는 부가, 또는 기타 변형(예를 들어, 뉴클레아제에 내성인 변형된 형태와 같은 화학적 유도체)을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "작동가능한 연결"은 구성요소가 의도한 방식으로 기능할 수 있도록 허용하는 설명된 구성요소의 물리적 병치를 의미한다. 핵산과 작동가능하게 연결된 발현 조절 요소의 예에서, 그 관계는 조절 요소가 핵산의 발현을 조절하도록 하는 관계이다. 전형적으로, 전사를 조절하는 발현 조절 영역은 전사된 핵산의 5' 말단 근처(즉, "업스트림")에 병치된다. 발현 조절 영역은 또한 전사된 서열의 3' 말단(즉, "다운스트림") 또는 전사체 내(예를 들어, 인트론에서)에 위치할 수 있다. 발현 조절 요소는 전사된 서열로부터 떨어진 거리에 위치할 수 있다(예를 들어, 핵산으로부터 100 내지 500, 500 내지 1000, 2000 내지 5000, 또는 그 이상의 뉴클레오티드). 발현 조절 요소의 구체적인 예는 일반적으로 전사된 서열의 5'에 위치하는 프로모터이다. 발현 조절 요소의 다른 예는 전사된 서열의 5' 또는 3', 또는 전사된 서열 내에 위치할 수 있는 인핸서이다.
일부 발현 조절 영역은 작동가능하게 연결된 치료적 핵산에 조절가능한 발현을 부여한다. 신호(때때로 자극으로 지칭된다)는 이러한 발현 조절 영역에 작동가능하게 연결된 치료적 핵산의 발현을 증가 또는 감소시킬 수 있다. 신호에 반응하여 발현을 증가시키는 이러한 발현 조절 영역은 종종 유도성으로 지칭된다. 신호에 반응하여 발현을 감소시키는 이러한 발현 조절 영역은 종종 억제성으로 지칭된다. 일반적으로 이러한 요소에 의해 부여되는 증가 또는 감소의 양은 존재하는 신호의 양에 비례하며; 신호의 양이 많을수록 발현의 증가 또는 감소가 커진다.
다수의 조절가능한 프로모터가 당업계에 공지되어 있다. 바람직한 유도성 발현 조절 영역은 소분자 화합물로 자극되는 유도성 프로모터를 포함하는 것들을 포함한다. 한 구현양태에서, 발현 조절 영역은 경구로 전달할 수 있지만 일반적으로 식품에서 발견되지 않는 화학물질에 반응성이다. 특정 예는, 예를 들어 미국 특허 번호 5,989,910; 5,935,934; 6,015,709; 및 6,004,941에서 찾을 수 있다.
한 구현양태에서, 치료적 구조체는 통합 서열을 추가로 포함한다. 한 구현양태에서, 치료적 구조체는 단일 통합 서열을 포함한다. 또 다른 구현양태에서, 치료적 구조체는 치료적 핵산 또는 그의 일부를 표적 세포의 게놈 내로 통합하기 위한 제 1 및 제 2 통합 서열을 포함한다. 바람직한 구현양태에서, 통합 서열(들)은 마리너, 슬리핑 뷰티, FLP, Cre, ФC31, R, 람다, 및 AAV, 레트로바이러스 및 렌티바이러스와 같은 통합 바이러스로부터의 통합 수단으로 이루어진 군으로부터 선택되는 통합 수단과 조합하여 기능적이다.
한 구현양태에서, 본 발명의 조성물은 치료적 구조체에 더하여 비-치료적 구조체를 추가로 포함하고, 여기서 비-치료적 구조체는 제 2 발현 조절 영역에 작동가능하게 연결된 통합 수단을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 이러한 제 2 발현 조절영역 및 치료적 핵산에 작동가능하게 연결된 발현 조절 영역은 동일하거나 상이할 수 있다. 통합을 위한 코딩된 수단은 바람직하게는 마리너, 슬리핑 뷰티, FLP, Cre, ФC31, R, 람다, 및 AAV, 레트로바이러스 및 렌티바이러스와 같은 통합 바이러스로부터의 통합을 위한 수단으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가 교시를 위해 WO 2008/020318을 참조하고, 이는 그 전체가 참고로 본원에 명시적으로 포함된다. 한 구현양태에서, (예를 들어, 이중) 유도체화된-키토산 핵산 폴리플렉스의 핵산은 인공 핵산이다.
바람직한 인공 핵산은 펩티드 핵산(PNA), 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고(PMO), 잠금 핵산(LNA), 글리콜 핵산(GNA) 및 트레오스 핵산(TNA)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
한 구현양태에서, DD-키토산 핵산 폴리플렉스의 핵산은 치료적 핵산이다. 한 구현양태에서, 치료적 핵산은 치료적 RNA이다. 바람직한 치료적 RNA는 안티센스 RNA, siRNA, 짧은 헤어핀 RNA, 마이크로 RNA, 및 효소 RNA를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
한 구현양태에서, 치료적 핵산은 DNA이다.
한 구현양태에서, 치료적 핵산은 치료적 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
2.3. 폴리올
키토산-유도체 나노입자는 폴리올로 작용화될 수 있다. 일반적으로 본 발명에 유용한 폴리올은 일반적으로 친수성이다. 일부 경우에, 키토산-유도체 나노입자는 아미노기와 같은 양이온성 성분 및 폴리올로 작용화된다. 아미노기와 같은 양이온성 모이어티 및 폴리올로 작용화된 이러한 키토산-유도체 나노입자를 "이중-유도체화된 키토산 나노입자"라고 한다.
일부 구현양태에서, 키토산-유도체 나노입자는 하기 화학식 II의 폴리올을 포함한다:
Figure pct00002
여기서:
R2는 H 및 히드록실로부터 선택되고;
R3은 H 및 히드록실로부터 선택되고; 및
X는 하나 이상의 히드록실 치환기로 임의로 치환된 C2-C6알킬렌으로부터 선택된다.
일부 구현양태에서, 키토산-유도체 나노입자는 화학식 II의 폴리올로 작용화되고, 여기서 R2는 H 및 히드록실로 부터 선택되고; R3는 H 및 히드록실로부터 선택되고; X는 하나 이상의 히드록실 치환기로 임의로 치환된 C2-C6알킬렌으로부터 선택된다.
일부 구현양태에서, 키토산-유도체 나노입자는 하기 화학식 III의 폴리올을 포함한다:
Figure pct00003
여기서:
-----Y는 =O 또는 -H2이고;
R2는 H 및 히드록실로부터 선택되고;
R3은 H 및 히드록실로부터 선택되고;
X는 하나 이상의 히드록실 치환기로 임의로 치환된 C2-C6알킬렌으로부터 선택되고; 및
Figure pct00004
는 폴리올 및 유도체화된 키토산 사이의 결합을 나타낸다.
한 구현양태에서, 3 내지 7개의 탄소를 갖는 본 발명에 따른 폴리올은 하나 이상의 탄소-탄소 다중 결합을 가질 수 있다. 바람직한 구현양태에서, 본 발명에 따른 폴리올은 카르복실기를 포함한다. 추가의 바람직한 구현양태에서, 본 발명에 따른 폴리올은 알데히드기를 포함한다. 당업자는 본 발명에 따른 폴리올이 알데히드기를 포함할 때, 이러한 폴리올이 개방 사슬 형태(알데히드) 및 고리 형태(헤미아세탈) 둘 모두를 포함한다는 것을 인식할 것이다.
폴리올의 비제한적인 예는 글루콘산, 트레온산, 글루코스 및 트레오스를 포함한다. 카르복실 및/또는 알데하이드기를 가질 수 있거나 당류 또는 이의 산 형태일 수 있는 다른 이러한 폴리올의 예는 미국 특허 번호 10,046,066에 더 자세히 기술되어 있으며, 이의 개시 내용은 본원에 참고로 명시적으로 포함된다. 당업자는 폴리올이 특정 입체화학으로 제한되지 않는다는 것을 인식할 것이다.
바람직한 구현양태에서, 폴리올은 2,3-디히드록실프로파노산; 2,3,4,5,6,7-헥사히드록실헵탄알; 2,3,4,5,6-펜타히드록실헥산알; 2,3,4,5-테트라히드록실헥산알; 및 2,3-디히드록실프로판알로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
바람직한 구현양태에서, 폴리올은 D-글리세르산, L-글리세르산, L-글리세로-D-만노헵토스, D-글리세로-L-만노헵토스, D-글루코스, L-글루코스, D-푸코스, L-푸코스, D-글리세르알데히드 및 L-글리세르알데히드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 구현양태에서, 폴리올은 화학식 IV 또는 화학식 V의 화합물일 수 있다:
Figure pct00005
바람직한 구현양태에서, 폴리올은 화학식 IV의 화합물이다. 일부 경우에, 화학식 IV의 폴리올은 환원성 아민화에 의해 키토산에 커플링되었다.
카르복실기를 갖는 친수성 폴리올은 키토산 또는 아민-작용화된 키토산(예를 들어, Arg-커플링된 키토산(Arg-키토산))과 같은 양이온 작용화된 키토산에 커플링될 수 있다. 일부 구현양태에서, 폴리올은 6.0±0.3의 반응 pH에서 커플링된다. 이 pH에서 친수성 폴리올의 카르복실산기는 친핵성 치환 반응 메커니즘에 따라 키토산 골격 상의 커플링되지 않은 아민에 의해 공격당할 수 있다.
천연 당류인 친수성 폴리올은 환원성 아민화에 이은 NaCBH3 또는 NaBH로 환원에 의해 키토산, 예를 들어 아민-작용화된 키토산(예를 들어, Arg-커플링된 키토산(Arg-키토산))과 같은 양이온-작용화된 키토산에 커플링될 수 있다.
2.4. 중합체:폴리플렉스 조성물
키토산 폴리플렉스는 친수성, 비-하전된 부분 및 음으로 하전된(음이온성) 부분을 포함하는 다수의 중합체와 혼합될 수 있다. 상기 기재된 바와 같이, 키토산 폴리플렉스는 음이온성 부분-함유 중합체와 복합하기 전에 또는 부재 하에 양전하를 갖도록 제형화된다. 따라서 적절한 조건하에서, 중합체 성분은 키토산-유도체 핵산 폴리플렉스와 가역적 전하:전하 복합체를 형성할 것이다. 일부 구현양태에서, 중합체 성분의 중합체는 비분지형이다. 일부 구현양태에서, 중합체는 분지형이다. 일부 경우에, 중합체 성분은 분지형 및 비분지형 중합체의 혼합물을 포함한다.
일부 구현양태에서, 투여 후, 세포에 들어간 후 및/또는 세포내섭취 후에 중합체 성분은 키토산 폴리플렉스로부터 방출된다. 이론에 얽매이지 않고, 폴리플렉스와 음이온성 부분-함유 중합체를 복합체화함으로써 형성된 폴리플렉스:중합체 조성물은 형질감염 효율을 실질적으로 방해하지 않으면서 개선된 시험관내, 용액내 및/또는 생체내 안정성을 제공할 수 있다고 가정된다. 일부 구현양태에서, 이렇게 형성된 폴리플렉스:중합체 조성물은, 예를 들어, 그렇지 않으면 중합체 성분이 없는 동일한 폴리플렉스와 비교하여 감소된 점막-접착 특성을 제공할 수 있다.
바람직한 구현양태에서, 폴리플렉스:중합체 조성물은 생리학적 pH에서 낮은 순 양성, 중성 또는 순 음성 제타 전위(약 +10 mV 내지 약 -20 mV)를 갖는다. 이러한 조성물은 생리학적 조건에서 감소된 응집 및 생체내에서 어디에나 있는 음이온성 성분에 대한 감소된 비-특이적 결합을 나타낼 수 있다. 상기 특성은 세포와 접촉하기 위한 이러한 조성물의 이동(예를 들어, 점액에서의 향상된 확산)을 향상시키고 핵산의 향상된 세포내 방출을 초래할 수 있다.
바람직한 구현양태에서, 폴리플렉스:중합체 입자 조성물은 1000nm 미만, 더욱 바람직하게는 500nm 미만, 가장 바람직하게는 200nm 미만의 평균 유체역학적 직경을 갖는다. 특정 구현양태에서, 폴리플렉스:중합체 입자 조성물은 50nm 내지 1000nm 이하, 바람직하게는 50nm 내지 500nm 이하, 가장 바람직하게는 50nm 내지 200nm 이하의 평균 유체역학적 직경을 갖는다. 특정 구현양태에서, 폴리플렉스:중합체 입자 조성물은 50nm 내지 175nm 이하, 바람직하게는 50nm 내지 150nm 이하의 평균 유체역학적 직경을 갖는다. 특정 구현양태에서, 폴리플렉스:중합체 입자 조성물은 75nm 내지 1000nm 이하, 바람직하게는 75nm 내지 500nm 이하, 가장 바람직하게는 75nm 내지 200nm 이하의 평균 유체역학적 직경을 갖는다. 특정 구현양태에서, 폴리플렉스:중합체 입자 조성물은 75nm 내지 175nm 이하, 바람직하게는 75nm 내지 150nm 이하의 평균 유체역학적 직경을 갖는다. 특정 구현양태에서, 폴리플렉스:중합체 입자 조성물은 100nm 초과 및 175nm 미만의 평균 유체역학적 직경을 갖는다.
한 구현양태에서, 폴리플렉스:중합체 조성물은 80%, 적어도 80%, 또는 바람직하게는 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%의 % 수퍼코일 DNA 함량을 갖는다.
한 구현양태에서, 폴리플렉스:중합체 조성물은 생리학적 pH에서 +10mV 내지 -10mV, 가장 바람직하게는 생리학적 pH에서 +5mV 내지 -5mV의 평균 제타 전위를 갖는다.
폴리플렉스:중합체 조성물은 바람직하게는 입자 크기와 관련하여 균질하다. 따라서, 바람직한 구현양태에서, 조성물은 낮은 평균 다분산 지수("PDI")를 갖는다. 특히 바람직한 구현양태에서, 폴리플렉스:중합체 조성물의 분산액은 0.5 미만, 다욱 바람직하게는 0.4 미만, 더욱 바람직하게는 0.3 미만, 더욱 더 바람직하게는 0.25 미만, 가장 바람직하게는 0.2 미만의 PDI를 갖는다.
일부 경우에, 폴리플렉스:중합체 조성물의 분산액은 1회 이상의 동결 해동 주기 후 전술한 PDI, 평균 제타 전위, % 슈퍼코일 DNA, 또는 평균 입자 크기(nm) 또는 크기 범위 중 하나 이상를 나타낸다. 일부 경우에, 폴리플렉스:중합체 조성물의 분산액은 4℃에서 적어도 48시간 동안 용액에 보관한 후 전술한 PDI, 평균 제타 전위, % 슈퍼코일 DNA, 또는 평균 입자 크기(nm) 또는 크기 범위 중 하나 이상을 나타낸다. 일부 경우에, 폴리플렉스:중합체 조성물의 분산액은 4℃에서 적어도 1주 또는 2주, 또는 이상 동안 용액에 보관한 후 전술한 PDI, 평균 제타 전위, % 슈퍼코일 DNA, 또는 평균 입자 크기(nm) 또는 크기 범위 중 하나 이상을 나타낸다.
일부 경우에, 폴리플렉스:중합체 조성물의 분산액은 동결건조 및 재수화 후 전술한 PDI, 평균 제타 전위, % 슈퍼코일 DNA, 또는 평균 입자 크기(nm) 또는 크기 범위 중 하나 이상을 나타낸다. 일부 경우에, 폴리플렉스:중합체 조성물의 분산액은 분무 건조 및 재수화 후 전술한 PDI, 평균 제타 전위, % 슈퍼코일 DNA, 또는 평균 입자 크기(nm) 또는 크기 범위 중 하나 이상을 나타낸다. 일부 경우에, 폴리플렉스:중합체 조성물의 분산액은 적어도 250μg/mL 이상의 핵산 농도로 농축될 때(예를 들어, 접선 유동 여과와 같은 한외여과에 의해) 전술한 PDI, 평균 제타 전위, % 슈퍼코일 DNA, 또는 평균 입자 크기(nm) 또는 크기 범위 중 하나 이상을 나타낸다. 일부 경우에, 폴리플렉스:중합체 조성물의 분산액은 125μg/mL에서 약 1,000μg/mL의 핵산 농도로 농축될 때, 전술한 PDI, 평균 제타 전위, % 슈퍼코일 DNA, 또는 평균 입자 크기(nm) 또는 크기 범위 중 하나 이상을 나타낸다. 일부 경우에, 폴리플렉스:중합체 조성물의 분산액은 125μg/mL에서 약 25,000μg/mL의 핵산 농도로 농축될 때 전술한 PDI, 평균 제타 전위, % 슈퍼코일 DNA, 또는 평균 입자 크기(nm) 또는 크기 범위 중 하나 이상을 나타낸다. 일부 경우에, 폴리플렉스:중합체 조성물의 분산액은 125μg/mL에서 약 2,000μg/mL의 핵산 농도로 농축될 때 전술한 PDI, 평균 제타 전위, % 슈퍼코일 DNA, 또는 평균 입자 크기(nm) 또는 크기 범위 중 하나 이상을 나타낸다. 일부 경우에, 폴리플렉스:중합체 조성물의 분산액은 125μg/mL에서 약 5,000μg/mL의 핵산 농도로 농축될 때 전술한 PDI, 평균 제타 전위, % 슈퍼코일 DNA, 또는 평균 입자 크기(nm) 또는 크기 범위 중 하나 이상을 나타낸다. 일부 경우에, 폴리플렉스:중합체 조성물의 분산액은 125μg/mL에서 약 10,000μg/mL의 핵산 농도로 농축될 때 전술한 PDI, 평균 제타 전위, % 슈퍼코일 DNA, 또는 평균 입자 크기(nm) 또는 크기 범위 중 하나 이상을 나타낸다.
일반적으로, 본원에 기재된 폴리플렉스:중합체 조성물은 동결건조보호제, 동결보호제, 계면활성제, 재수화제 또는 습윤제 등과 같은 부형제가 없는 경우에도 PDI 또는 평균 입자 크기로 측정할 때 유리한 용액 거동(예: 안정성 및/또는 비-응집)을 나타낸다. 일부 경우에, 본원에 기재된 폴리플렉스:중합체 조성물은 생리학적 유체 또는 모의 생리학적 유체에서 PDI 또는 평균 입자 크기로 측정할 때 유리한 용액 거동(예를 들어, 안정성 및/또는 비-응집)을 나타낸다. 예를 들어, 일부 구현양태에서, 본원에 기재된 폴리플렉스:중합체 조성물은 모의 장액, 장액, 모의 소변, 포유동물 소변에서, 포유동물 방광에서 배양될 때(예를 들어, 소변과 접촉하여), 및/또는 장(예: 결장, 소장 또는 대장, 바람직하게는 결장)에서 배양될 때 안정하다. 일부 구현양태에서, 폴리플렉스:중합체 조성물은 본원에 기재된 하나 이상의 조건 하에(예를 들어, 모의 장액에서) 적어도 약 10분, 또는 약 10분 내지 약 1시간 동안, 또는 적어도 약 1시간 이상 동안, 또는 1시간 내지 약 2시간 동안 안정하다.
상기 기재된 바와 같이, 본원에 기재된 폴리플렉스:중합체 조성물은 바람직하게는 조성물에서 실질적으로 크기 안정성이다. 바람직한 구현양태에서, 본 발명의 조성물은 실온에서 6시간 동안, 더욱 바람직하게는 12시간, 더욱 바람직하게는 24시간, 가장 바람직하게는 48시간 동안 평균 직경이 100% 미만, 더욱 바람직하게는 50% 미만, 가장 바람직하게는 25% 미만으로 증가하는 폴리플렉스:중합체 입자를 포함한다. 특히 바람직한 구현양태에서, 본 발명의 조성물은 실온에서 적어도 24시간 또는 적어도 48시간 동안 평균 직경이 25% 미만으로 증가하는 폴리플렉스:중합체 입자를 포함한다.
본 조성물의 폴리플렉스:중합체 입자는 바람직하게는 냉각 조건 하에 실질적으로 크기 안정성이다. 바람직한 구현양태에서, 본 발명의 조성물은 6시간 동안, 더욱 바람직하게는 12시간, 더욱 바람직하게는 24시간, 가장 바람직하게는 48시간 동안 2-8℃에서 평균 직경이 100% 미만, 더욱 바람직하게는 50% 미만, 가장 바람직하게는 25% 미만으로 증가하는 폴리플렉스:중합체 입자를 포함한다.
본 조성물의 폴리플렉스:중합체 입자는 바람직하게는 동결-해동 조건 하에서 실질적으로 크기 안정성이다. 바람직한 구현양태에서, 본 발명의 조성물은 -20 내지 -80℃에서 동결된 후 해동 후 실온에서 6시간, 더욱 바람직하게는 12시간, 더욱 바람직하게는 24시간, 가장 바람직하게는 48시간 동안 바람직하게는 100% 미만, 보다 바람직하게는 50% 미만, 가장 바람직하게는 25% 미만으로 평균 직경이 증가하는 폴리플렉스를 포함한다.
바람직한 구현양태에서, 조성물은 0.5mg/ml 초과의 핵산 농도를 갖고 침전된 폴리플렉스가 실질적으로 없다. 더욱 바람직하게는, 조성물은 적어도 0.6mg/ml, 더욱 바람직하게는 적어도 0.75mg/ml, 더욱 바람직하게는 적어도 1.0mg/ml, 더욱 바람직하게는 적어도 1.2mg/ml, 가장 바람직하게는 적어도 1.5mg/ml의 핵산 농도를 갖고 침전된 폴리플렉스가 실질적으로 없다. 또 다른 바람직한 구현양태에서, 조성물은 2mg/ml 초과의 핵산 농도를 갖고 침전된 폴리플렉스가 실질적으로 없다. 더욱 바람직하게는, 조성물은 적어도 2.5mg/ml, 더욱 바람직하게는 적어도 5mg/ml, 더욱 바람직하게는 적어도 10mg/ml, 더욱 바람직하게는 적어도 15mg/ml, 가장 바람직하게는 약 25mg/ml의 핵산 농도를 갖고 침전된 폴리플렉스가 실질적으로 없다. 일부 구현양태에서, 조성물은 0.5mg/mL 내지 약 25mg/mL의 핵산 농도를 갖고 침전된 폴리플렉스가 실질적으로 없다. 일부 구현양태에서, 조성물은 ≤ 약 25mg/mL의 핵산 농도를 갖고 침전된 폴리플렉스가 실질적으로 없다. 조성물은 수화될 수 있다. 바람직한 구현양태에서, 조성물은 비-복합체화된 핵산이 실질적으로 없다.
바람직한 구현양태에서, 폴리플렉스:중합체 입자 조성물은 등장성이다. 폴리플렉스 안정성을 유지하면서 등장성을 달성하는 것은 약제학적 조성물을 제형화하는데 매우 바람직하며, 이러한 바람직한 조성물은 약제학적 제형 및 치료적 적용에 매우 적합하다.
특정 구현양태에서, 폴리플렉스:중합체 입자 조성물은 pH를 감소시켜, 예를 들어 PEG, 중합체 코트의 전부 또는 일부를 방출하도록 언코팅(uncoated)될 수 있다. 특정 구현양태에서, 중합체 코트는 중합체의 다중음이온성 앵커 영역의 pKa 미만인 pH 조건 하에 입자를 배양함으로써 방출된다. 예를 들어, 중합체 코트가 폴리글루타메이트인 경우, 중합체 코트는 폴리글루타메이트의 pKa 미만의 pH, 예컨대 약 4.25 미만의 pH에서 입자를 배양함으로써 방출될 수 있다. 특정 구현양태에서, 중합체 코트는 중합체 코트의 다중음이온 앵커 영역의 pKa보다 적어도 0.25 pH 단위 또는 0.5 pH 단위 이상 낮은 pH 조건 하에 입자를 배양함으로써 방출될 수 있다.
특정 구현양태에서, 폴리플렉스:중합체 입자 조성물은 입자에 높은 이온 강도를 적용함으로써, 예를 들어 PEG, 중합체 코트의 전부 또는 일부를 방출하도록 언코팅될 수 있다.
이론에 얽매이지 않고, 특정 생리학적 조건은 본원에 기재된 가역적으로 PEG화된 키토산 DNA 폴리플렉스의 부분적(예:> 5%), 상당한(> 50%), 광범위한(예:> 90%) 또는 전체 언코팅을 촉진할 수 있다고 가정된다. 예를 들어, 특정 세포하 구획(예: 엔도솜, 초기 엔도솜, 후기 엔도솜 또는 리소솜)의 낮은 pH 조건은 중합체 코트의 방출을 촉진할 수 있다. 또 다른 예로서, 특정 세포외 조건은 본원에 기재된 가역적으로 PEG화된 키토산 DNA 폴리플렉스의 부분적(예:> 5%), 실질적인(> 50%), 광범위한(예:> 90%), 또는 완전한(100%) 언코팅을 촉진할 수 있다. 어떤 경우에는, 소화관의 특정 위치에서 일반적으로 발생하는 높은 이온 강도 및/또는 산성 pH 조건이 본원에 기술된 가역적으로 PEG화된 키토산 DNA 폴리플렉스의 부분적(예:> 5%), 상당한(> 50%), 광범위한(예:> 90%) 또는 완전한(100%) 언코팅을 촉진할 수 있다.
특정 구현양태에서, 본원에 기재된 PEG화된 폴리플렉스는 세포, 조직 또는 신체 구획(예를 들어, 장, 소장, 대장, 결장, 폐, 또는 방광)으로의 전달을 위해 제형화되어 폴리플렉스가 PEG화된 상태를 유지하고 이에 의해 표적 세포의 형질감염을 촉진한다. 일부 구현양태에서, 본원에 기재된 PEG화된 폴리플렉스는 세포내 환경으로의 진입 후 또는 진입 중에 중합체 코트를 부분적으로(예: > 5%), 실질적으로(> 50%), 광범위하게(예: > 90%) 또는 완전히(100%) 방출한다. 특정 구현양태에서, 본원에 기재된 PEG화된 폴리플렉스는 세포, 조직 또는 신체 구획(예: 장, 소장, 대장, 결장, 폐 또는 방광)으로의 전달을 위해 제형화되어 PEG화된 폴리플렉스는 세포, 조직 또는 신체 구획(예: 장, 소장, 대장, 결장, 폐 또는 방광)으로의 전달시에 부분적으로 (예: > 5%), 실질적으로(> 50%), 광범위하게(예: > 90%), 또는 완전히(100%) 중합체 코트를 방출한다.
중합체의 음이온성 앵커 영역의 음이온 전하 밀도 및/또는 pKa는 의도된 조건 하에 방출을 촉진하거나 억제하도록 조정될 수 있음이 이해될 것이다. pH, 부피 및 이온 강도, 및 제형의 다른 조건은 의도된 조건 하에서 방출을 촉진하거나 억제하도록 조정될 수 있음이 유사하게 이해될 것이다. 예를 들어, 낮은 pH 위 환경을 통해 장으로 전달하기 위해, PEG화된 폴리플렉스 제형은 장용 코팅되고/되거나 위 환경의 pH를 증가시키기 위해 완충제 중에서 전달될 수 있다. 최적화된 가역적으로 PEG화된 입자 조성물 및 제형은 본원에 기재된 검정을 사용하여 안정성 및 형질감염 효율에 대해 검정함으로써 확인될 수 있다.
음이온성 부분-함유 중합체와 복합체화된 키토산 폴리플렉스를 포함하는 조성물은 "(+):(-) 몰비"로서 지칭되는 (예를 들어, 이중) 유도체화된-키토산 폴리플렉스의 양이온성 작용기(+) 대 중합체의 음이온 모이어티(-)의 비율을 특징으로 할 수 있다. 이 (+):(-) 몰비는 약 1:100 초과 내지 약 10:1 미만까지 다양할 수 있다.
특정 구현양태에서, (+):(-) 몰비는 약 1:75 초과 내지 약 8:1 미만일 수 있다. 일부 경우에, (+):(-) 몰비는 1:10 초과 내지 10:1 미만일 수 있다. 일부 경우에, (+):(-) 몰비는 1:10 또는 약 1:10 내지 약 10:1일 수 있다. 일부 경우에, (+):(-) 몰비는 1:8 또는 약 1:8 내지 약 8:1일 수 있다. 특정 구현양태에서, (+):(-) 몰비는 1:50 초과 내지 약 10:1 미만일 수 있다. 일부 경우에, (+):(-) 몰비는 1:25 초과 내지 약 10:1 미만일 수 있다. 일부 경우에, (+):(-) 몰비는 1:10 초과 내지 약 7:1 미만일 수 있다. 일부 경우에, (+):(-) 몰비는 1:8 초과 내지 약 7:1 미만일 수 있다. 일부 경우에, (+):(-) 몰비는 1:8 초과 내지 약 6:1 미만일 수 있다.
특정 구현양태에서, (예를 들어, 이중) 유도체화된-키토산 폴리플렉스의 양이온성 작용기가 아미노 모이어티인 경우, 음이온성 부분-함유 중합체와 복합체화된 키토산 폴리플렉스를 포함하는 조성물은 "N:A 몰비"로 지칭되는, (예를 들어, 이중) 유도체화된-키토산 폴리플렉스의 아미노기(N) 대 중합체의 음이온(A) 모이어티의 비율을 특징으로 할 수 있다. 이 N:A 몰비는 약 1:100 초과 내지 약 10:1 미만까지 다양할 수 있다.
특정 구현양태에서, N:A 몰비는 약 1:75 초과 내지 약 8:1 미만일 수 있다. 일부 경우에, N:A 몰비는 1:10 초과 내지 10:1 미만일 수 있다. 일부 경우에, N:A 몰비는 1:10 또는 약 10:1 내지 약 10:1일 수 있다. 일부 경우에, N:A 몰비는 약 1:8 또는 약 1:8 내지 약 8:1일 수 있다. 특정 구현양태에서, N:A 몰비는 1:50 초과 내지 약 10:1 미만일 수 있다. 일부 경우에, N:A 몰비는 1:25 초과 내지 약 10:1 미만일 수 있다. 일부 경우에, N:A 몰비는 1:10 초과 내지 약 7:1 미만일 수 있다. 일부 경우에, N:A 몰비는 1:8 초과 내지 약 7:1 미만일 수 있다. 일부 경우에, N:A 몰비는 1:8 초과 내지 약 6:1 미만일 수 있다.
추가로 또는 대안적으로, 음이온성 부분-함유 중합체와 복합체화된 키토산 폴리플렉스를 포함하는 조성물은 "(+):P:(-) 몰비"로 지칭되는, (예를 들어, 이중) 유도체화된-키토산 폴리플렉스의 양이온성 작용기(+) 대 핵산의 인 원자(P) 대 중합체의 음이온 모이어티(-)의 3-성분 비율을 특징으로 할 수 있다.
특정 구현양태에서, (+):P가 적어도 2:1 내지 20:1 이하인 경우, (+):(-)의 몰비는 적어도 1:40 내지 약 40:1로 다양할 수 있다. 특정 구현양태에서, (+):P가 적어도 2:1 내지 20:1 이하인 경우, (+):(-)의 몰비는 적어도 1:40 내지 약 1:10으로 다양할 수 있다. 일부 구현양태에서, (+):P가 적어도 2:1 내지 20:1 이하인 경우, (+):(-)의 몰비는 적어도 1:25 내지 약 25:1로 다양할 수 있다. 일부 구현양태에서, (+):P가 적어도 2:1 내지 20:1 이하인 경우, (+):(-)의 몰비는 적어도 1:25 내지 약 1:10으로 다양할 수 있다. 일부 경우에, (+):P가 적어도 2:1 내지 20:1 이하인 경우, (+):(-)의 몰비는 적어도 1:20 내지 약 20:1로 다양할 수 있다. 일부 경우에, (+):P가 적어도 2:1 내지 20:1 이하인 경우, (+):(-)의 몰비는 적어도 1:20 내지 약 1:10으로 다양할 수 있다. 일부 경우에, (+):P가 적어도 2:1 내지 20:1 이하인 경우에, (+):(-)의 몰비는 적어도 1:10 내지 약 10:1로 다양할 수 있다. 일부 경우에, (+):P가 적어도 2:1 내지 20:1 이하인 경우에, (+):(-)의 몰비는 적어도 1:25 내지 약 2:1로 다양할 수 있다. 일부 경우에, (+):P가 적어도 2:1 내지 20:1 이하인 경우에, (+):(-)의 몰비는 적어도 1:20 내지 약 1:1로 다양할 수 있다.
특정 바람직한 구현양태에서, (+):P:(-)는 3:1:3.5 내지 3:1:17.5이다. 특정 바람직한 구현양태에서, (+):P:(-)는 5:1:3.5 내지 5:1:17.5이다. 특정 바람직한 구현양태에서, (+):P:(-)는 7:1:3.5 내지 7:1:17.5이다. 특정 바람직한 구현양태에서, (+):P:(-)는 약 3:1:3.5, 3:1:7, 3:1:10, 3:1:15, 3:1:17.5, 또는 3:1:20이다. 특정 바람직한 구현양태에서, (+):P:(-)는 약 5:1:3.5, 5:1:7, 5:1:10, 5:1:15, 5:1:17.5, 또는 5:1:20이다. 특정 바람직한 구현양태에서, (+):P:(-)는 약 7:1:3.5, 7:1:7, 7:1:10, 7:1:15, 7:1:17.5, 또는 7:1:20이다. 특정 바람직한 구현양태에서, (+):P:(-)는 약 10:1:10, 10:1:15, 10:1:20, 10:1:25, 10:1:30, 또는 10:1:40이다.
당업자는 음이온성 부분-함유 중합체와 복합체를 형성하는 아미노-작용화된 키토산 폴리플렉스 입자는 ""N:P:A 몰비"로 지칭되는, (예를 들어, 이중) 유도체화된-키토산 폴리플렉스의 아미노 작용기(N) 대 핵산의 인 원자(P) 대 중합체의 음이온 모이어티(A)의 3-성분 비율을 특징으로 할 수 있음을 이해할 것이다. 특정 구현양태에서, N:P가 적어도 2:1 내지 20:1 이하인 경우, P:A의 몰비는 적어도 1:40 내지 약 40:1로 다양할 수 있다.
특정 구현양태에서, N:P가 적어도 2:1 내지 20:1 이하인 경우, P:A의 몰비는 적어도 1:40 내지 약 1:10으로 다양할 수 있다. 특정 구현양태에서, N:P가 적어도 2:1 내지 20:1 이하인 경우, P:A의 몰비는 적어도 1:25 내지 약 25:1로 다양할 수 있다. 특정 구현양태에서, N:P가 적어도 2:1 내지 20:1 이하인 경우, P:A의 몰비는 적어도 1:25 내지 약 1:10으로 다양할 수 있다. 일부 경우에, N:P가 적어도 2:1 내지 20:1 이하인 경우에, P:A의 몰비는 적어도 1:20 내지 약 20:1로 다양할 수 있다. 일부 경우에, N:P가 적어도 2:1 내지 20:1 이하인 경우에, P:A의 몰비는 적어도 1:20 내지 약 1:10으로 다양할 수 있다. 일부 경우에, N:P가 적어도 2:1 내지 20:1 이하인 경우에, P:A의 몰비는 적어도 1:10 내지 약 10:1로 다양할 수 있다. 일부 경우에, N:P가 적어도 2:1 내지 20:1 이하인 경우에, P:A의 몰비는 적어도 1:25 내지 약 2:1로 다양할 수 있다. 일부 경우에, N:P가 적어도 2:1 내지 20:1 이하인 경우에, P:A의 몰비는 적어도 1:20 내지 약 1:1로 다양할 수 있다.
특정 바람직한 구현양태에서, N:P:A는 3:1:3.5 내지 3:1:17.5이다. 특정 바람직한 구현양태에서, N:P:A는 5:1:3.5 내지 5:1:17.5이다. 특정 바람직한 구현양태에서, N:P:A는 7:1:3.5 내지 7:1:17.5이다. 특정 바람직한 구현양태에서, N:P:A는 10:1:10 내지 10:1:40이다. 특정 바람직한 구현양태에서, N:P:A는 약 3:1:3.5, 3:1:7, 3:1:10, 3:1:15, 3:1:17.5, 또는 3:1:20이다. 특정 바람직한 구현양태에서, N:P:A는 약 5:1:3.5, 5:1:7, 5:1:10, 5:1:15, 5:1:17.5, 또는 5:1:20이다. 특정 바람직한 구현양태에서, N:P:A는 약 7:1:3.5, 7:1:7, 7:1:10, 7:1:15, 7:1:17.5 또는 7:1:20이다. 특정 구현양태에서, N:P:A는 약 10:1:10, 10:1:15, 10:1:20, 10:1:25, 10:1:30 또는 10:1:40이다.
2.4.1. 친수성 비-하전된 부분
중합체의 친수성 비-하전된 부분은 폴리알킬렌 폴리올 또는 폴리알킬렌옥시 폴리올 부분, 또는 이들의 조합일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 중합체의 친수성 비-하전된 부분은 폴리알킬렌 글리콜 또는 폴리알킬렌옥시 글리콜 부분이거나 이를 포함할 수 있다. 특정 구현양태에서, 폴리알킬렌 글리콜 부분은 폴리에틸렌 글리콜 부분 및/또는 모노메톡시 폴리에틸렌 글리콜 부분이거나 이를 포함한다. 특정 바람직한 구현양태에서, 중합체의 비-하전 부분은 폴리에틸렌 글리콜이거나 이를 포함한다. 중합체의 친수성 비-하전된 부분은 폴리락트산과 같은 다른 생물학적으로 적합한 중합체(들)이거나 이를 포함할 수 있다.
PEG 이외에도, 몇몇 친수성 비-하전 실재가 당업계에 공지되어 있다(Lowe 등, Antibiofouling polymer interfaces: poly(ethyleneglycol) and other promising candidates, Polym. Chem., 6, 198-212, 2015, 및 Knop 등, Poly(ethylene glycol) in Drug Delivery: Pros and Cons as Well as Potential Alternatives. Angewandte Chemie International Edition, 49(36), 6288-6308, 2010). 중합체의 친수성 비-하전된 부분의 예는 다음과 같으나 이에 제한되지 않는다: 폴리(글리세롤), 폴리(2-메타크릴로일옥시에틸 포스포릴콜린), 폴리(설포베타인 메타크릴레이트) 및 폴리(카르복시베타인 메타크릴레이트), 폴리(2-메틸-2-옥사졸린), 폴리(2-에틸-2-옥사졸린) 및 폴리(비닐피롤리돈).
친수성 부분은 약 500 Da 내지 약 50,000 Da의 중량 평균 분자량을 가질 수 있다. 일부 구현양태에서, 친수성 부분은 약 1,000 Da 내지 약 10,000 Da의 중량 평균 분자량을 갖는다. 특정 구현양태에서, 친수성 부분은 약 1,500 Da 내지 약 7,500 Da의 중량 평균 분자량을 갖는다. 특정 구현양태에서, 친수성 부분은 약 3,000 Da 내지 약 5,000 Da의 중량 평균 분자량을 갖는다. 일부 경우에, 친수성 부분은 5,000 Da 또는 약 5,000 Da의 중량 평균 분자량을 갖는다.
2.4.2. 음이온성 중합체 부분
중합체의 음이온성 중합체 부분은 생리학적 pH에서 음으로 하전된 다수의 작용기를 포함할 수 있다. 그러한 음이온성 중합체가 친수성 비-하전 중합체 부분을 갖는 중합체의 성분으로서 제공될 수 있고, 양으로 하전된(예를 들어, 이중) 유도체화된-키토산-핵산 나노입자와 (예를 들어, 가역성)전하:전하 복합체를 형성할 수 있다면, 매우 다양한 음이온성 중합체가 본원에 기재된 방법 및 조성물에 사용하기에 적합하다.
예시적인 음이온성 중합체는 생리학적 pH에서 순 음전하를 갖는 폴리펩티드를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 경우에, 폴리펩티드 또는 이의 일부는 생리학적 pH에서 음전하를 띤 측쇄를 갖는 아미노산으로 구성된다. 예를 들어, 중합체의 음이온성 중합체 부분은 폴리글루타메이트 폴리펩티드, 폴리아스파르테이트 폴리펩티드, 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 추가의 아미노산 또는 이의 모방체는 다중음이온성 폴리펩티드에 혼입될 수 있다. 예를 들어, 글리신 및/또는 세린 아미노산은 유연성을 증가시키거나 2차 구조를 감소시키기 위해 혼입될 수 있다.
일부 경우에, 음이온성 중합체는 음이온성 탄수화물 중합체이거나 이를 포함할 수 있다. 예시적인 음이온성 탄수화물 중합체는 생리학적 pH에서 음으로 하전된 글리코스아미노글리칸을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예시적인 음이온성 글리코스아미노글리칸은 콘드로이틴 설페이트, 더마탄 설페이트, 케라틴 설페이트, 헤파린, 헤파린 설페이트, 히알루론산, 또는 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 구현양태에서, 중합체의 음이온성 중합체 부분은 히알루론산이거나 히알루론산을 포함한다.
추가적인 또는 대안적인 음이온성 탄수화물 중합체는 덱스트란 설페이트를 포함하는 중합체를 포함할 수 있다.
일부 경우에, 다중음이온 부분은 폴리메타크릴산 및 이의 염, 폴리아크릴산 및 이의 염, 메타크릴산 및 이의 염의 공중합체, 및 아크릴산 및/또는 메타크릴산 및 이의 염의 공중합체, 예를 들어 폴리알킬렌옥사이드, 폴리아크릴산 공중합체로 이루어진 군으로부터 선택된 다중음이온이거나 이를 포함한다.
일부 경우에, 다중음이온 부분은 알기네이트, 카라기난, 푸르셀라란, 펙틴, 크산탄, 히알루론산, 헤파린, 헤파란 설페이트, 콘드로이틴 설페이트, 셀룰로오스, 산화 셀룰로오스, 카르복시메틸 셀루오즈, 크로스마르멜로스, 펜던트 카르복실기, 포스페이트 기 또는 설페이트 기를 함유하는 합성 중합체 및 공중합체, 주로 음전하의 폴리아미노산 및 생체적합성 폴리페놀 물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 다중음이온이거나 이를 포함한다.
중합체의 음이온성 부분은 약 500 Da 내지 약 5,000 Da의 중량 평균 분자량을 가질 수 있다. 일부 구현양태에서, 음이온성 부분은 약 500 Da 내지 약 3,000 Da의 중량 평균 분자량을 갖는다. 특정 구현양태에서, 음이온성 부분은 약 500 Da 내지 약 2,500 Da의 중량 평균 분자량을 갖는다. 특정 구현양태에서, 음이온성 부분은 약 500 Da 내지 약 2,000 Da의 중량 평균 분자량을 갖는다. 일부 구현양태에서, 음이온성 부분은 약 500 Da 내지 약 1.500 Da의 중량 평균 분자량을 갖는다. 특정 구현양태에서, 음이온성 부분은 약 1,000 Da 내지 약 5,000 Da의 중량 평균 분자량을 갖는다. 특정 구현양태에서, 음이온성 부분은 약 1,000 Da 내지 약 3,000 Da의 중량 평균 분자량을 갖는다. 일부 구현양태에서, 음이온성 부분은 약 1,000 Da 내지 약 2,500 Da의 중량 평균 분자량을 갖는다. 특정 구현양태에서, 음이온성 부분은 약 1,000 Da 내지 약 2,000 Da의 중량 평균 분자량을 갖는다. 일부 경우에서, 음이온성 부분은 1,500 Da 또는 약 1,500 Da의 중량 평균 분자량을 갖는다.
본원에 사용된 "블록 공중합체", "블록 공-중합체" 등은 별개의 단독중합체 영역을 함유하는 공중합체를 지칭한다. 이블록 공중합체는 2개의 별개의 단독중합체 영역을 함유한다. 삼블록 공중합체는 3개의 별개의 단독 중합체 영역을 함유한다. 3개의 별개의 영역은 각각 상이할 수 있거나(예: AAAA-BBBB-CCCC), 2개의 영역은 동일(예: AAAA-BBBB-AAAA) 유사(예: AAAA-BBBB-AAA)일 수 있으며, 여기서 "A", "B" 및 "C"는 구성되는 공중합체를 형성하는 상이한 단량체 서브유닛을 나타낸다. 예를 들어, "A"는 폴리에틸렌 글리콜 단독중합체의 에틸렌 글리콜 단량체 서브유닛을 나타낼 수 있고 B는 폴리글루탐산 단독중합체의 글루탐산 서브유닛을 나타낼 수 있다. 블록 공중합체는 선형(예를 들어, 이- 또는 삼-) 블록 공중합체일 수 있다. 본 발명에 사용하기 위한 선형 이블록 및 삼블록 공중합체의 예시적인 구현양태는 하기 비-배타적 목록에 열거된 것들을 포함한다:
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
*K: kDa로 PEG의 분자량
## 서브유닛 수
한 구현양태에서, 블록 공중합체는 하기 구조를 갖는 PEG-폴리글루탐산 중합체이거나 이를 포함한다:
Figure pct00009
한 구현양태에서, 블록 공중합체는 하기 구조를 갖는 PEG-폴리아스파르트산 중합체이거나 이를 포함한다:
Figure pct00010
한 구현양태에서, 블록 공중합체는 하기 구조를 갖는 PEG-히알루론산 중합체이거나 이를 포함한다:
Figure pct00011
2.5. 제조 방법
상기 기재된 바와 같이, 당업자는 본 발명의 폴리플렉스:중합체 입자가 다양한 방법에 의해 제조될 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, 폴리플렉스 입자가 생성된 다음 중합체와 접촉할 수 있다. 예시적인 비제한적 구현양태에서, 폴리플렉스 입자는 작용화된 키토산 및 뉴클레오티드 공급원료를 제공하고 조합함으로써 제조된다. 공급원료 농도는 다양한 아미노 대 포스페이트 비율(N/P), 혼합 비율 및 표적 뉴클레오티드 농도를 수용하도록 조정될 수 있다. 일부 구현양태에서, 특히 작은 배치, 예를 들어 2mL 미만의 배치에서, 작용화된 키토산 및 뉴클레오티드 공급원료는 뉴클레오티드 공급원료를 용기를 볼텍싱하면서 작용화된 키토산 공급원료에 천천히 적하함으로써 혼합될 수 있다. 다른 구현양태에서, 작용화된 키토산 및 뉴클레오티드 공급원료는 2개의 유체 스트림을 인-라인 혼합함으로써 혼합될 수 있다. 다른 구현양태에서, 생성된 폴리플렉스 분산액은 한외여과(예를 들어, 접선 유동 여과(TFF)) 또는 용매 증발(예를 들어, 동결건조 또는 분무 건조)과 같은 당업계에 공지된 수단에 의해 농축될 수 있다. 폴리플렉스 형성을 위한 바람직한 방법은 WO 2009/039657에 개시되어 있으며, 이는 그 전체가 참고로 본원에 명백히 포함된다.
유사하게, 폴리플렉스 입자 공급원료(예를 들어, 폴리플렉스 조성물을 포함하는 수용액)가 제공될 수 있고(예를 들어, 상기 기재된 반응 혼합물로부터 분리된) 중합체 공급원료(예를 들어, 중합체를 포함하는 수용액)와 조합될 수 있다. 공급원료 농도는 다양한 아미노 대 음이온 비율(N/A), 아미노 대 인(N:P) 비율, N:P:A 비율, 혼합 비율 및 표적 뉴클레오티드 농도를 수용하도록 조정될 수 있다. 일부 구현양태에서, 특히 작은 배치, 예를 들어 2mL 미만의 배치에서, 공급원료는 용기를 와동시키면서 제1 공급원료(예를 들어, 폴리플렉스)를 제2 공급원료(예를 들어, 중합체)에 천천히 적하함으로써 혼합될 수 있다. 다른 구현양태에서, 공급원료는 2개의 유체 스트림을 인-라인 혼합함으로써 혼합될 수 있다. 다른 구현양태에서, 생성된 폴리플렉스:중합체 복합체 분산액은 한외여과(예를 들어, 접선 유동 여과(TFF)) 또는 용매 증발(예를 들어, 동결건조 또는 분무 건조)과 같은 당업계에 공지된 수단에 의해 농축될 수 있다.
일부 구현양태에서, 폴리플렉스:중합체 조성물은 코어-쉘 유형 입자 조성물을 포함하고, 여기서 입자는 폴리플렉스 코어 및 비-공유적으로 결합된(예를 들어, 방출가능한) 중합체 쉘을 포함한다. 이해되는 바와 같이, 이러한 코어-쉘 유형 조성물을 제조하는 한 가지 방법은 폴리플렉스를 형성한 다음, 상기 기재된 바와 같이 중합체 공급원료와 조합하는 것을 포함한다.
대안적으로, 폴리플렉스:중합체 조성물은 핵산, 유도체화된 키토산, 및 적어도 하나의 다중음이온성(PA) 앵커 영역 및 적어도 하나의 친수성 중합체(예를 들어, PEG) 꼬리 영역를 포함하는 다수의 선형 블록 공중합체를 적절한 비율로 혼합하어 폴리플렉스:중합체 조성물을 형성하는 1-단계 방법으로 제조될 수 있다. 이론에 얽매이지 않고, 본 발명자들은 이러한 1-단계 방법이 생체내 점막 확산이 제한된 특정 징후에서 유리할 수 있는 더 작은 입자 크기를 생성할 수 있다고 가정한다.
3. 분말 제형
본 발명의 폴리플렉스:중합체 조성물은 분말을 포함한다. 바람직한 구현양태에서, 본 발명은 건조 분말 폴리플렉스:중합체 조성물을 제공한다. 바람직한 구현양태에서, 건조 분말 폴리플렉스:중합체 조성물은 본 발명의 키토산-핵산 폴리플렉스 분산액의 탈수(예를 들어, 분무 건조 또는 동결건조)를 통해 생성된다.
4. 약제학적 제형
본 발명은 또한 본 발명의 폴리플렉스:중합체 조성물을 포함하는 "약제학적으로 허용되는" 또는 "생리학적으로 허용되는" 제형을 제공한다. 이러한 제형은 치료 방법을 실행하기 위해 대상체에게 생체내 투여될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "약제학적으로 허용되는" 및 "생리학적으로 허용되는"은 바람직하게는 과도한 부작용(예: 메스꺼움, 복통, 두통 등)을 일으키지 않고 대상체에게 투여될 수 있는 담체, 희석제, 부형제 등을 지칭한다. 이러한 투여용 제제에는 멸균된 수성 또는 비-수성 용액, 현탁액, 및 에멀젼이 포함된다. 액체 제형에는 현탁액, 용액, 시럽 및 엘릭서가 포함된다. 액체 제형는 고체를 재구성하여 제조할 수 있다.
약제학적 제형은 대상체에 투여하기에 적합한 담체, 희석제, 부형제, 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등으로부터 제조될 수 있다. 이러한 제형은 정제(코팅 또는 비코팅), 캡슐(경질 또는 연질), 마이크로비드, 에멀젼, 분말, 과립, 결정, 현탁액, 시럽 또는 엘릭서에 함유될 수 있다. 다른 첨가제 중에서 보조 활성 화합물 및 보존제, 예를 들어 항균제, 항산화제, 킬레이트제 및 불활성 가스 등이 또한 존재할 수 있다.
부형제는 염, 등장화제, 혈청 단백질, 완충제 또는 기타 pH-조절제, 항산화제, 증점제, 비하전 중합체, 보존제 또는 동결보호제를 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물에 사용되는 부형제는 등장화제 및 완충제 또는 기타 pH-조절제를 추가로 포함할 수 있다. 이들 부형제는 pH(약 6.0-8.0) 및 삼투몰농도(약 50-400mmol/L)의 바람직한 범위를 달성하기 위해 첨가될 수 있다. 적합한 완충제의 예는 아세테이트, 보레이트, 카르보네이트, 시트레이트, 포스페이트 및 설폰화된 유기 분자 완충제이다. 이러한 완충제는 0.01 내지 1.0%(w/v) 농도로 조성물에 존재할 수 있다. 등장화제는 당업계에 공지된 임의의 것, 예를 들어 만니톨, 덱스트로스, 글루코스 및 염화나트륨, 또는 기타 전해질로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 등장화제는 글루코스 또는 염화나트륨이다. 등장화제는 조성물이 도입되는 생물학적 환경의 삼투압과 동일하거나 유사한 삼투압을 조성물에 부여하는 양으로 사용될 수 있다. 조성물 중 등장화제의 농도는 사용된 특정 등장화제의 성질에 따라 달라지며 약 0.1 내지 10% 범위일 수 있다. 글루코스가 사용되는 경우, 바람직하게는 1 내지 5% w/v, 더욱 특히 5% w/v의 농도로 사용된다. 등장화제가 염화나트륨인 경우, 이는 바람직하게는 최대 1% w/v, 특히 0.9% w/v의 양으로 사용된다. 본 발명의 조성물은 보존제를 추가로 함유할 수 있다. 보존제의 예는 폴리헥사메틸렌-비구아니딘, 벤잘코늄 클로라이드, 안정화된 옥시클로로 착물(예: Purite®로 알려진 것), 페닐수은 아세테이트, 클로로부탄올, 소르브산, 클로르헥시딘, 벤질 알코올, 파라벤 및 티메로살이다. 전형적으로, 이러한 보존제는 약 0.001 내지 1.0%의 농도로 존재한다. 또한, 본 발명의 조성물은 동결보존제를 함유할 수도 있다. 바람직한 동결보존제는 글루코스, 수크로스, 만니톨, 락토스, 트레할로스, 소르비톨, 콜로이드성 이산화규소, 바람직하게는 100,000g/mol 미만의 분자량의 덱스트란, 글리세롤, 및 100,000g/mol 미만의 분자량의 폴리에틸렌 글리콜 또는 이들의 혼합물이다. 가장 바람직한 것은 글루코스, 트레할로스 및 폴리에틸렌 글리콜이다. 전형적으로, 이러한 동결보존제는 약 0.01 내지 10%의 농도로 존재한다.
약제학적 제형은 이의 의도된 투여 경로와 적합하도록 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여의 경우, 조성물은 부형제와 혼합되고 정제, 트로키, 캡슐, 예를 들어 젤라틴 캡슐 또는 코팅, 예를 들어 장용 코팅(Eudragit® 또는 Sureteric®)의 형태로 사용될 수 있다. 약제학적으로 적합한 결합제 및/또는 보조제 물질이 경구 제형에 포함될 수 있다. 정제, 환제, 캡슐제, 트로키제 등은 다음 성분 또는 유사한 성질의 화합물을 함유할 수 있다: 미세결정질 셀룰로오스, 트라가칸트 검 또는 젤라틴과 같은 결합제; 전분 또는 락토스과 같은 부형제, 알긴산, 프리모겔 또는 옥수수 전분과 같은 붕해제; 마그네슘 스테아레이트 또는 기타 스테아레이트와 같은 윤활제; 콜로이드성 이산화규소와 같은 활택제; 슈크로스 또는 사카린과 같은 감미제; 또는 페퍼민트, 메틸 살리실레이트 또는 향미제와 같은 향미제.
제형은 또한 임플란트 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템을 포함하는 제어 방출 제형과 같이 신체로부터의 급격한 분해 또는 제거로부터 조성물을 보호하기 위한 담체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 스테아레이트와 같은 시간 지연 물질을 단독으로 또는 왁스와 조합하여 사용할 수 있다.
좌약 및 기타 직장 투여가능한 제제(예: 관장제로 투여 가능한 제제)도 고려된다. 직장 전달과 관련하여서는 추가로 예를 들어 Song 등, Mucosal drug delivery: membranes, methodologies, and applications, Crit. Rev. Ther. Drug. Carrier Syst., 21:195-256, 2004; Wearley, Recent progress in protein and peptide delivery by noninvasive routes, Crit. Rev. Ther. Drug. Carrier Syst., 8:331-394, 1991을 참고한다.
투여에 적절한 추가 약제학적 제형은 당업계에 공지되어 있고 본 발명의 방법 및 조성물에 적용가능하다(예를 들어 Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) 18th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa.; The Merck Index(1996) 12th ed., Merck Publishing Group, Whitehouse, N.J.; and Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms, Technonic Publishing Co., Inc., Lancaster, Pa., (1993)을 참고한다).
5. 투여
한 구현양태에서, 폴리플렉스:중합체 조성물의 사용은 생리학적 pH에서 폴리플렉스의 장기간 안정성을 제공한다. 이것은 효과적인 점막 투여를 제공한다.
점막 세포 또는 조직과 접촉하기 위한 다수의 투여 경로 중 임의의 것이 가능하고 특정 경로의 선택은 부분적으로 표적 점막 세포 또는 조직에 의존할 것이다. 주사기, 내시경, 캐뉼러, 삽관 튜브, 카테터 및 기타 물품을 투여에 사용할 수 있다.
장애나 상태 또는 증상의 진행이나 악화를 예방하거나 억제하는 것이 만족스러운 결과이기는 하지만, 대상체를 치료하기 위한 용량 또는 "유효량"은 바람직하게는 측정가능하거나 검출가능한 정도로 상태의 증상 중 하나, 몇 가지 또는 모두를 개선하기에 충분하다. 따라서, 표적 조직에서 치료적 핵산을 발현함으로써 치료할 수 있는 상태 또는 장애의 경우, 본 발명의 방법으로 치료할 수 있는 상태를 개선하기 위해 생성된 치료적 RNA 또는 치료적 단백질의 양은 상태 및 원하는 결과에 따라 달라질 것이며, 숙련된 기술자가 쉽게 확인할 수 있다. 적절한 양은 치료되는 상태, 원하는 치료 효과 및 개별 대상체(예: 대상체 내 생체이용률, 성별, 연령 등)에 따라 다를 것이다. 유효량은 관련 생리학적 효과를 측정하여 확인할 수 있다.
수의학적 적용은 또한 본 발명에 의해 고려된다. 따라서, 한 구현양태에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 비-인간 포유동물에게 본 발명의 폴리플렉스:중합체 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 비-인간 포유동물을 치료하는 방법을 제공한다.
5.1. 경구 투여
본 발명의 조성물은 경구 투여될 수 있다. 경구 투여는 삼키는 것을 포함할 수 있고, 이에 의해 화합물이 위장관에 들어갈 수 있다. 본 발명의 조성물은 또한 위장관에 직접 투여될 수 있다.
경구 투여에 적합한 제형은 정제, 캡슐, 미립자 또는 코팅된 미립자를 함유하는 코팅된 캡슐, 액체 또는 분말, 로젠지(액체 충전 포함), 츄, 다중- 및 나노-미립자, 겔, 필름, 난형(ovules) 및 스프레이과 같은 고체 제형을 포함한다.
정제 투여 형태는 일반적으로 붕해제를 함유한다. 붕해제의 예에는 나트륨 전분 글리콜레이트, 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 칼슘 카르복시메틸 셀룰로오스, 크로스카멜로스 나트륨, 크로스포비돈, 폴리비닐피롤리돈, 메틸 셀룰로오스, 미세결정질 셀룰로오스, 저급 알킬-치환된 히드록시프로필 셀룰로오스, 전분, 전호화 전분 및 나트륨 알기네이트가 포함된다. 일반적으로, 붕해제는 투여 형태의 1중량% 내지 25중량%, 바람직하게는 5중량% 내지 20중량%를 구성할 것이다.
결합제는 일반적으로 정제 제형에 응집성을 부여하기 위해 사용된다. 적합한 결합제는 미세결정질 셀룰로오스, 젤라틴, 당, 폴리에틸렌 글리콜, 천연 및 합성 검, 폴리비닐피롤리돈, 전호화 전분, 히드록시프로필 셀룰로오스 및 히드록시프로필 메틸셀룰로오스를 포함한다. 정제는 또한 락토스(일수화물, 분무 건조된 일수화물, 무수물 등), 만니톨, 자일리톨, 덱스트로스, 슈크로스, 소르비톨, 미세결정질 셀룰로오스, 전분 및 이염기성 인산칼슘 이수화물과 같은 희석제를 함유할 수 있다.
정제는 또한 임의로 나트륨 라우릴 설페이트 및 폴리소르베이트 80과 같은 표면 활성제, 및 이산화규소 및 활석과 같은 활택제를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 표면 활성제는 정제의 0.2중량% 내지 5중량%를 구성할 수 있고, 활택제는 정제의 0.2중량% 내지 1중량%를 구성할 수 있다.
정제는 또한 일반적으로 마그네슘 스테아레이트, 칼슘 스테아레이트, 아연 스테아레이트, 나트륨 스테아릴 푸마레이트, 및 마그네슘 스테아레이트와 나트륨 라우릴 설페이트의 혼합물과 같은 윤활제를 함유한다. 윤활제는 일반적으로 정제의 0.25중량% 내지 10중량%, 바람직하게는 0.5중량% 내지 3중량%를 구성한다.
다른 가능한 성분에는 항산화제, 착색제, 향미제, 보존제 및 맛 차폐제가 포함된다.
정제 블렌드는 직접 또는 롤러로 압축하여 정제를 형성할 수 있다. 정제 블렌드 또는 블렌드의 일부는 대안적으로 정제화 전에 습식-, 건식- 또는 용융-과립화, 용융 응결 또는 압출될 수 있다. 최종 제형은 하나 이상의 층을 포함할 수 있고 코팅되거나 언코팅될 수 있으며; 캡슐화될 수도 있다.
정제의 제형은 문헌 Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Vol.1, H. Lieberman 및 L. Lachman (Marcel Dekker, New York, 1980)에 기재되어 있다.
인간 또는 수의학적 사용을 위한 소모성 경구 필름은 일반적으로 빠르게 용해되거나 점막에 접착될 수 있는 유연한 수용성 또는 수팽윤성 박막 투여 형태이고 전형적으로 필름-형성 중합체, 결합제, 용매, 습윤제, 가소제, 안정화제 또는 유화제, 점도 조절제 및 용매를 포함한다. 제형의 일부 구성 요소는 하나 이상의 기능을 수행할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물을 포함하는 다중미립자 비드가 본 발명에 포함된다.
기타 가능한 성분에는 항산화제, 착색제, 향미제 및 향미 증강제, 보존제, 타액 자극제, 냉각제, 공용매(오일 포함), 연화제, 증량제, 소포제, 계면활성제 및 맛 차폐제가 포함된다.
본 발명에 따른 필름은 전형적으로 박리가능한 백킹 지지체 또는 종이 상에 코팅된 얇은 수성 필름의 증발 건조에 의해 제조된다. 이것은 건조 오븐 또는 터널, 일반적으로 결합된 코팅 건조기, 또는 동결 건조 또는 진공에 의해 수행될 수 있다.
경구 투여용 고체 제형은 즉시 및/또는 변형 방출로 제형화될 수 있다. 변형 방출 제형에는 지연-방출, 지속-방출, 펄스-방출, 제어-방출, 표적 방출 및 예정 방출이 포함된다.
고에너지 분산 및 삼투성 및 코팅된 입자와 같은 다른 적합한 방출 기술이 알려져 있다.
5.2. 점막 투여
본 발명의 조성물은 또한 점막에 투여될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 소장 및/또는 대장 및/또는 결장의 점막 세포 또는 조직을 포함하나 이에 제한되지 않는 위장관의 점막 세포 또는 조직에 투여될 수 있다. 다른 표적 점막 세포 또는 조직은 안구, 기도 상피, 폐, 질 및 방광 세포 또는 조직을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
이러한 목적을 위한 전형적인 제형은 액체, 겔, 하이드로겔, 용액, 크림, 발포체, 필름, 임플란트, 스펀지, 섬유, 분말, 및 마이크로에멀젼을 포함한다.
본 발명의 화합물은 비강내로 또는 흡입에 의해, 전형적으로 건조 분말의 형태로(단독으로, 혼합물로서, 예를 들어 락토스와의 건조 블렌드로, 또는 혼합 성분입자로서) 적절한 추진제를 사용하거나 사용하지 않고 건조 분말 흡입기 또는 가압 용기, 펌프, 스프레이, 분무기 또는 네뷸라이저에서 에어로졸 스프레이로서 점막에 투여될 수 있다.
흡입기 또는 취입기에 사용하기 위한 캡슐, 블리스터 및 카트리지는 본 발명의 화합물의 분말 혼합물, 락토스 또는 전분과 같은 적합한 분말 베이스 및 I-류신, 만니톨 또는 마그네슘 스테아레이트과 같은 성능 개질제를 함유하도록 제형화될 수 있다.
흡입/비강내 투여용 제형은 즉시 및/또는 변형 방출로 제형화될 수 있다. 변형 방출 제형에는 지연 방출, 지속 방출, 펄스 방출, 제어 방출, 표적 방출 및 예정 방출이 포함된다.
본 발명의 화합물은 직장으로 또는 질내로, 예를 들어 좌약, 페서리 또는 관장의 형태로 투여될 수 있다. 코코아 버터는 전통적인 좌약 베이스이지만 적절하게 다양한 대안을 사용할 수 있다.
직장/질 투여용 제형은 즉시 및/또는 변형 방출로 제형화될 수 있다. 변형 방출 제형에는 지연 방출, 지속 방출, 펄스 방출, 제어 방출, 표적 방출 및 예정 방출이 포함된다.
본 발명의 화합물은 또한 전형적으로 점적 형태로 눈 또는 귀에 직접 투여될 수 있다. 안구 및 귀 투여에 적합한 기타 제형에는 연고, 생분해성(예: 흡수성 겔 스펀지, 콜라겐) 및 비-생분해성(예: 실리콘) 임플란트, 웨이퍼, 렌즈 및 미립자 시스템이 포함된다. 제형은 또한 이온삼투에 의해 전달될 수 있다.
안구/귀 투여용 제형은 즉시 및/또는 변형 방출로 제형화될 수 있다. 변형 방출 제형에는 지연 방출, 지속 방출, 펄스 방출, 제어 방출, 표적 방출 또는 예정 방출이 포함된다.
6. 치료적 응용
한 구현양태에서, 본 발명의 폴리플렉스:중합체 조성물은 치료적 처리를 위해 사용될 수 있다. 이러한 조성물은 때때로 본원에서 치료적 조성물로 지칭된다.
하기에 논의되는 바와 같이, 본 발명의 치료적 단백질은 치료적 핵산을 포함하는 본 발명의 폴리플렉스:중합체 조성물에 의해 생산된다. 하기에 기재된 바와 같은 대상 단백질의 사용은 이러한 단백질 사용에 영향을 미치기 위한 본 발명의 폴리플렉스:중합체 조성물의 사용을 지칭한다.
본 발명에서 사용하기 위해 고려되는 치료적 단백질은 매우 다양한 활성을 가지며 매우 다양한 장애의 치료에 사용된다. 치료적 단백질 활성 및 본 발명의 치료적 단백질로 치료할 수 있는 적응증에 대한 하기 설명은 예시적이며 완전한 것으로 의도되지 않는다. "대상체"라는 용어는 동물을 지칭하며, 포유동물이 바람직하고, 인간이 특히 바람직하다.
치료적 단백질 및 표적 질병의 부분 목록이 표 4에 제시되어 있다.
표 4
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
또 다른 구현양태에서, 본 발명의 치료적 조성물은 치료적 단백질을 코딩하지 않는 치료적 핵산, 예를 들어 치료적 RNA를 포함한다. 예를 들어, 질병 및/또는 바람직하지 않은 세포 또는 생리학적 상태의 메카니즘에 관여하는 유전자를 표적으로 하는 치료적 RNA를 선택함으로써, 본 발명의 조성물은 광범위한 질병 및 상태의 치료에 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물은 사용된 치료적 RNA가 표적 선택의 범위와 관련하여 제한되지 않는 특성을 갖는다. 따라서, 본 발명의 조성물은 적합한 표적 점막 조직을 포함하는 임의의 질병 또는 상태에서의 용도를 발견한다.
치료적 구현양태의 특정한 비제한적인 예는 하기에 기재되어 있다. 일부 경우에, 치료적 구현양태는 비-점막 표적 조직, 세포 또는 기관에 작용하도록 의도된다. 치료 효과가 비-점막인 경우, 본원에 기재된 폴리플렉스:중합체 조성물에 의해 접촉된 세포 또는 조직은 점막이고 치료 작용은 점막 표적에 대해 원위인 것으로 이해된다. 예를 들어, 점막 세포를 형질감염시켜 호르몬 또는 기타 치료제를 생산하고 분비할 수 있다.
6.1. 고혈당증 및 체질량
치료적 단백질에는 인슐린 및 인슐린 유사체가 포함된다. 당뇨병은 췌장 β-세포로부터 인슐린 생산이 없거나(1형) 불충분하여(2형) 야기되는 쇠약해지는 대사 질환이다(Unger, R.H. 등, Williams Textbook of Endocrinology Saunders, Philadelphia(1998)). 베타 세포는 식사 후 방출을 위해 인슐린을 제조 및 저장하는 특수 내분비 세포이며(Rhodes, 등 J. Cell Biol. 105:145(1987)), 인슐린은 혈액으로부터 필요한 조직에 글루코스의 전달을 촉진하는 호르몬이다. 당뇨병 환자는 혈당 수치를 자주 모니터링해야 하며 많은 환자가 생존을 위해 매일 여러 차례 인슐린 주사를 맞아야 한다. 그러나, 이러한 환자는 인슐린 주사에 의해 이상적인 글루코스 수준에 거의 도달하지 않는다(Turner, R. C. 등. JAMA 281:2005(1999)). 또한, 인슐린 수치가 장기간 상승하면 저혈당 쇼크 및 인슐린에 대한 신체 반응의 둔감화와 같은 해로운 부작용이 발생할 수 있다. 결과적으로, 당뇨병 환자는 심혈관 질환, 신장 질환, 실명, 신경 손상 및 상처 치유 장애와 같은 장기적인 합병증을 여전히 발병한다(UK Prospective Diabetes Study(UKPDS) Group, Lancet 352, 837(1998)).
본 발명의 방법으로 치료할 수 있는 장애에는 고혈당 상태, 예를 들어 인슐린-의존성(1형) 또는 비의존성(2형) 당뇨병 뿐만 아니라 고혈당 상태와 관련되거나 그로 인한 생리학적 상태 또는 장애가 포함된다. 따라서, 본 발명의 방법에 의해 치료될 수 있는 고혈당 상태는 또한 만성 또는 급성 고혈당증(예를 들어, 당뇨병)과 관련된 조직병리학적 변화를 포함한다. 특정 예로는 췌장 변성(β-세포 파괴), 신장 세뇨관 석회화, 간 변성, 눈 손상(당뇨병성 망막병증), 당뇨병성 족부, 구강 및 잇몸과 같은 점막의 궤양, 과도한 출혈, 혈액 응고 또는 상처 치유 지연 및 관상동맥 심장 질환, 뇌졸중, 말초 혈관 질환, 이상지질혈증, 고혈압 및 비만의 위험 증가를 포함한다.
본 조성물은 글루코스 감소, 글루코스 내성 향상, 고혈당 상태(예를 들어, 당뇨병)의 치료 또는 고혈당 상태와 관련되거나 그로 인한 생리학적 장애의 치료에 유용하다. 이러한 장애에는, 예를 들어 당뇨병성 신경병증(자율성), 신병증(신장 손상), 피부 감염 및 기타 피부 장애, 손상 또는 상처의 느린 또는 지연된 치유(예: 당뇨병성 낭종을 유발함), 실명을 유도할 수 있는 눈 손상(망막병증, 백내장), 당뇨병성 족부 및 가속화된 치주염을 포함한다. 이러한 장애에는 관상동맥 심장 질환, 뇌졸중, 말초 혈관 질환, 이상지질혈증, 고혈압 및 비만의 발병 위험 증가도 포함된다.
본원에 사용된 용어 "고혈당의" 또는 "고혈당증"은 대상체의 상태와 관련하여 사용될 때 대상체의 혈액에 존재하는 일시적 또는 만성 비정상적으로 높은 수준의 글루코스을 의미한다. 이 상태는 글루코스 대사 또는 흡수의 지연에 의해 야기되어 대상체가 글루코스 불내성 또는 정상 대상체에서 전형적으로 발견되지않는 상승된 글루코스 수준 상태(예: 당뇨병 발병 위험이 있는 글루코스 불내성 아당뇨병 환자 또는 당뇨병 대상체)를 보이게 된다. 정상 혈당에 대한 공복 혈장 글루코스(FPG) 수준은 약 110mg/dl 미만, 손상된 글루코스 대사의 경우 약 110 내지 126mg/dl, 당뇨병 환자의 경우 약 126mg/dl 초과이다.
장 점막 조직에서 단백질을 생성하여 치료할 수 있는 장애에는 비만 또는 바람직하지 않은 체질량도 포함된다. 렙틴, 콜레시스토키닌, PYY 및 GLP-1은 배고픔을 감소시키고 에너지 소비를 증가시키며 체중 감소를 유도하거나 정상적인 글루코스 항상성을 제공한다. 따라서, 다양한 구현양태에서, 비만 또는 바람직하지 않은 체질량, 또는 고혈당증을 치료하기 위한 본 발명의 방법은 렙틴, 콜레시스토키닌, PYY 또는 GLP-1을 코딩하는 치료적 핵산의 사용을 포함한다. 다른 구현양태에서, 그렐린을 표적으로 하는 치료적 RNA가 사용된다. 그렐린은 식욕 및 배고픔을 증가시킨다. 따라서, 다양한 구현양태에서, 비만 또는 바람직하지 않은 체질량, 또는 고혈당증을 치료하기 위한 본 발명의 방법은 이의 발현을 감소시키기 위해 그렐린을 표적화하는 치료적 RNA의 사용을 포함한다. 치료가능한 장애에는 또한 일반적으로 비만과 관련된 장애, 예를 들어 비정상적으로 상승된 혈청/혈장 LDL, VLDL, 트리글리세리드, 콜레스테롤, 혈관이 좁아지거나 막히는 플라크 형성, 고혈압/뇌졸중의 위험 증가, 관상동맥 심장병 등이 포함된다.
본원에 사용된 용어 "뚱뚱한" 또는 "비만"은 연령 및 성별이 일치하는 정상 대상체와 비교하여 체질량이 적어도 30% 증가한 대상체를 지칭한다. "바람직하지 않은 체질량"은 대응되는 정상 대상체보다 1% 내지 29% 더 큰 체질량을 갖는 대상체 및 체질량이 정상이지만 체질량의 증가를 감소 또는 방지하고자 하는 대상체를 지칭한다.
한 구현양태에서, 본 발명의 치료적 단백질은 글루카곤 길항제이다. 글루카곤은 췌도에서 β-세포에 의해 생성되는 펩티드 호르몬이며 글루코스 대사의 주요 조절자이다(Unger R.H. & Orci L.N. Eng. J. Med. 304:1518(1981); Unger R.H. Diabetes 25:136 (1976)). 인슐린과 마찬가지로, 혈당 농도는 글루카곤 분비를 매개한다. 그러나 인슐린과 달리, 글루카곤은 혈당이 감소하면 분비된다. 따라서 글루카곤의 순환 농도는 단식 중에 가장 높고 식사 중에 가장 낮다. 글루카곤 수준 증가는 인슐린의 글루코스 저장 촉진을 줄이고 간을 자극하여 글루코스를 혈액으로 방출한다. 글루카곤 길항제의 구체적인 예는 [des-His1, des-Phe6, Glu9]글루카곤-NH2이다. 스트렙토조토신 당뇨병 쥐에서, 이 글루카곤 길항제의 정맥내 볼루스(0.75μg/g 체중) 투여의 15분 이내에 혈당 수준이 37% 감소했다(Van Tine B. A. 등, Endocrinology 137:3316(1996)). 또 다른 구현양태에서, 본 발명은 췌장으로부터 글루카곤 생성 수준을 감소시키기 위한 치료적 RNA의 사용을 포함하는, 당뇨병 또는 고혈당증을 치료하는 방법을 제공한다.
다른 구현형태에서, 고혈당 상태 또는 바람직하지 않은 체질량(예를 들어, 비만)을 치료하는데 유용한 본 발명의 치료적 단백질은 글루카곤-유사 펩티드-1(GLP-1)이다. GLP-1은 식사 중에 장의 L-세포에서 방출되는 호르몬으로 췌장 β- 세포를 자극하여 인슐린 분비를 증가시킨다. GLP-1은 비만 및 당뇨병 치료를 위한 매력적인 치료제로 만드는 추가 활성을 가지고 있다. 예를 들어, GLP-1은 위 배출을 감소시키고, 식욕을 억제하고, 글루카곤 농도를 감소시키고, β-세포 질량을 증가시키고, 글루코스-의존적 방식으로 인슐린 생합성 및 분비를 자극하고, 인슐린에 대한 조직 민감성을 증가시킬 가능성이 있다(Kieffer T.J., Habener J.F. Endocrin. Rev. 20:876(2000)). 따라서 식사와 동시에 장에서 GLP-1의 조절된 방출은 고혈당 상태 또는 바람직하지 않은 체질량에 대한 치료적 이점을 제공할 수 있다. 디펩티딜 펩티다제 IV(DPP IV)에 내성이 있는 GLP-1 유사체는 더 긴 작용 지속시간과 향상된 치료적 가치를 제공한다. 따라서, GLP-1 유사체가 바람직한 치료적 폴리펩티드이다. 또 다른 구현양태에서, 본 발명은 DPP IV의 수준을 감소시키기 위한 치료적 RNA의 사용을 포함하는, 당뇨병 또는 고혈당증을 치료하는 방법을 제공한다.
또 다른 구현양태에서, 고혈당 상태를 치료하는 데 유용한 본 발명의 치료적 단백질은 호르몬 레지스틴에 대한 길항제이다. 레지스틴은 식이-유발 및 유전적 형태의 비만에서 발현이 증가하는 지방세포-유래 인자이다. 순환하는 레지스틴의 중화는 비만 마우스에서 혈당 및 인슐린 작용을 향상한다. 반대로, 정상 마우스에 레지스틴을 투여하면 글루코스 내성과 인슐린 작용이 손상된다(Steppan CM 등, Nature 409:307(2001)). 따라서 장에서 레지스틴의 생물학적 효과를 길항하는 단백질의 생산은 비만-관련 인슐린 저항성 및 고혈당 상태에 대한 효과적인 치료법을 제공할 수 있다. 또 다른 구현양태에서, 본 발명은 지방 조직에서 레지스틴 발현 수준을 감소시키기 위한 치료적 RNA의 사용을 포함하는, 당뇨병 또는 고혈당증을 치료하는 방법을 제공한다.
또 다른 구현양태에서, 고혈당 상태 또는 바람직하지 않은 체질량(예를 들어, 비만)을 치료하는데 유용한 본 발명의 치료적 폴리펩티드는 렙틴이다. 렙틴은 주로 지방 세포에서 생성되지만 위장에서 식사-의존적 방식으로 소량으로 생성된다. 렙틴은 지방 세포 대사 및 체중에 대한 정보를 뇌의 식욕 중추에 전달하여 음식 섭취 감소(포만 촉진)를 알리고 신체의 에너지 소비를 증가시킨다.
또 다른 구현양태에서, 고혈당 상태 또는 바람직하지 않은 체질량(예를 들어, 비만)을 치료하는 데 유용한 본 발명의 치료적 폴리펩티드는 지방세포 보체-관련 단백질(Acrp30)의 C-말단 구형 헤드 도메인이다. Acrp30은 분화된 지방세포에 의해 생성되는 단백질이다. 구형 헤드 도메인으로 구성된 Acrp30의 단백질 분해 절단 산물을 마우스에 투여하면 상당한 체중 감소가 발생한다(Fruebis J. 등, Proc. Natl Acad. Sci USA 98:2005(2001)).
또 다른 구현양태에서, 고혈당 상태 또는 바람직하지 않은 체질량(예를 들어, 비만)을 치료하는 데 유용한 본 발명의 치료적 폴리펩티드는 콜레시스토키닌(CCK)이다. CCK는 장에서 특정 영양소에 반응하여 장에서 분비되는 위장 펩티드이다. CCK 방출은 소비된 음식의 양에 비례하며 뇌에 식사를 종료하라는 신호를 보내는 것으로 믿어진다(Schwartz M. W. 등, Nature 404:661-71(2000)). 결과적으로, 상승된 CCK는 식사량을 줄이고 체중 감소 또는 체중 안정화(즉, 체중 증가를 방지하거나 증가를 억제)를 촉진할 수 있다.
PYY와 관련하여 예를 들어 le Roux 등, Proc Nutr Soc. 2005 May;64(2):213-6 문헌을 참고한다.
6.2. 면역학적 장애
한 구현양태에서, 본 발명의 치료적 조성물은 면역조절 활성을 갖는다. 예를 들어, 본 발명의 치료적 폴리펩티드는 면역 세포의 증식, 분화 또는 동원(주화성)을 활성화 또는 억제함으로써 면역계의 결핍 또는 장애를 치료하는 데 유용할 수 있다. 면역 세포는 조혈 과정을 통해 발달하여 다능성 줄기 세포에서 골수(혈소판, 적혈구, 호중구 및 대식세포) 및 림프구(B 및 T 림프구) 세포를 생성한다. 이러한 면역 결핍 또는 장애의 원인은 유전적, 암 또는 일부 자가면역 장애와 같은 체세포성, 후천성(예: 화학요법 또는 독소에 의해) 또는 감염성일 수 있다.
본 발명의 치료적 조성물은 조혈 세포의 결핍 또는 장애를 치료하는데 유용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 치료적 폴리펩티드는 특정(또는 많은) 유형의 조혈 세포의 감소와 관련된 장애를 치료하기 위한 노력의 일환으로 다능성 줄기 세포를 포함하는 조혈 세포의 분화 또는 증식을 증가시키는 데 사용될 수 있다. 면역 결핍 증후군의 예로는 혈액 단백질 장애(예: 무감마글로불린혈증, 이상감마글로불린혈증), 모세혈관확장성 운동실조, 공통 가변성 면역결핍, 디조지(DiGeorge) 증후군, HIV 감염, HTLV-BLV 감염, 백혈구 접착 결핍 증후군, 림프구감소증, 식세포 살균성 기능장애, 중증 복합 면역결핍증(SCID), 비스콧-알드리치(Wiskott-Aldrich) 장애, 빈혈, 혈소판감소증 또는 혈색소뇨증를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 치료적 조성물은 또한 자가면역 장애를 치료하는데 유용할 수 있다. 많은 자가면역 질환은 면역 세포가 자신을 이물질로 부적절하게 인식하여 발생한다. 이러한 부적절한 인식은 면역 반응을 일으켜 숙주 조직을 파괴한다. 따라서, 면역 반응, 특히 T-세포의 증식, 분화 또는 주화성을 억제하는 본 발명의 치료적 조성물의 투여는 자가면역 질환을 예방하는데 효과적인 치료법이 될 수 있다.
본 발명에 의해 치료될 수 있는 자가면역 장애의 예는 애디슨병, 용혈성 빈혈, 항인지질 증후군, 류마티스 관절염, 피부염, 알레르기성 뇌척수염, 사구체신염, 굿파스처 증후군, 그레이브스병, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 신경염, 안염, 수포성 천포창, 천포창, 다발내분비병증, 자반병, 라이터병, 강직성 증후군, 자가면역 갑상선염, 전신성 홍반 루푸스, 자가면역 폐염, 길랭-바렐리 증후군, 인슐린-의존성 당뇨병, 크론병, 궤양성 대장염 및 자가면역 염증성 안질환을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
유사하게, 천식(특히 알레르기성 천식) 또는 기타 호흡기 문제와 같은 알레르기 반응 및 상태는 또한 본 발명의 치료적 조성물에 의해 치료될 수 있다. 또한, 이러한 분자는 아나필락시스, 항원 분자에 대한 과민증 또는 혈액형 부적합성을 치료하는 데 사용할 수 있다.
본 발명의 치료적 조성물은 또한 장기 거부 또는 이식편대숙주병(GVHD)을 치료 및/또는 예방하는데 사용될 수 있다. 장기 거부 반응은 면역 반응을 통해 이식된 조직의 숙주 면역 세포 파괴에 의해 발생한다. 유사하게, 면역 반응은 GVHD에도 관여하지만, 이 경우 외래 이식된 면역 세포가 숙주 조직을 파괴한다. 면역 반응, 특히 T-세포의 증식, 분화 또는 주화성을 억제하는 본 발명의 치료적 조성물의 투여는 장기 거부 또는 GVHD를 예방하는 효과적인 치료법일 수 있다.
유사하게, 본 발명의 치료적 조성물은 또한 염증을 조절하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 치료적 폴리펩티드는 염증 반응에 관여하는 세포의 증식 및 분화를 억제할 수 있다. 이러한 분자는 감염과 관련된 염증(예: 패혈성 쇼크, 패혈증 또는 전신 염증 반응 증후군(SIRS)), 허혈-재관류 손상, 내독소 치사, 관절염, 췌장염, 보체-매개 초급성 거부반응, 신염, 사이토카인 또는 케모카인 유도 폐 손상, 염증성 장 질환(IBD), 크론병, 또는 사이토카인(예: TNF 또는 IL-1)의 과잉 생산으로 인한 결과를 포함하는 만성 및 급성 상태 모두에서 염증성 상태를 치료하는 데 사용될 수 있다. 한 구현양태에서, TNFα에 대해 표적화된 치료적 RNA는 염증을 치료하기 위해 본 발명의 조성물에서 사용된다. 또 다른 바람직한 구현양태에서, IL-1에 대해 표적화된 치료적 RNA는 염증을 치료하기 위해 본 발명의 조성물에 사용된다. siRNA 치료적 RNA가 특히 바람직하다. 본 발명에서 치료를 위한 관심 염증성 장애는 만성 폐쇄성 폐 장애(COPD), 간질성 방광염, 및 염증성 장 질환을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
6.3. 응고 장애
일부 구현양태에서, 본 발명의 치료적 조성물은 또한 지혈(출혈의 정지) 또는 혈전용해 활성(덩어리 형성)을 조절하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 지혈 또는 혈전용해 활성을 증가시킴으로써, 본 발명의 치료적 조성물은 혈액 응고 장애(예를 들어, 섬유소원혈증, 인자 결핍증), 혈소판 장애(예를 들어, 혈소판감소증), 또는 외상, 수술, 또는 다른 원인에 의한 상처를 치료하는 데 사용될 수 있다. 대안적으로, 지혈 또는 혈전용해 활성을 감소시킬 수 있는 본 발명의 치료적 조성물은 응고를 억제하거나 용해하기 위해 사용될 수 있다. 이들 치료적 조성물은 심장마비(경색), 뇌졸중 또는 흉터의 치료에 중요할 수 있다. 한 구현양태에서, 본 발명의 치료적 폴리펩티드는 혈우병 또는 다른 응집/응고 장애(예를 들어, 인자 VIII, IX 또는 X)의 치료에 유용한 응고 인자이다.
6.4. 과증식성 장애
한 구현양태에서, 본 발명의 치료적 조성물은 세포 증식을 조절할 수 있다. 이러한 치료적 폴리펩티드는 신생물을 비롯한 과증식성 장애를 치료하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 치료적 조성물에 의해 치료될 수 있는 과증식성 장애의 예는 복부, 뼈, 유방, 소화계, 간, 췌장, 복막, 내분비선(부신, 부갑상선, 뇌하수체, 고환, 난소, 흉선, 갑상선), 눈, 두경부, 신경계(중추 및 말초), 림프계, 골반, 피부, 연조직, 비장, 흉부 및 비뇨생식기에 위치한 신생물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
유사하게, 다른 과증식성 장애도 본 발명의 치료적 조성물에 의해 치료될 수 있다. 이러한 과증식성 장애의 예로는 고감마글로불린혈증, 림프증식성 장애, 파라단백질혈증, 자반병, 유육종증, 세자리(Sezary) 증후군, 발덴스트론 마크로글로불린혈증, 고셔병, 조직구증, 및 상기에 열거된 기관계에 위치하는 신생물 이외의 다른 과증식성 질병환이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
순환계로의 전달은 다양한 조직에 대한 치료적 단백질의 접근을 제공한다. 대안적으로, 본 발명의 치료적 조성물은 과증식성 장애를 억제할 수 있는 다른 세포의 증식을 자극할 수 있다.
예를 들어, 면역 반응을 증가시킴으로써, 특히 과증식성 장애의 항원 특성을 증가시키거나 T-세포를 증식, 분화 또는 동원함으로써, 과증식성 장애가 치료될 수 있다. 이 면역 반응은 기존 면역 반응을 강화하거나 새로운 면역 반응을 시작하여 증가할 수 있다. 대안적으로, 면역 반응을 감소시키는 것은 또한 화학요법제와 같은 과증식성 장애를 치료하는 한 방법일 수 있다.
6.5. 감염성 질병
한 구현양태에서, 본 발명의 치료적 조성물은 감염성 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 면역 반응을 증가시키고, 특히 B 및/또는 T 세포의 증식 및 분화를 증가시킴으로써 감염성 질병을 치료할 수 있다. 면역 반응은 기존 면역 반응을 강화하거나 새로운 면역 반응을 시작함으로써 증가할 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 치료적 조성물은 또한 반드시 면역 반응을 유도하지 않으면서 감염원을 직접적으로 억제할 수 있다.
바이러스는 본 발명의 치료적 조성물에 의해 치료될 수 있는 질병 또는 증상을 유발할 수 있는 감염원의 한 예이다. 바이러스의 예에는 다음 DNA 및 RNA 바이러스 과가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다: 아르보바이러스, 아데노바이러스과, 아레나바이러스과, 아르테리바이러스, 비르나바이러스과, 부냐바이러스과, 칼리시바이러스과, 써코바이러스과, 코로나바이러스과, 플라비바이러스과, 헤파드나바이러스과(간염), 헤르페스바이러스과(예: 거대세포바이러스, 단순포진, 대상포진), 모노네가바이러스(예: 파라믹소바이러스과, 모르빌리바이러스, 랍도바이러스과), 오르토믹소바이러스과(예: 인플루엔자), 파포바바이러스과, 파보바이러스과, 피코르나바이러스과, 폭스바이러스과(예: 천연두 또는 백시니아), 레오바이러스과(예: 로타바이러스), 레트로바이러스과(HTLV-I, HTLV-II, 렌티바이러스) 및 토가비리과(예: 루비바이러스). 이러한 과에 속하는 바이러스는 관절염, 세기관지염, 뇌염, 안구 감염(예: 결막염, 각막염), 만성 피로 증후군, 간염(A, B, C, E, 만성 활동성, 델타), 수막염, 기회 감염(예: AIDS), 폐렴, 버킷 림프종, 수두, 출혈열, 홍역, 볼거리, 파라인플루엔자, 광견병, 감기, 소아마비, 백혈병, 풍진, 성병, 피부병(예: 카포시, 사마귀) 및 바이러스혈증을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 질병 및 증상을 야기할 수 있다. 본 발명의 치료적 조성물은 이들 증상 또는 질병을 치료하는데 사용될 수 있다.
유사하게, 질병 또는 증상을 유발할 수 있고 본 발명의 치료적 조성물에 의해 치료될 수 있는 박테리아 또는 진균제는 하기의 그람-음성 및 그람-양성 박테리아 과 및 진균을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 방선균(예: 코리네박테리움,마이코박테리움, 노카르디아), 아스페르길루스증, 간균과(예: 탄저병, 클로스트리디움), 박테로이드과, 모세포증, 보르데텔라, 보렐리아, 브루셀라증, 칸디다증, 캄필로박터, 콕시디오이데스진균증, 크립토코커스, 피부사상균증, 장내세균과(클렙시엘라, 살모낼라, 세라티아, 예르시니아), 에리스펠로트릭스, 헬리코박터, 레지오넬라증, 렙토스피라증, 리스테리아, 마이코플라즈마탈레스, 나이세리아과(예: 아시네토박터, 임질, 수막구균), 파스퇴렐라시아 감염(예: 방선균, 헤모필루스, 파스퇴렐라), 슈도모나스, 리케차과, 클라미디아과, 매독 및 포도구균. 이러한 박테리아 또는 곰팡이 과는 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다음 질병 또는 증상을 유발할 수 있다: 균혈증, 심내막염, 안구 감염(결막염, 결핵, 포도막염), 치은염, 기회 감염(예: AIDS 관련 감염), 손발톱주위염, 보철물-관련 감염, 라이터병, 백일해 또는 농흉과 같은 호흡기 감염, 패혈증, 라임병, 고양이 긁힘병, 이질, 파라티푸스, 식중독, 장티푸스, 폐렴, 임질, 수막염, 클라미디아, 매독, 디프테리아, 나병, 파라결핵, 결핵, 루푸스, 보툴리누스 중독, 괴저, 파상풍, 농가진, 류마티스열, 성홍열, 성병, 피부병(예: 봉와직염, 피부 균류), 독소혈증, 요로 감염, 상처 감염. 본 발명의 치료적 조성물은 이들 증상 또는 질병을 치료하는데 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 치료적 조성물에 의해 치료될 수 있는 질병 또는 증상을 유발하는 기생충은 다음과 같은 과를 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 아메바증, 바베시아증, 콕시듐증, 크립토스포리디움증, 디엔타메비아증, 도린, 체외기생충, 편모충, 헬민티아증, 리슈마니아증, 틸레리아증, 톡소플라스마증, 트리파노소마증 및 트리코모나스. 이러한 기생충은 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 질병 또는 증상을 유발할 수 있다: 옴, 트롬비큘리아증, 안구 감염, 장 질환(예: 이질, 편모충증), 간 질환, 폐 질환, 기회 감염(예: AIDS 관련), 말라리아, 임신 합병증 및 톡소플라스마증. 본 발명의 치료적 조성물은 이들 증상 또는 질병을 치료하는데 사용될 수 있다.
6.6. 재생
본 발명의 치료적 조성물은 점막 조직 또는 표적 점막 세포 또는 조직에 인접한 조직의 재생을 촉진하여 세포를 분화, 증식 및 유인하는 데 사용될 수 있다. (Science 276:59-87(1997) 참고.) 조직의 재생은 선천적 결함, 외상(상처, 범(bums), 절개 또는 궤양), 연령 질병(예를 들어 골다공증, 골관절염, 치주 질환, 간부전), 성형 수술을 포함한 수술, 섬유증, 재관류 손상 또는 전신 사이토카인 손상에 의해 손상된 조직을 수리, 교체 또는 보호하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 치료적 조성물은 다음을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 조직의 재생을 촉진할 수 있다: 기관(예를 들어, 췌장, 간, 장, 신장, 피부, 내피), 근육(평활근, 골격근 또는 심장근), 혈관(혈관 내피 포함), 신경계, 조혈 및 골격(뼈, 연골, 힘줄 및 인대) 조직. 바람직하게는, 재생은 소량의 흉터를 유발하거나 흉터 없이 발생한다. 재생은 또한 혈관신생을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 치료적 조성물은 치유하기 어려운 조직의 재생을 증가시킬 수 있다. 예를 들어 힘줄/인대 재생이 증가하면 손상 후 회복 시간이 빨라진다. 본 발명의 치료적 조성물은 또한 손상을 피하기 위한 노력으로 예방적으로 사용될 수 있다. 치료할 수 있는 특정 질병에는 건염, 수근관 증후군 및 기타 힘줄 또는 인대 결함이 있다. 치유되지 않는 상처의 조직 재생의 추가 예에는 욕창, 혈관 기능 부전과 관련된 궤양, 외과적 및 외상성 상처가 포함된다.
유사하게, 신경 및 뇌 조직은 또한 신경 세포를 증식 및 분화시키기 위해 본 발명의 치료적 조성물을 사용함으로써 재생될 수 있다. 이 방법을 사용하여 치료할 수 있는 질병에는 중추 및 말초 신경계 질환, 신경병증 또는 기계적 및 외상성 장애(예: 척수 장애, 두부 외상, 뇌혈관 질환 및 뇌졸중)가 있다. 특히, 말초 신경 손상과 관련된 질병, 말초 신경병증(예: 화학 요법 또는 기타 의학적 요법으로 인한), 국소 신경병증 및 중추 신경계 질환(예: 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 근위축성 측삭 경화증 및 샤이-드래거 증후군과 관련된 질병)은 모두 본 발명의 치료적 조성물을 사용하여 치료될 수 있다. CNS 장애와 관련하여, 혈액 뇌 장벽을 파괴하는 방법, 및 CNS로의 수송을 제공하는 모이어티에 치료제를 커플링시키는 방법을 포함하여, 뇌 조직에 대한 치료적 접근을 용이하게 하기 위한 수많은 수단이 당업계에 공지되어 있다. 한 구현양태에서, 치료적 핵산은 융합 단백질을 코딩하도록 조작되며, 이 융합 단백질은 수송 모이어티 및 치료적 단백질을 포함한다.
6.7. 주화성
한 구현양태에서, 본 발명의 치료적 조성물은 주화성을 조절할 수 있다. 예를 들어, 한 구현양태에서, 본 발명의 치료적 폴리펩티드는 주화성 활성을 갖는다. 주화성 분자는 세포(예: 단핵구, 섬유아세포, 호중구, T-세포, 비만 세포, 호산구, 상피 및/또는 내피 세포)를 염증, 감염 또는 과증식 부위와 같은 신체의 특정 부위로 유인하거나 동원한다. 그런 다음 동원된 세포는 특정 외상이나 이상을 물리치고/하거나 치유할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 치료적 폴리펩티드는 특정 세포의 주화성 활성을 증가시킬 수 있다. 이러한 주화성 분자는 신체의 특정 위치로 표적 세포의 수를 증가시켜 염증, 감염, 과증식성 장애 또는 면역계 장애를 치료하는 데 사용할 수 있다. 예를 들어, 주화성 분자는 면역 세포를 손상된 위치로 유인함으로써 조직에 대한 상처 및 기타 외상을 치료하는 데 사용할 수 있다. 본 발명의 주화성 분자는 또한 상처 치료에 사용될 수 있는 섬유아세포를 유인할 수 있다.
본 발명의 치료적 조성물은 주화성 활성을 억제할 수 있는 것으로 또한 고려된다. 이들 치료적 조성물은 또한 장애를 치료하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 치료적 조성물은 주화성의 억제제로서 사용될 수 있다.
표적 조직 부근에서 활성화되는 친치료적 단백질의 사용이 특히 바람직하다.
사용이 고려되는 추가 치료적 폴리펩티드는 다음을 포함하지만 이로 제한되지 않는다: 성장 장애 또는 소모 증후군을 치료하기 위한 성장 인자(예를 들어, 성장 호르몬, 인슐린-유사 성장 인자-1, 혈소판-유래 성장 인자, 표피 성장 인자, 산성 및 염기성 섬유아세포 성장 인자, 변형 성장 인자-β 등); 및 외래 항원 또는 병원체(예: H. Pylori)에 대한 대상체의 수동 면역화 또는 보호를 제공하거나, 암, 관절염 또는 심혈관 질환의 치료를 제공하기 위한 항체(예: 인간 또는 인간화); 사이토카인, 인터페론(예: 인터페론(IFN), IFN-α2b 및 2α, IFN-α N1, IFN-β1b, IFN-감마), 인터루킨(예: IL-1 내지 IL-10), 종양 괴사 인자(TNF-α, TNF-β), 케모카인, 과립구 대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF), 폴리펩티드 호르몬, 항균 폴리펩티드(예: 항균, 항진균, 항바이러스 및/또는 항기생충 폴리펩티드), 효소(예: 아데노신 데아미나제), 성선자극 호르몬, 케모택틴, 지질-결합 단백질, 필가스팀(뉴포젠), 헤모글로빈, 에리트로포이에틴, 인슐리노트로핀, 이미글루세라제, 사브라모팀, 조직 플라스미노겐 활성화제(tPA), 유로키나제, 스트렙토키나제, 페닐알라닌 암모니아 분해효소, 뇌-유래 신경영양 인자(BDNF), 신경 성장인자(NGF), 트롬보포이에틴(TPO), 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD), 아데노신 데아미다제, 카탈라제, 칼시토닌, 엔도텔린, L-아스파라기나제 펩신, 유리카제, 트립신, 키모트립신, 엘라스타제, 카르복시펩티다제, 락타제, 수크라제, 내인성 인자, 부갑상선 호르몬(PTH)-유사 호르몬, 가용성 CD4, 및 항체 및/또는 이의 항원-결합 단편(예: FAb)(예: 오르토클론 OKT-e(항-CD3), GPIIb/IIa 단일클론 항체). 추가로 이러한 인자를 코딩하는 핵산을 표적화하는 치료적 RNA가 고려된다.
6.8. 백신
한 구현양태에서, 본 발명은 환자에게 백신을 접종하는 방법을 제공한다. 방법은 원하는 에피토프를 생성할 수 있는 본 발명의 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 바람직한 구현양태에서, 조성물은 에피토프를 포함하는 단백질을 발현할 수 있는 치료적 핵산 구조체를 포함한다.
6.9. 화장품 용도
한 구현양태에서, 본 발명은 화장품 용도를 위한 DD-키토산 핵산 폴리플렉스를 제공한다. 본 발명의 화장품은 화장품 용도에 적합한 제형 내에 DD-키토산 핵산 폴리플렉스를 포함한다.
실시예
실시예 1:
1. 일반 물질
1.1 플라스미드 DNA 벡터
Figure pct00015
1.2.시약
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
1.3. 소비재
Figure pct00019
Figure pct00020
1.4. 장비
Figure pct00021
Figure pct00022
2. 일반 절차
2.1 이중 유도체화된 키토산의 제조
키토산은 US 9623112 B2에 따라 아르기닌 및 글루콘산으로 이중 유도체화(DD-키토산, DD-X)되었다.
2.2 이중 유도체화된 키토산 및 DNA 폴리플렉스의 제조
DD-키토산은 US9623112 B2 및 US8722646 B2에 따라 플라스미드 DNA 벡터로 필요에 따라 다양한 아민-대-포스페이트(N:P) 몰비로 폴리플렉스되었다. 수크로스, 트레할로스 또는 만니톨과 같은 추가 부형제가 필요에 따라 포함되었다. 다양한 플라스미드 DNA 벡터가 본원에 표시된 대로 테스트되었다.
2.3 PEG-폴리글루탐산(PEG-PGA) 용액의 제조
일반적으로, PEG-PGA는 최대 40mg/mL의 농도에서 필요에 따라 물 또는 부형제 용액에 용해되었다. 생성된 PEG-PGA 용액을 후속 제형을 위해 원하는 최종 아민-대-포스페이트-대-음이온 몰비(N:P:A)를 달성하기 위하여 필요한 음이온 종(A, 예: 글루탐산)의 필요한 몰 농도로 희석하였다.
2.4 PEG-히알루론산(PEG-HA) 용액의 제조
일반적으로, PEG-HA를 40 내지 100mg/mL의 농도로 물에 분배하고 10분 동안 초음파 처리했다. 생성된 PEG-HA 용액을 후속 제형을 위해 원하는 최종 아민-대-포스페이트-대-음이온 몰비(N:P:A)를 달성하기 위하여 10% 트레할로스 중에서 필요한 음이온 종(A, 예: 히알루론산)의 필요한 농도로 희석하여서 트레할로스의 최종 농도가 5%가 되도록 하였다.
2.5 PEG-폴리아스파르트산(PEG-PAA) 용액의 제조
일반적으로, PEG-PAA를 5% 트레할로스에 40 내지 100mg/mL 농도로 분배하고, 10 내지 15분 동안 초음파 처리하였다. 필요한 경우, 생성된 PEG-PAA 용액을 후속 제형을 위해 원하는 아민-대-포스페이트-대-음이온 몰비(N:P:A)를 달성하기 위해 5% 트레할로스 중에서 필요한 음이온성 종(A, 즉 아스파르트산)의 필요한 농도로 희석하여서 트레할로스의 최종 농도가 5%가 되도록 하였다.
2.6 트레할로스 용액의 제조
일반적으로, 트레할로스를 필요에 따라 최대 0.2g/mL의 농도로 물에 용해시켰다. 생성된 트레할로스를 0.2um 필터를 사용하여 여과하였다. 필요한 경우, 트레할로스 용액을 후속 제형에 필요한 농도로 희석하였다.
2.7 50mM 트리스, pH 8에서 PAA 용액 제조
일반적으로, PAA는 필요에 따라 100mg/mL 또는 20mg/mL의 농도로 50mM 트리스 pH 8에 용해되었다. 필요한 경우 PAA 용액을 50mM 트리스 pH 8 중에서 후속 필요에 필요한 농도로 희석했다.
2.8 20mM NaCl의 제조
40mL의 물에 46.75mg의 NaCl을 용해한다. 0.2um 필터를 통해 용액을 여과한다.
2.9 모의 장액(SIF)의 제조
FaSSIF V1 용액은 FaSSIF V1 분말을 2.24mg/mL의 농도로 물에 용해시켜 제조하였다. pH는 대략 6.6인 것으로 확인되었다. FaSSIF V2 용액은 FaSSIF V2 분말을 1.79mg/mL의 농도로 물에 용해시켜 제조하였다. pH는 약 6.6인 것으로 확인되었다.
2.10 PEG-다중음이온(PEG-PA)
PEG-PA는 PEG-폴리글루탐산, PEG-히알루론산 또는 PEG-폴리아스파르트산과 같은 다중음이온에 접합된 PEG에 대한 일반 용어이다.
2.11 점적에 의한 PEG화된 폴리플렉스의 제조
PEG화된 폴리플렉스는 동일한 부피의 폴리플렉스 용액(0.1mL)을 희석된 PEG-PA 용액(0.1mL)에 적하하여 제조하였다.
2.12 인-라인 혼합에 의한 PEG화된 폴리플렉스의 제조
PEG화된 폴리플렉스는 US9623112 B2 및 US8722646 B2에 기재된 것과 같은 인-라인 혼합 장치를 사용하여 동일한 부피의 희석된 PEG-PA 용액을 폴리플렉스 용액과 혼합함으로써 제조된다.
2.13 150mmol PBS에서 PEG화된 폴리플렉스의 안정성
300uL의 150mmol PBS 중에 PEG화된 폴리플렉스 100uL를 혼합한다. 혼합 0 및 2시간에서 입자 크기 직경을 측정한다. 비-PEG화 폴리플렉스 대조군과 비교한다.
2.14 % 슈퍼코일 DNA
% 슈퍼코일 DNA 측정 전에, 과량의 PAA에 적용하여 폴리플렉스 또는 PEG화된 폴리플렉스로부터 전체 DNA를 방출해야 한다. 1μL의 샘플 분취량(0.1mg/mL DNA의 표적)을 10μL의 PAA(50mM 트리스 중 100mg/mL)와 조합하고, 혼합하고, 37℃에서 30분 동안 배양했다. 방출 후, DNA는 아가로스 겔 전기영동에 적용하였다.
2.15 피코그린(Picogreen)에 의한 제형 중의 전체 DNA
피코그린 검정을 사용하여 DNA를 측정하기 전에, 과량의 PAA를 사용하여 폴리플렉스 또는 PEG화된 폴리플렉스로부터 전체 DNA를 방출해야 한다. 10μL의 샘플 분취량(2ug/mL DNA의 표적)을 10μL의 PAA(50mM 트리스 중 20mg/mL)와 조합하고, 혼합하고, 37℃에서 30분 동안 배양했다. 방출 후, 수퍼코일 DNA 플라스미드를 선형화하기 위해 적절한 제한 효소(RE)를 사용하여 DNA를 분해한다. 피코그린 검정의 경우, RE 분해된 샘플의 10uL 분취량을 190uL의 피코그린 작업 용액(Qubit ds DNA 완충액:Qubit ds DNA Picogreen 시약 199:1)과 혼합하고 2분 동안 배양하고 형광을 측정하였다(여기: 485, 방출 컷오프: 515nm, 방출: 535nm). 결과는 참조 DNA 표준 곡선에 대해 정량화된다.
2.16 유리 DNA
폴리플렉스 내로의 DNA 포획의 검증을 위해, 10μL의 샘플 분취량(1000ng DNA의 표적)을 2μL의 6X 로딩 완충액과 조합하고 겔 전기영동에 적용하였다.
2.17 겔 전기영동
설명된 대로 준비된 샘플을 샘플 레인에 로드했다. 표준 레인에는 수퍼코일된 DNA 래더로 로드되었다. 참조 레인에는 2μL의 참조 DNA(200ng의 DNA) + 8μL 물 + 2μL 6X 로딩 완충제가 로딩되었다. 샘플은 100V에서 75분 동안 1X SYBR세이프 DNA 스테인이 함유된 0.8% 아가로스 겔에서 분해되었다. 겔은 겔독(GelDoc) 이미징 시스템으로 이미지화되었다.
2.18 폴리플렉스 및 PEG화된 폴리플렉스의 나노입자 크기 측정
제타사이저 나노(Zetasizer Nano) 광산란 기기를 사용하여 입자 크기 측정을 수행했다. 일반적으로 샘플은 희석되지 않았거나 10mM NaCl에서 최대 20배 희석되었고 일회용 큐벳 또는 제타사이저 접힌 모세관 셀(최소 0.8mL)에 로드되었다. 제타사이저는 3분 동안 3회 측정하기 전에 25℃에서 최대 3분 동안 샘플을 배양하도록 프로그래밍되었다. Z-평균 직경 및 다분산도(PDI)는 표준 편차(n=3)로 보고되었다. 제타사이저는 또한 점도 및 굴절률과 관련하여 샘플의 구성을 설명하도록 프로그래밍되었다.
2.19 폴리플렉스 및 PEG화 폴리플렉스의 제타 전위
제타사이저 나노 광산란 기기를 사용하여 제타 전위 측정을 수행했다. 일반적으로, 10mM NaCl에 희석된 PEG화된 폴리플렉스를 제외하고, 희석되지 않은 샘플을 제타사이저 접힌 모세관 셀(최소 0.8mL)에 로딩했다. 제타사이저는 반복 측정 (반복 횟수는 제타사이저 소프트웨어에 의해 자동으로 결정됨)전에 25℃에서 최대 3분 동안 샘플을 배양하도록 프로그래밍되었다. 제타 전위 값은 표준 편차(n=3)로 보고되었다. 제타사이저는 또한 점도 및 유전 상수와 관련하여 샘플의 최종 구성을 설명하도록 프로그래밍되었다.
2.20 단기 안정성
단기 안정성 연구의 경우, 제형을 기재된 바와 같이 동결-건조시키고 적절한 온도(-20℃, 4℃ 또는 실온)에서 보관하였다. 적절한 시간에 샘플을 재수화하고 설명된 대로 분석했다.
3. PEG-PGA(mPEG1K-b-PLE10)를 사용한 폴리플렉스의 PEG화
3.1 절차
DD-X-DNA(pVax) 폴리플렉스는 이전에 기술된 바와 같이 하기 표시된 바와 같은 N:P 비율에서 5% 트레할로스 중에서 0.1mg/mL DNA의 DNA 농도로 생성되었다.
Figure pct00023
PEG-PGA 용액을 이어서 1:1 부피비로 DD-X-DNA 폴리플렉스와 적하 혼합에 의해 혼합하여 하기에 나타낸 바와 같이 0.05mg/mL DNA에서 PEG화된 폴리플렉스를 수득하였다. 입자 크기, PDI 및 제타 전위에 대해 샘플을 테스트했다(테스트된 제형은 동결되지 않았다).
Figure pct00024
3.2 결과
mPEG1K-b-PLE10으로 제조된 동결-해동되지 않은 PEG화된 폴리플렉스는 하기에 나타낸 바와 같은 특정 N:P:A 비율에서 안정한 제형(표시된 것을 제외하고)을 수득하였다.
Figure pct00025
* 응집된 샘플
4. PEG-PGA(mPEG1K-b-PLE10 및 mPEG5K-b-PLE10) 및 PEG-HA(HA-202)를 사용한 폴리플렉스의 PEG화
4.1 절차
DD-X-DNA(pVax-opt-hIL10) 폴리플렉스는 이전에 기술된 바와 같이 하기 표시된 바와 같은 N:P 비율에서 5% 트레할로스 중에서 0.25mg/mL DNA 농도로 생성되었다.
Figure pct00026
PEG-PGA 용액 또는 PEG-HA 용액을 이어서 하기 표시된 바와 같이 0.125 mg/mL DNA에서 PEG화된 폴리플렉스를 생성하기 위해 적하 혼합에 의해 1:1 부피비로 DD-X-DNA 폴리플렉스와 혼합하였다. 샘플을 동결 및 해동한 다음 입자 크기, PDI 및 제타 전위에 대해 테스트했다.
Figure pct00027
* N:A 비율은 mPEG1K-b-PLE10의 경우 1:92, mPEG5K-b-PLE10의 경우 1:8.5, HA-202의 경우 1:15로 설정되었다.
4.2 결과
동결-해동된 샘플의 물리화학적 결과는 하기 표에 제공된다. mPEG1K-b-PLE10 또는 HA-202로 제조된 PEG화된 폴리플렉스는 동결-해동에 안정적인 제형을 생성하지 못했다. mPEG5K-b-PLE10으로 제조된 PEG화된 폴리플렉스는 동결-해동에 안정적이었다.
Figure pct00028
* 응집된 샘플
** PEG화된 샘플에 대한 제타 전위는 신선한 샘플(동결 해동되지 않은)에서 결정되었다.
5. PEG-HA를 사용한 폴리플렉스의 PEG화
5.1 절차
DD-X-DNA(pVax-opt-hIL10) 폴리플렉스는 이전에 기술된 바와 같이 하기 표시된 바와 같은 N:P 비율에서 5% 트레할로스 중에서 0.25mg/mL DNA 농도로 생성되었다.
Figure pct00029
5% 트레할로스 중 PEG-HA 용액을 이어서 1:1 부피비로 DD-X-DNA 폴리플렉스와 적가 혼합에 의해 혼합하여 하기에 나타낸 바와 같이 0.125mg/mL DNA에서 PEG화된 폴리플렉스를 수득하였다. 입자 크기, PDI 및 제타 전위에 대해 샘플을 테스트했다.
Figure pct00030
Figure pct00031
5.2 결과
HA-201(HA 10k-PEG 2k)은 물에 용해되지 않았다. 그것은 하이드로겔을 형성했고 더 이상 사용되지 않았다. HA-202(HA 50k-PEG 2k)는 물에서 점성 용액을 형성했다. 폴리플렉스는 PEG화 후 가시적인 응집을 보였고 더 이상의 테스트는 수행되지 않았다.
6. PEG-PGA 폴리플렉스의 제조
6.1 절차
PEG화된 폴리플렉스의 제조
N:P 7 폴리플렉스(CMC-INT06-098A) 분취량을 본원에 기재된 바와 같이 PEG-PGA를 사용하여 PEG화하였다. 생성된 PEG화된 폴리플렉스를 물리화학적 특성 및 DNA 캡처에 대해 테스트했다. N:P 7 폴리플렉스 외에 생성된 제형이 생성되었다.
Figure pct00032
6.2 결과
테스트 샘플의 외관, pH, 입자 크기, PDI, 제타 전위 및 전도도는 다음과 같다:
Figure pct00033
유리 DNA 및 % 수퍼코일은 다음과 같다:
Figure pct00034
7. PEG-PGA와 인-라인 혼합 후 TFF 농축에 의한 농축된 PEG화된 폴리플렉스
7.1 절차
PEG-PGA와 인-라인 혼합 후 TFF 농축에 의한 농축된 PEG화 폴리플렉스
DD-X-DNA(pVax-PD-L1-Fc) 폴리플렉스는 이전에 기술된 바와 같이 7:1의 N:P 비율에서 5% 트레할로스 중에서 0.25mg/mL DNA의 DNA 농도에서 생성되었다. 이어서, 5% 트레할로스 중 PEG-PGA 용액을 인-라인 혼합(각 유체 스트림에서 7mL/분)에 의해 1:1 부피비로 DD-X-DNA 폴리플렉스와 혼합하여 0.125mg/mL DNA 및 N:P:A 비율은 7:1:17.5인 PEG화된 폴리플렉스를 수득하였다. 실온에서 60분 동안 배양한 후, 이전에 US8722646 B2에 기재된 공정을 사용하여 PEG화된 폴리플렉스를 TFF(재생 셀룰로오스 막, MWCO 10kDa, 15psig 입구 압력)에 의해 농축시켰다. TFF 동안, 0.25mg/mL, 0.5mg/mL의 명목상 DNA 농도에서 분취량을 취했다. 약 1mg/mL의 명목상 DNA 농도까지 최종 생성물을 수집하였다. 샘플을 분취하고 -80℃에서 보관했다. 해동 후, 샘플은 입자 크기, PDI, 제타 전위, 유리 DNA 및 % 슈퍼코일 DNA에 대해 테스트되었다. 도 11에 개략도가 제공되어 있다.
Figure pct00035
7.2 결과
해동된 테스트 샘플의 입자 크기, PDI, 제타 전위, 유리 DNA 및 % 슈퍼코일은 다음과 같은 것으로 밝혀졌다:
Figure pct00036
7.3 결론
PEG화된 폴리플렉스는 TFF 농축 과정에 의해 0.125mg/mL DNA에서 1mg/mL DNA로 농축될 수 있었고, 콜로이드적으로 안정한 나노입자를 유지할 수 있었다.
8. 사전-농축된 폴리플렉스의 PEG화에 의한 농축된 PEG화된 폴리플렉스
8.1 절차
농축된 DD-X-DNA(pVax-PD-L1-Fc) 폴리플렉스는 US8722646 B2에 이전에 기술된 바와 같이 7:1의 N:P 비율 및 9% 수크로스를 포함하는 1mg/mL DNA의 DNA 농도로 생성되었다. 이어서, 물 중의 PEG-PGA 용액을 인-라인 혼합(각 유체 스트림에서 7mL/분)에 의해 1:1 부피비로 DD-X-DNA 폴리플렉스와 혼합하여 0.5mg/mL DNA 및 N:P:A 비율 7:1:7 또는 N:P:A 비율 7:1:17.5인 PEG화된 폴리플렉스를 수득했다. 실온에서 60분 동안 배양한 후, PEG화된 폴리플렉스를 분취하고 -80℃에서 보관했다.
해동 후, 입자 크기, PDI, 제타 전위, 유리 DNA 및 % 슈퍼코일 DNA에 대해 샘플을 테스트했다.
Figure pct00037
8.2 결과
원료 폴리플렉스 및 PEG화된 폴리플렉스의 물리화학적 특성
Figure pct00038
8.3 결론
1mg/mL DNA에서 DD-X-DNA 폴리플렉스를 7:1:7 및 7:1:17.5의 N:P:A 비율에서 가시적인 응집 없이 0.5mg/mL의 최종 DNA 농도로 PEG화하였다.
9. PEG-PGA 또는 PEG-PAA를 사용한 폴리플렉스의 PEG화
9.1 절차
N:P 7 폴리플렉스(CMC-INT06-24C) 분취량을 본원에 기재된 바와 같이 PEG-PGA 또는 PEG-PAA를 사용하여 PEG화하였다. 생성된 PEG화된 폴리플렉스를 물리화학적 특성 및 DNA 캡처에 대해 테스트했다. N:P 7 폴리플렉스 외에 생성된 제형이 생성되었다.
Figure pct00039
9.2 결과
Figure pct00040
샘플 A-F를 본원에 기재된 바와 같이 유리 DNA에 대해 테스트하였다. 생성된 겔은 가시적인 유리 DNA를 나타내지 않았다.
9.3 결론
PEG-PGA(mPEG5K-b-PLE10) 또는 PEG-PAA(mPEG5K-b-PLD10)로 PEG화된 폴리플렉스는 유리 DNA가 없는 안정적인 나노입자를 형성했다.
10. 모의 장액에서 PEG화된 폴리플렉스의 안정성
10.1 절차
테스트 제품
N:P 7 폴리플렉스(CMC-INT06-24C) 분취량을 본원에 기재된 바와 같이 PEG-PGA를 사용하여 PEG화하였다. 생성된 PEG화된 폴리플렉스를 FaSSIF 완충액에서 안정성에 대해 테스트했다.
Figure pct00041
SIF 1:3, v/v에서 PEG화된 폴리플렉스의 안정성 테스트
50uL의 폴리플렉스를 150uL의 모의 장액에 첨가한다. 잘 혼합한다. 즉시 50uL의 현탁액을 DLS 큐벳에 분취하고 물 350uL을 첨가하고 설명된 대로 DLS로 입자 크기를 측정한다. 나머지 샘플 용액을 3개의 튜브로 나눈다. 적절한 시점에서 350uL의 물을 튜브에 첨가하고 완전히 혼합한 다음 DLS로 입자 크기를 측정한다.
SIF 3:1, v/v에서 PEG화된 폴리플렉스의 안정성 테스트
75uL의 폴리플렉스를 25uL의 모의 장액에 첨가한다. 잘 혼합한다. 즉시 50uL의 현탁액을 DLS 큐벳에 분취하고 물 350uL를 첨가하고 설명된 대로 DLS로 입자 크기를 측정한다. 나머지 샘플 용액을 3개의 튜브로 나눈다. 적절한 시점에서 350uL의 물을 튜브에 첨가하고 완전히 혼합한 다음 DLS로 입자 크기를 측정한다.
10.2 결과
비-PEG화 폴리플렉스(7-1-0으로 표시됨)는 완충액과 혼합하는 즉시 응집되었다(최대 규모). PEG화 폴리플렉스(PEG-PGA, mPEG5K-b-PLE10로)는 1:3 (FaSSIF:PEG화 폴리플렉스, v/v) 비율에서 24시간 동안 안정적으로 유지되었다. PEG화된 폴리플렉스(PEG-PGA, mPEG5K-b-PLE10로)는 3:1 (FaSSIF:PEG화된 폴리플렉스, v/v) 비율에서 1시간 동안 안정적으로 유지되었다.
11. FaSSIF 완충액에서 PEG화된 폴리플렉스의 안정성-유리 DNA
참조: CMC-INT06-EXP-072
11.1 절차
N:P 7 폴리플렉스(CMC-INT06-024C, DD-X-DNA(pVax-opt-hIL10) 폴리플렉스, 5% 트레할로스, 0.25mg/mL) 분취량을 PEG-PGA(5% 트레할로스 중)를 사용하여 본원에 설명된 대로 PEG화해서 하기 표의 목표 N:P:A 비율을 달성하였다. 생성된 PEG화된 폴리플렉스를 하기 표의 비율에 따라 FaSSIF 완충액에서 안정성에 대해 테스트했다. 2시간 후, 다음의 물리화학적 특성이 결정되었다: 유리 DNA, pH, 직경 및 PDI.
Figure pct00042
11.2 결과
Figure pct00043
FaSSIF-폴리플렉스 샘플의 유리 DNA 검정. 도 5에 도시된 바와 같이 유리 DNA는 관찰되지 않았다.
레인 설명은 하기에 제공되어 있다.
Figure pct00044
Figure pct00045
12. PEG화된 폴리플렉스의 제조 및 시험관내 형질감염
12.1 시험관내 형질감염 시약
Figure pct00046
12.2 시험관내 형질감염 소비재
Figure pct00047
시험관내 형질감염 장비
Figure pct00048
12.4 절차
테스트 제품
N:P 7 폴리플렉스(CMC-INT06-024C, DD-X-DNA(pVax-opt-hIL10)폴리플렉스, 5% 트레할로스, 0.25mg/mL) 분취량을 PEG-PGA(mPEG5K-b-PLE10, 5% 트레할로스 중에서)를 사용하여 본원에 기술된 바와 같이 PEG화하여 하기 표의 목표 N:P:A 비율을 달성하였다. 생성된 PEG화된 폴리플렉스를 동결/해동 전 및 후에 입자 직경, PDI, 제타 전위에 대해 테스트했다. 해동된 샘플을 시험관내 형질감염에 대해 테스트하였다.
Figure pct00049
12.5 시험관내 형질감염 절차
세포 준비
패시지 19에서 HEK293T 세포(ATCC)를 통과시키고 원심분리하여 트립신을 제거한 다음, 10% FBS가 보충된 DMEM에 2배 재현탁시켰다. 바이-세포 자동 세포 생존율 분석기(Vi-Cell Auto Cell Viability Analyzer)에서 세포 생존율 및 계수를 수행하여 세포 계수 및 생존율을 확인했다. 세포를 10% FBS가 보충된 DMEM에서 1.25X105개 세포/mL의 농도로 희석하고 96-웰의 투명한 바닥 TC 플레이트(200uL, 웰당 25,000개 세포)에 분배했다. 플레이트를 실온에서 15-20분 동안 배양한 후 37℃/5% CO2에서 밤새 배양한 다음 형질감염에 사용했다.
폴리플렉스의 희석
표적 농도가 달리 제공되지 않는 한, 테스트 샘플을 0.125mg/mL DNA로 희석하였다. 대조군 샘플(CMC-INT06-024 및 CMC-JAN01-010)은 물에 0.14mg/mL로 희석된 0.25mg/mL DNA로 제공된다. 그런 다음 모든 테스트 및 대조군 샘플을 물에 연속적으로 총 10회 희석에 대해 1/1.35로 희석했다. 이러한 연속 희석물을 옵티-멤(Opti-MEM)에서 17.7배 더 희석하고 이 희석된 폴리플렉스 35.6uL를 각 웰에 이중으로 첨가했다(대조군 샘플의 경우 282ng의 폴리플렉스에서 19ng의 폴리플렉스까지 및 테스트 샘플의 경우 251ng의 폴리플렉스에서 17ng의 폴리플렉스까지의 최종 용량 범위를 제공한다).
세포의 형질감염
형질감염은 다음과 같이 수행하였다. 먼저, 각 HEK293T 웰에서 배지를 제거한 다음 0.1mL 옵티-멤(Opti-MEM)(pH 7.4)을 첨가한 다음 제거했다. 옵티-멤(이전 섹션 참조)에 희석된 폴리플렉스 샘플을 각 웰에 첨가하고 37℃에서 3시간 동안 배양했다. 배양 후, 배지를 제거하고 0.2mL의 완전한 배지로 교체하고 37℃에서 다시 배양했다. 48시간 후 상층액을 제거하고 즉시 MSD 검정에 사용했다. 나머지 세포를 용해하여 전체 단백질을 결정하였다.
전체 단백질의 정량화
각 웰에 대한 전체 단백질은 표준 곡선에 대해 BSA를 사용하는 DCTM 단백질 검정을 사용하여 결정되었다. ELISA를 위해 상청액이 제거되면 나머지 세포층은 4℃에서 10분 동안 용해 완충액에서 용해되었다. v-바닥, 96-웰 플레이트로 옮기기 전에 용해물을 여러 번 피펫팅했다(기포 형성을 최소화하면서). 그런 다음 용해물을 1000g에서 4℃에서 5분 동안 원심분리하여 정화했다.
단백질 표준 곡선 제조
단백질 검정 표준 II(소 혈청 알부민) 원액을 밀리-Q 물에서 5mg/ml로 제조하고 4℃에서 보관했다. 표준 곡선은 용해 완충액(샘플이 제조된 동일한 완충액)에서 단백질 표준의 1:2 연속 희석을 수행하여 제조되었다.
로리(Lowry)/DCTM 단백질 검정
작업 시약 A'는 각각 1ml의 시약 A에 20μl의 시약 S를 첨가하여 제조했다. 25μl의 작업 시약 A'를 96-웰 플레이트의 각각의 웰에 옮겼다. 웰당 5μl의 세포 용해물 또는 표준물을 첨가하였다. 그런 다음 200μl의 시약 B를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 5초 동안 진탕하고 실온에서 15분 동안 배양하여 발색되도록 하였다. 흡광도는 스펙트라맥스(SpectraMAX) 플레이트 판독기에서 750nm에서 측정되었다. 표준 흡광도를 표준 농도에 대해 플롯팅했다. 스펙트라맥스(SpectraMax) 소프트웨어 곡선 피팅 분석이 사용되었으며 4개의 매개변수 알고리즘이 표준 곡선에 가장 적합한 곡선을 제공했다. 소프트웨어는 또한 단백질 표준 곡선에서 샘플의 단백질 농도를 보간했다.
MSD 검정에 의한 hIL-10 단백질의 정량화
상청액을 1000 x g에서 10분 동안 원심분리한 다음 적절하게 희석했다. 검정을 위한 모든 시약은 사용 전에 실온과 평형을 이루게 하였다. 검정을 위한 표준은 희석제 2에 hIL-10을 지정된 농도로 재구성하여 제조하고 실온에서 15분 동안 배양한 다음 희석제 2로 4배 연속 희석하여 표준 곡선의 7회 용량을 제조했다. MSD 플레이트의 2개 컬럼에 50μL의 표준을 이중으로 첨가한다. 나머지 웰에 25μL의 희석제 2 및 25μL의 샘플을 첨가한다. 플레이트를 덮고 300rpm에서 2시간 동안 진탕하면서 실온에서 배양한다. 플레이트를 세척한 다음 희석된 검출 항체 25μL을 첨가한다. 실온에서 300rpm에서 2시간 동안 진탕하면서 배양한다. 플레이트를 세척한 다음 150μL 2X 판독 완충제(Read Buffer) T를 첨가한다. 바코드를 사용하는 메조스케일을 사용하여 판독한다(VPLEX 단일 지점이 자동으로 할당된다). 표준물질의 흡광도를 표준 농도에 대해 플롯팅하고 4개 매개변수 알고리즘이 있는 프리즘 그래프패드(Prism GraphPad) 소프트웨어를 사용하여 샘플의 hIL-10 양을 보간했다. 일단 각 웰에서 hIL-10의 양이 결정되면 DCTM 단백질 검정에서 결정된 전체 단백질로 정규화되었다(즉, 전체 단백질 mg당 ng hIL-10). 용량 반응 곡선은 형질감염된 DNA의 양(ng)에 대한 전체 단백질 mg당 ng hIL-10을 플롯팅하여 그래프패드 프리즘 (GraphPad Prism)에서 준비했다. EC50 및 전체 단백질 mg당 hIL-10의 예상 최대량을 결정했다.
12.6 결과
모든 입자는 응집 없이 안정했다. PEG화 후 모든 샘플에 대해 제타 전위가 -3mV로 감소했다. 동결 해동 후 폴리플렉스는 동일한 특성을 나타냈다. 시험관내 형질감염 결과는 비-PEG화 샘플 및 PEG화된 샘플에 대해 유사했다(도 6).
Figure pct00050
13. 폴리스티렌 비드의 PEG화
참조: CMC-INT06-EXP-039 및 CMC-INT06-EXP-055
13.1 절차
오렌지색 폴리스티렌 비드의 PEG화
일반적으로: 1mL의 아민-변형된 폴리스티렌 비드를 자기 교반 막대가 있는 7mL 유리병으로 옮긴다. 5 uL의 1M HCl을 첨가한다. 1.5mL 에펜도르프 튜브에 70mg의 PEG NHS 및 8mg의 EDC-HCl을 1mL의 물에 투명한 용액이 될 때까지 용해시킨다. 이 용액 0.7mL를 폴리스티렌 현탁액에 천천히 첨가한다. 빛으로부터 보호하면서 밤새 실온에서 용액을 교반한다. PEG화된 오렌지색 입자를 하기에 기재된 바와 같이 정제하고 농축시켰다. 입자 크기 및 제타 전위 측정을 사용하여 PS 입자의 PEG화를 확인했다.
녹색 폴리스티렌 비드의 PEG화
일반적으로: 2mL의 녹색 아민-변형된 폴리스티렌 비드를 자기 교반 막대가 있는 7mL 유리병으로 옮긴다. 10uL의 1M HCl을 첨가한다. 1.5mL 에펜도르프 튜브에 100mg의 PEG-NHS 및 5mg의 EDC-HCl을 1mL의 물에 투명한 용액이 될 때까지 용해시킨다. 이 용액 0.9mL를 폴리스티렌 현탁액에 천천히 첨가한다. 빛으로부터 보호하면서 밤새 실온에서 용액을 교반한다. PEG화된 녹색 입자를 하기에 기재된 바와 같이 정제 및 농축시켰다. 입자 크기 및 제타 전위 측정을 사용하여 PS 입자의 PEG화를 확인했다.
파랑색 폴리스티렌 비드의 PEG화
일반적으로: 1mL의 파랑색 아민-변형된 폴리스티렌 비드를 자기 교반 막대가 있는 7mL 유리병으로 옮긴다. 물 2mL를 첨가한다. 1.5mL 에펜도르프 튜브에 270mg의 PEG-NHS 및 10.34mg의 EDC-HCl을 1mL의 물에 투명한 용액이 될 때까지 용해시킨다. 이 용액 0.9mL를 폴리스티렌 현탁액에 천천히 첨가한다. 빛으로부터 보호하면서 밤새 실온에서 용액을 교반한다. PEG화된 파랑색 입자를 하기에 기재된 바와 같이 정제 및 농축시켰다. 입자 크기 및 제타 전위 측정을 사용하여 PS 입자의 PEG화를 확인했다.
PEG화 폴리스티렌의 정제 및 농축
PEG화된 PS 입자를 다음과 같이 정제하고 농축하였다. 아미콘 울트라(Amicon Ultra) 필터에 반응 혼합물 300uL를 분취한다. 5000rpm에서 10분 동안 원심분리한다. 바닥에서 액체를 제거하고 필터 상단에 300uL의 물을 첨가한다(비드는 필터 상에 유지된다). 비드를 세척하기 위해 원심분리 및 세척을 4회 반복한다. 다른 필터의 비드를 단일 필터에 풀링한다. 300uL의 물을 첨가하고 다시 원심분리한다. 녹색 비드 및 오렌지색 비드를 약 1.5mL까지 물에 현탁시켰다.
390uL의 물에 10uL의 현탁액을 혼합하여 폴리스티렌 입자의 유체역학적 직경을 측정한다. 780uL의 10mM NaCl 중에 입자 현탁액 20uL을 혼합하여 폴리스티렌 입자의 제타 전위를 측정한다.
13.2 결과
반응이 끝날 때 제타 전위가 상당히 감소하면 PEG화가 발생했음을 입증하는 것이다.
Figure pct00051
14. RITC-DDX + DNA 폴리플렉스 및 PEG화된 RITC-DD-X + DNA 폴리플렉스의 제조
참조: 아래 제공
14.1 RITC-DD-X 시약
Figure pct00052
14.2 RITC-DD-X 장비
Figure pct00053
14.3 절차
RITC-표지된 DD-X
RITC는 탄수화물 중합체 72(2008) 616-624에서 파생된 방법을 기반으로 DD-X에 접합되었다. 간단히 말해서, DD-X 원액(로트 JAN03-009)을 물에 용해시켜 농도 40mM 및 pH 5.8을 달성했다. DD-X 용액을 동일한 부피의 DMSO와 혼합하고 실온에서 1시간 동안 교반한 다음, 질소 기체로 15분 동안 버블링하였다. 별도의 용기에서 RITC를 DMSO(목표 3.7mg/mL)에 용해시키고 DD-X/DMSO 혼합물(RITC/DMSO:DD-X/DMSO 1:8, v/v)에 적가했다. 생성된 혼합물을 빛이 차단된 실온에서 65시간 동안 교반하였다. RITC-표지된 DD-X를 물에 대한 투석으로 정제한 후 동결건조하였다. 미반응 RITC를 메탄올로 추출하고, 여과액이 무색이 될 때까지 메탄올로 부흐너 깔때기에서 세척하였다. 세척된 분말을 수집하고 실온에서 밤새 진공 건조하였다. 최종 수집된 분말은 외관상 분홍색이었다. DD-X에 대한 RITC의 접합은 H-NMR 분광법에 의해 확인되었다: RITC-DD-X를 D2O + DCl/D2O에 용해(8mg/mL)하여 pH 약 2.5에 도달했다.
RITC-DD-X + DNA 폴리플렉스
RITC-DD-X(상기 기재) 및 표지되지 않은 DD-X의 50/50 블렌드를 제조한 다음, 본원에 기재된 드립 방법 절차에 따라 GWiz-GFP 플라스미드 DNA를 사용하여 5% 트레할로스 중 N:P 20 폴리플렉스(0.1mg/mL DNA)를 제조하였다.
RITC-DD-X + DNA 폴리플렉스
RITC-DD-X(상기 기재됨) 및 표지되지 않은 DD-X의 33/67 블렌드를 제조한 다음, 본원에 기재된 인-라인 혼합 절차에 따라 pVax-opt-hIL10 플라스미드 DNA를 사용하여 5% 트레할로스 중 N:P 7 폴리플렉스(0.25mg/mL DNA)를 제조하였다.
PEG화 RITC-DD-X + DNA 폴리플렉스
N:P 7 폴리플렉스 분취량을 본원에 기재된 바와 같이 PEG-PGA를 사용하여 PEG화하였다. 생성된 PEG화된 폴리플렉스를 입자 크기, PDI 및 제타 전위에 대해 테스트했다. N:P 7 폴리플렉스 외에 생성된 제형이 생성되었다.
Figure pct00054
14.4 결과
입자 크기, PDI 및 제타 전위에 대한 결과
Figure pct00055
Figure pct00056
폴리플렉스 CMC-INT06-075 D, E 및 F가 응집되었다.
15. 유형 III 뮤신 내부의 상이한 PS 비드의 응집 평가 및 1 및 3μm 트랜스웰을 통한 확산 정량화
참조: CMC-INT06-EXP-042
15.1 뮤신 확산 물질
Figure pct00057
15.2 뮤신 확산 장비
Figure pct00058
15.3 철차
유형 III 뮤신 현탁액의 제조
유형 III 뮤신 현탁액은 유형 III 뮤신을 필요에 따라 5% w/w 내지 0.1% w/w의 목표 농도로 물에 분배하여 제조했다.
뮤신 테스트에서의 응집
테스트 샘플(RITC-표지된 폴리플렉스, 아민 변형된 PS 비드, 또는 PEG화된 PS 비드)을 다양한 농도에서 마이크로튜브에서 유형 III 뮤신 현탁액과 조합하여 테스트 샘플 및 뮤신의 최종 목표 농도를 달성했다. 샘플-뮤신 샘플을 빛으로부터 보호하고 실온에서 30rpm으로 혼합하였다. 30분과 60분에 혼합물을 이비디(Ibidi) u-슬라이드에 분취하고 EVOS 현미경으로 가시적인 응집을 관찰했다.
뮤신-로딩된 트랜스웰을 통한 확산 평가
샘플 제조.
테스트 샘플(RITC-표지된 폴리플렉스, 아민 변형된 PS 비드, 또는 PEG화된 PS 비드)을 마이크로튜브에서 유형 III 뮤신 현탁액과 조합하여 테스트 샘플의 최종 표적 농도 및 0.4%의 최종 뮤신 농도를 달성하였다. 샘플을 빛으로부터 보호하고 트랜스웰 인서트에 로딩하기 전에 1시간 동안 40rpm에서 혼합했다.
트랜스웰 제조 및 샘플 확산
트랜스웰 바닥을 0.6mL의 0.4% 유형 III 뮤신으로 채웠다. HTS 트랜스웰 인서트(1um 또는 3um PET 막과 함께)에 미리 혼합된 샘플 + 뮤신 0.1mL를 로딩했다. 대조군은 0.4% 뮤신만 없이 로딩되었다. 참조(100% 확산을 모방하기 위해)는 미리 혼합된 샘플 + 트랜스웰 인서트 없는 뮤신(0.7 mL)이었다. 37℃에서 20시간 배양한 후, 바닥 웰로의 테스트 샘플의 확산을 형광 플레이트 판독기(Envision)로 평가했다.
15.4 결과
뮤신 테스트에서의 응집
도 7에 나타낸 바와 같이, RITC-표지된 폴리플렉스 및 아민 변형된 PS 비드 둘 모두는 1시간 동안 배양 후 뮤신에서 응집을 나타냈다. PEG화된 PS 비드는 가시적인 응집을 나타내지 않았다.
뮤신-로딩된 트랜스웰을 통한 확산 평가
도 8에 나타낸 바와 같이, 0.4% 뮤신에서, PEG화된 PS 비드는 아민 변형된 PS 비드 및 RITC-표지된 폴리플렉스와 비교하여 3um 또는 1um PET 막을 통한 20시간 배양 후에 가장 높은 수준의 확산을 가졌다. 이것은 뮤신에서 PEG화된 PS 비드의 응집이 적기 때문이었다.
16. 트랜스웰 반복을 사용한 유형 III 뮤신을 통한 PEG화된 폴리플렉스 제형의 확산 및 플루로닉스(Pluronics) F127의 효과.
16.1 재료
Figure pct00059
Figure pct00060
16.2 장비
Figure pct00061
16.3 절차
4% 플루로닉스 F127 용액 제조
플루로닉스(Pluronics) F127을 물에 용해시켜 4% w/w를 달성하고 0.22um 여과하였다.
유형 III 뮤신 현탁액의 제조
유형 III 뮤신 현탁액을 본원에 기재된 바와 같이 제조하였다.
뮤신 테스트에서의 응집
테스트 샘플(PEG화된 RITC-DD-X + DNA 폴리플렉스, RITC-표지된 폴리플렉스, 아민 변형된 PS 비드, 또는 PEG화된 PS 비드)을 다양한 농도로 마이크로튜브에서 유형 III 뮤신 현탁액과 조합하여 테스트 샘플 및 뮤신의 최종 표적 농도를 달성하였다. 샘플-뮤신 샘플을 빛으로부터 보호하고 실온에서 30rpm으로 혼합하였다. 30분 및 60분에 혼합물을 이비디(Ibidi) u-슬라이드에 분취하고 EVOS 현미경으로 가시적인 응집을 관찰했다.
뮤신-로딩된 트랜스웰을 통한 확산 평가
샘플 제조.
테스트 샘플(PEG화된 RITC-DD-X + DNA 폴리플렉스, RITC-표지된 폴리플렉스)을 마이크로튜브에서 플루로닉스 F127 용액이 있거나 없이 유형 III 뮤신 현탁액과 조합하여 테스트 샘플의 최종 표적 농도 및 0.5%의 최종 뮤신 농도를 달성하였다. 대조군(아민 변형 PS 비드, PEG화 PS 비드)은 뮤신만을 조합하여 0.5%의 최종 뮤신 농도를 만들었다. 샘플을 빛으로부터 보호하고 트랜스웰 인서트에 로딩하기 전에 1시간 동안 40rpm에서 혼합했다.
트랜스웰 제조 및 샘플 확산
트랜스웰 바닥을 0.6mL의 0.5% 유형 III 뮤신으로 채웠다. 3um PET 막이 있는 HTS 트랜스웰 인서트에 미리 혼합된 샘플 + 뮤신 0.1mL를 로드했다. 참조(100% 확산을 모방하기 위해)는 미리 혼합된 샘플 + 트랜스웰 인서트가 없는 뮤신(0.7 mL)이었다. 37℃에서 20시간 배양한 후, 바닥 웰로의 테스트 샘플의 확산을 형광 플레이트 판독기(Envision)로 평가했다.
16.4 결과
PS 비드의 PEG화
아민 변형된 PS 비드의 PEG화는 뮤신 확산을 거의 10배 향상시켰다(도 9). 형광 현미경은 PEG화 PS 비드가 뮤신에서 응집되지 않은 반면, 비-PEG화 PS 비드가 동일한 조건에서 심하게 응집됨을 보여주었다.
뮤신에서 PEG화 폴리플렉스 확산
폴리플렉스(N:P 7)의 PEG화는 32%에서 50 - 52%로 뮤신 확산을 증가시키며, 이는 비-PEG화 폴리플렉스에 비해 확산이 약 60% 개선된 것이다(도 9). 테스트된 N:P:A 비율은 뮤신 확산에 대해 유사하게 수행되었다. 형광 현미경은 PEG화된 폴리플렉스 및 비-PEG화 폴리플렉스 사이에 유의한 형태학적 차이를 나타내지 않았다.
뮤신 확산에 대한 플루로닉스 F127의 효과
플루로닉스 F127의 존재는 비-PEG화 폴리플렉스 및 PEG화된 폴리플렉스의 뮤신 확산을 개선했다(10-15%)(도 10).
17.다양한 NPA 비율로 2.5 또는 5% 트레할로스에서 c125에서 제조된 PEG화된 폴리플렉스의 동결-건조
참조: CMC-INT06-EXP-103
17.1 동결건조 물질
Figure pct00062
17.2 동결건조 장비
Figure pct00063
17.3 절차
DD-X-DNA(pVax-PD-L1-Fc) 폴리플렉스는 이전에 기술된 바와 같이 7:1의 N:P 비율에서 5% 트레할로스 중에서 0.25mg/mL DNA의 DNA 농도에서 생성되었다. 이어서, 폴리플렉스의 분취량을 이전에 기재된 바와 같이 PEG화(mPEG5K-b-PLE10)하였다. N:P 7 폴리플렉스 외에 생성된 제형이 생성되어 2mL 유리 바이알에 채워졌다(1mL 및 0.1mL 충전 부피가 테스트되었다).
Figure pct00064
샘플은 다음 제어된 동결 건조 사이클을 사용하여 동결건조되었다:
동결: +20에서 -40℃까지(1℃/분에서), 그 다음 -40℃에서 120분.
1차 건조: -32℃ 및 63mTorr에서 3800분
2차 건조: P = 63mTorr, 선반 T -32 에서 30℃까지(0.2℃/분), 그 다음 30℃에서 360분.
2차 건조의 마지막에, 바이알을 질소 기체로 퍼징하고, 마개를 막고, 실온으로 평형화되도록 하였다. 단기 안정성은 실온(주위 습도), 실온 건조기 내, 4℃에서 수행하였다. 선택한 시점에서 1mL 샘플을 물로 재수화하고 분석 전에 15분 동안 배양했다. 본원에 기재된 바와 같이 입자 크기, PDI, 제타 전위 및 유리 DNA에 대해 샘플을 분석하였다.
17.4 결과
동결 건조 케이크는 붕괴 또는 균열의 징후가 없었다. 0.1 mL 샘플은 케이크를 형성하기에 불충분한 부피로 인해 고리 모양이었다. 재수화된 샘플에서는 유리 DNA가 관찰되지 않았다.
도 13은 실온 및 4℃에서 4주까지 동결 건조된 PEG화 폴리플렉스의 안정성을 보여준다. 샘플은 동결전 건조 부피로 재수화하였다.
18. 동결-해동에 의한 인-라인 혼합된 PEG-PP을 위한 잠재적 동결-건조 부형제의 선별
18.1 부형제 선별 물질
Figure pct00065
18.2 절차
만니톨 용액의 제조
일반적으로, 만니톨을 0.125g/mL의 농도로 물에 용해시켰다. 생성된 용액을 0.2um 필터를 사용하여 여과하였다. 필요한 경우, 만니톨 용액을 후속 제형에 필요한 농도로 희석하였다.
콜리돈(Kollidon) 12(PVP 2) 용액의 제조
일반적으로, PVP 2를 0.05g/mL의 농도로 물에 용해시켰다. 생성된 용액을 0.2um 필터를 사용하여 여과하였다. 필요한 경우, PVP 2 용액을 후속 제형에 필요한 농도로 희석하였다.
PEG 4kDa 용액의 제조
일반적으로, PEG 4kDa를 0.05g/mL의 농도로 물에 용해시켰다. 생성된 용액을 0.2um 필터를 사용하여 여과하였다. 필요한 경우, PEG 4kDa 용액을 후속 제형에 필요한 농도로 희석하였다.
제형의 제조
DD-X-DNA(pVax-PD-L1-Fc) 폴리플렉스는 이전에 기술된 바와 같이 7:1의 N:P 비율로 0.25mg/mL DNA의 DNA 농도에서 다른 부형제 없이 생성되었다. 이어서, 폴리플렉스의 분취량을 본원에 기재된 바와 같이 PEG화(mPEG5K-b-PLE10)하였다.
Figure pct00066
비-PEG화 폴리플렉스(CMC-INT06-112A) 또는 PEG화된 폴리플렉스(CMC-INT06-112B)의 분취량을 다양한 농도에서 물 또는 다른 부형제와 혼합하여 하기에 기술된 최종 표적 부형제 농도 및 0.1mg/mL의 농도의 최종 DNA를 달성했다.
Figure pct00067
생성된 제형을 분취하고 다음 중 하나를 수행하였다: 냉동 바이알에 충전하고 -80℃에서 냉동; 또는 본원에 기재된 바와 같이 동결건조하였다. 해동된 샘플을 본원에 기재된 바와 같이 입자 크기, PDI, 제타 전위, pH, % 슈퍼코일 DNA 및 유리 DNA에 대해 분석하였다. 동결건조된 샘플에는 아래 제공된 별도의 샘플 ID가 할당되었다.
Figure pct00068
동결건조된 샘플을 건조 전에 초기 농도로 물로 재수화시키고, 본원에 기재된 바와 같이 입자 크기, PDI, 제타 전위, pH, % 슈퍼코일 DNA 및 유리 DNA에 대해 분석하였다.
18.3 결과
비-PEG화 폴리플렉스, (CMC-INT06-112 A1)만이 물 중에서 동결-해동 후에 심하게 응집되었다. 결과적으로 이 샘플에 대해 더 이상의 테스트를 수행하지 않았다.
물 또는 테스트된 임의의 부형제 또는 농도 중에서 PEG화된 폴리플렉스 제형은 반투명했고 다른 물리화학적 특성은 동결-해동 전과 변함이 없었다.
Figure pct00069
Figure pct00070
동결건조 케이크의 외관.
비-PEG화 폴리플렉스의 동결건조된 케이크, (CMC-INT06-116 A1)만이 물 중에서 외관이 일관되지 않고 붕괴되었다. 물 또는 시험된 임의의 부형제 또는 농도에서 PEG화된 폴리플렉스 제형, (CMC-INT06-116 B1 내지 CMC-INT06-116 B11)의 동결건조된 케이크는 균일하고 미세한 수축과 함께 균열이 없었다.
동결건조된 샘플의 재수화 후 물리화학적 특성
비-PEG화 폴리플렉스, (CMC-INT06-116 A1)만이 물 중에서 재수화 후에 심하게 응집되었다. 결과적으로 이 샘플에 대해 더 이상의 테스트를 수행하지 않았다. 물 또는 테스트된 임의의 부형제 또는 농도에서 PEG화된 폴리플렉스 제형은 반투명했고 다른 물리화학적 특성은 동결건조 전과 변함이 없었다.
Figure pct00071
Figure pct00072
18.4 결론
N:P:A 비율 = 7:1:17.5에서 PGA(1.3k)-PEG(5k)를 사용하는 PEG화된 폴리플렉스는 부형제의 부재 하에 동결-해동 또는 동결건조 후 폴리플렉스 응집을 방지하였다. 트레할로스, 만니톨, PEG 4kDa 또는 PVP 2kDa는 동결-해동 또는 동결건조 시 PEG화된 폴리플렉스 응집을 방지하기 위해 필요하지 않으며 테스트 농도에서 응집을 일으키지 않는다.
19. 농축되고 5% 트레할로스 중에서 희석된 PEG화된 폴리플렉스의 동결건조
참조: CMC-INT06-EXP-110 및 CMC-INT06-128
19.1 절차
DD-X-DNA(pVax-PD-L1-Fc) 폴리플렉스는 이전에 기술된 바와 같이 7:1의 N:P 비율에서 5% 트레할로스가 있거나 없이 0.25mg/mL DNA의 DNA 농도로 생성되었다. 그런 다음 폴리플렉스의 분취량을 PEG화(mPEG5K-b-PLE10)한 다음 이전에 설명한 대로 TFF 공정을 사용하여 농축했다. N:P 7 폴리플렉스 외에 생성된 제형이 생성되어 2 또는 10mL 유리 바이알에 채워졌다(0.3mL, 1mL 및 2mL 충전 부피가 테스트되었다).
Figure pct00073
샘플은 하기의 제어된 동결 건조 사이클을 사용하여 동결건조되었다:
동결: +20에서 -40℃(1℃/분에서)까지, 그 다음 -40℃에서 120분.
1차 건조: -32℃ 및 63mTorr에서 3800분
2차 건조: P = 63 mTorr, 선반 T -30에서 30℃(0.2℃/분)까지 , 그 다음 30℃에서 6시간.
2차 건조가 끝나면, 바이알을 질소 가스로 퍼징하고 마개를 막고 실온으로 평형을 이루게 하였다. 샘플을 물로 재수화하여 다양한 배수 농도(1배 또는 10배)를 달성했다. 샘플을 본원에 기재된 바와 같이 입자 크기, PDI에 대해 분석하였다.
19.2 결과
동결-건조된 샘플은 1mL 충전 부피에서 확고한 외관, 가벼운 수축 및 균열을 갖는 케이크를 가졌다. 1mg/mL 및 10mg/mL로 재수화된 동결-건조된 샘플은 외관이 반투명했으며 가시적인 응집물이 없었다. 25mg/mL로 재수화된 동결-건조된 샘플은 현탁액을 형성하기에 불충분한 물의 부피로 인해 점성 겔을 형성했다(도 12). 50mg/mL로 재수화된 동결-건조된 샘플은 현탁액을 형성하기에 불충분한 물의 부피로 인해 페이스트를 형성했다.
10mg/mL 및 25mg/mL로 재수화된 동결-건조된 샘플을 나노입자 크기, PDI 및 제타 전위에 대해 테스트했으며, 4℃에서 적어도 48시간 동안 어느 조건에서도 명백한 응집이 없었다(도 12 ).
20. 4.5% 수크로스 또는 물에서 제조된 PEG-PP(다양한 NPA 비율)의 동결-건조
참조: CMC-INT06-129
20.1 절차
DD-X-DNA(pVax-PD-L1-Fc) 폴리플렉스는 이전에 기재된 바와 같이 7:1의 N:P 비율에서 0.125mg/mL DNA의 DNA 농도에서 다른 부형제 없이 생성되었다. 이어서, 폴리플렉스의 분취량을 본원에 기재된 바와 같이 PEG화(mPEG5K-b-PLE10)하였다. 추가 테스트 샘플 CMC-INT06-124 A 및 CMC-INT06-124 B는 이미 본원에 설명되어 있다.
Figure pct00074
생성된 제형을 2mL 유리 바이알에 채우고(0.3mL 및 1mL 충전 부피를 테스트되었다) 하기 제어된 동결 건조 사이클을 사용하여 동결건조시켰다:
동결: 20에서 -40℃(1℃/분에서)까지, 그 다음 -40℃에서 120분.
1차 건조: -35℃ 및 63mTorr에서 3660분
2차 건조: P = 63mTorr, 선반 T -35에서 30℃(0.2℃/분)까지 , 그 다음 30℃에서 360분.
2차 건조가 끝나면 바이알을 질소 가스로 퍼징하고 마개를 닫고 실온으로 평형화되도록 하였고 사용할 때까지 4℃에서 보관했다.
부형제가 없는 샘플(CMC-INT06-129 A, CMC-INT06-129 B, CMC-INT06-129 C)에 대해 4℃에서 단기 안정성을 수행했다. 4.5% 수크로스 샘플(CMC-INT06-129 D 및 CMC-INT06-129 E)을 시간 0에서 테스트했다. 선택한 시점에서 샘플을 물로 재수화하여 동결건조 전의 농도를 얻었다. 재수화된 샘플을 본원에 기재된 바와 같이 입자 크기, PDI 및 제타 전위에 대해 분석하였다.
20.2 결과
모든 제형은 성공적으로 동결건조되었다. 동결보호제가 없는 제형은 수축/방사상 수축을 나타냈다; 낮은 NPA 비율(즉, NPA = 7:1:7)과 낮은 충전 부피(0.3mL)를 가진 제품은 정전기(케이크가 위로 옆으로 움직이거나, 부서지는 등)에 더 취약했다. 4.5% 수크로스를 함유한 제형은 제한된 수축만 보였고 표면이 광택이 있었다.
동결건조된 샘플에 대한 설명
Figure pct00075
시간 0에서 재수화된 샘플의 외관, 입자 크기, PDI 및 제타 전위.
Figure pct00076
부형제가 없는 상태에서 4℃에서 최대 4주 동안 동결건조된 샘플의 안정성(재수화된 샘플의 입자 크기, PDI 및 제타 전위)이 도 14에 제시되어 있다. 결과는 입자 크기 및 제타 전위에 변화가 없음을 보여주었고 PDI의 증가가 제한적이거나 전혀 없었다.
아래 표는 현재 발견에 대한 요약을 제공한다:
Figure pct00077
실시예 2:
달리 기술되지 않는 한, 일반적인 방법, 조성물 및 절차는 실시예 1에서 상기에 기술된 바와 같다.
PEG는 폴리글루타메이트 꼬리를 포함하고 폴리플렉스는 7:1:7(중간 PEG화) 또는 7:1:17.5(높은 PEG화)의 NPA 비율을 포함하는, 가역적으로 PEG화된 이중 유도체화된 키토산 폴리플렉스(DDX) 80μL를 마우스 방광에 250μg/mL로 투여했다. 대조군으로 7:1의 NP 비율로 비-PEG화 폴리플렉스 80μL를 마우스 방광에 투여하였다. 투여된 제형를 방광에서 1시간 동안 배양한 후 분석을 위해 방광의 내용물을 수집하였다. 도 15에 도시된 바와 같이, 방광에서의 배양은 비-PEG화 폴리플렉스의 심각한 응집을 야기하였다. 대조적으로, 높은 및 중간 PEG화된 폴리플렉스 모두 방광에서 배양 후 검출가능한 응집을 나타내지 않았다.
실시예 3:
가역적으로 PEG화된 DDX 입자 및 비-PEG화 DDX 입자의 생체내 유전자 전달 효율을 비교하였다. NP7, NP15 및 NP20에서 비-PEG화 DDX 입자 및 NPA 7:1:3.5(낮은 PEG화) 및 NPA 7:1:17.5(높은 PEG화)에서 PEG화된 DDX를 테스트했다. 가역적으로 PEG화된 DDX 입자를 실시예 1 및 2에 기재된 바와 같이 PEG-폴리글루타메이트로 코팅하였다. 각각의 DDX 제형을 2가지 상이한 농도(125μg/mL 및 1,000μg/mL)에서 테스트하였다. 제형은 결장내 점적(ICI)에 의해 3 150μL 용량으로 주입되었다. 24시간 후, 결장 샘플을 수집하고 이식유전자 mRNA 발현에 대해 분석하였다. 도 16에 도시된 바와 같이, PEG화된 DDX 입자는 복제수 발현의 증가(>10x)에 의해 검출되는 바와 같이 현저하게 향상된 유전자 전달을 달성하였다. 검출가능한 유전자 발현을 갖는 % 샘플 또한 PEG화된 DDX 제형에서 상당히 향상되었다.
mRNA 발현 이외에도, 이식유전자 코딩 단백질 발현의 발현도 또한 평가되었다. NP15(2군) 및 NP20(3군)에서 비-PEG화 DDX 입자 및 NPA 7:1:3.5(7군) 및 NPA 7:1:17.5(5군 및 6군)에서 PEG화 DDX 입자가 테스트되었다. 가역적으로 PEG화된 DDX 입자를 실시예 1 및 2에 기재된 바와 같이 PEG-폴리글루타메이트로 코팅하였다. 각각의 DDX 제형을 125μg/mL에서 테스트하였다. 제형은 결장내 점적(ICI)에 의해 3 150μL 용량으로 주입되었다. 24시간 후, 세포 샘플을 수집하고 메조스케일 발견 면역검정(Mesoscale Discovery Immunoassay)을 사용하여 이식유전자 단백질 발현에 대해 분석했다. 도 17에 도시된 바와 같이, 비-PEG화 DDX 입자에 비해 PEG화된 DDX 입자로 처리된 마우스 결장에서 이식유전자 코딩 단백질 발현이 상당히 증가하였다.
각각 1000μg/mL로 제형화된 7:1의 NP 비율을 갖는 비-PEG화 DDX 입자 및 7:1:17.5의 NPA 비율을 갖는 PEG화된 DDX 입자로 단백질 발현 실험을 반복하였다. 제형은 3 x 150μL ICI 절차를 사용하여 투여되었다; 결장 절편을 투여 후 24시간에 수확하고 단백질 용해물을 사용하여 메조스케일 발견 면역검정을 사용하여 인간 PD-L1-Fc 단백질을 정량화했다. 도 18에 도시된 바와 같이, 비-PEG화 DDX 입자에 비해 PEG화된 DDX 입자로 처리된 마우스 결장에서 이식유전자 코딩 단백질 발현이 상당히 증가하였다.
실시예 4:
PEG화된 DDX 나노입자는 상기 실시예에 개괄된 일반적인 방법을 사용하여 제조되었으며 물리화학적 매개변수가 검정되었다. 25% 양이온(아르기닌(R)) 최종 작용화도 및 10% 폴리올(글루코스(G)) 최종 작용화도를 갖는 이중 유도체화된 폴리플렉스는 NP20:1(비-PEG화) 및 NPA10:1:5(PEG화) 비율로 제조되었다. 동결보호제(5% 트레할로스 또는 1% 만노스)는 각각의 비-PEG화 및 PEG화 폴리플렉스에 대해 제공된 향상된 동결보호를 기반으로 선택되었다. 제형을 냉동 또는 동결건조한 다음 해당되는 해동 또는 재수화했다. 샘플을 % 슈퍼코일 DNA, 외관, 입자 크기, PDI, 제타 전위 및 pH에 대해 테스트했다.
도 19에 도시된 바와 같이, 비-PEG 동결건조에 대한 t=0에서, % 슈퍼코일 DNA는 대응하는 PEG화된 제형보다 상당히 더 낮았다. % 슈퍼코일 DNA는 핵산 전달 물질의 품질을 나타내며, 바람직하게는 >80%, 더욱 바람직하게는 >90%이어야 한다.
폴리플렉스는 10:1:5의 NPA(PEG화) 비율로 제조되었다. 이러한 폴리플렉스의 경우, 양이온/폴리올 최종 작용화도는 28%R 및 10%G이고 DNA 농도는 125μg/mL이었다. 동결보호제는 1% 만니톨이었다. 제형을 동결건조하고 최대 12주 동안 4℃ 및 실온에서 보관했다. t=0(초기), 2주, 4주, 8주 및 12주에서 샘플을 원래의 DNA 농도로 재수화하고, % 슈퍼코일 DNA, 입자 크기 및 PDI에 대해 테스트했다. 도 20에 도시된 바와 같이, 동결건조된 PEG화된 DDX 제형은 4℃ 또는 실온(RT)에서 저장될 때 최대 12주 동안 안정하였다.
폴리플렉스는 10:1:5의 NPA(PEG화된) 비율 및 20:1의 NP(비-PEG화된) 비율로 제조되었다. 이러한 폴리플렉스의 경우, 양이온/폴리올 최종 작용화도는 28% R 및 10% G이고 DNA 농도는 1000μg/mL이었다. 동결보호제(5% 트레할로스 또는 1% 만니톨)는 각각의 비-PEG화 및 PEG화 폴리플렉스에 대해 제공된 향상된 동결보호를 기반으로 선택되었다. 제형을 동결건조한 다음 표시된 표적 DNA 농도로 재수화했다(c1000 = 1mg/mL, c2000 = 2mg/mL, c5000 = 5mg/mL, c10,000 = 10mg/mL). 입자 크기 및 PDI에 대해 샘플을 테스트했다. 도 21에 도시된 바와 같이, 동결건조된 PEG화 제형은 10mg/mL까지의 농도에서 안정적으로 재수화되었고, 반면에 비-PEG화 제형은 2mg/mL까지 안정적으로 재수화될 수 있었다. 2mg/mL의 재수화 농도는 유용한 유전자 전달 제형을 제공했지만, PEG화된 제형의 달성가능하게 안정적인 DNA 농도(10mg/mL)의 예상치 못한 상당한 증가는 치료적 또는 임상적 관련 효과를 달성하기 위한 필요한 용량 부피의 면에서 상당한 이점을 제공한다.
폴리플렉스는 10:1:5의 NPA(PEG화된) 비율 및 10:1의 NP(비-PEG화된) 비율로 제조되었다. 이들 폴리플렉스의 경우, 양이온/폴리올 최종 작용화도는 28% R 및 10% G였다. 1% 만니톨(PEG화 폴리플렉스) 또는 5% 트레할로스(비-PEG화 폴리플렉스)를 함유하는 제형을 125μg/mL DNA 농도로 마우스 방광에 투여하고, 1시간 동안 배양하고 분석을 위해 방광의 내용물을 수집했다. 동적 광산란에 의한 시각적 외관 및 나노입자 크기에 대해 샘플을 조사했다. 도 22에 도시된 바와 같이, PEG화 폴리플렉스는 검출가능한 응집을 나타내지 않은 반면, 비-PEG화 폴리플렉스는 크기 및 다분산 지수(PDI)의 증가에 의해 좌측 및 수집된 소변 샘플의 이미지에서 백색 응괴의 출현에 의해 우측에 도시된 바와 같이 심각한 응집을 나타내었다.
폴리플렉스는 10:1:5의 NPA(PEG화된) 비율 및 20:1의 NP(비-PEG화된) 비율로 제조되었다. 이들 폴리플렉스의 경우, 양이온/폴리올 최종 작용화도는 28% R 및 10% G였다. 1% 만니톨(PEG화 폴리플렉스) 또는 5% 트레할로스(비-PEG화 폴리플렉스)를 함유하는 제형을 멸균 여과 적합성에 대해 검정하였다. 0.5mL의 비-PEG화(NPA 20:1) 및 PEG화된(NPA 10:1:5) DDX 폴리플렉스 제형을 1mg DNA/mL에서 서로 다른 막 유형으로 구성된 0.2μm 기공 필터(13mm 직경, 1cm2 표면적)를 통해 여과하였다: PES(폴리에테르설폰), PVDF(폴리비닐리덴 디플루오라이드), PTFE(폴리테트라플루오로에틸렌) 및 나일론. 나노입자 크기, 제타 전위, 전도도, pH, 양이온(아르기닌) 및 폴리올(글루코스) 함량 및 DNA 함량에 대해 샘플을 테스트했다. 도 23에 예시된 바와 같이, DNA 농도는 PEG화된 폴리플렉스 제형(<10%)과 비교하여 비-PEG화폴리플렉스 제형의 여과 후 상당히 더 큰 감소(15-32%)를 나타내었다. 이러한 결과는 비-PEG화 폴리플렉스가 검정 조건에서 응집됨을 시사한다.
도 23에 도시된 결과를 확인하기 위해, PEG화 및 비-PEG화 DDX 키토산-DNA 폴리플렉스의 생산을 확대하고 제형을 더 큰 부피에서 여과성에 대해 테스트하였다. 이들 폴리플렉스의 경우, 양이온/폴리올 최종 작용화도는 28% R 및 10% G였다. 1% 만니톨(PEG화 폴리플렉스) 또는 5% 트레할로스(비-PEG화 폴리플렉스)를 함유하는 제형을 멸균 여과 적합성에 대해 검정하였다. 1mg DNA/mL의 DNA 농도에서 비-PEG화(NPA 20:1:0) 및 PEG화(NPA 10:1:5) DDX DNA 폴리플렉스 제형 5-15mL를 0.8/0.2μm 기공 PES 필터 스택(직경 25mm, 표면적 2.8cm2, 각 필터)을 통해 여과했다. 여과는 30psig에서 일정한 압력 Vmax 여과 설정을 통해 이루어졌다(도 24에 도시된 개략도). 여과성은 표면적 당 수집된 여과액 질량으로 결정되었다. 여과 전 및 후 샘플을 나노입자 크기, 제타 전위, 전도도, pH, 양이온/폴리올 함량 및 DNA 함량에 대해 테스트했다.
도 24에 도시된 바와 같이, DNA 농도는 PEG화된 폴리플렉스 제형(<10%)과 비교하여 비-PEG화된 폴리플렉스 제형의 여과 후 상당히 더 큰 감소(19%)를 나타내었다. 또한, 비-PEG화 폴리플렉스 제형은 1.375g의 폴리플렉스/cm2 막 표면적의 최대 농도로 공급될 때 여과 장치를 막았다. 대조적으로, PEG화된 폴리플렉스는 최대 5.35g의 폴리플렉스/cm2 표면적까지 테스트된 모든 폴리플렉스 농도에서 필터를 막지 않았으며, 이는 5.35g/cm2 초과의 PEG화된 폴리플렉스 제형이 여과가능한 상태로 남아 있음을 시사한다.
폴리플렉스는 도 25에 표시된 NPA(PEG화) 또는 NP(비-PEG화) 비율 및 0.125 mg/mL(c125)의 DNA 농도로 제조되었다. 양이온/폴리올 수 비율은 25% R 및 10% G였다. 동결보호제는 1% 만니톨(1% Man)이었다. 제형은 동결-해동(FT) 또는 동결건조 및 재수화(FD)하였다. 샘플을 % 슈퍼코일 DNA, 나노입자 크기 및 제타 전위에 대해 테스트했다. 도 25에 도시된 바와 같이, 비-PEG화 DDX 제형은 동결/해동 및 동결건조/재수화 후에 침전되었다. % 슈퍼코일 DNA는 침전된 샘플에서 측정할 수 없었다. 대조적으로, PEG화된 DDX 제형(NPA 10:1:5 및 10:1:2.5)은 동결/해동 후 응집되지 않은 반면, 10:1:1 제형은 동결/해동 후 약간의 응집을 나타내었지만, 비-PEG화된 물질보다 현저히 적었다. 동결건조/재수화 후, 테스트된 PEG화된 모든 DDX 제형(NPA 10:1:5 ~ 10:1:1)에서 검출가능한 응집을 나타내지 않았다.
PEG화된 DDX 폴리플렉스를 제조하고 직접 점적에 의해 개 소장에 전달하였다. 도 26에 도시된 바와 같이, mRNA 복제수는 개에서 전달 후 24시간에 검출되어서 유전자 전달을 입증하였다.
PEG화된 폴리플렉스를 다양한 비율의 아세테이트 완충제와 혼합하여 낮은 pH 환경을 모의실험하여 생성된 용액의 pH를 결정하였다. 입자의 제타 전위도 모니터링되었다. 중합체 코트의 음이온 앵커 영역의 pKa(~4.25) 아래로 pH가 낮아짐에 따라 제타 전위가 극적으로 증가하여 중합체 코트의 방출을 나타내었다(도 27 참조).
실시예 5:
이중 유도체화된 키토산(Arg:글루콘산)을 함유하는 가역적으로 PEG화된 폴리플렉스를 X가 3.5, 9 또는 14.5인 7:1:X의 N:P:A 비율로 제조했으며, 여기서 폴리글루타메이트 앵커 영역은 크기가 서로 달랐다. PLE5는 PEG-폴리글루타메이트(PEG-PLE) 중합체를 포함하는 폴리플렉스를 지칭하며, 여기서 폴리글루타메이트 앵커 영역은 길이가 5개의 글루타메이트 아미노산이다. PLE10은 10개의 글루타메이트 아미노산 길이를 지칭하고, PLE25는 25개의 글루타메이트 아미노산 길이를 지칭한다. 생성된 PEG화된 폴리플렉스의 물리화학적 매개변수는 아래 표에 제시되어 있다.
Figure pct00078
생성된 PEG화된 폴리플렉스를 입자 크기에 대해 검정하였고, 제조된 폴리플렉스 중에서 크기의 상당한 변화가 확인되지 않았다(도 28). 폴리플렉스를 물에 분산시키고 pH를 측정했는데, 이는 PLE 길이가 더 길고 N:A 비율이 감소하는 것이 모두 수성 분산액의 더 높은 pH에 기여함을 나타내었다(도 29). 유사하게, 제타 전위 측정은 더 긴 길이의 PLE 앵커 영역 및 감소하는 N:A 비율 모두가 제타 전위를 감소시키는 것으로 나타났다(도 30(왼쪽)). 더욱이, 본 발명자들은 N:P:A가 7:1:X, X=9에서 7:1:X, X=14.5로 조정됨에 따라 PLE25 폴리플렉스에 대한 제타 전위가 감소하는 이러한 경향의 평준화를 관찰했으며, 이는 최대 PEG화는 더 적은 양의 중합체에서 달성됨을 나타낸다(도 30(오른쪽)).
PAA가 다양한 농도에서 PEG화된 폴리플렉스를 함유하는 수성 완충액에서 혼합된 PEG화된 폴리플렉스를 폴리아스파르트산(PAA) 경쟁 검정에서 검정하였고 핵산 접근성이 관찰된다. 핵산 접근성은 피코그린 검정으로 측정된다. 접근가능한 핵산은 피코그린에 결합하고 결합으로 인한 형광 신호의 증가가 검출된다. 완전히 방출 및/또는 완전히 접근가능한 핵산은 최대 형광 신호를 제공한다. 최대 신호의 절반을 달성하는 데 필요한 PAA 농도에 대한 EC50은 테스트된 폴리플렉스의 안정성 척도인 PAA 접촉에 의해 입자 구성이 얼마나 쉽게 붕괴되는지를 나타낸다. 결과는 PLE25 PEG화된 폴플렉스가 다른 폴리플렉스보다 다소 덜 안정함을 나타낸다(도 31-32).
PEG화된 폴리플렉스를 c125(125μg/mL DNA) 반응 혼합물로 제조한 다음 FaSSIF-V2와 1:2 부피비(과량 FaSSIF)로 혼합하였다. FaSSIF-V2와 혼합한 후 DLS 측정을 37℃에서 시간 0(t0) 및 30분(t=30)에서 수행하여 입자 크기 및 다분산도를 측정하고(도 33) 샘플을 제타 전위 및 pH에 대해 검정하였다(도 34). 테스트된 조건에서 폴리플렉스는 더 긴 다중음이온 사슬 길이(예: PLE25가 가장 안정하고 PLE5가 가장 덜 안정함) 및 키토산의 더 높은 아미노 작용화(예: N:P:A 14.5 가장 안정하고 N:P:A 3.5 가장 덜 안정함)에서 더 안정적이었다.
실시예 6:
PEG화된 폴리플렉스에 대한 다중음이온 종 및 분자량(MW)의 효과를 조사하였다. PLE(폴리글루타메이트), PLD(폴리아스파르트산, 즉 PAA) 및 HA(히알루론산)에 대해 연구했다. 4.51%의 트레할로스 용액을 저장안정화제로 사용하였다. PEG 다중음이온 작업 용액을 제조했다.
PEG-HA 25는 트레할로스 희석제에 용해되지 않고 겔-유사 종으로 되었다. 100배 희석해도 겔이 용해되지 않았다. PEG-HA 25는 추가 분석에서 제외되었다. 생성된 c250 용액을 볼텍싱하면서 c250 용액에 PEG 다중음이온 용액을 적가함으로써 1:1 v/v 비율로 PEG 다중음이온과 혼합하였다. PEG 다중음이온을 첨가한 후, 10초 동안 볼텍싱을 계속하였다. 다음의 PEG화된 폴리플렉스가 생성되었다.
Figure pct00079
상기 조성물을 추가 분석 전에 주위 온도에서 1시간 동안 배양하였다.
별도로, 이중 유도체화된 키토산 핵산 폴리플렉스의 용액을 4.51% 트레할로스 용액 중에서 1000μg/mL 핵산 농도(c1000)에서 125μg/mL(c125) 핵산 농도로 희석하였다. 동결 해동(F/T) 후 모든 샘플은 외관, pH, 크기, 제타 전위 및 유리 DNA 함량에 대해 테스트되었다. 그 결과를 하기 표 및 도 35-36에 나타내었다.
Figure pct00080
Figure pct00081
Figure pct00082
Figure pct00083
폴리플렉스 샘플을 아가로스 겔 전기영동으로 분석하여 복합체화되지 않은 핵산을 검출했다(도 37). PEG-PLD50으로 PEG화된 7:1:30 N:P:A 폴리플렉스(도 37, 하단 행 6-8)를 제외한, 테스트된 모든 샘플은 검출가능한 복합체화되지 않은 핵산을 나타내지 않았다.
결과는 다음을 시사한다: PEG-PLE10, PEG-PLD10 및 PEG-PLD50은 PEG화를 위해 7:1 NP 비율에서 DDX 폴리플렉스와 양립가능하다. F/T 후, 어떠한 c125 PEG화된 폴리플렉스 용액에서도 침전물이 관찰되지 않았다. PEG-PLE10 및 PEG-PLD10은 폴리플렉스와 혼합할 때 유사하게 작용한다. 폴리플렉스의 크기는 PEG화 후 140nm에서 160nm로 증가했다. 그리고 NPA 비율이 7:1:3.5, 7:1:5, 7:1:9, 7:1:15 및 7:1:30인 경우 크기는 160nm에서 정체되었다. 제타 전위는 PEG 다중음이온 비율이 증가함에 따라 감소하지만, 감소는 7:1:9 이상에서 느려졌으며, 이는 PEG화가 포화 상태에 도달했을 수 있음을 시사한다. PEG-PLD50의 경우, PEG화 후 최대 NPA 비율이 7:1:15인 경우 폴리플렉스 크기는 PEG화 전의 폴리플렉스(7:1:0)와 비슷하다. NPA 7:1:30에서, 폴리플렉스 크기는 PEG화 후 440nm로 증가했다. PEG-PLD50 PEG화 폴리플렉스의 제타 전위는 PEG-PLD50 비율이 증가함에 따라 감소한다. PEG-PLD50의 경우 유리 DNA가 7:1:30에 대해 관찰되었지만, 다른 제형에서는 유리 DNA가 보이지 않았으며, 이는 7:1:30 PEG-PLD50의 폴리플렉스에서 핵산이 느슨하게 감싸지고/지거나 PLD-50이 핵산에 대한 유도체화된 키토산의 결합을 붕괴함을 시사한다.
실시예 6:
비-공유 가역적 PEG화의 효과를 공유 PEG화와 비교하였다. 도 38에 도시된 바와 같이, 적정가능한 다중음이온 고정 영역을 갖는 비-공유 PEG화된 폴리플렉스 및 공유적으로 PEG화된 폴리플렉스는 둘 모두 다중음이온 앵커 영역의 음전하를 유지하는 pH 조건 하에서 중성에 가까운 제타 전위를 가질 것으로 예상된다. 낮은 pH(예: pH 2)에서 다중음이온 앵커 영역을 중성 또는 양전하까지 적정하면, 비-공유적으로 PEG화된 폴리플렉스의 제타 전위가 감지가능하게 증가해야 한다. 대조적으로, 공유-결합된 PEG는 방출될 수 없고 제타 전위가 많이 변하지 않아야 한다.
2개의 상이한 공유 PEG화 전략이 도 39에 도시된 바와 같이 연구되었다. 첫 째, PEG-PLE이 이중-유도체화(DDX) 키토산에 가교결합되어 가교결합된 PEG-키토산 공급원료를 형성하고 DNA가 첨가되어 폴리플렉스(키토산에 가교결합된 PEG)를 형성한다(도 39, 중간 행). 둘째, 가역적으로 PEG화된 폴리플렉스가 형성되었고 EDC/NHS를 첨가하여 PEG-PA 중합체를 폴리플렉스에 공유 가교결합시켰다(폴리플렉스에 가교결합된 PEG)(도 39, 하단). 공유적으로 PEG화된 폴리플렉스는 둘 모두 pH를 6에서 2로 조정한 후 제타 전위에서 최소한의 변화를 보여주었다. 대조적으로, 가역적으로 PEG화된 폴리플렉스의 제타 전위는 크게 증가했다. 폴리플렉스는 또한 유리 폴리아스파르트산(PAA)으로 채린지에 의해 안정성을 테스트했다. 폴리플렉스에서 핵산은 가역적으로 PEG화된 폴리플렉스 및 PEG 가교된 키토산 폴리플렉스로부터 PAA 챌린지에 의해 방출되었다. 대조적으로, 폴리플렉스 형성 후 가교결합은 테스트된 조건 하에서 PAA 챌린지 후에 핵산을 방출하지 않는 폴리플렉스를 제공하였다.
X가 9, 3 또는 1인 N:P:A 7:1:X에서 가역적으로 PEG화된 폴리플렉스에 대해 형질감염 효율을 검정하고, 비-PEG화 폴리플렉스(7:1:0)와 비교했다. 결과는 가역적 PEG화에 의해 형질감염 효율이 감소되지 않았다는 것을 나타내었다(도 40).
가역적으로 PEG화된 폴리플렉스 및 공유적으로 PEG화된 폴리플렉스의 형질감염 효율을 비교하였다. 도 41에 도시된 바와 같이, 가역적으로 PEG화된 폴리플렉스는 높은 형질감염 효율을 유지한 반면, 공유 PEG화된 폴리플렉스의 두 유형 모두 불량한 형질감염 효율을 나타내었다.
실시예 7:
핵산, 키토산, 및 PEG-다중음이온 중합체의 1단계 혼합(1-단계)에 의해 형성된 가역적으로 PEG화된 폴리플렉스의 형질감염 효율을 미리형성된 키토산 DNA 폴리플렉스와 PEG-다음이온 중합체를 혼합함으로써 형성된(2-단계) 가역적으로 PEG화된 폴리플렉스와 비교하였다. mRNA 발현은 1-단계 또는 2-단계 PEG화 폴리플렉스의 결장내 전달 후 24시간에 결장 조직에서 검출되었다. mRNA와 단백질은 1-단계 또는 2-단계 PEG화 폴리플렉스의 방광내 전달 후 24시간에 방광 조직에서 검출되었다. 도 42-43에 도시된 결과는 1-단계 폴리플렉스 및 2-단계 폴리플렉스 모두 테스트된 조건에서 유사한 형질감염 효율을 보임을 나타낸다. 이론에 얽매이지 않고, 일반적으로 크기가 더 작은 1-단계 폴리플렉스는 매우 점성인 점막에서 더 우수한 확산 특성을 나타낼 수 있다고 가정된다.
* * * *
등가물
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 마치 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 참고로 포함된 것과 같은 정도로 전체가 모든 목적을 위해 참고로 본원에 포함된다. 상기에 제시된 개시 내용은 독립적인 유용성을 가진 다수의 별개의 발명을 포함할 수 있다. 이들 발명의 각각이 그 바람직한 형태(들)로 개시되었지만, 여기에 개시되고 설명된 바와 같은 그의 특정 구현양태는 많은 변형이 가능하기 때문에 제한적인 의미로 고려되어서는 안 된다. 본 발명의 주제는 여기에 개시된 다양한 요소, 특징, 기능 및/또는 특성의 모든 신규 및 자명하지 않은 조합 및 하위 조합을 포함한다. 다음 청구범위는 특히 신규하고 자명하지 않은 것으로 간주되는 특정 조합 및 하위 조합을 지적한다. 특징, 기능, 요소 및/또는 속성의 다른 조합 및 하위 조합으로 구현된 발명은 본 출원, 본 출원의 우선권을 주장하는 출원 또는 관련 출원에서 청구될 수 있다. 다른 발명에 관한 것이든 동일한 발명에 관한 것이든, 그리고 원래의 청구 범위와 비교하여 범위가 더 넓거나 좁거나 같거나 다른 이러한 청구항은 또한 본 개시내용의 발명의 주제 내에 포함되는 것으로 간주된다.

Claims (39)

  1. 조성물로서,
    (a) 아미노-작용화된 키토산 및 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 키토산-유도체 나노입자를 포함하는 복합체로서, 상기 적어도 하나의 핵산 분자는 3:1 초과의 아미노 대 인(N:P) 몰비로 상기 키토산-유도체 나노입자에 비-공유적으로 결합됨으로써 양전하를 갖는 유도체화된 키토산 핵산 복합체를 형성하는, 상기 복합체; 및
    (b) 상기 키토산-유도체 나노입자에 비-공유적으로 결합된 다수의 선형 블록 공중합체로서, 상기 선형 블록 공중합체는 적어도 하나의 다중음이온성(PA) 앵커 영역 및 적어도 하나의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 꼬리 영역을 포함하고, 상기 PEG-PA 분자는 상기 키토산-유도체 나노입자에 비-공유적으로 결합하는, 상기 다수의 선형 블록 공중합체를 포함하고,
    상기 조성물은 약 1:100 초과 및 약 10:1 미만인 아미노 대 음이온(N:A) 몰비를 포함하는, 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 선형 블록 공중합체가 PA 앵커 영역 및 PEG 꼬리 영역을 포함하는 이블록 공중합체인, 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 선형 블록 공중합체가 2개의 PEG 꼬리 영역이 측면에 위치된 중앙 PA 앵커 영역, 또는 대안적으로 2개의 PA 앵커 영역이 측면에 위치된 중앙 PEG 꼬리 영역을 포함하는 삼블록 공중합체인, 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 PA 꼬리 영역이 폴리펩티드를 포함하고, 상기 폴리펩티드는 음으로 하전된, 조성물.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 PA 꼬리 영역이 탄수화물을 포함하고, 상기 탄수화물은 음으로 하전된, 조성물.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 탄수화물이 다수의 카르복실레이트, 포스페이트 및/또는 설페이트 모이어티를 포함하는, 조성물.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 탄수화물이 글리코스아미노글리칸인, 조성물.
  8. 제1항에 있어서, PEG-PA 분자가
    (a) PEG-폴리글루탐산(PEG-PGA) 분자;
    (b) PEG-폴리아스파르트산(PEG-PAA) 분자; 또는
    (c) PEG-히알루론산(PEG-HA) 분자,
    또는 1, 또는 2의 조합, 또는 (a)-(c)의 전부를 포함하는, 조성물.
  9. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PEG-PA 분자의 PEG 부분이 약 500 Da 내지 약 50,000 Da, 바람직하게는 약 1,000 Da 내지 10,000 Da, 더욱 바람직하게는 약 1,500 Da 내지 약 7,500 Da, 더욱 더 바람직하게는 약 3,000 Da 내지 약 5,000 Da, 가장 바람직하게는 약 5,000 Da의 중량 평균 분자량(Mw)을 포함하는, 조성물.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PEG-PA 분자의 PA 부분이 약 500 Da 내지 약 3,000 Da, 더욱 바람직하게는 약 1,000 Da 내지 약 2,500 Da, 더욱 바람직하게는 약 1,500 Da의 중량 평균 분자량(Mw)을 포함하는, 조성물.
  11. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PEG-PA 분자의 PA 부분이, 예를 들어 약 5 내지 약 25개의 산성 아미노산을 포함하는 선형 폴리펩티드를 포함하는, 조성물.
  12. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 N:P 몰비가 약 3:1 초과 및 약 100:1 미만, 더욱 바람직하게는 약 5:1 초과 및 약 50:1 미만, 더욱 더 바람직하게는 약 5:1 초과 및 약 30:1 미만, 더욱 더 바람직하게는 약 5:1 초과 및 약 20:1 미만, 더욱 더 바람직하게는 약 5:1 초과 및 약 10:1 미만, 가장 바람직하게는 약 7:1인, 조성물.
  13. 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 N:A 몰비가 약 1:75 초과 및 약 8:1 미만, 더욱 바람직하게는 약 1:50 초과 및 약 6:1 미만, 더욱 더 바람직하게는 약 1:25 초과 및 약 6:1 미만, 더욱 더 바람직하게는 약 1:10 초과 및 약 6:1 미만, 더욱 더 바람직하게는 약 1:5 초과 및 약 6:1 미만인, 조성물.
  14. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 N:P 몰비가 약 1:8 내지 약 30:1(예를 들어, 약 20:1, 15:1, 10:1, 8:1 또는 7:1)이고, 상기 P:A 몰비는 약 1:50 내지 약 1:5이고, 더욱 바람직하게는 상기 N:A 몰비는 약 1:10 내지 약 5, 더욱 바람직하게는 약 1:5 내지 약 2, 더욱 바람직하게는 약 1:3 내지 약 1.5, 더욱 바람직하게는 약 1:2.5 내지 약 1이고, 더욱 더 바람직하게는 상기 N:P:A 비율은 약 7:1:7; 약 7:1:12; 또는 약 7:1:17인, 조성물.
  15. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키토산-유도체 나노입자가 화학식 II의 폴리올을 포함하거나 화학식 II의 폴리올로 작용화된, 조성물:
    Figure pct00084

    여기서:
    (a) R2는 H 및 히드록실로부터 선택되고;
    (b) R3은 H 및 히드록실로부터 선택되고; 및
    (c) X는 하나 이상의 히드록실 치환기로 임의로 치환된 C2-C6알킬렌으로부터 선택된다.
  16. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키토산-유도체 나노입자가 화학식 III의 폴리올을 포함하는, 조성물:
    Figure pct00085

    여기서:
    -----Y는 =O 또는 -H2이고;
    R2는 H 및 히드록실로부터 선택되고;
    R3은 H 및 히드록실로부터 선택되고;
    X는 하나 이상의 히드록실 치환기로 임의로 치환된 C2-C6알킬렌으로부터 선택되고; 및
    Figure pct00086
    는 폴리올 및 유도체화된 키토산 사이의 결합을 나타낸다.
  17. 제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노-작용화된 키토산이 아르기닌, 라이신 또는 오르니틴 작용화된, 바람직하게는 아르기닌 작용화된, 조성물.
  18. 제 1항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이
    (a) 공복 상태의 모의 장액에서 적어도 24시간 동안; 또는
    (b) 37℃에서 포유 동물의 소변에 분산되어 적어도 1 시간 동안 안정한, 조성물.
  19. 제 1항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 계면활성제, 부형제, 및/또는 저장 안정화제를 추가로 포함하는, 조성물.
  20. 제 19항에 있어서, 상기 조성물은 저장 안정화제를 포함하고, 바람직하게는 상기 저장 안정제는 단당류, 이당류, 다당류, 또는 이들의 환원 알코올이고, 더욱 더 바람직하게는 상기 저장 안정화제가 트레할로스 및 만니톨에서 선택되는, 조성물.
  21. 제 19항 또는 제 20항에 있어서, 상기 조성물이 계면활성제를 포함하고, 바람직하게는 상기 계면활성제는 폴록사머를 포함하고, 더욱 바람직하게는 상기 폴록사머는 폴록사머 407인, 조성물.
  22. 제 1항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 핵산이 RNA를 포함하는, 조성물.
  23. 제 1항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 핵산이 DNA를 포함하는, 조성물.
  24. 제 1항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 정제수에 분산된 조성물을 포함하는 수성 분산액에서 4℃에서 적어도 48시간 동안, 또는 1주 동안 안정한, 조성물.
  25. 제 24항에 있어서, 상기 조성물이 동결/해동 및/또는 건조/재수화 후 수성 분산액에서 안정하고, 바람직하게는 상기 건조가 분무 건조, 동결건조, 분무 동결 건조, 증발 또는 초임계 건조를 포함하고, 더욱 바람직하게는 상기 건조가 동결건조 또는 분무 건조를 포함하는, 조성물.
  26. 제 24항 또는 제 25항에 있어서, 상기 조성물이 수성 분산액에서 4℃에서, 예를 들어 적어도 48시간 또는 1주 후에 0.2 미만의 다분산 지수를 나타내는, 조성물.
  27. (a) 아미노-작용화된 키토산 및 적어도 하나의 핵산을 포함하는 키토산-유도체 나노입자를 포함하는 복합체를 제공하는 단계; 및
    (b) 상기 복합체를 PEG-PA 분자를 포함하는 용액과 혼합하여 조성물을 포함하는 반응 혼합물을 형성하는 단계를 포함하여, 제 1항 내지 제 26항 중 어느 한 항의 조성물을 제조하는 방법.
  28. 제 27항에 있어서, (a)의 상기 복합체가 0.01mg/mL 내지 25mg/mL, 더욱 바람직하게는 0.05 내지 10mg/mL, 더욱 바람직하게는 0.10내지 5mg/mL, 더욱 바람직하게는 0.10 내지 2mg/mL의 뉴클레오티드 농도로 제공되는, 방법.
  29. 제 27항 또는 제 28항에 있어서, (a) 및 (b)가 1:10 내지 10:1, 바람직하게는 1:5 내지 5:1, 더욱 바람직하게는 1:2 내지 2:1, 더욱 더 바람직하게는 약 1:1의 (v/v) 비율로 혼합되는, 방법.
  30. 제 27항, 제 28항 또는 제 29항에 있어서, 상기 방법이 반응 혼합물을 농축하는 단계를 추가로 포함하고, 바람직하게는 상기 농축이 한외여과, 용매 승화, 및/또는 용매 증발을 포함하고, 더욱 바람직하게는 상기 한외여과가 접선 유동 여과를 포함하는, 방법.
  31. 제 27항에 있어서, 상기 아미노-작용화된 키토산이 친수성 폴리올을 포함하거나 친수성 폴리올로 작용화된, 방법.
  32. 아미노-작용화된 키토산, 적어도 하나의 핵산, 및 PEG-PA 분자를 동시에 또는 순차적으로 혼합하여 조성물을 포함하는 반응 혼합물을 형성하는 단계를 포함하여, 제 1항 내지 제 26항 중 어느 한 항의 조성물을 제조하는 방법.
  33. 제 32항에 있어서, 상기 방법은 아미노-작용화된 키토산, 적어도 하나의 핵산, 및 PEG-PA 분자를 동시에 조합함으로써 조성물을 포함하는 반응 혼합물을 형성하는, 방법.
  34. 제 1항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 따른 조성물, 또는 제 23항 내지 제 33항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성된 조성물과 세포를 접촉시키는 단계를 포함하여, 핵산으로 세포를 형질감염시키는 방법.
  35. 제 34항에 있어서, 상기 세포가 점막 조직을 포함하거나 점막 조직으로부터 유래된 세포인, 방법.
  36. 제 35항에 있어서, 상기 점막 조직이 폐 조직, 비강 조직, 안구 조직, 질 조직, 방광 조직 또는 위장관 조직인, 방법.
  37. 제 35항에 있어서, 상기 세포가 대상체의 장 세포이고 상기 접촉이 대상체에게 상기 조성물을 경구로 또는 직장내로 투여하는 것을 포함하는 것인, 방법.
  38. 제 35항에 있어서, 상기 세포가 방광의 세포이고 상기 접촉이 대상체에게 상기 조성물을 방광내 투여하는 것을 포함하는 것인, 방법.
  39. 제 27항 내지 제 33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 PEG-PA를 포함하는 상기 중합체 성분을 포함하지 않는 입자와 비교하여 감소된 점막-접착성을 제공하는, 방법.
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