KR20150021022A - 이중으로 유도화된 키토산 나노입자 및 이의 제조 방법과 생체 내 유전자 도입을 위하여 이를 이용하는 방법 - Google Patents

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Abstract

아르기닌과 글루콘산으로 이중으로 유도화된 키토산; 그리고 이를 만드는 방법 및 이를 이용하는 방법, 이를 테면, 생체내 유전자 운반을 위하여 이용하는 방법이 본 명세서에서 제공된다.

Description

이중으로 유도화된 키토산 나노입자 및 이의 제조 방법과 생체 내 유전자 도입을 위하여 이를 이용하는 방법{DUALLY DERIVATIZED CHITOSAN NANOPARTICLES AND METHODS OF MAKING AND USING THE SAME FOR GENE TRANSFER IN VIVO}
본 발명은 일반적으로 이중으로 유도화된 키토산이 포함된 나노입자와 생체내에서 핵산 운반, 이를 테면, 유전자 도입을 위하여 상기 나노입자를 만들고 이용하는 방법들에 관계된다.
키토산은 N-아세틸-D-글루코사민과 D-글루코사민으로 된 비-독성 양이온성 공중합체다. 키토산은 핵산과 복합체를 형성할 수 있으며, 생물적합성 및 비-독성 폴리사카라이드로써 세포의 형질감염을 위한 DNA 운반 비이클로 이용되었다. 바이러스성 외피의 복잡함 및 잠재적 독성으로 인하여 핵산의 비-바이러스성 운반에 있어서 키토산의 이용에 대하여 많은 관심이 집중되어 왔다.
유전자 형질감염에 적합한 조성물들을 식별해내는 시도에서 변형된 키토산과 핵산 사이의 복합체 포함, 다수의 키토산/DNA 복합체들이 검사되었다. 이를 테면, WO2010/088565; WO2008/082282 참고. 상기 복합체들은 여러 성질들 중에서 용해도, 응집(aggregation) 성향, 복합체 안정성, 입자 크기, DNA를 방출하는 능력, 그리고 형질감염(transfection) 효율에 있어서 다양한 것으로 밝혀졌다.
본 명세서에서는 아르기닌과 글루콘산이 공조적으로 작용하여 상기 키토산의 형질감염 효율을 개선시킨다는 놀라운 발견이 제시된다.
아르기닌과 글루콘산은 키토산 나노입자의 형질감염 효율을 공조적으로(synergistically) 증가시킨다는 예상치못한 발견이 본 명세서에서 개시된다. 따라서 이를 테면 생체내에서 세포, 조직, 및 장기로 핵산의 운반을 용이하게 하는 신규한 조성물들이 본 명세서에서 제공된다. 특히, 이중으로 유도화된 키토산 기반의 나노입자가 본 명세서에서 제공되며, 이때 전술한 나노입자는 임의선택적으로 핵산을 더 포함한다.
한 구현예에 있어서, 상기 나노입자는 최소한 하나의 아미노산에 결합된(coupled) 키토산을 포함한다. 바람직한 구현예에 있어서, 상기 아미노산은 양전하를 띈다. 더 바람직한 구현예에 있어서, 상기 아미노산은 아르기닌이다.
또다른 구현예에 있어서, 상기 나노입자는 유기산, 바람직하게는 글루콘산에 결합된 키토산을 포함한다.
또다른 구현예에 있어서, 상기 나노입자는 아르기닌 및 글루콘산 모두에 결합된 키토산을 포함한다(화학식 1 참고).
[화학식 1]
Figure pct00001
이때 n은 1 내지 2000의 정수이며,
α는 아르기닌의 기능화(functionalization) 정도이며,
β는 글루콘산의 기능화 정도이며; 그리고
각 R1은 수소, 아세틸, 화학식 2, 및 화학식 3으로부터 독립적으로 선택된다.
[화학식 2]
Figure pct00002
[화학식 3]
Figure pct00003
본 명세서에서 설명된 것과 같이 이중으로 유도화된 키토산은 초기 농도 비율 또는 최종 기능화 비율의 변화에 따른 아르기닌 및 글루콘산을 포함한다. 초기 농도 비율은 글루콘산 변형된 키토산에 이용되는데, 글루콘산에 있는 카르복실 기의 몰 비율을 키토산 또는 아르기닌-변형된 키토산에 있는 총 아민 기로 나눈 것으로 나타내며, 한편 최종 기능화 비율은 원소 분석 결과에 의해 탄소와 질소의 중량비로부터 산출된 최종 변형된 키토산의 기능화 정도를 나타낸다. 한 구현예에 있어서, 키토산은 약 5% 내지 약 60%, 이를 테면, 약 8% 내지 약 30%의 최초 농도에서 글루콘산과 결합된다. 또다른 구현예에 있어서, 바람직하게는 약 30%이다. 또다른 구현예에 있어서, 키토산은 약 10% 내지 약 55%의 최종 농도에서 아르기닌과 결합된다.
특히, 이중으로 유도화된 키토산("DD-키토산")과 같이 형성된 키토산-핵산 폴리플렉스(polyplexes)는 기능화되지 않은 키토산 또는 단일 아미노산 잔기, 아미노산 폴리머, 또는 오직 글루콘산 잔기에만 접합된 키토산으로 형성된 핵산 폴리플렉스보다 더 높은 형질감염 효율을 나타낸다. 본 명세서에서 설명된 것과 같이 폴리플렉스내 이중으로 기능화된 키토산의 이용으로 인하여 부여되는 기타 바람직한 성질은 점막 방벽을 침투하는 능력의 개선, 폴리플렉스의 강화된 안정성, 세포의 감소된 독성 및 핵산의 세포내 방출 강화를 포함한다. 나아가, 일부 바람직한 구현예들에 있어서, 피험체 DD-키토산 폴리플렉스 조성물은 생리학적 pH에서 투여될 수 있다(이를 테면, 전신 투여).
따라서, 한 측면에 있어서, 본 발명은 DD-키토산 핵산 폴리플렉스를 제공한다. 상기 DD-키토산 핵산 폴리플렉스는 아르기닌과 글루콘산으로 이중으로 유도화된 키토산을 포함한다.
한 구현예에 있어서, 상기 DD-키토산 핵산 폴리플렉스는 DD-키토산의 pKa 이하의 pH에서 형성된다.
한 구현예에 있어서, 상기 DD-키토산 핵산 폴리플렉스는 7이하의 pH에서 형성된다.
한 구현예에 있어서, 상기 DD-키토산 핵산 폴리플렉스는 1-60%의 기능화 정도를 가진 복합된 아르기닌과 글루콘산을 보유한다.
한 구현예에 있어서, 상기 DD-키토산 핵산 폴리플렉스는 1-30%의 기능화 정도를 가진 복합된 아르기닌과 글루콘산을 보유한다.
한 구현예에 있어서, 상기 DD-키토산 핵산 폴리플렉스에서 아르기닌 대 글루콘산의 몰 비율은 100:1 내지 1:100이다.
한 구현예에 있어서, 상기 DD-키토산 핵산 폴리플렉스에서 아르기닌 대 글루콘산의 몰 비율은 50:1 내지 1:50이다.
한 구현예에 있어서, 상기 DD-키토산 핵산 폴리플렉스에서 아르기닌 대 글루콘산의 몰 비율은 10:1 내지 1:10이다.
한 구현예에 있어서, 상기 DD-키토산 핵산 폴리플렉스에서 아르기닌 대 글루콘산의 몰 비율은 5:1 내지 1:5이다.
한 구현예에 있어서, 상기 DD-키토산 핵산 폴리플렉스에서 아르기닌 대 글루콘산의 몰 비율은 2:1 내지 1:2이다.
바람직한 구현예들에 있어서, 아르기닌 대 글루콘산의 몰 비율은 키토산의 분자량에 역 비례하는데, 가령, 더 작은 분자량의 DD-키토산는 키토산에 대하여 더 높은 몰 비율의 아르기닌을 필요로 하며, 그 역도 성립된다.
한 구현예에 있어서, 상기 DD-키토산 핵산 폴리플렉스에서 상기 핵산은 DNA이다.
한 구현예에 있어서, 상기 DD-키토산 핵산 폴리플렉스에서 상기 핵산은 RNA이다.
한 구현예에 있어서, 상기 DD-키토산 핵산 폴리플렉스에서 상기 핵산은 인공(artificial) 핵산이다. 바람직한 구현예에 있어서, 상기 인공 핵산은 펩티드 핵산 (PNA), 포스포로디아미데이트 몰포리노 올리고 (PMO), 잠김(locked) 핵산 (LNA), 글리콜 핵산 (GNA) 및 트레오스 핵산 (TNA)으로 이루어진 그룹에서 선택된다.
한 구현예에 있어서, 상기 DD-키토산 핵산 폴리플렉스의 핵산은 치료 핵산이다. 한 구현예에 있어서, 상기 치료 핵산은 치료 RNA다. 바람직한 구현예에 있어서, 상기 치료 RNA는 안티센스(antisense) RNA, siRNA, 짧은 헤어핀 RNA, 마이크로 RNA, 및 효소 RNA로 이루어진 그룹에서 선택된다.
한 구현예에 있어서, 상기 치료 핵산은 DNA다.
한 구현예에 있어서, 상기 치료 핵산은 치료 단백질이 인코딩된 핵산 서열을 포함한다.
한 측면에 있어서, 본 발명은 다수의 DD-키토산 핵산 폴리플렉스가 포함된 조성물을 제공한다.
한 구현예에 있어서, 상기 조성물은 3.0-8.0의 pH, 더욱 바람직하게는 4.0-7.0, 그리고 가장 바람직하게는 4.5-6.5의 pH를 갖는다.
한 측면에 있어서, 본 발명은 본 발명의 DD-키토산 핵산 폴리플렉스가 포함된 약학 조성물을 제공한다. 바람직한 구현예에 있어서, 상기 DD-키토산 핵산 폴리플렉스는 치료 핵산을 포함한다.
한 측면에 있어서, 본 발명은 치료요법적으로 유효량의 본 발명의 약학 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 질환 치료 방법들을 제공한다.
한 구현예에 있어서, 해당 약학 조성물은 생리학적 pH에서 투여된다.
한 구현예에 있어서, 해당 약학 조성물은 전신으로 투여된다.
한 구현예에 있어서, 해당 약학 조성물은 조직을 표적으로 하기 위하여 국소적으로 투여된다. 바람직한 구현예에 있어서, 해당 약학 조성물은 점막 조직으로 투여된다. 한 구현예에 있어서, 상기 점막 조직은 GI 조직이다.
한 측면에 있어서, 본 발명은 DD-키토산 핵산 폴리플렉스가 포함된 백신을 제공하며, 이때 상기 핵산은 항원을 인코드한다.
한 측면에 있어서, 본 발명은 환자에게 백신접종하는 방법들을 제공한다. 상기 방법들은 본 발명의 백신을 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
한 측면에 있어서, 본 발명은 DD-키토산 핵산 폴리플렉스가 포함된 면역원성 조성물을 제공하는데, 이때 상기 핵산은 면역원을 인코드한다.
한 측면에 있어서, 본 발명은 소요의 분자에 대항한 면역 반응을 개시 또는 증가시키는 방법들을 제공한다. 상기 방법들은 본 발명의 면역원성 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하고, 이때 상기 핵산은 소요의 분자 에피토프를 인코드한다.
도 1은 결합된 두 성분 아르기닌과 글루콘산 사이에 최적의 기능화 조합을 유도하는 아르기닌 및 글루콘산에 의해 이중 유도화된 키토산을 만드는 과정의 순서도다.
도 2a는 글루콘산의 10%, 30%, 또는 60%의 최초 농도(x-축)에서 결합된 24mer 키토산의 형질감염 효율 (ng SEAP/mg 단백질; y-축)을 보여준다.
도 2b는 아르기닌의 9.7%, 12.3%, 26%, 또는 52%의 최종 기능화 정도(x-축)에서 결합된 24mer 키토산의 형질감염 효율 (ng SEAP/mg 단백질; y-축)을 보여준다.
도 3은 아민/인산염 (N/P) 비율 20에서 24mer 키토산으로 만든 폴리플렉스의 형질감염 효율 (ng SEAP/mg 단백질; y-축)을 나타내는데, 이때 (A)는 26%의 최종 기능화 정도의 아르기닌과 5%의 최종 기능화 정도의 글루콘산을 가지도록 아르기닌과 글루콘산에 이중으로 결합된 폴리플렉스이며; (B)는 26%의 최종 기능화 정도를 가지도록 아르기닌 단독으로 결합된 폴리플렉스이며, 또는 (C)는 전체 아민에 대해 30% 글루콘산의 최초 농도에서 글루콘산 단독으로 결합된 폴리플렉스를 나타낸다.
도 4는 아민/인산염 (N/P) 비율 20에서 최종 기능화 26%의 아르기닌 단독으로(0%; x-축) 결합된 24mer 키토산(0%; x-축)으로 만들어진 폴리플렉스 또는 3%, 5%, 6% 및 9% 최종 기능화 정도(x-축)의 글루콘산으로 추가로 결합된 24mer 키토산으로 만들어진 폴리플렉스의 형질감염 효율 (ng SEAP/mg 단백질; y-축)을 나타낸다.
도 5는 각각 26% 및 5%의 최종 기능화 정도에서 아르기닌과 글루콘산으로 이중으로 유도화된 24mer 키토산의 형질감염 효율 (ng SEAP/mg/단백질; y-축)(작은 체크무늬 막대) 또는 26% 아르기닌 단독으로 결합된 키토산의 형질감염 효율 (ng SEAP/mg/단백질; y-축)(큰 체크무늬 막대)에서 40 (N40), 20 (N20) 또는 10 (N10)의 아민/인산염 (N/P) 비율의 효과(x-축)를 나타낸다.
도 6은 각각 26% 및 5%의 최종 기능화 정도에서 아르기닌과 글루콘산으로 이중으로 유도화된 24mer 키토산의 형질감염 효율 (ng SEAP/mg 단백질)(작은 체크무늬 막대) 또는 26%의 최종 기능화 정도에서 아르기닌 단독으로 결합된 키토산의 형질감염 효율 (ng SEAP/mg 단백질)(큰 체크무늬 막대)에서 제제의 pH의 효과(x-축)를 나타낸다.
도 7은 최종 농도 52% (A, B) 또는 26% (C, D) 단독 (A, C)의 아르기닌 또는 최종 농도 8% (B) 또는 6% (D)의 글루콘산으로 유도화된 24mer 키토산에 의한 형질감염 효율(ng SEAP/mg/단백질; y-축)에서 아르기닌 기능화 비율의 효과를 나타낸다. 30% 최초 농도 글루콘산 단독(E)으로 결합된 24mer 키토산이 기준으로 또한 포함된다.
도 8은 각각 26% 및 5%의 최종 기능화 정도에서 아르기닌과 글루콘산으로 이중으로 유도화된 24mer 키토산(작은 체크무늬 막대), 또는 26% 아르기닌 단독으로 결합된 키토산(큰 체크무늬 막대)의 형질감염 효율을 보여주는데, 이때 (a)는 293T 세포, (b)는 HT1080 또는 Hela 인간 세포주 또는 (c)는 원숭이 VERO 또는 뮤린 NIH3T3 세포주에서의 형질감염 효율을 나타낸다.
도 9는 키토산 (A), 26% 아르기닌으로 기능화된 키토산 (B), 그리고 최종 기능화 정도 26%의 아르기닌 및 5%의 글루콘산으로 이중으로 기능화된 키토산(C)을 근육내 주입 후 2일 시점에서 근육에서 유전자 발현을 보여준다.
도 10은 키토산 (A), 26% 아르기닌으로 기능화된 키토산 (B), 그리고 최종 기능화 정도 26%의 아르기닌 및 6%의 글루콘산으로 이중 기능화된 키토산(C)의 결장 운반 후 2일 시점에서 말단 결장에서 유전자 발현을 보여준다.
도 11은 아민/인산염 (N/P) 비율 40에서 생성되고 (A) 26% 아르기닌 단독으로 결합되어 만들어진 24mer 키토산 또는 (B) 26% 아르기닌과 최종 기능화 정도 5%의 글루콘산으로 이중으로 유도화된 24mer 키토산이 포함된 루시페라제 siRNA 폴리플렉스의 시험관내 녹다운(knock down) 효율을 보여준다.
도 12는 실온에서 3개월 저장 후 물로 복원된 후 동결건조된 DD-키토산-핵산 폴리플렉스의 물리화학적 성질을 보여준다.
키토산은 키틴의 탈아세틸화된 형태로써, 갑각류(이를 테면 새우, 게, 바닷가재)의 외골격의 주요 성분이 되는 N-아세틸글루코사민 중합체다. 키토산은 키틴으로부터 탈아세틸화에 의해 형성되고, 이렇게 형성되었기 때문에 단일 중합체 분자는 아니며, 상이한 분자량 및 상이한 수준의 탈아세틸화를 갖는 분자들의 부류다. 시판되는 키토산에서 탈아세틸화 비율은 일반적으로 50-100% 범위다.
본 명세서에서 설명된 상기 키토산 유도체들은 본 명세서에서 설명된 것과 같이 양전하를 띈 또는 중성 모이어티들을 가진 생성된 자유 아미노 그룹들의 기능화에 의해 생성된다. 본 명세서에서 설명된 바와 같이 유도화된 키토산은 다음에 기술된 것들이 포함된 핵산 운반 비이클로써 유익한 여러 성질들을 보유한다: 키토산은 음전하를 띈 핵산에 효과적으로 결합하여 핵산에 복합되고, 조정가능한 크기의 나노입자로 만들어질 수 있으며, 세포에 의해 유입될 수 있고, 세포 안에서 적절한 시점에 상기 핵산을 배출할 수 있다.
50% 이상의 임의의 탈아세틸화 수준을 갖는 키토산은 1% 내지 50%의 기능화 수준으로 본 발명에 이용된다. (기능화 비율은 상기 키토산 중합체에서 자유 아미노 모이어티 수에 비례하여 측정된다.) 탈아세틸화 및 기능화 수준은 상기 기능화된 키토산 유도체에 비전하 밀도(specific charge density)를 부여한다. 생성된 전하 밀도는 용해도, 핵산 결합 및 후속적인 방출, 그리고 포유류 세포 막과의 상호작용에 영향을 끼친다. 따라서, 본 발명에 따라, 이들 성질은 최적의 효과를 위하여 최적화되어야 한다. 예시적인 키토산 유도체들은 2007년 1월 24일자로 제출된 Baker 외; 11/657,382에서 설명되며, 이의 전문이 명세서의 참고자료에 편입된다. 한 구현예에 있어서, 본 명세서에서 설명된 것과 같이 상기 이중으로 유도화된 키토산은 최소한 50%의 탈아세틸화 수준을 보유한 키토산을 포함한다. 한 구현예에 있어서, 상기 탈아세틸화 수준은 최소한 60%, 더욱 바람직하게는 최소한 70%, 더욱 바람직하게는 최소한 80%, 더욱 바람직하게는 최소한 90%, 그리고 가장 바람직하게는 최소한 95%이다. 바람직한 구현예에 있어서, 본 명세서에서 설명된 것과 같이 상기 이중으로 유도화된 키토산은 최소한 98%의 탈아세틸화 수준을 보유한 키토산을 포함한다.
본 발명에서 설명된 상기 키토산 유도체들은 중성 및 생리학적 pH에서 가용성인 일정 범위의 평균 분자량을 보유하는데, 본 발명의 목적에 맞는 3 ~ 110 kDa 범위의 분자량이 포함된다. 본 명세서의 구현예들에서 평균 분자량이 더 낮은 유도화된 키토산 (<25 kDa, 이를 테면, 약 5kDa 내지 약 25kDa)이 제시되며, 이들은 바람직한 운반 및 형질감염 성질들을 보유할 수 있고, 그리고 크기는 작지만, 유리한 가용성을 보유한다. 유도화된 키토산의 평균 분자량이 낮을수록 평균 분자량이 더 높은 키토산보다 일반적으로 가용성이 더 크고, 따라서 평균 분자량이 낮은 유도화된 키토산은 상기 핵산을 더 용이하게 방출하게 되는 핵산/키토산 복합체를 만들고, 세포의 형질감염을 증가시킨다. 많은 문헌들이 이러한 키토산 기반의 운반 시스템을 위한 이러한 모든 매개변수들의 최적화에 집중되어 있다.
당업계 숙련자는 키토산이 화학구조식 I을 보유하는 다수의 분자를 지칭하며, 이때 n은 임의의 정수이고, 각 R1은 수소라는 것을 인지할 것이다. 또한, 평균 분자량, 이를 테면, 3kD 내지 110kD의 평균 분자량을 갖는 것으로 언급되는 키토산은 일반적으로 이를 테면, 3kD 내지 110kD의 평균 분자량을 갖는 다수의 키토산 분자를 지칭하며, 이때 각 키토산 분자는 상이한 쇄 길이(n+2)를 보유할 수 있다. "n-mer 키토산"라고 불리는 키토산은 반드시 화학구조식 I(이때 각 키토산 분자는 n+2의 쇄 길이를 갖는다)의 키토산 분자를 포함할 필요가 없다는 것도 잘 알려져 있다. 오히려, 본 명세서에서 이용된 바와 같이 "n-mer 키토산"은 다수의 키토산 분자를 지칭하며, 각각은 상이한 쇄 길이를 가지고, 이때 이들 다수의 키토산들은 n의 쇄 길이를 갖는 키토산 분자와 실질적으로 유사한 또는 대등한 평균 분자량을 보유한다. 예를 들면, 24-mer 키토산은 다수의 키토산 분자를 포함할 수 있는데, 각 분자는 이를 테면, 7-50의 상이한 쇄 길이를 갖지만, 24의 쇄 길이를 갖는 키토산 분자와 실질적으로 유사한 또는 대등한 평균 분자량을 갖는다.
본 명세서에서 설명된 것과 같이 상기 기능화된 키토산 유도체들은 이중으로 유도화된-키토산 화합물들, 이를 테면, 키토산-아르기닌-글루콘산 화합물들이다. 일반적으로, 상기 키토산-아르기닌-글루콘산 화합물들은 다음의 화학식 1을 갖고:
Figure pct00004
이때 이때 n은 1 내지 2000의 정수이고,
α는 아르기닌의 기능화 정도이며,
β는 글루콘산의 기능화 정도이며; 그리고
각 R1은 수소, 아세틸, 화학식 2, 및 화학식 3으로부터 독립적으로 선택된다.
[화학식 2]
Figure pct00005
[화학식 3]
Figure pct00006
본 발명에 따라 키토산을 수성 매질에서 아르기닌 또는 글루콘산에 접합시키 위한 바람직한 방법이 본 명세서에서 설명되는데, 이때, Boc-L-아르기닌 (Boc-R) 및 글루콘산 (Gluco)이 이용된다. 상기 방법은 잘 알려진 수용성 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 (EDC) 그리고 N-히드록시숙시니미드 (NHS)를 이용하여 키토산 골격에 있는 아민과 Boc-R 또는 글루콘산에 있는 카르복실산 사이에 아미드 형성을 촉매한다.
일반적으로, 이를 테면, 6.0 ± 0.5 그리고 더욱 바람직하게는 6.0 ± 0.2의 표적 결합 pH로 조정된 pH를 갖는 희석 HCl 용액 안에 있는 키토산은 먼저 Boc-R 또는 Gluco에 결합되고, 정제되고, 그 다음 제 2 기능기에 결합된다. 예를 들면, 키토산이 아르기닌에 먼저 결합된다면, 상기 아르기닌-결합된 키토산 (R-키토산)이 정제될 수 있고, 그 다음 글루콘산에 결합된다. 역으로, 키토산이 글루콘산에 먼저 결합된다면, 상기 글루콘산-결합된 키토산 (gluco-키토산)이 정제될 수 있고, 그 다음 아르기닌에 결합된다. 결합 순서에 관계없이, 공지의 방법을 이용하여 아르기닌과 글루콘산이 키토산에 결합될 수 있다.
예를 들면, 아르기닌은 Boc-R 및 NHS의 pH 조정된 수성 용액 혼합물을 희석된 HCl 안의 키토산에 첨가하고, 이어서 24시간 동안 실온에서 결합이 시작되도록 EDC 수용액이 첨가됨으로써, 키토산 또는 gluco-기능화된 키토산 (gluco-키토산)에 결합될 수 있다. 키토산 아민의 농도, 반응 pH 그리고 키토산-아민에서 R-COOH의 몰 비율 그리고 EDC:NHS:R-COOH은 사전-산출될 수 있고, 그리고 아르기닌의 재생가능한 최종 기능화 정도를 갖도록 충족될 수 있다. Boc-R-키토산은 상기 De-Boc 반응에 앞서 정제될 수 있다. De-Boc는 조절된 HCl 농도 및 반응 시간을 이용하여 HCl 매질에서 진행될 수 있다. de-Boc 동안 키토산의 임의의 탈중합화는 반응 용액의 점성을 측정함으로써 감시될 수 있고(이것은 중요한 것이 아닌 것으로 증명되었으며), de-Boc의 효율은 de-Boc-R-키토산 및 Boc-R-키토산에서 양성자 NMR에 의해 확인될 수 있다. 상기 기능화 정도는 상기 정제된 de-Boc-R-키토산의 C, N 원소 분석에 의해 측정될 수 있다.
글루콘산은 반응 pH 6.0 ± 0.3에서 키토산 또는 아르기닌-결합된 키토산 (R-키토산)에 결합될 수 있다. 이 pH에서, 글루콘산의 상기 카르복실산 기는 친핵 치환 반응 기전에 따라 키토산 골격에 있는 결합안된 아민의 공격을 받을 수 있다. 친핵성 치환 반응은 키토산 골격의 아민 기에서 주도적으로 발생될 것이지만, 글루콘산이 R-키토산에 결합될 때, 소량의 글루콘산은 동일한 기전을 통하여 아르기닌의 아민 기와 공유 결합을 형성할 가능성이 또한 있다는 것을 당업계 숙련자는 인지할 것이다. 이러한 이유로, 특정 구현예들에 있어서, 화학식 1의 R1은 수소, 아세틸, 화학식 2, 화학식 3, 및 화학식 4로부터 독립적으로 또한 선택될 수 있다.
[화학식 4]
Figure pct00007
Boc-R-키토산, de-Boc-R-키토산, gluco-키토산, 및/또는 이중으로 유도화된 키토산은 침전, 또는 컬럼 처리, 또는 정규 투석, 또는 적절한 분자량 컷오프(MWCO)의 셀룰로오스 투석 튜브를 이용하여, 또는 접선-유동-여과(TFF) 및 정용여과 카트릿지(diafiltration cartridges)를 통하여 Mili-Q 물에 대해 역류 투석을 통하여 정제될 수 있다.
따라서, "이중으로 유도화된-키토산" 또는 "DD-키토산"은 이를 테면, 키토산에 아르기닌 및 글루콘산 모두가 공유적으로 결합된, 이중으로 기능화된 키토산 ("이중으로 기능화된-키토산" 또는 "DF-키토산)으로 불릴 수 있다. 상기 아르기닌은 단일 아미노산 또는 폴리펩티드로 키토산에 공유적으로 부착될 수 있다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, 다른 언급이 없는 한, 용어 "펩티드" 및 "폴리펩티드"는 호환된다.
용어 "폴리펩티드"는 통상적인 폴리펩티드 (가령, L 또는 D-아미노산을 포함하는 짧은 폴리펩티드), 뿐만 아니라 원하는 기능적 활성을 보유하는 펩티드 등가물들, 펩티드 유사체들 그리고 펩티드모방체들(peptidomimetics)을 지칭하는데 최대한 광범위하게 이용된다. 펩티드 등가물들은 하나 또는 그 이상의 아미노산이 관련된 유기산, 아미노산 또는 이와 유사한 것들로 치환, 또는 측쇄 또는 기능기들의 치환 또는 변형에 의해 통상적인 펩티드와는 구별될 수 있다.
펩티드모방체들은 당분야에 공지된 바와 같이, 대체 링키지(linkage)에 의해 대체된 하나 또는 그 이상의 펩티드 링키지를 보유할 수 있다. 당분야에 공지된 바와 같이, 상기 펩티드 골격의 일부 또는 전부가 형태학적으로 억압된 사이클릭 알킬 또는 아릴 치환체들로 대체되어 상기 기능적 아미노산 측쇄들의 이동성이 제한될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드들은 당분야에 공지된 재조합 및 합성 방법과 같은 인지된 방법들에 의해 생산될 수 있다. 펩티드 합성 기술은 잘 알려져 있으며, 그리고 Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-2456 (1963), Atherton, 외., Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press (1989), and Merrifield, Science 232:341-347 (1986)에서 설명된 것들이 포함된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "선형 폴리펩티드"는 폴리펩티드를 구성하는 아미노산 측쇄에 공유적으로 부착된 가지를 이룬 기들이 없는 폴리펩티드를 지칭한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "분기형 폴리펩티드"는 폴리펩티드를 구성하는 아미노산 측쇄에 공유적으로 부착된 가지를 이룬 기들이 포함된 폴리펩티드를 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "아미노산"은 자연 발생적 아미노산 뿐만 아니라 자연적으로 발생되지 않는 아미노산, 이를 테면 아미노산 유사체들을 포함한다. 용어 "아미노산"은 자연 발생적 (D) 또는 (L) 아미노산, 화학적으로 변형된 아미노산, 이를 테면 노르류신 그리고 아미노산의 특징인 것으로 당분야에 공지된 자연 발생적 아미노산의 성질들을 보유한 화학적으로 합성된 화합물들을 지칭한다.
펩티드상의 아미노산 잔기는 당분야에서 표준이 되는 약어로 나타낸다.
일부 구현예들에 있어서, 적절한 경우 DD-키토산은 DD-키토산 유도체들을 포함하는데, 이를 테면, 부착된 리간드를 가진 DD-키토산과 같이, 추가 기능화기가 통합된 DD 키토산이 포함된다. "유도체들"은 공유적으로 변형된 N-아세틸-D-글루코사민 및/또는 D-글루코사민 단위를 포함하는 키토산-기반 폴리머, 뿐만 아니라 다른 단위들이 통합된, 또는 다른 모이어티가 부착된 키토산-기반 폴리머를 포함하는 범주의 키토산-기반 폴리머가 포함되는 것으로 이해될 것이다. 유도체들은 아르기닌-기능화된 키토산에서 실시된 바와 같이, 글루코사민의 히드록실 기의 변형 또는 아민 기의 변형에 기반을 둔다. 키토산 유도체들의 예로는 삼메틸화된 키토산, PEG화된 키토산, 티올레이트화된 키토산, 갈락토실화된 키토산, 알킬화된 키토산, PEI-통합된 키토산, 우론산 변형된 키토산, 글리콜 키토산, 및 이와 유사한 것들을 포함하나 이에 국한되지 않는다. 키토산 유도체들에 대한 추가 교시는 예를 들면, "Non-viral Gene Therapy"의 pp63-74, K. Taira, K. Kataoka, T. Niidome (editors), Springer-Verlag Tokyo, 2005, ISBN 4-431-25122-7; Zhu 외., Chinese Science Bulletin, December 2007, vol. 52 (23), pp. 3207-3215; 그리고 Varma 외., Carbohydrate Polymers 55 (2004) 77-93를 참고한다.
분산계(Dispersed systems)는 연속 매질을 통하여 분산된 상(dispersed phase)으로 공지된, 미립자 물질로 구성된다. DD-키토산 핵산 폴리플렉스의 "분산(dispersion)"은 수화된 DD-키토산 핵산 폴리플렉스를 포함하는 조성물이며, 이때 폴리플렉스는 매질을 통하여 분산되어 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "전-농축된(pre-concentrated)" 분산은 농축된 분산을 형성하는 농축 과정을 겪지 않은 것이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 폴리플렉스 침전물이 "실질적으로 없는" 이란 눈으로 관찰하였을 때 상기 조성물에는 미립자들이 기본적으로 없다는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 생리학적 pH는 pH 6 내지 8을 나타낸다.
"DD-키토산 핵산 폴리플렉스 " 또는 이의 문법적으로 대등한 표현들은 다수의 DD-키토산 분자와 다수의 핵산 분자들이 포함된 복합체를 의미한다. 바람직한 구현예에 있어서, 상기 이중으로 유도화된-키토산은 전술한 핵산과 복합된다.
상기 DD-키토산 핵산 폴리플렉스는 핵산 성분과 DD-키토산 성분을 포함한다. 키토산, 및 DD-키토산 핵산 폴리플렉스는 당분야에 공지된 임의의 방법들에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면, 기능화된 키토산 및 뉴클레오티드 공급원료 농도는 다양한 아민-대-인산염 비율(N/P), 혼합 비율 그리고 목표 뉴클레오티드 농도에 맞춤-조정될 수 있다. 일부 구현예들에 있어서, 특히 작은 배취(batches), 이를 테면, 2 mL 미만의 배취의 경우, 상기 기능화된 키토산과 뉴클레오티드 공급원료는 용기의 볼텍싱은 유지시키면서 상기 뉴클레오티드 공급원료를 상기 기능화된 키토산 공급원료에 한방울씩 서서히 떨어뜨려 혼합될 수 있다. 다른 구현예들에 있어서, 상기 기능화된 키토산 및 뉴클레오티드 공급원료는 두 개의 유체 스트림의 인-라인 혼합에 의해 혼합될 수 있다. 다른 구현예들에 있어서, 생성된 폴리플렉스 분산은 TFF에 의해 농축될 수 있다. 폴리플렉스 형성을 위한 바람직한 방법은 WO 2009/039657에서 설명되어 있으며, 이의 전문은 명세서의 참고자료에 특별히 편입된다.
본 발명의 핵산은 포스포디에스테르 결합을 일반적으로 포함하지만, 일부 경우에는 다양한 목적 이를 테면, 안정성 및 보호 등의 임의의 다양한 목적을 위하여 포함된 대체 골격 또는 다른 변형 또는 모이어티를 보유하는 핵산 유사체들이 포함된다. 고려되는 다른 핵산 유사체들은 비-리보스 골격을 가진 것들을 포함한다. 또한, 자연 발생적 핵산, 유사체들, 이 둘의 혼합물이 만들어질 수 있다. 상기 핵산은 단일 가닥으로 되거나 또는 이중 가닥으로 되거나 또는 이중 가닥으로 된 또는 단일 가닥으로 된 서열을 모두 가진 부분들이 포함된다. 핵산은 DNA, RNA 및 하이브리드(이때 상기 핵산은 데옥시리보-뉴클레오티드와 리보-뉴클레오티드의 임의의 조합을 포함하고), 그리고 우라실, 아데닌, 티민, 시토신, 구아닌, 이노신, 산틴, 하이포산틴, 이소시토신, 이소구아닌 등이 포함된 염기의 임의의 조합을 포함하나 이에 국한되지 않는다. 핵산은 트리플렉스, 듀플렉스 또는 단일-가닥이 포함된 임의의 형태의 DNA, 트리플렉스, 듀플렉스 또는 단일-가닥이 포함된 임의의 형태의 RNA, 안티센스, siRNA, 리보자임, 데옥시리보자임, 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 키메라, 마이크로RNA, 및 이의 유도체를 포함한다. 핵산은 펩티드 핵산 (PNA), 포스포로디아미데이트 몰포리노 올리고 (PMO), 잠김 핵산 (LNA), 글리콜 핵산 (GNA) 및 트레오스 핵산 (TNA)을 포함하나 이에 국한되지 않는 인공 핵산을 포함한다.
한 구현예에 있어서, 상기 핵산 성분은 치료 핵산을 포함한다. 해당 DD-키토산 핵산 폴리플렉스는 당분야에 공지된 임의의 치료 핵산의 용도에 적용가능하다. 치료 핵산은 포유류 세포에서 치료 효과를 발휘하는 RNA 분자인 치료 RNAs를 포함한다. 치료 RNAs는 안티센스 RNAs, siRNAs, 짧은 헤어핀 RNAs, 마이크로 RNAs, 및 효소 RNAs을 포함하나 이에 국한되지 않는다. 치료 핵산은 트리플렉스 분자를 형성하는 핵산, 단백질 결합 핵산, 리보자임, 데옥시리보자임, 그리고 작은 뉴클레오티드 분자를 포함하나 이에 국한되지 않는다.
많은 유형의 치료 RNAs들이 당분야에 공지되어 있다. 예를 들면, Grimm 외., Therapeutic application of RNAi: is mRNA targeting finally ready for prime time? J. Clin. Invest., 117:3633-3641, 2007; Aagaard 외., RNAi therapeutics: Principles, prospects and challenges, Adv. Drug Deliv. Rev., 59:75-86, 2007; Dorsett 외., siRNAs: Applications in functional genomics and potential as therapeutics, Nat. Rev. Drug Discov., 3:318-329, 2004. 이들은 이중-가닥으로 된 짧은 간섭 RNA (siRNA)를 포함한다.
치료 핵산은 세포독성 단백질 및 프로드럭이 포함된, 치료 단백질을 인코드하는 핵산을 또한 포함한다.
바람직한 구현예에 있어서, 상기 핵산 성분은 치료 핵산 구조체(construct)를 포함한다. 상기 치료 핵산 구조체는 치료 효과를 발휘할 수 있는 핵산 구조체다. 치료 핵산 구조체들은 치료 단백질을 인코드하는 핵산, 뿐만 아니라 치료 RNAs인 전사체를 생산하는 핵산을 포함할 수 있다. 치료 핵산은 결함성 유전자의 치환 또는 보강물로 작용함으로써 유전자 치료에 효과를 제공하기 위하여, 또는 치료 산물을 인코드함으로써 특정 유전자 산물의 결핍을 보상하는데 이용될 수 있다. 치료 핵산은 내생성 유전자의 발현을 또한 억제시킬 수 있다. 치료 핵산은 해독 산물의 전부 또는 일부를 인코드할 수 있고, 그리고 세포 안에 이미 존재하는 DNA와 재복합되어 기능을 할 수 있고, 이로 인하여 유전자의 결함 부분에 대체된다. 또한 치료 핵산은 단백질의 일부를 인코드하고, 유전자 산물의 공동-억제에 의해 이 효과를 발휘할 수 있다. 바람직한 구현예에 있어서, 상기 치료 핵산은 U.S.S.N. 11/694,852(이의 전문이 명세서의 참고자료에 편입된다)에서 공개된 것들로부터 선택된다.
바람직한 구현예에 있어서, 상기 치료 핵산은 호르몬, 효소, 사이토킨, 케모킨, 항체, 유사분열촉진 인자들, 성장 인자들, 분화 인자들, 혈관신생에 영향을 주는 인자들, 응혈 형성에 영향을 주는 인자들, 혈당 수준에 영향을 주는 인자들, 포도당 대사에 영향을 주는 인자들, 지질 대사에 영향을 주는 인자들, 혈액 콜레스테롤 수준에 영향을 주는 인자들, 혈액 LDL 또는 HDL 수준에 영향을 주는 인자들, 세포 자가사멸에 영향을 주는 인자, 음식물 섭취에 영향을 주는 인자들, 에너지 소비에 영향을 주는 인자들, 식욕에 영향을 주는 인자들, 영양분 흡수에 영향을 주는 인자들, 염증에 영향을 주는 인자들, 그리고 뼈 형성에 영향을 주는 인자들로 이루어진 집단으로부터 선택된 치료 단백질을 인코드한다. 인슐린, 렙틴, 글루카곤 길항제, GLP-1, GLP-2, 그렐린, 콜레시스토키닌, 성장 호르몬, 응고 인자들, PYY, 에르트로포에틴, 염증 저해제, IL-10, IL-17 길항제들, TNFα 길항제들, 성장 호르몬 방출 호르몬, 또는 부갑상선 호르몬을 인코드하는 치료 핵산이 특히 바람직하다.
발현 제어 영역
바람직한 구현예에 있어서, 본 발명의 폴리플렉스는 치료 핵산을 포함하는데, 이는 코딩 영역에 작용가능하도록 연계된 발현 제어 영역을 포함하는 치료 구조체다. 상기 치료 구조체는 그 자체가 치료제인 치료 핵산, 또는 치료 단백질을 인코드하는 치료 핵산을 만든다.
일부 구현예들에 있어서, 치료 구조체의 상기 발현 제어 영역은 구성적 활성을 보유한다. 다수의 바람직한 구현예들에 있어서, 치료 구조체의 상기 발현 제어 영역은 구성적 활성을 보유하지 않는다. 이는 치료 핵산의 역학적 발현을 위하여 제공된다. "역학적(dynamic)" 발현이란 시간의 경과에 따라 변화되는 발현을 의미한다. 역학적 발현은 탐지가능한 발현 기간과 구별되는 저발현 또는 무발현 기간이 몇몇 포함될 수 있다. 다수의 바람직한 구현예들에 있어서, 상기 치료 핵산은 조절가능한 프로모터에 작용가능하도록 연계된다. 이는 치료 핵산의 조절가능한 발현을 위하여 제공된다.
발현 제어 영역은 조정력을 가진 폴리뉴클레오티드 (때로, 요소들이라고도 지칭된다), 이를 테면 작용가능하도록 연계된 치료 핵산의 발현에 영향을 주는 프로모터 및 인헨서과 같은 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본 명세서에서 포함된 발현 제어 요소들은 박테리아, 효모, 식물, 또는 동물 (포유류 또는 비-포유류)로부터 기인된 것일 수 있다. 발현 제어 영역은 전장 프로모터 서열, 이를 테면, 고유의 프로모터 및 인헨서 요소들, 뿐만 아니라 전장의 전부 또는 일부를 보유한 하위 서열 또는 폴리뉴클레오티드 변이체 또는 비-변이체 기능(이를 테면, 영양분 조정 또는 세포/조직-특이적 발현의 일부 양을 보유). 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 핵산 서열, 하위 서열 또는 단편등에서 용어 "기능적(functional)" 그리고 이의 문법적 변형이 이용될 때, 상기 서열이 고유의 핵산 서열(이를 테면, 비-변이체 또는 변형안된 서열)의 하나 또는 그 이상의 기능을 보유한다는 의미가 된다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "변이체(variant)"는 서열 치환, 결손, 또는 추가, 또는 다른 변형 (이를 테면, 뉴클레아제에 저항성인 변형된 형태와 같은 화학적 유도체들)을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "작용가능한 링키지"는 설명된 바와 같이 의도된 방식으로 기능을 하도록, 성분들의 물리적 병치(juxtaposition)를 말한다. 핵산과 작용가능한 링키지에 있는 발현 제어 요소의 예에서, 상관관계는 상기 제어 요소가 상기 핵산의 발현을 조절하는 것이다. 전형적으로, 전사를 조절하는 발현 제어 영역은 전사된 핵산의 5' 단부 (가령, "상류") 부근에 병치되어 있다. 발현 제어 영역은 또한 전사된 서열의 3' 말단(가령, "하류") 또는 전사체 안에(이를 테면, 인트론 안에) 위치될 수도 있다. 발현 제어 요소들은 전사된 서열로부터 일정 거리 (이를 테면, 상기 핵산으로부터 100 내지 500, 500 내지 1000, 2000 내지 5000개, 또는 그 이상의 뉴클레오티드)에 위치할 수 있다. 발현 제어 요소의 특정 예는 프로모터이며, 보통 전사된 서열의 5'에 위치한다. 발현 제어 요소의 또다른 예는 인헨서이며, 전사된 서열의 5' 또는 3' 또는 전사된 서열 안에 위치한다.
일부 발현 제어 영역은 작용가능하도록 연계된 치료 핵산의 조절가능한 발현을 제공한다. 신호 (때로 자극으로도 불림)는 이러한 발현 제어 영역에 작용가능하도록 연계된 치료 핵산의 발현을 증가 또는 감소시킬 수 있다. 신호에 반응하여 발현을 증가시키는 이러한 발현 제어 영역은 대개 유도성(inducible)으로 불린다. 신호에 반응하여 발현을 감소시키는 이러한 발현 제어 영역은 대개 억제성(repressible)으로 불린다. 전형적으로, 이러한 요소들에 의해 부여되는 증가 또는 감소의 양은 존재하는 신호의 양에 비례된다; 신호의 양이 많을수록 발현에서 증가 또는 감소의 폭이 커진다.
다양한 조절가능한 프로모터들은 당분야에 공지되어 있다. 바람직한 유도성 발현 제어 영역은 작은 분자 화학적 화합물로 자극되는 유도성 프로모터가 포함된 것들을 포함한다. 한 구현예에 있어서, 발현 제어 영역은 경구로 운반가능하지만 일반적으로 식품에서는 발견되지 않은 화학물질에 반응성을 가진다. 예를 들면, 특정 예들은 미국 특허 5,989,910; 5,935,934; 6,015,709; 및 6,004,941에서 찾아볼 수 있다.
한 구현예에 있어서, 상기 치료 구조체는 통합 서열을 더 포함한다. 한 구현예에 있어서, 상기 치료 구조체는 단일 통합 서열을 포함한다. 또다른 구현예에 있어서, 상기 치료 구조체는 상기 치료 핵산 또는 이의 일부분을 표적 세포의 게놈에 융합시키기 위하여 제 1 통합 서열과 제 2 통합 서열을 포함한다. 바람직한 구현예에 있어서, 상기 통합 서열(들)은 매리너(mariner), 애기괭이밥(sleeping beauty), FLP, Cre, φC31, R, 람다로 이루어진 그룹에서 선택된 통합용 수단, 그리고 AAV, 레트로바이러스, 및 렌티바이러스와 같은 융합 바이러스로부터 통합시키기 위한 수단과 결합하여 기능을 한다.
한 구현예에 있어서, 해당 조성물은 치료 구조체에 추가하여 비-치료 구조체를 더 포함하는데, 이때 상기 비-치료 구조체는 제 2 발현 제어 영역에 작용가능하도록 연계된 통합을 위한 수단이 인코딩된 핵산 서열을 포함한다. 상기 치료 핵산에 작용가능하도록 연계된 상기 제 2 발현 제어 영역과 발현 제어 영역은 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 통합용 인코드된 수단은 바람직하게는 매리너, 애기괭이밥, FLP, Cre, φC31, R, 람다 그리고 AAV, 레트로바이러스, 및 렌티바이러스와 같은 바이러스 융합을 위한 융합 수단으로 이루어진 그룹에서 선택된다.
추가 교시용으로, 전문이 명세서의 참고 자료에 편입된 WO2008020318을 참고한다. 한 구현예에 있어서, 상기 DD-키토산 핵산 폴리플렉스의 상기 핵산은 인공 핵산이다.
바람직한 인공 핵산은 펩티드 핵산 (PNA), 포스포로디아미데이트 몰포리노 올리고 (PMO), 잠김 핵산 (LNA), 글리콜 핵산 (GNA) 그리고 트레오스 핵산 (TNA)을 포함하나 이에 국한되지 않는다.
한 구현예에 있어서, 상기 DD-키토산 핵산 폴리플렉스의 핵산은 치료 핵산이다. 한 구현예에 있어서, 상기 치료 핵산은 치료 RNA다. 바람직한 치료 RNAs는 안티센스 RNA, siRNA, 짧은 헤어핀 RNA, 마이크로 RNA, 및 효소 RNA을 포함하나 이에 국한되지 않는다.
한 구현예에 있어서, 상기 치료 핵산은 DNA다.
한 구현예에 있어서, 상기 치료 핵산은 치료 단백질이 인코딩된 핵산 서열을 포함한다.
폴리플렉스
바람직한 구현예에 있어서, 상기 조성물의 폴리플렉스는 기능화 이전에 110 kDa 미만, 더욱 바람직하게는 65 kDa 미만, 더욱 바람직하게는 50 kDa 미만, 더욱 바람직하게는 40 kDa 미만, 그리고 가장 바람직하게는 30 kDa 미만의 평균 분자량을 보유한 키토산 분자들을 포함한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 조성물의 폴리플렉스의 폴리플렉스는 기능화 이전에 15 kDa 미만, 10 kDa 미만, 7 kDa 미만, 또는 5 kDa 미만의 평균 분자량을 보유한 키토산을 포함한다.
바람직한 구현예에 있어서, 상기 폴리플렉스는 평균 680 미만의 글루코사민 단량체 유닛, 더욱 바람직하게는 400 미만의 글루코사민 단량체 유닛, 더욱 바람직하게는 310 미만의 글루코사민 단량체 유닛, 더욱 바람직하게는 250 미만의 글루코사민 단량체 유닛, 그리고 가장 바람직하게는 190 미만의 글루코사민 단량체 유닛을 보유하는 키토산 분자들을 포함한다. 일부 구현예들에 있어서, 상기 폴리플렉스는 평균 95 미만의 글루코사민 단량체 유닛, 65 미만의 글루코사민 단량체 유닛, 45 미만의 글루코사민 단량체 유닛, 또는 35 미만의 글루코사민 단량체 유닛을 보유한 키토산 분자들을 포함한다.
바람직한 구현예에 있어서, 해당 폴리플렉스는 아민 대 인산염 (N/P) 의 비율이 2 대 100, 이를 테면, 2 대 50, 이를 테면, 2 대 40, 이를 테면, 2 대 30, 이를 테면, 2 대 20, 이를 테면, 2 대 5를 보유한다. 바람직하게는, 상기 N/P 비율은 상기 키토산의 분자량에 역비례하는데, 가령, 분자량이 더 적을수록 DD-키토산은 더 높은 N/P 비율을 요구하고, 그 역도 성립된다.
바람직한 구현예에 있어서, 해당 폴리플렉스는 1000 nm 미만, 더욱 바람직하게는 500 nm 미만, 그리고 가장 바람직하게는 200 nm 미만의 평균 유체역학적 직경을 보유한다.
한 구현예에 있어서, 상기 DD-키토산 핵산 폴리플렉스는 산성 pH, 이를 테면, pH 7 이하, 가장 바람직하게는 pH 약 4 내지 6에서 최소한 0 mV의 평균 제타 전위(zeta potential)를 보유한다.
한 구현예에 있어서, 상기 DD-키토산 핵산 폴리플렉스는 산성 pH에서 +1 내지 +60 mV, 더욱 바람직하게는 +1 내지 +40 mV, 더욱 바람직하게는 +1 내지 +30 mV의 평균 제타 전위 보유한다.
바람직한 구현예에 있어서, 상기 폴리펩티드는 생리학적 pH 및 6 이하의 pKa에서 낮은 순 양성(net positive), 중성, 또는 순 음성(net negative) 하전을 보유한다. 이러한 DD-키토산 핵산 폴리플렉스는 감소된 세포의 독성 및 핵산의 세포내 강화된 방출을 나타낸다.
상기 DD-키토산 핵산 상기 조성물의 폴리플렉스는 폴리플렉스 크기에 있어서 바람직하게는 균질성이다. 따라서, 바람직한 구현예에 있어서, 상기 조성물은 낮은 평균 다분산 지수 ("PDI")를 보유한다. 특히 바람직한 구현예에 있어서, 상기 DD-키토산 핵산 폴리플렉스 분산은 0.5 미만, 더욱 바람직하게는 0.4 미만, 더욱 바람직하게는 0.3 미만, 그리고 가장 바람직하게는 0.25 미만의 PDI를 갖는다.
해당 조성물의 상기 폴리플렉스는 바람직하게는 상기 조성물에 안정적인 실질적 크기를 갖는다. 바람직한 구현예에 있어서, 본 발명의 조성물은 실온에서 6시간, 더욱 바람직하게는 12 시간, 더욱 바람직하게는 24 시간, 그리고 가장 바람직하게는 48 시간 동안 100% 미만, 더욱 바람직하게는 50% 미만, 그리고 가장 바람직하게는 25% 미만으로 평균 직경이 증가되는 폴리플렉스를 포함한다.
해당 조성물의 상기 폴리플렉스는 바람직하게는 냉동 조건하에서 실질적으로 안정적인 1크기를 갖는다. 바람직한 구현예에 있어서, 본 발명의 조성물은 2℃ ~ 8℃에서 6시간, 더욱 바람직하게는 12 시간, 더욱 바람직하게는 24 시간, 그리고 가장 바람직하게는 48 시간 동안 100% 미만, 더욱 바람직하게는 50% 미만, 그리고 가장 바람직하게는 25% 미만으로 평균 직경이 증가되는 폴리플렉스를 포함한다.
해당 조성물의 상기 폴리플렉스는 바람직하게는 냉동-해동 조건하에서 실질적으로 안정적인 크기를 갖는다 바람직한 구현예에 있어서, 본 발명의 조성물은 -20℃ ~ -80℃에서 냉동에서 해동 후 6시간, 더욱 바람직하게는 12 시간, 더욱 바람직하게는 24 시간, 그리고 가장 바람직하게는 48 시간 동안 100% 미만, 더욱 바람직하게는 50% 미만, 그리고 가장 바람직하게는 25% 미만으로 평균 직경이 증가되는 폴리플렉스를 포함한다.
바람직한 구현예에 있어서, 상기 조성물은 0.5 mg/ml 이상의 핵산 농도를 보유하며, 그리고 침전된 폴리플렉스는 실질적으로 없다. 더욱 바람직하게는, 상기 조성물은 최소한 0.6 mg/ml, 더욱 바람직하게는 최소한 0.75 mg/ml, 더욱 바람직하게는 최소한 1.0 mg/ml, 더욱 바람직하게는 최소한 1.2 mg/ml, and 가장 바람직하게는 최소한 1.5 mg/ml의 핵산 농도를 보유하며, 그리고 침전된 폴리플렉스는 실질적으로 없다. 상기 조성물은 수화되어 있다. 바람직한 구현예에 있어서, 상기 조성물에서 복합체형성안된 핵산은 실질적으로 없다.
바람직한 구현예에 있어서, 상기 DD-키토산 핵산 폴리플렉스 조성물은 등장성(isotonic)이다. 폴리플렉스 안정성이 유지되면서 등장성의 획득은 약학 조성물을 제형화함에 있어서 매우 바람직하고, 그리고 이들 바람직한 조성물은 약학 제제 및 치료 용도에 아주 적합하다.
일반적으로, 상기 DD-키토산 핵산 폴리플렉스가 포함된 조성물은 표적 세포에 접촉되는데 이용된다. 이러한 접촉으로 표적이 되는 세포에 의해 발현되는 핵산이 일반적으로 운반된다. 본 명세서에서 설명된 상기 DD-키토산 핵산 폴리플렉스에 적합한 조성물은 당분야에 공지되어 있고, 일반적으로 아래에서 설명된다.
분말로된 제제( Powerded formulations )
본 발명의 상기 DD-키토산 핵산 폴리플렉스 조성물은 분말을 포함한다. 바람직한 구현예에 있어서, 본 발명은 DD-키토산 핵산 폴리플렉스 건조 분말 조성물을 제공한다. 바람직한 구현예에 있어서, 상기 DD-키토산 핵산 폴리플렉스 건조 분말 조성물은 본 발명의 키토산-핵산 폴리플렉스 분산의 탈수화를 통하여 만들어진다.
약학 제제( Pharmaceutical formulations )
본 발명은 본 발명의 DD-키토산 핵산 폴리플렉스 조성물이 포함된 "약학적으로 수용가능한" 또는 "생리학적으로 수용가능한" 제제를 또한 제공한다. 이러한 제제는 치료 방법을 실행하기 위하여 피험체에게 생체내로 투여될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "약학적으로 수용가능한" 그리고 "생리학적으로 수용가능한"이란 바람직하게는 과도한 부작용 (이를 테면, 메스꺼움, 복부 통증, 두통, 등)없이 피험체에게 투여될 수 있는 운반체, 희석제, 부형제 및 이와 유사한 것들을 지칭한다. 이러한 투여용 조제물은 멸균 수성 또는 비-수성 용액, 현탁액, 및 유액을 포함한다.
약학 제제는 피험체에게 투여될 수 있는 운반체, 희석제, 부형제, 용매, 분산 배지, 코팅, 항균 및 항곰팡이 물질, 등장성 및 흡수 지연 물질, 그리고 이와 유사한 것들로부터 만들어질 수 있다. 이러한 제제는 테블릿 (피복된 또는 피복안된), 캡슐 (경질 또는 연질), 마이크로비드, 유액, 분말, 과립, 결정, 현탁액, 시럽 또는 엘륵시르 안에 포함될 수 있다. 다른 첨가제중에서 보충 활성 화합물들 및 보존제, 예를 들면, 항균, 항산화, 킬레이트 물질, 비활성 기체 및 이와 유사한 것들이 또한 존재할 수 있다.
부형제는 염, 등장성 물질, 혈청 단백질, 완충액 또는 기타 pH-조절제, 항산화제, 증점제, 전하를 안띈 중합체, 보존제 또는 동결방지제를 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물에 이용되는 부형제는 등장성 물질과 완충액 또는 다른 pH-조절제를 더 포함할 수 있다. 이들 부형제는 pH (약 6.0-8.0) 및 삼투성 (약 50-300 mmol/L)의 바람직한 범위 달성을 위하여 추가될 수 있다. 적합한 완충액의 예로는 아세트산염, 붕산염, 탄산염, 구연산염, 인산염 및 술폰산염처리된 유기 분자 완충액이다. 이러한 완충액은 조성물 안에 0.01 내지 1.0% (w/v)의 농도 범위로 존재할 수 있다. 등장성 물질은 당분야에 공지된 임의의 것들, 이를 테면 만니톨, 덱스트로즈, 포도당 그리고 염화나트륨, 또는 기타 전해질과 같은 것들로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 상기 등장성 물질은 포도당 또는 염화나트륨이다. 상기 등장성 물질들은 상기 조성물이 도입되는 생물학적 환경과 동일한 또는 유사한 삼투압을 상기 조성물에게 제공하는 양으로 이용될 수 있다. 상기 조성물 안에 등장성 물질의 농도는 특정 이용되는 특정 등장성 물질의 성질에 따라 달라질 것이며, 그 범위는 약 0.1 내지 10%가 될 수 있다. 포도당이 이용될 때, 1 내지 5% w/v, 더 구체적으로 5% w/v 농도로 이용되는 것이 바람직하다. 상기 등장성 물질이 염화나트륨인 경우, 바람직하게는 최대 1% w/v, 특히 0.9% w/v의 양으로 이용된다. 본 발명의 상기 조성물은 보존제를 더 포함할 수 있다. 예시적인 보존제는 폴리헥사메틸렌-비구아니딘, 염화 벤잘코니움, 안정화된 옥시클로로 복합체 (이를 테면 PuriteR로 공지된 것들과 같은), 페닐머큐리 아세트산염, 클로로부탄올, 소르브산, 클로로헥시딘, 벤질 알코올, 파라벤, 그리고 티메로살이다. 전형적으로, 이러한 보존제는 약 0.001 내지 1.0%의 농도로 존재한다. 더욱이, 본 발명의 상기 조성물은 동결보존제(cryopreservative agent)를 또한 포함할 수 있다. 바람직한 동결보존제는 포도당, 슈크로즈, 만니톨, 락토즈, 트레할로스, 솔비톨, 콜로이드성 이산화규소, 바람직하게는 100,000 g/mol 미만의 분자량을 가진 덱스트란, 글리세롤, 100,000 g/mol 미만의 분자량을 가진 폴리에틸렌 글리콜 또는 이의 혼합물들이다. 포도당, 트레할로스 및 폴리에틸렌 글리콜이 가장 바람직하다. 전형적으로, 이러한 동결보존제는 약 0.01 내지 10%의 농도로 존재한다.
약학 제제는 의도된 투여 경로에 순응되도록 제형화될 수 있다. 예를 들면, 경구 투여를 위하여, 조성물은 부형제와 함께 혼입될 수 있고, 테블릿, 트로키, 캡슐, 이를 테면, 젤라틴 캡슐, 또는 코팅, 이를 테면, 장용피 (Eudragit® 또는 Sureteric®)의 형태로 이용될 수 있다. 약학적으로 양립가능한 결합 물질, 및/또는 어쥬번트 물질들이 경구 제제에 포함될 수 있다. 상기 테블릿, 알약, 캡슐, 트로키 및 이와 유사한 것들은 다음의 성분들 또는 유사한 성질의 화합물들중 임의의 것을 포함할 수 있다: 미소결정 셀롤로오즈, 검 트라가탄 또는 젤라틴과 같은 결합제; 전분 또는 락토즈과 같은 부형제, 알긴산, Primogel, 또는 옥수수 전분과 같은 붕해제; 스테아레이트 마그네슘 또는 Sterotes와 같은 윤활제; 콜로이드성 이산화규소와 같은 활택제(glidant); 슈크로즈 또는 사카린과 같은 감미제; 또는 페퍼민트, 메틸 살리실레이트, 또는 향신료와 같은 풍미제.
제제는 신속한 분해 또는 체내로부터 제거에 대항하여 상기 조성물을 보호하기 위한 운반제, 이를 테면, 임플란트 또는 미소포획된 운반계와 같은 제어된 방출 제제를 또한 포함할 수 있다. 예를 들면, 시간 지연 물질, 이를 테면 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 스테아레이트가 단독으로, 또는 왁스와 복합되어 이용될 수 있다.
좌약 및 기타 직장으로 투여가능한 제제 (이를 테면, 관장에 의해 투여가능한 것들)가 또한 고려된다. 추가적인 직장 운반의 경우는 예를 들면, Song 외., Mucosal drug delivery: membranes, methodologies, and applications, Crit. Rev. Ther. Drug. Carrier Syst., 21:195-256, 2004; Wearley, Recent progress in protein and peptide delivery by noninvasive routes, Crit. Rev. Ther. Drug. Carrier Syst., 8:331-394, 1991을 참고한다.
투여에 적합한 추가 약학 제제는 당분야에 공지되어 있으며, 본 발명의 방법 및 조성물에 적용가능하다(이를 테면, Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) 18th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa.; The Merck Index (1996) 12th ed., Merck Publishing Group, Whitehouse, N.J.; 그리고 Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms, Technonic Publishing Co., Inc., Lancaster, Pa., (1993)) 참고.
투여
한 구현예에 있어서, DD-키토산 핵산 폴리플렉스에서 DD-키토산을 사용하면 생리학적 pH에서 폴리플렉스의 안정성이 연장된다. 이점은 효과적인 전신 투여, 뿐만 아니라 다른 방식의 투여에도 적용된다.
임의의 여러 투여 경로들이 가능하며, 특정 경로의 선택은 상기 표적 조직에 따라 일부 달라질 것이다. 투여를 위하여 주사기, 내시경, 캐뉼라(cannulas), 삽관 튜브, 카테테르 및 다른 물품들이 이용될 수 있다.
피험체를 치료하기 위한 투여분량(doses) 또는 "유효량"은 비록 질환 또는 상태 또는 증상의 진행 또는 악화를 예방 또는 저해시키는 것이 만족스런 결과이기는 하지만, 상태의 증상 중 하나, 일부 또는 전부가 바람직하게는 측정가능한 또는 탐지가능한 정도로 개선시키는데 충분한 양이다. 따라서, 표적 조직에서 치료 핵산을 발현시킴으로써 치료가능한 질환 또는 장애의 경우, 본 발명의 방법에 의해 치료가능한 상태를 개선시키기 위하여 생산되는 치료 RNA 또는 치료 단백질의 양은 상기 상태 및 원하는 결과에 따라 달라질 것이며, 당업자에 의해 용이하게 확인될 수 있다. 적절한 양은 치료될 상태, 원하는 치료 효과, 뿐만 아니라 개별 피험체(이를 테면, 피험체에서의 생물이용성, 성별, 나이, 등.)에 따라 달라질 것이다. 상기 유효량은 관련 생리학적 효과를 측정함으로써 확인될 수 있다.
본 발명에서는 수의학적 용도 또한 고려된다. 따라서, 한 구현예에 있어서, 본 발명은 인간이 아닌 포유류를 치료하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 본 발명의 키토산-기반의 나노입자를 이를 필요로 하는 사람이 아닌 포유류에 투여하는 것을 포함한다.
비경구 투여(Parenteral administration)
본 발명의 화합물들은 혈류, 근육, 내부 장기로 직접 투여될 수 있다. 비경구 투여를 위한 적합한 방법은 정맥, 동맥, 복막, 수막강내, 심실내, 요도내, 흉골내, 두개내(intracranial), 근육내 그리고 피하내 투여를 포함한다. 비경구 투여를 위한 적합한 장비는 바늘(미세바늘 포함) 주사기(injectors), 바늘-없는 주사기 및 주입 기술을 포함한다.
비경구 제제는 염, 탄수화물, 완충 물질과 같은 부형제가 포함된 일반적으로 수성 용액이지만, 일부 용도에서 멸균 비-수성 용액으로, 또는 멸균, 발열원-없는 물과 같은 적합한 비이클과 병용되는 건조된 형태로 좀더 적합하게 제형화될 수 있다.
멸균 상태 하에서 예를 들면, 동결건조(lyophilisation)에 의한 비경구 제제의 제조는 당분야에 공지된 표준 약학 기술을 이용하여 용이하게 실행될 수 있다.
비경구 용액의 제조에 이용되는 화합물들의 용해도는 예를 들면, 용해도-증강 물질의 혼입과 같이 적절한 제제 기술을 이용하여 증가될 수 있다.
비경구 투여용 제제는 즉각적 및/또는 변형된 방출이 되도록 제제화될 수 있다. 변형된 방출 제제는 지연된(delayed)-방출, 지속된(sustained)-방출, 펄스형(pulsed)-방출, 제어형(controlled)-방출, 표적화된(targeted)-방출 그리고 예정된(programmed)-방출을 포함한다. 따라서, 본 발명의 화합물들은 활성 화합물의 변형된 방출을 제공하는 이식된 데포우(depot)와 같이 투여용 고형, 반-고형 또는 요변성(thixotropic) 액체로 제제화될 수 있다.
경구 투여(Oral administration)
해당 조성물은 경구로 투여될 수 있다. 경구 투여는 삼키는 것을 포함하는데, 상기 화합물은 위장 관으로 유입된다. 본 발명의 조성물은 위장관에 직접적으로 투여될 수도 있다.
경구 투여에 적합한 제제는 과립 또는 피복된 과립, 액체 또는 분말이 포함된 테블릿, 캡슐, 피복된 캡슐과 같은 고형 제제, 당의정(lozenges)(액체가 충전된 것을 포함), 씹는 형태(chews), 다중- 및 나노미립자, 겔, 필름, 난형제(ovules), 및 스프레이를 포함한다.
액체 제제는 현탁액, 용액, 시럽 및 엘륵시르를 포함한다. 액체 제제는 고체의 복원에 의해 준비될 수 있다.
테블릿 투약형(dosage forms)은 일반적으로 붕해제(disintegrant)를 포함한다. 붕해제의 예로는 전분 글리콜레이트 나트륨, 카르복시메틸 셀롤로오즈 나트륨, 카르복시메틸 셀롤로오즈 칼슘, 크로스카르멜로스 나트륨, 크로스포비돈, 폴리비닐피롤리돈, 메틸 셀롤로오즈, 미소결정 셀롤로오즈, 저가 알킬-치환된 히드록시프로필 셀롤로오즈, 전분, 전-젤라틴화된 전분 및 알긴산 나트륨을 포함한다. 일반적으로, 상기 붕해제는 상기 투약형의 1 중량 % 내지 25 중량 %, 바람직하게는 5 중량 % 내지 20 중량 %를 포함할 수 있다.
테블릿 제제에 점착성질을 부여하는데 결합제들이 일반적으로 이용된다. 적합한 결합제들은 미소결정 셀롤로오즈, 젤라틴, 슈가, 폴리에틸렌 글리콜, 천연 및 합성 검, 폴리비닐피롤리돈, 전-젤라틴화된 전분, 히드록시프로필셀롤로오즈 그리고 히드록시프로필 메틸셀롤로오즈를 포함한다. 테블릿은 희석제, 이를 테면 락토즈 (1수화물, 분무-건조된 1수화물, 무수물 및 이와 유사한 것들), 만니톨, 크실리톨, 덱스트로즈, 슈크로즈, 솔비톨, 미소결정 셀롤로오즈, 전분 및 이염기성 인산칼슘 이수화물을 또한 포함할 수 있다.
테블릿은 임의선택적으로 표면 활성 물질, 이를 테면, 라우릴 설페이트 나트륨 및 폴리소르베이트 80, 그리고 활택제, 이를 테면, 이산화규소 및 활석을 또한 포함할 수 있다. 존재한다면, 표면 활성 물질은 상기 테블릿의 0.2 중량 % 내지 5 중량 %를 포함할 수 있고, 상기 활택제는 상기 테블릿의 0.2 중량 % 내지 1 중량 %를 포함할 수 있다.
테블릿은 또한 일반적으로 스테아레이트 마그네슘, 스테아레이트 칼슘, 스테아레이트 아연, 스테아릴 퓨마레이트 나트륨, 스테아레이트 마그네슘과 라우릴 설페이트 나트륨의 혼합물과 같은 윤활제를 포함한다. 윤활제는 일반적으로 상기 테블릿의 0.25 중량 % 내지 10 중량 %, 바람직하게는 0.5 중량 % 내지 3 중량 %를 포함한다.
기타 가능한 성분들은 항-산화제, 발색제, 풍미제, 보존제 및 미각 차폐제(taste-masking agent)를 포함한다.
테블릿 혼합물(blends)은 직접 또는 롤러를 이용하여 압착시켜 테블릿이 형성된다. 테블릿 혼합물 또는 혼합물의 일부분들은 테블릿화되기에 앞서 대안으로 습식-, 건식- 또는 용융 과립모양화된, 용융 응결(melt congealed) 또는 압출될 수 있다. 상기 최종 제제는 하나 또는 그 이상의 층을 포함할 수 있고, 피복되거나 피복되지 않을 수 있으며; 피포(encapsulated)화될 수도 있다.
테블릿의 제제는 Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Vol. 1, by H. Lieberman and L. Lachman (Marcel Dekker, New York, 1980)에서 논의된다.
인간 또는 수의학적으로 사용되는 소비가능한 경구 필름은 유연성있는 물-용해가능한 또는 물-팽창가능한, 신속하게 용해되거나 또는 점막흡착성이 있는 박판형이며, 그리고 일반적으로 필름-형성 중합체, 결합제, 용매, 습윤제, 가소제, 안정화제, 유화제, 점성-변형제 및 용매를 포함한다. 상기 제제의 일부 성분은 하나 이상의 기능을 수행할 수 있다.
본 발명에는 본 발명의 조성물이 포함된 다중미립자형 비드가 또한 포함된다.
기타 가능한 성분은 항-산화제, 발색제, 풍미제, 풍미 강화제, 보존제, 침색 자극 물질, 냉각 물질, 공-용매(오일 포함), 완화제, 벌커제, 항-포말제, 계면활성제, 그리고 미각 차폐제를 포함한다.
본 발명에 따른 필름은 일반적으로 벗겨낼 수 있는 받침층 또는 종이 위에서 피복된 수성 박판을 증발 건조시켜 만든다. 건조 오븐 또는 터널(tunnel), 일반적으로 복합 코팅 건조기, 또는 냉동-건조 또는 진공에 의해 실행될 수 있다.
경구 투여용 고형 제제는 즉각 및/또는 변형된 방출을 위하여 제제화될 수 있다. 변형된 방출 제제는 지연된 방출, 지속된 방출, 펄스형 방출, 제어형 방출, 표적화된 방출 그리고 예정된 방출을 포함한다.
기타 적합한 방출 기술, 이를 테면 고에너지 분산 및 삼투 그리고 피복된 미립자등이 공지되어 있다.
국소 투여(Topical administration)
본 발명의 상기 화합물들은 피부 또는 경피를 통하여 피부 또는 점막에 국소적으로 투여될 수 있다. 이 목적을 위한 전형적인 제제는 겔, 히드로겔, 로션, 용액, 크림, 연고, 산포제(dusting powder), 드레싱, 포말(foams), 필름, 피부 패취, 웨이퍼(wafers), 임플란트, 스폰지, 섬유, 밴드 및 마이크로유액을 포함한다.
국소 투여를 위한 기타 수단은 전기천공, 전리요법, 음파영동(phonophoresis), 초음파영동(sonophoresis) 및 미세바늘 또는 바늘-없는 주사기(이를 테면 PowderjectTM, BiojectTM, 등)을 포함한다.
국소 투여용 제제는 즉각 및/또는 변형된 방출을 위하여 제제화될 수 있다. 변형된 방출 제제는 지연된 방출, 지속된 방출, 펄스형 방출, 제어형 방출, 표적화된 방출 그리고 예정된 방출을 포함한다.
흡입/비강 투여(Inhaled/Intranasal administration)
본 발명의 화합물들은 건조 분말 흡입기로부터 건조 분말 형태 (단독으로 또는 혼합물, 예를 들면, 락토즈와 함께 건조 혼합물, 또는 혼합된 분말 입자)로 또는 적합한 추진체와 함께 또는 추진체 없이 가압된 용기, 펌프, 스프레이, 분무기(atomiser), 또는 네뷸라이져(nebuliser)로부터 에어로졸 스프레이 형태로 비강 또는 흡입에 의해 투여될 수 있다.
흡입기(inhaler) 또는 살포기(insufflator)에 사용하기 위한 캡슐, 블리스터 및 카트릿지는 본 발명의 화합물, 락토즈 또는 전분과 같은 적절한 분말 베이스 그리고 I-류신, 만니톨, 또는 스테아레이트 마그네슘과 같은 성능 변형제의 분말 믹스를 포함하도록 제제화될 수 있다.
흡입/비강 투여용 제제는 즉각 및/또는 변형된 방출을 위하여 제제화될 수 있다. 변형된 방출 제제는 지연된 방출, 지속된 방출, 펄스형 방출, 제어형 방출, 표적화된 방출 그리고 예정된 방출을 포함한다.
직장/질내 투여(Rectal/Intravaginal administration)
본 발명의 상기 화합물들은 좌약, 질좌약(pessary), 또는 관자제의 형태로 직장 또는 질 안으로 투여될 수 있다. 코코아 버터가 전통적인 좌약 베이스이지만 적합한 경우 다양한 대체물이 이용될 수 있다.
직장/질내 투여용 제제는 즉각 및/또는 변형된 방출을 위하여 제제화될 수 있다. 변형된 방출 제제는 지연된 방출, 지속된 방출, 펄스형 방출, 제어형 방출, 표적화된 방출 그리고 예정된 방출을 포함한다.
안구/귀 투여(Ocular/Aural administration)
본 발명의 상기 화합물은 일반적으로 드롭(drop) 형태로 눈 또는 귀로 직접 투여될 수 있다. 눈 및 귀 투여에 적합한 다른 제제는 연고, 생분해가능한(이를 테면 흡수가능한 겔 스폰지, 콜라겐) 및 생분해불가능한(이를 테면, 실리콘) 임플란트, 와이퍼, 렌즈 및 미립자 시스템을 포함한다. 제제는 또한 전리요법에 의해 운반될 수 있다.
안구/귀 투여용 제제는 즉각 및/또는 변형된 방출을 위하여 제제화될 수 있다. 변형된 방출 제제는 지연된 방출, 지속된 방출, 펄스형 방출, 제어형 방출, 표적화된 방출 그리고 예정된 방출을 포함한다.
사용 방법
한 구현예에 있어서, 본 발명의 DD-키토산 핵산 폴리플렉스 조성물은 치료요법적 처치에 이용될 수 있다. 이러한 조성물을 본 명세서에서 치료 조성물로 불리기도 한다.
하기에서 논의된 바와 같이, 본 발명의 치료 단백질은 치료 핵산이 포함된 본 발명의 폴리플렉스에 의해 만들어진다. 하기에서 설명된 것과 같이 해당 단백질의 용도는 이러한 단백질 용도에 영향을 주는 해당 폴리플렉스의 용도로 지칭된다.
본 발명에서 사용이 고려되는 치료 단백질은 광범위한 활성을 보유하며, 다양한 질환의 치료에 용도를 갖는다. 다음의 치료 단백질 활성에 대한 설명 및 본 발명의 치료 단백질로 치료가능한 징후는 예를 든 것이며, 이 목록은 하나도 빠짐없이 만들어진 것은 아니다. 용어 "피험체(subject)"는 동물을 말하는 것이며, 포유류가 바람직하며, 특히 사람이 바람직하다.
일부 치료 단백질 및 표적 질환들은 표 1에서 열거된다.
선도 화합물 표적 질병 기능 치료 효과
인슐린 당뇨병 인슐린 대체 내당능 증진
당뇨병 지연/예방
글루카곤 길항제 당뇨병 내인 포도당 생성 감소 내당능 증진
GLP-1 당뇨병
비만		 β-세포 성장 모의, 인슐린 민감성 증진, 식욕 억제 내당능 증진
체중 감소 유발
렙틴 비만
당뇨병		 식욕 억제 및 인슐린 민감성 증진 체중 감소 유발
내당능 증진
CCK 비만 식욕 억제 체중 감소 유발
성장 호르몬 (GH) 성장 호르몬 결핍,
소모 및 항노화		 성장 호르몬 대체 성장 증진
응고 인자 혈우병 응고 인자 대체 응고 시간 향상
치료 항체 및 항체 단편/부분 감염
암		 병원체 중화 또는 면역 조절 감염 또는 이식 거부 예방
염증 억제제, 예를 들어, IL-10, TNFα, 길항제, IL-17 길항제 위장 기관 염증; 예를 들어, 염증성 장 질환(IBD) 면역 조절 위장 기관 염증 예방
또다른 구현예에 있어서, 본 발명의 치료 조성물은 치료 단백질, 이를 테면, 치료 RNAs을 인코드하지 않은 치료 핵산을 포함한다. 예를 들면, 질환의 기전 및/또는 바람직하지 못한 세포의 기전 또는 생리학적 상태의 기전에 관련된 유전자를 표적으로 하는 치료 RNAs를 선택함으로써, 해당 조성물은 광범위한 질환 및 상태의 치료에 이용될 수 있다. 해당 조성물은 이용되는 상기 치료 RNAs가 표적 선별 범위에 있어서 제한되지 않는 특성을 갖는다. 따라서, 해당 조성물은 적합한 표적에 관련된 임의의 질환 또는 상태에 용도를 찾는다.
바람직한 조직, 질환들, 및 상태가 하기에 포함되지만, 이는 예를 든 것이며, 이에 제한되지 않는다:
표적 기관 표적 질병
위장 기관 당뇨병
비만
영증성 장 질환
과민성 장 증후군
위장 감염
소화 궤양
위식도 역류
위마비
치질
영양소 흡수장애
위장암 (결장직장, 췌장, 위, 식도, 담관, 담당 암)
췌장염
혈색소증
복강병
식품 알레르기
면역 내성 유도
눈 황반 변성
나이관련 황반 변성
포도막염
색소성 망막염
홍채염
공막염
녹내장
각막염
망막병
눈 감염 (예를 들어, 각막진균증)
자궁, 질, 난소 및 자궁경부 암
감염
자궁내막증
자궁경부염
비뇨기 통증
용종
자궁근종
자궁내막 증식증
방광 및 요로 요실금
방광 및 요로 감염
과활동성 방광
발기 부전
당뇨신경병증
신장 당뇨병성신장증
막성신증
고혈압
신장암
고혈압
다낭성 신종
사구체신염
간 이상지질형증/과콜레스테롤혈증
당뇨병
대사증후군
간암
A형, B형, C형 간염
혈색소증
간경화증
지방간염
당원축적병
피부 건선
여드름
장미증
육아종성 피부염
항-주름
탈색소
폐 / 호흡기관 폐암
만성 폐쇄성 폐질환
기도감염
낭성섬유증
폐혈관 질환
중증 근무력증
섬유증
천식
뇌 헌팅턴병
알츠하이머병
파킨슨병
뇌암
비만
신경 장애
혈액 세포 암
감염 질환
자가면역 질환
근육 대사 증후군
죽상동맥경화증
당뇨병
육종
염증 (예를 들어, 다근염)
당원축적병
근질환
심장 심근경색
죽상동맥경화증
협심증
심근병증
국소 빈혈
고혈압성 심장병
혈전증
동맥류
지방성 당뇨병
비만
대사 증후군
죽상동맥경화증
이상지질혈증
고혈당증 및 체질량(Hyperglycemia and Body Mass)
치료 단백질은 인슐린 및 인슐린 유사체들을 포함한다. 진성 당뇨병 diabetes mellitus)은 췌장 β-세포로부터 인슐린 생산이 없거나(유형 1) 또는 불충분한(유형 2) 생산으로 인하여 야기되는 쇠약성 대사 질환이다 (Unger, R.H. 외., Williams Textbook of Endocrinology Saunders, Philadelphia (1998)). 베타-세포는 식사 후 방출을 위한 인슐린을 제조 및 저장하도록 특화된 내분비 세포들이고,(Rhodes, et. al. J. Cell Biol. 105:145(1987)), 인슐린은 혈액으로부터 포도당을 필요로 하는 조직으로 포도당의 운반을 촉진시키는 호르몬이다. 당뇨 환자는 반드시 혈당 수준을 빈번하게 점검하고, 많은 환자들은 생존을 위하여 매일 인슐린 주사를 여러차례 맞아야 한다. 그러나, 이러한 환자들중에서 인슐린 주사에 의해 이상적인 포도당 수준에 도달되는 환자는 거의 드물다(Turner, R. C., 외. JAMA 281:2005(1999)). 더욱이, 인슐린 수준의 장기간 상승은 저혈당 쇼크 및 인슐린에 대한 신체의 둔감화와 같은 부작용을 초래할 수 있다. 결과적으로, 당뇨 환자들에서 장기적 여병, 가령, 심혈관 질환들, 신장 질환, 시력상실, 신경 손상 및 상처 치료 장애(UK Prospective Diabetes Study (UKPDS) Group, Lancet 352, 837 (1998))가 여전히 발생된다.
본 발명의 방법에 의해 치료가능한 장애들은 인슐린-의존적 (유형 1) 또는 인슐린-독립적(유형 2) 당뇨병과 같은 과혈당 상태, 뿐만 아니라 과혈당 상태와 연합된 또는 과혈당 상태로 인한 생리학적 상태 또는 장애들이 포함된다. 따라서, 본 발명의 방법에 의해 치료가능한 과혈당 상태는 만성 또는 급성 고혈당증(이를 테면, 당뇨병)과 연합된 조직 병리학적 변화를 또한 포함한다. 구체적인 예로는 췌장의 퇴화(β-세포 파괴), 신장 세관 석회화, 간의 퇴화, 눈 손상(당뇨성 망막병증), 당뇨성 발, 입 및 잇몸과 같은 점막의 궤양, 과다 출혈, 혈액 응고 지연 또는 상처 치유 지연, 그리고 관상 심장 질환 위험 증가, 뇌졸중, 말초 혈관 질환, 이상지혈증, 고혈압 및 비만을 포함한다.
해당 조성물은 포도당을 감소시키고, 포도당 내성을 개선시키고, 과혈당 상태(이를 테면, 당뇨병)를 치료하거나 또는 과혈당 상태와 연합된 또는 과혈당 상태로 인한 생리학적 장애를 치료하는데 유용하다. 이러한 장애는 예를 들면, 당뇨성 신경병증 (자율신경성), 신장 장애 (신장 손상), 피부 감염 및 기타 피부 장애, 손상 또는 상처의 느린 또는 지연된 치유 (이를 테면, 당뇨성 화농성 염증(carbuncles)으로 이어짐), 시력상실로 이어질 수 있는 눈 손상 (망막병증, 백내장), 당뇨성 발 그리고 가속화된 치주염을 포함한다. 이러한 장애들은 관상 심장 질환, 뇌졸중, 말초 혈관 질환, 이상지혈증, 고혈압 및 비만의 발생 위험 증가를 또한 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 피험체의 상태와 관련되어 이용된 용어 "과혈당의" 또는 "고혈당증"은 피험체의 혈액 안에 존재하는 포도당 수준이 일시적 또는 만성적으로 비정상적으로 높은 상태를 말한다. 상기 상태는 포도당 대사 또는 흡수가 지연되어, 상기 피험체는 정상적인 피험체에서는 일반적으로 발견되지 않는 포도당 과민 또는 상승된 수준의 포도당을 나타냄으로써 야기될 수 있다(이를 테면, 당뇨병이 발생될 위험에 처한 포도당 민감성 준당뇨 환자, 또는 당뇨 환자). 정상 혈당의 공복 혈장 포도당 (FPG) 수준은 약 110 mg/dl 미만이며, 손상된 포도당 대사의 경우는 약 110 내지 126 mg/dl이며, 그리고 당뇨병 경우는 약 126 mg/dl이상이다.
장 점막 조직에서 단백질을 생산함으로써 치료가능한 장애는 비만 또는 바람직하지 못한 체질량을 또한 포함한다. 렙틴, 콜레시스토키닌, PYY 및 GLP-1은 배고픔을 감소시키고, 에너지 소비를 증가시키고, 체중 감소를 유도하거나 또는 정상적인 포도당 항상성을 제공한다. 따라서, 다양한 구현예들에 있어서, 비만 또는 바람직하지 못한 체질량, 또는 고혈당증을 치료하기 위한 본 발명의 방법은 렙틴, 콜레시스토키닌, PYY 또는 GLP-1을 인코드하는 치료 핵산의 이용을 포함한다. 또다른 구현예에 있어서, 그렐린(ghrelin)을 표적으로 하는 치료 RNA가 이용된다. 그렐린은 식욕 및 배고픔을 증가시킨다. 따라서, 다양한 구현예들에 있어서, 비만 또는 바람직하지 못한 체질량, 또는 고혈당증을 치료하기 위한 본 발명의 방법은 그렐린의 발현을 감소시키기 위하여 이를 표적으로 하는 치료 RNA의 이용과 관련된다. 치료가능한 장애는 일반적으로 비만과 관련된 것들, 예를 들면, 비정상적으로 상승된 혈청/혈장 LDL, VLDL, 트리글리세리드, 콜레스테롤, 혈관을 좁아지게 하거나 또는 차단시키는 플락 형성, 고혈압/뇌졸중, 관상 심장 질환, 등을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "살 찐" 또는 "비만"은 나이 및 성별에 맞는 정상적인 개체와 비교하여 체질량이 최소한 30% 증가된 피험체를 말한다. "바람직하지 못한 체질량"은 필적되는 정상 피험체보다 1%-29% 많은 체질량을 가진 피험체 뿐만 아니라 체질량은 정상이지만, 이들의 체질량을 증가 또는 감소시키기를 원하는 피험체를 지칭한다.
한 구현예에 있어서, 본 발명의 치료 단백질은 글루카곤 길항제다. 글루카곤은 췌장 섬에서 β-세포에 의해 만들어지는 펩티드 호르몬이며, 포도당 대사의 주요 조절물질이다. (Unger R. H. & Orci L. N. Eng. J. Med. 304:1518(1981); Unger R. H. Diabetes 25:136 (1976)). 인슐린과 마찬가지로, 혈당 농도는 글루카곤 분비를 조정한다. 그러나, 인슐린과 대조적으로 글루카곤은 혈당의 감소에 반응하여 분비된다. 따라서, 글루카곤의 순환 농도는 공복 기간에 최대가 되며, 식사 중에 최저가 된다. 글루카곤 수준이 증가되어 포도당 저장을 촉진시키는 인슐린을 감축시키고, 간을 자극하여 포도당을 혈액으로 방출시킨다. 글루카곤 길항제의 특정 예는 [des-His1, des-Phe6, Glu9]글루카곤-NH2이다. 스트렙토조토신 당뇨성 렛의 경우, 혈당 수준은 글루카곤 길항제의 정맥 볼루스(0.75 ㎍/g 체중량) 후 15분 이내에 37% 낮아졌다 (Van Tine B. A. et. al. Endocrinology 137:3316 (1996)). 또다른 구현예에 있어서, 본 발명은 당뇨병 또는 고혈당증을 치료하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 췌장으로부터 글루카곤 생산 수준을 감소시키는 치료 RNA의 사용을 포함한다.
또다른 구현예에 있어서, 과혈당 상태 또는 바람직하지 못한 체질량 (이를 테면, 비만)을 치료하는데 유용한 본 발명의 치료 단백질은 글루카곤-유사 펩티드-1 (GLP-1)다. GLP-1은 식사하는 동안 내장에 있는 L-세포로부터 방출되는 호르몬으로써, 췌장 β-세포를 자극하여 인슐린 분비를 증가시킨다. GLP-1은 비만 및 당뇨병을 치료하기 위하여 이를 흥미로운 치료 물질로 만드는 추가 활성을 보유한다. 예를 들면, GLP-1은 위 배출(gastric emptying)을 감소시키고, 식욕을 억제하고, 글루카곤 농도를 감소시키고, β-세포 물질을 증가시키고, 포도당-의존적 방식으로 인슐린 생합성 및 분비를 자극하고, 그리고 인슐린에 대한 조직 민감성을 적당하게 증가시킨다 (Kieffer T. J., Habener J. F. Endocrin. Rev. 20:876 (2000)). 따라서, 식사와 함께 장에서 GLP-1의 조절된 방출은 과혈당 상태 또는 바람직하지 못한 체질량에 대하여 유익한 치료를 제공할 수 있다. 디펩티딜 펩티데이트 IV (DPP IV)에 저항성인 GLP-1 유사체들은 더 오랜 작용 기간 및 개선된 치료 가치를 제공한다. 따라서, GLP-1 유사체들은 바람직한 치료 폴리펩티드다. 또다른 구현예에 있어서, 본 발명은 당뇨병 또는 고혈당증을 치료하는 방법을 제공하는데, DPP IV의 수준을 감소시키기 위하여 치료 RNA의 사용을 포함한다.
또다른 구현예에 있어서, 과혈당 상태를 치료하는데 유용한 본 발명의 치료 단백질은 호르몬 레지스틴(resistin)에 대한 길항제다. 레지스틴은 지방세포로부터 유도된 인자로써, 식이요법에 의해 유도된 그리고 유전적 비만 형태에서 이의 발현이 상승된다. 순환 레지스틴의 중화는 비만 마우스에서 혈당 및 인슐린 작용을 개선시킨다. 역으로, 정상적인 마우스에게 레지스틴을 투여하면 포도당 내성 및 인슐린 작용이 손상된다 (Steppan CM et. al. Nature 409:307 (2001)). 따라서, 장에서 레지스틴의 생물학적 효과를 길항하는 단백질의 생산은 비만-연계된 인슐린 저항성 및 과혈당 상태에 대한 효과적인 치료법을 제공할 수 있다. 또다른 구현예에 있어서, 본 발명은 당뇨병 또는 고혈당증을 치료하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 지방 조직에서 레지스틴 발현 수준을 감소시키기 위하여 치료 RNA의 사용을 포함한다 .
또다른 구현예에 있어서, 과혈당 상태 또는 바람직하지 못한 체질량 (이를 테면, 비만)을 치료하는데 유용한 본 발명의 치료 폴리펩티드는 렙틴이다. 주로 함지방세포(adipocyte)에서 생산되지만, 렙틴은 위에서 음식물에 의존적인 방식으로 소량 생산된다. 렙틴은 지방 세포 대사와 체질량에 대한 정보를 음식 섭취를 줄이라는 신호를 보내고(포만감을 조장하고), 신체 에너지 소비를 증가시키게 하는 뇌의 식욕 중추에 전달한다.
또다른 구현예에 있어서, 과혈당 상태 또는 바람직하지 못한 체질량 (이를 테면, 비만)을 치료하는데 유용한 본 발명의 치료 폴리펩티드는 함지방세포 상보성-관련된 단백질 (Acrp30)의 C-말단 구형 머리 도메인(C-terminal globular head domain)이다. Acrp30은 분화된 함지방세포에 의해 생산되는 단백질이다. 구형 머리 도메인으로 이루어진 Acrp30의 단백질 분해성 절단 산물을 마우스에게 투여하면 상당한 체중 감소가 유도된다 (Fruebis J. 외., Proc. NatL Acad. Sci USA 98:2005 (2001)).
또다른 구현예에 있어서, 과혈당 상태 또는 바람직하지 못한 체질량 (이를 테면, 비만)을 치료하는데 유용한 본 발명의 치료 폴리펩티드는 콜레시스토키닌 (CCK)이다. CCK는 장에서 특정 영양분에 반응하여 내장에서 분비되는 위장 펩티드다. CCK 방출은 섭취된 음식물의 양에 비례되며, 식사를 끝내라는 신호를 뇌에게 보내는 것으로 보고있다(Schwartz M. W. et. al. Nature 404:661-71(2000)). 결과적으로, 상승된 CCK는 음식 양을 감소시킬 수 있고, 체중 감소 또는 체량 안정화를 촉진시킬 수 있다(가령, 체중 증가를 예방 또는 저해).
PYY의 경우, 예를 들면 le Roux 외., Proc Nutr Soc. 2005 May; 64(2):213-6를 참고한다.
면역학적 장애(Immunological disorder)
한 구현예에 있어서, 본 발명의 치료 조성물은 면역조절 활성을 보유한다. 예를 들면, 본 발명의 치료 폴리펩티드는 면역 세포의 증식, 분화 또는 이동(화학주성)을 활성화 또는 억제시킴으로써, 면역계의 결핍 또는 장애를 치료하는데 유용할 수 있다. 면역 세포는 혈액생성 과정, 다능성 줄기 세포로부터 골수(혈소판, 적혈구, 호중구 및 대식세포) 그리고 임파구(B 및 T 임파세포) 세포의 생산을 통하여 발생된다. 이러한 면역 결핍 또는 장애의 병리는 후천적(이를 테면 화학요법 또는 독소에 의해), 또는 감염에 의한 유전적, 체세포, 가령, 암 또는 일부 자가면역 장애일 수 있다.
본 발명의 치료 조성물은 조혈 세포의 결핍 또는 장애의 치료에 유용할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 치료 폴리펩티드는 특정 (또는 많은) 유형의 조혈 세포의 감소와 연합된 이들 장애를 치료하기 위한 시도에서 다능성 줄기 세포가 포함된 조혈 세포의 분화 또는 증식을 증가시키는데 이용될 수 있다. 면역학적 결핍 증후군의 예로는 다음을 포함하나 이에 국한되지 않는다: 혈액 단백질 장애 (이를 테면 무감마글로블린혈증, 면역글로블린 이상증), 혈관확장성 운동실조증, 통상적인 가변적 면역결핍(common variable immunodeficiency), 디죠지 증후군(Digeorge Syndrome), HIV 감염, HTLV-BLV 감염, 백혈구 부착 결핍증후군, 림프구감소증, 식세포 살균 기능이상(phagocyte bactericidal dysfunction), 심각한 복합 면역결핍 (SCIDs), 비스코트-올드리치 장애(Wiskott-Aldrich Disorder), 빈혈, 혈소판감소증, 또는 혈색소뇨증.
본 발명의 치료 조성물은 자가면역 장애를 치료하는데 또한 유용할 수 있다. 많은 자가면역 장애는 면역 세포가 자신을 외부 물질로 오인하여 발생된다. 이러한 부적절한 인지는 숙주 조직의 파괴로 이어지는 면역 반응을 초래한다. 따라서, 면역 반응, 구체적으로 T 세포의 증식, 분화, 화학주성을 저해시키는 본 발명의 치료 조성물의 투여는 자가면역 장애를 예방하는 효과적인 치료법이 될 수 있다.
본 발명에 의해 치료될 수 있는 자가면역 장애의 예로는 다음을 포함하나 이에 국한되지 않는다: 애디슨 질환(Addison Disease), 용혈성 빈혈, 항인지질 증후근, 류마티스 관절염, 피부염, 알레르기성 뇌척수염, 사구체신염, 굿포스터 증후군(Goodpasture's Syndrome), 그래이브(Graves) 질환, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 신경염, 안염, 수포성 유천포창(Bullous Pemphigoid), 수포창(Pemphigus), 다발성내분비장애(Polyendocrinopathies), 자반병, 라이터(Reiter) 질환, 강직-인간 증후군(Stiff-Man Syndrome), 자가면역 갑상선염, 전신 홍반성 낭창, 자가면역 폐 염증, 길랑-바레 증후군(Guillain-Barre Syndrome), 인슐린-의존성 진성 당뇨병, 크론(Crohn) 질환, 궤양성 결장염 및 자가면역 염증성 안 질환.
유사하게 알레르기 반응 및 상태, 가령 천식 (구체적으로 알레르기성 천식) 또는 기타 호흡 곤란 등이 본 발명의 치료 조성물에 의해 치료될 수 있다. 더욱이, 이들 분자는 항원성 분자에 대한 과다민감성, 과민증(anaphylaxis), 또는 혈액 군 불일치(incompatibility)를 치료하는데 이용될 수 있다.
본 발명의 치료 조성물은 장기 거부 또는 이식편-대-숙주 질환 (GVHD)을 치료 및/또는 예방하는데 또한 이용될 수 있다. 장기 거부는 면역 반응을 통하여 이식된 조직을 숙주 면역 세포가 파괴함으로써 발생된다. 유사하게, 면역 반응은 GVHD에 또한 관련되지만, 이 경우 외부 이식된 면역 세포는 숙주 조직을 파괴한다. 면역 반응, 구체적으로 T 세포의 증식, 분화, 화학주성을 저해시키는 본 발명의 치료 조성물의 투여는 장기 거부 또는 GVHD를 예방하는 효과적인 치료법이 될 수 있다.
유사하게, 본 발명의 치료 조성물은 염증을 조정하는데 또한 이용될 수 있다. 예를 들면, 상기 치료 폴리펩티드는 염증 반응에 관련된 세포의 증식 및 분화를 저해시킬 수 있다. 이들 분자는 감염과 연합된 염증 (이를 테면 폐혈증 쇼크, 폐혈증, 또는 전신 염증성 반응 증후군(SIRS)), 허혈-재관류 손상, 내독소 치사, 관절염, 췌장염, 보체-중개된 초급성 거부, 신장염, 사이토킨 및 케모킨 유도된 폐 손상, 염증성 장 질환(IBD), 크론 질환, 또는 사이토킨(이를 테면 TNF 또는 IL-1)의 과다 생산으로 야기된 것들을 포함하는 만성 및 급성 상태의 염증을 치료하는데 이용될 수 있다. 한 구현예에 있어서, TNFα에 대항하는 표적된 RNA 치료는 염증을 치료하기 위하여 해당 조성물에 이용된다. 또다른 바람직한 구현예에서, IL-1에 대항하는 표적된 RNA 치료는 염증을 치료하기 위하여 해당 조성물에 이용된다. siRNA 치료 RNAs가 특히 바람직하다. 본 발명에서 치료 관심 피험체가 되는 염증성 장애는 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD), 간질성 방광염(interstitial cystitis) 및 염증성 장 질환을 포함하나 이에 국한되지 않는다.
응고 장애( Clotting disorders )
일부 구현예들에 있어서, 본 발명의 치료 조성물은 지혈 (출혈의 중단) 또는 혈전용해성 활성 (응고 형성)을 조절하는데 또한 이용될 수 있다. 예를 들면, 지혈 또는 혈전용해성 활성을 증가시킴으로써, 본 발명의 치료 조성물은 혈액 응결 장애 (이를 테면 무섬유소원혈증, 인자 결핍), 혈액 혈소판 장애 (이를 테면 혈소판감소증), 또는 외상, 수술 또는 다른 원인에 의해서 발생된 상처를 치료하는데 이용될 수 있다. 대안으로, 지혈 또는 혈전용해성 활성을 감소시킬 수 있는 본 발명의 치료 조성물은 응고를 저해 또는 용해시키는데 이용될 수 있다. 이들 치료 조성물은 심장 마비(경색), 뇌졸중, 또는 흉터의 치료에 중요할 것이다. 한 구현예에 있어서, 본 발명의 치료 폴리펩티드는 혈우병 또는 기타 응결/응고 장애 (이를 테면, Factor VIII, IX 또는 X)의 치료에 유용한 응고인자다.
과다증식성 장애( Hyperproliferative disorders )
한 구현예에 있어서, 본 발명의 치료 조성물은 세포 증식을 조절할 수 있다. 이러한 치료 폴리펩티드는 신생물(neoplasms)이 포함된 과다증식성 장애를 치료하는데 이용될 수 있다.
본 발명의 치료 조성물에 의해 치료될 수 있는 과다증식성 장애의 예로는 복부, 뼈, 유방, 소화계, 간, 췌장, 복막, 내분비선(부신, 부갑상선, 뇌하수체, 고환, 난소, 흉선, 갑상선), 눈, 머리 및 목, 신경(중추 및 말초), 임파계, 골반, 피부, 연질 조직, 비장, 흉부 및 비뇨생식기를 포함하나 이에 국한되지 않는 부위에 위치된 신생물을 포함한다.
유사하게, 본 발명의 치료 조성물에 의해 기타 과다증식성 장애도 또한 치료될 수 있다. 이러한 과다증식성 장애의 예로는 다음을 포함하나 이에 국한되지 않는다: 과다감마글로블린혈증, 임파증식성 장애, 이상단백혈증, 자반병, 유육종증, 세자리(Sezary) 증후군, 발덴스트롬 매크로글로블린혈증(Waldenstron's Macroglobulinemia), 고셔병(Gaucher's disease), 조직구증(histiocytosis), 및 상기 열거된 장기에 위치된 종양을 제외한 기타 임의의 과다증식성 질환.
순환계로의 운반은 광범위한 다양한 조직으로 치료 단백질의 통로를 제공한다. 대안으로, 본 발명의 치료 조성물은 과다증식성 장애를 저해시킬 수 있는 다른 세포의 증식을 촉진시킬 수 있다.
예를 들면, 면역 반응을 증가시킴으로써, 구체적으로 과다증식성 장애의 항원성 질을 증가시키고, 또는 T-세포의 증식, 분화 또는 이동시킴으로써, 과다증식성 장애가 치료될 수 있다. 이러한 면역 반응은 기존 면역 반응을 강화시키거나, 또는 새로운 면역 반응을 개시함으로써 증가될 수 있다. 대안으로, 면역 반응을 감소시키는 것은 화학요법제와 같이 는 방법은 과다증식성 장애를 치료하는 방법이 될 수도 있다.
감염성 질환( Infectious disease )
한 구현예에 있어서, 본 발명의 치료 조성물은 감염성 질환을 치료하는데 이용될 수 있다. 예를 들면, 면역 반응을 증가시킴으로써, 구체적으로 B 및/또는 T 세포의 증식 및 분화를 증가시킴으로써, 감염성 질환이 치료될 수 있다. 이러한 면역 반응은 기존 면역 반응을 강화시키거나, 또는 새로운 면역 반응을 개시함으로써 증가될 수 있다. 대안으로, 본 발명의 상기 치료 조성물은 면역 반응을 반드시 유도하지 않고 감염성 물질을 직접적으로 저해시킬 수도 있다.
본 발명의 치료 조성물에 의해 치료될 수 있는 질환 또는 증상을 야기하는 감염성 물질의 한 가지 예가 바이러스다. 바이러스의 예로는 다음의 DNA 및 RNA 바이러스성 패밀리를 포함하나 이에 국한되지 않는다: 아르보바이러스(Arbovirus), 아데노비리데(Adenoviridae), 아레나비리데(Arenaviridae), 아르테리바이러스(Arterivirus), 비르나비리데(Birnaviridae), 분야비리데(Bunyaviridae), 칼시비리데(Caliciviridae), 씨르코비리데(Circoviridae), 코로나비리데(Coronaviridae), 플라비비리데(Flaviviridae), 헵파드나비리데(Hepadnaviridae) (간염), 헤르페스비리데(Herpesviridae) (이를 테면, 사이토메갈로바이러스(Cytomegalovirus), 헤르페스 심플렉스(Herpes Simplex), 헤르페스 조스터(Herpes Zoster)), 모노네가바이러스(Mononegavirus) (이를 테면 파라믹소비리데(Paramyxoviridae), 모르빌리바이러스(Morbillivirus), 랍도비리데(Rhabdoviridae)), 오르소믹소비리데(Orthomyxoviridae) (이를 테면 인플루엔자), 파포바비리데(Papovaviridae), 파르보비리데(Parvoviridae), 피코르나비리데(Picornaviridae), 폭스비리데(Poxviridae) (이를 테면, 천연구 또는 우두), 레오비리데 (이를 테면 로타바이러스(Rotavirus)), 레트로비리데(Retroviridae) (HTLV-I, HTLV-II, 렌티바이러스(Lentivirus)), 및 토가비리데(Togaviridae) (이를 테면 루비바이러스(Rubivirus)). 이들 패밀리에 속하는 바이러스들은 다음을 포함하나 이에 국한되지 않는 다양한 질환 또는 증상들을 야기할 수 있다: 관절염, 세기관지염, 뇌염, 눈 감염 (이를 테면 결막염, 각막염), 만성 피로 증후군, 간염 (A, B, C, E, 만성 활성, 델타), 수막염, 면역체계가 약해질 때 발생되는 기회성 감염 (이를 테면 AIDS), 폐렴, 버킷 림프종(Burkitt's Lymphoma), 천연두, 출혈열, 홍역, 유행성 이하선염, 파라인플루엔자, 광견병, 감기, 소아마비, 백혈병, 풍진, 성관계에 의해 전염되는 질환들, 피부 질환들 (이를 테면 카포시(Kaposi), 사마귀), 그리고 바이러스혈증. 본 발명의 치료 조성물은 이들 질환 또는 증상중 임의의 것을 치료하는데 이용될 수 있다.
유사하게, 질환 또는 증상을 야기시킬 수 있으며, 본 발명의 치료 조성물에 의해 치료될 수 있는 박테리아성 또는 곰팡이 물질은 다음의 그람-음성(Gram-Negative) 및 그람-양성(Gram-positive) 박테리아 패밀리와 곰팡이들을 포함하나 이에 국한되지 않는다: 악티노미세텔레스(이를 테면 코리네박테리움( Corynebacterium), 미코박테리움(Mycobacterium), 노르카르디아(Norcardia)), 아스퍼길로시스(Aspergillosis), 바실라세에(Bacillaceae) (이를 테면 탄저(Anthrax), 클로스트리듐(Clostridium)), 박테리오다세에(Bacteroidaceae), 블라스토미코시스(Blastomycosis), 보르데텔라(Bordetella), 보렐리아(Borrelia), 브루셀로시스(Brucellosis), 칸디디아시스(Candidiasis), 캄필로박터(Campylobacter), 콕시디오미코시스(Coccidioidomycosis), 크립토콕시스(Cryptococcosis), 데르마토시코세스(Dermatocycoses), 엔테로박테이오세에(Enterobacteriaceae) (클렙시엘라(Klebsiella), 살모넬라(Salmonella), 세라티아(Serratia), 에르시니아(Yersinia)), 에리시펠로트릭스(Erysipelothrix), 헬리코박터(Helicobacter), 레기오넬로시스(Legionellosis), 렙토스피로시스(Leptospirosis), 리스테리아(Listeria), 미코플라스마탈레스(Mycoplasmatales), 네이세리세에(Neisseriaceae) (이를 테면 악시네토박터(Acinetobacter), 고노리아(Gonorrhea), 메니고코카이(Menigococcal)), 파스테우레라세에(Pasteurellacea) 감염 (이를 테면 악티노바실러스(Actinobacillus), 헤모필러스(Heamophilus), 파스테우레라(Pasteurella)), 슈도모나스(Pseudomonas), 리켓시아세에(Rickettsiaceae), 클라미디아세에(Chlamydiaceae), 십필리스(Syphilis), 그리고 스파필로코카(Staphylococcal). 이들 박테리아성 또는 곰팡이성 패밀리는 다음의 질환 또는 증상을 야기시킬 수 있지만, 이에 국한되지는 않는다: 균혈증, 심내막염, 눈 감염 (결막염, 결핵, 포도막염), 치은염, 면역체계가 약해질 때 발생되는 기회성 감염 (이를 테면 AIDS 관련된 감염), 손톱주위염, 보철-관련된 감염, 라이터(Reiter) 질환, 기도감염, 이를 테면, 백일해 또는 축농증, 폐혈증, 라임(Lyme) 질환, 고양이-긁힘(Cat-Scratch)병, 이질, 파라티푸스 열, 식중독, 장티푸스, 폐렴, 임질, 수막염, 클라미디아, 매독, 디프테리아, 나병, 파라결핵병(Paratuberculosis), 결핵, 낭창, 보튤리누스중독, 괴저, 파상풍, 농가진, 류마티즘열, 성홍열, 성관계에 의해 전염되는 질환들, 피부 질환들 (이를 테면 봉와직염, 피부진균증), 독혈증, 요로 감염, 상처 감염. 본 발명의 치료 조성물은 이들 증상 또는 질환중 임의의 것을 치료하는데 이용될 수 있다.
더욱이, 본 발명의 치료 조성물에 의해 치료될 수 있는 기생충 인자들이 이을키는 질환 또는 증상에는 다음과 같은 군들이 포함하나 이에 국한되지 않는다: 아메바증(Amebiasis), 바베시아병(Babesiosis), 콕시디아증(Coccidiosis), 크립토스포리디움병(Cryptosporidiosis), 뇌먹는아메바증(Dientamoebiasis), 구역(Dourine), 동물외부기생충(Ectoparasitic), 라블편모충증(Giardiasis), 연충병(Helminthiasis), 리슈마이나증(Leishmaniasis), 타일레이아증(Theileriasis), 주혈원충병(Toxoplasmosis), 트립파노소마증(Trypanosomiasis), 그리고 트리코모나스질염(Trichomonas). 이들 기생충들은 다음의 다양한 질환들 또는 증상을 야기시킬 수 있지만, 이에 국한되지 않는다: 옴(Scabies), 털진드기유충증(Trombiculiasis), 눈 감염, 내장 질환 (이를 테면 이질, 람블편모충증), 간 질환, 폐 질환, 면역체계가 약해질 때 발생되는 기회성 감염 (이를 테면 AIDS 관련된), 말라리아, 임신 합병증, 그리고 주혈원충병. 본 발명의 치료 조성물은 이들 증상 또는 질환중 임의의 것을 치료하는데 이용될 수 있다.
재생(Regeneration)
본 발명의 치료 조성물은 조직의 재생을 촉진시키기 위하여 세포를 분화, 증식 그리고 유인하는데 이용될 수 있다. (Science 276:59-87 (1997) 참고) 조직의 재생은 선천적 결함, 외상(상처, 화상, 자상, 또는 궤양, 노화, 질환 (이를 테면 골다공증, 골관절염, 치주 질환, 간 부전), 미용 성형술이 포함된 외과술, 섬유증, 재관류 손상, 또는 전신 사이토킨 손상에 의해 손상된 조직을 복구, 대체, 또는 보호하는데 이용될 수 있다.
본 발명의 치료 조성물은 장기 (이를 테면 췌장, 간, 내장, 신장, 피부, 내피), 근육 (평활근, 골격근 또는 심근), 맥관(맥관 내피 포함), 신경, 조혈 및 골격(뼈, 연골, 건 및 인대) 조직을 포함하나 이에 국한되지 않는 다양한 조직의 재생을 촉진시킬 수 있다. 바람직하게는, 재생은 소량의 반흔 또는 반흔없이 일어난다. 재생에는 또한 혈관신생이 포함될 수 있다.
더욱이, 본 발명의 치료 조성물은 치료되기 어려운 조직의 재생을 증가시킬 수 있다. 예를 들면, 건/인대 재생의 증가는 손상이후 회복 시간을 단축시킬 수 있다. 본 발명의 치료 조성물은 손상을 피하기 위한 시도로 예방차원에서 또한 이용될 수 있다. 치료될 수 있는 특정 질환들은 건염, 손목 관절 증후군 및 기타 건 및 인대 결함을 포함한다. 치유불가능한 상처의 조직 재생의 추가 예로는 욕창, 혈액 공급 장애와 관련된 궤양, 외과술 및 트라우마 상처를 포함한다.
유사하게, 또한 신경 세포를 증식 및 분화시키기 위하여 본 발명의 치료 조성물을 이용하여 신경 및 뇌 조직이 재생될 수 있다. 이 방법에 의해 치료될 수 있는 질환들은 중추 및 말초신경계 질환들, 신경장애, 또는 물리적 그리고 외상성 장애 (이를 테면 척수 장애, 두부 손상, 뇌혈관 질환, 및 뇌졸중)을 포함한다. 특히, 말초 신경 손상과 연관된 질환들, 말초 신경장애(이를 테면 화학요법 또는 기타 의학적 요법으로 인하여 발생된), 국소화된 신경장애, 그리고 중추 신경계 질환들 (이를 테면 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 헌팅턴 질환, 근위축성 측색 경화증, 그리고 샤이-드레이가 증후군(Shy-Drager syndrome))은 모두 본 발명의 치료 조성물을 이용하여 치료될 수 있다. CNS 장애의 경우 뇌 조직에 치료 접근을 용이하게 하는 여러 가지 수단들이 당분야에 공지되어 있는데, 혈액 뇌 방벽을 붕괴시키는 방법과 CNS로 운반을 해주는 모이어티에 치료 물질을 연결시키는 방법들을 포함한다. 한 구현예에 있어서, 융합 단백질을 인코드하도록 치료 핵산을 만들 수 있는데, 이때 융합 단백질은 운반 모이어티와 치료 단백질을 포함한다. 대안으로, 해당 조성물은 CNS에 직접 운반될 수 있다.
화학주성(Chemotaxis)
한 구현예에 있어서, 본 발명의 치료 조성물은 화학주성을 조정할 수 있다. 예를 들면, 한 구현예에 있어서, 본 발명의 치료 폴리펩티드는 화학주성 활성을 보유한다. 화학주성 분자는 세포 (이를 테면 단핵구, 섬유아세포, 호중구, T-세포, 비만 세포, 호산구, 상피 및/또는 내피 세포)를 염증, 감염, 또는 과다증식 부위와 같은 신체의 특정 부위로 끌어들이거나 이동시킨다. 이동된 세포는 특정 외상 상처 또는 비정상과 싸우거나 및/또는 치료할 수 있다.
예를 들면, 본 발명의 치료 폴리펩티드는 특정 세포의 화학주성 활성을 증가시킬 수 있다. 이러한 화학주성 분자들은 신체의 특정 위치를 표적으로 하는 세포의 수를 증가시킴으로써 염증, 감염, 과다증식성 장애, 또는 임의의 면역계 장애를 치료하는데 이용될 수 있다. 예를 들면, 화학주성 분자들은 손상된 위치로 면역 세포를 유인하여 조직에서 상처 및 기타 외상을 치료하는데 이용될 수 있다. 본 발명의 화학주성 분자는 섬유아세포를 또한 유인할 수 있고, 이는 상처를 치료하는데 이용될 수 있다.
본 발명의 치료 조성물은 화학주성 활성을 저해시킬 수 있다는 것 또한 고려된다. 이들 치료 조성물은 또한 장애를 치료하는데 이용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 치료 조성물은 화학주성의 저해제로 이용될 수 있다.
표적 조직의 주변에서 활성화되는 프로테라피(protherapeutic) 단백질의 사용이 특히 바람직하다.
사용이 고려되는 추가적인 치료 폴리펩티드들은 다음을 포함하나 이에 국한되지 않는다: 성장 장애 또는 소모성 증후군을 치료하기 위한 성장 인자들 (이를 테면, 성장 호르몬, 인슐린-유사 성장 인자-1, 혈소판-유도된 성장 인자, 상피 성장 인자, 산성 및 염기성 섬유아세포 성장 인자들, 형질변형 성장 인자-β, 등); 그리고 외부 항원 또는 병원균 (이를 테면, H. 피로리(H. Pylori))에 대항하여 피험체를 수동 면역화 또는 보호할 수 있는, 또는 암, 관절염 또는 심혈관 질환을 치료하기 위한 항체들 (이를 테면, 인간 또는 인간화된); 사이토킨, 인터페론(이를 테면, 인터페론 (IFN), IFN-α2b 및 2α, IFN-α N1, IFN-β1b, IFN-감마), 인터루킨(이를 테면, IL-1 내지 IL-10), 종양 괴사 인자 (TNF-α, TNF-β), 케모킨, 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 폴리펩티드 호르몬, 항미생물 폴리펩티드 (이를 테면, 항박테리아성, 항곰팡이성, 항바이러스성, 및/또는 항기생충성 폴리펩티드), 효소(이를 테면, 아데노신 탈아미나제), 고나도프로핀, 케모탁틴, 지질-결합 단백질, 필가스팀(Neupogen), 헤모글로빈, 에르트로포에틴, 인슐로트로핀, 이미글루세라제(imiglucerase), 사르브라모스팀(sarbramostim), 조직 플라스미노겐 활성물질(tPA), 유로키나제, 스트렙토키나제, 페날알라닌 암모니아 리아제, 뇌-유도된 향신경성 인자 (BDNF), 신경 성장 인자 (NGF), 트롬보포에틴 (TPO), 슈퍼옥시드 디스무타제(SOD), 아데노신 탈아미다제, 카탈라제 칼시토닌, 엔도텔리안, L-아스파라기나제 펩신, 유리카제 트립신, 키모트립신 엘라스타제, 카르복시펩티다제 락타제, 슈크라제 고유 인자, 칼시토닌, 부갑상선 호르몬(PTH)-유사 호르몬, 가용성 CD4, 및 항체들 및/또는 이의 항원-결합 단편들 (가령, FAbs) (이를 테면, 오르소클론 OKT-e (항-CD3), GPIIb/IIa 단클론 항체). 이러한 인자들이 인코딩된 핵산을 표적으로 하는 치료 RNAs가 추가로 고려된다.
백신
한 구현예에 있어서, 본 발명은 환자에게 백신접종하는 방법들을 제공한다. 상기 방법들은 바람직한 에피토프를 생산할 수 있는 본 발명의 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 바람직한 구현예에 있어서, 상기 조성물은 상기 에피토프가 포함된 단백질을 발현시킬 수 있는 치료 핵산 구조체를 포함한다.
미용학적 용도
한 구현예에 있어서, 본 발명은 미용적 용도로 DD-키토산 핵산 폴리플렉스를 제공한다. 해당 화장품은 미용학적 용도에 적합한 제제 안에 DD-키토산 핵산 폴리플렉스를 포함한다.
실시예들
이중으로 유도화된 키토산의 형성 및 DNA 폴리플렉스의 형성
키토산은 잘 알려진 방법에 따라 아르기닌과 글루콘산 (DD-키토산)에 의해 이중으로 유도화된다. DD-키토산은 분비된 알칼리 포스파타제 (SEAP) 또는 루시페라제 siRNA를 인코드하는 DNA 벡터에 의해 폴리플렉스화된다.
DNA 폴리플렉스로 시험관내 형질감염
일반적으로 DD-키토산 핵산 폴리플렉스 제제로 293T 세포의 시험관내 형질감염은 두 단계로 실행된다: 세포의 준비에 이어서 형질감염.
세포주의 유지
상기 293T 세포주는 UBC의 Dr. Kieffer 실험실의 호의에 의해 제공받았고, 다음과 같이 준비되었다. 인간 신장 세포는 SV40 T-항원을 사용하여 형질전환되었고; 10% 태아 소 혈청 (FBS) 및 페니실린/스트렙토마이신이 포함된 고포도당 Dulbecco 변형된 Eagle 배지(DMEM)에서 성장되었고; 그리고 80% 미만의 합류로 유지되었다. HT1080 (인간 연결 조직으로부터 상피 세포) 및 HeLa (인간 경부 상피 세포)는 10% FBS 및 페니실린/스트렙토마이신이 포함된 MEM(최소 필수 배지)에서 성장되었고; 그리고 90% 미만의 합류로 유지되었다. VERO (원숭이 신장 상피 세포)는 열에 의해(56℃에서 30분) 비활성화된 10% FBS, 1mM 피루베이트 나트륨 및 500㎍/ml 젠타마이신이 포함된 DMEM에서 성장되었고; 그리고 90% 미만의 합류로 유지되었다. NIH3T3 (마우스 배아 섬유아세포)은 10% FBS 및 페니실린/스트렙토마이신이 포함된 DMEM에서 성장되었고; 그리고 90% 미만의 합류로 유지되었다.
형질감염용 세포의 준비
형질감염을 위한 세포는 다음과 같이 준비되었다 . 형질감염 하루 전, 293T 세포는 3 mL의 완전 배지(고 포도당 DMEM + 10% FBS + 페니실린/스트렙토마이신)가 있는 6-웰 조직 배양 플레이트(4.5 x 105 세포/웰) 안에 3 mL의 완전 배지(고 포도당 DMEM + 10% FBS + 페니실린/스트렙토마이신)에 추가되었다. 형질감염 하루 전, 인산염 완충된 염수 (PBS)로 세포를 1x 세척하고, 0.5 mL의 0.05% 트립신으로 세포를 트립신처리하고, 0.5 mL의 완전 배지를 추가하고, 그리고 혈구계산기를 이용하여 10㎕를 카운팅함으로써 2개의 선택된 웰에 대하여 세포 카운트가 측정되었다. 세포가 ~50% 합류 (~7 x 105 세포/웰)된 경우, 그 다음 형질감염이 진행되었다. (세포가 너무 부족하거나 또는 너무 합류된 경우, 형질감염은 진행되지 않았다) 유사하게, 형질감염 하루 전, HeLa 세포는 웰당 1x 105 세포 농도로 도말되었고, 한편 HT1080, NIH3T3 및 VERO 세포는 3 ml의 각 완전 배지에서 웰당 2x 105 세포 농도로 도말되었고, 그 다음 날 ~50% 합류에서 형질감염이 실행되었다.
세포의 형질감염
형질감염은 다음과 같이 실행되었다. 먼저, 각 웰에서 배지가 제거되고, 1 mL Opti-mem (pH 7.4)를 각 웰에 추가하고, 부드럽게 휘젓고, 그 다음 빼낸다. (6개 웰은 세포가 제거되지 않도록 한 번에 세척되었다.) 그 다음 세포가 제거되지 않도록 조심스럽게 또다른 1 mL의 Opti-mem (pH 7.4)가 각 웰에 추가되었다. 그 다음, 폴리플렉스 시료가 각 웰(2 ㎍의 표적 DNA)에 추가되고, 휘젓고, 2시간 동안 37℃에서 항온처리되었다. 항온처리 후, 배지가 제거되고, 2 mL의 완전 배지로 대체된 후, 37℃에서 다시 항온처리되었다. 요구되는 시점에서 상청액이 제거되었고, 후속적인 SEAP 분석을 위하여 -20℃에 보관되었다.
SEAP 단백질 분석
SEAP 분석은 SEAP 화학발광 분석 키트를 이용하여 실행되었다. 분석용 모든 시약은 사용에 앞서 30분간 25℃에서 균등화되었다. 0.1% 소 혈청 알부민, 50% 글리세롤을 탄 키트의 1x 희석 완충액에 태반 알칼리 포스파타제를 1mg/mL로 용해시키고, 그 다음 DMEM을 이용하여 0.01 pg/㎕로 10-배 연속 희석시켜, 분석용 표준이 준비되었다. 표준 및 해동된 시료는 희석 완충액 4에 1의 비율로 희석되었고, 30분간 65℃에서 열 비활성화되었고, 2분간 얼음 위에서 항온처리되었고, 원심분리되었고 (16100 x rcf, RT, 2분간) 그리고 상청액은 새 튜브로 이동되었다. 25℃에서 5분 동안 평형화된 후, 50 ㎕의 시료 및 표준은 Microlite-1 플레이트의 각 웰에 이중으로 추가되었다. 비활성화 완충액 (50 ㎕)이 그 다음 각 웰에 추가되었고, 기포 발생 없이 혼합되도록 피펫을 이용하여 상하로 부드럽게 피펫팅한 후, 5분간 항온처리되었다. 기질/인헨서 시약은 1:19의 기질 대 인헨서의 비율로 5분간 항온처리하여 준비되었다. 상기 기질/인헨서는 그 다음 각 웰에 추가되었고, 20분간 항온처리되었으며, 상기 플레이트는 발광측정기(Lmax11384, Molecular Devices)에서 1초간의 통합 시간으로 판독되었다.
SEAP mRNA 분석-정량적-실시간-폴리메라제 쇄 반응 (Q-RT-PCR)
다양한 시료에서 SEAP mRNA 발현의 상대적 정량은 Q-RT-PCR에 의해 측정되었다. 간략하게 설명하자면, 총 mRNA는 TRIzol 시약을 이용하여 추출 및 정제되었고, Q-RT-PCR은 Superscript II를 이용하여 실행되었다. SEAP 유전자 프라이머 및 형광발생 프로브는 Primer Express (Version 1.5) (Applied Biosystems, Foster City, California)를 이용하여 기획되었다. ABI 7000 서열 탐지 시스템(Applied Biosystems)을 이용하여 전체 용적 25㎕에서 모든 폴리메라제 쇄 반응 (PCR)이 실행되었다. 각 반응 혼합물은 1xTaqMan Universal Master Mix, 20 μM의 각 프라이머 및 10 μM의 프로브를 포함하였다. 10 ㎕의 각 상보 DNA (역 전사된 총 RNA 4.5-45 ng에 상응)가 각 PCR 반응에 이용되었다. PCR 과정은 50℃에서 2분간 초기 항온처리와 이어서 95℃에서 10분간 항온처리, 그리고 95℃에서 15초 및 60℃에서 1분의 PCR 40회, 그리고 60℃에서 1분으로 구성되었다. 각 96-웰 분석 플레이트는 음성 역 전사효소 및 음성 상보 DNA 대조군이 포함되었다. 상기 결과는 하우스키핑 유전자(housekeeping gene) GAPDH (기준 유전자)에 대해 표준화되었고, 그리고 상기 처리된 조직과 처리안된 대조군 조직 간의 상태적인 표적 유전자 발현 비율로 나타낸다. 상기 방법은 Pfaffl의 방법으로 불린다(Pfaffl MW. Nucleic Res (2001) 29:e45)
세포의 siRNA 녹다운 형질감염
유전자 발현의 녹다운(knockdown)은 우선 숙주 세포에 siRNA/변형된-dd-키토산 폴리플렉스를 먼저 형질감염시키고, 이어서 동일한 숙주 세포를 DNA/Lipofectamine 2000으로 형질감염시킴으로써 실행되었다.
형질감염 하루 전, 1ml의 완전 배지에서 24-웰 플레이트의 웰당 9 x 104 293T 세포가 도말되었다. 형질감염 당일, 세포 (50% 합류)는 형질감염에 앞서 Optimem로 세척되었다. 웰에서 배지가 제거되고 0.25 ml의 Opti-mem가 다시 추가되고, 그 자리에서 휘젓고, Opti-mem가 제거되고, 그리고 0.25 ml의 새로운 Opti-mem가 대체됨으로써, 세포들이 세척되었다. siRNA 형질감염은 각 웰에 200 nM의 siRNA/변형된-키토산 폴리플렉스가 추가되고, 5% CO2 배양기 안에서 37C로 항온처리됨으로써 실행되었다. 2시간 후, 상기 Opti-mem가 제거되었고, 0.5 ml의 완전 배지로 대체되었다. DNA 형질감염은 0.4 ㎍의 루시페라제-함유 Lipofectamine 미립자를 각 웰에 추가하고, 5% CO2 배양기 안에서 37C로 항온처리됨으로써 실행되었다. 2시간 후, 상기 배지가 제거되었고, 0.5ml의 새로운 완전 배지로 대체되었고, 그 다음 상기 세포는 다시 배양기로 이동되었다. siRNA로 형질감염된 후 48시간 시점에서, 루시페라제 분석을 위하여 세포 용해물이 수거되었다. 수거를 위하여, Dulbecco의 인산염 완충된 염수로 세포는 세척되었고, EDTA-없는 프로테아제 저해제들이 포함된 Glo Lysis 완충액 500 ㎕를 타고, 튜브에 수거하고 5분 항온처리 후, 바로 분석하거나, 또는 -80℃에 보관되었다.
루시페라제 분석
상기 루시페라제 분석은 Bright-Glo 루시페라제 분석 시스템을 이용하여 실행되었다. Glo Lysis 완충액, Bright-Glo 완충액, 분석용 시료들은 사용하기에 앞서 실온에서 평형화되었다. EDTA-없는 프로테아제 저해제와 1mg/ml BSA가 포함된 1X Glo Lysis 완충액에서 QuantiLum 재조합 루시페라제 효소는 90 ng/ml으로 희석되고, 그 다음 30 ng/ml으로, 그리고 다시 10-배 연속 희석에 의해 0.003 ng/ml으로 희석되어 분석용 표준이 준비되었다. Bright-Glo 기질은 이용하기 전 최소한 10분 동안 Bright-Glo 완충액으로 복원되어 Bright-Glo 분석 시약을 만들었다. 100 ㎕의 시료 및 표준은 이중으로 Microlite-1 플레이트의 각 웰에 추가되었다. Bright-Glo 분석 시약 (100 ㎕)이 그 다음 각 웰에 추가되었고, 2분간 항온처리되었으며, 상기 플레이트는 발광측정기에서 1초간의 통합 시간으로 판독되었다.
동물
동물 연구용 외과적 프로토콜은 동물 관리를 위하여 University of British Columbia Committee에서 승인되었다. 상기 동물 작업은 자격을 갖춘 훈련된 직원들에 의해 실행되었고, ~8주령의 C57BL/6 암컷 마우스는 Jackson Laboratory (Bar Harbour, Maine)에서 구입하였다. 마우스는 12시간 명/암주기에서 우리당 2-4마리씩 수용되었고, 1주일의 순응 기간이 제공되었으며, 자유롭게 표준 설치류 음식(Research Diets Inc., New Brunswick, NJ) 및 물이 제공되었다. 마우스는 Department of Physiology, University of British Columbia (UBC)의 동물 수용시설에 수용되었다.
마우스에서 결장 형질감염
순수 C57BL/6 마우스는 마취되었고(1.5-2.0% 이소플루란 흡입, Baxter CA2L9108), 그리고 기능화된 DD-키토산-DNA 폴리플렉스 또는 기능화안된-키토산-DNA 폴리플렉스를 0.25 mg/mL로 운반하는 gWiz-SEAP 플라스미드가 1회 관장으로 전달되었다. 2일 후, 마우스를 희생시킨 후, 조직이 수거되었다.
생체내 마우스 형질감염: 근육으로 폴리플렉스 운반
마우스의 근육으로 표지(marker)를 운반하기 위하여 상기 DD-키토산-DNA 폴리플렉스가 포함된 SEAP 발현 벡터는 헴스트링 중앙에 주사에 의해 투여된다. 마우스는 마취되고, 50 ㎕의 폴리플렉스가 주사기를 통하여 주입된다. 다양힌 시점에서 마우스가 희생되었고, 이들의 근육 조직들이 수거되었으며, 그리고 SEAP의 mRNA 발현에 대해 처리되었다. 대조군으로 오직 DNA만 주사된다.
DD-키토산-핵산 폴리플렉스의 동결건조 및 물로 복원
-80℃에서 냉동된 DD-키토산-핵산 폴리플렉스(각 280㎕)는 사전-냉각된 용기에 두었다. 그 다음 상기 용기는 동결건조기(SAVANT-Modulyo D)에 연결되었다. 상기 폴리플렉스는 28이상의 시간 동안 <-40℃에서 5 torr의 일정한 압력 하에 동결-건조되었다. 동결건조된 후, 상기 DD-키토산-핵산 폴리플렉스는 후속 실험을 위하여 물을 이용하여 원래 농도로 복원되었다.
결과
도 2-4, 및 7은 오직 글루콘산 단독(도 2a)으로 유도화된 키토산, 아르기닌 단독 (도2b)으로 유도화된 키토산 또는 글루콘산과 아르기닌의 이중으로 유도화된 키트산의 형질감염 효과를 오직 아르기닌 또는 글루콘산만으로 유도화된 키토산과 비교한 것을 나타낸다(도 3 및 7). 도 3과 7은 키토산이 아르기닌과 글루콘산에 의해 이중으로 유도화된 경우 시너지 효과를 보여준다. 상기 시너지 효과는 최종 기능화 수준 26%에서 아르기닌과 최종 기능화 정도 3% 내지 9%에서 글루콘산에 의해 이중으로 기능화될 때 나타날 수 있으며, 최종 기능화 정도 약 5%의 글루콘산에서 최대 효과를 나타내었다 (도 4; 또는 각각 최종 기능화 정도 26%와 6%에서 아르기닌과 글루콘산에 의해 이중으로 기능화된 키토산에서 시너지 효과를 보여주는 도 7 참고). 도 5와 6은 형질감염 효율에 있어서 폴리플렉스의 N/P 비율과 pH의 효과를 나타낸다. (1) 아르기닌 단독 또는 (2) 아르기닌과 글루콘산으로 이중 유도화된 키토산의 형질감염 효과는 N/P 비율과 직접적으로 비례하였지만, 이중으로 유도화된 키토산이 테스트된 모든 N/P 비율에서 아르기닌 단독으로 유도화된 키토산보다 더 높은 형질감염 효율을 보유하였다(도 5). 대조적으로, pH는 형질감염 효율에 영향을 주지 않았다 (도 6). 생체외 상이한 세포주들에서(도 8), siRNA (도 11) 및 생체내(도 9-10)에서 시너지 효과를 또한 볼 수 있을 것이다. DD-키토산-DNA 폴리플렉스의 근육내 운반으로 생체내 근육 세포에서 SEAP mRNA 발현이 상당히 증가되었다(도 9). 추가적으로, 순수 마우스(형질감염안됨)와 비교하여 치료된 마우스의 결장 조직에서 SEAP mRNA가 상대적으로 증가됨을 보여준다(도 10). 냉동된 그리고 동결건조된 DD-키토산-핵산 폴리플렉스는 모두 3개월 동안 실온에서 보관된 후 물리화학적으로 안정성을 나타낸다. 이들 폴리플렉스는 하룻밤 항온처리 후 물로 복원된 후 이들의 안정성이 또한 유지되었다(도 12).
모든 인용문헌은 이들의 전문이 명세서의 참고자료에 편입된다.
본 명세서에서 언급된 모든 특허 및 특허 공개는 명세서의 참고자료에 편입된다.
전술한 설명에 의해 당업자들에게는 특정 변형 및 개선이 나타날 수 있다. 이러한 모든 변형 및 개선은 본 명세서의 간결성 및 용이한 판독을 위하여 본 명세서에서 삭제되었지만, 다음의 청구범위의 범주내에 타당하게 존재한다는 것을 인지해야만 한다.

Claims (14)

  1. 글루콘산과 아르기닌이 결합된 키토산을 포함하는 키토산-유도체 나노입자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 키토산은 약 5% 내지 약 60%의 초기 농도에서 글루콘산과 결합된, 나노입자.
  3. 제2항에 있어서, 상기 키토산은 약 8% 내지 약 30%의 초기 농도에서 글루콘산과 결합된, 나노입자.
  4. 제3항에 있어서, 상기 키토산은 약 3% 내지 약 10%의 최종 농도에서 글루콘산과 결합된, 나노입자.
  5. 제4항에 있어서, 상기 키토산은 약 5%의 최종 농도에서 글루콘산과 결합된, 나노입자.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키토산은 약 10% 내지 약 55%의 농도에서 아르기닌과 결합된, 나노입자.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 상기 나노입자를 포함하고, 여기서 키토산은 핵산과 착화되어 이중으로 유도화된(DD) 키토산 핵산 폴리플렉스를 형성하는, 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 핵산은 DNA 또는 siRNA인, 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DD-키토산 핵산 폴리플렉스에서 인산염에 대한 아민의 비율은 2 내지 100인, 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 DD-키토산 핵산 폴리플렉스에서 상기 인산염에 대한 아민의 비율은 2 내지 50인, 조성물.
  11. 제9항에 있어서, 상기 DD-키토산 핵산 폴리플렉스에서 상기 인산염에 대한 아민의 비율은 2 내지 30인, 조성물.
  12. 제9항에 있어서, 상기 DD-키토산 핵산 폴리플렉스에서 상기 인산염에 대한 아민의 비율은 2 내지 15인, 조성물.
  13. 세포와 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 접촉시키는 것을 포함하는, 세포로 핵산 분자를 운반하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 세포는 생체 내 세포인, 방법.
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