BR112014023405B1 - Nanopartícula de derivado de quitosana, composição compreendendo a nanopartícula e método in vitro para distribuir molécula de ácido nucleico a uma célula - Google Patents

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Abstract

nanopartículas de quitosana duplamente derivatizado e métodos de produção e uso do mesmo para transferência de gene in vivo. o presente documento fornece uma quitosana duplamente derivatizada com arginina e ácido glucônico; e métodos para produção e uso da mesma, por exemplo, para a transferência de gene in vivo.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO
[0001] A presente invenção geralmente se relaciona com nanopartículas compreendendo quitosana duplamente derivatizado e métodos de produção e uso do mesmo para liberação de ácidos nucleicos, por exemplo, para transferência de gene in vivo.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[0002] A quitosana é um copolímero catiônico não-tóxico de N-acetil-D- glucosamina e D-glucosamina. A quitosana pode formar um complexo com ácido nucleico e, como um polissacarídeo biocompatível e atóxico, tem sido usado como um veículo de liberação de DNA para transfectar células. Houve um grande interesse em focar no uso da quitosana na liberação não-viral de ácido nucleico devido às complexidades e toxicidade potencial do envelope viral.
[0003] Um número de complexos de quitosana/DNA, incluindo complexos entre quitosana modificada e ácidos nucleicos foram examinados na tentativa de identificar composições bem adequadas para a transfecção do gene. Ver, por exemplo, WO2010/088565; WO2008/082282. Os complexos foram encontrados para variar, entre outras propriedades, a solubilidade, a propensão para a agregação, estabilidade complexa, tamanho de partícula, capacidade de liberar o DNA e a eficiência da transfecção.
[0004] A descoberta surpreendente de que a arginina e o ácido glucônico agem sinergicamente para melhorar a eficiência da transfecção da quitosana é apresentada neste documento.
RESUMO DA INVENÇÃO
[0005] É divulgado neste instrumento o achado inesperado de que a arginina e o ácido glucônico aumentam sinergicamente a eficiência da transfecção de nanopartículas da quitosana, portanto, são apresentadas aqui, novas composições que facilitam a liberação de ácidos nucleicos para as células, tecidos e órgãos, por exemplo, in vivo. Em especial, são aqui apresentadas nanopartículas com base na quitosana duplamente derivatizada, caracterizadas pelo fato de que as nanopartículas mencionadas compreendem ainda, opcionalmente, ácido nucleico.
[0006] Em uma modalidade, as nanopartículas compreendem a quitosanaque está acoplada pelo menos a um aminoácido. Em uma modalidade preferencial, o aminoácido é carregado positivamente. Em uma modalidade mais preferencial, o aminoácido é a arginina.
[0007] Em outra modalidade, as nanopartículas compreendem a quitosana que está acoplada a um ácido orgânico, preferencialmente, ao ácido glucônico.
[0008] Em outra modalidade, as nanopartículas compreendem a quitosanaque está acoplada tanto à arginina quanto ao ácido glucônico, ver, por exemplo,Fórmula I
Figure img0001
onde n é um número inteiro de 1 a 2000,α é o grau de funcionalização da arginina,β é o grau de funcionalização do ácido glucônico; ecada R 1é selecionado de maneira independente do hidrogênio, acetil,Fórmula (II) e Fórmula (III).
Figure img0002
[0009] A quitosana duplamente derivatizada conforme descrito neste documento compreende arginina e ácido glucônico em diferentes porcentagens da concentração inicial ou da funcionalização final. A porcentagem da concentração inicial é usada para a quitosana modificada por ácido glucônico modificado, que representa a razão molar do grupo carboxila no ácido glucônico dividida pelos grupos amina totais na quitosana ou na quitosana modificada por arginina, enquanto a porcentagem da funcionalização final representa o grau de funcionalização da quitosana modificada final calculada a partir da relação de peso do carbono e do nitrogênio em decorrência da análise elementar. Em uma modalidade, a quitosana é acoplada ao ácido glucônico em uma concentração inicial de cerca de 5% a cerca de 60%, por exemplo, cerca de 8% a cerca de 30%. Em outra modalidade, preferencialmente cerca de 30%. Em outra modalidade, a quitosana é acoplada à arginina em uma concentração final de cerca de 10% a cerca de 55%.
[0010] Em particular, os poliplexos do ácido nucleico-quitosana formados com essa quitosana duplamente derivatizada ("DD-quitosana") apresentam uma maior eficiência de transfecção que os poliplexos do ácido nucleico formados com quitosana não funcionalizada ou quitosana que é conjugada aos resíduos dos aminoácidos simples, polímeros de aminoácidos ou resíduos de ácido glucônico sozinhos. Outras propriedades desejáveis conferidas pelo uso da quitosana duplamente funcionalizada nos poliplexos aqui descritos incluem uma melhor capacidade de penetrar a barreira mucosa, estabilidade aprimorada do poliplexo, toxicidade celular reduzida e liberação intracelular aprimorada do ácido nucleico. Além disso, em algumas modalidades preferenciais, as composições em questão do poliplexo da DD-quitosana podem ser administradas em pH fisiológico (por exemplo, administração sistêmica).
[0011] Portanto, em um aspecto, a invenção fornece poliplexos do ácido nucleico da DD-quitosana. Os poliplexos do ácido nucleico da DD-quitosana compreendem quitosana que é duplamente derivatizada com arginina e ácido glucônico.
[0012] Em uma modalidade, o poliplexo do ácido nucleico da DD-quitosana é formado em pH inferior ao pKa de DD-quitosana.
[0013] Em uma modalidade, o poliplexo do ácido nucleico da DD-quitosana é formado em pH abaixo de 7.
[0014] Em uma modalidade, o poliplexo do ácido nucleico da DD-quitosana tem um grau combinado da funcionalização com arginina e ácido glucônico de 1-60%.
[0015] Em uma modalidade, o poliplexo do ácido nucleico da DD-quitosana tem um grau combinado de funcionalização com a arginina e com o ácido glucônico de 1-30%.
[0016] Em uma modalidade, a razão molar da arginina em relação ao ácido glucônico no poliplexo de ácido nucleico da DD-quitosana é entre 100: 1 e 1: 100.
[0017] Em uma modalidade, a razão molar da arginina em relação ao ácido glucônico no poliplexo de ácido nucleico da DD-quitosana é entre 50:1 e 1:50.
[0018] Em uma modalidade, a razão molar entre a arginina e o ácidoglucônico no poliplexo de ácido nucleico da DD-quitosana é 10:1 e 1:10.
[0019] Em uma modalidade, a razão molar entre a arginina e o ácidoglucônico no poliplexo de ácido nucleico da DD-quitosana é 5:1 e 1:5.
[0020] Em uma modalidade, a razão molar da arginina em relação ao ácido glucônico no poliplexo de ácido nucleico da DD-quitosana é entre 2:1 e 1:2.
[0021] Em modalidades preferenciais, a razão molar da arginina em relação ao ácido glucônico é inversamente proporcional ao peso molecular da quitosana, ou seja, um peso molecular menor de DD-quitosana requer uma razão molar superior da arginina em relação à quitosana e vice-versa.
[0022] Em uma modalidade, o ácido nucleico do poliplexo de ácido nucleico da DD-quitosana é o DNA.
[0023] Em uma modalidade, o ácido nucleico do poliplexo do ácido nucleico da DD-quitosana é o RNA.
[0024] em uma modalidade, o ácido nucleico do poliplexo do ácido nucleico da DD-quitosana é um ácido nucleico artificial. Em uma modalidade preferencial, o ácido nucleico artificial é selecionado do grupo consistindo no ácido nucleico do peptídeo PNA), poligômero fosforodiamidato morfolino (PMO), ácido nucleico bloqueado (LNA), ácido nucleico glicólico (GNA) e ácido nucleico de treose (TNA).
[0025] Em uma modalidade, o ácido nucleico do poliplexo do ácido nucleico da DD-quitosana é ácido nucleico terapêutico. Em uma modalidade, o ácido nucleico terapêutico é um RNA terapêutico. Em uma modalidade preferencial, o RNA terapêutico é selecionado a partir do grupo consistindo em RNA anti-senso, siRNA, RNA curto em grampo, micro RNA e RNA enzimático.
[0026] Em uma modalidade, o ácido nucleico terapêutico é o DNA.
[0027] Em uma modalidade, o ácido nucleico terapêutico compreende uma sequência de ácido nucléico codificando uma proteína terapêutica.
[0028] Em um aspecto, a invenção apresenta uma composição compreendendo uma pluralidade de poliplexos de ácido nucleico da DD-quitosana.
[0029] Em uma modalidade, a composição tem um pH entre 3,0-8.0, mais preferencialmente entre 4,0-7,0 e mais preferencialmente entre 4,5-6,5.
[0030] Em um aspecto, a invenção apresenta uma composição farmacêutica compreendendo um poliplexo de ácido nucleico da DD-quitosana da invenção. Em uma modalidade preferencial, o poliplexo de ácido nucleico da DD- quitosana compreende um ácido nucleico terapêutico.
[0031] Em um aspecto, a invenção apresenta métodos de tratamento da doença, compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica da invenção a um paciente.
[0032] Em uma modalidade, a composição farmacêutica em questão é administrada em pH fisiológico.
[0033] Em uma modalidade, a composição farmacêutica em questão éadministrada sistematicamente.
[0034] Em uma modalidade, a composição farmacêutica em questão éadministrada localmente ao tecido-alvo. Em uma modalidade preferencial, a composição farmacêutica em questão é administrada ao tecido mucoso. Em uma modalidade, o tecido mucoso é o tecido GI.
[0035] Em um aspecto, a invenção apresenta uma vacina, compreendendo um poliplexo de ácido nucleico da DD-quitosana, no qual o ácido nucleico codifica um antígeno.
[0036] Em um aspecto, a invenção apresenta métodos para a vacinação de um paciente. Os métodos compreendem a administração de uma vacina da invenção a um paciente.
[0037] Em um aspecto, a invenção apresenta uma composição imunogênica, compreendendo um poliplexo de ácido nucleico da DD-quitosana, no qual o ácido nucleico codifica um imunógeno.
[0038] Em um aspecto, a invenção apresenta métodos para iniciar ou aumentar uma resposta imune a uma molécula de interesse. Os métodos compreendem a administração de uma composição imunogênica da invenção a um paciente, na qual o ácido nucleico codifica um epítopo da molécula de interesse.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0039] A FIG. 1 é um fluxograma do processo de produção da quitosana duplamente derivatizada com arginina e ácido glucônico, resultando em uma combinação ideal de graus de funcionalização entre dois componentes acoplados.
[0040] A FIG. 2 mostra a eficiência da transfecção (proteína ng SEAP/mg; eixo y) de quitosana 24mer acoplada (A) ao ácido glucônico a uma concentração inicial (eixo x) de 10%, 30% ou 60% ou (B) à arginina em um grau de funcionalização final (eixo x) de 9,7%, 12,3%, 26% ou 52%.
[0041] A FIG. 4 mostra a eficiência da transfecção (proteína ng SEAP/mg; eixo y) de poliplexos produzidos à razão de amina/fosfato (N/P) de 20 com quitosana 24mer (A) acoplada à arginina e ao ácido glucônico aos graus de funcionalização final de 26% de arginina e 5% de ácido glucônico; (B) à arginina sozinha ao grau de funcionalização final de 26%, ou (C) acoplada ao ácido glucônico sozinho a uma concentração inicial de 30% de ácido glucônico para a amina total.
[0042] A FIG. 4 mostra a eficiência da transfecção (proteína ng SEAP/mg; eixo y) de poliplexos produzidos à razão de amina/fosfato (N/P) de 20 com quitosana 24mer acoplada à funcionalização final da 26% de arginina sozinha (0%; eixo x) ou acoplada ainda ao ácido glucônico aos graus de funcionalização final de ácido glucônico de 3%, 5%, 6% e 9% (eixo x).
[0043] A FIG. 5 mostra o efeito da razão de amina/fosfato (N/P) (eixo x) de 40 (N40), 20 (N20) ou 10 (N10) na eficiência da transfecção (proteína ng SEAP/mg; eixo y) de quitosana 24mer quitosana duplamente derivatizada com arginina e ácido glucônico aos graus de funcionalização final de 26% e 5% respectivamente (quadradinhos) ou quitosana acoplada a 26% de arginina sozinha (quadradinhos).
[0044] A FIG. 6 mostra o efeito do pH da formulação (eixo x) sobre a eficiência da transfecção (proteína ng SEAP/mg) de 24mer quitosana duplamente derivatizada com arginina e ácido glucônico aos graus de funcionalização final de 26% e 5%, respectivamente (quadradinhos) ou quitosana acoplada à arginina apenas a um grau de funcionalização final de 26% (quadradinhos).
[0045] A FIG. 7 mostra o efeito da funcionalização da arginina percentual sobre a eficiência da transfecção (proteína ng/SEAP/mg; eixo y) por 24mer quitosana derivatizada com arginina a uma concentração final de 52% (A, B) ou 26% (C, D) sozinha (A, C) ou também com ácido glucônico em uma concentração final de 8% (B) ou 6% (D). 24mer quitosana acoplada a 30% de ácido glucônico à concentração inicial de (E) também está incluída como uma referência.
[0046] A FIG. 8 mostra a eficiência de transfecção de 24mer quitosana duplamente derivatizada com arginina e ácido glucônico aos graus de funcionalização final de 26% e 5%, respectivamente (quadradinhos) ou quitosana acoplada a 26% de arginina sozinha (quadradinhos) em células (A) 293T, (B) HT1080 ou linhas de células humanas Hela ou (C) linhas das células do macaco VERO ou murino NIH3T3.
[0047] A FIG. 9 mostra a expressão do gene no músculo 2 dias após a injeção intramuscular de quitosana (A), quitosana funcionalizada com 26% de arginina (B), e quitosana duplamente funcionalizada com graus de funcionalização de 26% de arginina e 5% de ácido glucônico (C).
[0048] A FIG. 10 mostra a expressão do gene no cólon distal músculo 2 dias após a liberação colônica da quitosana (A), quitosana funcionalizada com 26% de arginina (B), e quitosana duplamente funcionalizada com arginina e ácido glucônico nos graus de funcionalização de 26% de arginina e 6% de ácido glucônico (C).
[0049] A FIG. 11 mostra eficiência da redução da expressão in vitro de poliplexos de siRNA luciferase compreendendo 24mer de quitosana produzida em uma razão de amina/fosfato (N/P) de 40 e acoplados (A) a 26% de arginina sozinha ou (B) duplamente derivatizados com 26% de arginina e ácido glucônico em um grau de funcionalização final de 5%.
[0050] A FIG. 12 mostra propriedade físico-química dos poliplexos de ácido nucleico DD-quitosana liofilizado após reconstituição com água após armazenamento de 3 meses a temperatura ambiente.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0051] A quitosana é a forma desacetilada da quitina, que é um polímero de N-acetilglicosamina que é o componente principal do exoesqueleto dos crustáceos (por exemplo, camarão, caranguejo, lagosta). A quitosana é formada da quitina pela desacetilação, não sendo uma molécula polimérica única, mas uma classe de moléculas que têm pesos moleculares diferentes e diferentes graus de desacetilação. A desacetilação percentual nas quitosanas comerciais está, normalmente, entre 50-100%.
[0052] Os derivados da quitosana aqui descritos são gerados pela funcionalização dos grupos de amina livre resultante com carga positiva ou frações neutras, conforme descrito neste instrumento. As quitosanas derivatizadas descritas neste instrumento têm várias propriedades que não vantajosas para um veículo de distribuição de ácido nucleico inclusive: elas se vinculam efetivamente e complexam os ácidos nucleicos negativamente carregados, elas podem ser formadas de nanopartículas de tamanho controlável, elas podem ser absorvidas pelas células e elas podem distribuir ácidos nucleicos no momento oportuno dentro das células.
[0053] As quitosanas com qualquer grau de desacetilação superior a 50% são usadas na presente invenção, com funcionalização entre 1% e 50%. (A funcionalização percentual é determinada em relação ao número de frações de amina livres no polímero de quitosana)). Os graus de desacetilação e a funcionalização transmitem uma densidade de cargas específica ao derivado da quitosana funcionalizada. A densidade da carga resultante afeta a solubilidade, a vinculação do ácido nucleico e a distribuição subsequente e a interação com membranas da célula mamária. Assim, em conformidade com a presente invenção, essas propriedades devem ser otimizadas para uma eficácia ideal. Os exemplos de derivados da quitosana estão descritos em Baker et al; 11/657, 382 depositado em 24 de janeiro de 2007, as quais são incorporados a este instrumento por referência. Em uma modalidade, a quitosana duplamente derivada descrita neste instrumento compreende quitosana que tem um grau de desacetilação de pelo menos 50%. Em uma modalidade, o grau de desacetilação é de pelo menos 60%, mais preferencialmente pelo menos 70%, mais preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 90% e mais preferencialmente pelo menos 95%. Em uma modalidade, a quitosana duplamente derivada descrita neste instrumento compreende quitosana que tem um grau de desacetilação de pelo menos 98%.
[0054] Os derivados da quitosana descritos neste instrumento têm uma variação dos pesos moleculares médios que são solúveis em pH neutro e fisiológico e incluem, para os efeitos desta invenção, pesos moleculares variando de 3 a 110KDa. As modalidades descritas neste instrumento possuem um peso molecular das quitosanas derivatizadas (<25 kDa, por exemplo, de cerca de 5kDa para cerca de 25kDa), as quais têm propriedades de distribuição e transfecção desejáveis e são menores em tamanho e têm solubilidades favoráveis. A quitosana derivatizada com peso molecular médio inferior é geralmente mais solúvel do que aquela com peso molecular mais elevado, sendo a primeira produz um ácido nucleico/complexo de quitosana que distribuirá com mais facilidade o ácido nucleico e resultará no aumento da transfecção das células. Muita literatura se dedicou à otimização de todos esses parâmetros para sistemas de distribuição com base na quitosana.
[0055] Uma pessoa versada na técnica reconhecerá que a quitosana se refere a várias moléculas que têm a estrutura da Fórmula I, onde n é qualquer número inteiro e R1 é hidrogênio. Além disso, há uma referência à quitosana por ela ter peso molecular médio, por exemplo, de 3kD a 110kD, geralmente há referência a várias moléculas de quitosana que têm peso molecular médio de, por exemplo, 3kD a 110kD, respectivamente, em que cada molécula de quitosana pode ter comprimentos diferentes de cadeia (n+2). Também é bem reconhecido que a quitosana denominada "n-mer quitosana" não necessariamente compreende moléculas da Fórmula I, em que cada molécula de quitosana tem um comprimento de cadeia de n+2. Em vez disso, "n-mer quitosana" usado neste instrumento se refere a várias moléculas de quitosana, sendo que cada uma delas pode ter comprimentos de cadeia diferentes, em que a pluralidade tem um peso molecular médio substancialmente similar ou equivalente à molécula de quitosana que tem o comprimento de cadeia n. Por exemplo, 24-mer quitosana pode compreender várias moléculas de quitosana, tendo cada uma delas comprimentos de cadeia diferentes que variam, por exemplo de 7-50, mas que tem peso molecular médio substancialmente similar ou equivalente à molécula de quitosana que tem o comprimento de cadeia 24.
[0056] Os derivados da quitosana funcionalizada descritos neste instrumento são compostos de quitosana duplamente derivatizada, por exemplo, compostos de quitosana-arginina-ácido glucônico. Em geral, os compostos de quitosana-arginina-ácido glucônico têm a seguinte estrutura da Fórmula I
Figure img0003
(I) onde n é um número inteiro de 1 a 2000, α é o grau de funcionalização da arginina,β é o grau de funcionalização do ácido glucônico; ecada R 1é selecionado de maneira independente do hidrogênio, acetil, Fórmula (II) e Fórmula (III).
Figure img0004
[0057] Um método preferencial para a conjugação da quitosana com a arginina e com o ácido glucônico em um meio aquoso, de acordo com a presente invenção, está descrito neste instrumento, no qual Boc-L-arginina (Boc-R) e ácido glucônico (Gluco) são usados. O método utiliza a bem conhecida água solúvel em 1-etil-3-(3-Dimetilaminopropilamina)-carbodiimida (EDC) e N-hidroxisuccinimida (NHS) para catalisar a formação do amido entre uma amina na cadeia principal da quitosana e de um ácido carboxílico no Boc-R ou ácido glucônico.
[0058] Geralmente, a quitosana em solução de HCl diluída com um pH ajustado para um pH de acoplamento alvo de, por exemplo, 6,0 ± 0,5 e mais preferencialmente 6,0 ± 0,2 é primeiro acoplada ao Boc-R ou Gluco, purificado e, em seguida, é acoplada ao segundo grupo funcional. Por exemplo, se a quitosana for primeiro acoplada à arginina, a quitosana acoplada à arginina (R- quitosana) pode ser purificada e, em seguida, acoplada ao ácido glucônico. Inversamente, se a quitosana for primeiro acoplada ao ácido glucônico, a quitosana acoplada ao ácido glucônico (gluco-quitosana) pode ser purificada e, em seguida, acoplada à arginina. Independentemente da ordem do acoplamento, a arginina e o ácido glucônico podem ser acoplados à quitosana usando métodos bem conhecidos.
[0059] Por exemplo, a arginina pode ser acoplada à quitosana ou à quitosana gluco-funcionalizada (gluco-quitosana) adicionando uma mistura de Boc-R e uma solução aquosa de NHS de pH ajustado à quitosana em HCl diluído, seguida da adição de uma solução de água EDC para iniciar o acoplamento à temperatura ambiente por 24 horas. A concentração de amina quitosana, pH da reação e as razões molares de R-COOH sobre amina quitosana e EDC:NHS:R- COOH pode ser previamente calculada e satisfeita para ter um grau de funcionalização final reprodutível da arginina. BOC-R-quitosana pode ser purificado antes da reação De-Boc. De-Boc pode prosseguir em meio de HCl com a concentração de HCl e o tempo de reação controlados. Qualquer despolimerização de quitosana durante de-Boc pode ser monitorada pela medição da viscosidade da solução de reação, a qual foi comprovadamente insignificante, e a eficiência de de-Boc pode ser verificada pelo próton NMR em de-Boc-R- quitosana e Boc-R-quitosana. O grau de funcionalização pode ser determinado a partir de C, análise elementar N de de-Boc-R-quitosana purificada.
[0060] O ácido glucônico pode ser acoplado à quitosana ou à quitosana acoplada à arginina (R-quitosana) a um pH de reação de 6,0 ± 0,3. Nesse pH, o grupo ácido carboxílico do ácido glucônico pode ser atacado por aminas não acopladas na cadeia principal da quitosana de acordo com o mecanismo de reação de substituição nucleofílica. Uma pessoa versada na técnica reconhecerá que, ao acoplar o ácido glucônico a R-quitosana, também é possível que uma pequena quantidade de ácido glucônico possa formar uma ligação covalente com o grupo amina da arginina por meio do mesmo mecanismo, embora seja provável que a reação de substituição nucleofílica ocorra predominantemente com o grupo amina da cadeia principal da quitosana. Dessa forma, em determinadas modalidades, R1 da Fórmula I também pode ser independentemente selecionado a partir do hidrogênio, acetil, Fórmula (II), Fórmula (III) e Fórmula (IV).
Figure img0005
[0061] BOC-R-quitosana, de-Boc-R-quitosana, gluco-quitosana, e/ou quitosana duplamente derivatizada podem ser purificadas pela precipitação ou pelo tratamento da coluna ou por diálise regular, ou diálise de fluxo inverso contra água Milli-Q, usando tubulação de diálise de celulose de corte do peso molecular adequado (MWCO) por meio de uma filtração de fluxo tangencial (TFF) e cartuchos de diafiltração.
[0062] Portanto, “quitosana duplamente derivatizada” ou “DD-quitosana” também se refere à quitosana que foi duplamente funcionalizada ("quitosana duplamente funcionalizada" ou "DF-quitosana"), por exemplo, acoplada à arginina e ao ácido glucônico, sendo que ambos estão covalentemente associados à quitosana. A arginina pode ser covalentemente associada à quitosana tanto como aminoácido único quanto como um polipeptídeo.
[0063] Como usado neste instrumento, salvo se indicado em contrário, os termos "peptídeo" e "polipeptídeo" são usados indistintamente.
[0064] O termo "polipeptídeo" é usado no seu sentido mais amplo para se referir a polipeptídeos convencionais (ou seja, polipeptídeos curtos contendo aminoácidos-D ou L), bem peptídeos equivalentes, peptídeos análogos de peptídeo e peptídeos miméticos que mantêm a atividade funcional desejada. Os peptídeos equivalentes podem diferir dos peptídeos convencionais pela substituição de um ou mais aminoácidos com ácidos orgânicos relacionados, aminoácidos ou similares ou substituição ou modificação de cadeias laterais ou grupos funcionais.
[0065] Os peptídeos miméticos podem ter uma ou mais ligações peptídicas, substituídas por uma ligação alternativa, como é conhecido pela técnica. As partes ou toda a cadeia principal do peptídeo também podem ser substituídas pelos substituintes alquila ou arila cíclica contidos de maneira conforme para restringir a mobilidade das cadeias laterais de aminoácidos funcionais, como conhecido pela técnica.
[0066] Os polipeptídeos desta invenção podem ser produzidos por métodos reconhecidos, como métodos sintéticos e recombinantes que são bem conhecidos na técnica. As técnicas para a síntese de peptídeos são bem conhecidas e incluem aquelas descritas em Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-2456 (1963), Atherton, et al., Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press (1989), and Merrifield, Science 232:341-347 (1986).
[0067] Como usado neste instrumento, o termo “polipeptídeo linear” se refere a um polipeptídeo que não possui grupos de ramificação covalentemente associados às cadeias laterais dos seus aminoácidos constituintes. Como usado neste instrumento, o termo “polipeptídeo ramificado” se refere a um polipeptídeo que compreende grupos de ramificação covalentemente associados às cadeias laterais de seus aminoácidos constituintes.
[0068] Como usado neste instrumento, o termo "aminoácido" inclui os aminoácidos de ocorrência natural, bem como os aminoácidos de ocorrência não- natural como os aminoácidos análogos. O termo "aminoácido" se refere aos aminoácidos (D) ou (L) de ocorrência natural, aos aminoácidos quimicamente modificados, aminoácidos de ocorrência natural como norleucina compostos e quimicamente sintetizados que possuem propriedades conhecidas na técnica com sendo características de um aminoácido.
[0069] Resíduos de aminoácidos em peptídeos são abreviados como padronizado na técnica.
[0070] Em algumas modalidades, se apropriado, DD-quitosana inclui derivados da DD-quitosana derivados, por exemplo, DD quitosana que incorpora uma funcionalização adicional, por exemplo, DD-quitosana com um ligante associado. O termo "Derivados" será entendido como incluindo uma vasta categoria de polímeros à base de quitosana compreendendo unidades de N- acetil-D-glucosamina e/ou D-glucosamina covalentemente modificadas, bem como polímeros à base de quitosana incorporando outras unidades ou ligados a outras frações. Os derivados são baseiam-se frequentemente em uma modificação do grupo hidroxila ou do grupo amina de glucosamina, como realizado com a quitosana funcionalizada pela arginina. Os exemplos de derivados da quitosana incluem, entre outros, quitosana trimetilada, quitosana peguilada, quitosana, quitosana tiolada, quitosana galactosilada, quitosana alquilada, quitosana PEI-incorporada, quitosana modificado por ácido urônico, glicol-quitosana e afins. Para obter mais informações sobre os derivados da quitosana, consulte, por exemplo, p. 63-74 de "Non-viral Gene Therapy", K. Taira, K. Kataoka, T. Niidome (editores), Springer-Verlag, Tóquio, 2005, ISBN 4-431-25122-7; Zhu et al, Chinese Science Bulletin, dezembro de 2007, vol. 52 (23), p. 3207-3215; e Varma et al, Carbohydrate Polymers 55 (2004) 77-93.
[0071] Os sistemas dispersos consistem em matéria particulada, conhecida como fase dispersa, distribuída em um meio contínuo. "Dispersão" de poliplexos de ácido nucleico de DD-quitosana é uma composição compreendendo poliplexos de ácido nucleico de DD-quitosana hidratados, em que os poliplexos são distribuídos em todo o meio.
[0072] Como usado neste instrumento, dispersão “pré-concentrada” é aquela que não sofreu processo de concentração para formar uma dispersão concentrada.
[0073] Como usado neste instrumento, "substancialmente livre" de precipitado do poliplexo significa que a composição está essencialmente livre de partículas que podem ser observadas na inspeção visual.
[0074] Como usado neste instrumento, pH fisiológico se refere a um pH entre 6 e 8.
[0075] Por "poliplexo de ácido nucleico de DD-quitosana" ou seus equivalentes gramaticais entende-se um complexo compreendendo várias moléculas de DD-quitosana e várias moléculas de ácido nucleico. Em uma modalidade preferencial, a quitosana duplamente derivatizada é complexada com o referido ácido nucleico.
[0076] Os poliplexos de ácido nucleico de DD-quitosana compreendem um componente de ácido nucleico e um componente de DD-quitosana. Os poliplexos de ácido nucleico de DD-quitosana podem ser preparados por qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, quitosana funcionalizada e concentrações da matéria-prima de nucleotídeo podem ser ajustadas para acomodar várias razões amina-fosfato (N/P), razões misturadas concentrações do nucleotídeo- alvo. Em algumas modalidades, especialmente em lotes pequenos, por exemplo, lotes inferiores a 2 ml, a quitosana funcionalizada e as matérias-primas do nucleotídeo podem ser lentamente misturadas pingando a matéria-prima do nucleotídeo na matéria-prima da quitosana funcionalizada enquanto o recipiente é colocado em vórtex. Em outras modalidades, a quitosana funcionalizada e as matérias-primas do nucleotídeo podem ser misturadas misturando linearmente os dois fluidos. Em outras modalidades, a dispersão do poliplexo resultante pode ser concentrada pela TFF. Um método preferencial para a formação do poliplexo é divulgado em WO 2009/039657, que está expressamente incorporada a este instrumento em sua totalidade por referência.
[0077] O ácido nucleico da presente invenção conterá geralmente ligações fosfodiéster, embora em alguns casos os ácidos nucleicos análogos incluídos possam ter cadeias principais alternativas ou outras modificações ou frações incorporadas para todos e quaisquer fins, por exemplo, estabilidade e proteção. Outros ácidos nucleicos análogos contemplados incluem aqueles com cadeias principais sem ribose. Além disso, misturas de ácidos nucleicos de ocorrência natural, análogos e ambos podem ser feitos. Os ácidos nucleicos podem ser de fita única ou de fita dupla ou conterem partes da sequência de fita única e de fita dupla. Os ácidos nucleicos incluem, entre outros, DNA, RNA e híbridos em que o ácido nucleico contém qualquer combinação de desoxinucleotídeo e ribonucleotídeo e qualquer combinação de bases, incluindo uracila, adenina, timina, citosina, guanina, inosina, hipoxantina xantina, isocitosina, isoguanina, etc. Os ácidos nucleicos incluem DNA em qualquer forma, RNA em qualquer forma, incluindo com fita tripla, dupla ou única, anti-senso, siRNA, ribozimas, desoxirribozimas, polinucleotídeos, oligonucleotídeos, quimeras, microRNA e seus derivados. Os ácidos nucleicos incluem ácidos nucleicos artificiais, incluindo, entre outros, ácido nucleico peptídico (PNA), poligômero fosforodiamidato morfolino (PMO), ácido nucleico bloqueado (LNA), ácido nucleico glicólico (GNA) e ácido nucleico de treose (TNA).
[0078] Em uma modalidade, o componente do ácido nucleico compreende um ácido nucleico terapêutico. Os poliplexos do ácido nucleico de DD-quitosana são favoráveis ao uso de qualquer ácido nucleico terapêutico conhecido na técnica. Os ácidos nucleicos terapêuticos incluem RNAs terapêuticos, que são moléculas de RNA capazes de exercer um efeito terapêutico em uma célula mamífera. Os RNAs terapêuticos incluem, entre outros, RNAs antisense, siRNAs, RNAs curtos em grampo, micro RNAs e RNAs enzimáticos. Os ácidos nucleicos terapêuticos incluem, entre outros, ácidos nucleicos destinados a formar moléculas triplas, ácidos nucleicos vinculados à proteína, ribozimas, desoxirribosimas e moléculas pequenas de nucleotídeo.
[0079] Muitos tipos de RNAs terapêuticos são conhecidas na técnica. Por exemplo, ver Grimm et al., Therapeutic application of RNAi: o alvo de mRNA está sendo finalmente lido pela primeira vez? J. Clin. Invest., 117:3633-3641, 2007; Aagaard et al., RNAi therapeutics: Principles, prospects and challenges, Adv. Drug Deliv. Rev., 59:75-86, 2007; Dorsett et al., siRNAs: Applications in functional genomics and potential as therapeutics, Nat. Rev. Drug Discov., 3:318-329, 2004. Esses incluem RNA interferente curto de fita dupla (siRNA).
[0080] Os ácidos nucleicos terapêuticos também incluem ácidos nucleicos que codificam proteínas terapêuticas, inclusive proteínas citotóxicas e pró-drogas.
[0081] Em uma modalidade preferencial, o componente do ácido nucleico compreende um construto do ácido nucleico terapêutico. O construto do ácido nucleico terapêutico é capaz de exercer um efeito terapêutico. Os construtos do ácido nucleico terapêutico podem compreender ácidos nucleicos que codificam proteínas terapêuticas, bem como ácidos nucleicos que produzem transcritos que são RNAs terapêuticos. Um ácido nucleico terapêutico pode ser utilizado para realizar a terapia genética, servindo como uma substituição ou intensificação para um gene defeituoso ou para compensar a falta de um produto do gene específico, pela codificação de um produto terapêutico. Um ácido nucleico terapêutico também pode inibir a expressão de um gene endógeno. Um ácido nucleico terapêutico pode codificar todo ou uma parte de um produto de tradução, e pode funcionar pela recombinação com o DNA já presente em uma célula, substituindo, assim, uma parte defeituosa de um gene. Ele também pode codificar uma parte de uma proteína e exercer o seu efeito em virtude da cossupressão de um produto do gene. Em uma modalidade preferencial, o ácido nucleico terapêutico é selecionado a partir daqueles divulgados em U.S.S.N. 11/694.852, os quais são expressamente incorporados a este instrumento por referência.
[0082] Em uma modalidade preferencial, o ácido nucleico terapêutico codifica uma proteína terapêutica que é selecionada a partir do grupo consistindo em hormônios, enzimas, citocinas, quimiocinas, anticorpos, fatores mitogênicos, fatores de crescimento, fatores de diferenciação, fatores que influenciam a angiogênese, fatores que influenciam a formação de coágulos sanguíneo, fatores que influenciam os níveis de glicose no sangue, fatores influenciam o metabolismo da glicose, fatores influenciam o metabolismo lipídico, fatores que influenciam os níveis de colesterol do sangue, fatores que influenciam os níveis de LDL ou HDL no sangue, fatores que influenciam a apoptose celular, fatores que influenciam a ingestão de alimentos, fatores que influenciam o gasto energético, fatores que influenciam o apetite, fatores que influenciam a absorção de nutrientes, fatores que influenciam a inflamação e fatores que influenciam a formação óssea. Especialmente preferencial é a codificação, pelos ácidos nucleicos terapêuticos, da insulina, leptina, antagonista de glucagon, GLP-1, GLP- 2, Grelina, colecistoquinina, hormônio do crescimento, fatores de coagulação, PYY, eritropoietina, inibidores da inflamação, IL-10, antagonistas de IL-17, antagonistas de TNFa, hormônio que libera hormônio do crescimento ou hormônio da paratireoide.
[0083] Regiões de Controle de Expressão
[0084] Em uma modalidade preferencial, um poliplexo da invenção compreende um ácido nucleico terapêutico, que é um construto terapêutico, compreendendo uma região de controle de expressão operativamente ligada a uma região de codificação. O construto terapêutico produz ácido nucleico terapêutico, que pode ser terapêutico por si próprio, ou que pode codificar uma proteína terapêutica.
[0085] Em algumas modalidades, a região de controle da expressão de um construto terapêutico possui atividade constitutiva. Em um número de modalidades preferenciais, a região de controle de expressão de um construto terapêutico não tem atividade constitutiva. Isso proporciona a expressão dinâmica de um ácido nucleico terapêutico. Por expressão "dinâmica" entende-se que é a expressão que muda ao longo do tempo. A expressão dinâmica pode incluir vários desses períodos de expressão baixa ou ausente separados por períodos de expressão detectável. Em um número de modalidades preferenciais, o ácido nucleico terapêutico está operativamente ligado a um promotor regulável. Isso proporciona uma expressão regulável de ácidos nucleicos terapêuticos.
[0086] As regiões de controle de expressão compreendem polinucleotídeos reguladores (às vezes denominados neste instrumento elementos), como promotores e potenciadores, que influenciam a expressão de um ácido nucleico terapêutico operativamente ligado.
[0087] Os elementos de controle de expressão aqui incluídos podem ser provenientes de bactérias, levedura, planta ou animal (mamíferos e não mamíferos). As regiões de controle de expressão incluem sequências de promotor de comprimento, como promotor nativo e elementos potenciadores, bem como subsequências ou variantes do polinucleotídeo que mantêm todo ou parte docomprimento total ou da função não variante (por exemplo, manter determinada quantidade da regulação de nutriente ou da expressão específica dacélula/tecido). Como usado neste instrumento, o termo "funcional" e suas variações gramaticais, quando usado em referência a uma sequência de ácido nucleico, subsequência ou fragmento significa que a sequência tem uma ou mais funções da sequência do ácido nucleico nativo (por exemplo, sequência não variante ou não modificada). Como usado neste instrumento, o termo "variante" significa uma substituição, apagamento, adição ou outra modificação da sequência (por exemplo, derivados químicos como formas modificadas resistentes às nucleases).
[0088] Como usado neste instrumento, o termo "ligação operável" se refere a uma justaposição física dos componentes então descritos para permitir que eles funcionem da maneira pretendida. No exemplo de um elemento de controle de expressão na ligação operável com um ácido nucleico, a relação é tal que o elemento de controle modula a expressão do ácido nucleico. Normalmente, uma região de controle de expressão que modula a transcrição é justaposta próximo à extremidade 5' do ácido nucleico transcrito (ou seja, "a montante"). As regiões de controle da expressão também podem estar localizadas na extremidade 3' da sequência transcrita (ou seja, "a jusante") ou no transcrito (por exemplo, em um íntron). Os elementos de controle de expressão podem estar localizados a uma distância da sequência transcrita (por exemplo, 100 a 500, 500 a 1000, 2000 a 5000 ou mais nucleotídeos a partir do ácido nucleico). Um exemplo específico de um elemento de controle de expressão é um promotor, que está normalmente localizado na posição 5' da sequência transcrita. Outro exemplo específico de um elemento de controle de expressão é um potenciador, que está normalmente localizado na posição 5' ou 3' da sequência transcrita ou dentro da sequência transcrita.
[0089] Determinadas regiões de controle de expressão conferem uma expressão regulável a um ácido nucleico terapêutico ligado operativamente. Um sinal (às vezes denominado estímulo) pode aumentar ou diminuir a expressão de um ácido nucleico terapêutico operativamente ligado a essa região de controle de expressão. Essas regiões de controle de expressão que aumentam a expressão em resposta a um sinal são frequentemente denominadas induzíveis. Essas regiões de controle de expressão que diminui a expressão em resposta a um sinal são frequentemente denominadas repressíveis. Normalmente, ou aumento ou a diminuição conferida por esses elementos é proporcional à quantidade do sinal presente; quanto maior for a quantidade de sinal, maior será o aumento ou a diminuição na expressão.
[0090] Vários promotores reguláveis são conhecidos na técnica. As regiões de controle de expressão induzíveis incluem aquelas que compreendem um promotor induzível que é estimulado com um composto químico molecular. Em uma modalidade, uma região de controle de expressão é responsiva a um produto químico que é distribuível oralmente, mas que não é normalmente encontrado em alimentos. Podem ser encontrados exemplos específicos, por exemplo, na Pat. US n° 5,989,910; 5,935,934; 6,015,709; e 6,004,941.
[0091] Em uma modalidade, o construto terapêutico compreende ainda uma sequência de integração. Em uma modalidade, o construto terapêutico compreende uma sequência de integração única. Em outra modalidade, o construto terapêutico compreende uma primeira e uma segunda sequência de integração para integrar o ácido nucleico terapêutico ou uma parte do mesmo ao genoma de uma célula alvo. Em uma modalidade preferencial, as sequências de integração são funcionais em combinação com um meio para integração que é selecionado a partir do grupo consistindo em marinheiro, bela adormecida, FLP, ΦC31, R, lambda e meio para integração a partir de vírus de integração como AAV, retrovírus e lentivírus.
[0092] Em uma modalidade, a composição em questão compreende ainda um construto não terapêutico além de um construto terapêutico, em que o construto não terapêutico compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica um meio para a integração operativamente ligada a uma segunda região de controle de expressão. Essa segunda região de controle de expressão e a região de controle de expressão operativamente ligada ao ácido nucleico terapêutico podem ser iguais ou diferentes. O meio codificado para integração é preferencialmente selecionado a partir do grupo consistindo em marinheiro, bela adormecida, FLP, Cre, ΦC31, R, lambda e meio para integração a partir de vírus de integração como AAV, retrovírus e lentivírus.
[0093] Para obter mais informações, ver WO2008020318, que está expressamente incorporada a este instrumento em sua integralidade por referência. Em uma modalidade, o ácido nucleico do poliplexo do ácido nucleico da DD-quitosana é um ácido nucleico artificial.
[0094] Os ácidos nucleicos artificiais preferenciais incluem, entre outros, ácido nucleico peptídico (PNA), poligômero fosforodiamidato morfolino (PMO), ácido nucleico bloqueado (LNA), ácido nucleico glicólico (GNA) e ácido nucleico de treose (TNA).
[0095] Em uma modalidade, o ácido nucleico do poliplexo do ácido nucleico da DD-quitosana é ácido nucleico terapêutico. Em uma modalidade, o ácido nucleico terapêutico é um RNA terapêutico. Os RNAs terapêuticos incluem, entre outros, RNAs antisense, siRNA, RNAs curtos em grampo, micro RNA e RNA enzimático.
[0096] Em uma modalidade, o ácido nucleico terapêutico é o DNA.
[0097] Em uma modalidade, o ácido nucleico terapêutico compreende uma sequência de ácido nucléico codificando uma proteína terapêutica.
[0098] Poliplexos
[0099] Em uma modalidade preferencial, os poliplexos das composições compreendem moléculas de quitosana que têm um peso molecular inferior a 110 kDa, mais preferencialmente inferior a 65 kDa, mais preferencialmente inferior a 50 kDA, mais preferencialmente inferior a 40kDa e mais preferencialmente inferior a 30kDa antes da funcionalização. Em algumas modalidades, os poliplexos das composições compreendem quitosana que tem um peso molecular inferior a 15 kDa, inferior a 10 kDa, inferior a 7 kDA, ou inferior a 5kDa antes da funcionalização.
[00100] Em uma modalidade preferencial, os poliplexoscompreendem moléculas de quitosana que têm, em média, menos de 680 unidades do monômero de glucosamina, mais preferencialmente menos de 400unidades do monômero de glucosamina, mais preferencialmente menos de 310unidades do monômero de glucosamina, mais preferencialmente menos de 250unidades do monômero de glucosamina e mais preferencialmente menos de 190unidades do monômero de glucosamina. Em algumas modalidades, os poliplexos compreendem moléculas de quitosana que têm, em média, menos de 95 unidades do monômero de glucosamina, menos de 65 unidades do monômero de glucosamina, menos de 45 unidades do monômero de glucosamina, ou menos de 35 unidades do monômero de glucosamina.
[0100] Em uma modalidade preferencial, os poliplexos em questão têm uma razão de amina e fosfato (N/P) de 2 para 100, por exemplo, 2 para 50, 2 para 40, 2 para 30, 2 para 20, 2 para 5. Preferencialmente, a razão N/P é inversamente proporcional ao peso molecular da quitosana, ou seja, um peso molecular menor de DD-quitosana necessita de uma razão N/P maior e vice- versa.
[0101] Em uma modalidade preferencial, os poliplexos em questão têm um diâmetro hidrodinâmico médio inferior a 1000 nm, mais preferencialmente inferior a 500 nm e mais preferencialmente inferior a 200 nm.
[0102] Em uma modalidade, os poliplexos do ácido nucleico de DD- quitosana têm um potencial zeta médio de pelo menos 0 mV em um pH ácido, por exemplo, pH inferior a 7, mais preferencialmente um pH entre cerca de 4 a 6.
[0103] Em uma modalidade, os poliplexos do ácido nucleico de DD- quitosana têm um potencial zeta médio de +1 a 60 0 mV, mais preferencialmente de +1 a 40 mV, mais preferencialmente de +1 a 30 mV em um pH ácido.
[0104] Em uma modalidade preferencial, o polipeptídeo tem uma carga positiva líquida baixa, neutra ou negativa líquida em pH fisiológico e pKa inferior a 6. Esses poliplexos de ácido nucleico de DD-quitosana apresentam toxicidade celular reduzida e liberação intracelular de ácido nucleico intensificada.
[0105] Os poliplexos do ácido nucleico de DD-quitosana da composição são preferencialmente homogêneos em relação ao tamanho do poliplexo. Portanto, em uma modalidade preferencial, a composição tem um índice de polidispersão ("PDI") médio baixo. Em uma modalidade especialmente preferencial, a dispersão do ácido nucleico de DD-quitosana tem um PDI inferior a 0,5, mais preferencialmente inferior a 0,4, mais preferencialmente inferior a 0,3 e mais preferencialmente inferior a 0,25.
[0106] Os poliplexos das composições em questão possuem, preferencialmente, tamanho substancial estável na composição. Em umamodalidade preferencial, uma composição da invenção compreende poliplexos que aumentam, em média, o diâmetro em menos de 100%, mais preferencialmente menos de 50% e mais preferencialmente menos de 25%, a temperatura ambiente por 6 horas, mais preferencialmente 12 horas, mais preferencialmente 24 horas e mais preferencialmente 48 horas.
[0107] Os poliplexos das composições em questão possuem, preferencialmente, tamanho substancial estável abaixo das condições de resfriamento. Em uma modalidade preferencial, uma composição da invenção compreende poliplexos que aumentam, em média, o diâmetro em menos de 100%, mais preferencialmente menos de 50% e mais preferencialmente menos de 25%, entre 2 e 8°C por 6 horas, mais preferencialmente 12 horas, mais preferencialmente 24 horas e mais preferencialmente 48 horas.
[0108] Os poliplexos das composições em questão possuem, preferencialmente, tamanho substancial estável abaixo das condições de congelamento-descongelamento. Em uma modalidade preferencial, uma composição da invenção compreende poliplexos que aumentam, em média, o diâmetro em menos de 100%, mais preferencialmente menos de 50% e mais preferencialmente menos de 25%, a temperatura ambiente por 6 horas, mais preferencialmente 12 horas, mais preferencialmente 24 horas e mais preferencialmente 48 horas após descongelamento do congelamento a -20 a - 80°C.
[0109] Em uma modalidade preferencial, a composição tem uma concentração de ácido nucleico superior a 0,5 mg/ml e está substancialmente livre do poliplexo precipitado. Mais preferencialmente, a composição tem uma concentração de ácido nucleico de pelo menos 0,6 mg/ml, mais preferencialmente pelo menos 0,75 mg/ml, mais preferencialmente pelo menos 1,0 mg/ml, mais preferencialmente pelo menos 1,2 mg/ml e mais preferencialmente pelo menos 1,5 mg/ml e está substancialmente livre do poliplexo precipitado. As composições são hidratadas. Em uma modalidade preferencial, a composição está substancialmente livre do ácido nucleico não complexado.
[0110] Em uma modalidade preferencial, a composição do poliplexo de ácido nucleico da DD-quitosana é isotônico. Alcançar a isotonicidade, enquanto a estabilidade do poliplexo é mantida, é altamente desejável na formulação das composições farmacêuticas, e essas composições preferenciais são bem adaptadas à formulação farmacêutica e às aplicações terapêuticas.
[0111] Geralmente, as composições compreendendo os poliplexos de ácido nucleico da DD-quitosana são usados para entrar em contato com a célula alvo. Esse contato geralmente resulta na distribuição do ácido nucleico para expressão pela célula alvo. As composições adequadas para os poliplexos de ácido nucleico da DD-quitosana aqui descritas são bem conhecidas na técnica e geralmente estão descritas abaixo.
[0112] Formulações em Pó
[0113] As composições de poliplexo de ácido nucleico da DD-quitosana da invenção incluem pós. Em uma modalidade preferencial, a invenção proporciona uma composição de poliplexo de ácido nucleico da DD-quitosana em pó seco. Em uma modalidade preferencial, a composição de poliplexo de ácido nucleico da DD-quitosana em pó seco é produzido por meio da desidratação de uma dispersão do poliplexo do ácido nucleico de quitosana da invenção.
[0114] Formulações Farmacêuticas
[0115] A presente invenção também proporciona formulações "farmaceuticamente aceitável" ou "fisiologicamente aceitável" compreendendo composições do poliplexo de ácido nucleico da DD-quitosana da invenção. Essas formulações podem ser administradas in vivo a um sujeito de modo a praticar os métodos de tratamento.
[0116] Como usado neste instrumento, os termos "farmaceuticamente aceitável" e "fisiologicamente aceitável" se refere aos transportadores, diluentes, excipientes e similares que podem ser administrados a um sujeito, preferencialmente sem produzir os efeitos colaterais adversos excessivos (por exemplo, náusea, dor abdominal, dores de cabeça, etc.). Esses preparativos para a administração incluem soluções aquosas ou não aquosas estéreis, suspensões e emulsões.
[0117] As formulações farmacêuticas podem ser provenientes de transportadores, diluentes, excipientes, solventes, meio de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos e similares, compatíveis com a administração a um sujeito. Essas formulações podem estar contidas em um comprimido (revestido ou não revestido), cápsula (mole ou dura), microbead, emulsão, grânulo, cristal, suspensão, xarope ou elixir. Compostos ativoscomplementares e conservantes, entre outros aditivos, também podem estar presentes, como por exemplo, em antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes e semelhantes.
[0118] Os excipientes podem incluir um sal, um agente isotônico, uma proteína sérica, um tampão e outro agente de controle do pH, um antioxidante, um espessante, um polímero não carregado, um conservante ou um crioprotetor. Os excipientes usados em composições da invenção podem incluir ainda um agente isotônico e um tampão ou outro agente de controle do pH. Esses excipientes podem ser acrescentados para obter variações preferenciais do pH (cerca de 6,0-8,0) e osmolaridade (cerca de 50-300 mmol/L). Exemplos de tampões adequados são acetato, borato, carbonato, citrato, fosfato e tampão de molécula orgânica sulfonada. Esses tampões podem apresentar uma composição nas concentrações de 0,01 a 1,0% (p/v). Um agente isotônico pode serselecionado a partir daqueles conhecidos na técnica, por exemplo, manitol, dextrose, glucose e cloreto de sódio e outros eletrólitos. Preferencialmente, o agente isotônico é a glicose ou o cloreto de sódio. Os agentes isotônicos podem ser usados em quantidades que transmitem à composição a mesma pressão osmótica ou semelhante a do ambiente biológico no qual estão introduzidos. A concentração do agente isotônico na composição dependerá da natureza do agente particular específico usado e pode variar de cerca de 0,1 a 10%. Quando a glicose é usada, ela é preferencialmente usada na concentração de 1 a 5% p/v, mais especificamente 5% p/v. Quando o agente isotônico é o cloreto de sódio, ele é preferencialmente empregado nas quantidades de até 1% p/v, especificamente 0,9% p/v. As composições da invenção podem conter ainda um conservante. Exemplos de conservantes são polihexametileno biguanida, cloreto benzalcônio, complexos de oxicloro estabilizado (conhecidos como PuriteR), acetato de fenilmercúrio, clorobutanol, ácido sórbico, clorexidina, álcool benzílico, parabenos e timerosal. Normalmente, esses conservantes estão presentes em concentrações de cerca de 0,001 a 1,0%. Além disso, as composições da invenção também podem conter um agente criopreservativo. Os criopreservativos preferenciais são glicose, sacarose, manitol, trealose, sorbitol, dióxido de silício coloidal, dextrano de peso molecular preferencial inferior a 100.000 g/mol, flicerol e polietilenoglicóis de pesos moleculares inferiores a 100.000 g/ml ou misturas dos mesmos. Os preferidos são a glicose, trealose e polietilenoglicol. Normalmente, esses criopreservativos estão presentes em concentrações de cerca de 0,01 a 10%.
[0119] Uma formulação farmacêutica pode ser formulada para que seja compatível com a rota de administração pretendida. Por exemplo, para administração oral, uma composição pode ser incorporada com excipientes e ser usada na forma de comprimidos, pastilhas, cápsulas, por exemplo, cápsulas de gelatina ou revestimentos, revestimentos entéricos (Eudragit® ou Sureteric®). Agentes de ligação farmaceuticamente compatíveis e/ou materiais adjuvantes podem ser incluídos em formulações orais. Os comprimidos, pílulas, cápsulas, pastilhas e afins podem conter qualquer um dos seguintes ingredientes ou compostos de natureza similar: um ligante como celulose microcristalina, goma adragante ou gelatina; um excipiente como amido ou lactose, um agente de desintegração como ácido algínico, Primogel ou amido de milho; um lubrificante como estearato de magnésio ou Sterotes; deslizante como dióxido de silício coloidal; um agente edulcorante como sacarose ou sacarina; ou agente aromatizante como menta, salicilato de metil ou aromatizante.
[0120] As formulações também podem incluir transportadores para proteger a composição da degradação ou eliminação rápida do corpo, como uma formulação de liberação controlada, inclusive sistemas de implante e sistemas de distribuição microencapsulados. Por exemplo, um material retardante como monoestearato de glicerila ou estearato de glicerila sozinho ou em combinação com uma cera, pode ser empregado.
[0121] Supositórios e outras formulações que possam ser administradas por via retal (por exemplo, aquelas administradas por enema) também são contemplados. Ainda em relação à distribuição por via retal, por exemplo, Song et al., Mucosal drug delivery: membranes, methodologies, and applications, Crit. Rev. Ther. Drug. Carrier Syst., 21:195-256, 2004; Wearley, Recent progress in protein and peptide delivery by noninvasive routes, Crit. Rev. Ther. Drug. Carrier Syst., 8:331-394, 1991.
[0122] As formulações farmacêuticas adicionais apropriadas para a administração são conhecidas na técnica e são aplicáveis nos métodos e composições da invenção (ver, por exemplo, Pharmaceutical Sciences (1990) 18a ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa.; The Merck Index (1996) 12a ed., Merck Publishing Group, Whitehouse, N.J.; e PharmaceuticalPrinciples of Solid Dosage Forms, Technonic Publishing Co., Inc., Lancaster, Pa., (1993)).)
[0123] Administração
[0124] Em uma modalidade, o uso da DD-quitosana nos poliplexos de ácido nucleico da DD-quitosana proporciona uma estabilidade prolongada dos poliplexos em pH fisiológico. Isso proporciona uma administração sistêmica efetiva, bem como outras formas de administração.
[0125] Qualquer número de vias de administração é possível e a escolha de uma via específica dependerá, em parte, do tecido alvo. Seringas, endoscópios, cânulas, tubos de intubação, cateteres e outros artigos podem ser usados para administração.
[0126] As doses ou a "quantidade efetiva" para tratamento de um sujeito são preferencialmente suficientes para melhorar um, vários ou todos os sintomas da doença, em uma extensão mensurável ou detectável, apesar de impedir ou inibir uma progressão ou piorar o distúrbio ou a doença ou um sintoma, é um resultado satisfatório. Assim, no caso de uma doença ou distúrbio tratável pela expressão de um ácido nucleico terapêutico no tecido alvo, a quantidade de RNA terapêutico ou de proteína terapêutica produzida para melhorar uma condição tratável por um método de invenção dependerá da doença e do resultado desejado e poderá ser prontamente determinada pela pessoa versada na técnica. As quantidades apropriadas dependerão da doença tratada, do efeito terapêutico desejado, bem como do sujeito individual (por exemplo, biodisponibilidade no sujeito, gênero, idade, etc.) A quantidade efetiva pode ser determinada pela medição dos efeitos psicológicos relevantes.
[0127] As aplicações veterinárias também são contempladas pela presente invenção. Portanto, em uma modalidade, a invenção apresenta métodos de tratamento de mamíferos não humanos, que envolve a administração de nanopartícula baseada em quitosana da invenção a um mamífero não humano que tenha necessidade de tratamento.
[0128] Administração Parenteral
[0129] Os compostos da invenção podem ser administrados diretamente na corrente sanguínea, no músculo ou em um órgão interno. O meio adequado para a administração parenteral inclui intravenoso, intra-arterial, intraperitoneal, intratecal, intraventricular, intrauretral, intracisternal, intramuscular e subcutâneo. Os dispositivos adequados para a administração parenteral incluem injetores de agulha (inclusive micro-agulha), injetores livres de agulha e técnicas de infusão.
[0130] As formulações parenterais são normalmente soluções aquosas que podem conter excipientes como sais, carboidratos e agentes tamponadores, mas, para algumas aplicações, elas podem ser mais adequadamente formuladas como uma solução não aquosa estéril ou como uma forma seca a ser usada juntamente com um veículo adequado como água estéril livre de nitrogênio.
[0131] O preparo das formulações perenterais em condições estéreis, por exemplo, por liofilização, pode ser prontamente conseguida usando técnicas farmacêuticas padronizadas bem conhecidas por aqueles versados na técnica.
[0132] A solubilidade dos compostos usados no preparo das soluções parenterais pode aumentar pelo uso de técnicas de formulação apropriadas, como a incorporação de agentes potenciadores da solubilidade.
[0133] As formulações para a administração parenteral podem ser formuladas para que sejam de liberação imediata e/ou modificada. As formulações da liberação modificada incluem liberação retardada, sustentada, pulsada, controlada, direcionada e programada. Os compostos da invenção podem ser formulados como um sólido, semissólido ou líquido tixotrópico para administração como um depósito implantado proporcionando uma liberação modificada do composto ativo.
[0134] Administração Oral
[0135] As composições em questão podem ser administradas oralmente. A administração oral pode envolver a deglutição de forma que o composto entre no trato gastrointestinal. As composições da invenção também podem ser administradas diretamente para o trato gastrointestinal.
[0136] As formulações adequadas para a administração oral incluem formulações sólidas como comprimidos, cápsulas, cápsulas revestidas contendo particulados ou particulados revestidos, líquidos ou pós, losangos (inclusive cheios de líquido), gomas, multi e nanoparticulados, géis, filmes, óvulos e sprays.
[0137] As formulações líquidas incluem suspensões, soluções, xaropes e elixires. As formulações líquidas podem ser preparadas pela reconstituição de um sólido.
[0138] As formas de dosagem contêm geralmente um desintegrante. Os exemplos de desintegrantes incluem amido glicolato sódico, carboximetilcelulose de sódio, carboximetilcelulose de cálcio, croscarmelose sódica, crospovidona, polivinilpirrolidona, metilcelulose, celulose microcristalina, hidroxipropilcelulose alquil-substituído inferior, amido, amido pré-gelatinizado e alginato de sódio. Geralmente, o desintegrante compreenderá de 1% do peso a 25% do peso, preferencialmente de 5% do peso a 20% do peso da forma da dosagem.
[0139] Os ligantes são geralmente usados para transmitir qualidades coesivas à formulação do comprimido. Os ligantes adequados incluem celulose microcristalina, gelatina, açúcares, polietilenoglicol, gomas naturais e sintéticas, polivinilpirrolidona, amido pré-gelatinizado, hidroxipropilcelulose ehidroxipropilmetilcelulose. Os comprimidos também podem conter diluentes, como lactose (monohidrato, monohidrato seco por pulverização, anidro e similares), manitol, xilitol, dextrose, sacarose, sorbitol, celulose microcristalina, amido e fosfato de cálcio dibásico dihidratado.
[0140] Os comprimidos podem compreender também, opcionalmente, agentes ativos de superfície, como lauril sulfato de sódio e polissorbato 80 como dióxido de silício e talco. Se presentes, os agentes ativos de superfície podem compreender de 0,2% do peso a 5% do peso do comprimido e os deslizantes podem compreender de 0,2% do peso a 1% do peso do comprimido.
[0141] Os comprimidos contêm também, geralmente, estearato de magnésio, estearato de cálcio, estearato de zinco, estearilfumarato de sódio, e misturas de estearato de magnésio com laurilsulfato de sódio. Os lubrificantes compreendem, geralmente, de 0,25% do peso a 10% do peso, preferencialmente de 0,5% do peso a 3% do peso do comprimido.
[0142] Outros ingredientes possíveis incluem antioxidantes, corantes, agentes aromatizantes, conservadores e agentes de mascaramento de sabor.
[0143] As misturas do comprimido podem ser comprimidas diretamente ou por meio de um rolo compressor para formar os comprimidos. As misturas do comprimido ou as partes das misturas podem ser, alternativamente, granuladas úmidas, secas ou fundidas, fundidas congeladas ou extrudadas antes da formação dos comprimidos. A formulação final pode compreender uma ou mais camadas e pode ser revestida ou não revestida; ela pode até ser encapsulada.
[0144] A formulação dos comprimidos é discutida em Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Vol. 1, de H. Lieberman e L. Lachman (Marcel Dekker, Nova York, 1980).
[0145] Os filmes de desintegração oral consumíveis por humanos ou para uso veterinário são normalmente formas de dosagem de filme fino solúvel em água ou expansível em água que pode se dissolver rapidamente ou mucoadesivo e compreendem normalmente um polímero formador de filme, um ligante, um solvente, um umectante, um plastificante, um estabilizador ou emulsificador, um agente modificador de viscosidade e um solvente. Determinados componentes da formulação podem desempenhar mais de uma função.
[0146] Também estão incluídos na invenção grânulos multiparticulados compreendendo uma composição da invenção.
[0147] Outros ingredientes possíveis incluem antioxidantes, corantes, aromatizantes e potenciadores de sabor, conservantes, agentes estimulantes salivares, agentes de refrigeração, co-solventes (inclusive óleos), emolientes, agentes de volume, agentes antiespumantes, surfactantes e agentes que mascaram o sabor.
[0148] Os filmes, de acordo com a invenção, são normalmente preparados pela secagem evaporativa dos filmes aquosos finos revestidos sobre um suporte destacável ou papel. Isso pode ser realizado em um forno de secagem ou túnel, normalmente um secador revestidor ou pelo congelamento a seco ou aspiração a vácuo.
[0149] As formulações sólidas para a administração oral podem ser formuladas para que sejam de liberação imediata e/ou modificada. As formulações da liberação modificada incluem liberação retardada, sustentada, pulsada, controlada, direcionada e programada.
[0150] Outras tecnologias adequadas como dispersões de energia alta e partículas osmóticas e revestidas são conhecidas.
[0151] Administração Tópica
[0152] Os compostos da invenção também podem ser administrados topicamente na pele ou na mucosa, ou seja, por via dérmica ou transdérmica. As formulações típicas para esse fim incluem géis, hidrogéis, loções, soluções, cremes, pomadas, pós finos, compressas, espumas, filmes, adesivos para a pele, bolachas, implantes, esponjas, fibras, ataduras e microemulsões.
[0153] Outros meios de administração tópica incluem distribuição por eletroporação, iontoforese, fonoforese, sonoforese e micro-agulha ou injeção sem agulha (por exemplo, PowderjectTM, Bioject, etc.).
[0154] As formulações para a administração tópica podem ser formuladas para que sejam de liberação imediata e/ou modificada. As formulações da liberação modificada incluem liberação retardada, sustentada, pulsada, controlada, direcionada e programada.
[0155] Administração Intranasal/Por Inalação
[0156] Os compostos da invenção também podem ser administrados por via intranasal ou por inalação, normalmente na forma de um pó seco (sozinho ou como uma mistura, por exemplo, em uma mistura seca com lactose, ou como uma partícula de componente misturado) a partir de um inalador em pó seco ou como um spray em aerossol a partir de um contêiner pressurizado, bomba, spray, atomizador ou nebulizador, com ou sem o uso de um propelente adequado.
[0157] As cápsulas, blisters e cartuchos para uso em um inalador ou insuflador podem ser formulados para que contenham um mix em pó do composto da invenção, uma base em pó adequada como lactose ou amido e um modificador de desempenho com I-leucina, manitol ou estearato de magnésio.
[0158] As formulações para a administração intranasal/por inalação podem ser formuladas para que sejam de liberação imediata e/ou modificada. As formulações da liberação modificada incluem liberação retardada, sustentada, pulsada, controlada, direcionada e programada.
[0159] Administração retal/intravaginal
[0160] Os compostos da invenção podem ser administrados por via retal ou vaginal, por exemplo, na forma de um supositório, pessário ou enema. Manteiga de cacau é a base tradicional para supositório, mas várias alternativas podem ser usadas, conforme apropriado.
[0161] As formulações para a administração retal/vaginal podem ser formuladas para que sejam de liberação imediata e/ou modificada. As formulações da liberação modificada incluem liberação retardada, sustentada, pulsada, controlada, direcionada e programada.
[0162] Administração ocular/Auricular
[0163] Os compostos da invenção também podem ser administrados diretamente no olho ou no ouvido, normalmente na forma de gotas. Outras formulações adequadas para administração ocular e auricular incluem pomadas, implantes biodegradáveis (por exemplo, esponjas de gel absorvível, colágeno) e não biodegradáveis (por exemplo, silicone), pastilhas, lentes e sistemas particulados. As formulações também podem ser distribuídas por iontoforese.
[0164] As formulações para a administração ocular/auricular podem ser formuladas para que sejam de liberação imediata e/ou modificada. As formulações da liberação modificada incluem liberação retardada, sustentada, pulsada, controlada, direcionada ou programada.
[0165] Métodos de Uso
[0166] Em uma modalidade, as composições do poliplexo de ácido nucleico da DD-quitosana da invenção podem ser usados para tratamento terapêutico. Essas composições são, às vezes, denominadas composições terapêuticas neste instrumento.
[0167] As proteínas terapêuticas da invenção, conforme discutido abaixo, são produzidas pelos poliplexos da invenção compreendendo ácidos nucleicos terapêuticos. O uso das proteínas em questão, conforme descrito abaixo, se refere ao uso dos poliplexos em questão para dar efeito ao uso da proteína.
[0168] As proteínas terapêuticas contempladas para uso na invenção têm uma grande variedade de atividades e encontram uso no tratamento de uma ampla variedade de distúrbios. A descrição de atividades da proteína terapêutica a seguir e as indicações tratáveis com proteínas terapêuticas da invenção são exemplos e não se trata de um rol exaustivo. O termo "sujeito" se refere a um anima, com preferência de mamíferos e sendo os humanos especialmente preferenciais.
[0169] Uma lista parcial de proteínas terapêuticas e doenças alvo é apresentada na Tabela 1.
[0170] Tabela 1.
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[0171] Em outra modalidade, as composições terapêuticas da invençãocompreendem ácidos nucleicos terapêuticos que não codificam proteínas terapêuticos, por exemplo, RNAs terapêuticos, por exemplo, selecionando RNAs terapêuticos que alvejam os genes envolvidos nos mecanismos de doença e/ou condições celulares ou fisiológicas indesejáveis, as composições em questão podem ser usadas no tratamento de uma matriz ampla de doenças e condições. As composições em questão têm um caráter de que os RNAs terapêuticos usados não estão limitados em relação ao escopo da seleção alvo. Portanto, as composições em questão encontram uso em qualquer doença ou condição que envolva um alvo adequado.
[0172] Tecidos, doenças e condições preferenciais incluem os seguintesitens, os quais são exemplificativos e, em nenhuma hipótese, são limitantes:
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[0173] Hiperglicemia e Massa Corporal
[0174] As proteínas incluem insulina e análogos da insulina. O diabetes mellitus é uma doença metabólica debilitante causada pela produção de insulina ausente (tipo 1) ou insuficiente (tipo 2) das células-e pancreáticas (Unger, R.H. et al., Williams Textbookof Endocrinology Saunders, Philadelphia (1998)).). As células beta são células endócrinas especializadas que fabricam e armazenam insulina para liberação após a refeição (Rhodes, et. al. J. Cell Biol. 105:145(1987)) e a insulina é um hormônio que facilita a transferência de glicose do sangue para os tecidos em que forem necessários. Os pacientes com diabetes devem monitorar frequentemente os níveis de glicose no sangue e são necessárias muitas injeções de insulina diárias para sua sobrevivência. No entanto, esses pacientes raramente atingem níveis de glicose ideais por meio da injeção de insulina (Turner, R. C. et al. JAMA 281:2005(1999)). Além disso, a elevação prolongada dos níveis de insulina pode resultar em efeitos colaterais prejudiciais como choque hipoglicêmico e dessensibilização da resposta do corpo à insulina. Consequentemente, os pacientes diabéticos ainda desenvolvem complicações a longo prazo, como doenças cardiovasculares, doença renal, cegueira, dano do nervo e distúrbios de cicatrização (UKProspective Diabetes Study (UKPDS) Group, Lancet 352, 837 (1998)).)
[0175] As desordens tratáveis por um método de invenção incluem uma condição hiperglicêmica, como diabetes dependente de insulina (tipo 1) ou independente (tipo 2), bem como condições ou distúrbios fisiológicos associados ou que resultam da condição hiperglicêmica. Assim, condições hiperglicêmicas tratáveis por meio de um método da invenção também incluem uma alteração histopatológica associada com hiperglicemia crônica ou aguda (por exemplo, diabetes). Exemplos particulares incluem degeneração do pâncreas (destruição de células β), calcificação do túbulo renal, degeneração do fígado, lesões oculares (retinopatia diabética), pé diabético, ulcerações na mucosa tais como boca e gengiva, excesso de sangramento, atraso da coagulação sanguínea ou cicatrização de feridas e aumento do risco de doença coronariana, acidente vascular cerebral, doença vascular periférica, dislipidemia, hipertensão e obesidade.
[0176] As composições em questão são úteis para diminuir a glicose, melhorando a tolerância à glicose, tratando a condição hiperglicêmica (por exemplo, diabetes) ou para o tratamento de distúrbios fisiológicos associados ou resultantes de uma condição hiperglicêmica. Esses distúrbios incluem, porexemplo, neuropatia diabética (autonômica), nefropatia (danos nos rins), infecções da pele e outros distúrbios cutâneos, cicatrização lenta ou demorada de lesões ou feridas (por exemplo, que resultam em carbúnculos diabéticos), dano ocular (retinopatia, cataratas) que podem levar à cegueira, pé diabético e periodontite acelerada. Esses distúrbios também incluem um risco elevado de desenvolvimento de doença coronária do coração, derrame, doença vascular periférica, dislipidemia, hipertensão e obesidade.
[0177] Como usado neste documento, o termo "hiperglicêmico" ou "hiperglicemia", quando usado em referência a uma condição de um sujeito, significa um nível anormalmente alto transitório ou crônico de glicose presente no sangue de um sujeito. A condição pode ser causada por um atraso no metabolismo ou absorção da glicose, tal que o sujeito apresenta intolerância à glicose ou um estado de glicose elevada tipicamente não encontrado em sujeitos normais (por exemplo, em sujeitos subdiabéticos intolerantes à glicose em risco de desenvolvimento de diabetes ou em sujeitos diabéticos). Os níveis de glicose (FPG) de plasma em jejum para normoglicemia são inferiores a cerca de 110 mg/dl, para o metabolismo da glicose prejudicado, entre cerca de 110 e 126 mg/dl e para diabéticos superiores a cerca de 126 mg/dl.
[0178] Os distúrbios tratáveis pela produção de uma proteína em um tecido da mucosa do intestino também incluem obesidade ou uma massa corporal indesejável. Leptina, colecistocinina, PYY e GLP-1 diminuem a fome, aumentam o gasto energético, induzem a perda de peso ou provêm a homeostase de glicose normal. Assim, em várias modalidades, um método de invenção para o tratamento da obesidade ou de uma massa corporal indesejável, ou hiperglicemia, envolve o uso de um ácido nucleico terapêutico que codifica leptina, colecistoquinina, PYY ou GLP-1. Em outra modalidade, um RNA terapêutico direcionado à grelina é usado. A grelina aumenta o apetite e a fome. Assim, em várias modalidades, um método da invenção para o tratamento da obesidade ou de uma massa corporal indesejável, ou hiperglicemia, envolve o uso de um RNA terapêutico direcionado à grelina para aumentar a expressão do mesmo. Distúrbios tratáveis também incluem aqueles tipicamente associados à obesidade, por exemplo, soro/plasma LDL anormalmente elevado, VLDL, triglicérides, colesterol, formação de placa levando a estreitamento ou obstrução dos vasos sanguíneos, aumento do risco de hipertensão/acidente vascular cerebral, doença coronariana, etc.
[0179] Como usado neste instrumento, o termo "obeso" ou "obesidade" se refere ao sujeito que têm pelo menos um aumento de 30% da massa corporal em comparação com um sujeito normal de idade e sexo correspondentes. "Massa corporal indesejável" se refere aos sujeitos que têm 1%-29% de massa corporal acima em relação a um sujeito normal, bem como aos sujeitos que são normais em relação à massa corporal, mas que desejam diminuir ou evitar um aumento da sua massa corporal.
[0180] Em uma modalidade, uma proteína terapêutica da invenção é um antagonista do glucagon. O glucagon é o hormônio peptídeo produzido pelas células β em ilhéus pancreáticos e é um regulador importante do metabolismo da glicose (Unger R. H. & Orci L. N. Eng. J. Med. 304:1518(1981); Unger R. H. Diabetes 25:136 (1976)). Enquanto que com a insulina, a concentração de glicose no sangue media a secreção do glucagon. No entanto, ao contrário da insulina, o glucagon é secretado em resposta à diminuição da glicose no sangue. Portanto, as concentrações circulantes do glucagon são mais elevadas durante os períodos de jejum e mais baixas durante a refeição. Os níveis de glucagon aumentam para restringir a insulina de promover o armazenamento da glicose e estimular o fígado para liberar a glicose para o sangue. Um exemplo específico de antagonista do glucagon é [des-His1, des-Fe6, Glu9-glucagon-NH2. Em ratos diabéticos com estreptozotocina, os níveis de glicose no sangue reduziram em 37% em 15 min de um bolus intravenoso (0,75 μg/g do peso corporal) deste antagonista de glucagon (Van Tine B. A. et.al. Endocrinology 137:3316 (1996)). Em outra modalidade, a invenção apresenta um método para o tratamento do diabetes ou da hiperglicemia, compreendendo o uso de um RNA terapêutico para diminuir os níveis de produção do glucagon do pâncreas.
[0181] Em outra modalidade, a proteína terapêutica da invenção útil para o tratamento da condição de hiperglicemia ou de massa corporal indesejável (por exemplo, obesidade) é o peptídeo 1 semelhante ao glucagon (GLP-1). GLP-1 é um hormônio liberado das células L no intestino durante uma refeição que estimula as células β pancreáticas a aumentar a secreção de insulina. GLP-1 tem atividades adicionais que o torna um agente terapêutico atrativo para o tratamento da obesidade e do diabetes. Por exemplo, o GLP-1 reduz o esvaziamento gástrico, suprime o apetite, reduz a concentração de glucagon, aumenta a massa da célula β, estimula a biossíntese e a secreção da insulina de uma maneira dependente da glicose e provavelmente aumenta a sensibilidade do tecido à insulina (Kieffer T. J., Habener J. F. Endocrin. Rev. 20:876 (2000)). Portanto, a liberação regulada de GLP-1 no intestino que coincida com a refeição pode proporcionar um benefício terapêutico para a condição hiperglicêmica ou para uma massa corporal indesejável. Os análogos do GLP-1 que são resistentes ao dipeptidil-peptidase IV (DPP IV) apresentam uma duração mais longa da ação e um valor terapêutico melhor. Assim, os análogos do GLP-1 são polipeptídeos terapêuticos preferenciais. Em outra modalidade, a invenção apresenta um método para o tratamento do diabetes ou da hiperglicemia, compreendendo o uso de um RNA terapêutico para diminuir os níveis de DPP IV
[0182] Em outra modalidade, uma proteína terapêutica da invenção útil para o tratamento de uma condição hiperglicêmica é um antagonista do hormônio resistina. A resistina é um fator derivado do adipócito para o qual a expressão é elevada em formas de obesidade genéticas e induzidas por dieta. A neutralização da resistina circulante melhora a glicose no sangue e a ação da insulina em camundongos obesos. Inversamente, a administração da resistina em camundongos normais prejudica a tolerância à glicose e a ação da insulina (Steppan CM et. al. Nature 409:307 (2001)). A produção de uma proteína que antagoniza os efeitos biológicos da resistina no intestino pode, portanto, oferecer uma terapia efetiva para a resistência à insulina associada à obesidade e para as condições hiperglicêmicas. Em outra modalidade, a invenção apresenta um método para o tratamento do diabetes ou da hiperglicemia, compreendendo o uso de um RNA terapêutico para diminuir os níveis da expressão de resistina no tecido adiposo.
[0183] Em outra modalidade, o polipeptídeo terapêutico da invenção útil para o tratamento da condição de hiperglicemia ou de massa corporal indesejável (por exemplo, obesidade) é a leptina. A leptina, embora produzida principalmente pelas células de gordura, também é produzida em pequenas quantidades, de um modo dependente da refeição, no estômago. A leptina transmite informações sobre o metabolismo das células de gordura e o peso corporal para os centros de apetite no cérebro, onde ele sinaliza a redução da ingestão alimentar (promove a saciedade) e aumenta o gasto de energia do corpo.
[0184] Em outra modalidade, um polipeptídeo terapêutico da invenção útil para o tratamento de uma condição hiperglicêmica ou de massa corporal indesejável (por exemplo, obesidade) é o domínio globular C-terminal da proteína relacionada ao complemento de adipócito (Acrp30). Acrp30 é uma proteína produzida por adipócitos diferentes. A administração de um produto de clivagem proteolítica de Acrp30 consistindo de um domínio globular para camundongos resulta em uma perda de peso significativa (Fruebis J. et al. Proc. NatL Acad. Sci USA 98:2005 (2001)).
[0185] Em outra modalidade, um polipeptídeo terapêutico da invenção útil para o tratamento da condição de hiperglicemia ou de massa corporal indesejável (por exemplo, obesidade) é a colecistoquinina (CCK). CCK é um peptídeo gastrointestinal secretado a partir do intestino em resposta aos nutrientes específicos contidos do intestino. A liberação da CCK é proporcional à quantidade de alimento consumido e acredita-se que sinalize o cérebro para terminar a refeição (Schwartz M. W. et. al. Nature 404:661-71(2000)). Consequentemente, a CCK elevada pode reduzir o tamanho da refeição e promover uma perda de peso ou a estabilização do peso (ou seja, evitar ou inibir aumentos no ganho de peso).
[0186] Em relação ao PYY, ver, por exemplo, le Roux et al., Proc Nutr Soc. 2005 May; 64(2):213-6.
[0187] Distúrbios Imunológicos
[0188] Em uma modalidade, uma composição terapêutica da invenção possui atividade imunomodulatória. Por exemplo, um polipeptídeo terapêutico da presente invenção pode ser útil no tratamento de deficiências ou distúrbios do sistema imunológico, pela ativação ou inibição da proliferação, diferenciação ou mobilização (quimiotaxia) das células imunológicas. As células imunológicas se desenvolvem por meio de um processo de hematopoiese, produzindo mieloide (plaquetas, células vermelhas sanguíneas, neutrófilos e macrófagos) e linfoide (linfócitos B e T) a partir de células-tronco pluripotentes. A etiologia dessasdeficiências ou distúrbios imunológicos pode ser genética, somática, como o câncer ou alguns distúrbios autoimunes adquiridos (por exemplo, por quimioterapia ou toxinas) ou infecciosos.
[0189] Uma composição terapêutica da presente invenção pode ser útil no tratamento de deficiências ou distúrbios de células hematopoiéticas. Por exemplo, um polipeptídeo terapêutico da presente invenção poderia ser usado para aumentar a diferenciação ou a proliferação de células hematopoiéticas, incluindo as células-tronco pluripotentes, em um esforço para tratar esses distúrbios associados com uma diminuição em alguns (ou muitos) tipos de células hematopoiéticas. Os exemplos de síndromes de deficiência imunológica incluem, entre outros: distúrbios da proteína do sangue (por exemplo, agamaglobulinemia, disgamaglobulinemia), ataxia telangiectasia, imunodeficiência comum variável, síndrome de Digeorge, infecção por HIV, infecção por HTLV-BLV, síndrome da deficiência de adesão leucocitária, linfopenia, disfunção bactericida fagocitária, imunodeficiência combinada severa (SCID), síndrome de Wiskott-Aldrich, anemia, trombocitopenia ou hemoglobinúria.
[0190] Uma composição terapêutica da presente invenção pode ser útil no tratamento de distúrbios autoimunes. Muitas doenças autoimunes resultam do reconhecimento inadequado do próprio material como material estranho pelas células imunológicas. Este reconhecimento inadequado resulta em uma resposta imunológica, levando à destruição do tecido hospedeiro. Por conseguinte, a administração de uma composição terapêutica da presente invenção que inibe uma resposta imunológica, em especial, a proliferação, diferenciação ou quimiotaxia de células T, pode ser uma terapia eficaz na prevenção de doenças autoimunes.
[0191] Os exemplos de distúrbios autoimunes que podem ser tratados pela presente invenção incluem, entre outros: Doença de Addison, anemia hemolítica, síndrome antifosfolípide, artrite reumatoide, dermatite, encefalomielite alérgica, glomerulonefrite, Síndrome de Goodpasture, Doença de Graves, esclerose múltipla, Miastenia Gravis, neurite, oftalmia, penfigóide bolhoso, pênfigo, poliendocrinopatia, púrpura, Doença de Reiter, Síndrome de Stiff-Man, tireoidite autoimune, lúpus eritematoso sistêmico, inflamação pulmonar autoimune, SÍNDROME de Guillain-Barré, diabetes mellitis insulino-dependente, Doença de Crohn, colite ulcerativa e doença ocular inflamatória autoimune.
[0192] Da mesma forma, as reações alérgicas e condições, tais como a asma (especialmente asma alérgica) ou outros problemas respiratórios, também podem ser tratadas por uma composição terapêutica da presente invenção. Além disso, essas moléculas podem ser usadas para tratar anafilaxia, hipersensibilidade a uma molécula antigênica, ou incompatibilidade de grupo sanguíneo.
[0193] Uma composição terapêutica da presente invenção também pode ser usada para tratar e/ou prevenir a rejeição de órgãos ou doença do enxerto contra hospedeiro (GVHD). A rejeição de órgãos ocorre pela destruição das células imunológicas hospedeiras do tecido transplantado por meio de uma resposta imunológica. Da mesma forma, uma resposta imunológica também está envolvida na GVHD, mas, neste caso, as células imunológicas transplantadas estranhas destroem os tecidos hospedeiros. A administração de uma composição terapêutica da presente invenção que inibe uma resposta imunológica, em especial, a proliferação, diferenciação ou quimiotaxia de células T, pode ser uma terapia eficaz na prevenção da rejeição de órgãos ou da GVHD.
[0194] Da mesma forma, uma composição terapêutica da presente invenção também pode ser utilizada para modular a inflamação. Por exemplo, o polipeptídeo terapêutico pode inibir a proliferação e a diferenciação das células envolvidas em uma resposta inflamatória. Estas moléculas podem ser usadas para tratar condições inflamatórias, condições crônicas e agudas, inclusive inflamação associada à infecção (por exemplo, choque séptico, sepse ou síndrome da resposta inflamatória sistêmica (SIRS)), lesões de isquemia- reperfusão, letalidade por endotoxinas, artrite, pancreatite, rejeição hiperaguda mediada pelo complemento, nefrite, citocina ou quimiocina induzida por lesão no pulmão, doença inflamatória intestinal (IBD), Doença de Crohn ou resultante da produção excessiva de citocinas (por exemplo, TNF ou IL-1.) Em umamodalidade, um RNA terapêutico direcionado ao TNFα é usado nas composições em questão para tratar a inflamação. Em outra modalidade preferencial, um RNA terapêutico direcionado ao IL-1 é usado nas composições em questão para tratar a inflamação. RNAs terapêuticos siRNA são especialmente preferenciais. Desordens inflamatórias de interesse para o tratamento na presente invenção incluem, entre outros, cistite intersticial, doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), cistite intersticial e doença inflamatória intestinal.
[0195] Distúrbios de coagulação
[0196] Em algumas modalidades, uma composição terapêutica da presente invenção também pode ser usada para modular a atividade hemostática (interrupção do sangramento) ou a atividade trombolítica (formação de coágulo). Por exemplo, aumentando a atividade hemostática ou trombolítica, uma composição terapêutica da presente invenção poderia ser usada para tratar distúrbios de coagulação do sangue (por exemplo, afibrinogenemia, deficiências de fator), transtornos plaquetários (por exemplo, trombocitopenia) ou ferimentos resultantes de trauma, cirurgia ou outras causas. Alternativamente, uma composição terapêutica da presente invenção que pode diminuir a atividade hemostática ou trombolítica poderia ser usada para inibir ou dissolver o coágulo. Estas composições terapêuticas poderiam ser importantes no tratamento de ataques cardíacos (infarto), derrames ou cicatrizes. Em uma modalidade, um polipeptídeo terapêutico da invenção é um fator de coagulação, útil para o tratamento da hemofilia ou outros distúrbios de coagulação (por exemplo, Fator VIII, IX ou X).
[0197] Transtornos Hiperproliferativos
[0198] Em uma modalidade, uma composição terapêutica da invenção é capaz de modular a proliferação celular. Esse polipeptídeo terapêutico pode ser usado para tratar distúrbios hiperproliferativos, inclusive neoplasias.
[0199] Exemplos de distúrbios hiperproliferativos que podem ser tratados por uma composição terapêutica da presente invenção incluem, entre outros, neoplasias localizadas: no abdômen, osso, peito, sistema digestivo, fígado, pâncreas, peritônio, glândulas endócrinas (adrenal, paratireoide, pituitária, testículos, ovário, timo, tireoide), olho, cabeça e pescoço, sistema nervoso (central e periférico), sistema linfático, pélvica, pele, tecidos moles, baço, torácico e urogenital.
[0200] Da mesma forma, outros distúrbios hiperproliferativos também podem ser tratados por uma composição terapêutica da presente invenção. Exemplos desses distúrbios hiperproliferativos incluem, entre outros: hipergamaglobulinemia, distúrbios linfoproliferativos, paraproteinemias, púrpura, sarcoidose, Síndrome de Sézary, Macroglobulinemia de Waldenstrom, Doença de Gaucher, histiocitose e qualquer outra doença hiperproliferativa, além da neoplasia, localizada em um sistema de órgãos listado acima.
[0201] A distribuição para o sistema circulatório proporciona acesso de proteínas terapêuticas para uma grande variedade de tecidos. Alternativamente, uma composição terapêutica da presente invenção pode estimular a proliferação de outras células que podem inibir o distúrbio hiperproliferativo.
[0202] Por exemplo, aumentando uma resposta imunológica, aumentando, especialmente, as antigênicas qualidades do distúrbio hiperproliferativo ou proliferando, diferenciando ou mobilizando células T, os distúrbios hiperproliferativos podem ser tratados. Esta resposta imunológica pode ser aumentada, intensificando uma resposta imunológica existente, ou iniciando uma nova resposta imunológica. Alternativamente, a diminuição de uma resposta imunológica também pode ser um método de tratamento de distúrbios hiperproliferativos, como com um agente quimioterapêutico.
[0203] Doença Infecciosa
[0204] Em uma modalidade, uma composição terapêutica da presente invenção pode ser usada para tratar doenças infecciosas. Por exemplo, aumentando a resposta imunológica, aumentando, especialmente, a proliferação e a diferenciação das células B ou T, as doenças infecciosas podem ser tratadas. Esta resposta imunológica pode ser aumentada, intensificando uma resposta imunológica existente, ou iniciando uma nova resposta imunológica. Alternativamente, a composição terapêutica da presente invenção pode também inibir, diretamente, o agente infeccioso, sem necessariamente provocar uma resposta imunológica.
[0205] Os vírus são um exemplo de agente infeccioso que pode causar doença ou sintomas que podem ser tratados por uma composição terapêutica da presente invenção. Os exemplos de vírus incluem, entre outros, as seguintes famílias de vírus DNA e RNA: Arbovirus, Adenoviridae, Arenaviridae, Arterivirus, Birnaviridae, Bunyaviridae, Caliciviridae, Circoviridae, Coronaviridae, Flaviviridae, Hepadnaviridae (Hepatite), Herpesviridae (such as, Cytomegalovirus, Herpes Simplex, Herpes Zoster), Mononegavirus (por exemplo, Paramyxoviridae, Morbillivirus, Rhabdoviridae), Orthomyxoviridae (por exemplo, Influenza), Papovaviridae, Parvoviridae, Picornaviridae, Poxviridae (como Varíola ou Vaccinia), Reoviridae (por exmeplo, Rotavírus), Retroviridae (HTLV-I, HTLV-II, Lentivírus), e Togaviridae (por exemplo, Rubivirus). Os vírus pertencentes a estas famílias podem causar uma variedade de doenças ou de sintomas, inclusive, entre outros: artrite, bronquiolite, encefalite, infecções oculares (por exemplo, conjuntivite, queratite), síndrome da fadiga crônica, hepatite (A, B, C, E, Ativa Crônica, Delta), meningite, infecções oportunistas (por exemplo, AIDS), pneumonia, Linfoma de Burkitt, catapora, febre hemorrágica, sarampo, caxumba, Parainfluenza, raiva, resfriado comum, poliomielite, leucemia, rubéola, doenças sexualmente transmissíveis, dermatoses (por exemplo, sarcoma de Kaposi, verrugas) e viremia. Uma composição terapêutica da presente invenção pode ser usada para tratar qualquer um destes sintomas ou doenças.
[0206] Da mesma forma, agentes bactericidas ou fúngicos que podem causar doença ou sintomas e que podem ser tratados por uma composição terapêutica da presente invenção incluem, entre outros, as seguintes famílias de bactérias Gram-negativas e Gram-positivas e fungos: Actinomicetos (por exemplo, Corynebacterium, Mycobacterium, Norcardia), aspergilose, bacilos (por exemplo, Anthrax, Clostridium), Bacteroidaceae, blastomicose, Bordetella, Borrelia, brucelose, candidíase, Campylobacter, coccidioidomicose, criptococose, dermatocicoses, enterobactérias (Klebsiella, Salmonella, Serratia, Yersinia), Erysipelothrix, Helicobacter, legionelose, leptospirose, Listeria, Mycoplasmatales, Neisseriaceae (por exemplo, Acinetobacter, gonorreia, Meningocócica), infecções por Pasteurellacea (por exemplo, Actinobacillus, Heamophilus, Pasteurella), Pseudomonas, Rickettsiaceae, Chlamydiaceae, sífilis e Staphylococcal. Estas famílias bacterianas ou fúngicas podem causar as seguintes doenças ou sintomas, incluindo, entre outros: bacteremia, endocardite, infecções oculares (conjuntivite, tuberculose, uveíte), gengivite, infecções oportunistas (por exemplo, infecções relacionadas a AIDS), paroníquia, infecções relacionadas à prótese, Doença de Reiter, infecções do trato respiratório, como coqueluche ou empiema, sepse, Doença de Lyme, doença da arranhadura do gato, disenteria, febre paratifóide, intoxicação alimentar, febre tifoide, pneumonia, gonorreia, meningite, clamídia, sífilis, difteria, lepra, paratuberculose, tuberculose, lúpus, botulismo, gangrena, tétano, impetigo, febre reumática, escarlatina, doenças sexualmente transmissíveis, doenças de pele (por exemplo, celulite, dermatocicose), toxemia, infecções do trato urinário, infecções de ferida. Uma composição terapêutica da presente invenção pode ser usada para tratar qualquer um destes sintomas ou doenças.
[0207] Além disso, agentes parasitas que causam doenças ou sintomas que podem ser tratados por uma composição terapêutica da presente invenção incluem, entre outros, as seguintes famílias: Amebíase, babesiose, coccidiose, criptosporidiose, dientamoebíase, tripanossomíase, ectoparasitas, giardíase, helmintíase, leishmaniose, theileriose, toxoplasmose, tripanossomíase e tricomoníase. Estes parasitas podem causar uma variedade de doenças ou de sintomas, incluindo, entre outros: Escabiose, Trombiculíase, infecções oculares, doença intestinal (por exemplo, disenteria, giardíase), doença hepática, doença pulmonar, infecções oportunistas (por exemplo, infecções relacionadas a AIDS), malária, complicações na gravidez e toxoplasmose. Uma composição terapêutica da presente invenção pode ser usada para tratar qualquer um destes sintomas ou doenças.
[0208] Regeneração
[0209] Uma composição terapêutica da presente invenção pode ser usada para diferenciar, proliferar e atrair as células, promovendo a regeneração dos tecidos. (Ver, Science 276:59-87 (1997).) A regeneração dos tecidos pode ser usada para reparar, substituir ou proteger o tecido danificado por defeitos congênitos, trauma (feridas, queimaduras, incisões ou úlceras), doença associada à idade (por exemplo, osteoporose, osteoartrite, doença periodontal, insuficiência hepática), cirurgia, incluindo cirurgia plástica, fibrose, lesão de reperfusão ou danos sistêmicos da citocina.
[0210] As composições terapêuticas da invenção podem promover a regeneração de uma variedade de tecidos, incluindo, mas não se limitando aos órgãos (por exemplo, pâncreas, fígado, intestino, rins, pele, endotélio), tecido muscular (liso, esquelético ou cardíaco), vascular (incluindo endotélio vascular), nervoso, hematopoiético e esquelético (osso, cartilagem, tendões e ligamento). Preferencialmente, a regeneração incorre em uma pequena quantidade de cicatrizes, ou ocorre sem deixar cicatrizes. A regeneração também pode incluir a angiogênese.
[0211] Além disso, uma composição terapêutica da presente invenção pode aumentar a regeneração dos tecidos difíceis de curar. Por exemplo, o aumento da regeneração do tendão/ligamento aceleraria o tempo de recuperação após o dano. Uma composição terapêutica da presente invenção também poderia ser usada profilaticamente em um esforço para evitar danos. Doenças específicas que podem ser tratadas incluem tendinite, síndrome do túnel do carpo e outros defeitos de tendão ou ligamento. Outro exemplo de regeneração do tecido de feridas não cicatrizadas inclui úlceras de pressão, úlceras associadas à insuficiência vascular, feridas cirúrgica e traumáticas.
[0212] Da mesma forma, o tecido nervoso e cerebral também pode ser regenerado usando uma composição terapêutica da presente invenção para proliferar e diferenciar as células nervosas. Doenças que poderiam ser tratadas usando este método incluem doenças do sistema nervoso periférico e central, neuropatias ou distúrbios mecânicos e traumáticos (por exemplo, distúrbios da medula espinhal, traumatismo craniano, doença cerebrovascular e derrame). Especificamente, doenças associadas às lesões do nervo periférico, neuropatia periférica (por exemplo, resultante de quimioterapia ou outras terapias médicas), neuropatias localizadas e doenças do sistema nervoso central (por exemplo, Mal de Alzheimer, Doença de Parkinson, Doença de Huntington, esclerose lateral amiotrófica e síndrome de Shy-Drager), todas poderiam ser tratadas usando composições terapêuticas da presente invenção. Com relação a doenças do SNC, são conhecidos vários meios na técnica para facilitar o acesso terapêutico ao tecido cerebral, incluindo métodos para interromper a barreira hemato- encefálica e métodos de agentes terapêuticos de acoplamento para frações que fornecem transporte para SNC. Em uma modalidade, um ácido nucleico terapêutico é concebido a fim de codificar uma proteína de fusão, a qual compreende uma fração de transporte e uma proteína terapêutica. Alternativamente, as composições em questão podem ser distribuídas diretamente ao SNC.
[0213] Quimiotaxia
[0214] Em uma modalidade, uma composição terapêutica da invenção pode modular a quimiotaxia. Por exemplo, em uma modalidade, um polipeptídeo terapêutico da presente invenção possui uma atividade de quimiotaxia. Uma molécula quimiotática atrai ou mobiliza células (por exemplo, monócitos, fibroblastos, neutrófilos, células T, mastócitos, eosinófilos, células epiteliais e/ou endoteliais) para um determinado local no corpo, como inflamação, infecção ou local de hiperproliferação. As células mobilizadas podem, então, lutar e/ou curar o trauma específico ou a anormalidade.
[0215] Por exemplo, um polipeptídeo terapêutico da presente invenção pode aumentar a atividade quimiotática de células específicas. Estas moléculas quimiotáticas podem, então, ser usadas para tratar a inflamação, infecção, distúrbios hiperproliferativos ou qualquer distúrbio do sistema imunológico, aumentando o número de células direcionadas para um determinado local no corpo. Por exemplo, as moléculas quimiotáticas podem ser usadas para tratar feridas e outro trauma aos tecidos atraindo células imunológicas para o local lesionado. As moléculas quimiotáticas da presente invenção também podem atrair fibroblastos, que podem ser usados para tratar ferimentos.
[0216] Também é contemplado que uma composição terapêutica da presente invenção pode inibir a atividade quimiotática. Essas composições terapêuticas também podem ser usadas para tratar distúrbios. Assim, uma composição terapêutica da presente invenção poderia ser usada como inibidor da quimiotaxia.
[0217] Especialmente preferencial para uso são as proteínas proterapêuticas que são ativadas na proximidade de tecidos-alvo.
[0218] Polipeptídeos terapêuticos adicionais previstos para uso incluem, entre outros, fatores de crescimento (por exemplo, hormônio do crescimento, fator-1 de crescimento semelhante à insulina, fator de crescimento derivado de plaquetas, fator de crescimento epidérmico, fatores de crescimento fibroblástico básico e ácido, transformando fator-β de crescimento transformador, etc.), para tratar distúrbios de crescimento ou síndromes definhantes; e anticorpos (por exemplo, humano ou humanizado), para oferecer imunização passiva ou proteção de um sujeito contra antígenos estranhos ou patógenos (por exemplo, o H. Pylori), ou oferecer tratamento para câncer, artrite ou doença cardiovascular; citocinas, interferons (por exemplo, interferon (IFN), IFN-α2b e 2α, IFN-αN1, IFN-β1b, IFN- gama), interleucinas (por exemplo, IL-1 a IL-10), fator de necrose tumoral (TNF-α TNF-β), quimiocinas, fator estimulante da colônia de macrófagos e granulócitos (GM-CSF), hormônios polipeptídeos, polipeptídeos antimacrobianos (por exemplo, polipeptídeos antibacterianos, antifúngicos, antivirais e/ou antiparasitários), enzimas (por exemplo, deaminase da adenosina), gonadrotrofinas, quimiotaxias, proteínas vinculantes ao lipídeo, filgrastim (Neupogen), hemoglobina, eritropoietina, insulinotropina, imiglucerase, sarbramostim, ativador de plasminogênio tecidual (tPA), uroquinase, estreptoquinase, fenilalanina amônia- liase, fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), fator de crescimento do nervo (NGF), Trombopoietina (TPO), superóxido dismutase (SOD), adenosina deamidase, calcitonina de catalase, endotelina, pepsina L-asparaginase, uricase tripsina, quimotripsina elastase, lactase carboxipeptidase, fator intrínseco da sacarase, calcitonina, Hormônio semelhante ao hormônio da paratireoide (PTH), CD4 solúvel e/ou fragmentos vinculantes aos anticorpos e/ou antígeno (por exemplo, FAbs) dos mesmos (por exemplo, orthoclone OKT-e (anti-CD3), anticorpo monoclonal GPIIb/IIa). Adicionalmente contemplados são os RNAs terapêuticos que direcionam os ácidos nucleicos que codificam esses fatores.
[0219] Vacina
[0220] Em uma modalidade, a invenção apresenta métodos para a vacinação de um paciente. Os métodos compreendem a administração de uma composição da invenção capaz de produzir o epítopo desejado. Em uma modalidade preferencial, a composição compreende um construto do ácido nucleico terapêutico capaz de expressar uma proteína que compreende o epítopo.
[0221] Aplicações cosméticas
[0222] Em uma modalidade, a invenção apresenta poliplexos do ácido nucleico da DD-quitosana ácido para uso cosmético. Os cosméticos em questão compreendem os poliplexos do ácido nucleico da DD-quitosana em uma formulação adequada para uso cosmético.
[0223] EXEMPLOS
[0224] Formação de quitosana duplamente derivatizada e formação de poliplexos do DNA
[0225] A quitosana foi duplamente derivatizado com arginina e ácido glucônico (DD-quitosana) de acordo com métodos bem conhecidos. A DD- quitosana foi poliplexada com uma codificação do vetor de DNA para fosfatase alcalina secretada (SEAP) ou luciferase siRNA.
[0226] Transfecção In Vitro com poliplexo do DNA
[0227] No geral, transfecção in vitro de células 293T com formulações do poliplexo do ácido nucleico da DD-quitosana foi realizada em duas etapas: preparação de células seguida pela transfecção.
[0228] Manutenção das Linhas da Célula
[0229] A linha da célula 293T foi cortesia do laboratório do Dr. Kieffer na UBC e foi preparada como disposto a seguir. Células de rim humano foram transformadas com antígeno-T SV40; crescimento em Meio Eagle Modificado por Dulbecco de glicose elevada (DMEM) contendo 10% de soro bovino fetal (FBS) e penicilina/estreptomicina; e foram mantidas abaixo de 80% de confluência. HT1080 (células epiteliais do tecido conjuntivo humano) e HeLa (células epiteliais cervicais humanas) são cultivadas em MEM (meio essencial mínimo) contendo 10% FBS e penicilina/estreptomicina; e mantida abaixo de 90% de confluência. VERO (células epiteliais de rim de macaco) são cultivadas em DMEM contendo 10% de FBS inativado pelo calor (56oC por 30min), 1mM de sódio piruvato e 500ug/ml de gentamicina; e mantida abaixo de 90% de confluência. NIH3T3 (fibroblastos embrionários de rato) são cultivados em DMEM contendo 10% de FBS e penicilina/estreptomicina; e mantida abaixo de 90% de confluência.
[0230] Preparação das Células para Transfecção
[0231] As células foram preparadas para transfecção como disposto a seguir. No dia anterior à transfecção, as células 293T foram adicionadas às placas de cultura de tecidos de 6 poços (4,5 x 105 células/poço) em 3mL de meio completo (DMEM de glicose elevada + 10% de FBS + penicilina/estreptomicina). No dia da transfecção, a contagem de células foi determinada para dois poços selecionados pela lavagem de células 1X com células de tripsinização do tampão fosfato-salino (PBS) com 0.5 ml de 0,05% de tripsina, adicionando 0.5 mL do meio completo e contando 10 μl, usando um hemocitômetro. Se as células forem ~ 50% confluentes (~ 7 x 105 células/poço), então a transfecção progrediu. (Se células eram muito escassas ou muito confluentes, não houve progresso na transfecção)). Da mesma forma, no dia anterior à transfecção, as células HeLa foram colocadas em1x 10 5células/poço, enquanto células HT1080, NIH3T3 e VERO foram colocadas em 2 x 105 células/poço em 3 ml de seus respectivos meios completos e a transfecção foi realizada no dia seguinte, em ~ 50% de confluência.
[0232] Transfecção de células
[0233] A transfecção foi realizado da seguinte forma. Primeiro, o meio foi removido de cada poço, seguido pela adição de 1 mL de Opti-mem (pH 7.4) para cada poço, agitando suavemente e, em seguida, a remoção. (Seis poços foram lavados de cada vez para impedir que as células fossem deslocadas)). Em seguida, outro 1 mL de Opti-mem (pH 7.4) foi adicionado cuidadosamente a cada poço para não deslocar as células. Em seguida, as amostras de poliplexo foram adicionadas a cada poço (alvo de 2 μg de DNA), giradas e incubadas a 37°C por 2h. Após a incubação, o meio foi removido e substituído por 2 ml de meio completo e é incubado novamente a 37°C. Nos momentos necessários, o sobrenadante foi removido e armazenado a -20 °C para o ensaio da SEAP subsequente.
[0234] Ensaio da proteína SEAP
[0235] Ensaio de SEAP foi realizado utilizando o kit para Ensaio Quimioluminescente de SEAP. Todos os reagentes para o ensaio foram incubados a 25°C por 30 min antes do uso. Foram preparados padrões para o ensaio pela dissolução de fosfatase alcalina placentária a 1 mg/mL em 1X tampão de diluição do kit marcado com 0.1% albumina do soro bovino e 50% de glicerol e, em seguida, diluindo com um fator de diluições em série de 10 com DMEM para 0,01 pg/uL. Padrões e amostras descongeladas foram então diluídos 1 em 4 com tampão de diluição, inativada pelo calor a 65°C por 30 min, incubada no gelo por 2 min, centrifugada (16100 x rcf por 2 min em RT) e sobrenadantes transferidos para tubos novos. Depois do equilíbrio a 25°C por 5 min, 50 uL de amostras e padrões foram adicionados a cada poço de uma placa de Microlite-1 em duplicado. Em seguida, foi adicionado tampão de inativação (50 uL) em cada bem e pipetado acima e para baixo suavemente para misturar, sem criar bolhas e foi incubado por 5 min. O reagente do potenciador/substrato foi preparado durante a incubação de 5 min a uma razão de 1:19 do substrato para o potenciador. O substrato/potenciador foi, então, adicionado em cada poço, incubado por 20 minutos e, em seguida, a placa foi lida no luminômetro (Lmax11384, Dispositivos Moleculares) com um tempo de integração de 1 seg.
[0236] Ensaio de mRNA SEAP - Reação da Cadeia de Polimerase em Tempo Real Quantitativo (Q-RT-PCR)
[0237] Quantificação relativa da expressão de RNAm SEAP em várias amostras foi determinada por Q-RT-PCR. Brevemente, mRNA total foi extraído e purificado usando o Reagente TRIzol e Q-RT-PCR foi feito usando Superscript II. Os iniciadores do gene SEAP e a sonda fluorogênica foram concebidos usando Primer Express (versão 1.5) (Biossistemas Aplicados, Cidade de Foster, Califórnia). O sistema de detecção da sequência ABI 7000 (Biossistemas Aplicados) foi usado para realizar todas as reações em cadeia da polimerase (PCR) em um volume total de 25 μl. Cada mistura da reação continha IxTaqMan Universal Master Mix, 20 μm de cada iniciador e 10 μM da sonda. Dez microlitres de cada DNA complementar (equivalente a 4.5-45 ng do RNA total transcrito reverso) foram usados em cada reação de PCR. O processo de PCR consistia de uma incubação inicial a 50°C por 2 min, seguido de uma incubação de 10 min a 95°C, 40 ciclos de PCR a 95°C por 15 segundos e 1 minuto a 60°C. Cada placa de ensaio de 96 poços continha menos transcriptase reversa e menos controles do DNA complementar. Os resultados foram normalizados para GAPDH (gene de referência) do gene constitutivo e expressos como a razão da expressão do gene alvo relativo entre o tecido tratado e o tecido de controle não tratado. O método é referido como método do Pfaffl (Pfaffl MW. Nucleic Acids Res (2001) 29:e45)
[0238] Transfecção do Knockdown de siRNA das Células
[0239] Knockdown da expressão do gene foi realizado primeiro, pela transfecção das células hospedeiras com siRNA/poliplexos de DD-quitosana modificados seguidos pela transfecção das mesmas células hospedeiras com DNA/Lipofectamine 2000.
[0240] No dia anterior à transfecção, 9 x 104 foram colocadas 293T células/poço de uma placa de 24 poços em 1 ml de meio completo. No dia da transfecção, as células (50% de confluência) foram lavadas em Opti-mem antes da transfecção. As células foram lavadas removendo o meio no poço, adicionando 0,25 ml de Opti-mem, com agitação no local, seguida da remoção do Opti-mem e da substituição por 0,25 ml de Opti-mem fresco. A transfecção do siRNA foi realizada pela adição de 200 nM de siRNA/poliplexo de quitosana modificado para cada poço e pela incubação a 37 C em uma incubadora 5% CO2. Depois de 2h, o Opti-mem foi removido e substituído por 0,5 ml de meio completo. A transfecção do DNA foi realizada adicionando 0.4 ug de partículas de Lipofectamine contendo Luciferase para cada poço e incubando a 37C em um incubadora 5% CO2. Após 2h, o meio foi removido e substituído por 0,5 ml de meio completo fresco e, em seguida, as células foram devolvidas para a incubadora. Quarenta e oito horas depois da transfecção com siRNA, o lisado celular foi coletado para o ensaio da luciferase. Para a coleta, as células foram lavadas com tampão fosfato-salino de Dulbecco e marcadas com 500ul de tampão de Lise Glo, contendo inibidores de protease livres de EDTA, recolhidos aos tubos após incubação de 5 min e analisados imediatamente ou armazenado a -80°C.
[0241] Ensaio de luciferase
[0242] O ensaio de luciferase foi realizada utilizando o sistema de Ensaio de Luciferase Bright-Glo. O Tampão de Lise Glo, o Tampão Bright-Glo e as amostras para o ensaio foram incubados à temperatura ambiente antes do uso. Os padrões para o ensaio foram preparados diluindo enzima Luciferase Recombinante QuantiLum em 1 X Tampão de Glo Lise contendo inibidor de protease livre de EDTA e 1 mg/ml de BSA para 90 ng/ml e, então, para 30 ng/ml diluindo, em seguida, por um fator de diluições em série de 10 para 0.003 ng/ml. O Substrato Bright-Glo foi reconstituído com Tampão de Bright-Glo para fazer o Reagente do Ensaio de Bright-Glo pelo menos 10 minutos antes do uso. Cem uL das amostras e padrões foram adicionados a cada poço de uma placa de Microlite-1 em duplicado. O Reagente de Ensaio de Bright-Glo (100 uL) foi então adicionado a cada poço e incubado por 2 min no luminômetro e lido com um tempo de integração de 1 seg.
[0243] Animais
[0244] Os protocolos cirúrgicos para os estudos em animais foram aprovados pelo Comitê para Cuidado dos Animais da University of British Columbia. O trabalho com animal foi realizado por uma equipe qualificada e treinada, Fêmeas ~8 semanas de idade CB57BL/6 camundongos foram adquiridos do Laboratório Jackson (Bar Harbour, Maine). Os camundongos foram alojados em 2-4 animais por jaula em um ciclo de 12h de claro/escuro e foi dada uma semana para aclimatarem, bem como comida normal e padrão para roedores (Research Diets Inc., New Brunswick, NJ) e água à vontade. Os ratos foram alojados em instalações para animais no Departamento de Fisiologia, University of British Columbia (UBC).
[0245] Transfecção de Cólon em Camundongos
[0246] Camundongos virgens C57BL/6 foram anestesiados (1,5-2,0% de inalante de isoflurano, Baxter CA2L9108) e foi dada uma única distribuição de enema de poliplexo de DNA da DD-quitosana ou poliplexo de DNA da DD- quitosana funcionalizada carregando plasmídeo gWiz-SEAP em 0,25 mg/mL. Após dois dias, os camundongos foram sacrificados e os tecidos foram colhidos.
[0247] Transfecção em Rato In Vivo: Distribuição de Poliplexo ao Músculo
[0248] Para a distribuição do marcador para o músculo do rato, o poliplexo de DNA da DD-quitosana compreendendo o vetor de expressão SEAP é administrado por injeção na coxa medial. Os camundongos são anestesiados e 50 uL de poliplexo são injetados por seringa. Em vários momentos, os camundongos são sacrificados e seus tecidos musculares são coletados e processados para a expressão de mRNA da SEAP. O DNA é injetado sozinho como controle.
[0249] Liofilização e reconstituição dos poliplexos do ácido nucleico da DD- quitosana com águaOs poliplexos do ácido nucleico da DD-quitosana congelados a -80°C °(280ul cada) foram colocados em um vaso previamente resfriado. O vaso foi então conectado a um liofilizador (SAVANT-Modulyo D). Os poliplexos foram congelados a seco sob pressão constante de 5 torr à temperatura < - 40°C °por mais de 28 horas. Após a liofilização, os poliplexos do ácido nucleico da DD- quitosana foram reconstituídos com água até a concentração original para experimentos posteriores.
[0250] Resultados
[0251] As FIGs. 2-4 e 7 mostram as eficiências da transfecção da quitosana derivatizada com ácido glucônico apenas (FIG. 2A), arginina apenas (FIG. 2B) ou quitosana duplamente derivatizada com ácido glucônico e arginina em comparação com a quitosana derivatizada com apenas arginina ou ácido glucônico (FIGs. 3 e 7). As FIGs. 3 e 7 mostram um efeito sinérgico quando a quitosana é duplamente derivatizada com arginina e ácido glucônico. O efeito sinérgico pode ser visto quando a quitosana é duplamente funcionalizada com arginina em um grau de funcionalização final de 26% e ácido glucônico em graus de funcionalização final variando de 3% a 9%, embora o maior efeito tenha sido visto em um grau de funcionalização final de ácido glucônico de cerca de 5% (FIG. 4; ver também FIG. 7 mostrando um efeito sinérgico com quitosana duplamente funcionalizada com arginina e ácido glucônico em graus de funcionalização final de 26% e 6%, respectivamente). As FIGs. 5 e 6 mostram o efeito da relação N/P e pH da formulação do poliplexo, respectivamente, sobre a eficiência da transfecção. As eficiências de transfecção da quitosana derivatizada com (1) arginina apenas ou (2) arginina e glucônico foram diretamente correlacionados com a relação N/P, embora a quitosana duplamente derivatizada tenha tido uma maior eficiência de transfecção elevada do que a quitosana derivatizada com arginina sozinha em todas as relações de N/P testadas (FIG. 5). Em contraste, o pH não afetou a eficiência de transfecção (FIG. 6). O efeito sinérgico também pode ser visto em linhas de células diferentes ex vivo (FIG. 8), para siRNA (FIG. 11) e in vivo (FIGs. 9-10). Distribuição intramuscular do poliplexo do DNA da DD-quitosana resulta em aumento significativo da expressão de mRNA SEAP em células musculares in vivo (FIG. 9). Além disso, os aumentos relativos no mRNA SEAP no tecido do cólon dos camundongos tratados em relação aos camundongos virgens (não-transfectados) são mostrados (FIG. 10). Os poliplexos de ácido nucleico da DD-quitosana congelada e liofilizada mostrou estabilidade nas propriedades físico-químicas após armazenamento em temperatura ambiente por 3 meses. Esses poliplexos também mantiveram sua estabilidade após incubação durante a noite seguida de reconstituição com água (FIG. 12).
[0252] Estas referências são expressamente incorporadas a este instrumento em sua integralidade por referência.
[0253] Todas as patentes e publicações de patente a que se faz referência neste documento são aqui incorporadas por referência.
[0254] Certas modificações e melhorias ocorrerão aos versados na técnica ao lerem a descrição supra. Deve-se compreender que todas essas modificações e melhorias foram excluídas deste documento em nome da concisão e legibilidade, mas estão devidamente dentro do escopo das reivindicações abaixo.

Claims (24)

1. Nanopartícula de derivado de quitosana caracterizada pelo fato deque compreende quitosana acoplada com ácido glucônico e arginina.
2. Nanopartícula, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelofato de que a referida quitosana é acoplada com ácido glucônico em uma concentração inicial de 5% a 60%.
3. Nanopartícula, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelofato de que a referida quitosana é acoplada com ácido glucônico em uma concentração inicial de 8% a 30%.
4. Nanopartícula, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelofato de que a referida quitosana é acoplada com ácido glucônico em uma funcionalização final de 3% a 10%.
5. Nanopartícula, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelofato de que a referida quitosana é acoplada com ácido glucônico em uma funcionalização final de 5%.
6. Nanopartícula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a5, caracterizada pelo fato de que a referida quitosana é acoplada com arginina em uma concentração de 10% até 55%.
7. Composição que compreende a nanopartícula, conforme definidaem qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que a quitosana é complexada com um ácido nucleico para formar um poliplexo de ácido nucleico de quitosana duplamente derivatizado (DD).
8. Composição, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelofato de que o referido ácido nucleico é DNA ou RNA.
9. Composição, de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizadapelo fato de que a razão de amina para fosfato do referido poliplexo de ácido nucleico de DD-quitosana está entre 2 a 100, entre 2 a 50, entre 2 a 30 ou entre 2 a 15.
10. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizada pelo fato de que o referido poliplexo de ácido nucleico de DD- quitosana possui um grau combinado da funcionalização com a referida arginina e o ácido glucônico de 1-60% ou 1-30%.
11. Composição, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o referido ácido nucleico é selecionado do grupo que consiste em ácido nucleico do peptídeo (PNA), oligômero fosforodiamidato morfolino (PMO), ácido nucleico bloqueado (LNA), ácido nucleico glicólico (GNA) e ácido nucleico de treose (TNA).
12. Composição, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que o referido RNA é selecionado do grupo que consiste em RNA anti- senso, siRNA, RNA curto em grampo, micro RNA e RNA enzimático.
13. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 12, caracterizada pelo fato de que as referidas moléculas de quitosana possuem um peso molecular médio de menos de 110 kDa, menos de 50 kDa, menos de 30 kDA, menos de 10 kDa ou menos de 5 kDa antes da funcionalização com o referido ácido glucônico e a arginina.
14. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 13, caracterizada pelo fato de que o referido poliplexo de ácido nucleico de DD- quitosana possui um índice de polidispersão (PDI) médio selecionado do grupo que consiste em menos de 0,5, menos de 0,4, menos de 0,3 e menos de 0,25.
15. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 14, caracterizada pelo fato de que o referido poliplexo de ácido nucleico de DD- quitosana possui uma razão molar da referida arginina em relação ao referido ácido glucônico entre 100:1 e 1:100, entre 50:1 e 1:50, entre 10:1 e 1:10, entre 5:1 e 1:5, ou entre 2:1 e 1:2.
16. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 15, caracterizada pelo fato de que o referido ácido nucleio codifica uma proteína terapêutica selecionada do grupo que consiste em insulina, leptina, antagonista de glucagon, GLP-1, GLP-2, Grelina, colecistoquinina, um hormônio de crescimento, um fator de coagulação, PYY, eritropoietina, um inibidor da inflamação, uma citocina, um antagonista de IL-17, um antagonista de TNFα, hormônio que libera hormônio de crescimento e hormônio da paratireoide.
17. Composição, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que o referido ácido nucleico codifica insulina, um antagonista de glucacon, GLP-1 ou leptina.
18. Composição, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que o referido ácido nucleico codifica IL-10, um antagonista de TNFα ou um antagonista de IL-17.
19. Composição, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que o referido ácido nucleico codifica leptina, colecistoquinina, PYY ou GLP-1.
20. Composição, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que a referida citocina é IL-10.
21. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 20, caracterizada pelo fato de que a referida composição é isotônica.
22. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 21, caracterizada pelo fato de que o referido poliplexo de ácido nucleico de DD- quitosana é estável em tamanho e aumenta em diâmetro médio em menos de 100% a temperatura ambiente por 6 horas.
23. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 22, caracterizada pelo fato de que o referido poliplexo de ácido nucleico de DD- quitosana possui uma concentração de ácido nucleio entre 0,5 mg/ml e 1,5 mg/ml, e é livre de poliplexo precipitado.
24. Método in vitro para distribuir uma molécula de ácido nucleico a umacélula caracterizado pelo fato de compreender o contato da referida célula com uma composição, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 7 a 23.
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