CN1226054C - 壳聚糖－精氨酸缀合物抗凝血材料的制备方法 - Google Patents
壳聚糖－精氨酸缀合物抗凝血材料的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1226054C CN1226054C CN 03144230 CN03144230A CN1226054C CN 1226054 C CN1226054 C CN 1226054C CN 03144230 CN03144230 CN 03144230 CN 03144230 A CN03144230 A CN 03144230A CN 1226054 C CN1226054 C CN 1226054C
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- chitosan
- arginine
- conjugate
- anticoagulant
- conjugates
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- External Artificial Organs (AREA)
Abstract
本发明公开了一种壳聚糖-精氨酸缀合物抗凝血材料的制备方法，属于生物医学工程领域中的血液相容性材料的制备技术。该方法将壳聚糖溶于N，N，N’，N’-四甲基乙二胺溶液，然后向该溶液加入1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺和N-羟基-丁二酰亚胺偶联剂和精氨酸，在磁力搅拌下室温反应，透析后常温干燥得到的壳聚糖-精氨酸缀合物；在上述的缀合物中，加入氧化葡萄糖醛，进行交联反应制成膜材。本发明优点在于，由于精氨酸本身具有抗凝血性，其分子上的羧基可和壳聚糖上的氨基发生反应，将其作为壳聚糖的缀合物从而提高壳聚糖的抗凝血性能；采用了无细胞毒性的葡萄糖醛交联剂，降低了壳聚糖-精氨酸缀合物的细胞毒性；制备过程简单，易于实现。
Description
技术领域
本发明涉及一种壳聚糖-精氨酸缀合物抗凝血材料的制备方法，属于生物医学工程领域中的血液相容性材料的制备技术。
背景技术
人工器官的主要物质基础是高分子生物材料。高分子生物材料常用于体内植入，因此作为高分子生物材料，首先要考虑其生物相容性。生物相容性包括血液相容性和细胞相容性，对血液相容性而言，最突出的问题是材料与血液接触后血液的凝固。许多合成高分子材料在与血液接触时，两者的界面会发生一系列复杂的相互作用，导致凝血反应和血栓的形成，从而限制了其在医学领域的应用。并且，合成高分子与组织长期接触易产生代谢毒物，这是亟待解决的问题。
壳聚糖是一种生物相容性良好、可降解、无细胞毒性的天然碱性多糖，其结构与细胞外基质成分糖胺聚糖类似。近年来，国内外科研人员从仿生角度出发，对壳聚糖进行羧甲基和磺酸化改性，使改性后的壳聚糖结构类似于肝素，成为类肝素抗凝血材料。Vongchan等人把壳聚糖加入到氯磺酸和二甲基甲酰胺(DMF)形成的配合物中，低温反应得到磺酸化壳聚糖衍生物，通过测定凝血时间、抗FXa的活性、在抗凝血酶(AT III)存在下对FXa的抑制作用等三个方面对改性后的壳聚糖进行抗凝血性能的评估。实验结果表明，该壳聚糖衍生物通过抗凝血酶III来抑制FXa的活性和直接抑制凝血酶的活性。武汉大学的杜予民研究组合成了N-丙酰、N-己酰、N，O-季铵盐取代的磺酸化壳聚糖，并考察了它们的抗凝血性。结果表明，丙酰基和己酰基的引入可提高部分凝血活酶时间(APTT)的活性，而丙酰基也可提高凝血酶的时间。
但是目前所研制的抗凝血材料的抗凝血性尚不十分理想，且常用戊二醛对壳聚糖及其衍生物进行交联，进而制成膜材。但戊二醛的细胞毒性在某种程度上限制了其在生物医学领域的应用。已有研究证实，差不多所有的血液中凝血酶为丝氨酸蛋白酶，其活性受丝氨酸抑制剂(serpin)控制。丝氨酸蛋白酶识别serpin分子中的特定区域P1-P′1，首先形成非共价的复合物，然后形成紧密的丝氨酸蛋白酶复合物。精氨酸恰好处于serpin分子的P1位点。因而精氨酸本身具有抗凝血性，将其作为壳聚糖的缀合物(conjugate)可制备一种新型抗凝血材料。
发明内容
本发明的目的在于提供一种壳聚糖-精氨酸缀合物抗凝血材料的制备方法，以该方法制备的抗凝血材料的部分凝血活酶时间(APTT)与壳聚糖的部分凝血活酶时间(APTT)相比较，有明显的提高，并且所得的交联膜材无细胞毒性。
为达到上述目的，本发明是通过下述技术方案加以实现。
(1)将脱乙酰度80％的分子量5,000-50,000壳聚糖溶于pH4.0-5.0的N，N，N’，N’_四甲基乙二胺(TEMED)溶液，然后向该溶液加入与精氨酸等摩尔量的1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺和N-羟基-丁二酰亚胺偶联剂和精氨酸，精氨酸加入量为与壳聚糖氨基摩尔比的5-80％，在磁力搅拌下室温反应6-10小时，然后经去离子水透析和常温干燥处理得到取代度2-50％的壳聚糖-精氨酸缀合物。
(2)在上述的壳聚糖-精氨酸缀合物加入量为壳聚糖-精氨酸缀合物5-15％的氧化葡萄糖醛，35℃-40℃真空烘箱中反应24小时，经交联后制成膜材。
以生理盐水反复浸泡洗涤后所得壳聚糖-精氨酸缀合物的抗凝血材料。
发明优点在于，由于精氨酸本身具有抗凝血性，其分子上的羧基可和壳聚糖上的氨基发生反应，因而可将其作为壳聚糖的缀合物(conjugate)从而提高壳聚糖的抗凝血性能。在制成膜材的过程中，采用了无细胞毒性的葡萄糖醛交联剂，代替了有毒性的常用的交联剂戊二醛，从而降低了壳聚糖-精氨酸缀合物的细胞毒性。而且壳聚糖-精氨酸缀合物的制备过程简单，易于实现。
附图说明
图1为壳聚糖的13C谱
图2为精氨酸的13C谱
图3为壳聚糖-精氨酸缀合物的13C谱
上述谱图是用400MHz的Varian UNITY plus 400的核磁共振仪测定的，以D2O/H2O(1∶1 w/v)为溶剂。
具体实施方式
结合附图对本发明加以进一步说明：壳聚糖-精氨酸缀合物分子结构式和碳原子的编号下式所示。附图3为壳聚糖-精氨酸缀合物13C谱图，图中化学位移在100.8、56.6、71.6、77.4、74.9、60.1ppm处出现的吸收峰分别归属于壳聚糖的C1、C2、C3、C4、C5、C6。并在化学位移158.2ppm处出现了精氨酸的胍基C12的特征峰，这表明壳聚糖-精氨酸缀合物缀合物的形成。
实施例一：
称取13克高碘酸钠，溶于100克去离子水中，加入10克葡萄糖，置于暗箱中，滴加盐酸10μl调解pH为酸性，室温下反应12小时，依次加入醋酸钡和硫酸钠，分别与未反应的过量高碘酸钠和钡离子反应，离心去除沉淀，上清液经冷冻干燥得氧化葡萄糖醛。
取脱乙酰化度80％、分子量5000的壳聚糖2.0克，加入到用HCl调节pH为的4.8的TEMED溶液中，加入0.0906克1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺和0.0546克N-羟基-丁二酰亚胺，搅拌均匀后，加入精氨酸0.082克，室温下反应8小时后，用去离子水中透析5天，常温干燥得最终产物。将精制过的200mg壳聚糖-精氨酸缀合物溶于去离子水中，加入10mg氧化葡萄糖醛，搅拌均匀后倾入表面光洁的塑料培养皿中，37℃真空烘箱内反应24小时，最终得到交联薄膜。将薄膜样品裁剪成5mm×10mm矩形小块，用0.9％生理盐水浸泡24h后作为抗凝血性能检测的样品，所得样品记为CS1-ArgC1-1；按同样制备步骤和条件，以分子量10000，脱乙酰化度80％，和分子量50000，脱乙酰化度80％的壳聚糖原料制备的具有抗凝血性能的样品，并分别记为CS2-ArgC1-1，CS3-ArgC1-1。
PT、TT、APTT试剂盒均购自Dade Behring公司，贫血小板血浆(PPP)取自20名健康人晨间空腹静脉血，加0.109mol/L柠檬酸钠抗凝液1∶9抗凝，3000r/min离心分离血浆混合而成。把样品膜置于100μL贫血小板血浆(PPP)的试管中，分别测定凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)、部分凝血活酶时间(APTT)。
PT检测：将200μL的ThromborelRS试剂加入试管中，置于37℃水浴1min，同时启动秒表，记录凝固时间，不断地轻轻倾斜试管，观察管内液体停止流动所需的时间，重复3次取平均值。
TT检测：将200μL的Test-ThromborelR试剂加入试管中，置于37℃水浴1min，同时启动秒表，记下凝固时间，重复3次取平均值。
APTT检测：将100μl Actin试剂加入试管中，37℃下水浴3min，加入0.025mol/L的氯化钙，同时启动秒表，记录凝固时间，重复3次取平均值。
实施例二：
取脱乙酰化度80％、分子量5000的壳聚糖2.0克，加入到用HCl调节pH为的4.8的TEMED溶液中，加入0.3624克1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺和0.2184克N-羟基-丁二酰亚胺，搅拌均匀后，加入精氨酸0.328克，室温下反应8小时后，去离子水中透析5天，常温干燥得最终产物。将精制过的200mg壳聚糖-精氨酸缀合物溶于去离子水中，加入10mg氧化葡萄糖醛，搅拌均匀后倾入表面光洁的塑料培养皿中，37℃真空烘箱内反应24小时，最终得到交联薄膜。将薄膜样品裁剪成5mm×10mm矩形小块，用0.9％生理盐水浸泡24h后作为抗凝血性能检测的样品，所得样品记为CS1-ArgC2-1；按同样制备步骤和条件，以分子量10000，脱乙酰化度80％，和分子量50000，脱乙酰化度80％的壳聚糖原料制备的具有抗凝血性能的样品，并分别记为CS2-ArgC2-1，CS3-ArgC2-1。
PT检测：将200μL的ThromborelRS试剂加入试管中，置于37℃水浴1min，同时启动秒表，记录凝固时间，不断地轻轻倾斜试管，观察管内液体停止流动所需的时间，重复3次取平均值。
TT检测：将200μL的Test-ThromborelR试剂加入试管中，置于37℃水浴1min，同时启动秒表，记下凝固时间，重复3次取平均值。
APTT检测：将100μl Actin试剂加入试管中，37℃下水浴3min，加入0.025mol/L的氯化钙，同时启动秒表，记录凝固时间，重复3次取平均值。
实施例三：
取脱乙酰化度80％、分子量50,000的壳聚糖2.0克，加入到pH4.8的TEMED/HCl缓冲溶液中，加入0.5436克1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺和0.3276克N-羟基-丁二酰亚胺，搅拌均匀后，加入精氨酸0.492克，室温下反应8小时后，中和，去离子水中透析5天，冷冻干燥得最终产物。将精制过的200mg壳聚糖-精氨酸缀合物溶于去离子水中，加入10mg氧化葡萄糖醛，搅拌均匀后倾入表面光洁的塑料培养皿中，37℃真空烘箱内反应24小时，最终得到交联薄膜。将薄膜样品裁剪成5mm×10mm矩形小块，用0.9％生理盐水浸泡24h后作为抗凝血性能检测的样品；所得样品记为CS1-ArgC3-1。按同样制备步骤和条件，以分子量10000，脱乙酰化度80％，和分子量50000，脱乙酰化度80％的壳聚糖原料制备的具有抗凝血性能的样品，并分别记为CS2-ArgC3-1，CS3-ArgC3-1。
PT检测：将200μL的ThromborelRS试剂加入试管中，置于37℃水浴1min，同时启动秒表，记录凝固时间，不断地轻轻倾斜试管，观察管内液体停止流动所需的时间，重复3次取平均值。
TT检测：将200μL的Test-ThromborelR试剂加入试管中，置于37℃水浴1min，同时启动秒表，记下凝固时间，重复3次取平均值。
APTT检测：将100μl Actin试剂加入试管中，37℃下水浴3min，加入0.025mol/L的氯化钙，同时启动秒表，记录凝固时间，重复3次取平均值。
对比例一：
将精制过的200mg壳聚糖(分子量5000，取代度80％)溶于去离子水中，加入10mg氧化葡萄糖醛，搅拌均匀后倾入表面光洁的塑料培养皿中，37℃真空烘箱内反应24小时，最终得到交联薄膜。将薄膜样品裁剪成5mm×10mm矩形小块，用生理盐水浸泡24h后作为抗凝血性能检测的样品。制备的样品为CS-1，按同样制备步骤和条件，以分子量10000，脱乙酰化度80％，和分子量50000，脱乙酰化度80％的壳聚糖原料制备的具有抗凝血性能的样品，并分别记为CS-2和CS-3。
PT检测：将200μL的ThromborelRS试剂加入试管中，置于37℃水浴1min，同时启动秒表，记录凝固时间，不断地轻轻倾斜试管，观察管内液体停止流动所需的时间，重复3次取平均值。
TT检测：将200μL的Test-ThromborelR试剂加入试管中，置于37℃水浴1min，同时启动秒表，记下凝固时间，重复3次取平均值。
APTT检测：将100μl Actin试剂加入试管中，37℃下水浴3min，加入0.025mol/L的氯化钙，同时启动秒表，记录凝固时间，重复3次取平均值。
对上述的实施例和对比例所得到的样品采用L-929成纤维细胞，琼脂糖覆盖法按照国标ISO10993-5进行细胞毒性的检测。其检测结果列入下表，表中“-”表示无细胞毒情，凝血性能的检测数值为三次试验的平均值±σ。
| 样品 | TT(s) | PT(s) | APTT(s) | 细胞毒性 |
| CS1 | 17.9±1.2 | 14.8±1.0 | 34.7±1.7 | - |
| CS2 | 17.7±1.5 | 15.1±1.1 | 33.1±2.0 | - |
| CS3 | 18.4±1.8 | 15.2±1.5 | 34.9±2.2 | - |
| CS1-ArgC1-1 | 20.2±1.3 | 17.9±2.1 | 66.7±2.6 | - |
| CS1-ArgC2-1 | 26.1±1.6 | 18.4±1.4 | 70.2±2.1 | - |
| CS1-ArgC3-1 | 19.0±0.8 | 18.3±0.5 | 87.5±3.0 | - |
| CS2-ArgC1-1 | 18.5±0.9 | 20.i±1.7 | 68.1±2.6 | - |
| CS2-ArgC2-1 | 20.7±0.8 | 25.1±0.2 | 73.7±3.2 | - |
| CS2-ArgC3-1 | 18.9±0.7 | 19.2±0.9 | 80.1±2.7 | - |
| CS3-ArgC1-1 | 23.2±0.3 | 27.8±1.5 | 71.5±3.4 | - |
| CS3-ArgC2-1 | 17.2±1.6 | 18.2±0.9 | 74.7±2.4 | - |
| CS3-ArgC3-1 | 18.4±1.1 | 15.2±2.3 | 85.1±3.8 | - |
Claims (1)
1.一种壳聚糖-精氨酸缀合物抗凝血材料的制备方法，其特征在于：
(1)将脱乙酰度80％的分子量5,000-50,000壳聚糖溶于pH4.0-5.0的N，N，N’，N’-四甲基乙二胺溶液，然后向该溶液加入与精氨酸等摩尔量的1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺和N-羟基-丁二酰亚胺偶联剂和精氨酸，精氨酸加入量为与壳聚糖氨基摩尔比的5-80％，在磁力搅拌下室温反应6-10小时，然后经去离子水透析和常温干燥处理得到取代度2-50％的壳聚糖-精氨酸缀合物；
(2)在上述的壳聚糖-精氨酸缀合物加入量为壳聚糖-精氨酸缀合物5-15％的氧化葡萄糖醛，35℃-40℃真空烘箱中反应24小时，经交联后制成膜材，以生理盐水反复浸泡洗涤后所得壳聚糖-精氨酸缀合物的抗凝血材料。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 03144230 CN1226054C (zh) | 2003-09-02 | 2003-09-02 | 壳聚糖－精氨酸缀合物抗凝血材料的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 03144230 CN1226054C (zh) | 2003-09-02 | 2003-09-02 | 壳聚糖－精氨酸缀合物抗凝血材料的制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1519035A CN1519035A (zh) | 2004-08-11 |
| CN1226054C true CN1226054C (zh) | 2005-11-09 |
Family
ID=34286590
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 03144230 Expired - Fee Related CN1226054C (zh) | 2003-09-02 | 2003-09-02 | 壳聚糖－精氨酸缀合物抗凝血材料的制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN1226054C (zh) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8119780B2 (en) | 2006-06-02 | 2012-02-21 | Synedgen, Inc. | Chitosan-derivative compounds and methods of controlling microbial populations |
| WO2013138930A1 (en) * | 2012-03-21 | 2013-09-26 | Engene, Inc. | Dually derivatized chitosan nanoparticles and methods of making and using the same for gene transfer in vivo |
| CN103539866A (zh) * | 2012-07-09 | 2014-01-29 | 中国医学科学院生物医学工程研究所 | 可控性精氨酸偶联壳聚糖的制备方法 |
| CN106632726A (zh) * | 2015-10-29 | 2017-05-10 | 天津工业大学 | 一种壳聚糖接枝精氨酸的方法 |
| CN108635340B (zh) * | 2018-05-11 | 2021-07-30 | 昆明医科大学第二附属医院 | 一种曲安奈德高分子药物长效缓释膜片及其制备方法 |
| CN108721254B (zh) * | 2018-05-11 | 2021-07-30 | 昆明医科大学第二附属医院 | 一种紫杉醇-n-琥珀酰羟乙基壳聚糖高分子药物长效缓释膜片及其制备方法 |
-
2003
- 2003-09-02 CN CN 03144230 patent/CN1226054C/zh not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1519035A (zh) | 2004-08-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ma et al. | Anticoagulant sodium alginate sulfates and their mussel-inspired heparin-mimetic coatings | |
| JP5165298B2 (ja) | 新規なヘパリン様硫酸化多糖類 | |
| JP4278716B2 (ja) | Ｎ−硫酸化ヒアルロン酸化合物、その誘導体および製造方法 | |
| KR100375299B1 (ko) | 히알루론산의 가교결합형 아마이드 유도체와 이의 제조방법 | |
| CN101200504B (zh) | 高分子巯基化改性衍生物及其交联材料 | |
| Vikhoreva et al. | Preparation and anticoagulant activity of a low-molecular-weight sulfated chitosan | |
| JP3121019B2 (ja) | 水溶性を増大させるための繰返しポリマーの化学修飾 | |
| US4740594A (en) | Dextran derivatives endowed, particularly with anti-coagulant properties and anti-complementary properties, their preparation and their biological uses | |
| JP2001510713A (ja) | 物理的な止血活性および塞栓活性、および吻合後の癒着形成についての予防活性を有している生体適合材料の製造におけるヒアルロン酸誘導体の使用 | |
| CN101429287B (zh) | 一种高抗凝血纤维素膜材料及其制备方法 | |
| WO2004022603A1 (en) | Hyaluronic acid derivatives and processes for preparing the same | |
| JP2002536465A (ja) | ヒアルロン酸をポリマーに架橋する方法 | |
| Yixue et al. | Modification of agarose with carboxylation and grafting dopamine for promotion of its cell-adhesiveness | |
| Wang et al. | Introducing multiple bio-functional groups on the poly (ether sulfone) membrane substrate to fabricate an effective antithrombotic bio-interface | |
| JPH0140630B2 (zh) | ||
| CN110028692B (zh) | 一种基于离子键-共价键协同表面肝素化抗凝血医用装置的制备方法 | |
| Zhao et al. | Highly hemo-compatible, mechanically strong, and conductive dual cross-linked polymer hydrogels | |
| CN1226054C (zh) | 壳聚糖－精氨酸缀合物抗凝血材料的制备方法 | |
| CN111533827B (zh) | 一种负电性多糖季铵盐止血材料及其制备方法及应用 | |
| CN115068697A (zh) | 一种基于超支化聚季铵盐的抗菌复合材料 | |
| Magnani et al. | Sulphated hyaluronic acids: a chemical and biological characterisation | |
| US5606012A (en) | Polyetheramidoamine hydrogels as heparinizable materials | |
| CN110804104A (zh) | 一种细胞膜仿生表面改性细菌纤维素及其制备方法与应用 | |
| Mincheva et al. | Novel polyelectrolyte complexes between N-carboxyethylchitosan and synthetic polyelectrolytes | |
| CN114225097B (zh) | 一种负载抗菌肽的可自愈水凝胶创面敷料及其制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C19 | Lapse of patent right due to non-payment of the annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |