CN110520534A - 程序性死亡配体1的肠表达 - Google Patents
程序性死亡配体1的肠表达 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110520534A CN110520534A CN201780072387.3A CN201780072387A CN110520534A CN 110520534 A CN110520534 A CN 110520534A CN 201780072387 A CN201780072387 A CN 201780072387A CN 110520534 A CN110520534 A CN 110520534A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- nucleic acid
- cell
- polypeptide
- sequence
- human
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108010074708 B7-H1 Antigen Proteins 0.000 title claims abstract description 173
- 102000008096 B7-H1 Antigen Human genes 0.000 title claims abstract description 26
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 title abstract description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 32
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 31
- 230000004968 inflammatory condition Effects 0.000 claims abstract description 16
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 93
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 80
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 80
- 208000024908 graft versus host disease Diseases 0.000 claims description 30
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 27
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 27
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 27
- 208000009329 Graft vs Host Disease Diseases 0.000 claims description 26
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 22
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 18
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 16
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 15
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 14
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 14
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 12
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 10
- 101001117317 Homo sapiens Programmed cell death 1 ligand 1 Proteins 0.000 claims description 9
- 238000005457 optimization Methods 0.000 claims description 9
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 claims description 9
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 claims description 8
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 claims description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 7
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 claims description 6
- 230000004540 complement-dependent cytotoxicity Effects 0.000 claims description 6
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 claims description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 5
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 5
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 claims description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 4
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 claims description 3
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 claims description 3
- 102000048776 human CD274 Human genes 0.000 claims description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 3
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims description 3
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 claims description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims 2
- 208000004232 Enteritis Diseases 0.000 claims 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 56
- 102100024216 Programmed cell death 1 ligand 1 Human genes 0.000 description 130
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 122
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 49
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 39
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 33
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 31
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 30
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 27
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 27
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 25
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 22
- 102100040678 Programmed cell death protein 1 Human genes 0.000 description 19
- 101710089372 Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 description 19
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 19
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 18
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 17
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 17
- 125000003729 nucleotide group Chemical class 0.000 description 17
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 15
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 14
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 13
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 13
- 239000010408 film Substances 0.000 description 12
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 11
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 11
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 11
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 11
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 10
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 10
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 10
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 9
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 9
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 8
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 8
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 7
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 7
- 206010009887 colitis Diseases 0.000 description 7
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 7
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 7
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 7
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 7
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 7
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 7
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 7
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 7
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 6
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 6
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 6
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 6
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 6
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 6
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 6
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 6
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 206010015548 Euthanasia Diseases 0.000 description 5
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 5
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 5
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 5
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 5
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 5
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 5
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 5
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 5
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 5
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 5
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 4
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 108091006020 Fc-tagged proteins Proteins 0.000 description 4
- -1 ICOS Proteins 0.000 description 4
- 229920000168 Microcrystalline cellulose Polymers 0.000 description 4
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 4
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 4
- 206010051379 Systemic Inflammatory Response Syndrome Diseases 0.000 description 4
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 4
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 4
- 230000006196 deacetylation Effects 0.000 description 4
- 238000003381 deacetylation reaction Methods 0.000 description 4
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 230000003760 hair shine Effects 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 235000019813 microcrystalline cellulose Nutrition 0.000 description 4
- 239000008108 microcrystalline cellulose Substances 0.000 description 4
- 229940016286 microcrystalline cellulose Drugs 0.000 description 4
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 4
- 235000010603 pastilles Nutrition 0.000 description 4
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 4
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 4
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 4
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 4
- 229940032147 starch Drugs 0.000 description 4
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 4
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 4
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 4
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- TVZRAEYQIKYCPH-UHFFFAOYSA-N 3-(trimethylsilyl)propane-1-sulfonic acid Chemical compound C[Si](C)(C)CCCS(O)(=O)=O TVZRAEYQIKYCPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 3
- 241000792859 Enema Species 0.000 description 3
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 3
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 3
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 3
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 3
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 3
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 3
- 239000007920 enema Substances 0.000 description 3
- 229940095399 enema Drugs 0.000 description 3
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 3
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 3
- 238000007306 functionalization reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 3
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 3
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 3
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 3
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 3
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 3
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 3
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 3
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 3
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 3
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 3
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 3
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 2
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 2
- 208000014997 Crohn colitis Diseases 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091093094 Glycol nucleic acid Proteins 0.000 description 2
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 2
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 2
- 229920002153 Hydroxypropyl cellulose Polymers 0.000 description 2
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 2
- 229920000881 Modified starch Polymers 0.000 description 2
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 2
- 240000007019 Oxalis corniculata Species 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 2
- 206010063837 Reperfusion injury Diseases 0.000 description 2
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 2
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 2
- 206010040070 Septic Shock Diseases 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 2
- 108091046915 Threose nucleic acid Proteins 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 2
- 102100033019 Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 11 Human genes 0.000 description 2
- 101710116241 Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 11 Proteins 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;sodium Chemical compound [Na].CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 2
- XMQFTWRPUQYINF-UHFFFAOYSA-N bensulfuron-methyl Chemical compound COC(=O)C1=CC=CC=C1CS(=O)(=O)NC(=O)NC1=NC(OC)=CC(OC)=N1 XMQFTWRPUQYINF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 2
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 2
- OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N chlorobutanol Chemical compound CC(C)(O)C(Cl)(Cl)Cl OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000005253 cladding Methods 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 229940075614 colloidal silicon dioxide Drugs 0.000 description 2
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 230000037011 constitutive activity Effects 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 2
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 2
- RBLGLDWTCZMLRW-UHFFFAOYSA-K dicalcium;phosphate;dihydrate Chemical compound O.O.[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O RBLGLDWTCZMLRW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 2
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 235000011194 food seasoning agent Nutrition 0.000 description 2
- 238000002825 functional assay Methods 0.000 description 2
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 239000001863 hydroxypropyl cellulose Substances 0.000 description 2
- 235000010977 hydroxypropyl cellulose Nutrition 0.000 description 2
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 2
- 208000012947 ischemia reperfusion injury Diseases 0.000 description 2
- XUWPJKDMEZSVTP-LTYMHZPRSA-N kalafungina Chemical compound O=C1C2=C(O)C=CC=C2C(=O)C2=C1[C@@H](C)O[C@H]1[C@@H]2OC(=O)C1 XUWPJKDMEZSVTP-LTYMHZPRSA-N 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 230000006651 lactation Effects 0.000 description 2
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 2
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 2
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 150000004682 monohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 2
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 2
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 150000004804 polysaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 2
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 2
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 2
- 230000036303 septic shock Effects 0.000 description 2
- 208000013223 septicemia Diseases 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 2
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 2
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 2
- 239000007916 tablet composition Substances 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- JCZPMGDSEAFWDY-SQOUGZDYSA-N (2r,3s,4r,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanamide Chemical compound NC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO JCZPMGDSEAFWDY-SQOUGZDYSA-N 0.000 description 1
- JCIIKRHCWVHVFF-UHFFFAOYSA-N 1,2,4-thiadiazol-5-amine;hydrochloride Chemical compound Cl.NC1=NC=NS1 JCIIKRHCWVHVFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-2,4-dioxo-1,3-diazinane-5-carboximidamide Chemical compound CN1CC(C(N)=N)C(=O)NC1=O IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VBICKXHEKHSIBG-UHFFFAOYSA-N 1-monostearoylglycerol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)CO VBICKXHEKHSIBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000004998 Abdominal Pain Diseases 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000032116 Autoimmune Experimental Encephalomyelitis Diseases 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000008203 CTLA-4 Antigen Human genes 0.000 description 1
- 108010021064 CTLA-4 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 229940045513 CTLA4 antagonist Drugs 0.000 description 1
- 101100491335 Caenorhabditis elegans mat-2 gene Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- GHXZTYHSJHQHIJ-UHFFFAOYSA-N Chlorhexidine Chemical compound C=1C=C(Cl)C=CC=1NC(N)=NC(N)=NCCCCCCN=C(N)N=C(N)NC1=CC=C(Cl)C=C1 GHXZTYHSJHQHIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 1
- 229920002785 Croscarmellose sodium Polymers 0.000 description 1
- RGHNJXZEOKUKBD-UHFFFAOYSA-N D-gluconic acid Natural products OCC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O RGHNJXZEOKUKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000305071 Enterobacterales Species 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 229920001503 Glucan Polymers 0.000 description 1
- RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-N Gluconic acid Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 206010019233 Headaches Diseases 0.000 description 1
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 101000611936 Homo sapiens Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108700002232 Immediate-Early Genes Proteins 0.000 description 1
- 102100026878 Interleukin-2 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 244000246386 Mentha pulegium Species 0.000 description 1
- 235000016257 Mentha pulegium Nutrition 0.000 description 1
- 235000004357 Mentha x piperita Nutrition 0.000 description 1
- 239000004909 Moisturizer Substances 0.000 description 1
- 101100519207 Mus musculus Pdcd1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101001117316 Mus musculus Programmed cell death 1 ligand 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N N-Vinyl-2-pyrrolidone Chemical compound C=CN1CCCC1=O WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010028813 Nausea Diseases 0.000 description 1
- 240000002853 Nelumbo nucifera Species 0.000 description 1
- 235000006508 Nelumbo nucifera Nutrition 0.000 description 1
- 235000006510 Nelumbo pentapetala Nutrition 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 241000282577 Pan troglodytes Species 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 229920002413 Polyhexanide Polymers 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 230000033540 T cell apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100022153 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Human genes 0.000 description 1
- 101710165473 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Proteins 0.000 description 1
- 201000006704 Ulcerative Colitis Diseases 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N Xylitol Natural products OCCC(O)C(O)C(O)CCO TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WGKMWBIFNQLOKM-UHFFFAOYSA-N [O].[Cl] Chemical compound [O].[Cl] WGKMWBIFNQLOKM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003070 absorption delaying agent Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 208000024340 acute graft versus host disease Diseases 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000000783 alginic acid Substances 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 229960001126 alginic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000004781 alginic acids Chemical class 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 229960000686 benzalkonium chloride Drugs 0.000 description 1
- CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N benzyl(dimethyl)azanium;chloride Chemical compound [Cl-].C[NH+](C)CC1=CC=CC=C1 CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-QZABAPFNSA-N beta-D-glucosamine Chemical group N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-QZABAPFNSA-N 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000003139 biocide Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 238000010322 bone marrow transplantation Methods 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960005069 calcium Drugs 0.000 description 1
- 235000001465 calcium Nutrition 0.000 description 1
- CJZGTCYPCWQAJB-UHFFFAOYSA-L calcium stearate Chemical compound [Ca+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O CJZGTCYPCWQAJB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000013539 calcium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 239000008116 calcium stearate Substances 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 230000035605 chemotaxis Effects 0.000 description 1
- 229960003260 chlorhexidine Drugs 0.000 description 1
- 229960004926 chlorobutanol Drugs 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 1
- 229940099112 cornstarch Drugs 0.000 description 1
- 239000006184 cosolvent Substances 0.000 description 1
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 229960001681 croscarmellose sodium Drugs 0.000 description 1
- 229960000913 crospovidone Drugs 0.000 description 1
- 235000010947 crosslinked sodium carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000010908 decantation Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003405 delayed action preparation Substances 0.000 description 1
- 230000003544 deproteinization Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 1
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 210000003162 effector t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 description 1
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 239000003974 emollient agent Substances 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 201000002491 encephalomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 239000002702 enteric coating Substances 0.000 description 1
- 238000009505 enteric coating Methods 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- BEFDCLMNVWHSGT-UHFFFAOYSA-N ethenylcyclopentane Chemical compound C=CC1CCCC1 BEFDCLMNVWHSGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MVPICKVDHDWCJQ-UHFFFAOYSA-N ethyl 3-pyrrolidin-1-ylpropanoate Chemical compound CCOC(=O)CCN1CCCC1 MVPICKVDHDWCJQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 208000012997 experimental autoimmune encephalomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 238000001125 extrusion Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- PJVNDJOBKYOMBU-UHFFFAOYSA-N formic acid;phenol Chemical class OC=O.OC1=CC=CC=C1 PJVNDJOBKYOMBU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 239000000174 gluconic acid Substances 0.000 description 1
- 235000012208 gluconic acid Nutrition 0.000 description 1
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 231100000869 headache Toxicity 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000001050 hortel pimenta Nutrition 0.000 description 1
- 102000048362 human PDCD1 Human genes 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940071676 hydroxypropylcellulose Drugs 0.000 description 1
- 230000005934 immune activation Effects 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000003832 immune regulation Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000002998 immunogenetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000007358 intestinal barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 231100000225 lethality Toxicity 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 238000007909 melt granulation Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N meso ribitol Natural products OCC(O)C(O)C(O)CO HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 229960002900 methylcellulose Drugs 0.000 description 1
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000001333 moisturizer Effects 0.000 description 1
- 238000009126 molecular therapy Methods 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000003232 mucoadhesive effect Effects 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 230000008693 nausea Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000011049 pearl Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 239000003961 penetration enhancing agent Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000004303 peritoneum Anatomy 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- WVDDGKGOMKODPV-ZQBYOMGUSA-N phenyl(114C)methanol Chemical compound O[14CH2]C1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-ZQBYOMGUSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940096826 phenylmercuric acetate Drugs 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 239000004014 plasticizer Substances 0.000 description 1
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 229920000523 polyvinylpolypyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 235000013809 polyvinylpolypyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 238000000197 pyrolysis Methods 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N saccharin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)NS(=O)(=O)C2=C1 CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940081974 saccharin Drugs 0.000 description 1
- 235000019204 saccharin Nutrition 0.000 description 1
- 239000000901 saccharin and its Na,K and Ca salt Substances 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000010413 sodium alginate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000661 sodium alginate Substances 0.000 description 1
- 229940005550 sodium alginate Drugs 0.000 description 1
- 235000019812 sodium carboxymethyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920001027 sodium carboxymethylcellulose Polymers 0.000 description 1
- 229940045902 sodium stearyl fumarate Drugs 0.000 description 1
- 239000007909 solid dosage form Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000007711 solidification Methods 0.000 description 1
- 230000008023 solidification Effects 0.000 description 1
- 235000010199 sorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004334 sorbic acid Substances 0.000 description 1
- 229940075582 sorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000014347 soups Nutrition 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000006277 sulfonation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002511 suppository base Substances 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 235000012222 talc Nutrition 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 1
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940033663 thimerosal Drugs 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000002627 tracheal intubation Methods 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000005239 tubule Anatomy 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 238000005550 wet granulation Methods 0.000 description 1
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 1
- 239000000811 xylitol Substances 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N xylitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N 0.000 description 1
- 235000010447 xylitol Nutrition 0.000 description 1
- 229960002675 xylitol Drugs 0.000 description 1
- XOOUIPVCVHRTMJ-UHFFFAOYSA-L zinc stearate Chemical compound [Zn+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O XOOUIPVCVHRTMJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/711—Natural deoxyribonucleic acids, i.e. containing only 2'-deoxyriboses attached to adenine, guanine, cytosine or thymine and having 3'-5' phosphodiester links
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
- A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
- A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
- A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
- A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
- A61K9/5161—Polysaccharides, e.g. alginate, chitosan, cellulose derivatives; Cyclodextrin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/06—Anti-spasmodics, e.g. drugs for colics, esophagic dyskinesia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/70532—B7 molecules, e.g. CD80, CD86
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本文提供了用于改善炎性病症的方法和组合物,所述方法和组合物包括程序性死亡配体1的肠表达。
Description
发明领域
本公开涉及采用PD-L1的基因表达来改善炎性病症的方法和组合物。
发明背景
一般来讲免疫活化,具体地讲T细胞活化状态受到由T细胞上的共刺激分子(例如CD28、ICOS、OX40等)和共抑制分子(例如CTLA-4、程序性死亡蛋白-1(“PD-1”)等)的宿主介导的复杂的重叠调节机制的影响。程序性死亡配体-1(“PD-L1”,也称为B7H1)由树突状细胞和其他抗原递呈细胞组成型地表达,并且通过与PD-1的相互作用似乎介导T细胞下调。Patsoukis等人,Selective effects of PD-1 on Akt and Ras pathways regulatemolecular components of the cell cycle and inhibit T cell proliferation,Sci.Signal 5:ra46(2012)。
然而遗憾的是,人们对PD-L1与CD80的相互作用的影响尚不太清楚,对这两种途径之间的相互作用也不太清楚。在一些情形下,通过可溶性PD-L1阻断PD-1可有效增强T细胞反应,并增强移植物抗宿主病(“GvHD”)。Blazar等人,Blockade of Programmed Death-1Engagement Accelerates Graft-Versus-Host Lethality by an IFN-γ-DependentMechanism J.Immunol.171:1272-77(2003)。相反地,其他研究人员能够用可溶形式的PD-L1改善GvHD,但仅仅是在PD-L1敲除背景中才能如此。Deng等人B7H1/CD80InteractionAugments PD-1 Dependent T Cell Apoptosis and Ameliorates Graft-versus-HostDisease,J.Immunol.194:560-74(2105)。此外,外周树突状细胞对T细胞反应的作用似乎比以前认为的更复杂。例如,虽然未成熟的外周树突状细胞通常不引发T细胞分化,但已观察到在实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠模型中树突状细胞群浸润中枢神经系统(CNS)并促进表位扩散。Spagnuolo等人,Involvement of Immune Regulation in MultipleSclerosis,Immunology and Immunogenetics Insights 9:1-10。
因此,本领域明确需要更好地理解PD-L1在免疫保护性环境中在T细胞活化中的作用,以更好地利用PD-L1在炎性病症中的治疗潜力。
发明内容
本发明通过在免疫保护性环境中成功地采用PD-L1多肽(包括可溶性PD-L1多肽)的局部肠表达解决了现有技术中的上述科学不确定性,用于治疗多种炎性病症,包括例如炎性肠病(例如溃疡性结肠炎、克罗恩病等等)以及由器官或骨髓移植诱导的移植物抗宿主病(GvHD)。因此,在一个方面,本发明提供了一种治疗有需要的患者的炎性病症的方法,所述方法包括向所述患者的肠道施用包含PD-L1核酸的表达载体。
在一个实施方案中,PD-L1多肽是膜结合的PD-L1多肽。在优选的实施方案中,PD-L1多肽是人PD-L1或其剪接变体。在一个这样的实施方案中,PD-L1核酸编码PD-L1多肽,所述PD-L1多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列。
在另选的实施方案中,PD-L1多肽是可溶性PD-L1多肽,例如包含PD-L1(且优选地人PD-L1)的信号序列、IgV结构域和IgC结构域(即SEQ ID NO:1的氨基酸1-239)。在一些实施方案中,可溶性PD-L1多肽可缺少全部或部分信号序列(例如,其可包含SEQ ID NO:1的氨基酸19-238)。
在一些实施方案中,PD-L1核酸通过胶囊包封在核酸递送媒介物中的表达载体来递送。优选的核酸递送媒介物包括脱乙酰壳多糖或脱乙酰壳多糖衍生物纳米颗粒。在一个这样的实施方案中,脱乙酰壳多糖衍生物纳米颗粒包含与精氨酸和/或葡糖酸偶联的脱乙酰壳多糖。在另一个这样的实施方案中,脱乙酰壳多糖衍生物纳米颗粒包含与精氨酸和亲水性多元醇偶联的脱乙酰壳多糖。在一个实施方案中,亲水性多元醇是葡萄糖。
在另一方面,本发明提供了包含PD-L1核酸的表达载体以治疗有需要的患者的炎性病症,其中所述表达载体被施用至所述受试者的肠。在一些实施方案中,PD-L1核酸包含SEQ ID NO:2。优选地,PD-L1核酸包含在SEQ ID NO:2中的至少一个同义突变。更优选地,PD-L1核酸包含多个这样的突变以帮助分化并任选地改善表达。在示例性实施方案中,PD-L1核酸包含SEQ ID NO:3。
在一些实施方案中,PD-L1核酸还包含异源序列。异源序列可包含Fc结构域、蛋白标签、缀合的治疗剂或它们的组合。在一个实施方案中,PD-L1多肽的N端区与人IgG1 Fc区或其部分融合。PD-L1多肽可以通过(GGGGS)n(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列与人IgG1 Fc区或其部分融合。在一些实施方案中,IgG1 Fc是通过改变Fc结构域中的以下氨基酸中的一个或多个而突变以降低抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDCC):E233P、L234V、L235A、G236缺失、A327G、A330S和P331S。在示例性实施方案中,PD-L1核酸包含SEQID NO:4。
可通过本发明得到有利治疗的炎性病症包括慢性疾患和急性疾患,包括与感染相关的炎症(例如败血性休克、败血症或全身性炎症反应综合征(SIRS))、缺血-再灌注损伤、内毒素致死、炎性肠病、克罗恩病、结肠炎、或由细胞因子(例如TNF或IL-1)过量产生引起的疾患以及GvHD。
以引用的方式并入
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请以引用方式并入本文,其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体和单独地指出以引用方式并入。
附图说明
参考附图公开了本公开,在附图中:
图1:pVax-hPD-L1载体(SEQ ID NO:6)。编码膜结合的人PD-L1多肽的载体的质粒序列,优化的人PD-L1 cDNA被突出显示。
图2:pVax-hPD-L1 Fc载体(SEQ ID NO:7)。编码可溶性人PD-L1 Fc多肽的载体的质粒序列,优化的人PD-L1 cDNA被突出显示。
图3A:人PD-L1质粒和体外表达。(A)克隆在pVax骨架中的优化的hPD-L1 DNA序列的质粒图谱,该序列含有质粒复制起点(pUC ori;),该质粒复制起点受人巨细胞病毒立即早期基因启动子(CMV;)的控制且具有卡那霉素抗性基因。
图3B:体外PD-L1和PD-L1-Fc表达:使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)用1μg或2.5μg的Fc对照(白色)、PD-L1-Fc(黑色)或PD-L1(灰色)质粒DNA转染HEK293T细胞。转染后48h定量细胞培养上清液或细胞裂解液中的PD-L1蛋白含量。
图4:来自聚合复合物转染的PD-L1-Fc的体外表达。(A-B)如所指出的那样,用含有增加浓度的pVAX-opt-hPD-L1-Fc DNA的PD-L1-Fc聚合复合物转染HEK-293T。(A)在转染后48小时收集上清液,并通过ELISA测定hPD-L1-Fc蛋白。将数据标准化为细胞总蛋白。(B)EC50和最大蛋白表达的表。
图5:体外产生的Fc融合的构建体的纯化和表达。(A)通过考马斯凝胶染色确认的蛋白表达:使用Lipofectamine 2000(Invitrogen),用Fc对照或PD-L1-Fc质粒DNA转染HEK293T细胞。转染后24h将细胞培养基更换为无血清培养基。转染后72h收集细胞培养上清液,并使用Protein G HiTrap柱(GE)纯化Fc融合蛋白。使用PD-10脱盐柱(GE)将缓冲液更换为PBS,并以四个相等的级分(洗脱液1-4)洗脱蛋白质。(B)使用Lipofectamine 2000(Invitrogen),用Fc对照或PD-L1-Fc质粒DNA转染HEK293T细胞。转染后24h将细胞培养基更换为无血清培养基。转染后72h收集细胞培养上清液,并使用Protein G HiTrap柱(GE)纯化Fc融合蛋白。使用PD-10脱盐柱(GE)将缓冲液更换为PBS,并以四个相等的级分(F1-4)洗脱蛋白质。通过ELISA测定PD-L1蛋白浓度。(C)在6孔板中使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)用野生型PD-L1质粒DNA或对照(pVax)转染NIH/3T3细胞。洗涤细胞并将细胞在转染后24h重新接种在96孔平底板中。在第二天(第2天)和随后的3天,通过流式细胞术分析细胞表面上的PD-L1表达。(D)在6孔板中使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)用野生型PD-L1质粒DNA或对照(pVax)转染NIH/3T3细胞。洗涤细胞并将细胞在转染后24h重新接种在96孔平底板中。在第二天(第2天)和随后的3天,通过流式细胞术分析细胞表面上的PD-L1表达水平。
图6:以剂量依赖性方式通过人PD-1受体表达PD-L1-Fc信号。将细胞用PD-L1-Fc转染并从细胞培养上清液中纯化。(A)用增加浓度的PD-L1-Fc(40min)刺激PathHunter PD-1信号传导测定细胞,并通过发光(RLU;相对发光单位)测量信号活化。(B)用含和不含抗PD-1(低:0.1μg/mL;高:1.0μg/mL)的重组IgG1-Fc或PD-L1-Fc(50μg/mL,40min)孵育PathHunterPD-1信号传导测定细胞,并通过发光(RLU;相对发光单位)测量信号活化。一式三份测定细胞活化,并将数据表示为相对于未刺激的对照的RLU。数据表示为平均值±标准偏差,并且代表4次独立实验。使用学生t检验分析数据,并且星号表示统计学上显著的差异(*,p≤0.05;**,p≤0.01;***,p≤0.001)。
图7:质粒DNA产生的PD-L1-Fc在体外抑制T细胞活化。(A)从三只C57BL/6小鼠中分离纯化的CD4+T细胞并合并。将细胞接种到96孔平底板中,该板预涂有单独的或含5μg/ml无血清培养基产生的PD-L1-Fc的抗CD3(0.2μg/ml)。重组IgG1-Fc和重组PD-L1-Fc用作对照。刺激细胞3天,并通过流式细胞术检测FSC-SSC门中的细胞尺寸来测量细胞活化。(B)在6孔板中用野生型PD-L1质粒DNA或对照(pVax;)转染NIH/3T3细胞。转染后48小时,将细胞重新接种在96孔v形底板中,并用不同浓度的重组人PD-1孵育。洗涤细胞并用APC缀合的抗人PD-1或同种型对照染色,并通过流式细胞术通过评定转染细胞上的APC检测分析PD-1结合。还评定了PE缀合的抗人PD-L1或同种型对照的结合。鉴于重组PD-1已与NIH/3T3细胞上表达的PD-L1结合,预测抗人PD-L1-PE结合的减少是抗体结合的空间位阻的结果。图7A公开了“GGGGS”作为SEQ ID NO:5,“(GGGGS)3”作为SEQ ID NO:8。
图8:疾病模型优化。(A)对雄性Rag1-/-小鼠腹膜内注射幼稚T细胞,定义为CD4+CD25-CD45RB高或未治疗的。如通过体重减轻所观察到的,幼稚T细胞转移诱导疾病。(B)为了诱导急性移植物抗宿主病(GvHD),以700 cGY照射雌性BALB/c小鼠,并与同种异体C57Bl6/J骨髓(10M细胞)和2.5M脾细胞一起转移。如通过在前10天内观察到的初始体重减轻所观察到的,使用这些条件成功诱导GvHD。此外,大约在第20天开始观察到二次体重下降。无移植物组证实了成功照射并且BMT对照证实了同种异体骨髓的成功转移。
图9:PD-L1和PD-L1 Fc聚合复合物在GvHD中的治疗功效。(A)如先前在图8B中所展示的诱导GvHD。对小鼠不进行治疗或每周通过灌肠注射浓度为c1000的pVAX、PD-L1或PD-L1Fc聚合复合物,持续7周。将达到其初始体重的75%的动物安乐死。施用PD-L1和PD-L1 Fc聚合复合物拯救了动物的体重。(B)在PD-L1或PD-L1-Fc治疗的小鼠中疾病的临床征象减少,并且在PD-L1和PD-L1-Fc治疗的小鼠中在第21天观察到的平均临床征象也减少。(C)诱导GvHD后小鼠的存活曲线,所有未治疗的动物和pVAX治疗的动物都死于疾病,大约40%的PD-L1 Fc治疗的动物和30%的PD-L1治疗的动物(绿色)存活至第75天。
图10:PD-L1 Fc和PD-L1聚合复合物在GvHD中的治疗功效。(A)如先前在图8B中所展示的诱导GvHD。对小鼠不进行治疗或每周通过灌肠注射浓度为c1000的pVAX或PD-L1 Fc聚合复合物,持续7周。将达到其初始体重的75%的动物安乐死。施用PD-L1 Fc聚合复合物拯救了动物的体重。(B)如先前在图8B中所展示的诱导GvHD。对小鼠不进行治疗或每周通过灌肠注射浓度为c1000的pVAX或PD-L1聚合复合物,持续7周。将达到其初始体重的75%的动物安乐死。施用PD-L1聚合复合物拯救了动物的体重。(C)诱导GvHD后小鼠的存活曲线,所有pVAX治疗的动物都死于疾病,大约40%的PD-L1 Fc治疗的动物和30%的PD-L1治疗的动物存活至第75天。
图11:PD-L1和PD-L1 Fc在GvHD中的治疗效果。(A)如先前在图8B中所展示的诱导GvHD。对小鼠不进行治疗或每周通过灌肠注射浓度为c1000的pVAX、PD-L1或PD-L1 Fc聚合复合物,持续7周。与无治疗和第18天开始的pVAX治疗的动物相比,PD-L1治疗的动物和PD-L1 Fc治疗的动物的体重大大提高。(B)诱导GvHD后小鼠的存活曲线,所有pVAX治疗的动物以及未治疗的动物都死于疾病。在另一方面,50%的PD-L1 Fc治疗的动物和25%的施用PD-L1的动物存活至第45天。
图12:结肠炎DSS模型中重组PD-L1 Fc的施用。(A)图来自Song等人,Gut 2015。在Rag1-/-小鼠的饮用水中施用2%DSS,并在第2天腹膜内注射重组PD-L1 Fc蛋白或PBS。与注射PBS的动物相比,注射重组PD-L1 Fc引起的体重减轻不那么严重。(B)在Rag1-/-小鼠的饮用水中施用4%DSS,并在第3天和第6天腹膜内注射重组PD-L1 Fc或PBS。在整个研究中,动物的体重是等同的。然而,利用PD-L1-Fc可溶性蛋白未观察到治疗效果,因此Song等人的结果不可再现。
图13:PD-L1和PD-L1 Fc在T细胞结肠炎模型中的治疗功效。(A-B)根据图8A诱导T细胞结肠炎。从转移后第15天开始,在接下来的6周通过灌肠给小鼠每周注射pVAX或PD-L1c1000聚合复合物,或者不进行治疗。给死于疾病的动物为其初始体重的75%的固定评分。如通过整个研究中稳定的体重所观察到的,注射PD-L1聚合复合物抑制疾病进展。(B)诱导T细胞结肠炎后小鼠的存活曲线表明PD-L1治疗的动物均未死于疾病。在另一方面,必须将1只pVAX治疗的动物和2只未治疗的动物安乐死。(C-E)根据图8A诱导T细胞结肠炎。每周两至三次监测动物的体重(C)和临床征象(D),并且将第0天的体重用作基线体重(100%;第0天是结肠内滴注的第一天,对应于转移后第19天)。从转移后第19天开始,动物每周接受结肠内滴注,持续7周。(E)诱导T细胞结肠炎后小鼠的存活。当动物达到其初始体重的75%时,或者当活性严重降低时,将动物安乐死。出于绘图目的,对于实验的剩余部分,将安乐死小鼠的体重表示为其初始体重的75%。类似地,将安乐死小鼠的临床评分表示为最大评分8,直至研究结束。对于(C-E),蔗糖n=8,pVAX n=9,PD-L1-Fc n=9。
图14:PD-L1聚合复合物的施用诱导调节性T细胞中FoxP3的表达。在肠系膜淋巴结和脾的终点,在调节性T细胞(定义为CD4+CD25+FoxP3+细胞)中检验FoxP3的平均荧光强度(MFI)。与pVax组相比,在(A)肠系膜淋巴结(MLN)和(B)脾中,PD-L1治疗的动物中的FoxP3的表达都更高。
具体实施方式
本发明设想了PD-L1核酸的肠表达,用于治疗炎性病症。
PD-L1蛋白质和多核苷酸
本文设想的PD-L1多肽包括全长序列、可溶性片段及其变体。
全长PD-L1蛋白通常包含信号序列、IgV结构域和IgC结构域、跨膜结构域以及细胞质结构域。公众可在GenBank数据库中在NM_014143.3和NP_054862.1下获得人序列。人PD-L1转录物变体1的序列是规范序列,关于已知同种型描述的所有位置信息均从该序列确定。在该同种型中,信号序列显示为约氨基酸1至约18,IgV结构域显示为约19至约134,IgC结构域显示为约135至约227,跨膜结构域显示为约239至约259,且细胞质结构域显示为约260至约290。编码不同人PD-L1同种型的至少五种转录物(即剪接)变体是已知的并且描述于例如美国专利公布号2016/0122829中,所述专利的公开内容以引用方式明确地并入本文。
多种物种中PD-L1的核酸和氨基酸序列信息在本领域中是众所周知的,并且容易在公共数据库中获得,这些PD-L1包括例如猴PD-L1(NM 001083889.1和NP_001077358.1)、黑猩猩PD-L1(XM_0011401705.2和XP_001140705.1)、小鼠PD-L1(NM 021893.3和NP_068693.1)、大鼠PD-L1(NM_001191954.1和NP_001178883.1)、鸡D-L1(XM_424811.3和XP_424811.3)、牛PD-L1(NM_001163412.1和NP_001156884.1)以及狗PD-L1(XM_541302.3和XP_541302.3。
本发明的PD-L1核酸将通常包含编码人PD-L1多肽的核酸序列,其中PD-L1多肽优选地包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列,或其片段。在一些实施方案中,PD-L1多肽是膜结合的,即包括跨膜结构域和细胞质结构域的全长PD-L1。在另选的实施方案中,PD-L1多肽是可溶性PD-L1多肽,所述可溶性PD-L1多肽至少包含人PD-L1的IgV结构域和IgC结构域,并且任选地还包含信号序列。在一个实施方案中,PD-L1多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-239,这对应于全长cDNA序列的核苷酸1-717。在其他实施方案中,可溶性PD-L1多肽可缺少全部或部分信号序列(例如,其可包含SEQ ID NO:1的氨基酸19-239)。参见,例如美国专利公布号2017/0189476,其公开内容以引用方式明确地并入本文。
表1-人PD-L1的氨基酸序列
MRIFAVFIFMTYWHLLNAFTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEENHTAELVIPELPLAHPPNERTHLVILGAILLCLGVALTFIFRLRKGRMMDVKKCGIQDTNSKKQSDTHLEET(SEQ IDNO:1)
在一些实施方案中,PD-L1核酸与天然PD-L1核酸序列(SEQ ID NO:2)或其片段相同。优选地,进行至少一个同义核酸取代以允许在施用主题核酸之后从内源性人PD-L1核苷酸分化和检测所得转录物,并且更优选地进行多个这样的同义突变。在特别优选的实施方案中,PD-L1核酸序列经密码子优化以改善表达。在示例性实施方案中,PD-L1核酸优选地包含SEQ ID NO:3的核酸序列或与SEQ ID NO:3至少约70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的序列。
在一些实施方案中,本发明的PD-L1多肽可以与Fc区或其部分融合。在示例性实施方案中,PD-L1核酸包含SEQ ID NO:4的核酸序列或与SEQ ID NO:4至少约70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的核酸序列。
本发明的PD-L1核酸可以整体包括外显子1-4,以及外显子5的前35个核苷酸。需注意,ATG位点(起始密码子)位于外显子2的第13位。因此,本发明的PD-L1核酸可包括外显子2的最后52个核苷酸、外显子3和4的全部,以及外显子5的前35个核苷酸。
表2-人PD-L1的核酸序列
ATGAGGATATTTGCTGTCTTTATATTCATGACCTACTGGCATTTGCTGAACGCATTTACTGTCACGGTTCCCAAGGACCTATATGTGGTAGAGTATGGTAGCAATATGACAATTGAATGCAAATTCCCAGTAGAAAAACAATTAGACCTGGCTGCACTAATTGTCTATTGGGAAATGGAGGATAAGAACATTATTCAATTTGTGCATGGAGAGGAAGACCTGAAGGTTCAGCATAGTAGCTACAGACAGAGGGCCCGGCTGTTGAAGGACCAGCTCTCCCTGGGAAATGCTGCACTTCAGATCACAGATGTGAAATTGCAGGATGCAGGGGTGTACCGCTGCATGATCAGCTATGGTGGTGCCGACTACAAGCGAATTACTGTGAAAGTCAATGCCCCATACAACAAAATCAACCAAAGAATTTTGGTTGTGGATCCAGTCACCTCTGAACATGAACTGACATGTCAGGCTGAGGGCTACCCCAAGGCCGAAGTCATCTGGACAAGCAGTGACCATCAAGTCCTGAGTGGTAAGACCACCACCACCAATTCCAAGAGAGAGGAGAAGCTTTTCAATGTGACCAGCACACTGAGAATCAACACAACAACTAATGAGATTTTCTACTGCACTTTTAGGAGATTAGATCCTGAGGAAAACCATACAGCTGAATTGGTCATCCCAGAACTACCTCTGGCACATCCTCCAAATGAAAGGACTCACTTGGTAATTCTGGGAGCCATCTTATTATGCCTTGGTGTAGCACTGACATTCATCTTCCGTTTAAGAAAAGGGAGAATGATGGATGTGAAAAAATGTGGCATCCAAGATACAAACTCAAAGAAGCAAAGTGATACACATTTGGAGGAGACGTAA(SEQ ID NO.2)
表3-膜结合PD-L1的经密码子优化的核酸序列
ATGAGAATCTTCGCGGTGTTCATCTTCATGACCTACTGGCACCTCCTGAACGCTTTCACTGTGACCGTGCCTAAGGACCTCTACGTCGTGGAATACGGCTCCAACATGACCATCGAGTGCAAATTCCCAGTGGAGAAGCAGCTGGACCTGGCTGCCCTGATCGTGTACTGGGAAATGGAGGACAAGAACATCATCCAATTCGTGCATGGGGAGGAGGACCTGAAGGTCCAGCATTCGTCATATCGGCAAAGAGCCAGGCTGCTGAAGGATCAGCTGTCCCTCGGCAATGCGGCACTGCAGATTACCGATGTGAAGCTGCAGGACGCCGGAGTCTACCGGTGCATGATTTCCTACGGCGGAGCAGACTACAAGCGCATTACCGTGAAGGTCAACGCTCCCTACAACAAGATCAACCAGCGGATTCTGGTGGTCGACCCTGTGACCTCCGAGCATGAGCTGACCTGTCAAGCCGAAGGTTACCCGAAAGCGGAAGTGATCTGGACGTCGAGCGACCACCAGGTCTTGAGCGGAAAGACGACCACTACTAACAGCAAGCGGGAAGAGAAACTGTTTAACGTGACCAGCACTCTTCGGATCAACACCACCACTAACGAGATTTTCTACTGTACCTTTCGCCGGCTTGACCCGGAAGAAAATCACACCGCCGAGCTCGTGATCCCCGAGCTGCCCCTCGCCCACCCTCCTAACGAAAGAACCCACCTGGTCATCTTGGGGGCCATCCTGCTGTGCCTGGGAGTGGCCCTGACCTTCATTTTTAGGCTCCGAAAGGGCCGCATGATGGACGTGAAGAAATGCGGAATCCAGGACACTAACTCCAAGAAGCAGTCCGATACTCACCTGGAAGAAACCTAG(SEQ ID NO.3)
表4-与Fc片段融合的可溶性PD-L1的经密码子优化的核酸序列
ATGAGAATCTTCGCGGTGTTCATCTTCATGACCTACTGGCACCTCCTGAACGCTTTCACTGTGACCGTGCCTAAGGACCTCTACGTCGTGGAATACGGCTCCAACATGACCATCGAGTGCAAATTCCCAGTGGAGAAGCAGCTGGACCTGGCTGCCCTGATCGTGTACTGGGAAATGGAGGACAAGAACATCATCCAATTCGTGCATGGGGAGGAGGACCTGAAGGTCCAGCATTCGTCATATCGGCAAAGAGCCAGGCTGCTGAAGGATCAGCTGTCCCTCGGCAATGCGGCACTGCAGATTACCGATGTGAAGCTGCAGGACGCCGGAGTCTACCGGTGCATGATTTCCTACGGCGGAGCAGACTACAAGCGCATTACCGTGAAGGTCAACGCTCCCTACAACAAGATCAACCAGCGGATTCTGGTGGTCGACCCTGTGACCTCCGAGCATGAGCTGACCTGTCAAGCCGAAGGTTACCCGAAAGCGGAAGTGATCTGGACGTCGAGCGACCACCAGGTCTTGAGCGGAAAGACGACCACTACTAACAGCAAGCGGGAAGAGAAACTGTTTAACGTGACCAGCACTCTTCGGATCAACACCACCACTAACGAGATTTTCTACTGTACCTTTCGCCGGCTTGACCCGGAAGAAAATCACACCGCCGAGCTCGTGATCCCCGAGCTGCCCCTCGCCCACCCTCCTAACGAAAGAACTCCCAAGTCTTGCGATAAGACCCACACATGCCCGCCATGCCCAGCCCCGCCCGTGGCGGGCCCCTCCGTGTTTCTTTTCCCGCCGAAGCCTAAGGATACCCTGATGATCTCCCGCACCCCCGAAGTCACTTGTGTGGTGGTGGACGTCAGCCACGAAGATCCGGAAGTCAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGGGTCGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGCGAGGAACAGTACAACTCAACGTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCATCAGGACTGGCTGAACGGAAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGTCCAACAAGGGACTGCCGAGCTCGATCGAAAAGACCATTTCGAAGGCCAAGGGGCAGCCTAGGGAGCCACAGGTCTATACCCTCCCGCCCTCACGAGATGAACTGACCAAGAACCAAGTGTCATTGACTTGCCTCGTGAAGGGCTTCTACCCTTCCGACATCGCCGTGGAATGGGAATCCAACGGACAGCCGGAGAACAACTACAAGACTACTCCGCCCGTGCTTGACTCCGACGGTTCGTTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACCGTGGATAAGTCCCGCTGGCAACAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAAGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTCTCGTTGAGCCCTGGAAAATAG(SEQ ID NO.4)
如遗传密码所定义的,在特定蛋白质的氨基酸序列与可编码该蛋白质的核苷酸序列之间存在已知且确定的对应关系。同样地,如遗传密码所定义的,在特定核酸的核苷酸序列与由该核酸编码的氨基酸序列之间存在已知且确定的对应关系。
表3
遗传密码
丙氨酸(Ala,A)GCA,GCC,GCG,GCT
精氨酸(Arg,R)AGA,ACG,CGA,CGC,CGG,CGT
天冬酰胺(Asn,N)AAC,AAT
天冬氨酸(Asp,D)GAC,GAT
半胱氨酸(Cys,C)TGC,TGT
谷氨酸(Glu,E)GAA,GAG
谷氨酰胺(Gln,Q)CAA,CAG
甘氨酸(Gly,G)GGA,GGC,GGG,GGT
组氨酸(His,H)CAC,CAT
异亮氨酸(Ile,I)ATA,ATC,ATT
亮氨酸(Leu,L)CTA,CTC,CTG,CTT,TTA,TTG
赖氨酸(Lys,K)AAA,AAG
甲硫氨酸(Met,M)ATG
苯丙氨酸(Phe,F)TTC,TTT
脯氨酸(Pro,P)CCA,CCC,CCG,CCT
丝氨酸(Ser,S)AGC,AGT,TCA,TCC,TCG,TCT
苏氨酸(Thr,T)ACA,ACC,ACG,ACT
色氨酸(Trp,W)TGG
酪氨酸(Tyr,Y)TAC,TAT
缬氨酸(Val,V)GTA,GTC,GTG,GTT
遗传密码的一个重要的且众所周知的特征是其冗余,由此对于用于制备蛋白质的大多数氨基酸,可以采用多于一种编码核苷酸三联体。因此,多种不同的核苷酸序列可以编码给定的氨基酸序列。此类核苷酸序列被认为是功能等同的,因为它们导致在所有生物体中产生相同的氨基酸序列(尽管某些生物体可以比其他生物体更有效地翻译一些序列)。此外,偶尔可以在给定的核苷酸序列中发现嘌呤或嘧啶的甲基化变体。此类甲基化不影响三核苷酸密码子与相应的氨基酸之间的编码关系。
鉴于上述情况,编码本发明的融合蛋白或多肽(或其任何部分)的DNA或RNA的核苷酸序列可用于衍生融合蛋白或多肽氨基酸序列,使用遗传密码将该DNA或RNA翻译成氨基酸序列。同样地,对于融合蛋白或多肽氨基酸序列,可以从遗传密码(由于其冗余,对于任何给定氨基酸序列将产生多个核酸序列)推导出可以编码该融合蛋白或多肽的相应核苷酸序列。因此,本文对编码融合蛋白或多肽的多核苷酸序列的描述和/或公开应当理解为还包括对由该核苷酸序列编码的氨基酸序列的描述和/或公开。类似地,本文对融合蛋白或多肽氨基酸序列的描述和/或公开应当理解为还包括对可编码该氨基酸序列的所有可能的核苷酸序列的描述和/或公开。
在一些实施方案中,本发明的PD-L1蛋白不包含信号序列,因为这种序列通常在从细胞分泌多肽之前被切割。在其他实施方案中,PD-L1蛋白是可溶的,即由IgV结构域和IgC结构域(即,全长的膜结合的PD-L1的细胞外部分)组成,并且还可包含异源序列,诸如Fc结构域、蛋白标签、缀合的治疗剂等等。此类可溶性PD-L1同种型可以通过技术人员熟知的多种方式通过可变剪接产生。
在优选的实施方案中,如本文图2所示,可溶性PD-L1包括消除全长的膜结合的PD-L1 cDNA的外显子5的部分和外显子6和7的全部。可通过将PD-L1的N端区与人IgG1 Fc融合来产生可溶性PD-L1同种型,并且在一些实施方案中,可通过氨基酸序列(GGGGS)n(SEQ IDNO:5)来连接。在优选的实施方案中,IgG1 Fc可通过改变Fc结构域中的以下氨基酸而突变以降低抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDCC):E233P、L234V、L235A、G236缺失、A327G、A330S和P331S。Fc结构域可以是人源的,并且还可以源自人IgG1的Fc。
核酸递送媒介物
施用包含PD-L1核酸的表达载体以实现有效的肠表达这一目的可以使用本领域已知的任何方法来实现。在优选的实施方案中,将主题核酸递送媒介物施用至肠的局部(即未全身性地施用)。在一个实施方案中,核酸递送媒介物包含病毒载体。在另一个实施方案中,核酸递送媒介物包含阳离子脂质体。在优选的实施方案中,核酸递送媒介物包含脱乙酰壳多糖。在另选的实施方案中,使用生物基因递送媒介物(BGV),诸如例如肠细菌、噬菌体、病毒样颗粒、生物脂质体等,以将PD-L1多核苷酸递送至肠上皮。关于目前正在研究的BGV的综述,参见Seow和Wood Biological Gene Delivery Vehicles Beyond Viral Vectors,Molecular Therapy 17:767–777(2009),其内容整体并入本文。
在特定实施方案中,核酸递送媒介物包含脱乙酰壳多糖衍生物,例如结合另外的官能化,例如具有附接的配体的脱乙酰壳多糖。如本文所用的“脱乙酰壳多糖”应理解为包括广泛类别的包含共价修饰的N-乙酰基-D-葡糖胺和/或D-葡糖胺单元的基于脱乙酰壳多糖的聚合物,以及结合其他单元或附接至其他部分的基于脱乙酰壳多糖的聚合物。衍生物在很多情况下是基于对葡糖胺的羟基或胺基的修饰,诸如用精氨酸官能化的脱乙酰壳多糖完成的修饰。脱乙酰壳多糖衍生物的实例包括但不限于三甲基化脱乙酰壳多糖、PEG化脱乙酰壳多糖、巯基化脱乙酰壳多糖、半乳糖基化脱乙酰壳多糖、烷基化脱乙酰壳多糖、结合PEI的脱乙酰壳多糖、糖醛酸修饰的脱乙酰壳多糖、乙二醇脱乙酰壳多糖等等。关于脱乙酰壳多糖衍生物的进一步教导,参见,例如K.Taira、K.Kataoka、T.Niidome(编辑),Springer-Verlag Tokyo,2005,ISBN 4-431-25122-7,“Non-viral Gene Therapy”的第63-74页;Zhu等人,Chinese Science Bulletin,2007年12月,第52(23)卷,第3207-3215页;和Varma等人,Carbohydrate Polymers 55(2004)77–93
在本发明中使用具有大于50%的任何脱乙酰度(DDA)的脱乙酰壳多糖,官能化在1%与50%之间。(相对于脱乙酰壳多糖聚合物上的游离氨基部分的数量确定官能化百分比。)脱乙酰和官能化的程度赋予官能化的脱乙酰壳多糖衍生物特定的电荷密度。所得的电荷密度影响溶解度、核酸结合和随后的释放,以及与哺乳动物细胞膜的相互作用。因此,根据本发明,必须优化这些特性以获得最佳功效。示例性的脱乙酰壳多糖衍生物描述于Baker等人于2007年1月24日提交的11/657,382中,该文献以引用方式并入本文。在一个实施方案中,本文所述的双重衍生化脱乙酰壳多糖包含脱乙酰度为至少50%的脱乙酰壳多糖。在一个实施方案中,脱乙酰度为至少60%,更优选为至少70%,更优选为至少80%,更优选为至少90%,最优选为至少95%。在优选的实施方案中,本文所述的双重衍生化脱乙酰壳多糖包含脱乙酰度为至少98%的脱乙酰壳多糖。
本文所述的脱乙酰壳多糖衍生物具有在中性和生理pH下可溶的平均分子量范围,并且出于本发明的目的包括3-110kDa的分子量范围。本文所述的实施方案的特征在于衍生化脱乙酰壳多糖的平均分子量较低(<25kDa,例如为约5kDa至约25kDa),这些衍生化脱乙酰壳多糖具有期望的递送和转染特性,尺寸小且具有有利的溶解度。较低平均分子量的衍生化脱乙酰壳多糖通常比具有较高分子量的脱乙酰壳多糖更易溶解,前者因此产生核酸/脱乙酰壳多糖复合物,该复合物将更容易地释放核酸并提供增加的细胞转染。
在优选的实施方案中,使用脱乙酰壳多糖或脱乙酰壳多糖衍生物作为核酸递送媒介物,完成包含PD-L1核酸的表达载体的施用。本文所述的脱乙酰壳多糖衍生物是通过用带正电荷的和/或亲水性的部分官能化所得游离氨基而产生的。国际专利申请号PCT/CA2013/050218和PCT/CA2014/050921(其内容以引用方式整体并入本文)中描述的衍生化脱乙酰壳多糖具有许多有利于核酸递送媒介物的特性,包括:它们有效地结合并复合带负电荷的核酸,它们可以形成尺寸可控的纳米颗粒,它们可以被细胞吸收,并且它们可以在细胞内在适当时间释放核酸。
在优选的实施方案中,使用“双重衍生化脱乙酰壳多糖”或“DD-脱乙酰壳多糖”,其是指已被双重官能化的脱乙酰壳多糖(“双重官能化脱乙酰壳多糖”或“DF-脱乙酰壳多糖”),例如与Arg和亲水性多元醇两者偶联,这两者都与脱乙酰壳多糖共价附接。Arg可以作为单一氨基酸或作为多肽与脱乙酰壳多糖共价附接。亲水性多元醇可以是糖诸如葡萄糖。“DD-脱乙酰壳多糖核酸聚合复合物”或其语法等同物意指包含多个DD-脱乙酰壳多糖分子和多个编码PD-L1的核酸分子或其片段的复合物。在优选的实施方案中,双重衍生化脱乙酰壳多糖与编码PD-L1多肽的所述核酸复合。
DD-脱乙酰壳多糖PD-L1核酸聚合复合物包含PD-L1核酸组分和DD-脱乙酰壳多糖组分。脱乙酰壳多糖和DD-脱乙酰壳多糖核酸聚合复合物可通过本领域已知的任何方法制备。例如,可以调整官能化的脱乙酰壳多糖和核苷酸原料浓度以适应各种胺与磷酸盐比(N/P)、混合比和靶核苷酸浓度。用于聚合复合物形成的优选方法公开在WO 2009/039657中,其以引用方式整体明确地并入本文。
表达载体和表达控制区
本发明涉及包含PD-L1核酸、启动子以及转录和翻译终止信号的表达载体。可以将各种核苷酸和控制序列连接在一起以产生表达载体,该表达载体可以包括一个或多个方便的限制性位点,以允许在这些位点插入或取代编码PD-L1的核酸。另选地,可以通过将包含PD-L1核酸的多核苷酸或核酸构建体插入适当的载体中进行表达来表达PD-L1核酸。在形成表达载体时,PD-L1的编码序列位于载体中,使得其与适当的控制序列可操作地连接以进行表达。
表达载体可以是可方便地进行重组DNA程序并且可引起核酸表达的任何载体(例如质粒或病毒)。载体的选择将通常取决于载体与将要引入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线性的或闭环的质粒。载体可以是自主复制的载体,即作为染色体外实体存在的载体,其复制独立于染色体复制,这些载体例如质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。载体可以包含确保自我复制的任何构件。另选地,载体可以是这样的:当被引入宿主细胞中时,整合进基因组中并与整合进的一个或多个染色体一起复制。此外,可以使用单个载体或质粒或共同含有待引入宿主细胞基因组或转座子的总核酸的两个或更多个载体或质粒。
载体可任选地包括一个或多个选择性标记物,所述一个或多个选择性标记物允许容易地选择转化的、转染的、转导的或类似的细胞。选择性标记物是其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养型等的基因。对于自主复制,载体还可包含使得载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是介导在细胞中起作用的自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指能够使质粒或载体在体内复制的多核苷酸。
在优选的实施方案中,本发明的表达载体包含编码PD-L1的核酸分子或其片段,所述核酸分子包含与本文所述的PD-L1多肽的编码区可操作地连接的表达控制区。在一些实施方案中,核酸是DNA或RNA,例如mRNA。在一些实施方案中,PD-L1核酸是人工核酸。优选的人工核酸包括但不限于肽核酸(PNA)、磷酰二胺吗啉代寡聚物(phosphorodiamidatemorpholino oligo,PMO)、锁核酸(LNA)、乙二醇核酸(GNA)和苏糖核酸(TNA)。
在一个具体的实施方案中,表达载体是如本文示例的pVAX_hPD-L1(图1)。在另一个具体的实施方案中,表达载体是pVax_hPD-L1 Fc(图2)。
在一些实施方案中,表达控制区具有组成型活性。在多个优选的实施方案中,表达控制区不具有组成型活性。这提供了PD-L1核酸的动态表达。“动态”表达是指随时间变化的表达。动态表达可以包括几个这样的低表达或无表达的时段,间隔有可检测表达的时段。在多个优选的实施方案中,PD-L1核酸与可调节的启动子可操作地连接。这提供了核酸分子的可调节表达。表达控制区包含影响可操作地连接的PD-L1核酸的表达的调节性多核苷酸(本文有时称为元件),诸如启动子和增强子。
本文包括的表达控制元件可以来自细菌、酵母、植物或动物(哺乳动物或非哺乳动物)。表达控制区包括全长启动子序列,诸如天然启动子和增强子元件,以及保留全部或部分的全长或非变体功能(例如,保留一定量的营养调节或细胞/组织特异性表达)的子序列或多核苷酸变体。如本文所用,术语“功能性”及其语法变体,当用于提及核酸序列、子序列或片段时,意指该序列具有天然核酸序列(例如非变体或未修饰的序列)的一种或多种功能。如本文所用,术语“变体”意指序列取代、缺失或添加,或其他修饰(例如化学衍生物,诸如对核酸酶具有抗性的修饰的形式)。
如本文所用,术语“可操作的连接”是指所描述的组分的物理并置,以允许它们以其预期的方式发挥作用。在与核酸可操作连接的表达控制元件的实例中,该关系为使得控制元件调控核酸的表达。通常,调控转录的表达控制区并置在转录核酸的5’末端附近(即“上游”)。表达控制区还可以位于转录序列的3’末端(即“下游”)或位于转录物内(例如,内含子中)。表达控制元件可以位于远离转录序列的一定距离处(例如,距离核酸100至500个、500至1000个、2000至5000个或更多个核苷酸)。表达控制元件的具体实例是启动子,其通常位于转录序列的5’。表达控制元件的另一个实例是增强子,其可以位于转录序列的5’或3’,或位于转录序列内。
一些表达控制区赋予可操作地连接的PD-L1核酸可调节的表达。信号(有时称为刺激)可以增加或减少与这种表达控制区可操作地连接的PD-L1核酸的表达。响应于信号而增加表达的此类表达控制区通常被称为诱导型的。响应于信号而减少表达的此类表达控制区通常被称为抑制型的。通常,这些元件赋予的增加或减少的量与存在的信号量成比例;信号量越大,表达的增加或减少越大。
多种可调节的启动子在本领域中是已知的。优选的诱导型表达控制区包括含有用小分子化合物刺激的诱导型启动子的表达控制区。在一个实施方案中,表达控制区响应于可口服递送但通常不存在于食物中的化学物质。具体的实例可见于例如美国专利5,989,910;5,935,934;6,015,709;和6,004,941,所有这些专利均以引用方式整体并入本文。
在一个实施方案中,表达载体还包含整合序列。在一个实施方案中,表达载体包含单个整合序列。在另一个实施方案中,表达载体包含第一整合序列和第二整合序列,以用于将PD-L1核酸或其部分整合进靶细胞的基因组中。在优选的实施方案中,一个或多个整合序列与选自由以下组成的组的整合构件结合发挥作用:mariner、sleeping beauty、FLP、Cre、ФC31、R、λ,以及来自诸如AAV、逆转录病毒和慢病毒的整合病毒的整合构件。
在一个实施方案中,主题组合物除PD-L1构建体之外还包含非治疗性构建体,其中非治疗性构建体包含编码与第二表达控制区可操作地连接的整合构件的核酸序列。该第二表达控制区和与PD-L1核酸可操作地连接的表达控制区可以相同或不同。编码的整合构件优选地选自由以下组成的组:mariner、sleeping beauty、FLP、Cre、ФC31、R、λ,以及来自诸如AAV、逆转录病毒和慢病毒的整合病毒的整合构件。
用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域技术人员熟知的,参见例如Sambrook等人,1989,同上)。关于进一步的教导,参见WO2008020318,其以引用方式整体明确地并入本文。
药物制剂
本发明还提供了包含本发明的DD-脱乙酰壳多糖核酸聚合复合物组合物的“药学上可接受的”或“生理学上可接受的”制剂。此类制剂可以在体内施用于受试者以实施治疗方法。
如本文所用,术语“药学上可接受的”和“生理学上可接受的”是指可施用于受试者,优选地不产生过多的不良副作用(例如恶心、腹痛、头痛等)的载剂、稀释剂、赋形剂等等。用于施用的此类制剂包括无菌水性或非水性溶液、悬浮液和乳液。
药物制剂可以由与受试者施用相容的载剂、稀释剂、赋形剂、溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等等制备。此类制剂可以包含在片剂(包覆的或未包覆的)、胶囊(硬的或软的)、微珠、乳液、粉末、粒料、晶体、悬浮液、糖浆或酏剂中。除了其他添加剂之外,还可以存在补充的活性化合物和防腐剂,例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等等。
赋形剂可包括盐、等渗剂、血清蛋白、缓冲剂或其他pH控制剂、抗氧化剂、增稠剂、不带电荷的聚合物、防腐剂或冷冻保存剂。用于本发明组合物的赋形剂还可包括等渗剂和缓冲剂或其他pH控制剂。可以添加这些赋形剂以达到优选的pH范围(约6.0-8.0)和同渗容摩(约50-400mmol/L)。合适的缓冲剂的实例是乙酸盐、硼酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐和磺化有机分子缓冲剂。这些缓冲剂可以以0.01%至1.0%(w/v)的浓度存在于组合物中。等渗剂可选自本领域已知的任何等渗剂,例如甘露糖醇、右旋糖、葡萄糖和氯化钠,或其他电解质。优选地,等渗剂是葡萄糖或氯化钠。可以使用使组合物具有与其所引入的生物环境相同或相似的渗透压的等渗剂量。组合物中等渗剂的浓度将取决于所用特定等渗剂的性质,并且可以在约0.1%至10%的范围内。当使用葡萄糖时,优选以1%至5%w/v,更特别地5%w/v的浓度使用。当等渗剂是氯化钠时,优选以达1%w/v,特别地0.9%w/v的量使用。本发明的组合物还可含有防腐剂。防腐剂的实例是聚六亚甲基-双胍、苯扎氯铵、稳定化的氧氯复合物(诸如称为的复合物)、乙酸苯汞、氯代丁醇、山梨酸、氯己定、苄醇、对羟基苯甲酸酯和硫柳汞。通常,此类防腐剂的浓度为约0.001%至1.0%。此外,本发明的组合物还可含有冷冻保存剂。优选的冷冻保存剂是葡萄糖、蔗糖、甘露糖醇、乳糖、海藻糖、山梨糖醇、胶态二氧化硅、分子量优选低于100,000g/mol的葡聚糖、甘油和分子量低于100,000g/mol的聚乙二醇或它们的混合物。最优选的是葡萄糖、海藻糖和聚乙二醇。通常,此类冷冻保存剂的浓度为约0.01%至10%。
可以将药物制剂配制成与预期施用途径相容。例如,对于口服施用,可以将组合物与赋形剂掺合并以片剂、锭剂、胶囊(例如明胶)或包衣(例如肠溶衣(或))的形式使用。可以将药学上相容的粘合剂和/或佐剂材料包含在口服制剂中。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等等可含有下列任何成分或具有类似性质的化合物:粘合剂,诸如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶;赋形剂,诸如淀粉或乳糖;崩解剂,诸如海藻酸、Primogel或玉米淀粉;润滑剂,诸如硬脂酸镁或其他硬脂酸盐;助流剂,诸如胶态二氧化硅;甜味剂,诸如蔗糖或糖精;或调味剂,诸如薄荷、水杨酸甲酯或调味料。
制剂还可以包含载剂以保护组合物免于快速降解或从体内消除,诸如控释制剂,包括植入物和微囊化递送系统。例如,可以单独地使用或与蜡组合使用时间延迟材料诸如单硬脂酸甘油酯或硬脂酸甘油酯。
还设想了栓剂和其他可直肠施用的制剂(例如可通过灌肠施用的制剂)。关于直肠递送的进一步信息,参见,例如Song等人,Mucosal drug delivery:membranes,methodologies,and applications,Crit.Rev.Ther.Drug.Carrier Syst.,21:195-256,2004;Wearley,Recent progress in protein and peptide delivery by noninvasiveroutes,Crit.Rev.Ther.Drug.Carrier Syst.,8:331-394,1991。
适于施用的其他药物制剂在本领域中是已知的,并且适于本发明的方法和组合物(参见,例如Remington's Pharmaceutical Sciences(1990)第18版,Mack PublishingCo.,Easton,Pa.;The Merck Index(1996)第12版,Merck Publishing Group,Whitehouse,N.J.;和Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms,Technonic PublishingCo.,Inc.,Lancaster,Pa.,(1993))。
肠施用
主题组合物可以经口服施用。口服施用可能涉及吞咽,使得化合物进入胃肠道。本发明的组合物还可以直接施用至胃肠道。注射器、内窥镜、套管、插管、导管和其他物品可用于这种施用。适于口服施用的制剂包括固体制剂,诸如片剂、胶囊、含颗粒或包覆颗粒的包覆胶囊、液体、或粉末、锭剂(包括填充液体的锭剂)、咀嚼物、多颗粒和纳米颗粒、凝胶、膜、珠形剂(ovule)和喷雾剂。液体制剂包括悬浮液、溶液、糖浆和酏剂。液体制剂可以通过重构固体来制备。
片剂剂型通常含有崩解剂。崩解剂的实例包括羧甲淀粉钠、羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钙、交联羧甲基纤维素钠、交聚维酮、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、微晶纤维素、低级烷基取代的羟丙基纤维素、淀粉、预胶化淀粉和海藻酸钠。一般来讲,崩解剂占剂型的1重量%至25重量%,优选5重量%至20重量%。
粘合剂通常用于赋予片剂制剂粘合性。合适的粘合剂包括微晶纤维素、明胶、糖、聚乙二醇、天然和合成树胶、聚乙烯吡咯烷酮、预胶化淀粉、羟丙基纤维素和羟丙基甲基纤维素。片剂还可含有稀释剂,诸如乳糖(一水合物、喷雾干燥的一水合物、无水物等等)、甘露糖醇、木糖醇、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、微晶纤维素、淀粉和二水磷酸氢钙。
片剂还可任选地包含表面活性剂(诸如月桂基硫酸钠和聚山梨醇酯80)以及助流剂(诸如二氧化硅和滑石)。当存在时,表面活性剂可占片剂的0.2重量%至5重量%,并且助流剂可占片剂的0.2重量%至1重量%。
片剂通常还含有润滑剂,诸如硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌、硬脂酰富马酸钠,以及硬脂酸镁与月桂基硫酸钠的混合物。润滑剂通常占片剂的0.25重量%至10重量%,优选0.5重量%至3重量%。
其他可能的成分包括抗氧化剂、着色剂、调味剂、防腐剂和掩味剂。片剂共混物可直接压制或通过辊压制成片。在制片之前,可将片剂共混物或共混物部分湿法粒化、干法粒化或熔融粒化、熔融凝固或挤出。最终制剂可包括一个或多个层且可以是包覆的或未包覆的;它甚至可以是胶囊包封的。
片剂制剂在H.Lieberman和L.Lachman的Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets,第1卷(Marcel Dekker,New York,1980)中有所讨论。
用于人用途或兽医用途的可消耗口服膜通常是柔韧的水溶性或水溶胀性薄膜剂型,它们可快速溶解或粘附粘膜,并且通常包含成膜聚合物、粘合剂、溶剂、保湿剂、增塑剂、稳定剂或乳化剂、粘度改良剂和溶剂。制剂的一些组分可以执行多于一种功能。
本发明还包括含有本发明组合物的多颗粒珠粒。
其他可能的成分包括抗氧化剂、着色剂、调味料和增味剂、防腐剂、唾液刺激剂、凉爽剂、共溶剂(包括油)、润肤剂、增量剂、消泡剂、表面活性剂和掩味剂。
根据本发明的膜通常通过蒸发干燥涂布在可剥离的背衬支撑物或纸上的薄的水性膜来制备。这可以在干燥烘箱或隧道(通常是组合式涂布机干燥器)中完成,或通过冷冻干燥或抽真空来完成。用于口服施用的固体制剂可被配制成立即释放和/或修饰释放。修饰释放制剂包括延迟释放、持续释放、脉冲式释放、控制释放、靶向释放和程序化释放。
其他合适的释放技术诸如高能分散体及渗透性和包覆颗粒是已知的。
直肠/阴道内施用
本发明的化合物可以经直肠或阴道施用,例如以栓剂、子宫套或灌肠剂的形式施用。可可油是传统的栓剂基质,但可以酌情使用各种替代品。
用于直肠/阴道施用的制剂可被配制成立即释放和/或修饰释放。修饰释放制剂包括延迟释放、持续释放、脉冲式释放、控制释放、靶向释放和程序化释放。
用于治疗受试者的剂量或“有效量”优选地足以以可测量或可检测的程度改善疾患的一种、几种或所有症状,但预防或抑制炎性病症或疾患或症状的进展或恶化是令人满意的结果。因此,为改善可通过本发明方法治疗的疾患而产生的PD-L1蛋白的量将取决于疾患和所需的结果,并且可由技术人员容易地确定。适当的量将取决于所治疗的疾患、所需的治疗效果,以及个体受试者(例如受试者内的生物利用度、性别、年龄等)。通过测量相关的生理效应可以确定有效量。
本发明还设想了兽医应用。因此,在一个实施方案中,本发明提供了治疗非人哺乳动物的方法,所述方法包括将本发明的基于脱乙酰壳多糖的纳米颗粒施用于需要治疗的非人哺乳动物。
治疗方法
本发明的组合物和方法在调控炎症方面具有有利的用途。例如,治疗性多肽可以抑制参与炎症反应的细胞的增殖和分化。这些分子可用于治疗炎性疾患(慢性疾患和急性疾患),包括与感染相关的炎症(例如败血性休克、败血症或全身性炎症反应综合征(SIRS))、缺血-再灌注损伤、内毒素致死、炎性肠病(IBD)、克罗恩病、结肠炎、或由细胞因子(例如TNF或IL-1)过量产生引起的疾患。对于本发明的治疗来说特别感兴趣的炎性病症包括但不限于克罗恩病和炎性肠病。
本发明的治疗性组合物还可用于治疗和/或预防器官排斥或移植物抗宿主病(GvHD)。宿主免疫细胞通过免疫反应破坏移植的组织,因而发生器官排斥。类似地,GvHD中也涉及免疫反应,但是,在这种情况下,外来移植的免疫细胞破坏宿主组织。施用抑制免疫反应,特别是T细胞的增殖、分化或趋化性的本发明的治疗性组合物可以是预防器官排斥或GvHD的有效疗法。
本文阐述的实例示出了本公开的若干实施方案,但不应被解释为以任何方式限制本公开的范围。
实施例
实施例1
质粒构建和产生
将优化的PD-L1和PD-L1-Fc DNA序列均克隆到pVAX骨架克隆载体中。质粒含有质粒复制起点(pUC ori),该质粒复制起点受人巨细胞病毒立即早期基因启动子(CMV)控制且具有卡那霉素抗性基因(KAN)。设计的质粒由DNA 2.0(Newark,CA)定制合成。收到DNA后,根据制造商的建议进行重构。简而言之,将含有DNA的吸收纸放入具有穿孔底部(用23G针进行)的小的0.2mL管中。然后将小管放入较大的1.5mL管中。向吸收纸中添加200μL水,在室温下孵育1min后,将管以最大速度离心1min。在1.5ml管中回收溶解的DNA。然后使用DNA转化大肠杆菌DH5α(化学感受态细菌)。简而言之,在无菌条件下向100μl解冻的大肠杆菌DH5α细胞中添加10μL洗脱的DNA。在冰上孵育30min后,将细胞在42C下热激30秒并在冰上孵育2min。向DH5α转化的细胞中添加30μL的Luria-Bertani(LB)培养基,并在37C,180rpm振荡下孵育1小时。然后将培养物铺展在含有卡那霉素(50μg/ml)的LB琼脂板上,并在37C下孵育16小时。第二天,使用单个分离的菌落接种6mL含有卡那霉素(50μg/ml)的LB肉汤。将培养物在37C下在振荡器(180rpm)上孵育5-6小时。随后将培养物用于接种2.5L LB培养基,将其在37C下在振荡器上孵育16小时。然后根据制造商的说明,使用EndoFree Plasmid Giga试剂盒(QIAGEN)从该大细菌培养物中分离质粒DNA。分离后,使用限制性酶验证质粒内的PD-L1和PD-L1-Fc DNA插入物,并通过琼脂糖凝胶确认片段尺寸
实施例2
体外PD-L1和PD-L1-Fc表达
为了测量来自聚合复合物的体外表达,将HEK-293T细胞以每孔800,000个细胞的密度接种在6孔组织培养板中的高葡萄糖DMEM完全培养基(10%胎牛血清,50单位/ml青霉素,50μg/ml链霉素)中并在37℃和5%CO2下孵育过夜。第二天,将PD-L1-Fc聚合复合物在37℃水浴中短暂解冻。将每种聚合复合物在无菌水中稀释至12.5-200μg/ml DNA的浓度,相当于每孔0.5-8μg DNA,并保持在冰上直至转染。从每个孔中取出HEK-293T上清液,并用2ml预热的OptiMEM轻轻洗涤细胞。向每孔中添加1ml预热的OptiMEM。向孔中加入40μl稀释的聚合复合物,并轻轻旋转板以确保适当混合。将细胞在37℃和5%CO2下孵育3小时。孵育后,通过移液除去细胞培养基,用2ml预热的DMEM完全培养基替换,并将细胞在37℃和5%CO2中孵育48小时。在转染后48小时,从用PD-L1-Fc聚合复合物转染的孔或作为对照的未转染的细胞的孔中除去细胞培养基。通过离心(1500rpm,5min,4℃)从上清液中除去细胞碎片,并将上清液储存在-80℃下直至分析。为了定量细胞总蛋白,从孔中取出细胞培养上清液,用冷PBS洗涤转染的细胞,并向孔中添加500μl裂解缓冲液(50mM Tris pH 8.0,1%TritonX-100,100mM NaCl,1mM EDTA,10%甘油加cOmplete蛋白酶抑制剂混合物)。将板在冰上放置2-3分钟,使用细胞刮刀收集细胞,将细胞转移至1.5ml微量离心管中并在冰上放置30min。通过离心(13000rpm,10min,4℃)从裂解液中除去细胞碎片,并通过Lowry测定测量总蛋白。
根据制造商的方案,通过ELISA测量PD-L1蛋白浓度。简而言之,将96孔板涂有抗人PD-L1捕获抗体并在25℃下孵育过夜。第二天,将板用0.05%20的PBS溶液洗涤,用1%牛血清白蛋白(BSA)的PBS溶液封闭1小时,之后进行另外的洗涤步骤。将样品或标准品添加到板中并在25℃下孵育2小时。将生物素化的山羊抗人PD-L1检测抗体添加到孔中保持2小时,然后洗涤并添加链霉抗生物素蛋白-HRP保持20min。洗涤孔并添加四甲基联苯胺溶液保持20min以检测HRP。通过添加2N硫酸终止反应,并使用SoftMax Pro软件在450nm下在SpectraMAX Plus(ENG0214)上读板。使用由制造商提供的冻干标准蛋白计算PD-L1蛋白水平。将蛋白质样品拟合至标准的4参数逻辑曲线。在一些实例中,将PD-L1蛋白水平标准化为转染细胞中的总蛋白,并表示为ng PD-L1-Fc/mg细胞总蛋白。
为了评定PD-L1-Fc聚合复合物的转染效力,用增加量的DD-X聚合物内所含的DNA转染HEK-293T。随着pVAX-opt-hPD-L1-Fc质粒DNA的量增加,PD-L1蛋白的定量显示出hPD-L1-Fc表达的剂量依赖性增加(图4A)。尽管在转染之间PD-L1-Fc的最大表达(ng/mg)显示出一些变异性,但在独立转染之间EC50是相似的(图4B)。
实施例3
Fc融合蛋白(PD-L1-Fc)的纯化
将HEK293T细胞以5x106个细胞/烧瓶铺展在T75烧瓶中的DMEM(10%FBS,Multicell)中,并在37C下孵育。第二天,按照制造商的建议,使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)用PD-L1-Fc质粒DNA(9ug/烧瓶;每个烧瓶3ml)转染细胞,并在37℃下孵育。24h后,将DMEM培养基更换为12ml EXCELL无血清培养基(Sigma Aldrich)。48h后(转染后72h),收集上清液并储存在-20℃下直至纯化。按照制造商的建议,使用Protein G HiTrap柱(GE)纯化Fc融合蛋白。然后使用PD-10脱盐柱更换缓冲液,并在4个PBS级分(Gibco)中洗脱蛋白质。通过考马斯染剂检测蛋白质的存在。按照制造商的建议,通过ELISA(Duoset,R&D)测量每个级分中的PDL1浓度。
实施例4
体外PD-L1-Fc功能性测定
为了评定Fc融合的PD-L1构建体的功能性,将含或不含5μg/ml体外无血清培养基产生的PDL1-Fc或商业rhPDL1-Fc(Adipogen)的抗小鼠CD3(0.2μg/ml,eBioscience)和/或抗小鼠CD28(1μg/ml,eBioscience)添加到96孔平底板的孔中的PBS(50μl/孔)中。rhIgG1-Fc(Adipogen)用作阴性对照。
将板以中速放在板振荡器上1h,然后在4C下孵育过夜。第二天,从3只小鼠(Jackson Laboratories)中取出脾。通过在显微镜载片的磨砂末端上研磨脾来分离脾细胞。将红细胞在5ml内部制备的ACK裂解缓冲液中裂解1min,并通过添加45ml PBS(10%FBS)来终止裂解。离心和倾析后,将来自3只小鼠的细胞重悬于补充的RPMI培养基(10%FBS,NEAA,L-谷氨酰胺,2-ME;Multicell)中,合并,计数并调整至适当的浓度。按照制造商的建议,将一部分细胞用CellTrace Violet(Life Technologies)染色。通过移液小心地从aCD3/aCD28 96孔板中取出PBS。然后将细胞接种到孔中的RPMI培养基中(200,000个细胞/孔),并在37C下孵育3或4天。在任一时间点,将细胞转移到新的96孔v形底板中,并在黑暗中在冰上用可固定的活力染料(eBioscience)染色30min。用冷FACS缓冲液(PBS 2%FBS)洗涤细胞两次,并在流式细胞仪(BD LSR II)上获取。通过监测CellTrace Violet信道中的细胞分裂峰来测量细胞增殖。通过检测FSC-SSC门中的细胞尺寸来测量细胞活化。
为了确定opt-hPD-L1-Fc是否结合人PD-1受体并活化细胞内信号,使用PathHunter Jurkat PD-1(SHP2)信号传导测定(DiscoverX)。在测试该测定之前,产生大批量纯化的PD-L1-Fc蛋白。简而言之,通过用PD-L1-Fc质粒DNA转染HEK-293T细胞,从构建体表达PD-L1-Fc。简而言之,将3.9x105个HEK-293T细胞铺展在T175烧瓶中的30ml DMEM(Multicell)完全培养基(10%FBS,100U/ml青霉素,100μg/ml链霉素)中,并在37℃和5%CO2下孵育过夜。第二天,从烧瓶中吸出培养基,将细胞用10ml PBS(Multicell)洗涤一次。使用Lipofectamine 2000(Life Technologies;每个烧瓶100μl)在5.5mlOptiMEM(Gibco)中用49μg的PD-L1-Fc质粒转染细胞。将细胞(37℃和5%CO2)孵育2h,然后将40ml DMEM完全培养基添加到烧瓶中。将细胞孵育24h,吸出培养基,并用10ml PBS洗涤细胞。将EXCELL无血清培养基(45ml;Sigma)添加到烧瓶中,并将细胞在37℃和5%CO2下孵育。24h后(转染后48h),取出上清液并以1500rpm离心5min以除去细胞碎片。将上清液转移到新的50ml管中并储存在-80℃下。按照制造商的建议,使用Protein G HiTrap柱(GE)纯化PD-L1-Fc。按照制造商的建议,使用PD-10脱盐柱(GE)将缓冲液更换为PBS。将PD-L1-Fc储存在-80℃下直至蛋白质浓缩并定量。按照制造商的建议,使用Amicon Ultra-4离心过滤器(Millipore Sigma)浓缩PD-L1-Fc蛋白。通过PD-L1ELISA(R&D)立即定量蛋白质。在一些情况下,将PD-L1-Fc浓度在PBS中稀释至1mg/mL并储存在-80℃下。
为了评定通过人PD-L1受体的细胞内活化,按照制造商的建议培养PathHunter细胞。将细胞离心并重悬于预热的AssayComplete细胞铺板试剂中。将细胞接种到白色96孔平底组织培养板的孔中(50μl/孔;20,000个细胞/孔),并在室温下孵育15min。将AssayComplete细胞铺板试剂(10μl/孔)添加到含或不含抗PD-1(克隆NAT105,Abcam)的孔中。在AssayComplete铺板试剂中制备纯化的PD-L1-Fc蛋白或重组非裂解性人IgG1-Fc(Adipogen)并添加到细胞中(50μl/孔)。将细胞在37℃和5%CO2下孵育40min。将PathHunter生物测定试剂1添加到细胞中(10μl/孔),并将板置于板振荡器上以350rpm振荡1min。将细胞在室温和黑暗中孵育15min。将PathHunter生物测定试剂2(40μl)添加到每个孔中,并将细胞在室温和黑暗中孵育1小时。在光度计(enSpire-Perkin Elmer)上读取发光。相对于未刺激的对照,将数据分析为发光(RLU;相对荧光单位)。数据表示为平均值±标准偏差。使用学生t检验分析数据,并且星号表示统计学上显著的差异(*,p≤0.05;**,p≤0.01;***,p≤0.001)。
此处总结了前述的结果。为了确定从pVAX-opt-hPD-L1-Fc质粒表达的蛋白质是否将结合人PD-1受体并启动细胞内信号传导,使用PathHunter Jurkat PD-1(SHP2)信号传导测定(DiscoverX)。通过PD-1受体的信号传导随着纯化的PDL1-Fc剂量的增加而增加,并且在最大剂量为14.7μM时出现平台期(783μg/ml;图6A)。为了确保这种剂量依赖性的发光诱导是由PDL1-PD1特异性相互作用引起的,利用竞争测定(图6B)。用纯化的PDL1-Fc而非重组IgG1-Fc刺激PathHunter细胞导致发光增加,这表明信号诱导不是由PD-1与融合至PD-L1蛋白的Fc片段结合引起的。此外,在用PD-L1-Fc刺激细胞之前用抗人PD-1孵育细胞时,PDL1-Fc诱导的发光被抑制,这表明通过PD-1受体的结合和信号传导是由PDL1-PD1特异性相互作用引起的。
实施例5
野生型膜结合PD-L1体外表达和功能性测定
为了确定细胞表面的hPD-L1表达动力学,将NIH/3T3细胞接种(400,000个细胞/孔;2ml;DMEM 10%FBS)到6孔板中并在37C下孵育过夜。第二天,按照制造商的建议,使用Lipofectamine 2000用野生型PD-L1构建体质粒或pVax对照转染细胞。转染后24小时,将细胞用PBS洗涤,并通过添加无酶解离缓冲液(EFDB,Gibco;2ml/孔)重悬,在37C下孵育5min,并轻轻地将细胞从板移出。将细胞以1500rpm离心5min并重悬于DMEM(10%FBS)中。将细胞重新接种(10,000个细胞/孔)到96孔平底板中,并培养2-5天。在每个时间点,取出上清液,如上所述将细胞重悬于EFDB中,并将细胞分配到96孔v形底板中用于FACS染色。按照供应商的建议,将细胞用抗人PD-L1-PE(BioLegend)(0.2ng/孔)和可固定活力染料eFluor 780(eBioscience)在冰上在黑暗中染色30min。将细胞洗涤两次,重悬于FACS缓冲液中,并在流式细胞仪上获取。
为了测试在NIH/3T3细胞表面上表达的hPD-L1的功能性,采用PD-1结合测定。如上所述,在6孔板中转染NIH/3T3细胞。转染48小时后,如上所述将细胞重悬于EFDB中,离心,重悬于FACS缓冲液中,并接种到96孔v形底板中。将细胞以1500rpm离心5min,倾析,用或不用各种浓度的rhPD-1(R&D)重悬(50μl),并在37℃下孵育30min。将细胞离心,用FACS缓冲液洗涤两次,并用抗人PDL1-PE(0.2ng/孔)或同种型对照、抗人PD-1-APC(eBioscience)(0.8ng/孔)或同种型对照以及活力染料在冰上在黑暗中染色30min。然后将细胞洗涤两次,重悬于FACS缓冲液中,并使用BD LSR II流式细胞仪获取。使用FlowJo 10.2[软件(Tree Star,Or.CA)分析数据
实施例6
体内功效研究
GvHD模型
10周龄雌性BALB/c SPF小鼠(Charles River)以2x350 cGy分次剂量接受总共700cGy的全身照射(RS2000生物研究X射线源),在第-1天下午给予第一次照射,在第0天早上给予第二次照射。将8-10周龄雄性C57Bl6/j小鼠(Charles River)用于供体细胞。
研究包括3个对照组(n=5):非照射组、无移植物组、仅1000万个BMT的组;以及接受1000万个BMT和250万个脾细胞的4个治疗组(n=8)。从第1天开始,在接下来的6周每周一次通过灌肠治疗小鼠(总共7次给药)或不进行治疗。每天监测动物的体重和临床征象。终止体重减轻超过25%和或临床评分为8或更高的动物。
与pVAX对照治疗的动物相比,每周结肠内施用PD-L1或PD-L1-Fc聚合复合物降低了体重减轻(图9A、图10A、图10B和图11A)。相对于未治疗的动物和pVAX对照治疗的动物,接受PD-L1或PD-L1-Fc的小鼠还显示出与GvHD相关的临床征象的减少(图9B),并且具有提高的存活率(图9C、图10C和图11B)。不受理论束缚,本文设想到当T细胞通过肠道时,它们暴露于PD-L1多肽并变得“耐受”。离开肠道后,T细胞进入循环并可抑制效应T细胞功能。耐受的T细胞可导致调节性T细胞亚群的上调和/或致病性效应细胞的减少或抑制。此外,已显示PD-L1上调对上皮修复而言重要的分子。不受理论束缚,本文还设想到鉴于在照射和疾病之后胃肠道的屏障功能受损,那么增加上皮修复的PD-L1的增加也可以帮助恢复肠屏障功能。
实施例7
T细胞结肠炎模型
使用磁性活化细胞分选仪(MACS)CD4T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec,Auburn,CA)通过阴性选择从6-8周龄雌性C57BL/6小鼠的脾中分离总CD4+T细胞。随后使用FACS(FACSAriaTM,BD Biosciences,San Jose,CA)针对CD4+CD25-CD45RB高幼稚T细胞对富集的细胞进行分选。将5×105个CD4+CD25-CD45RB高细胞腹膜内(IP)转移至受体6-8周龄雌性B10-RAG2缺陷型小鼠(Jackson)。
每周2-3次监测动物的体重和临床征象。在第14天,通过针对CD4的流式细胞术染色确认CD4T细胞的存在。在T细胞转移后第15或19天开始每周灌肠治疗(总共6或7次治疗)。每周两次监测动物的体重和临床征象。终止体重减轻超过25%或有严重临床征象的动物。
与pVAX和蔗糖对照小鼠相比,通过结肠内滴注每周施用PD-L1-Fc聚合复合物降低了PD-L1-Fc治疗的小鼠的体重减轻并减少了疾病临床征象(图13C-图13D)。此外,相对于对照组,用PD-L1-Fc聚合复合物治疗提高了小鼠的存活率(图13E)。
虽然已经参考优选实施例描述了本公开,但是本领域技术人员将理解,在不脱离本公开的范围的情况下,可以进行各种改变并且可以用等同物替换本发明的元件以适应特定情况。因此,意图是本公开不限于作为实施本公开的最佳方式公开的特定实施方案,而是本公开将包括落入所附权利要求范围和精神内的所有实施方案。
Claims (24)
1.一种治疗有需要的患者的炎性病症的方法,所述方法包括向所述患者的胃肠道施用包含程序性死亡配体1(“PD-L1”)核酸的表达载体。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述PD-L1核酸编码人PD-L1多肽。
3.根据权利要求2所述的方法,其中所述PD-L1多肽是可溶性人PD-L1多肽,所述可溶性人PD-L1多肽包含人PD-L1的IgV结构域和IgC结构域(SEQ ID NO:1的氨基酸19-239)或由其组成。
4.根据权利要求2所述的方法,其中所述PD-L1多肽是可溶性人PD-L1多肽,所述可溶性人PD-L1多肽包含人PD-L1的信号传导结构域、IgV结构域和IgC结构域(SEQ ID NO:1的氨基酸1-239)或由其组成。
5.根据权利要求2-4中任一项所述的方法,其中所述PD-L1多肽的N端区与人IgG1Fc区或其部分融合。
6.根据权利要求5所述的方法,其中所述PD-L1多肽经由(GGGGS)n(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列与人IgG1Fc区或其部分融合。
7.根据权利要求5所述的方法,其中所述人IgG1Fc是通过改变Fc结构域中的以下氨基酸中的一个或多个而突变以降低抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDCC):E233P、L234V、L235A、G236缺失、A327G、A330S和P331S。
8.根据权利要求5所述的方法,其中所述PD-L1核酸包含SEQ ID NO.4的序列。
9.根据权利要求2所述的方法,其中所述PD-L1多肽是膜结合的PD-L1多肽,所述膜结合的PD-L1多肽包含人PD-L1的信号传导序列、IgV结构域、IgC结构域和跨膜结构域(SEQ IDNO:1的氨基酸1-259)或由其组成。
10.根据权利要求9所述的方法,其中所述PD-L1多肽还包含人PD-L1的细胞质结构域。
11.根据权利要求10所述的方法,其中所述PD-L1核酸包含SEQ ID NO.3的序列。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法,其中所述炎性病症是炎性肠病、溃疡性结肠炎或克罗恩病。
13.根据权利要求1-11中任一项所述的方法,其中所述炎性病症是移植物抗宿主病(GvHD)。
14.一种包含PD-L1核酸的表达载体,其中所述PD-L1核酸的序列与SEQ ID NO:2相比包含至少一个同义取代以供施用后检测,并且优选地包含多个同义取代。
15.根据权利要求14所述的表达载体,其中所述PD-L1核酸序列经密码子优化以供表达。
16.根据权利要求14所述的表达载体,其中所述PD-L1核酸还包含异源序列。
17.根据权利要求16所述的表达载体,其中所述异源序列包含Fc结构域、蛋白标签、缀合的治疗剂或它们的组合。
18.根据权利要求17所述的表达载体,其中所述Fc结构域包含人IgG1Fc区或其部分。
19.根据权利要求18所述的表达载体,其中所述PD-L1核酸包含SEQ ID NO.4的序列。
20.根据权利要求15所述的表达载体,其中所述PD-L1核酸包含SEQ ID NO.3的序列。
21.根据权利要求14-20中任一项所述的表达载体在治疗有需要的患者的炎性病症中的用途。
22.根据权利要求14-20中任一项所述的表达载体在制备用于治疗有需要的患者的炎性病症的药物中的用途。
23.根据权利要求21或22所述的用途,其中所述炎性病症是炎性肠病、溃疡性结肠炎或克罗恩病。
24.根据权利要求21或22所述的用途,其中所述炎性病症是移植物抗宿主病(GvHD)。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201662419899P | 2016-11-09 | 2016-11-09 | |
US62/419,899 | 2016-11-09 | ||
PCT/CA2017/051340 WO2018085935A1 (en) | 2016-11-09 | 2017-11-09 | Intestinal expression of programmed death ligand 1 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN110520534A true CN110520534A (zh) | 2019-11-29 |
Family
ID=62110197
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201780072387.3A Pending CN110520534A (zh) | 2016-11-09 | 2017-11-09 | 程序性死亡配体1的肠表达 |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US11603398B2 (zh) |
EP (1) | EP3538659A4 (zh) |
JP (1) | JP2019534300A (zh) |
CN (1) | CN110520534A (zh) |
AU (1) | AU2017356350B2 (zh) |
CA (1) | CA3043124A1 (zh) |
IL (1) | IL266540A (zh) |
WO (1) | WO2018085935A1 (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113061192A (zh) * | 2021-04-12 | 2021-07-02 | 佰思巢(上海)生物科技有限公司 | 一类对pd-1受体具有高亲和力的pdl1融合蛋白及其作为t细胞抑制剂的应用 |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP4087544A1 (en) * | 2020-01-10 | 2022-11-16 | ModernaTX, Inc. | Methods of making tolerogenic dendritic cells |
EP4093437A2 (en) * | 2020-01-22 | 2022-11-30 | Engene, Inc. | Localized expression of therapeutic nucleic acids in lung epithelial cells |
Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101084438A (zh) * | 2004-10-06 | 2007-12-05 | 梅约医学教育与研究基金会 | B7-h1和癌症的诊断、预后和治疗方法 |
US20100266617A1 (en) * | 2007-06-18 | 2010-10-21 | N.V. Organon | Antibodies to human programmed death receptor pd-1 |
US20120076805A1 (en) * | 2009-03-06 | 2012-03-29 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Methods and Compositions for the Generation and Maintenance of Regulatory T Cells |
US20120251514A1 (en) * | 2009-11-13 | 2012-10-04 | University Health Network | Modulated programmed death ligand-1 |
CN103987405A (zh) * | 2011-11-28 | 2014-08-13 | 默克专利股份公司 | 抗pd-l1抗体及其用途 |
WO2015178746A1 (ko) * | 2014-05-23 | 2015-11-26 | 주식회사 제넥신 | Pd-l1 융합 단백질 및 이의 용도 |
US20160235863A1 (en) * | 2013-09-25 | 2016-08-18 | Engene, Inc. | Dually derivatized chitosan nanoparticles and methods of making and using the same for gene transfer in vivo |
Family Cites Families (19)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1443905A4 (en) * | 2001-10-03 | 2010-06-23 | Univ Johns Hopkins | COMPOSITIONS FOR ORAL GENE THERAPY AND METHOD OF USE THEREOF |
ATE482694T1 (de) * | 2002-07-05 | 2010-10-15 | Temrel Ltd | Zusammensetzung zur kontrollierten wirkstoffabgabe |
RU2375047C2 (ru) * | 2004-03-26 | 2009-12-10 | Лек Фармасьютиклз Д.Д. | Фармацевтическая лекарственная форма, устойчивая к действию желудочного сока, включающая n-(2-(2-фталимидоэтокси)ацетил)-l-аланил-d-глутаминовую кислоту (lk 423) |
WO2008020318A2 (en) * | 2006-03-30 | 2008-02-21 | Engene, Inc. | Non-viral compositions and methods for transfecting gut cells in vivo |
WO2008011344A2 (en) * | 2006-07-17 | 2008-01-24 | Nationwide Children's Hospital Inc. | Disruption of programmed death-1 (pd-1) ligands to adjuvant adeno-associated virus vector vaccines |
US8062852B2 (en) * | 2007-10-01 | 2011-11-22 | The Children's Hospital And Regional Medical Center | Detection and treatment of autoimmune disorders |
US8703152B2 (en) * | 2008-06-03 | 2014-04-22 | University Of Rochester | Methods of treating inflammatory intestinal disease and managing symptoms thereof |
EP2391387A1 (en) * | 2009-01-29 | 2011-12-07 | Synedgen, Inc. | Nucleic acid delivery using modified chitosans |
KR101342641B1 (ko) * | 2009-06-25 | 2013-12-20 | 주식회사 바이오리더스 | 폴리감마글루탐산-키토산 나노입자를 함유하는 면역보강제 조성물 |
WO2011127344A2 (en) * | 2010-04-08 | 2011-10-13 | University Of Virginia Patent Foundation | Method to detect and treat infectious or inflammatory diarrhea |
WO2013078230A1 (en) * | 2011-11-23 | 2013-05-30 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Use of pdl1 expressing cells to convert t cells into regulatory t cells |
EP2828332B1 (en) * | 2012-03-21 | 2017-05-10 | enGene, Inc. | Dually derivatized chitosan nanoparticles and methods of making and using the same for gene transfer in vivo |
GB201319548D0 (en) * | 2013-11-05 | 2013-12-18 | Medical Res Council | Amorphous magnesium-substituted calcium phosphate compositions and their uses |
US20150139994A1 (en) * | 2013-11-12 | 2015-05-21 | The Regents Of The University Of California | Compositions and methods for preventing allogeneic immune rejection |
EP2881463A1 (en) * | 2013-12-09 | 2015-06-10 | DRK-Blutspendedienst Baden-Württemberg-Hessen gGmbH | Factor IX variants with clotting activity in absence of their cofactor and/or with increased F.IX clotting activity and their use for treating bleeding disorders |
EP3079704B1 (en) * | 2013-12-13 | 2019-01-02 | CONARIS research institute AG | A pharmaceutical composition containing combinations of nicotinamide and 5-aminosalicylic acid for beneficially influencing the intestinal microbiota and/or treating gastrointestinal inflammation |
KR20150135148A (ko) * | 2014-05-23 | 2015-12-02 | 주식회사 제넥신 | Pd-l1 융합 단백질 및 이의 용도 |
US20160220636A1 (en) * | 2015-01-29 | 2016-08-04 | Sarah Bacus | Method of treating auto-immune or inflammatory diseases using b7 family proteins of derivatives thereof |
BR112018001232A2 (pt) * | 2015-07-21 | 2018-09-25 | The Children's Medical Center Corporation | pd-l1 que expressa células-tronco hematopoéticas e usos |
-
2017
- 2017-11-09 US US16/348,834 patent/US11603398B2/en active Active
- 2017-11-09 AU AU2017356350A patent/AU2017356350B2/en active Active
- 2017-11-09 EP EP17869214.1A patent/EP3538659A4/en active Pending
- 2017-11-09 JP JP2019524031A patent/JP2019534300A/ja active Pending
- 2017-11-09 CN CN201780072387.3A patent/CN110520534A/zh active Pending
- 2017-11-09 CA CA3043124A patent/CA3043124A1/en active Pending
- 2017-11-09 WO PCT/CA2017/051340 patent/WO2018085935A1/en unknown
-
2019
- 2019-05-08 IL IL266540A patent/IL266540A/en unknown
-
2023
- 2023-03-14 US US18/121,557 patent/US20230416337A1/en active Pending
Patent Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101084438A (zh) * | 2004-10-06 | 2007-12-05 | 梅约医学教育与研究基金会 | B7-h1和癌症的诊断、预后和治疗方法 |
US20100266617A1 (en) * | 2007-06-18 | 2010-10-21 | N.V. Organon | Antibodies to human programmed death receptor pd-1 |
US20120076805A1 (en) * | 2009-03-06 | 2012-03-29 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Methods and Compositions for the Generation and Maintenance of Regulatory T Cells |
US20120251514A1 (en) * | 2009-11-13 | 2012-10-04 | University Health Network | Modulated programmed death ligand-1 |
CN103987405A (zh) * | 2011-11-28 | 2014-08-13 | 默克专利股份公司 | 抗pd-l1抗体及其用途 |
US20160235863A1 (en) * | 2013-09-25 | 2016-08-18 | Engene, Inc. | Dually derivatized chitosan nanoparticles and methods of making and using the same for gene transfer in vivo |
WO2015178746A1 (ko) * | 2014-05-23 | 2015-11-26 | 주식회사 제넥신 | Pd-l1 융합 단백질 및 이의 용도 |
Non-Patent Citations (6)
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113061192A (zh) * | 2021-04-12 | 2021-07-02 | 佰思巢(上海)生物科技有限公司 | 一类对pd-1受体具有高亲和力的pdl1融合蛋白及其作为t细胞抑制剂的应用 |
CN113061192B (zh) * | 2021-04-12 | 2023-08-22 | 佰思巢(上海)生物科技有限公司 | 一类对pd-1受体具有高亲和力的pdl1融合蛋白及其作为t细胞抑制剂的应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU2017356350B2 (en) | 2024-02-29 |
EP3538659A1 (en) | 2019-09-18 |
US11603398B2 (en) | 2023-03-14 |
EP3538659A4 (en) | 2020-07-15 |
US20230416337A1 (en) | 2023-12-28 |
JP2019534300A (ja) | 2019-11-28 |
WO2018085935A1 (en) | 2018-05-17 |
US20190263887A1 (en) | 2019-08-29 |
AU2017356350A1 (en) | 2019-05-30 |
IL266540A (en) | 2019-07-31 |
CA3043124A1 (en) | 2018-05-17 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN102066405B (zh) | 用于细胞穿透的超荷电蛋白 | |
US10450354B2 (en) | CD20-binding immunotoxins for inducing cellular internalization and methods using same | |
CN108135968A (zh) | 嵌合多肽组装体及其制备和使用方法 | |
TW201141509A (en) | Modified binding proteins inhibiting the VEGF-A receptor interaction | |
US20230416337A1 (en) | Intestinal expression of programmed death ligand 1 | |
RU2725954C1 (ru) | Пептид, обладающий высокой аффинностью к белку pd-l1, и его применение | |
Siebert et al. | Tuftsin-properties and analogs | |
CN110790829B (zh) | pHLIP胞外段作为抗原制备的抗体在制备抗肿瘤药物中的应用 | |
EP3424948A1 (en) | Vascular endothelial growth factor targeting peptide-elastin fusion polypeptide and self-assembling nanostructure, which are for inhibiting angiogenesis | |
KR20220048988A (ko) | 대식세포 특이적 인게이저 조성물 및 이의 사용 방법 | |
CN106470707A (zh) | 用于口服递送生物活性货物的cholix毒素衍生的融合分子 | |
CN110121506A (zh) | 条件活性多肽及产生它们的方法 | |
US10206976B2 (en) | Protein particles comprising disulfide crosslinkers and uses related thereto | |
CN107531769A (zh) | 原毒素‑ii变体及使用方法 | |
CN102666845B (zh) | 磷酸酶和张力蛋白同系物(pten)抑制剂组合物,用途以及方法 | |
JP7390294B2 (ja) | 糖鎖模倣ペプチドを用いて癌を処置する組成物および方法 | |
Yan et al. | Delivery of human NKG2D-IL-15 fusion gene by chitosan nanoparticles to enhance antitumor immunity | |
WO2018176732A1 (zh) | 与cd56分子特异性结合的多肽及其应用 | |
JP2022512539A (ja) | 併用療法 | |
JP2022511286A (ja) | Sirpアルファ系キメラタンパク質を含む併用療法 | |
JP7242059B2 (ja) | シェーグレン症候群の治療用ペプチド | |
WO2012094905A1 (zh) | 基于b7-1-pe40kdel外毒素融合基因的dna疫苗及其用途 | |
CN115956078A (zh) | Akt3调节剂及其使用方法 | |
CA3167921A1 (en) | Clathrin-chimeric antibody receptor constructs for immune cell activation therapy in vivo | |
Krummenacher et al. | Mechanisms by which pathogens hijack and utilize membrane domains to mediate cytotoxicity |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |