CN113214413B - 高抗氧化活性的甜茶多糖提取物及其提取方法 - Google Patents

高抗氧化活性的甜茶多糖提取物及其提取方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了高抗氧化活性的甜茶多糖提取物及其提取方法。所述多糖提取物的DPPH自由基清除活性的IC50值为0.302mg/mL，ABTS自由基清除活性的IC50值为0.815mg/mL。所述提取方法包括：(1)将甜茶预处理得到甜茶粉；(2)去除甜茶粉中的脂溶性化合物；(3)以DES低共熔溶剂为提取溶剂进行微波提取；(4)提取物离心取上清得到甜茶粗多糖提取物。本发明采用低共熔溶剂‑微波辅助提取方法从甜茶中提取多糖，有效提高溶剂对多糖的溶解能力，实现高效提取多糖且所制备的甜茶多糖具有高抗氧化活性，具有提取效率高、提取成本低，提取工艺简单、稳定可靠且提取的甜茶多糖具有高抗氧化活性等系列优点。

Description

高抗氧化活性的甜茶多糖提取物及其提取方法
技术领域
本发明涉及从植物中提取的多糖提取物及其提取方法，尤其涉及从甜茶中提取的高抗氧化活性的多糖提取物以及提取方法，属于植物多糖的提取领域。
背景技术
木姜叶柯(学名：Lithocarpus litseifolius(Hance)Chun)是壳斗科，柯属乔木，分布于中国秦岭南坡以南各省区。2017年，木姜叶柯被批准为新食品原料。由于木姜叶柯嫩叶有甜味，嚼烂时为粘胶质，长江以南多数山区居民用其叶作茶叶代品，通称甜茶。甜茶在中国民间已有上千年的食用历史，是一种药食两用、兼具茶、糖、药三种功能的植物，其中以四川、湖南和云南资源最为丰富。关于甜茶的药用功能，据《中药志》记载及有关文献资料报导：“能防治高血压、治疗湿热痢疾、皮肤瘙痒、痈疽恶疮等症。并具有滋养肝肾和胃降逆、润肺止咳、解困醒酒等作用”。《本草纲目》记载:“气味甘、平”、“无毒、疗痔、止血及血痢、止渴、活血、利小便”。
多糖(Polysaccharides)是一种由10个以上的单糖通过糖苷键聚合而成的生物高分子化合物，通式为[C6(H2O)5]m，通常m远大于20。目前，植物多糖已受到越来越多科研工作者的关注，国际科学界甚至提出21世纪是多糖的世纪；大量的研究表明，植物多糖具有多种生物活性，包括抗氧化、降血脂、降血糖、抗炎、抗肿瘤、抗辐射、抗菌抗病毒、免疫调节、保护肝脏等保健作用。所以植物多糖早已被广泛运用到食品药品领域中，多糖的提取制备是其产品精深加工的关键。
低共熔溶剂(DES)是一种绿色且可回收的溶剂，由一定化学计量比的氢键受体(如季铵盐)和氢键供体(如酰胺、羧酸和多元醇等化合物)组合而成的两组分或三组分低共熔混合物。DES对生物活性成分的溶解能力比水高，因为它们可以接受外部电子或质子形成氢键，能更好的提取植物细胞中的多糖。此外，微波提取可以通过偶极子旋转和离子传导两种方式里外同时加热，也能使溶剂更好地渗透到植物细胞中，达到高效的提取效果。
氧化应激通常是由活性氧(ROS)引起的。ROS水平升高会导致自由基的产生，这可能会对脱氧核糖核酸(DNA)、蛋白质和脂质产生有害影响。同时，自由基引起的氧化应激是导致多种疾病的重要因素之一，例如癌症、神经性疾病、炎症、心血管疾病和衰老。大量的研究表明，多糖可以通过清除自由基来以免受ROS诱导引起的氧化损伤。
现有的从甜茶中提取多糖的方法均不同程度的存在抗氧化活性不理想、产率低等缺陷。因此，提供一种高效、绿色的制备高抗氧化活性甜茶多糖的方法成为甜茶多糖产业化发展亟待解决的首要问题。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种高氧化活性的甜茶多糖提取物；
本发明的目的之二是提供从甜茶中提取高氧化活性多糖的提取方法为实现上述目的，本发明所采取的技术方案包括：
本发明首先提供了一种高氧化活性的甜茶多糖提取物，其DPPH自由基清除活性的IC50值为0.302mg/mL，ABTS自由基清除活性的IC50值为0.815mg/mL。
本发明提供的甜茶多糖提取物的抗氧化活性显著高于采用现有的采用水提法提取的甜茶多糖提取物的抗氧化活性。
本发明的另一方面是提供了一种从甜茶中高效提取具有高抗氧化活性的多糖的方法，包括以下步骤：
(1)将甜茶预处理得到甜茶粉；(2)去除甜茶粉中的脂溶性化合物；(3)以DES低共熔溶剂为提取溶剂，将去除脂溶性化合物的甜茶进行微波提取；(4)提取物离心取上清，得到甜茶粗多糖提取物。
作为本发明一种优选的具体实施方式，步骤(1)中所述甜茶的预处理得到甜茶粉的方法包括：将甜茶依次进行干燥、粉碎和过筛，即得；其中，所述的过筛优选为过60目筛。
作为本发明一种优选的具体实施方式，步骤(2)中去除甜茶粉中的脂溶性化合物的方法包括：将甜茶粉与乙醇混均后进行超声处理；将超声处理后的产物离心，取沉淀，即得。为了实现更好的去除脂溶性化合物的效果，优选将所得的沉淀与乙醇混均后再次进行超声处理以及将超声处理后的产物离心，取沉淀；其中，所述的乙醇可以为20-95％乙醇；按照g：mL计，甜茶粉与乙醇的比例优选为1：(5-30)；所述的超声处理的条件优选为：超声功率为500-800W，超声处理的时间为10-60min；所述的乙醇优选为80％乙醇；按照g：mL计，甜茶粉与乙醇的比例优选为1：10；所述的超声处理的条件优选为：超声功率为640W，超声处理的时间为30min。
本发明中所述的“DES低共熔溶剂”是由氢键受体(如季铵盐)和氢键供体(如酰胺、羧酸和多元醇等化合物)组合而成的两组分或三组分低共熔混合物；作为本发明一种优选的具体实施方式，所述的DES低共熔溶剂由氯化胆碱和乙二醇与超纯水组成；其中，按照体积比计，氯化胆碱和乙二醇的体积之和与超纯水的比例优选为(6-9)：(4-1)，更优选的，氯化胆碱和乙二醇的体积之和与超纯水的比例优选为7：3；按照摩尔比计，氯化胆碱和乙二醇的比例优选为(1-3)：(2-5)，更优选的，氯化胆碱和乙二醇的比例为1:3。
作为本发明一种优选的具体实施方式，步骤(3)中提取溶剂所加入的量依据甜茶粉的用量来计算，按照g：mL计，甜茶粉与提取溶剂的比例优选为1：(20-60)；进一步优选的，甜茶粉与提取溶剂的比例可以为1：(20-40)，更优选的，甜茶粉与提取溶剂的比例为1：(30-35)。
作为本发明一种优选的具体实施方式，步骤(3)所述的微波提取的时间可以为4-12min，优选为8-12min，最优选为10-12min；所述微波提取的功率可以为320-640W；优选为560-640W。
作为本发明一种优选的具体实施方式，还进一步包括：将得到的甜茶粗多糖提取物进行如下的纯化处理得到甜茶多糖提取物纯品：(a)将甜茶粗多糖提取物浓缩；(b)去除浓缩产物中的淀粉和蛋白；(c)加入乙醇进行醇沉，所得沉淀用水复溶后进行透析处理、干燥，得到甜茶多糖提取物纯品。
其中，步骤(b)中所述的去除浓缩产物中的淀粉和蛋白的方法包括：加入耐高温α-淀粉酶进行水解反应去除甜茶粗多糖提取物中的淀粉，将淀粉酶灭活后，离心去除变性的酶及其它的蛋白；步骤(c)中所述的醇沉包括向甜茶粗多糖提取物中加入95％乙醇进行醇沉；所述的透析处理包括用分子量截留量3.5kDa的透析袋进行透析处理。
本发明以成品甜茶研磨制得的茶粉为原料，使并以称重法计算甜茶多糖的提取率为参考指标，通过单因素多水平实验结合Box-Behnken中心组合设计-响应面法优化了低共熔溶剂-微波辅助提取甜茶多糖的最佳提取工艺条件，主要包括提取时间、微波功率、DES低共熔溶剂与水的比例、低共熔溶剂低共熔溶剂与原料甜茶粉的比例，最终确定提取时间为11.1min、微波功率为576W、DES低共熔溶剂与水的比例为7.9：2.1(v：v)、DES低共熔溶剂与原料甜茶粉的比例为30.6：1(mL：g)为加压提取的最佳工艺参数，在此条件下进行三次验证试验，测得甜茶多糖提取率为4.22±0.15％。
根据以上响应面分析实验结果，本发明进一步采用低共熔溶剂-微波辅助提取法制备甜茶多糖，与传统水提法制备的甜茶多糖进行比较，以2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)或维生素C(Vc)作为阳性对照，考察其抗氧化活性。结果表明，传统水提法制备的甜茶多糖的DPPH自由基清除活性明显低于本发明的低共熔溶剂辅助微波提取法制备的甜茶多糖。阳性对照BHT、本发明的低共熔溶剂辅助微波提取法和传统水提法制备的甜茶多糖的DPPH自由基清除活性的IC50分别为0.268mg/mL、0.302mg/mL和5.382mg/mL。结果表明本发明低共熔溶剂辅助微波提取法制备的甜茶多糖具有远高于传统水提法制备的甜茶多糖的DPPH自由基清除活性，且与阳性对照BHT活性相似；本发明的低共熔溶剂辅助微波提取法制备的甜茶多糖的ABTS自由基清除活性低于阳性对照Vc，但远高于传统水提法制备的甜茶多糖；本发明提供的低共熔溶剂辅助微波提取法制备的甜茶多糖的总还原力低于阳性对照Vc，但远高于传统水提法制备的甜茶多糖。在本发明最佳提取方案下制备的甜茶多糖具有显著的抗氧化活性，具有作为高抗氧化活性的天然产物应用于食品、药品工业领域的潜力。
与现有技术相比，本发明主要具有如下的有益效果：
(1)本发明采用低共熔溶剂-微波辅助提取方法从甜茶中提取多糖，该方法能够有效提高溶剂对多糖的溶解能力，实现高效提取多糖的目的，且制备的甜茶多糖具有高抗氧化活性的特点，其抗氧化活性显著高于现有技术中采用水提法提取的甜茶多糖的抗氧化活性；本发明方法在提取产率上也显著高于现有技术的水提法提取的甜茶多糖的产率。
(2)本发明方法具有绿色高效，提取效率高，提取成本低，提取时间短，提取工艺简单且稳定可靠，提取能耗低，且提取的甜茶多糖具有高抗氧化活性的优点，本发明方法的推广和应用将对甜茶多糖产业化发展起到重要的推动作用。
(3)本发明所提供的低共熔溶剂-微波辅助提取甜茶多糖工艺条件的响应面优化方法将为低共熔溶剂-微波辅助提取在甜茶多糖实际生产中的应用提供可靠的参考，为甜茶多糖作为功能性食品的研发提供技术支撑。
附图说明
图1为提取时间对甜茶多糖提取率的影响图。
图2为微波功率对甜茶多糖提取率的影响图。
图3为DES与水的比例对甜茶多糖提取率的影响图。
图4为低共熔溶剂与甜茶粉的比例对甜茶多糖提取率的影响图。
图5为提取时间和微波功率对甜茶多糖提取率的响应面三维图和等高线图。
图6为提取时间和DES与水的比例对甜茶多糖提取率的响应面三维图和等高线图。
图7为提取时间和低共熔溶剂与甜茶粉的比例对甜茶多糖提取率的响应面三维图和等高线图。
图8为微波功率和DES与水的比例对甜茶多糖提取率的响应面三维图和等高线图。
图9为微波功率和低共熔溶剂与甜茶粉的比例对甜茶多糖提取率的响应面三维图和等高线图。
图10为DES与水的比例和低共熔溶剂与甜茶粉的比例对甜茶多糖提取率的响应面三维图和等高线图。
图11为低共熔溶剂辅助微波提取法和传统水提法制备的甜茶多糖对DPPH自由基的清除能力。
图12为低共熔溶剂辅助微波提取法和传统水提法制备的甜茶多糖对ABTS自由基的清除能力。
图13为低共熔溶剂辅助微波提取法和传统水提法制备的甜茶多糖的总还原力。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
实施例1甜茶多糖的提取
(1)将成品甜茶在45℃的恒温热风烘箱中干燥至恒重，再用Super Mill-1500打粉机进行研磨，随后过60目筛，甜茶粉装入密封袋中，置于-20℃保存备用。
(2)准确称量2.0g甜茶粉，加入到50mL离心管中，并涡旋混匀，加入20mL 80％乙醇(1：10，w/v)，使用PL-S80T超声波清洗机在640W的功率下超声30min。样品配平后通过X3R型高速冷冻离心机在4000g下离心10min，弃去上清液后的沉淀再加入20mL 80％乙醇，使用PL-S80T超声波清洗机在80％的功率下超声30min，样品配平后通过X3R型高速冷冻离心机在4000g下离心10min，弃去上清液保留沉淀。
(3)低共熔溶剂的配制：准确称量100g氯化胆碱和121.29mL乙二醇(摩尔比为1：3)，混匀，在80℃水浴锅搅拌至澄清透明，冷却至室温后，按照氯化胆碱-乙二醇：超纯水＝7：3(v：v)加入超纯水，混匀即为DES低共熔溶剂。
(4)准确量取80mL步骤(3)得到的DES低共熔溶剂(即DES与原料甜茶的比例为40mL/g)，将步骤(2)得到的去除脂溶性化合物的沉淀从离心管中用DES低共熔溶剂洗涤到250mL烧杯中，摇匀；随后，使用实验室微波炉(MKJ-J1-3，山东青岛麦克威微波应用技术有限公司)对甜茶多糖进行辅助提取，设置提取时间为8min，微波功率为480W；提取结束后将烧杯中的样品分装在4个50mL的离心管中，配平，4000g下离心15min，离心后收集上层清液(木姜叶柯粗多糖水提物)，沉淀按上述步骤再提取一次。第二次提取结束的沉淀再加入20mL超纯水，摇匀后于4000g下离心15min，收集上清液。最后，混合两次提取液和洗涤沉淀的清液，使用旋转蒸发仪在80℃旋蒸，浓缩至原体积的1/3。
(5)将上述木姜叶柯粗多糖水提物中加入7.5mg高峰α-淀粉酶(高峰α-淀粉酶即耐高温α-淀粉酶，40000U/g，北京索莱宝科技有限公司)(5U/mL)在80℃的水浴锅中反应4h，以去除木姜叶柯粗多糖水提物中的淀粉；反应结束后，将水浴锅温度升至95℃，水浴30min将高峰α-淀粉酶灭活，然后取出样品冷却至室温，通过4000g离心15min去除变性的酶及样品中少量的蛋白。
(6)将步骤(5)获得的提取液用三倍体积的95％乙醇醇沉，醇沉步骤在恒温加热式磁力搅拌器上完成，注意逐滴加入95％乙醇，完成该步骤后将样品置于4℃冰箱沉淀过夜；次日，通过4000g离心15min获得甜茶多糖沉淀；接着，沉淀加入30mL 80％的乙醇，摇匀，通过4000g离心15min洗涤沉淀；最后，用60℃超纯水复溶沉淀(若出现无法溶解的沉淀，则需要通过4000g离心15min去除不溶物)。
(7)将复溶后的甜茶多糖提取物采用透析袋(分子量截留量3.5kDa)作进一步快速纯化，具体方法为：将甜茶多糖提取物分装在透析袋中，将透析袋放入透析液(超纯水)中透析，每2h更换一次超纯水，换水前检测透析液的电导率，直至透析前后电导率不再改变。根据实际操作情况得出，大约透析3天可完全透析掉样品中的淀粉水解产物及其他小分子物质；最后，收集透析袋中的样品通过冷冻干燥获得纯化后的甜茶多糖，冷冻干燥时间为48h，干燥结束后立即收集样品用分析天平称重。提取率计算公式如下：
提取率＝A/B×100％
其中，A为甜茶粉重量(2.0g)；B为甜茶多糖的重量。
经过计算，本实施例的多糖提取率为2.59％，多糖提取产量为51.8mg。
实施例2甜茶多糖的提取
与实施例1的区别在于：在步骤(3)中氯化胆碱-乙二醇：超纯水＝8：2(v：v)，步骤(4)中提取时间为10min，微波功率为560W；其余均与实施例1相同。
经过计算，本实施例的多糖提取率为3.73％，多糖的的提取产量74.6mg。
实施例3甜茶多糖的提取
与实施例1的区别在于：在步骤(4)中提取时间为10min，微波功率为640W；其余均与实施例1相同。
经过计算，本实施例的提取率3.44％，多糖的提取产量65.8mg。
实施例4甜茶多糖的提取
与实施例1的区别在于：步骤(4)中提取时间为10min，微波功率为560W；其余均与实施例1相同。
经过计算，本实施例的多糖提取率3.92％，多糖的提取产量78.4mg。
实施例5甜茶多糖的提取
与实施例1的区别在于在步骤(3)中按照氯化胆碱-乙二醇：超纯水＝9：1(v：v)，步骤(4)中提取时间为10min，微波功率为560W；其余均与实施例1相同。
经过计算，本实施例的多糖提取率3.65％，多糖的提取产量73.0mg。
实施例6甜茶多糖的提取
与实施例1的区别在于：在步骤(3)中按照氯化胆碱-乙二醇：超纯水＝8：2(v：v)，步骤(4)中提取时间为10min，微波功率为560W，DES与原料甜茶的比例为20(mL/g)；其余均与实施例1相同。
经过计算，本实施例的多糖提取率为4.08％，多糖的提取产量为81.6mg。
实施例7甜茶多糖的提取
与实施例1的区别在于：在步骤(3)中按照氯化胆碱-乙二醇：超纯水＝8：2(v：v)，步骤(4)中提取时间为10min，微波功率为560W，DES与原料甜茶的比例为50(mL/g)；其余均与实施例1相同。
经过计算，本实施例的多糖提取率为3.73％，多糖的提取产量为75.6mg。
对比实施例甜茶多糖的传统水提法
与实施例1的区别在于：使用超纯水代替低共熔溶剂。准确量取80mL超纯水(超纯水/原料＝40，mL/g)，将步骤(2)得到的去除脂溶性化合物的沉淀从离心管中用超纯水洗涤到250mL烧杯中，摇匀；随后，使用恒温水浴锅(HH-4，邦西仪器科技有限公司)对甜茶多糖进行水浴加热提取，设置提取时间为2h，提取温度为95℃；提取次数同样为两次；其余均与实施例1相同。
经过计算，本对比实施例的多糖提取率为3.65％，多糖的提取产量为73.0mg。
试验例1甜茶多糖的低共熔溶剂辅助微波提取工艺条件的优化试验
1.单因素多水平实验
根据实施例1的制备甜茶多糖的低共熔溶剂辅助微波提取方法，筛选出4个影响甜茶多糖提取率的因素，即：提取时间、微波功率、DES与水的比例、低共熔溶剂与原料甜茶粉的比例；以甜茶多糖提取率为参考指标，进行单因素多水平实验。
1.1提取时间的单因素实验
选取5个水平进行提取时间的单因素实验：固定微波功率为480W、DES与水的比例为7：3(v：v)、低共熔溶剂与原料甜茶粉的比例为40(mL/g)，测量在提取时间(min)分别为4min、6min、8min、10min及12min时甜茶多糖的提取率。
提取时间对甜茶多糖提取率的影响如图1所示，从试验结果可以看出，当提取时间为4min时，甜茶多糖的提取率仅为2.24％左右，当提取时间为10min时，甜茶多糖的提取率达到了2.74％左右，随着提取时间的增加，甜茶多糖的提取率又呈现明显降低趋势，故最佳提取时间为10min。
1.2微波功率的单因素实验
选取5个水平进行提取时间的单因素实验：固定提取时间为10min、DES与水的比例为例为7：3(v：v)、低共熔溶剂与原料甜茶粉的比例为40(mL/g)，测量在微波功率分别为320、400、480、560及640W时甜茶多糖的提取率。
微波功率对甜茶多糖提取率的影响如图2所示，根据该结果可以看出，随着微波功率的增加，甜茶多糖的提取率呈上升的趋势，当微波功率为560W时，甜茶多糖的提取率达到最大值。随后，甜茶多糖提取率开始降低，故单因素试验确定的最佳微波功率为560W。
1.3DES与水的比例的单因素实验
选取5个水平进行提取压力的单因素实验：固定提取时间为10min、微波功率为560W、低共熔溶剂与原料甜茶粉的比例为40(mL/g)，测量在DES与水的比例分别为5：5、6：4、7：3、8：2及9：1时甜茶多糖的提取率。
DES与水的比例对甜茶多糖提取率的影响的试验结果为图3所示，根据图3可以看出，甜茶多糖的提取率随DES与水的比例的增加呈现先增加后降低的趋势，DES与水的比例为8：2时甜茶多糖的提取率最高。故单因素试验确定的最佳DES与水的比例为8：2。
1.4低共熔溶剂与原料甜茶粉的比例的单因素实验
选取5个水平进行提取压力的单因素实验：固定提取时间为10min、微波功率为560W、DES与水的比例为8：2，测量在低共熔溶剂与原料甜茶粉的比例分别为20、30、40、50及60(mL/g)时甜茶多糖的提取率。
测量在低共熔溶剂与原料甜茶粉的比例对甜茶多糖提取率的影响的试验结果为图4所示，根据图4可以看出，甜茶多糖的提取率随低共熔溶剂与原料甜茶粉的比例的增加呈现先增加后降低的趋势，测量在低共熔溶剂与原料甜茶粉的比例为30(mL/g)时甜茶多糖的提取率最高。故单因素试验确定的最佳低共熔溶剂与原料甜茶粉的比例为30(mL/g)。
2.响应面分析试验
根据上述单因素多水平实验结果，以提取时间(X1)、微波功率(X2)、DES与水的比例(X3)、低共熔溶剂与原料甜茶粉的比例(X4)为自变量，以甜茶多糖提取率为响应值，采用Box-Behnken中心组合设计法设计四因素三水平的响应面分析试验，响应面试验设计因素与水平如表1所示。
表1响应面试验设计因素与水平
Figure BDA0003097308050000121
根据Box-Behnke试验设计原理，利用响应面设计四因素三水平进一步优化甜茶多糖提取的反应条件，实施29个试验点，其中24个分析因子，5个中心试验以估计误差。表2列出了响应面实验矩阵和实验数据。
表2响应面实验设计与结果
Figure BDA0003097308050000122
Figure BDA0003097308050000131
采用Design Expert 8.0.6对试验结果进行回归拟合分析生成二阶多项式方程，得到具有编码因子的最终方程如下：
Y＝4.16+0.16X1+0.12X2-0.097X3-0.088X4+0.12X1X2-0.032X1X3+0.30X1X4+0.057X2X3-0.27X2 X4-0.11X3X4-0.19X1 2-0.38X2 2-0.43X3 2-0.32X4 2
其中，Y是甜茶多糖的提取率；X1、X2、X3和X4分别是提取时间(min)、微波功率(W)、DES与水的比例(v：v)、低共熔溶剂与原料甜茶粉的比例(mL/g)。
表3回归方程方差分析
Figure BDA0003097308050000132
Figure BDA0003097308050000141
注：R2＝0.9140，R2 adj＝0.8280，C.V.＝4.25％，adeq.precision＝9.795；
aA,时间(min)；B,功率(W)；C,DES:水(v:v)；D,DES/原料(mL/g)；
b*显著差异(p<0.05)，**极显著差异(p<0.01)。
表3为回归模型的方差分析表，二次回归模型具有较高的F值(10.63)和较低的P值(P<0.0001)表明该模型的适用性非常显著。模型的决定系数R2＝0.9140，校正决定系数R2 adj＝0.8280，证明该模型与实际实验过程具有较高的拟合度。因此，该回归模型具有可行性，可以利用该模型对甜茶多糖提取率与单因素水平变化的关系以及数据波动进行预测。
在本实验中，当P<0.05时，表明该因素显著，当P<0.01时，表明该因素极显著。失拟项P值(0.1106，P>0.05)和F值(3.68)表明残差主要有随机误差组成，对优化结果的影响可以忽略不计。此外，C.V.(方程中Y的变异系数)值代表实验的置信度，C.V.值越大，表示实验可靠性低，本试验中C.V.＝4.25％，表明实验操作可信，具有足够的准确性和普遍适用性。此外，参数优化系数表明线性系数(X1，X2，X3)，二次项(X1 2，X2 2，X3 2，X4 2)和相互作用系数(X1X4，X2X4)对甜茶多糖的提取率有很大影响(P<0.05)。
图5、6、7、8、9、10显示了响应面预测结果的三维响应面图(3D)和等高线图。通常，带有椭圆形轮廓图的响应面表明相应变量之间的相互作用是显著的，而圆形轮廓图表明相应变量之间的相互作用是不显著的。由图5-10可知，提取时间(X1)和低共熔溶剂与原料甜茶粉的比例(X4)、微波功率(X2)和低共熔溶剂与原料甜茶粉的比例(X4)之间的相互作用是显著的。
根据上述步骤构建的回归模型，应用统计学软件Design-Expert 8.0.6对甜茶多糖的低共熔溶剂辅助微波提取工艺进一步优化，结果显示，在以下最佳反应条件下可以得到最大提取率的甜茶多糖：提取时间为11.12min、微波功率为577.20W、DES与水的比例为7.87：2.13(v：v)、低共熔溶剂与原料甜茶粉的比例为30.59(mL/g)。甜茶多糖提取率的预测值为4.22％。考虑实际操作，将以上条件调整为提取时间为11.1min、微波功率为576W、DES与水的比例为7.9：2.1(v：v)、低共熔溶剂与原料甜茶粉的比例为30.6(mL/g)，在提取时间为11.1min、微波功率为576W、DES与水的比例为7.9：2.1(v：v)、低共熔溶剂与原料甜茶粉的比例为30.6(mL/g)的条件下进行三次验证试验，测得甜茶多糖提取率为4.22±0.15％，与理论预测值相差不大，说明Box-Behnken中心组合设计-响应面法优化后的低共熔溶剂辅助微波提取甜茶多糖的工艺可行，可推广于产业应用。
3.抗氧化活性试验
根据以上响应面分析实验结果，采用低共熔溶剂-微波辅助提取法制备甜茶多糖，与传统水提法制备的甜茶多糖进行比较，以2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)或维生素C(Vc)作为阳性对照，考察其抗氧化活性。
图11、12和13显示了低共熔溶剂辅助微波提取法和传统水提法制备的甜茶多糖的抗氧化活性。如图11所示，阳性对照、低共熔溶剂辅助微波提取法和传统水提法制备的甜茶多糖表现出显著的DPPH自由基清除活性，并且和浓度呈正相关。结果表明，传统水提法制备的甜茶多糖的DPPH自由基清除活性明显低于本发明的低共熔溶剂辅助微波提取法制备的甜茶多糖。阳性对照BHT、本发明的低共熔溶剂辅助微波提取法和传统水提法制备的甜茶多糖的DPPH自由基清除活性的IC50分别为0.268mg/mL、0.302mg/mL和5.382mg/mL。结果表明本发明低共熔溶剂辅助微波提取法制备的甜茶多糖具有远高于传统水提法制备的甜茶多糖的DPPH自由基清除活性，且与阳性对照BHT活性相似。
如图12所示，阳性对照、本发明的低共熔溶剂辅助微波提取法和传统水提法制备的甜茶多糖表现出显著的ABTS自由基清除活性，同样与浓度呈正相关。传统水提法制备的甜茶多糖的ABTS自由基清除活性明显低于低共熔溶剂辅助微波提取法制备的甜茶多糖。阳性对照Vc、本发明的低共熔溶剂辅助微波提取法和传统水提法制备的甜茶多糖的ABTS自由基清除活性的IC50分别为0.036mg/mL、0.815mg/mL和10.087mg/mL。结果表明本发明的低共熔溶剂辅助微波提取法制备的甜茶多糖的ABTS自由基清除活性低于阳性对照Vc，但远高于传统水提法制备的甜茶多糖。
如图13所示，阳性对照、本发明的低共熔溶剂辅助微波提取法和传统水提法制备的甜茶多糖表现出显著的总还原力，同样与浓度呈正相关。传统水提法制备的甜茶多糖的总还原力明显低于本发明的低共熔溶剂辅助微波提取法制备的甜茶多糖。结果表明本发明提供的低共熔溶剂辅助微波提取法制备的甜茶多糖的总还原力低于阳性对照Vc，但远高于传统水提法制备的甜茶多糖。在本发明最佳提取方案下制备的甜茶多糖具有显著的抗氧化活性，具有作为高抗氧化活性的天然产物应用于食品、药品工业领域的潜力。

Claims (8)

1.从甜茶（Lithocarpus litseifolius (Hance) Chun）中提取的多糖提取物，其特征在于，所述多糖提取物的DPPH自由基清除活性的IC50值为0.302 mg/mL，所述多糖提取物的ABTS自由基清除活性的IC50值为0.815 mg/mL；其提取方法包括以下步骤：
（1）将甜茶进行预处理得到甜茶粉；
（2）去除甜茶粉中的脂溶性化合物；
（3）以DES低共熔溶剂为提取溶剂，将去除脂溶性化合物的甜茶粉进行微波提取；所述的DES低共熔溶剂由氯化胆碱、乙二醇与超纯水组成；其中，按照体积比计，氯化胆碱和乙二醇的体积之和与超纯水的比例为7.9：2.1；按照摩尔比计，氯化胆碱和乙二醇的比例为（1-3）：（2-5）；所述微波提取时间为11.1 min、微波提取的功率为576 W；按照mL：g 计，DES低共熔溶剂与甜茶粉的比例为30.6：1；
（4）提取物离心取上清得到甜茶粗多糖提取物。
2.按照权利要求1所述的多糖提取物，其特征在于，步骤（1）中所述甜茶的预处理得到甜茶粉的方法包括：将甜茶依次进行干燥、粉碎和过筛。
3.按照权利要求1所述的多糖提取物，其特征在于，步骤（2）中去除甜茶粉中的脂溶性化合物的方法包括：将甜茶粉与乙醇混均后进行超声处理；将超声处理后的产物离心，取沉淀，即得。
4.按照权利要求3所述的多糖提取物，其特征在于，还包括：所得的沉淀与乙醇混均后再次进行超声处理并将超声处理后的产物离心，取沉淀；其中，所述的乙醇为20-95%乙醇；按照g：mL计，甜茶粉与乙醇的比例为1：（5-30）；所述的超声处理的条件为：超声功率为500-800 W，超声处理的时间为10-60 min。
5.按照权利要求4所述的多糖提取物，其特征在于，所述的乙醇为80%乙醇；甜茶粉与乙醇的比例为1：10；所述的超声处理的条件为：超声功率为640 W，超声处理的时间为30 min。
6.按照权利要求1所述的多糖提取物，其特征在于，氯化胆碱和乙二醇的摩尔比例为1:3。
7.按照权利要求1所述的多糖提取物，其特征在于，还包括：将得到的甜茶粗多糖提取物进行下述的纯化处理得到甜茶多糖提取物纯品：（a）将甜茶粗多糖提取物浓缩；（b）去除浓缩产物中的淀粉和蛋白；（c）加入乙醇进行醇沉；所得沉淀用水复溶后进行透析处理、干燥，得到甜茶多糖提取物纯品。
8.按照权利要求7所述的多糖提取物，其特征在于，步骤（b）中所述的去除浓缩产物中的淀粉和蛋白的方法包括：加入淀粉酶进行水解反应去除甜茶粗多糖提取物中的淀粉，将淀粉酶灭活后，离心去除变性的酶及其它的蛋白；步骤（c）中所述的醇沉包括向甜茶粗多糖提取物中加入95％乙醇进行醇沉；所述的透析处理包括用分子量截留量3.5 kDa的透析袋进行透析处理。
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