CN109453364A - 一种双重响应性纳米颗粒及其在肿瘤抑制中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于肿瘤抑制药剂研发技术领域，具体涉及一种双重响应性纳米颗粒及其在肿瘤抑制中的应用专利申请事宜。该纳米颗粒名为P‑T4，属于一种两亲性多肽结构，氨基酸部分序列如SEQ ID NO.1所示，具体结构式表示为PEGx‑K‑DEAP‑AAN‑NLLMAAS。本申请以肿瘤微环境中表达Tie2分子的Tie2+巨噬细胞和内皮细胞作为靶向细胞，通过对现有短肽修饰改造，将其用于延缓化疗后肿瘤的复发，从而提高相关肿瘤的化疗效果。本申请所设计的双重响应性纳米颗粒P‑T4表现出较好的应用前景，减少了相关化疗治疗后血管重建发生，进而延缓了化疗后复发和肿瘤细胞转移的几率，具有较好的实用价值。

Description

一种双重响应性纳米颗粒及其在肿瘤抑制中的应用
技术领域
本发明属于肿瘤抑制药剂研发技术领域，具体涉及一种双重响应性纳米颗粒及其在肿瘤抑制中的应用专利申请事宜。
背景技术
复发是肿瘤化疗中治疗和预防的难点，也是造成死亡的主要原因之一。常规化疗药在治疗初期可以有效的抑制肿瘤的生长，但是大多数都是以复发而告终，研究表明血管重建在化疗后复发中占有相当重要的位置。
已有研究表明：Tie2分子是酪氨酸激酶受体家族中的蛋白质成员之一，在血管内皮细胞上广泛表达。Tie2、Tie1作为酪氨酸激酶受体介导血管生成素配体1/2（Ang2 /Ang1）的各种功能。Tie2-Ang2信号通路在肿瘤血管生成中发挥重要作用，并参与内皮细胞的增殖，迁移和稳定。除了内皮细胞上面的广泛表达外，Tie2分子还表达在巨噬细胞上。已有证据表明Tie2高表达的巨噬细胞（Tie2 positive macrophage，TAM）可以促进肿瘤血管生成。同时已有研究发现特异性敲除巨噬细胞上的Tie2受体可以明显的抑制化疗后复发的血管重建，并且影响了巨噬细胞在肿瘤组织中的活力，因此以Tie2分子作为靶向目标设计治疗药剂，对于相关肿瘤化疗后复发的抑制和预防应当是具有较好应用效果的。
现有技术中，靶向Tie2受体是有较多技术方案的，尤其是部分短肽表现出一定应用效果，但短肽在生物体内的不稳定性及较短的半衰期使得其难以直接应用。现有技术中，为增加小分子肽的稳定性和生物利用度，可以对这些小分子肽进行一定改造，常规改造方式包括环化或PEG化。但是这种改造应当是以小分子肽功能不受影响作为前提的，因此现有改造方式是否适合短肽T4、以及如何对短肽T4进行改造尚需进一步探讨和验证。
发明内容
本申请以表达Tie2分子的Tie2+巨噬细胞和内皮细胞作为靶向细胞，通过对短肽T4纳米化改造提供一种双重响应性纳米颗粒P-T4，通过增加其生物体内的稳定性和生物利用度，抑制肿瘤血管新生和肿瘤的化疗后复发，即发挥抑制肿瘤化疗后复发的作用，从而为相关疾病的治疗和改善奠定一定技术基础。
本申请所提供的技术方案详述如下。
一种双重响应性纳米颗粒，将其命名为P-T4，该纳米颗粒主要是通过对疏水性短肽T4(NLLMAAS)的纳米化修饰改造获得，改造后P-T4属于一种两亲性多肽结构，氨基酸部分序列如SEQ ID NO.1所示，具体结构式表示为：
PEGx-Lys(DEAP)-Ala-Ala-Asn-Asn-Leu-Leu-Met-Ala-Ala-Ser，或者表示为：PEGx-K（DEAP）-AAN- NLLMAAS；
所述x=800~2000，需要解释的是，根据分子量计算及生物体内纳米结构形态设计需要，在x=1000（即PEG1000）时，纳米结构更为合适；
纳米颗粒改造原理为：由豆荚蛋白酶剪切的底物Ala-Ala-Asn和微酸响应的异硫氰酸3-二乙氨基丙酯（DEAP）修饰的赖氨酸（Lys-DEAP）共轭链接在短肽T4上构成疏水段，由PEG1000修饰改造后作为亲水端，从而具备双亲性和双重响应性，而改造后在不影响短肽活性基础上可明显延长短肽的半衰期。
所述双重响应性纳米颗粒P-T4的具体制备方法，包括如下步骤：
（一）采用固相多肽合成法制备PEGx-K-AAN-NLLMAAS，具体参考如下步骤：
（1）树脂溶涨：称取2-Chlorotrityl Chloride Resin树脂，放入反应管中，加DCM，振荡混合均匀；
（2）接第一个氨基酸：抽滤掉溶剂，加入Fmoc-Ser(tBu)-OH氨基酸、DIEA、DM，振荡反应，充分反应后清洗；
（3）脱保护：用含有哌啶的DMF溶液进行脱保护；
（4）检测和清洗：对步骤（3）中脱保护后树脂进行茚三酮检测，以确定反应程度，并进行清洗；
（5）缩合：在步骤（4）中清洗后树脂中加入氨基酸（Fmoc-Ala-OH）、HBTU、DIEA充分反应；反应结束后清洗；
重复步骤（2）~步骤（5），依次连接各氨基酸和mPEGx-COOH，制备获得PEGx-K-AAN-NLLMAAS；
（二）利用DEAP修饰步骤（一）中所合成制备的PEGx-K-AAN-NLLMAAS，具体步骤参考如下：
（1）在步骤（一）制备所得树脂中加入含有水合肼的DMF，去除赖氨酸保护基dde，然后加入3-(二乙基氨基)丙基异硫氰酸酯（DEAP）、HBTU、DIEA，充分反应；
（2）对步骤（1）中反应结束后物料进行清洗（具体例如采用甲醇进行清洗），并从树脂上切割DEAP修饰改造后多肽，洗涤、干燥后即为：PEGx-K(DEAP)-AAN-NLLMAAS；
（三）对步骤（二）PEGx-K(DEAP)-AAN-NLLMAAS进行纳米化改造，制备双重响应性纳米颗粒P-T4，具体步骤为：
将步骤（二）制备所得PEGx-K(DEAP)-AAN-NLLMAAS溶于DMSO（二甲基亚砜）中，超声（功率具体例如为100w）处理条件下，将其逐滴滴加PBS中，制备形成纳米粒溶液，即为纳米化改造后的P-T4，即可进一步用于抑制肿瘤的化疗后复发；
具体纳米化改造时，具体物料用量为：
PEGx-K(DEAP)-AAN-NLLMAAS用量为1mg，DMSO用量为10μL，PBS具体为pH =7.4，具体用量为1mL。
所述双重响应性纳米颗粒P-T4在制备肿瘤抑制药剂中的应用，主要用于抑制肿瘤化疗治疗后的肿瘤复发，所述肿瘤具体例如为乳腺癌肿瘤；
所述化疗，具体例如为阿霉素（DOX）或脂质体阿霉素化疗治疗后肿瘤；
具体应用时，其作用原理为（如图1中图a、图b所示）：所制备的纳米颗粒P-T4在血液循环中可保持纳米粒结构而不干扰正常血管上的Tie2受体信号，而在EPR效应（enhancedpermeability and retention effect，实体瘤的高通透性和滞留效应）下可被动聚集在肿瘤部位，在肿瘤部位特异性高表达豆荚蛋白酶和微酸作用下将功能性短肽T4释放出来，在肿瘤局部的微环境中通过靶向肿瘤微环境中Tie2+巨噬细胞，特异性干扰Tie2受体进而抑制肿瘤血管新生和肿瘤的复发。
现有研究表明，经过放化疗或抗血管治疗后，肿瘤微环境内存在着大量的Tie2+巨噬细胞，这些细胞与化疗后血管重建正相关。部分研究也表明，这些巨噬细胞也可作用在肿瘤细胞上，并促进肿瘤细胞的转移。
作为本申请改造目标T4肽（NLLMAAS）而言，其属于短肽，已有研究表明，该短肽可以特异性结合Tie2受体，抑制信号转导、血管新生，可被瘤内注射用于阻断ANG1/Tie2受体信号，但该短肽疏水性强，生物利用度低，并且无组织特异性，因此限制了其应用，而对该短肽进行不同形式的改造，以增强其生物利用度和应用效果是必须的。
本申请中，通过将疏水性短肽T4肽进行改造，使其具有双重响应特性，进一步通过将其纳米化处理，使其自组装成纳米粒来提高其在生物体内的稳定度和生物利用度。初步应用实验即分析表明：纳米化后P-T4可较好聚集于肿瘤微环境中，在肿瘤微酸性环境和高表达的豆荚蛋白酶作用下释放功能性短肽T4，从而局部干扰Tie2受体信号来抑制血管重建进而抑制肿瘤化疗后复发。这种设计及改造不仅实现了短肽T4在肿瘤局部微环境中的特异性释放，而且可有效减少对正常组织的损伤，并且明显提升了短肽T4的半衰期和生物利用度，从而有效的抑制肿瘤化疗后复发。
总之，本申请以肿瘤微环境中表达Tie2分子的Tie2+巨噬细胞和内皮细胞作为靶向细胞，通过对现有短肽修饰改造，将其用于延缓化疗后肿瘤的复发，从而提高相关肿瘤的化疗效果。进一步地，在部分特定癌症细胞的实验中，本申请所设计的双重响应性纳米颗粒P-T4表现出较好的应用前景，减少了相关化疗治疗后血管重建发生，进而延缓了化疗后复发和肿瘤细胞转移的几率，因此具有较好的实用价值，同时也为相关癌症侵袭与转移的生物学机理研究、以及相关治疗药剂研发提供了一定借鉴和参考。
附图说明
图1为本申请所提供的双重响应性纳米粒P-T4 通过干扰Tie2相关巨噬细胞介导的血管新生来抑制化疗后肿瘤复发的示意图（图a）和纳米粒P-T4的作用原理示意图（图b）；
图2为各种纳米粒的特征，其中：
a图为纳米粒P-T4以及对照组纳米粒P-L、P-N、P-K的高分辨透射电镜图，标尺200 nm；b图为各纳米粒的粒径分布图；
图3为纳米粒P-T4的酸和酶响应性测定结果，其中：
a、b、c图分别为纳米粒P-T4在pH 6.8、pH 6.8+豆荚蛋白酶、以及pH 7.4+豆荚蛋白酶环境下的电镜图，标尺200 nm；
d图为上述不同条件刺激下纳米粒P-T4的粒径分布图；
e图为纳米探针P-T4在pH 7.4 和6.8中的相对荧光强度值，彩色图像下蓝色线（黑白视图下的最上一条）为游离的荧光剂TRITC和淬灭剂BHQ-1的荧光值；
f图为纳米粒P-T4的酶响应性，P-T4被豆荚蛋白酶剪切后由基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）测定；
图4为对照肽纳米粒P-N的豆荚蛋白酶响应性，P-N被豆荚蛋白酶剪切后由基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）测定；
图5为在饥饿状态下纳米粒P-T4通过AKT信号通路降低Tie2相关巨噬细胞的活力相关实验结果，其中：
a图为细胞Tie2 positive RAW 在1%FBS血清饥饿下由不同形式的功能肽刺激48h后细胞活力测定结果，实验过程中同时加入刺激因子ANG2(200 ng/mL) 或者PBS作为对照；
b图为细胞Tie2 negative RAW实验结果（实验方式同Tie2 positive RAW实验操作）；
c图为细胞Tie2 positive RAW 或 Tie2 negative RAW 在血清饥饿的状态下由不同形式的功能肽作用12h后蛋白测定结果，实验过程中同时加入刺激因子ANG2(200 ng/mL)或者PBS作为对照，其中AKT 和 ERK 磷酸化程度由Western blotting测定；
d图为分析软件ImageJ分析的Western blot 的结果；
上述所有实验中的pH被调整至6.8 ，**p<0.01；
图6为纳米粒P-T4在体内的清除和体内分布评价结果，其中：
a图为纳米粒P-T4-cy5.5 在体内的清除率结果，BALB/c 小鼠静脉注射P-T4-cy5.5后，在不同时间点，血液被收集并由小动物活体成像来测定；
b图为纳米粒P-T4-cy5.5的体内清除曲线；
c图为纳米粒P-T4-cy5.5静脉注射荷瘤小鼠24h后测定心肝脾肺肾肿瘤组织的离体荧光成像分布情况，注射生理盐水组作为空白对照；
d图为游离荧光染料cy5.5和纳米粒P-T4-cy5.5在主要脏器和肿瘤内的荧光定量值；
e图为对照纳米粒静脉注射荷瘤小鼠24h后测定肿瘤组织的离体荧光成像分布情况；
f图为对照纳米粒在肿瘤内的荧光定量值；
图7为纳米粒 P-T4 减少化疗后的肿瘤组织内Tie2相关巨噬细胞的数量和血管的密度实验结果；其中：
a图为肿瘤组织被荧光免疫组化标记CD11b 和 Tie2 抗体后激光共聚焦拍摄图；
b 图为CD31 免疫荧光染色结果；
c图和d图为肿瘤组织内 Tie2CD11b 面积和 CD31面积的定量分析，标尺200μm；*p<0.05，**p<0.01；
图8为纳米粒P-T4抑制化疗后复发和转移实验结果，其中：
a图为化疗药和纳米粒P-T4给药方式示意图；
b图为4T1-移植瘤Balb/c小鼠的生长曲线；
c图为不同给药组的肿瘤体重；
d图为肿瘤组织的H&E 染色；
e图为肺组织H&E 染色；
f图为肿瘤组织坏死定量分析；
g图为肺转移的定量分析，标尺200μm；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请做进一步解释说明，在介绍具体实施例前，就下述实施例中部分物料及实验设备等情况简要介绍说明如下。
生物材料：
小鼠：BALB/c 小鼠，购买于北京维通利华实验动物技术有限公司；
细胞株：
正常巨噬细胞（Tie2 negative RAW）、鼠内皮细胞 SVEC4-10等，购买自American TypeCulture Collection(ATCC)；
高表达Tie2的巨噬细胞RAW264.7（Tie2 positive RAW），参考现有技术构建即可；
实验试剂：
Tie2抗体，R&D Systems；
CD11b抗体、anti-CD31 抗体，Abcam, Cambridge Science Park；
4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、异硫氰酸3-二乙氨基丙酯(DEAP)，Sigma-Aldrich；
phospho-AKT抗体、AKT抗体、phospho-ERK抗体、ERK抗体、β-actin抗体，CellSignaling Technology；
实验仪器：
激光共聚焦显微镜，德国卡尔蔡司公司；
小动物活体成像，铂金埃尔默；
基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS），德国布鲁克公司；
激光纳米散射仪，马尔文仪器公司；
透射电子显微镜，美国FEI公司。
实施例1
以PEG1000为例，本实施例具体提供一种双重响应性纳米颗粒P-T4，具体结构式表示为：
PEG1000-Lys(DEAP)-Ala-Ala-Asn-Asn-Leu-Leu-Met-Ala-Ala-Ser，或者表示为：PEG1000-K（DEAP）-AAN- NLLMAAS。具体改造过程简介如下。
（一）采用固相多肽合成法制备PEG1000-K-AAN-NLLMAAS，
具体参考如下步骤：
（1）树脂溶涨：
称取取代度为0.5mmol/g的0.8g 的2-Chlorotrityl Chloride Resin树脂，放入反应管中，加DCM(15ml/g)，振荡30min混合均匀；
（2）接第一个氨基酸：
通过抽滤掉溶剂，加入3倍摩尔过量的Fmoc-Ser(tBu)-OH氨基酸，再加入10倍摩尔过量的DIEA，最后加入少量DMF溶解，振荡1h；最后用DMF和DCM交替清洗6遍，确保清洗干净；
（3）脱保护：
加15ml含20%哌啶的DMF溶液(15ml/g)，反应5min，去除反应后DMF溶液后，再加如15ml含20%哌啶的DMF溶液(15ml/g)，反应15min；
（4）检测和清洗：
抽滤去除步骤（3）中脱保护后的哌啶溶液，进行茚三酮检测（具体为：取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮、KCN、苯酚溶液各一滴，110℃加热5min，变深蓝色为阳性反应）；
检测确认反应充分后，进行清洗，具体为：DMF(10ml/g)清洗两次、甲醇(10ml/g) 清洗两次、DMF(10ml/g) 清洗两次；
（5）缩合：
取氨基酸（Fmoc-Ala-OH）三倍过量，HBTU三倍过量，均用尽量少DMF溶解后，加入步骤（4）中清洗后树脂中，再立刻加入DIEA十倍过量，反应40min；
反应结束后清洗，具体为：DMF(10ml/g)清洗一次、甲醇(10ml/g) 清洗两次、DMF(10ml/g) 清洗两次；
重复步骤（2）~步骤（5），依次连接各氨基酸和mPEG1000-COOH；最后检测确认反应正确后，清洗树脂后备用。
（二）利用DEAP修饰步骤（一）中所合成制备的PEG1000-K-AAN-NLLMAAS，
具体步骤参考如下：
（1）在步骤（一）制备所得树脂中加入含有一至两滴水合肼的DMF，以去除序列赖氨酸保护基dde，然后将用少量DMF溶解的三倍过量的3-(二乙基氨基)丙基异硫氰酸酯（DEAP）、三倍过量的HBTU加入步骤（一）的树脂中，再加入DIEA十倍过量，反应40min；
（2）对步骤（1）中反应结束后物料进行利用甲醇(10ml/g)清洗三次后，从树脂上切割DEAP修饰改造后多肽；
具体切割方式为（切割液，TFA 94.5%、水2.5%、EDT 2.5%、TIS 1%）：将步骤（1）中修饰改造后树脂装入烧瓶或者离心管中，按树脂和切割液10ml/g比例，常温震荡反应120min；
切割完成后，利用氮气吹干液体，然后利用乙醚进行层析并清洗干净后，干燥后即为PEG1000-K(DEAP)-AAN-NLLMAAS粗品（可根据需要进一步进行精制以提高纯度）。
（三）对步骤（二）PEG1000-K(DEAP)-AAN-NLLMAAS进行纳米化改造，制备双重响应性纳米颗粒P-T4，具体步骤为：
取步骤（二）制备所得PEG1000-K(DEAP)-AAN-NLLMAAS 1mg，溶于10μL 的DMSO（二甲基亚砜）中，超声（功率100w）处理条件下，将其逐滴滴加1mL的PBS (pH 7.4)中，滴加完成后继续超声处理5min，即为纳米化改造后的P-T4。
需要说明的是，为便于评价本申请改造后纳米颗粒的技术效果，参考上述制备过程，发明人制备了：酸响应肽PEG1000-K(DEAP)-AGQ-NLLMASS(简称P-L)，酶响应性肽PEG1000-K(C18)-AAN-NLLMAAS(简称P-N)，无响应性肽PEG1000-K(C18)-AGQ-NLLMAAS(简称P-K)，并分别进行了纳米化改造，以作为本申请纳米化改造的对照。
进一步地，发明人对本申请所制备的纳米颗粒P-T4的结构及双重响应特性进行了分析，相关分析结果简要介绍说明如下。
（1）纳米颗粒P-T4结构
对纳米化改造后P-T4进行动态光散射DLS测定（结果如图2中a图、b图所示），结果表明其纳米粒的直径大小为80nm左右，与透射电子显微镜（TEM）结果相一致。
（2）双重响应特性
本申请所提供的双重响应性纳米颗粒P-T4，所述双重响应主要是指酸响应性和酶响应性，具体而言：
纳米颗粒P-T4中异硫氰酸3-二乙氨基丙酯(DEAP)的碱解离常数pKb为6.8，其在肿瘤微环境的微酸性pH (6.7~7.1)的组织环境内可以发生质子化，经同电荷之间相互排斥进而使纳米颗粒膨胀变大从而暴露出豆荚蛋白酶酶切底物；
而豆荚蛋白酶(legumain)高表达于不同类型的肿瘤组织内，而本申请所设计提供的纳米颗粒P-T4中，因含有底物丙氨酸-丙氨酸-天冬酰胺（-AAN-），因此可被肿瘤细胞上高表达的legumain剪切，释放出功能性短肽T4，进而表现出豆荚蛋白酶的酶响应性。
纳米粒P-T4酸响应实验：
第一种实验：
将纳米粒P-T4溶液分别设置如下实验组：pH 6.8组、 pH 6.8 +豆荚蛋白酶组、pH 7.4+豆荚蛋白酶组；然后进行透射电子显微镜（TEM）测定，观察纳米粒形态变化；
第二种实验（纳米探针实验）：取纳米化改造前P-T4 1mg、荧光染料TRITC 0.1mg、淬灭剂BHQ-1 0.1mg，共同溶于10μL DMSO，加入到1ml PBS中超声5min，孵育1h后，10000g离心5min除去沉淀，调pH为6.8，溶液由荧光分光光度计测定其荧光强度，激发波长为555nm，发射波长580nm。
纳米粒P-T4酶响应性测定：
将豆荚蛋白酶溶解制备成0.2mg/ml溶液（溶解液中包含50 mM MES，250 mM NaCl，pH6.8），取50μL豆荚蛋白酶溶解液和50μL的P-T4孵育作用2h，反应产物由基质飞行时间质谱测定分子量变化。
作为对照，对本申请纳米颗粒P-T4进行酸、酶响应性分析时，同时对对照组（P-L、P-N、P-K）进行了分析。
双重响应性纳米颗粒P-T4的酸、酶响应性结果：
（1）TEM测定结果：
结果显示（如图3中a~d图）：纳米粒P-T4在pH 7.4可以形成纳米球；将pH 调整为6.8时，纳米粒出现膨胀状态；而对照组经pH6.8酸作用后，纳米粒形态不发生结构上的改变；
（2）纳米探针实验结果：
结果如图3（e图）所示，可以看出：纳米粒P-T4装载疏水性荧光探针TRITC和它的淬灭剂BHQ-1后，在正常pH7.4下由于荧光染料和其淬灭剂被包载在纳米粒里面，两分子近距离接触，其荧光值处于静熄状态，当调整pH为酸性时，纳米粒解离并释放两荧光分子而处于激活状态，结果表明有5倍的荧光值的差别，说明该纳米粒在酸性环境中处于解离状态；
（3）酶响应结果：
基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)检测结果表明（图3中f图以及图4）：两亲性片段的分子量为2200的峰消失，并出现另外两个小峰的分子量分别为718和1480，这与理论上断裂后的HO-Asn-Leu-Leu-Met-Ala-Ala-Ser 和PEG1000-Lys(DEAP)-Ala-Ala-Asn-NH2的分子量相一致；而对照组经豆荚蛋白酶作用后2200的峰仍存在，说明该短肽形成的纳米粒在没有酸响应下不能暴露出豆荚蛋白酶剪切底物，进而不能被酶剪切；这一结果说明纳米粒P-T4特异性在酸和酶共同作用下才能将功能肽T4释放出来；
另一方面，纳米粒P-T4经pH6.8的豆荚蛋白酶溶液作用后，TEM拍照显示纳米粒形态消失，说明纳米粒在酶的作用下可以破裂；这一结果表明纳米粒P-T4在正常生理状态下可自组装成纳米粒，并在微酸和高表达legumain的肿瘤微环境中将功能性游离短肽T4释放出来发挥作用。
综上，就本申请纳米颗粒P-T4结构分析可以看出，纳米颗粒P-T4由亲水端和疏水端组成：所述疏水端，由豆荚蛋白酶的酶切底物-AAN-、酸响应性异硫氰酸3-二乙氨基丙酯(DEAP)修饰的赖氨酸（Lys-DEAP）、以及功能性短肽PEP（也称T4肽）组成；所述亲水端，由PEG1000片段部分构成。而正是基于这种双亲性片段才可以在水溶液中自组装成纳米粒，并且在纳米化后可以通过实体瘤的高通透性和滞留效应（EPR效应）被动靶向肿瘤；另一方面，纳米结构的设计，可以增加功能性短肽T4在体内的半衰期和生物利用度，纳米化也使短肽T4特异性靶向肿瘤组织，从而减少对正常组织的非特异性结合。在生物体内，纳米颗粒P-T4先在酸环境中快速变成解离状态，暴露出酶剪切底物并被酶切，酶切后所释放功能性短肽T4局部靶向干扰肿瘤组织内巨噬细胞上Tie2受体的信号转导，从而抑制化疗后Tie2相关巨噬细胞介导血管重建的这一过程，进而抑制化疗后肿瘤的复发以及癌症转移。
实施例2
对于实施例1所制备纳米粒P-T4，本实施例主要是对纳米粒P-T4与Tie2+巨噬细胞活力关系进行初步研究和分析。
细胞活力测定：
将巨噬细胞RAW264.7经Lipofectamine 2000转染高表达Tie2蛋白，即为Tie2positive RAW；为了检测纳米粒P-T4对Tie2相关巨噬细胞活力的影响，选用RAW264.7作为对照组，即为Tie2 negative RAW；
将Tie2 positive RAW或Tie2 negative RAW培养在1% FBS血清中，细胞因子血管生长素ANG2作为模拟肿瘤微环境，加入200ng/ml ANG2入培养基中；
将实验分成：PBS组、游离1mM T4组、0.5 mM P-T4 +10 ug豆荚蛋白酶（legumain）组、1mM P-T4+10ug legumain组和 1 mM P-T4组，处理48h后，细胞活力由CCK-8测定。
信号通路机制判定：
对上述各实验组处理12h后细胞，提细胞蛋白进行western blot实验分析，检测蛋白含量。
分析结果表明：
Tie2 positive RAW在血清饥饿状态下能够维持细胞活力，而在加入含有legumain的纳米粒P-T4后，纳米粒通过干扰Tie2受体而抑制细胞的存活；具体而言（如图5中a图、b图所示）：
经legumain孵育作用后的P-T4与游离短肽T4产生相同的干扰效果，说明功能性短肽可以在legumain的作用下完全解离出来；同时，在没有legumain的作用下，纳米粒P-T4不能抑制Tie2相关巨噬细胞的存活；这一结果表明纳米粒P-T4仅仅在legumain作用下才能将功能短肽T4游离出来发挥干扰Tie2受体这一信号；
而相比于Tie2 positive RAW，纳米粒P-T4对Tie2 negative RAW的存活没有任何的影响；这一结果表明纳米粒P-T4仅仅在微酸和legumain高表达的肿瘤环境中将游离短肽T4释放出来通过干扰Tie2受体信号以降低Tie2 positive RAW的活力。
进一步地western blot实验分析表明（图5中c图、d图结果所示）：经legumain作用后的纳米粒P-T4抑制了细胞内AKT的磷酸化，也即，纳米粒P-T4通过AKT信号通路降低饥饿状态下的Tie2相关巨噬细胞的活力。
实施例3
本实施例以4T1(小鼠乳腺癌细胞)乳腺癌为例，通过评价纳米粒P-T4对化疗药脂质体阿霉素（L-D）治疗4T1乳腺癌后复发影响情况，来评价纳米粒P-T4的具体应用效果、应用前景。
（一）纳米粒P-T4体内分布评价
移植瘤模型的构建：将乳腺癌细胞系4T1培养在含10%FBS的培养基RPMI-1640中，待培养皿中细胞长满，收集细胞并计数，每只BALB/c小鼠皮下移植接种1×106个4T1细胞，待肿瘤组织肉眼可见，即为成功构建移植瘤模型。
纳米粒P-T4的体内双响应性检测：
首先将近红外荧光染料Cy5.5-NHS与不同的短肽的氨基反应，然后将反应产物Cy5.5、P-L-Cy5.5、P-N-Cy5.5、P-K-Cy5.5和 P-T4-Cy5.5尾静脉注射不同的移植瘤小鼠中，24h后，小鼠处死，肿瘤组织取出并由小动物活体成像仪检测其荧光强度。
纳米粒P-T4的体内半衰期和体内分布测定：
将Cy5.5、T4-Cy5.5 和 P-T4-Cy5.5尾静脉给药到移植瘤小鼠中，不同时间点后，血液被收集，其荧光强度由小动物活体成像仪测定；另外24h后，小鼠被处死，心肝脾肺肾和肿瘤组织取出，由小动物活体成像仪测定P-T4-Cy5.5的体内分布情况。
纳米粒P-T4的成功应用，其前提是该纳米粒可以在血液循环中高稳定性存在和在肿瘤部位能够聚集，因此，发明人首先以近红外荧光染料cy5.5作为标记，对纳米粒P-T4进行了修饰，然后进行了血液循环和体内研究。
结果表明（图6中a~f图结果所示），P-T4的半衰期为2h，而未修饰的短肽因为酶降解其半衰期在血液循环中仅仅几分钟（Adessi C et.al, Converting a peptide into adrug: strategies to improve stability and bioavailability. Current medicinalchemistry. 2002;9:963-78）；并且体内分布表明纳米粒可以有效的聚集在肿瘤组织。
（二）纳米粒P-T4对化疗脂质体载阿霉素(L-D)后Tie2相关巨噬细胞的数量和血管密度的影响
体内化疗后复发肿瘤组织的免疫组化分析：
将肿瘤组织放于冰冻切片机切片，厚度约 5µm，室温放置片刻后，浸入4℃冷多聚甲醛中室温固定 10 min；用 0.01 M pH 7.4 的 PBS/T 缓冲液漂洗 3 次，每次 5 min；再滴加正常羊血清完全浸润肿瘤组织，室温1h，用滤纸吸掉组织周围残留液体。每个组织滴加约60 μl 一抗（Tie2抗体、CD11b抗体和CD31抗体），于4℃冰箱湿盒内孵育过夜；恢复至室温。滴加DAPI 60ul 处理5min，用盖玻片进行封片，用激光共聚焦观察免疫荧光蛋白表达量。
免疫荧光分析结果表明（图7中a~d图所示）：
纳米粒P-T4明显的减少了化疗后Tie2+CD11b+巨噬细胞的数量，同时化疗后血管CD31的数量明显多于空白对照组；
纳米粒P-T4也一定程度上降低了血管的密度，这些结果表明纳米粒P-T4可以通过干扰巨噬细胞上的Tie2受体信号转导，进而干扰了Tie2相关巨噬细胞介导的血管新生。
（三）实际癌症转移和肿瘤复发影响
体内抑瘤实验：
移植瘤模型构建方法同上述一致，当肿瘤生长到100mm3时，小鼠被分成：生理盐水组、化疗药组、化疗药加短肽T4组以及化疗药加P-T4组；
首先每只小鼠尾静脉给药化疗药脂质体阿霉素（L-D）5mg/kg，三天给药一次，共两次，创建化疗后复发的模型；随后再给药短肽T4和纳米粒P-T4，给药量为50mg/kg，隔天一次，共给药8次，生理盐水组和化疗药组为对照组（给药方式如图8中a图所示）；
肿瘤的大小和小鼠体重两天记录一次，肿瘤的大小计算为肿瘤的长度乘以肿瘤的宽度的平方除以2；
经过两周治疗周期后，所有小鼠被处死，肿瘤和肺组织取出，其被4%多聚甲醛固定，切片经苏木精和伊红（H&E）染色观察肿瘤坏死和肺转移情况。
从肿瘤生长曲线和最终的肿瘤体重结果可以看出（如图8中b图、c图所示）：
单独给药化疗L-D后，在肿瘤早期可以有效的抑制肿瘤的生长，之后出现快速的复发；而给药纳米粒P-T4后可以减慢肿瘤化疗后复发，并且纳米粒P-T4对化疗后复发的抑制率比游离短肽T4更有效, 这些结果表明纳米粒P-T4可以有效的减慢化疗后复发。
肿瘤组织H&E染色表明：纳米粒P-T4结合化疗L-D组出现最大的坏死。
纳米粒P-T4对肿瘤转移的影响：
结果如图8中d~g图所示，可以看出：肺组织H&E染色表明P-T4显著的降低了化疗后的肺转移数量，这是由于P-T4干扰了巨噬细胞上的Tie2受体进而抑制了血管重建，抑制血管重建和肿瘤复发也降低了肺转移的概率。
总而言之，纳米粒P-T4不仅降低了化疗后肿瘤的复发，还抑制了肺转移的数量。
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<110> 郑州大学第一附属医院
<120> 一种双重响应性纳米颗粒及其在肿瘤抑制中的应用
<130> none
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工设计
<400> 1
Lys Ala Ala Asn Asn Leu Leu Met Ala Ala Ser
1 5 10

Claims (7)

1.一种双重响应性纳米颗粒，其特征在于，该纳米颗粒名为P-T4，属于一种两亲性多肽结构，氨基酸部分序列如SEQ ID NO.1所示，具体结构式表示为：
PEGx-Lys-DEAP-Ala-Ala-Asn-Asn-Leu-Leu-Met-Ala-Ala-Ser，或者表示为：PEGx-K-DEAP-AAN- NLLMAAS；
所述x=800~2000。
2.如权利要求1所述双重响应性纳米颗粒，其特征在于，x=1000，即PEGx =PEG1000。
3.权利要求1或2所述双重响应性纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（一）采用固相多肽合成法制备PEGx-K-AAN-NLLMAAS，
（二）利用DEAP修饰步骤（一）中所合成制备的PEGx-K-AAN-NLLMAAS；
（三）对步骤（二）PEGx-K(DEAP)-AAN-NLLMAAS进行纳米化改造，制备双重响应性纳米颗粒P-T4，具体步骤为：
将步骤（二）制备所得PEGx-K(DEAP)-AAN-NLLMAAS溶于DMSO中，超声处理条件下，将其逐滴滴加PBS中，制备形成纳米粒溶液，即为纳米化改造后的P-T4。
4.如权利要求3所述双重响应性纳米颗粒的制备方法，其特征在于，PBS具体pH要求为pH =7.4。
5.权利要求1或2所述双重响应性纳米颗粒在制备肿瘤抑制药剂中的应用，其特征在于，用于抑制肿瘤化疗治疗后的肿瘤复发。
6.如权利要求5所述双重响应性纳米颗粒在制备肿瘤抑制药剂中的应用，其特征在于，所述肿瘤具体为乳腺癌肿瘤；所述化疗，具体为脂质体阿霉素化疗。
7.如权利要求5所述双重响应性纳米颗粒在制备肿瘤抑制药剂中的应用，其特征在于，用于小鼠时，给药量不小于50mg/kg，隔天给药一次。
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