CN111574591B - 一种多肽及其合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多肽及其合成方法,多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示;该多肽的合成方法,由以下步骤组成:将DPMIβ沿X轴用笛卡尔坐标翻转得到镜像对应体LPMIβ;将LPMIβ拓扑嫁接到Apamin的α螺旋区上,从而得到嫁接了LPMIβ的Apamin;将LPMIβ的Apamin转化为DPMIβ的Apamin;将DPMIβ的Apamin环中第2位的天冬酰胺突变为精氨酸,在疏水作用和氢键的作用下自组装成D‑对映体小蛋白超分子纳米颗粒;通过两步二硫键氧化后,再通过Fmoc化学合成目标多肽DMSN,目标多肽DMSN的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示;该多肽用于抑制癌细胞生长;本发明的多肽具备长效的体内循环时间,相对于该靶点传统小分子药物,多肽药物具有特异性强,靶向性高的,体内副作用小的优势。
Description
技术领域
本发明属于生物医药抗癌领域,尤其涉及一种多肽及其合成方法。
背景技术
恶性肿瘤已成为日益常见且严重威胁人类生命和生活质量的主要疾病之一。原发性肝癌(Primary hepatic carcinoma)是一种肝细胞异常增生而导致的恶性肿瘤,恶性度高且病情进展快,预后差,常危及患者生命,其死亡率在我国恶性肿瘤中居第五位。结直肠癌、肝癌均属于消化道肿瘤,均是我国死亡率前10的恶性肿瘤可以看出与饮食密切相关的消化道肿瘤已经严重威胁我国居民健康。目前国内外针对肝癌和结直肠癌的临床治疗手段主要是手术切除、放化疗以及靶向治疗等,传统的治疗手段靶向性不足,导致治疗效果有限,同时受到高复发率和强副作用的掣肘。因此,开发靶向药物治疗在我国具有重大的临床价值和社会价值。
大量研究包括申请人的前期研究已经证明,在p53野生型的肝癌与肠癌中,阻断MDM2与p53蛋白的相互作用,可以恢复肿瘤中p53蛋白的含量与功能,从而诱导肿瘤细胞发生依赖于p53通路的凋亡与周期阻止,进而实现肿瘤的有效抑制。然而,到目前为止,还没有针对该靶点的MDM2拮抗剂被批准上市,部分抑制剂在临床前研究中由于有限的药效限制了其临床应用潜力,更为严重的是,多种该靶点的潜在药物在临床试验中由于毒性作用而直接导致了试验失败。
多肽类拮抗剂在抑制蛋白-蛋白相互作用时很大程度上地弥补了小分子抑制剂的劣势,可以显著减少与非靶点蛋白的相互作用,降低药物“脱靶毒性”,并且通过对多肽氨基酸序列的突变优化和修饰可以获得高亲和力。
与L-型多肽呈手性对称的D-型多肽(由非天然的D-型氨基酸构成)由于不能被蛋白酶识别形成酶-底物复合体,故而能抵抗蛋白酶水解,显著延长在体内的半衰期,同时因为无法被抗原呈递细胞加工因而免疫原性弱,不易产生机体的免疫反应。基于这些优点,D-型多肽在作为治疗药物方面明显优于L-型多肽。因此,开发D型靶向治疗癌症的多肽药物是现有医药发展的前沿方向。
发明内容
本发明的目的是提供一种多肽及其合成方法,能调节癌细胞内p53-MDM2/MDMX的相互作用,诱导细胞周期停滞和凋亡从而有效地抑制体内癌细胞的生长。
本发明采用以下技术方案:一种多肽,多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
一种多肽的合成方法,由以下步骤组成:
将DPMIβ沿X轴用笛卡尔坐标翻转得到镜像对应体LPMIβ;
将LPMIβ拓扑嫁接到Apamin的α螺旋区上,从而得到嫁接了LPMIβ的Apamin;
将LPMIβ的Apamin转化为DPMIβ的Apamin;
将DPMIβ的Apamin环中第2位的天冬酰胺突变为精氨酸,
在疏水作用和氢键的作用下自组装成D-对映体小蛋白超分子纳米颗粒;
通过两步二硫键氧化后,再通过Fmoc化学合成目标多肽DMSN,目标多肽DMSN的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步地,DPMIβ的合成方法由以下步骤组成:根据已设计好的序列,进行氨基酸称量;采用Boc化学固相肽合成法或Fmoc法合成DPMIβ。
进一步地,D-对映体小蛋白超分子纳米颗粒的粒径为80-200nm。
本发明的有益效果是:本发明的多肽具备长效的体内循环时间,更优的体内稳定性,组织被动富集优势;本发明中多肽的制备方法沿用经典的Fmoc多肽全化学合成流程,进一步进行了纳米工程化的优化修饰,强化了多肽药物的性能;相对于该靶点传统小分子药物,多肽药物具有特异性强,靶向性高的,体内副作用小的优势。
附图说明
图1为本发明的原理示意图;
图2为DMSN的制备与表征;
其中:A、DMSN的序列比对设计流程图与起效机制图;B、DMSN、DPMIβ的Apamin(DApamin)、LPMIβ的Apamin(LApamin)三个样品的圆二色谱图;C、有/无GSH孵育的DMSN的透射电子显微镜(TEM)图像;D、DMSN的水合粒径尺寸;E、经组织蛋白酶孵育的抵抗蛋白水解酶的能力;F&G、荧光偏振测定不同物质的靶蛋白结合能力。
图3为动物水平DMSN的富集能力;
其中:A、小动物脏器分离荧光成像;B-D,脏器荧光强度比例分析;E、细胞摄取荧光共聚焦图像;F、荧光强度分析;G、溶酶体逃逸验证;H、细胞毒性测试;I和J、蛋白免疫印迹的蛋白条带灰度分析;
图4为抗肿瘤能力测试;
其中:A、肿瘤生长曲线;B、结肠癌嫁接瘤模型中肿瘤的平均重量;C、肿瘤组织Tunel激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)图像;D、免疫组化染色;E、免疫组化评分;F、PDX瘤裸鼠肿瘤生长曲线;G、肿瘤照片;H、人源pdx模型中肿瘤的重量;I、免疫组化染色;J、免疫源性评价,颗粒酶与IFN-γ评价;K、TUNEL染色;L、肿瘤生长曲线;M、肿瘤重量评价;
图5为DMSN的安全性评价;
其中:A、嗜酸性粒细胞评价;B、细胞因子IL-2评价;C、IFN-γ评价;D、促红细胞生成素评价;E、血小板计数;F、红细胞计数;G、血红蛋白计数评价;H、血红蛋白评价;I、肝脏重量评价;J、丙氨酸转氨酶评价;K、天冬氨酸转氨酶评价;L、小鼠H&E染色肝切片的代表性图像;M、小鼠血尿素氮肾功能评价;N、小鼠血清肌酐肾功能评价;O、小鼠H&E染色肾切片的代表性图像。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
现有技术中通过“镜像肽嫁接”方法,可将生物活性D肽的表位嫁接到微蛋白模板上,以构建自组装的超分子颗粒。由于手性肽和蛋白质相对于天然存在的L-蛋白酶的空间不相容性提供了极高的催化自由能屏障,因此D-对映体肽和蛋白质对蛋白水解具有抗性,而且,蛋白酶体加工后的抗原呈递也依赖于蛋白水解,因此D蛋白和D肽(>15个氨基酸残基)的免疫原性总是较低。因此,可以肯定,D-对映体肽和蛋白质的自组装成有序的层次结构是设计和构建超分子手性的有利方法。
由于生物活性中的手性特异性相互作用,一种生物分子起着至关重要的生物功能,而其对映异构体通常是无活性的,甚至是有毒的。因此,迫切需要一些可行的方案来赋予手性超分子具有特定的生物学功能。为了解决这个问题,开发一种称为“镜像肽嫁接”的新方法,通过该方法可以将生物活性D肽的表位嫁接到D对映体小蛋白模板中。值得注意的是,得益于镜像噬菌体展示技术和计算机辅助设计技术,发现了越来越多的具有抗感染,抗糖尿病或抗肿瘤活性的D肽拮抗剂,从而为镜检提供了广泛的生物学功能。此外,手性特异性是一把双刃剑,它不仅消除了天然蛋白质的生物功能,而且消除了毒白蛋白的毒性,从而扩大了D-对映体小蛋白质模板的范围。基于这种方法,可以通过镜像表位嫁接和蛋白质/肽自组装的组合策略性地实施手性纳米技术。
“镜像肽嫁接”主要由两部分组成:“镜匹配”和“表位嫁接”。在此概念验证研究中,DPMIβ是MDM2和MDMX的12-mer D肽拮抗剂,可重新激活p53,移植到Apamin的镜像拓扑等效位置以生成自组装D-对映体小蛋白超分子纳米颗粒(DMSN)。另外,蛋白质/肽来源的超颗粒还应满足一些药理学要求:膜通透性,靶向蓄积和分解成具有小纳米级的成分,可实现肾脏清除。由于这些原因,DMSN继承了Apamin的阳离子特性以穿透癌细胞的膜。另外,DMSN被设计为通过增强的渗透性和保留(EPR)效应有利于肿瘤的被动靶向。而且,由于Apamin中的两个二硫键,DMSN具有氧化还原反应性,并在细胞内还原环境中分解成某些线性肽,进行起效。
本发明公开了一种多肽,多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示,即CRCKAPTAWYCNFECLLR,所述多肽均由D型氨基酸组成。
本发明还公开了一种多肽的合成方法,由以下步骤组成:
步骤1:根据已设计好的序列,进行氨基酸称量;采用Boc化学固相肽合成法或Fmoc法合成DPMIβ。
步骤2:利用Discovery Studio 2.5软件将DPMIβ沿X轴用笛卡尔坐标翻转得到镜像对应体LPMIβ。
步骤3:将LPMIβ拓扑嫁接到Apamin的α螺旋区上,从而得到嫁接了LPMIβ的Apamin。
步骤4:将LPMIβ的Apamin转化为DPMIβ的Apamin,出于对称性的原因,嫁接了DPMIβ的Apamin将在DPMIβ配体的结合位点特异性结合MDM2和MDMX。
步骤5:将DPMIβ的Apamin环中第2位的天冬酰胺突变为精氨酸。
步骤6:在疏水作用和氢键的作用下自组装成D-对映体小蛋白超分子纳米颗粒,D-对映体小蛋白超分子纳米颗粒的粒径为80-200nm。
步骤7:通过两步二硫键氧化后,再通过Fmoc化学合成目标多肽DMSN,目标多肽DMSN的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明通过“镜像肽嫁接”和肽衍生的自组装发展生物功能手性蛋白超分子颗粒。如图1和图2A所示,通过将DPMIβ镜像嫁接到Apamin的α-螺旋上,成功地将蜂毒神经毒素转化为自组装的D-对映体微型蛋白DMSN,以调节p53-MDM2/MDMX相互作用。本发明将MDM2和MDMX的12-mer D对映体肽拮抗剂DPMIβ嫁接到Apamin的α-螺旋上,以重新激活p53,成功构建了自组装的D-对映体小蛋白超分子纳米颗粒,称为DMSN。DMSN具有约100nm的良好水合物粒径,可实现EPR效应,并可响应细胞内还原环境而分解成小的纳米颗粒。此外,DMSN对多种癌症显示出出色的细胞膜渗透性,内体逃逸和体外p53依赖性抗增殖活性。DMSN有效抑制HCT116结肠癌异种嫁接模型,胰腺癌患者衍生的异种嫁接模型中的肿瘤生长,具有高度有利的安全性,并在B16F10同种异种黑素瘤模型中通过抗PD1疗法增强了抗肿瘤免疫力。
本发明还公开了一种多肽的应用,用于抑制癌细胞生长,尤其是用于激活p53活性诱导细胞周期停滞和凋亡,进而抑制体内癌细胞的生长;尤其是用于促进癌细胞内p53与MDM2/MDMX的相互作用。
实施例1
实验材料及仪器
表1实验试剂与生产商
试剂 | 生产商 |
FBS | Gibco |
异硫氰酸荧光素(FITC) | Sigma-Aldrich |
MTT | Dojindo |
EDTA | Sigma-Aldrich |
Sodium azide | Sigma-Aldrich |
HEPES | Sigma-Aldrich |
Tween20 | Sigma-Aldrich |
β-巯基乙醇 | Sigma-Aldrich |
十二烷基磺酸钠(SDS) | Sigma-Aldrich |
30%丙烯酰胺 | Biorad |
甘氨酸 | Sigma-Aldrich |
Trizma base | Sigma-Aldrich |
TEMED | Sigma-Aldrich |
氯化钠 | Sigma-Aldrich |
甲醇 | Sigma-Aldrich |
过硫酸铵 | Sigma-Aldrich |
氯化钾 | Sigma-Aldrich |
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> | Sigma-Aldrich |
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> | Sigma-Aldrich |
Horseradish标记羊抗鼠二抗 | Calbiochem |
ECL底物 | Biorad |
RIPA裂解液 | Sigma-Aldrich |
BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher |
抗β-catenin抗体 | Calbiochem |
抗actin抗体 | Sigma-Aldrich |
表2实验设备与生产商
设备 | 生产商 |
全波长酶标仪 | Tecan |
流式细胞仪 | Beckman |
激光共聚焦显微镜 | CLSM FV1200 Olympus |
化学发光成像系统 | 上海勤翔科学仪器有限公司 |
1.DMSN的制备
步骤1:根据已设计好的序列,进行氨基酸称量;采用Boc化学固相肽合成法或Fmoc法合成DPMIβ,DPMIβ的序列为:DTDADWDYDADNDFDEDKDLDLDR。
步骤2:利用Discovery Studio 2.5软件将DPMIβ沿X轴用笛卡尔坐标翻转得到镜像对应体LPMIβ。
步骤3:将LPMIβ拓扑嫁接到Apamin的α螺旋区上,从而得到嫁接了LPMIβ的Apamin。
步骤4:将LPMIβ的Apamin转化为DPMIβ的Apamin,出于对称性的原因,嫁接了DPMIβ的Apamin将在DPMIβ配体的结合位点特异性结合MDM2和MDMX。
步骤5:将DPMIβ的Apamin环中第2位的天冬酰胺突变为精氨酸。
步骤6:在疏水作用和氢键的作用下自组装成D-对映体小蛋白超分子纳米颗粒,D-对映体小蛋白超分子纳米颗粒的粒径为80-200nm。
步骤7:通过两步二硫键氧化后,再通过Fmoc化学合成目标多肽DMSN。
1.1DMSN对细胞内氧化还原环境升高的敏感性
首先,通过圆二色谱,确认DMSN在一般PBS溶液环境中的稳定性,发现DMSN与D型嫁接模板DApamin具有良好的结构稳定性,而L型嫁接模板LApamin结构不稳定,如图2B。
将DMSN在含有10mM GSH的细胞内氧化还原模拟磷酸盐盐缓冲液(PBS)溶液中孵育。孵育半小时后,所有80nm超分子粒子均发生变形,孵育1小时后溶液中出现约1nm小颗粒,如图2C。
如图2D所示,与TEM观察结果一致,动态光散射(DLS)表明DMSN在20%FBS中不含GSH孵育12小时后通常可以保持其胶体稳定性,而在10mM GSH中孵育则在1小时内尺寸急剧减小。
此外,为验证DMSN的蛋白水解抗性,将DMSN及其相同序列的L-对映体LMSN分别在100μM的RPMI 1640中与20μg/ml组织蛋白酶G一起孵育-组织蛋白酶G对碱性和庞大的疏水残基均具有双重特异性。在没有GSH的情况下孵育12小时后,DMSN保持完整性,而相同序列的L-对映异构体中有25%以上被降解。更重要的是,添加10mM GSH后,几乎所有还原的LMSN均被降解,而90%以上的DMSN还原则保持完美,如图2E所示。
1.2DMSN对p53-MDM2/MDMX相互作用的抑制作用评价
荧光偏振(FP)测定。实验中常利用的荧光偏振现象,指相互作用的两个分子中至少有一个标记荧光素,分子相互作用后结为整体,体积与分子质量均会增大,如果此时利用水平和垂直方向的偏振光激发,其荧光偏振信号将与未相互作用时不同。
荧光偏振分析即利用此原理,通过水平和垂直方向的荧光偏振值的不同判断分子是否相互作用。荧光偏振分析的优点在于可以定量测定,较大的待测分子在激发时荧光偏振值较高,因为相比,大分子更加难以旋转和运动;较小的待测分子的发射光将由于其运动状态而去偏振化,荧光偏振值会低。测得的偏振值可以使用软件进行计算和分析。
通过基于荧光偏振的竞争测定法测量了DMSN对p53-MDM2/MDMX相互作用的抑制作用,其中将不同浓度的DApamin,DMSN或DPMIβ应用于含1mM GSH的PBS缓冲液中,该缓冲液含有预孵育p53-FITC的MDM2或MDMX,DMSN和DPMIβ对MDM2的半数最大抑制浓度(IC50)值分别对MDM2为138nM和396nM,如图2F所示,对MDMX为82.2nM和122.3nM,如图2G所示。对于没有结合表位(DApamin)的支架,未观察到抑制作用。总的来说,这些结果表明氧化还原反应性DMSN完全继承了DPMIβ调节p53-MDM2/MDMX相互作用的功能。
1.3动物水平与细胞水平富集摄取能力检测
通过检测Cy38标记的DMSN在携带MC38肿瘤的同种异体嫁接物的小鼠中的器官和肿瘤特异性分布来进行药代动力学。以2.5mg/Kg的剂量注射200μLDMSN后1小时,肿瘤和器官中的荧光积累迅速达到最大值,此后逐渐消退,并且除肿瘤外的器官中的荧光大部分消失在6小时内不可见,如图3A所示。与Cy3标记的DPMIβ肽的随机分布比例形成鲜明对比的是,Cy3标记的DMSN在肿瘤中与其他器官的蓄积比率随时间逐渐增加,这表明DMSN的超分子结构优先在肿瘤中蓄积。而不是心脏,肝脏,脾脏,肾脏或肺,如图3B所示。与注射后6小时的DPMIβ相比,该器官的积聚较少,肿瘤与其他器官的比例较高,再次证明了这一发现,如图3C-3D所示。另外,DMSN显示出比其相同序列的L-对映异构体LMSN增加的肿瘤蓄积,大概是由于网状内皮系统的半衰期延长和蛋白质亲和力降低。
同时,通过使用不同材料孵育HCT116细胞,孵育时间一致,考察细胞摄取能力,发现DMSN摄取能力最强,如图3E-3F。
1.4DMSN的细胞内分布研究
将HCT116细胞与低浓度FITC标记的DMSN(20μg/mL)孵育6h,然后用早期内体(EEA1),晚期内体(RAB)和溶酶体(Lysotracker)的已知标记物进行染色。数据显示,DMSN与早期和晚期内体部分共定位,并且这种印象已通过共定位的定量分析得到验证,早期内体的Pearson系数为0.042,晚期内体的Pearson系数为0.019(指示性)逃脱核内体。更重要的是,在溶酶体中没有发现重叠,表明所有DMSN都可以在溶酶体吞噬作用之前逃逸到细胞质中,如图3G所示。
1.5蛋白免疫印迹实验
1)在悬浮培养细胞12孔板之中,每孔中加入1mL不同悬浮细胞液。细胞培养24h之后,在细胞内加入不同药物进行处理。处理48h之后,将细胞液离心弃上清,收集细胞,加入RIPA裂解液裂解细胞。
2)通过BCA定量试剂盒对每组样品中含有的总蛋白量进行定量,并通过调整样品体积的方式使每组样品中的蛋白浓度一致。蛋白量调整之后,加入Loading Buffer,沸水煮5min以使蛋白完全变性。
3)将不同组的样品进行SDS-PAGE分离。配制12%的含有SDS的聚丙烯酰胺分离胶和5%的聚丙烯酰胺浓缩胶。然后将制备好的样品与同样体积的预染蛋白样品加入上样孔中,进行电泳分离实验。电泳条件为:电压设置为70V,分离约15min至溴酚蓝到达分离胶处。之后调整电压至120V,分离约60min至溴酚蓝到达分离胶末端约1cm处,停止电泳。
4)将蛋白样品进行转膜处理。本课题中所有Western Blot实验均使用PVDF膜,在转膜仪上按顺序排放:三层滤纸、PVDF膜、胶、三层滤纸。设置转膜电流为100mA,转膜时间为1h。
5)封闭转膜完成的PVDF膜浸入含有5%BSA的封闭液中,室温孵育1h,TBST、5min洗涤2次。
6)一抗孵育按照需求配置不同抗体的稀释液,之后4℃孵育过夜,以达到抗体识别特定抗原的目的,然后TBST、5min洗涤2次。
7)二抗孵育根据不同一抗的来源种属配制相应的HRP标记的二抗(抗鼠或抗兔),1:2000稀释。之后室温孵育1h,TBST、5min洗涤2次。
8)显色用TBST配置1:5的ECL显色液,浸润5min,用干净的纸吸掉多余的显色液,使用化学发光仪进行曝光,如图3I和3J所示。
1.6MTT法测细胞活力
MTT,即3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐,也叫噻唑蓝。原理:活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为不能溶于水的蓝紫色结晶甲臜(Formazan),从而积聚在细胞中,但死细胞拒染。细胞中的甲臜可以溶解在二甲基亚砜(DMSO)中,通过测定其在570nm波长处的光吸收值,可计算活细胞数量。在一定细胞数范围内,甲臜的形成量与细胞数成正比。具体步骤如下:
1)接种细胞在96孔板中接种200μL细胞溶液,使每孔含有1×103-104个细胞。
2)培养细胞将细胞培养板放入CO2培养箱中,37℃、5%CO2条件下培养24h。
3)药物处理每个药物设3个孔,药物浓度为2.5μM,与细胞孵育24h。每孔加入20μL5mg/ml的MTT溶液,继续培养4h。
4)溶解终止培养,小心弃去孔内培养液,每孔加入150μL DMSO,低速摇床摇10min,使结晶充分溶解。
5)测量使用分光光度计测定其在570nm波长处的光吸收值.
1.7生物统计分析
所有数据均通过GraphPad Prism软件进行分析,记录三个独立测试的标准偏差(SD)的平均值,组别间的差异通过t-检验进行统计学显著性分析。P<0.05被认为具有统计学意义。
2.结果与讨论
2.1新的肽/蛋白质衍生的手性超分子设计与合成
蛋白质/肽来源的超分子颗粒应满足一些药理学要求:膜通透性,靶向蓄积和分解成小尺寸的小成分以使肾脏清除,因此,DMSN继承了Apamin的阳离子特性以渗透到癌细胞细胞膜中。此外,DMSN的设计波长为有利于通过增强的通透性和保留(EPR)效应进行肿瘤的被动靶向。此外,由于Apamin中的两个二硫键,DMSN具有氧化还原反应性并分解成一些线性肽在细胞内的还原环境中。因此,本文报道的治疗上可行的策略将使能够开发一类新的肽/蛋白质衍生的超分子手性来调节细胞内p53-MDM2/MDMX相互作用,并有可能重新激发针对细胞内蛋白-蛋白质的手性纳米技术的研究,相互作用是导致多种人类疾病发生和发展的原因。
将DPMIβ(一种MDM2和MDMX的12-mer D肽拮抗剂重新激活p53)嫁接到Apamin的镜像拓扑等效位置,以生成自组装的D-对映体小蛋白超分子纳米粒子(DMSN)。为了检测其在体内的活性,建立了单细胞嫁接物肿瘤模型并且通过将外科手术衍生的临床胰腺癌样品直接植入NOD/SCID小鼠中,建立了具有野生型p53和过表达MDM2/MDMX的患者异种嫁接(PDX)模型。最终通过将DPMIβ镜像嫁接到Apamin的α-螺旋上,本发明成功地将蜂毒神经毒素转化为自组装的D-对映体微型蛋白DMSN,以调节p53-MDM2/MDMX相互作用。DMSN具有约100nm的良好水合物粒径,可用于EPR效应,并可响应细胞内还原性环境而分解成小的纳米颗粒。此外,DMSN在体外和体内均表现出优异的细胞膜渗透性,内体逃逸和p53依赖性抗增殖活性。另外,DMSN进一步增强了由抗PD1疗法引起的抗肿瘤免疫力。此外,DMSN克服了免疫原性,靶向毒性和器官损伤,因此对于潜在的临床应用而言,DMSN足够安全。确实,这项工作证明了通过“镜像肽嫁接”和肽衍生的自组装发展生物功能手性蛋白超分子颗粒的概念证明,并且本文报道的这种治疗可行的策略将使能够开发出一种肽/蛋白质衍生的超分子手性用于临床预防和治疗人类疾病的研究。
3.验证试验
为了进一步验证上述模拟的结果,首次将携带HCT116 p53+/+肿瘤的小鼠用于腹膜内注射以研究DMSN的疗效。数据表明DMSN可通过恢复p53活性诱导细胞周期停滞和凋亡而有效地抑制体内癌细胞的生长。
单细胞嫁接物肿瘤模型始终不能代表患者肿瘤的生物学和遗传异质性,因此无法提供准确的治疗评估。为了解决这个问题,通过将外科手术衍生的临床胰腺癌样品直接植入NOD/SCID小鼠中,建立了具有野生型p53和过表达MDM2/MDMX的患者异种嫁接(PDX)模型。总之,数据表明DMSN可通过恢复p53活性诱导细胞周期停滞和凋亡而有效地抑制体内癌细胞的生长。
3.1DMSN对体外癌细胞生存力影响力评估
将癌细胞(如A375,Sk Hep-1,MCF 7和HCT116p53+/+携带野生型p53和HCT116p53-/-缺失的p53)与DMSN,DApamin,DPMIβ或Nutlin-3系列稀释液一起孵育Nutlin-3和DMSN在4种p53野生型细胞系中均显示出抗增殖活性,而在HCT116p53-/-细胞中未见生长抑制作用。游离肽DPMIβ和DApamin对任何癌细胞均无生长抑制作用。这些观察结果表明,DMSN克服了DPMIβ不能穿越细胞膜并以p53依赖性方式抑制癌细胞的生长,而不是由于蛋白质框架引起的细胞毒性的结果。为了在分子水平上研究细胞内DMSN的功能机制,通过蛋白质印迹分析分析了HCT116p53+/+细胞中p53,p21的表达。治疗24小时后,DMSN和Nutlin3显着诱导了p53及其响应基因p21的表达,p21是一种依赖细胞周期蛋白的激酶抑制剂,可促进细胞周期停滞,提示p53途径的激活。与这些结果一致,HCT116p53+/+细胞的细胞周期分析显示,用DMSN处理24小时后,G1/S停滞。此外,Annexin-V和PI染色证实,在用DMSN和Nutlin-3处理后48小时,HCT116p53+/+细胞经历了不同程度的凋亡。综上所述,这些结果表明DMSN可以在体外通过恢复p53途径抑制癌细胞,如图3H所示。
3.2DMSN对体内癌细胞生存力影响力的评估
首次将携带HCT116p53+/+肿瘤的小鼠用于腹膜内注射研究DMSN的疗效。接种4×106HCT116p53+/+细胞两周后,将小鼠随机分为五组(n=5/组),以接受为期13天的治疗方案,如下所示:DMSN为2.5mg/kg,DApamin为2.5mg/kg、2.5mg/kg的游离DPMIβ,1.5mg/kg的阿霉素(DOX)和PBS(对照)。采用治疗并每隔一天测量一次肿瘤体积,如图4A所示。在第13天,与PBS对照相比,DPMIβ和DApamin均未显示出治疗效果,而DMSN抑制肿瘤的生长达90.1%,好于临床化疗药物DOX的抑制水平(74.3%)。在实验结束时直接测量肿瘤重量可得出与肿瘤大小测量一致的结论,如图4B所示。此外,与其他组相比,TUNEL染色显示DMSN处理的肿瘤样品中细胞凋亡明显增强,如图4C所示。而且,与上述体外结果一致,与DPMIβ或DApamin处理的蛋白水平未改变相比,DMSN处理的肿瘤中p53和p21的表达升高,如图4D-4E所示。相反,增殖替代物Ki67在DMSN处理的肿瘤中显示出降低的表达,这再次表明了其抗增殖作用。值得注意的是,用DApamin治疗的组显示出与对照非常相似的结果,表明DMSN的肿瘤抑制能力是由嫁接肽而非支架赋予的。综上所述,这些数据表明DMSN可通过恢复p53活性诱导细胞周期停滞和凋亡而有效地抑制体内癌细胞的生长。
同时,我们进一步使用人源PDX模型进行药效验证,从肿瘤生长曲线如图4F所示、肿瘤照片如图4G所示、离体肿瘤重量如图4H所示分析,DMSN具有最好的抑制肿瘤生长的能力。
3.3DMSN对于潜在的临床应用安全性评估
将20例C57BL/6皮下携带同源B16F10黑色素瘤肿瘤的小鼠随机分为两组。四组:(1)PBS对照,(2)DMSN,(3)Anti-PD1和(4)DMSN/Anti-PD1组合。当B16F10肿瘤的体积达到100±20mm 3时,将腹膜内注射5mg/Kg小鼠PD-1中和抗体至组(3)和(4)中。之后,每隔一天隔天腹膜内给予100μLPBS(第(1)和(3)组)或1.5mg/kg DMSN(第(2)和(4)组)腹膜内注射。服药4天后,在DMSN/Anti-PD1联合治疗的肿瘤中发现CD8/CD4比例最高,而CD4+/CD25+Treg细胞最少,如图4I所示。同时,与DMSN或Anti-PD1单药治疗相比,联合治疗还导致肿瘤内颗粒酶和干扰素(IFN)γ升高,如图4J所示。这些结果证明DMSN可以增强由PD1阻断引起的抗肿瘤免疫应答。此外,TUNEL结果再次支持该观点,如图4K所示,其中DMSN/Anti-PD1联合治疗的肿瘤在所有四组中均表现出最多的凋亡细胞。因此,与单一疗法相比,组合疗法显着提高了肿瘤抑制率。在给药结束时,DMSN/Anti-PD1联合治疗组的平均肿瘤重量为128.0±31.02mg(M±SD),如图4L-4M所示,与DMSN治疗组的553.0±79.17mg(p<0.01),抗PD1治疗组645.2±124.1mg(p<0.01)和PBS治疗组1125±147.1mg(p<0.001)。
超分子纳米粒子的临床翻译,尤其是由肽和蛋白质组成的纳米粒子,由于其免疫原性和随后的过敏反应而受到阻碍。因此,评估了DMSN,LMSN和12-mer内衬肽(LPMI,阳性对照)在具有免疫能力的分子中的免疫原性。C57BL/6小鼠通过分析五次连续静脉注射以每次5mg/kg的剂量对血液中嗜酸性粒细胞(EOS),白介素2(IL2),干扰素γ(IFN-γ)和促红细胞生成素(EPO)的含量进行分析天。EOS,IFN-γ和IL2可以反映对肽和蛋白质的过敏反应和T细胞免疫原性应答,而EPO与交叉反应中和抗体呈负相关。如图5A所示,DMSN对EOS没有影响,与未经治疗的健康小鼠相比,IFN-γ,IL2和EPO明显降低,而LPMI和LMSN明显增加了血液EOS,IFN-γ,IL2水平并降低了EPO,如图5B-5D所示。这些结果证明DMSN的超分子纳米结构和D-对映异构体减弱了免疫原性。
此外,引起骨髓抑制的靶向毒性是MDM2/MDMX拮抗剂临床应用的另一个药学障碍。因此,在DMSN的三个功效测试中监测了体重,在DMSN处理的小鼠中未发现明显的体重减轻。而且,用DMSN治疗的Balb/C裸鼠没有白细胞减少症或血小板减少症的任何特征,如图5E、5F、5G、5H所示,这都是化学疗法诱发的骨髓抑制的两个典型症状。此外,DMSN处理后未发现溶血现象。
另外,在DMSN治疗携带HCT116肿瘤的Balb/C裸鼠后,还对肝,肾,脾,肺和心脏的药物毒性进行了全面评估。通过肝脏重量如图5I所示、丙氨酸转氨酶(ALT)如图5J所示、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)如图5K所示,评估肝脏的功能。如图5L所示,与对照组相比,在用DMSN治疗的小鼠中没有发现明显的变化,表明DMSN没有肝毒性。肝脏切片的组织病理学再次支持了这一结果。接下来,通过血液尿素氮(BUN)如图5M所示、血清肌酐(CRE)如图5N所示、和组织学变化(H&E染色)如图5O所示,评估肾脏毒性。同样,DMSN对肾脏的功能和组织学无明显不利影响。值得注意的是,还没有在DMSN治疗的小鼠中观察到其他常见的药物毒性,例如脾衰竭,心肌损伤或肺部过敏性耐药。总而言之,这些结果表明DMSN对于潜在的临床应用是足够安全的。
4.结论
通过将DPMIβ镜像嫁接到Apamin的α-螺旋上,成功地将蜂毒神经毒素转化为自组装的D-对映体微型蛋白DMSN,以调节p53-MDM2/MDMX相互作用。DMSN具有约100nm的良好水合物粒径,可用于EPR效应,并可响应细胞内还原性环境而分解成小的纳米颗粒。此外,DMSN在体外和体内均表现出优异的细胞膜渗透性,内体逃逸和p53依赖性抗增殖活性。另外,DMSN进一步增强了由抗PD1疗法引起的抗肿瘤免疫力。此外,DMSN克服了免疫原性,靶向毒性和器官损伤,因此对于潜在的临床应用而言,DMSN足够安全。确实,这项工作证明了通过“镜像镜像肽嫁接”和肽衍生的自组装发展生物功能手性蛋白超分子颗粒的概念证明,并且本文报道的这种治疗可行的策略将使能够开发出一种肽/蛋白质衍生的超分子手性用于临床预防和治疗人类疾病的研究。
序列表
<110> 西安交通大学医学院第一附属医院
<120> 一种多肽及其合成方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
Cys Arg Cys Lys Ala Pro Thr Ala Trp Tyr Cys Asn Phe Glu Cys Leu
1 5 10 15
Leu Arg
Claims (4)
1.一种多肽,其特征在于,所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示,所述多肽均由D型氨基酸组成。
2.一种多肽的合成方法,其特征在于,由以下步骤组成:
将DPMIβ沿X轴用笛卡尔坐标翻转得到镜像对应体LPMIβ;
将LPMIβ拓扑嫁接到Apamin的α螺旋区上,从而得到嫁接了LPMIβ的Apamin;
将LPMIβ的Apamin转化为DPMIβ的Apamin;
将DPMIβ的Apamin环中第2位的天冬酰胺突变为精氨酸,
在疏水作用和氢键的作用下自组装成D-对映体小蛋白超分子纳米颗粒;
通过两步二硫键氧化后,再通过Fmoc化学合成目标多肽DMSN,所述目标多肽DMSN的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示;
其中,所述DPMIβ的序列为DTDADWDYDADNDFDEDKDLDLDR。
3.根据权利要求2所述的一种多肽的合成方法,其特征在于,所述DPMIβ的合成方法由以下步骤组成:根据已设计好的序列,进行氨基酸称量;采用Boc化学固相肽合成法或Fmoc法合成DPMIβ。
4.根据权利要求2或3所述的一种多肽的合成方法,其特征在于,所述D-对映体小蛋白超分子纳米颗粒的粒径为80-200nm。
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