CN106474492B - 腺苷5′-单磷酸介导的靶向肿瘤的纳米传递系统的构建与应用 - Google Patents
腺苷5′-单磷酸介导的靶向肿瘤的纳米传递系统的构建与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及腺苷5′‑单磷酸介导的靶向肿瘤的纳米传递系统的构建与应用,揭示了一种新的可靶向肿瘤细胞的化合物――腺苷5′‑单磷酸,其通过识别肿瘤细胞表面表达的腺苷A1受体发挥靶向作用,其可与一些可检测标记物如与荧光标记相连接制备靶向性诊断肿瘤的制剂,其还可与一些具有抑制肿瘤活性的物质相连接制备靶向性抑制肿瘤的制剂。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学工程领域,更具体地,本发明涉及腺苷5′-单磷酸介导的靶向肿瘤的纳米传递系统的构建与应用。
背景技术
肿瘤的靶向性诊断和治疗一直以来都是医药领域研究的热点。尽管有很多配体受体依赖的靶向配体能应用于肿瘤靶向传递系统,但是迄今为止,仍然在临床上很少有成功应用的案例。为了更好地提高对肿瘤的特异性,采用主动靶向配体进行主动靶向的策略越来越多地受到关注,现有技术中研究的主动靶向配体主要包括单克隆抗体,蛋白质,多肽,碳水化合物,核酸适配体及小分子物质等。
例如,目前越来越多地被应用于肿瘤成像及治疗领域的纳米材料当静脉注射纳米材料后,由于纳米材料特有的渗透和滞留效应(即EPR效应),纳米材料会在肿瘤部位相对于正常组织更多地富集。然而,其尽管有一定的渗透和滞留效应,但仍然不足以实现非常特异性的靶向。
因此,发展可应用于动物水平甚至临床水平的有效的靶向配体仍然是本领域亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供腺苷5′-单磷酸介导的靶向肿瘤的纳米传递系统的构建与应用。
在本发明的第一方面,提供一种靶向肿瘤的材料,所述的材料包括相连接的(1)和(2):(1)纳米材料;以及(2)腺苷5′-单磷酸(AMP);其中,所述的肿瘤是过表达腺苷A1受体的肿瘤。
在另一优选例中,所述的荧光纳米材料是荧光共振能量转移式近红外纳米材料;较佳地,所述的荧光共振能量转移式近红外纳米材料是:以MEH-PPV为基质,采用PS-PEG-COOH将近红外染料NIR-775与MEH-PPV以纳米共沉淀的方式进行包裹形成的纳米材料;所述的(1)与(2)通过包含至少2个氨基的化合物相偶联,其中化合物的一个氨基与(2)的磷酸基团相连,另一个氨基与(1)荧光纳米材料表面暴露的羧基相连。
在另一优选例中,所述的包含至少2个氨基的化合物是NH2(CH2)nNH2,其中,n表示2-8,较佳地3-7(如4、5、6)的正整数。
在另一优选例中,每个纳米颗粒的表面偶联2-20个,较佳地4-10个腺苷5′-单磷酸。
在本发明的另一方面,提供所述的靶向肿瘤的材料的用途,用于制备靶向肿瘤从而检测(诊断)肿瘤或抑制肿瘤的制剂;其中,所述的肿瘤是过表达腺苷A1受体的肿瘤。
在本发明的另一方面,提供一种用于检测肿瘤或抑制肿瘤的制剂,其包含:所述的靶向肿瘤的材料;以及药学上可接受的载体。
在本发明的另一方面,提供腺苷5′-单磷酸的用途,用于介导纳米材料靶向肿瘤;其中,所述的肿瘤是过表达腺苷A1受体的肿瘤。
在本发明的另一方面,提供一种制备靶向肿瘤的材料的方法,所述方法包括:将纳米材料与腺苷5′-单磷酸相连,获得所述靶向肿瘤的材料;其中,所述的肿瘤是过表达腺苷A1受体的肿瘤。
在一个优选例中,所述的纳米材料是荧光纳米材料;所述方法包括:使所述的荧光纳米材料表面暴露羧基;通过包含至少2个氨基的化合物将所述荧光纳米材料与腺苷5′-单磷酸相连;其中化合物的一个氨基与腺苷5′-单磷酸的磷酸基团相连,另一个氨基与荧光纳米材料表面暴露的羧基相连。
本发明的其它方面由于本文的公开内容,对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、AMP功能化纳米材料的构建。
(a)AMP-HDA的合成;
(b)荧光共振能量转移式荧光纳米材料的合成。
图2、纳米材料的体外表征。
(a)NPs-AMP的透射电镜图;
(b)NPs-AMP及NPs的水合粒径图;其中横坐标d表示纳米粒子的粒径(尺寸)大小纵坐标为“Log粒径分布/数量(%)”。
(c)纳米材料的紫外吸收光谱及发射光谱;
(d)MTT法检测CW-2孵育纳米材料后细胞的存活率。
图3、纳米材料的体外表征。
(a)NPs的TEM照片。
(b)纳米材料的凝胶电泳分析。
(c)单位纳米材料偶联配体AMP数目的计算。
图4、纳米材料对结肠癌细胞CW-2的靶向行为。
(a)流式细胞仪检测纳米材料对结肠癌细胞CW-2及肠正常细胞(intestineepithelial cells,IECs)的结合行为;
(b,c)纳米材料对结肠癌细胞CW-2时间浓度依赖的靶向行为;
(d)激光共聚焦显微镜观察纳米材料在CW-2细胞中的亚细胞定位行为。
图5、NPs-AMP对结肠癌细胞的靶向机制研究。
(a)Real-time PCR法分析A1R或者A3R在癌细胞及肠正常细胞(IECs)中的表达水平;
(b)Western-blot法分析A1R在癌细胞及肠正常细胞(IECs)中的表达水平;
(c)免疫荧光法检测纳米材料与细胞膜蛋白A1R的共定位行为;
(d)通过抑制A1R的活性检测A1R对NPs-AMP靶向CW-2能力的影响;
(e)通过RNA干扰技术敲除A1R后检测A1R对NPs-AMP靶向CW-2能力的影响。
图6、Real-time PCR分析A1R转录水平。结果表明RNA干扰技术显著降低了结肠癌细胞CW-2的A1R转录水平,降低量为70%。
图7、NPs-AMP对结肠癌移植瘤的荧光成像分析。
(a)时间依赖型纳米材料对CW-2移植瘤(肿瘤直径0.25cm)的靶向成像;
(b)图(a)中肿瘤荧光/背景荧光比值分析;
(c)图(a)中36h时间点离体组织荧光成像;
(d)图(c)中器官或组织的荧光强度比率的量化分析;
(e)时间依赖型纳米材料对CW-2移植瘤(肿瘤直径~0.5cm)的靶向成像;
(f)图(e)中肿瘤荧光/背景荧光比值分析。
图8、纳米材料在结肠癌移植瘤中的定位。采用免疫组织化学法对图7(c)中的肿瘤组织进行染色。
(a)纳米材料与血管蛋白CD31的共定位。(I,I’)复合场,(II,II’)采用DAPI染色细胞核(蓝色),(III,III’)Alexa Fluor 488anti-mouse CD31 antibody标记肿瘤血管(绿色),(IV,IV’)纳米材料(红色)。
(b)纳米材料与细胞骨架蛋白α-tubulin的共定位。(I,I’)复合场,(II,II’)采用DAPI染色细胞核(蓝色),(III,III’)Alexa Fluor 488 anti-tubulin antibody标记肿瘤血管(绿色),(IV,IV’)纳米材料(红色)。
图9、MTT分析纳米材料对乳腺癌细胞MDA-MB-468的细胞毒性。测试时间点为24h时间点。
图10、流式细胞仪检测纳米材料对乳腺癌MDA-MB-468的结合行为。时间(a)及浓度(b)依赖的纳米材料靶向MDA-MB-468的行为。
图11、NPs-AMP在细胞及小鼠水平上靶向乳腺癌模型。
(a)流式细胞仪检测纳米材料对乳腺癌细胞MDA-MB-468及乳腺上皮细胞的细胞结合行为;
(b)激光共聚焦显微镜观察纳米材料在MDA-MB-468中的亚细胞定位行为;
(c)Real-time PCR检测MDA-MB-468及乳腺上皮细胞的腺苷受体的转录水平;
(d)沉默A1R后检测NPs-AMP对MDA-MB-468的靶向行为;
(e)时间依赖型纳米材料对MDA-MB-468移植瘤裸鼠的靶向成像;
(f)对(e)进行肿瘤荧光/背景荧光比值量化分析;
(g)(a)中36h时间点正常器官及肿瘤组织的离体成像;
(h)图(g)中器官或组织的荧光强度比率的量化分析。
图12、纳米材料与MDA-MB-468膜蛋白A1R的共定位分析。采用免疫荧光染色进行分析,结果表明,MDA-MB-468富含A1R,在纳米材料孵育细胞3h后,NPs-AMP(6μg/ml,red)显著与A1R呈现出共定位现象,相比之下,NPs在MDA-MB-468细胞中积累的量非常少且与A1R没有共定位现象。标尺:10μm。
图13、Real-time PCR分析MDA-MB-468细胞中A1R的转录水平。结果表明,RNA干扰技术显著降低了MDA-MB-468细胞中A1R的转录水平,降低量为77%。
图14、纳米材料在乳腺癌MDA-MB-468移植瘤中的定位分析。对图11(g)样品进行免疫组织化学分析。
(a)纳米材料与肿瘤血管蛋白CD31的共定位分析;
(b)纳米材料与细胞骨架蛋白α-tubulin的共定位分析。
标尺:10μm。
图15、结肠癌及乳腺癌细胞中A1R依赖的纳米材料靶向行为。
(a)流式细胞仪检测纳米材料对3株代表性结肠癌细胞的靶向行为;
(b)Real-time PCR检测(a)中3株代表性结肠癌细胞中A1R转录水平;
(c)流式细胞仪检测纳米材料对3株代表性乳腺癌细胞的靶向行为;
(d)Real-time PCR检测(c)中3株代表性乳腺癌细胞中A1R转录水平。
具体实施方式
本发明人经过广泛的研究,意外地发现一种新的可靶向肿瘤细胞的化合物――腺苷5′-单磷酸(AMP),其通过识别肿瘤细胞表面表达的腺苷A1受体发挥靶向作用,其可与一些可检测标记物如与荧光标记相连接制备靶向性诊断肿瘤的制剂,其还可与一些具有抑制肿瘤活性的物质相连接制备靶向性抑制肿瘤的制剂。
术语
如本文所用,“腺苷5′-单磷酸”(Adenosine-5-monophosphoric acid)又称为“单磷酸腺苷”或“一磷腺苷酸”等,其分子式为C10H14N5O7P;其结构式如下:
如本文所用,除非另外说明,所述的“肿瘤”是表面过表达或高表达腺苷A1受体的肿瘤。例如,所述的肿瘤包括:结肠癌,乳腺癌。
如本文所用,所述的“过表达腺苷A1受体”或“高表达腺苷A1受体”是指在肿瘤细胞表面,腺苷A1受体的表达量与一般细胞(常规组织细胞,如肠正常细胞)相比,有大于5倍的表达量上调,较佳地有高于10倍的表达量上调,更佳的有高于50倍的表达量提高;如表达量提高100倍以上、200倍以上、500倍以上、1000倍以上。
腺苷5′-单磷酸
腺苷是活细胞内的一种代谢中间产物。腺苷5′-单磷酸(AMP)是一种腺苷同系物,具有广泛的生理作用。目前有研究证实,AMP可以激活腺苷A1受体,表明腺苷及AMP都是腺苷A1受体的激动剂。但是,现有技术中目前还不清楚AMP是否可以携带其它物质并靶向腺苷A1受体。
本发明人在研究中意外地发现,AMP可以携带其它物质并靶向表面过表达的腺苷A1受体的肿瘤细胞。因此,本发明人认为,AMP及腺苷受体的相互识别可被应用于设计新的肿瘤靶向制剂。
基于本发明人的新发现,本发明提供了腺苷5′-单磷酸的用途,用于介导纳米材料靶向表面过表达或高表达腺苷A1受体的肿瘤。
AMP作为新的主动靶向配体,可以有效介导纳米材料通过腺苷A1受体靶向肿瘤(如结肠癌及乳腺癌),展现出在临床上诊断及治疗的潜力。
纳米材料
本发明中,所述的AMP可以与一些可检测标记物如与荧光标记相连接制备靶向性诊断肿瘤的制剂,或可以与一些具有抑制肿瘤活性的物质相连接制备靶向性抑制肿瘤的制剂。
所述的可检测标记物可以是能与AMP相连接的,且具有示踪性能的任何物质。作为本发明的优选方式,所述的可检测标记物是荧光纳米材料;更佳地为荧光共振能量转移式近红外纳米材料。所述的荧光共振能量转移式近红外纳米材料可以如下制备:以MEH-PPV为基质,采用PS-PEG-COOH将MEH-PPV及近红外染料NIR-775包裹起来制备纳米材料。应理解,其它本领域技术人员了解的制备带有荧光的纳米颗粒的方法也可被包含在本发明中。
纳米材料与AMP的连接
在本发明提供了纳米材料可以由AMP的介导而靶向肿瘤的启示下,应理解,任何可应用于将AMP与纳米材料相连接的方法或材料均可被应用于本发明中,被涵盖在本发明的方法中。所述的连接包括:共价连接,偶联,耦合,吸附,附着等。只要能将两者有效地组合在一起并使组合产物保留有靶向肿瘤的活性,任何方法均可被实施。
作为本发明的优选方式,所述的荧光共振能量转移式近红外纳米材料,即将PS-PEG-COOH对MEH-PPV及NIR-775进行包裹形成表面带有羧基的纳米颗粒,MEH-PPV接收激发光,产生可见区荧光,并将可见区光作为激发光源,激发近红外染料NIR-775产生近红外的荧光。由于氨基易于与羧基基团发生共价反应形成连接,并且,氨基还易于与磷酸基团发生共价反应形成连接。因此,可以采用包含至少2个氨基的化合物来将纳米材料(其表面上暴露有羧基)与AMP(其包含有磷酸基团)进行连接。
所述的包含至少2个氨基的化合物可以是多种化合物,只要其带有至少两个氨基,并且其本身不影响纳米材料或AMP的功能。作为本发明的优选方式,所述的包含至少2个氨基的化合物是NH2(CH2)nNH2;其中,n表示2-8,较佳地3-7(如4、5、6)的正整数。在本发明的具体实施例中,所采用的包含至少2个氨基的化合物是1,6-己二胺(HDA)。
在本发明的实施例中,制备了一种具体的AMP介导的靶向肿瘤的纳米传递系统,当将其在磷酸基团端偶联1,6-己二胺(HDA)获得AMP-HDA后,再将AMP-HDA通过共价偶联的方式偶联至表面暴露羧基的荧光共振能量转移式近红外纳米材料表面构成靶向纳米载体NPs-AMP,以未偶联AMP-HDA的纳米材料NPs作为阴性对照。结果显示,NPs-AMP显示了对结肠癌细胞CW-2高的特异亲和力,且这种靶向效应主要依赖于AMP与腺苷A1受体的特异性结合作用。并且,腺苷A1受体在结肠癌细胞中相对于正常肠细胞具有显著的上调表达。小鼠实验证实,NPs-AMP可以有效地靶向结肠癌肿瘤且进入到肿瘤细胞内部。更进一步,本发明人证实,NPs-AMP在细胞及小鼠水平具有主动靶向乳腺癌MDA-MB-468的能力。最后本发明人证实,NPs-AMP具有广泛靶向结肠癌及乳腺癌细胞的能力,且这种靶向作用与腺苷A1受体的表达呈现出正相关的趋势。
药物制剂
本发明还提供了包含本发明的靶向肿瘤的材料的组合物,该组合物可用于靶向肿瘤,发挥抑制肿瘤或诊断肿瘤的作用。所述的肿瘤是表达或高表达腺苷A1受体的肿瘤。其中,所述组合物(制剂)中,靶向肿瘤的材料是有效量的,如0.000001-50wt%;较佳的0.00001-20wt%;更佳的,0.0001-10wt%。
如本文所用,所述“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
如本文所用,所述“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体,包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体:它们本身并不是必要的活性成分,且施用后没有过分的毒性。
合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体,如水、盐水、缓冲液。另外,这些载体中还可能存在辅助性的物质,如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。
在得知了所述特异性靶向肿瘤的材料的用途后,可以采用本领域熟知的多种方法来将所述的靶向肿瘤的材料或其组合物给药于哺乳动物。包括但不限于:静脉注射、皮下注射、肌肉注射、经皮给予、局部给予、植入、缓释给予等;优选的,所述给药方式是非肠道给予的。
本发明还提供了一种用于诊断或抑制肿瘤的药盒,其中含有本发明的靶向肿瘤的材料或其组合物(制剂)。此外,为了方便给药,所述的药盒中还可含有注射用的针,和/或药学上可接受的载体,和/或使用说明书。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著,分子克隆实验指南,第三版,科学出版社,2002中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
以荧光纳米材料作为载体,首先将AMP的磷酸根偶联1,6-己二胺(HDA)制得AMPHDA,随后将AMPHDA共价偶联至表面带有羧基的荧光纳米材料表面制备成靶向纳米材料NPs-AMP,以未偶联的纳米材料NPs作为阴性对照。细胞水平以结肠癌细胞系CW-2,乳腺癌细胞系MDA-MB-468为模型进行细胞的靶向实验,小鼠水平,以种植有CW-2及MDA-MB-468的裸鼠为实验模型进行靶向实验验证。同时在细胞水平针对更广泛的结肠癌及乳腺癌模型进行了靶向实验。
实施例1、AMP功能化纳米材料的制备
首先制备了荧光共振能量转移式荧光纳米材料,以纳米材料poly2-methoxy-5-((2-ethylhexyl)oxy)-p-phenylenevinylene](MEH-PPV)为基质,结合近红外染料NIR775及polystyrene graft ethylene oxide functionalized with carboxyl groups(PS-PEG-COOH),采用纳米共沉淀的方式制备成表面暴露羧基的荧光共振能量转移式荧光纳米材料NPs(如图1b)。具体地,将5ml四氢呋喃混合液(含有MEH-PPV,40μg ml-1;NIR-775,0.6μgml-1;PS-PEG-COOH,60μg ml-1)快速加入到10ml超纯水中,同时进行超声波处理,持续约15min。制备的溶液即为自组装方式下生成的近红外纳米材料。使用旋转蒸发仪,采用真空加热的方式去除材料溶液中的四氢呋喃,旋转蒸发大约30min,至纳米材料液体无刺鼻气味,即说明四氢呋喃已去除干净,置于避光处备用。
将1,6-己二胺(Hexamethylenediamine,HDA)与腺苷单磷酸(adenosine5-monophosphate,AMP)的磷酸根相偶联制备成AMP-HDA(如图1a)。具体地,将AMP 744g与1,6-己二胺928g一起放入圆底烧瓶,加入0.8mL超纯水及3.2mL 4M HCl,搅拌至澄清,用80-200μL 1M HCl调节pH至6.5。
两分钟内缓慢加入1.92g EDC(会缓慢放热),室温条件下,缓慢旋转反应90min。
阳离子树脂的准备:称取阳离子交换树脂25g,用去离子水清洗两次,向其中加入300ml去离子水,用2N NaOH(加约5mL)调pH值至12,再次用去离子水反复洗涤,直至阳离子树脂水溶液pH~7(大约洗7-8次)。
将准备好的阳离子树脂装入4个树脂柱(约1cm×20cm规格),每个树脂柱装入约5cm高的树脂。先加入去离子水,保持湿润,夹子夹住,按照1ml反应液:3ml去离子水的比例将反应液平均加入到4个树脂柱中,放开夹子,使过滤后的液体往下滴,接收集管收集纯化后的液体,通过TLC点板的方式确定产物的有无。收集的液体应该是,TLC点板后有AMP-HDA,而没有HDA。
将收集的纯化后的混合液放入玻璃平皿中,-80℃冷冻2h,然后采用冷冻干燥的方式,冷冻干燥过夜(-50℃)。待样品变为白色结晶粉末后,收集样品,放入-20℃冰箱保存待用。
最后将AMP-HDA与荧光纳米材料共价偶联制备成靶向纳米材料NPs-AMP。具体制备方法为:偶联反应配比为:500μg纳米材料溶液,0.05mg AMP-HDA,0.33mg EDC,200μl HEPES(1M),置于旋转蒸发仪上旋转反应1h,温度设置为室温。
实施例2、AMP功能化纳米材料的表征
透射电镜结果显示,NPs-AMP及NPs呈圆形,粒度均匀(如图2a,图3a)。动态光散射检测纳米粒子的水合粒径,结果显示,当偶联AMP-HDA后,纳米材料的粒径由53nm增加至57nm(如图2b)。
凝胶电泳条件方法:采用0.5%琼脂糖凝胶进行电泳,电压设置为150V,电泳时间为30min。凝胶电泳结果显示NPs-AMP在0.5%凝胶电泳中相比NPs有一个较慢的迁移率(图3b),这是由于偶联AMP-HDA之后改变了纳米材料的表面电荷及粒径。这些结果表明,AMP被成功偶联到了纳米材料的表面。
测定每个纳米材料表面可以偶联的AMP数目。纳米材料的浓度计算为27.6nM(A=εbC,ε593=3,825,000)。X射线荧光光谱测试元素磷(AMP的量等同于元素磷的量)的浓度为122.5nM,所以每个纳米材料偶联4.4个AMP AMP(图3c)。
采用酶标仪测定纳米材料的紫外吸收光谱及荧光发射光谱。NPs-AMP展示了一种宽的紫外吸收光谱,其最大吸收峰在496nm处,相较于NPs的紫外吸收光谱,NPs-AMP的紫外吸收光谱有微小的蓝移(如图2c)。在494nm波长激发光激发下,NPs-AMP呈现出两个发射峰,一个为MEH-PPV发射峰,其峰值在594nm;另一个为NIR发射峰,其峰值为777nm,等同于NPs的发射光谱,更重要的是,NPs-AMP保持了NPs高的荧光强度(如图2c)。这些结果表明,AMP作为一个小分子配体,保持了NPs基本的荧光特性。
采用MTT法对纳米材料进行毒性检测,CW-2细胞复苏,培养2~3代后进行实验。将处于对数生长期的细胞进行传代,接种于96孔板中,接种密度为6×103细胞/孔(CW-2)。培养24h后,去除原培养液,将分散于新鲜的完全培养基中的不同浓度的纳米材料(NPs/NPs-AMP,0-100μg/ml)加入到96孔板中,每孔100μl。继续培养24h,然后采用MTT方法检测纳米材料的细胞毒性,方法为:向每孔中加入10μl MTT溶液(5mg/mL的溶液),4h后向孔板中加入10%SDS溶液,每孔100μL,37℃培养箱中放置过夜,使用酶标仪进行检测(OD570nm)。结果显示,NPs-AMP及NPs在5-100μg/ml材料浓度下都保持了对CW-2细胞高的细胞存活率(如图2d),表明偶联AMP-HDA未对细胞造成显著的额外毒性。此结果说明,AMP是一个生物可溶性小分子。
实施例3、NPs-AMP在细胞水平靶向结肠癌细胞
本发明人首先采用流式细胞仪的方法测试了NPs-AMP对典型结肠癌细胞CW-2的靶向能力,以分离于BALB/c小鼠的肠原代正常细胞为阴性细胞,以NPs为阴性材料,将一定浓度的靶向(NPs-AMP)与非靶向(NPs)纳米材料混合于新鲜培养基中,用以替换原细胞培养基,培养一定时间后进行流式检测。流式检测预处理方法及上机检测步骤为:(1)弃除培养基,用PBS洗涤孔板中贴壁细胞。(2)向6孔板中加入胰酶消化细胞,待大部分细胞即将要脱落时,表明细胞已消化充分,随即加入温浴的PBS/10%FBS终止消化,将细胞慢慢吹打下来。(3)收集细胞,将细胞吸到1.5ml离心管中,2000r.p.m,4℃条件下离心5min。(4)弃除上清,加入1ml PBS重悬细胞,上流式细胞仪进行检测。参数设置,激发波长:480nm滤光片;发射波长:780±30nm滤光片。
结果如图4a,对于CW-2细胞来说,NPs的非特异性结合非常微弱,但NPs-AMP相较于NPs,其纳米材料摄入量有一个40倍的增加。而对于原代肠正常细胞来说,NPs-AMP及NPs都呈现了对CW-2细胞非常弱的结合信号。且NPs-AMP的这种靶向行为呈现出显著的时间浓度依赖性(如图4b,c)。此结果表明,NPs-AMP具有显著癌细胞选择性靶向能力。
为了获得NPs-AMP与CW-2相互作用的细节,采用共聚焦显微镜对细胞的材料结合行为进行观察,细胞接种6孔板24h后,将混有不同种类的纳米材料(NPs及NPs-AMP,6μg/ml)的完全培养基(DMEM+10%胎牛血清)替换原有培养基,继续培养3h或24h后制片。结果如图4d,当孵育NPs-AMP 3h后,NPs-AMP呈现出明显的细胞膜聚集现象。24h后,NPs-AMP大量聚集在细胞质中,而相同条件下NPs却既没有聚集在细胞膜上,也没有聚集在胞质中,此结果表明,NPs-AMP可以特异性结合到CW-2细胞膜上,且慢慢内化入细胞质中。
总而言之,细胞实验证实,AMP可以作为一个靶向分子,介导纳米材料靶向结肠癌细胞而不靶向正常细胞。表明AMP是一个潜在的肿瘤靶向分子。
实施例4、腺苷A1受体(A1R)介导了纳米材料特异性靶向结肠癌细胞
本发明人猜测可能是AMP识别A1R或者A3R介导了纳米材料对结肠癌细胞的靶向作用。
为了验证上述假设,首先采用RT-PCR法检测了A1R或者A3R在结肠癌细胞CW-2及肠上皮细胞(IECs)中的表达水平(引物序列见补充材料表1),结果如图5a所示,RNA水平上,A1R在CW-2中有显著上调,是IECs中的1832倍,而A3R的表达在两种细胞中却没有差异。
进一步采用western-blot法对CW-2及IECs的A1R蛋白水平进行检测。结果表明,相对于IECs,CW-2在A1R的翻译水平仍然有一个显著的高表达(图5b)。此结果给予一个强烈的提示,是A1R而非A3R是CW-2细胞的生物标志物。
表1、本发明中所用PCR引物
为了研究NPs-AMP与CW-2细胞中高表达A1R的相互作用,本发明人采用免疫荧光技术进行研究,具体方法为:将纳米材料与细胞进行共孵育后,采用Santa-cruz的抗A1R抗体对细胞进行孵育,之后采用抗A1R抗体的绿色荧光二抗进行孵育,之后制片,拍照。结果如图5c所示,采用荧光抗体对A1R进行标记(绿色),结果显示CW-2表面大量富集A1R(图5c-III,4c-III’),NPs-AMP大量富集在细胞膜表面(图5c-IV)且NPs-AMP与A1R呈现出明显的共定位现象(图5c-I),在相同条件下,NPs几乎没有在CW-2细胞膜聚集(图5c-IV’)且没有呈现与A1R的共定位现象(图5c-I’)。此结果表明,NPs-AMP直接结合到CW-2表面高表达的A1R上。
为了更进一步研究是否是AMP与A1R的结合介导了NPs-AMP靶向传递到癌细胞中,本发明人采用8-CPT(A1R的抑制剂)抑制A1R的活性,处理方法为:选取腺苷A1受体的抑制剂8-cyclopentyltheophylline(8-CPT,10μM),将其与NPs-AMP(6μg/ml)混合后,加入到细胞培养基中,以不加抑制剂的NPs-AMP组作为阳性对照,孵育12h后进行流式细胞仪检测。结果如图5d,当抑制A1R后,NPs-AMP靶向CW-2细胞的能力明显减弱。
更进一步,本发明人采用基因沉默技术将A1R进行基因沉默,以带有病毒载体但不含沉默基因的组为对照组(shControl),以带有病毒载体且含有沉默基因的组为实验组(shA1R),具体方法为:将短的发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)序列克隆至含有U6启动子的pLKO.1-TRC逆转录病毒载体(Addgene)上,为排除慢病毒表达系统本身对细胞造成的额外影响,设置阴性对照,即空的干扰序列记为shControl,干扰序列记为shA1R。shRNA靶向序列为:
shControl:5′-CAAGATGAAGAGCACCAA-3′(SEQ ID NO:13);
shA1R:5′-TGGAGTACATGGTCTACTTCA-3(SEQ ID NO:14)。
将此载体与pCMV-dR8.91(Addgene)及pCMV-VSV-G(Addgene)共转染HEK-293细胞,使三者在HEK-293细胞中完成病毒包装过程,转染48h后,收集培养基上清(含有干扰基因的病毒颗粒),备用。
按照4×105细胞/孔的接种密度将CW-2细胞接种至6孔板,培养24h,将所述的培养基上清与新鲜培养基进行混合,替换原细胞培养基,每孔加入2ml混合液(约含有106pfu的慢病毒),继续孵育12h(此过程为干扰目的基因A1R),将培养基换为新鲜培养基,继续培养48h,使得细胞活力得到回复,此时即可用于NPs-AMP的靶向实验及检测A1R的沉默效果实验。
结果,测得shA1R组基因沉默量为70%(图6)。
靶向结果如图5e,在shControl中,NPs-AMP相对于NPs仍然具有强的靶向能力,而在shA1R组,NPs-AMP相对于NPs对CW-2细胞的靶向能力没有显著差异。此结果确证,AMP与A1R之间的相互作用介导了纳米材料的靶向传递。
实施例5、NPs-AMP小鼠水平靶向结肠癌肿瘤
对于靶向配体来说,主要挑战在于其在活体水平的靶向特异性。为了调查AMP是否能在活体水平介导纳米材料靶向结肠癌肿瘤。实验中采用NPs-AMP或NPs分别尾静脉注射接种有CW-2移植瘤的裸鼠体内(瘤的直径为0.25cm左右),采用活体成像仪对注射材料后的小鼠进行分时间点采样。结果如图7a所示,在NPs组,肿瘤部位并没有显著的荧光信号(圆圈处),其肿瘤荧光/背景荧光分别为1.5(12h),2.0(24h)和1.7(36h)(图7b)。相对比而言,NPs-AMP组具有显著的肿瘤靶向能力(图7a),其肿瘤荧光/背景荧光分别为3.3(12h),6.1(24h)和3.7(36h)。此结果显著表明,AMP有效促进了纳米材料主动靶向到结肠癌肿瘤部位。
进一步,本发明人检测了纳米材料对较大结肠癌肿瘤的靶向能力,待结肠癌移植瘤瘤块长至直径约0.5cm时,对其进行纳米材料的靶向成像实验。结果如图7e,7f,在NPs-AMP组发现了较强的肿瘤荧光信号(图7e),其肿瘤荧光/背景荧光的值分别为3.9(12h),6.9(22h)和8.8(33h)。此结果说明,NPs-AMP在较大肿瘤中展示了较强的靶向行为。
更进一步,本发明人对小鼠的主要器官及肿瘤组织进行离体拍照,取图7a中36h时间点的小鼠,将其处死并取其器官及组织。采用活体成像仪进行荧光拍照,结果如图7c所示,NPs-AMP组与NPs组相比,纳米材料在肿瘤部位聚集明显。通过量化分析发现,NPs-AMP组与NPs组相比,除了肾脏,大多数正常器官中的纳米材料都有不同程度的降低,而肿瘤部位的纳米材料含量有显著的提高(图7d)。此结果更进一步表明NPs-AMP特异性结合到结肠癌肿瘤部位。
为了更进一步追踪纳米材料在肿瘤部位的确切位置,本发明人对上述取得的肿瘤组织进行免疫组织化学分析,首先采用Alexa Fluor 488-conjugated anti-CD31antibody对肿瘤血管蛋白CD31进行标记(图8a-III,8a-III’),结果如图8a所示,NPs组纳米材料(以红色标记)在肿瘤组织中呈现出微弱的聚集现象(图8a-IV’),而NPs-AMP组纳米材料(以红色标记)大量聚集在肿瘤组织中(图8a-IV),同时发现NPs-AMP/NPs组纳米材料都没有明显的与蛋白CD31共定位的现象(图8a-I,8a-I’)。表明尾静脉注射纳米材料36h后,纳米材料已经深入到肿瘤组织的深处。为了更进一步追踪纳米材料在肿瘤组织中的位置,采用AlexaFluor 488-conjugated anti-α-tubulin antibody对细胞骨架蛋白α-tubulin进行染色(图8b-III,8b-III’),NPs-AMP组纳米材料大量富集在肿瘤组织中(图8b-IV)且与α-tubulin呈现出明显的共定位现象(图8b-I)。而NPs组纳米材料在肿瘤组织中没有明显的富集(图8b-IV’)且与α-tubulin没有显著的共定位现象(图8b-I’)。
此结果表明,在小鼠水平上,AMP显著促进了纳米材料进入到结肠癌肿瘤细胞内部。
实施例6、NPs-AMP在细胞水平及小鼠水平靶向乳腺癌细胞
基于以上结果,本发明人得出结论AMP与结肠癌中高表达的A1R介导了纳米材料在细胞及小鼠水平靶向结肠癌模型。为进一步扩展AMP在其它肿瘤中的纳米靶向传递作用。发明人选取典型乳腺癌细胞系MDA-MB-468,以分离于BALB/c小鼠的原代乳腺上皮细胞为阴性细胞。对NPs-AMP的靶向行为进行研究。
相类似地,相对于NPs,NPs-AMP并没有给MDA-MB-468带来明显的额外毒性(图9)。靶向结果如图10a所示,相对于NPs组来说,NPs-AMP组在MDA-MB-468细胞中纳米材料的摄入量提高了30倍,然而针对乳腺上皮细胞(mammary epithelial cells,MECs),NPs-AMP与NPs都没有明显的细胞靶向行为。NPs-AMP在MDA-MB-468细胞中呈现出时间浓度依赖的靶向行为(图10)。
共聚焦结果显示(图11b),NPs-AMP呈现了短时间(3h)结合在MDA-MB-468细胞细胞膜上,长时间(24h)进入到细胞质中规律,在相同条件下NPs组纳米材料呈现了非常微弱的纳米材料膜结合及进入细胞质的现象。进一步对A1R及A3R表达量进行检测,结果如图11c,MDA-MB-468与MECs相比,A1R有显著上调,上调倍数达到874倍,而A3R却没有上调现象。此结果暗示,A1R可能是MDA-MB-468的生物标志物,介导了NPs-AMP靶向MDA-MB-468细胞。
免疫荧光标记技术结果显示,NPs-AMP可以与MDA-MB-468细胞膜的A1R进行共定位(图12)。
更进一步,本发明人采用基因干扰技术对MDA-MB-468的A1R基因进行干扰,干扰量为77%(图13)。并对NPs-AMP的靶向行为进行研究,结果如图11d,在干扰对照组shControl中,NPs-AMP仍然保持着显著的靶向能力,而对干扰实验组shA1R,NPs-AMP对MDA-MB-468细胞的靶向能力大大下降。这些结果表明,AMP与A1R的相互作用介导了纳米材料选择性结合并内化入乳腺癌细胞中。
下一步,本发明人调查了AMP是否可以介导纳米材料在小鼠水平上靶向乳腺癌肿瘤。以种植有MDA-MB-468细胞的裸鼠为实验模型,当肿瘤直径达0.3cm时,尾静脉注射NPs-AMP或NPs,使用活体成像仪对小鼠的荧光信号进行分时间点采集。结果如图11e,11f,NPs-AMP组在24h内保持着对肿瘤组织持续的积累趋势,其肿瘤荧光/背景荧光的值依次为4.2(16h),7.3(24h),1.6(36h),而NPs组,肿瘤荧光/背景荧光的值处于微弱的水平。相应地,对36h时间点的小鼠进行处死,取其主要器官及肿瘤组织进行离体拍照,结果如图11g,NPs-AMP组与NPs组相比,纳米材料显著富集于肿瘤组织部位。对其进行量化分析,结果如图11h,当偶联AMP后,纳米材料在正常器官中的含量都有不同程度的下降,而在肿瘤组织中有显著上升。
进一步,采用免疫组织化学染色法对肿瘤部位的纳米材料进行定位分析,结果证实NPs-AMP可以被内化到肿瘤细胞的内部(图14)。
这些结果表明,NPs-AMP可以在小鼠水平靶向乳腺癌。
实施例7、NPs-AMP靶向更广泛的结肠癌及乳腺癌细胞
为了调查NPs-AMP具有更广泛的靶向结肠癌及乳腺癌细胞的能力,本发明人选取了3株结肠癌细胞SW620,Lovo,HCT116及3株乳腺癌细胞HS578T,T47D,MDA-MB-453作为研究模型,相应地以肠上皮细胞及乳腺上皮细胞为阴性细胞。
采用NPs-AMP及NPs对上述细胞进行材料的靶向能力检测及A1R表达量检测。结果如图15所示,在结肠癌模型中,NPs均表现出非常微弱的靶向结肠癌细胞的能力,而NPs-AMP对结肠癌细胞具有不同程度的靶向能力,其对应于NPs的增强倍数分别为SW620(4倍),Lovo(5倍),HCT116(14倍)(图15a)。
相应地,A1R的转录水平方面,结肠癌细胞相对于肠上皮细胞也有不同程度的增加,分别为SW620(27倍),Lovo(41倍)及HCT116(117倍)(图15b)。
通过对图15数据分析,本发明人发现NPs-AMP对结肠癌细胞靶向能力的强弱与结肠癌细胞中A1R的表达量呈正相关。同样的,本发明人也在乳腺癌细胞中发现了类似的规律(图15c,d)。
所有这些结果表明,AMP作为靶向分子具有更广泛的靶向过表达A1R的癌细胞的潜力。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (13)
1.一种靶向肿瘤的材料,其特征在于,所述的材料包括相连接的(1)和(2):
(1)荧光纳米材料;所述的荧光纳米材料是荧光共振能量转移式近红外纳米材料,其是以MEH-PPV为基质,采用PS-PEG-COOH将近红外染料NIR-775与MEH-PPV以纳米共沉淀的方式进行包裹形成的纳米材料;以及
(2)腺苷5′-单磷酸;
其中,所述的肿瘤是过表达腺苷A1受体的肿瘤。
2.如权利要求1所述的靶向肿瘤的材料,其特征在于,所述的(1)与(2)通过包含至少2个氨基的化合物相偶联,其中化合物的一个氨基与(2)的磷酸基团相连,另一个氨基与(1)荧光纳米材料表面暴露的羧基相连。
3.如权利要求2所述的靶向肿瘤的材料,其特征在于,所述的包含至少2个氨基的化合物是NH2(CH2)nNH2,其中,n表示2-8的正整数。
4.如权利要求3所述的靶向肿瘤的材料,其特征在于,n表示3-7的正整数。
5.如权利要求1-4任一所述的靶向肿瘤的材料,其特征在于,所述的肿瘤包括:结肠癌,乳腺癌。
6.权利要求1-4任一所述的靶向肿瘤的材料在制备靶向肿瘤从而检测或诊断肿瘤或抑制肿瘤的制剂中的用途;其中,所述的肿瘤是过表达腺苷A1受体的肿瘤。
7.如权利要求6所述的用途,其特征在于,所述的肿瘤包括:结肠癌,乳腺癌。
8.一种用于检测肿瘤或抑制肿瘤的制剂,其特征在于,其包含:
权利要求1-4任一所述的靶向肿瘤的材料;以及
药学上可接受的载体。
9.如权利要求8所述的制剂,其特征在于,所述的肿瘤包括:结肠癌,乳腺癌。
10.腺苷5′-单磷酸在制备用于介导纳米材料靶向肿瘤的制剂中的用途;其中,所述的肿瘤是过表达腺苷A1受体的肿瘤。
11.如权利要求10所述的用途,其特征在于,所述的肿瘤包括:结肠癌,乳腺癌。
12.一种制备靶向肿瘤的材料的方法,其特征在于,所述方法包括:将荧光纳米材料与腺苷5′-单磷酸相连,获得所述靶向肿瘤的材料;其中,所述的肿瘤是过表达腺苷A1受体的肿瘤;所述的荧光纳米材料是荧光共振能量转移式近红外纳米材料,其是以MEH-PPV为基质,采用PS-PEG-COOH将近红外染料NIR-775与MEH-PPV以纳米共沉淀的方式进行包裹形成的纳米材料。
13.如权利要求12所述的方法,其特征在于,所述方法包括:
使所述的荧光纳米材料表面暴露羧基;通过包含至少2个氨基的化合物将所述荧光纳米材料与腺苷5′-单磷酸相连;其中化合物的一个氨基与腺苷5′-单磷酸的磷酸基团相连,另一个氨基与荧光纳米材料表面暴露的羧基相连。
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