CN102188380A - 一种双重靶向肿瘤的纳米脂质体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药领域，更具体地，本发明公开了一种双重靶向肿瘤的纳米脂质体，含有ARYCRGD CFDATWLPPR多肽，本发明还公开了上述双重靶向肿瘤的纳米脂质体的制备方法及其在制备治疗抗肿瘤药物中的用途。

Description

一种双重靶向肿瘤的纳米脂质体及其制备方法

技术领域

本发明属于医药领域，更具体地，本发明公开了一种靶向肿瘤的纳米脂质体及其制备方法。

背景技术

近年来恶性肿瘤的发病率和死亡率呈明显上升趋势，已经成为威胁人类健康和生命的主要疾病。国际癌症研究机构的报道显示，1975年到2000年间，全球癌症病例数增长了一倍，每年新发病例约1200万，死亡患者超过700万。2010年癌症将跃居为全球的首要死因，2030年肿瘤患者人数将为现在的三倍，新发病例数将增至2000-2600万。

化疗是恶性肿瘤综合治疗中的主要手段之一，合理的化疗策略可显著延长肿瘤患者的生存时间，极大改善患者的生存质量。但目前常用的各种化疗药物在杀伤肿瘤细胞的同时对正常细胞也可能造成巨大的损伤。毒副反应的出现往往是限制药物剂量和使用的直接原因，其产生主要与化疗药物缺乏靶向性有关，某些毒副反应的产生也与药物的药代动力学和药效动力学行为欠佳及药物辅剂毒性相关。因此新型化疗药物的研发成为目前肿瘤领域研究的热点之一。

脂质体是一种主要由磷脂和/或胆固醇构成的类似于生物膜双分子层的囊泡状结构，由于磷脂分子具有一个亲水性的头部和两条疏水性的尾部，因此脂质体在水中平衡后具有双亲性质，既可用于包封脂溶性药物也可包封水溶性药物。脂质体有良好的组织相容性，且无毒无害，无免疫原性，因此其作为药物载体的研究越来越受到重视，这方面的发展十分迅速。

目前，许多学者开始致力于肿瘤靶向给药系统的研发。靶向给药系统即靶向制剂，是指借助一定的载体将药物通过局部、胃肠道或血液循环给药而选择性地浓集于靶器官、靶组织、靶细胞或细胞内结构的制剂。与普通制剂相比，肿瘤靶向制剂可以提高化疗药物的疗效，降低药物毒副作用，提高用药的安全性、有效性和可靠性。

针对肿瘤的特异性靶点众多，其中肿瘤血管是目前公认最佳的靶点，这与肿瘤及肿瘤血管的特性有关。实体瘤的生长和转移有赖于血管的生成，肿瘤的生长分为两期：无血管期和血管期。在无血管期，肿瘤主要依靠周围组织的弥散来获取营养物质和排泄代谢产物，瘤体直径一般不超过1-2mm；而到血管期，肿瘤内出现新生血管，并获得进一步生长的能力，肿瘤从而迅速生长并可发生转移。采用肿瘤新生血管作为靶点有诸多优势(Holig，P.，et al.，Novel RGD lipopeptidesfor the targeting of liposomes to integrin-expressing endothelial andmelanoma cells.Protein Eng Des Sel，2004.17(5)：p.433-41)，如药物可避开内皮细胞的屏障直接到达靶区，局部血管的破坏可影响依赖其血供的许多肿瘤细胞，肿瘤新生血管内皮细胞不易产生耐药等。对于实体瘤来说，药物直接导入肿瘤组织非常困难(Hambley，T.W.and W.N.Hait，Is anticancer drug development heading in the right direction？Cancer Res，2009.69(4)：p.1259-62.)，原因与肿瘤血管功能失常，血液灌注不良及肿瘤组织中淋巴组织功能异常，肿瘤组织间压增高(Jain，R.K.，Transport of molecules，particles，and cells in solid tumors.Annu RevBiomed Eng，1999.1：p.241-63.)，影响了药物从血管中的渗入有关。肿瘤血管的另一个特性是通透性增高，这在一定程度上似乎可以弥补药物难以渗入肿瘤组织的问题，但实际上这种方式并不十分有效，药物通过通透性增高的血管内皮进入肿瘤组织是粒径依赖性的，且不同的肿瘤内皮细胞通透性增高的程度不同(Maeda，H.，et al.，Tumor vascularpermeability and the EPR effect in macromolecular therapeutics：a review.JControl Release，2000.65(1-2)：p.271-84.，Iyer，A.K.，et al.，Exploiting theenhanced permeability and retention effect for tumor targeting.DrugDiscov Today，2006.11(17-18)：p.812-8.，Sugahara，K.N.，et al.，Tissue-penetrating delivery of compounds and nanoparticles into tumors.Cancer Cell，2009.16(6)：p.510-20.)。主动靶向血管的治疗则可以避免上述问题，进入血液循环的靶向药物可直接和靶点相结合，在肿瘤组织局部的血管中浓聚，局部增高的药物浓度也进一步有利于药物渗入肿瘤组织的内部。肿瘤血管破坏后，接受其血供的肿瘤细胞将继发死亡，因而药物无须进入肿瘤组织的内部即可发挥作用。同时，针对肿瘤血管的靶向分子许多也在肿瘤细胞表面高表达，因此主动靶向血管的药物可同时对血管内皮和肿瘤细胞起作用。

由于肿瘤血管内皮细胞在微环境的作用下呈异质性，不同类型的肿瘤中其表达的抗原和受体种类和数量不同，相同的配体或抗体与不同类型肿瘤血管内皮细胞的亲和力也有较大的差异，目前尚未发现一种靶分子可以高特异性、高亲和力地识别多种肿瘤。因此，设想采用双靶点策略来进一步提高多肽与血管内皮细胞或肿瘤细胞的特异性识别和结合能力。

理论上连接双靶点多肽的药物载体较连接单靶点多肽的药物载体有诸多优势。由于细胞表面抗原或受体的数量决定了靶向药物载体的定向释药能力(Park，J.W.，et al.，Anti-HER2 immunoliposomes：enhanced efficacy attributable to targeted delivery.Clin Cancer Res，2002.8(4)：p.1172-81.)，双靶点药物载体能够增加可识别的细胞数，进而增加药物载体与细胞的结合量；双靶位同时结合可增强药物载体与细胞间的结合能力，促进细胞对药物的摄取；双靶点策略可降低药物对非靶向细胞的毒性(Saul，J.M.，A.V. Annapragada，and R.V. Bellamkonda，Adual-ligand approach for enhancing targeting selectivity of therapeuticnanocarriers.J Control Release，2006.114(3)：p.277-87.)；此外还可通过两种不同的机制发挥抗肿瘤的作用等。

关于双靶点药物载体的研究甚少，能检索到的文献报道如下：McAteer等将血管内皮细胞粘附分子-1和P-选择素连接于氧化铁颗粒用于粥样硬化动脉内皮细胞的磁共振显像(McAteer，M.A.，et al.，Magnetic resonance imaging of endothelial adhesion molecules in mouseatherosclerosis using dual-targeted microparticles of iron oxide.ArteriosclerThromb Vasc Biol，2008.28(1)：p.77-83.)。表面连接整合素配体和半乳凝素特异多肽的脂质药物载体可增强磁共振造影剂的显像能力，还可用于提高抗肿瘤药物的疗效(Kluza，E.，et al.，Synergistic targeting ofalphavbeta3 integrin and galectin-1 with heteromultivalent paramagneticliposomes for combined MR imaging and treatment of angiogenesis.NanoLett，2010.10(1)：p.52-8.)。连接VEGF-2和抗整合素αVβ3抗体的微泡可增强卵巢癌移植瘤模型中肿瘤血管的超声成像能力(Willmann，J.K.，et al.，Dual-targeted contrast agent for US assessment of tumorangiogenesis in vivo.Radiology，2008.248(3)：p.936-44.)。连接叶酸分子和内皮细胞生长因子受体抗体的阿霉素脂质体及连接αCD19和αCD20双抗体的阿霉素脂质体被证实具有很好的肿瘤细胞毒作用(Laginha，K.，D.Mumbengegwi，and T. Allen，Liposomes targeted via two differentantibodies：assay，B-cell binding and cytotoxicity.Biochim Biophys Acta，2005.1711(1)：p.25-32.)。上述试验均将制备的双靶点药物载体与单靶点药物载体进行比较，结果显示双靶点药物有更好的肿瘤细胞特异性结合力，从实践上证实了双靶点策略的可行性。

深入分析上述研究可以发现，上述双靶点药物载体有一共同点，即研究者均将不同的独立的靶分子以一定比例混合后直接连接于药物载体表面。由于靶分子的有效连接数量与载药颗粒的靶向能力相关，故在载药颗粒表面积有限的情况下，载体表面的靶分子数量有限。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的发明人将两个不同结构的靶分子串联后再与载药颗粒相连，两个靶分子连接后空间构象互不影响，能维持各自原有的生物学活性，从而在功能上产生协同效应。

本发明公开了一种双重靶向肿瘤的纳米脂质体，含有ARYCRGDCFDATWLPPR多肽；

本发明提供的双重靶向肿瘤的纳米脂质体主要由三部分组成，ARYCRGDCFDATWLPPR多肽，脂质连接物和脂质体纳米粒。

本发明还公开了上述双重靶向肿瘤的纳米脂质体的制备方法，首先合成双重靶向肿瘤的ARYCRGDCFDATWLPPR多肽，然后合成多肽接枝物，制备双重靶向肿瘤纳米脂质体。

本发明还公开了上述上述双重靶向肿瘤的纳米脂质体在制备治疗抗肿瘤药物中的用途。

首先，本发明采用固相合成法获得双重靶向肿瘤的多肽，所述多肽的氨基酸序列如下：ARYCRGDCFDATWLPPR。其中ARYCRGDCFDG：其核心结构为RGD三肽，即精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp)序列，针对靶点是整合素αV家族。αV整合素为细胞黏附分子家族的重要成员之一，是一组跨膜糖蛋白受体，通过参与内皮细胞的激活和迁移、介导内皮细胞增殖、抑制内皮细胞凋亡、参与碱性成纤维细胞生长因子和VEGF诱导的血管生成、诱导环加氧酶2的产生等多种途径促进肿瘤的发生发展。αV整合素高表达于活化的肿瘤血管内皮细胞和肿瘤细胞表面，在生理状态下静止的血管内皮细胞和正常组织器官内呈低表达。药物载体连接含RGD序列的短肽后可显著增强其靶向肿瘤的能力。ATWLPPR序列是从噬菌体肽库中筛选出来的一个含有7个氨基酸残基的短肽，针对的靶点为VEGFR2的共受体神经内皮素-1(Neuropilin-1，NRP-1)。VEGFR-2(Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2)是VEGF/VEGFR家族成员，主要识别低分子量的VEGF(含110-165个氨基酸残基的VEGF)，在血管内皮细胞迁移、增殖、存活及血管通透性调节中起重要作用。NRP-1是一种非酪氨酸跨膜糖蛋白，是VEGFR-2的辅助受体，和VEGFR-2的共表达可显著促进VEGF165与VEGFR-2的结合，增强VEGF165介导的生物学作用，促进血管内皮的增殖。NRP-1亦高表达于活化的肿瘤血管内皮细胞和肿瘤细胞表面，在生理状态下静止的血管内皮细胞和正常组织器官内呈低表达。

本发明采用Fmoc固相合成法合成了多肽配体-赖氨酸-甘氨酸-甘氨酸-棕榈酸(lysine-glycine-glycine，KGG-pal)联结物(结构见附图1)，连接新型多肽和脂质体载药纳米粒。KGG序列是带正电荷的疏水性三肽，研究证实其连接14碳的脂肪酸后可稳定连于脂质体表面。由于赖氨酸具有两个氨基，故可同时与两个棕榈酸分子偶合，以模拟磷脂分子的两条疏水性长烃基链，插入脂质体双分子层后可显著增加多肽连接的牢固性。

本发明采用薄膜超声分散法制备脂质体载药颗粒，采用薄膜过滤法或高压均质法控制脂质体粒径在60-200nm。小粒径的纳米粒作为抗肿瘤药物载体有其独特优势。恶性肿瘤的侵袭性生长和转移有赖于血管的生成，虽然相对于正常血管来说，肿瘤组织中血管对药物的选择性渗透力较弱，内皮细胞间或细胞上的特异通道孔径更大，但最大直径仍不超过400nm。大粒径的脂质体在脾脏的截留更多，从血液中清除更快，到达肿瘤组织的脂质体明显减少。因此理论上小粒径长循环药物脂质体更易透过血管间隙发挥抗肿瘤的作用。

细胞学研究证实，本发明的含有RGD及ATWLPPR序列的双重靶向肿瘤的多肽修饰的脂质体纳米粒。新型多肽分子量小，核心载药颗粒粒径控制在60-100nm，故易穿透内皮细胞屏障进入肿瘤组织。研究证实，RGD及ATWLPPR序列连接后空间构象互不影响，能维持序列各自原有的生物学活性，从而产生协同效应。相较于只含有RGD或ATWLPPR序列的单靶向脂质体纳米粒，研发的双重靶向肿瘤的脂质体纳米粒有显著为优的与新生血管内皮细胞及肿瘤细胞的特异性结合力，可用于肿瘤显像和治疗领域。与无靶向及单靶向肿瘤的脂质体药物载体纳米粒相比，双重靶向肿瘤的脂质体药物载体纳米粒有更强的与新生血管内皮细胞及肿瘤细胞特异性结合能力。该药物载体可用于荷载多种药物如磁共振造影剂钆喷酸葡胺、抗肿瘤药物多西紫杉醇、阿霉素、喜树碱后，进一步用于恶性肿瘤的早期诊断和靶向治疗领域。

附图说明

图1：多肽配体-赖氨酸-甘氨酸-甘氨酸(lysine-glycine-glycine，KGG)-pal联结物的结构图；

图2：流式细胞仪检测荧光标记多肽与A549、HUVEC的结合能力实验结果；

其中左起第一组线为FITC-P4：FITC-ATWLPPR(单靶点多肽)；第二组线为FITC-P2：FITC-ARYCRGDCFDG(单靶点多肽)；第三组线为FITC-P16：FITC-ARYCRGDCFDATWLPPR(双重靶向多肽)。

图3：荧光酶标仪检测FITC标记多肽与A549细胞、HUVEC的结合能力实验结果；其中：

FITC-P1：FITC-ARYCRADCFDG(非血管靶向多肽)

FITC-P2：FITC-ATWLPPR(单靶点多肽)

FITC-P4：FITC-ATWLPPR  (单靶向多肽)

FITC-P16：FITC-ARYCRGDCFDATWLPPR(双重靶向多肽)

(*vs FITC-P1P＜0.05；# vs FITC-P2＜0.05；Δvs FITC-P4P＜0.05)

图4：荧光倒置显微镜下观察各荧光脂质体与细胞结合力实验结果；其中：A-D：A549细胞；E-H：HUVEC；A、E：非靶向荧光脂质体；B、F：ARYCRADCFDG-荧光脂质体；C、G：ATWLPPR-荧光脂质体；D、H：ARYCRGDCFDATWLPPR-荧光脂质体。

图5：粒度分析结果(5-1)，透射电镜下粒径结果(5-2)。

具体实施方式

实验材料

1.细胞和试剂

HUVEC(Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVEC)及A549细胞(肺腺癌细胞系)由上海市肺科医院中心实验室提供；Dulbecco′s Modified Eagle Media(DMEM高糖细胞培养基)购自Invitrogen公司；新生牛血清购自奥地利PAA公司；Coulter Isoton III稀释液购自美国BECKMAN公司；青霉素、链霉素、胰蛋白酶等购自华美公司；荧光标记多肽委托吉尔生化(上海)有限公司合成。

2.溶液配制

3.仪器设备及耗材

细胞培养瓶及多孔培养板(丹麦NUNC公司)；CO2培养箱(日本SANYO公司)；CA-1390-1循环气流垂直净化工作台(上海上净净化设备有限公司)；DK-S24型电热恒温水浴锅(上海精宏试验设备有限公司)；液氮生物容器(成都金凤液氮生物容器有限公司)；TS-1型脱色摇床(江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；0412-1离心机(上海手术器械厂)；Coulter Epics XL流式细胞仪(美国BECKMAN公司)；Olympus CKX41倒置显微镜(日本Olympus公司)；FLX800荧光/发光酶标仪(美国Biotek公司)；Microlon荧光酶标板(GREINER公司)。

通过以下实施例进一步说明本发明，但不作为本发明的限制。

实施例1：单靶点及双重靶向肿瘤多肽的合成步骤

采用9-芴甲氧羰基(fluorenylmethyloxycarbonyl，FMOC)固相合成法合成双靶向多肽，采用高效液相色谱(high performance liquidchromatography，HPLC)法纯化，采用质谱鉴定。具体合成步骤如下：

1)树脂溶涨：将FMOC-AA-Wang-Resin树脂放入反应管中，加二甲基甲酰胺(N，N-dimethylformamide，DMF)(15ml/g)30min；脱保护：吸弃DMF，加20％哌啶DMF溶液(15ml/g)5min，吸弃后再加20％哌啶DMF溶液(15ml/g)15min；

2)检测：抽掉哌啶溶液，取树脂十几粒，用乙醇洗三次，加入茚三酮，氰化钾，苯酚溶液各一滴，105℃-110℃加热5min，变深蓝色为阳性反应。

3)洗涤：DMF(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次。

4)缩合：保护氨基酸(FOMC-Asp-OH)三倍过量，1-氧-3-双二甲胺羧基苯骈三氮唑四氟化硼盐三倍过量，均用尽量少DMF溶解，加入反应管，立刻加入N-甲基吗啉十倍过量，反应30min。

5)洗涤：DMF(10ml/g)一次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次；

6)重复操作步骤2)--6)，依次连接FMOC-Tyr-OH、FMOC-Thr-OH、FMOC-Met-OH、FMOC-Asn-OH、FMOC-Pro-OH、FMOC-Arg-OH、FMOC-Lys-OH、FMOC-Leu-OH、FMOC-Phe-OH；

7)最后一次洗涤：DMF(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次，DCM(10ml/g)两次；

8)裂解：裂解液(10ml/g)(含TFA 94.5％；水2.5％；EDT 2.5％；TIS 1％)120min；

9)吹干洗涤：氮气尽量吹干裂解液，乙醚洗涤六次，常温挥干。

10)密封，-20度保存。

所得为白色粉末状物质，HPLC纯化，纯度＞95％。

实施例2：流式细胞仪观察双靶向多肽与细胞的结合力

A549细胞和HUVEC培养于6孔板，待细胞＞90％培养板时，将异硫氰酸荧光素(FITC)标记的单靶点多肽(FITC-ATWLPPR、FITC-ARYCRGDCFDG)及双重靶向多肽(FITC-ARYCRGDCFDATWLPPR)采用不含血清的DMEM培养液稀释为终浓度2μmol/L加入各孔，37℃，5％恒温培养箱内孵育3h，PBS缓冲液(PH 7.4)洗涤后每孔加0.25％的胰酶消化，收集细胞，0.5mlCoulter Isoton III稀释液洗涤一次，再加0.5mlCoulter Isoton III稀释液漩涡混匀后上机采用F1通道检测细胞相对荧光强度(结果见图2)。

结果可见FITC-ARYCRGDCFDG和FITC-ARYCRGDCFDATWL曲线较FITC-ATWLPPR右移，即相对荧光强度较FITC-ATWLPPR明显增高，证实其对肿瘤细胞及血管内皮细胞具有特异性结合能力。定量研究表明，FITC-ARYCRGDCFDG荧光强度较FITC-ATWLPPR有2.3倍(A549细胞)-3.3(HUVEC)倍增高，FITC-ARYCRGDCFDATWLPPR荧光强度较FITC-ARYCRGDCFDG有6.2倍(A549细胞)-8.77(HUVEC)倍增高，提示FITC-ARYCRGDCFDATWLPPR与细胞亲和力最强、FITC-ARYCRGDCFDG次之、FITC-ATWLPPR最弱。

实施例3：荧光酶标仪观测双靶向多肽与细胞结合力

A549细胞和HUVEC接种于24孔板，待细胞＞90％培养板时，将FITC标记的多肽采用不含血清的DMEM培养液稀释为终浓度5μmol/L加入各孔，37℃，5％恒温培养箱内孵育3h，PBS缓冲液(PH7.4)洗涤3次后每孔加细胞裂解液200μL裂解细胞，取100μL加入荧光酶标板，采用荧光酶标仪检测荧光强度，吸收波长485/20nm，发射波长528/20nm，结果见附图3。

结果显示FITC-ARYCRGDCFDG、FITC-ATWLPPR和FITC-ARYCRGDCFDATWLPPR的相对荧光强度明显高于FITC标记的非血管靶向多肽FITC-ARYCRADCFDG，其中FITC-ARYCRGDCFDG组荧光强度为对照组的2.4倍(A549细胞)-3.8(HUVEC)倍，FITC-ATWLPPR组荧光强度为对照组的1.87倍(A549细胞)-3.01(HUVEC)倍，FITC-P16组荧光强度为对照组的7.4倍(A549细胞)-8.8(HUVEC)倍，进一步证实多肽ARYCRGDCFDG、ATWLPPR、P16对肿瘤细胞及血管内皮细胞具有良好的特异性亲和力，FITC-ARYCRGDCFDATWLPPR与细胞亲和力最强、FITC-ARYCRGDCFDG次之、FITC-ATWLPPR再次。

实施例4：双重靶向肿瘤的多肽接枝物的合成

在上述合成的多肽末端添加KGG氨基酸序列，在固相多肽合成仪上按照实施例1所述方法进行合成，缩合、脱保护完成后再加入棕榈酸的DMF溶液进行缩合，切割洗涤后，HPLC纯化，质谱仪鉴定，得到双重靶向肿瘤的多肽接枝物。

实施例5：荧光双重靶向肿瘤纳米脂质体的合成

荧光脂质体的配方为蛋黄卵磷脂(egg phosphatide，egg PC)；胆固醇(cholesterol，CHOL)；单甲氧基聚乙二醇2000二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(mPEG2000-DSPE)；二棕榈酸甘油磷脂酰胆碱三乙基铵盐丽丝胺罗丹明(Lissamine TM Rhodamine B1，2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine triethylammoniumsalt，Rhodamine DHPE)(摩尔比)9∶1∶0.5∶0.01；主动靶向荧光脂质体在上述配方中再加入不同脂质多肽(ATWLPPR-Pal、ARYCRGDCFDG-Pal)及双重靶向多肽(ARYCRGDCFDATWLPPR-Pal)，其与总脂mol比为1∶542；各荧光脂质体浓度按磷脂计均为10mg/mL。上述配方溶解于氯仿后置于旋转蒸发仪中，在37℃水浴中旋转成膜，蒸去氯仿，真空干燥后加入pH 7.4的PBS溶液继续旋转，充分溶胀至薄膜脱落，所得混悬液经超声细胞粉碎仪间歇超声至略带乳光，再经Mini-extruder挤出(1μm、0.4μm、0.2μm、0.1μm各10次)即得所需的脂质体溶液，4℃冰箱保存待用。

实施例6：荧光倒置显微镜检测双重靶向肿瘤的纳米脂质体与细胞结合力

A549细胞、HUVEC接种于6孔细胞培养板，37℃、5％CO2培养箱中过夜。细胞长至＞90％培养板时，更换无血清DMEM培养液2ml，每孔分别加200μl非靶向荧光脂质体和靶向荧光脂质体，5％CO₂，37℃培养箱中孵育4小时，倾去培养液，生理盐水洗涤后置荧光倒置显微镜下观察(见附图4)。

在A549和HUVEC两种细胞中，非靶向荧光脂质体与其非特异性结合力极弱，倒置显微镜下几乎看不到荧光素存在。连接了靶向多肽的主动靶向荧光脂质体(ARYCRGDCFDG-荧光脂质体、ATWLPPR-荧光脂质体、ARYCRGDCFDATWLPPR-荧光脂质体)则与细胞结合力明显增强，细胞膜被红色FITC不同程度染色，其中ARYCRGDCFDATWLPPR-荧光脂质体组细胞荧光强度最强。

实施例7：流式细胞仪检测双重靶向肿瘤纳米脂质体与细胞结合力

A549细胞、HUVEC接种于6孔细胞培养板(2×10⁵/孔)，37℃、5％CO2培养箱中过夜。更换无血清DMEM培养液2ml，每孔分别加200μl非靶向荧光脂质体、ARYCRGDCFDG-荧光脂质体、ATWLPPR-荧光脂质体、ARYCRGDCFDATWLPPR-荧光脂质体，培养箱中孵育2小时。倾去培养液，生理盐水洗涤2次，每孔加0.2％胰酶100μl消化细胞，吸去胰酶，加PBS液(pH 7.4)0.5ml回收细胞。细胞悬液移入试管，2000rpm离心5min，弃上清，加Coulter Isoton III稀释液0.5ml，漩涡混合后上机采用通道2检测，检测细胞数2.5×10³个，以减去本底的相对荧光强度值作为半定量的指标。检测结果如下表：

流式细胞仪检测非靶向及各靶向荧光脂质体与A549细胞、HUVEC的结合能力

*vs非靶向荧光脂质体P＜0.05；#vs ARYCRGDCFDG-荧光脂质体P＜0.05；Δvs ATWLPPR-荧光脂质体P＜0.05。

非靶向荧光脂质体与A549细胞、HUVEC结合后其相对荧光强度水平较低，三种主动靶向荧光脂质体与细胞结合后荧光强度均有不同程度的增高，本研究中采用如下公式评判荧光强度增高幅度。

相对荧光强度增幅＝100％×(主动靶向荧光脂质体相对荧光强度

-非靶向荧光脂质体荧光强度)/非靶向荧光

脂质体荧光强度

按此公式计算，ARYCRGDCFDG-荧光脂质体、ATWLPPR-荧光脂质体、ARYCRGDCFDATWLPPR-荧光脂质体的相对荧光强度增幅在A549细胞中分别为137.5％、88.6％、151.1％，在HUVEC中增幅分别为95.6％、81.4％、103.5％，其中ARYCRGDCFDATWLPPR-荧光脂质体增高幅度在两种细胞中均为最强。各组间差异均存在统计学意义(p＜0.05)。

实施例8双重靶向肿瘤纳米脂质体粒径检测

检测设备：JEM-1200EXII型透射电子显微镜(日本JEOL公司)、MASTERSIZER 2000激光粒度仪(英国Malvern公司)。

检测方法：双重靶向肿瘤的纳米脂质体10μL滴加于碳涂膜的铜网上，停留2分钟后滤纸吸取多余液体，醋酸双氧铀染5min后自然干燥，置透射电镜下观察，拍照。双重靶向肿瘤的纳米脂质体采用磷酸缓冲液(pH＝7.4)稀释后用激光粒度仪测定其粒度和粒度分布。

检测结果：双重靶向肿瘤的纳米脂质体粒径范围在60-120nm之间，粒度分析结果与透射电镜下所见(见附图5)相符。

Claims (4)

1.一种双重靶向肿瘤的纳米脂质体，其特征在于含有ARYCRGDCFDATWLPPR多肽。

2.根据权利要求1所述的双重靶向肿瘤的纳米脂质体，其特征在于主要由三部分组成：ARYCRGDCFDATWLPPR多肽，脂质连接物和脂质体纳米粒。

3.权利要求1或2所述的双重靶向肿瘤的纳米脂质体的制备方法，其特征在于首先合成双重靶向肿瘤的ARYCRGDCFDATWLPPR多肽，然后合成多肽接枝物，最后制备双重靶向肿瘤的纳米脂质体。

4.权利要求1或2所述的双重靶向肿瘤的纳米脂质体在制备治疗抗肿瘤药物中的应用。

Images