CN100489104C - 一种制备生物相容性非病毒基因传递体系的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备生物相容性非病毒基因传递体系的方法。它的步骤如下：(1)配置含聚乙二醇链段的两亲聚合物与阳离子聚合物的混合溶液，其中阳离子聚合物浓度为0.1～1mg/mL，两亲聚合物与阳离子聚合物的摩尔比为1∶1～5∶1；(2)配置浓度为50～500μg/mL的质粒DNA溶液；(3)步骤(1)溶液加入到等体积的步骤(2)溶液中，漩涡混合并静置，获得表面含聚乙二醇链段的非病毒基因组装体。本发明通过含聚乙二醇链段的两亲聚合物的自组装共混改性，制备聚乙二醇化的非病毒基因传递体系，可有效保护DNA分子的生物活性，降低细胞毒性，提高体内的稳定性，获得高生物相容性非病毒基因传递体系。
Description
技术领域
本发明涉及一种制备生物相容性非病毒基因传递体系的方法，它属于基因治疗领域新型高效非病毒基因传递体系的制备方法和技术。
背景技术
现代基因技术和人类基因组工程图谱的完成，为采用基因分子生物学方法治疗各类疾病，提高人类生命质量提供了广阔的前景。基因治疗成为当前最活跃的生物高技术领域之一。由于裸露的核酸分子难以在体液中稳定存在，在主要器官中只能实现低层次的表达，寻求能够实现广泛基因表达的基因传递体系成为基因治疗在大规模临床应用中的关键问题。病毒载体虽然具有较高的转染效率，但潜在的毒性、免疫原性及靶向性等问题限制了其在临床治疗中的应用。开发具有高效安全和组织特异性的高生物相容性非病毒基因传递体系具有非常重要的意义。
阳离子聚合物由于具有可控的结构、较低的免疫原性及优异的浓缩DNA分子的能力，受到越来越多的关注。阳离子聚合物能与DNA通过静电吸引形成电荷中和的疏水性核，而过量阳离子聚合物则在外层形成保护的壳层。但阳离子聚合物/DNA基因组装体在体内传递时，易与体内的血液成分及细胞外基质发生非特异性吸附，导致在体内的聚集并被网状内皮系统清除出体内，降低基因传递体系在体内的循环时间并影响基因转染效率。制备聚乙二醇(PEG)化的基因传递体系可有效解决上述问题。已有研究均是通过化学键合的方式将PEG链段引入到基因传递体系中，但这种方法制备复杂且影响了基因载体缔合DNA分子的能力。超分子组装体是利用分子间相互作用力，如亲水/疏水性作用、静电作用、氢键等自组装形成的聚集体。由于具有可控的结构及合适的纳米尺寸，采用超分子组装手段制备新型的非病毒基因传递体系具有广阔的应用发展前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备生物相容性非病毒基因传递体系的方法。
它的步骤如下：
(1)配置含聚乙二醇链段的两亲聚合物与阳离子聚合物的混合溶液，其中阳离子聚合物浓度为0.1～1mg/mL，两亲聚合物与阳离子聚合物的摩尔比为1：1～5：1；
(2)配置浓度为50～500μg/mL的质粒DNA溶液；
(3)步骤(1)溶液加入到等体积的步骤(2)溶液中，漩涡混合并静置，获得表面含聚乙二醇链段的非病毒基因组装体。
所述的阳离子聚合物为天然或合成阳离子聚合物。阳离子聚合物为聚乙烯亚胺(PEI)、聚赖氨酸(PLL)或壳聚糖(Chitosan)。含聚乙二醇链段的两亲聚合物为胆固醇—聚乙二醇(CPEG)、聚乙二醇—聚丙二醇—聚乙二醇(PEO-PPO-PEO)或聚氧乙烯硬脂酸盐(Polyoxyethylene stearate)。质粒DNA为pEGFP。
本发明的有益效果：
1)本方法制备方法简单。通过加入含PEG链段两亲聚合物的共混改性，采用超分子组装技术，可制备PEG化基因组装体。
2)本方法适用范围广泛。阳离子聚合物基因载体可以为合成的聚合物，包括聚乙烯亚胺、聚赖氨酸，也可以为壳聚糖天然聚合物分子。
3)本方法结构可控。通过调节阳离子聚合物的种类、含PEG链段两亲聚合物及阳离子聚合物的加入比例，可制备不同种类、不同PEG化程度的非病毒基因传递体系。
附图说明
图1是PEI25k/DNA组装体在生理盐溶液中放置4h后，pEGFP转染HEK293T细胞的相差显微镜图。
图2是PEI25k/DNA组装体在生理盐溶液中放置4h后，pEGFP转染HEK293T细胞的荧光显微镜图。
图3是PEI25k/CPEG/DNA组装体在生理盐溶液中放置4h后，pEGFP转染HEK293T细胞的相差显微镜图。
图4是PEI25k/CPEG/DNA组装体在生理盐溶液中放置4h后，pEGFP转染HEK293T细胞的荧光显微镜图。
具体实施方式
本发明采用超分子组装技术，通过加入含PEG链段的两亲聚合物作为共混改性剂，制备PEG化的非病毒基因传递体系。具体包括以下三个步骤：(1)配置含聚乙二醇(PEG)链段的两亲聚合物与阳离子聚合物的混合溶液，其中阳离子聚合物浓度为0.1～1mg/mL，两亲聚合物与阳离子聚合物的摩尔比为1：1～5：1；(2)配置浓度为50～500μg/mL的质粒DNA溶液；(3)步骤(1)溶液加入到等体积的步骤(2)溶液中，漩涡混合并静置。阳离子聚合物与DNA分子通过静电吸引形成电荷中和的疏水性核，而过量阳离子聚合物则在疏水性核外层形成保护的壳层。在阳离子聚合物/DNA疏水性核形成的过程中，含PEG链段两亲聚合物的疏水性基团与疏水性核之间通过疏水性的相互作用力，可将PEG链段引入到基因超分子组装体中，获得表面含PEG链段的非病毒基因传递体系，保护DNA分子的生物活性。由于PEG链段具有很强的水合作用，在体内能阻抗各种蛋白质的非特异吸附、延长体内循环时间、降低细胞毒性、提高其在体内的稳定性，有效提高阳离子聚合物非病毒基因传递体系的生物相容性及基因转染效率。
实施例1：
配置NaCl浓度为20mM、pH为7.4、浓度为20mM的N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸(HEPEs)缓冲溶液。采用该缓冲溶液，配置聚乙烯亚胺(PEI，分子量为25000)与胆固醇—聚乙二醇(CPEG，分子量为1706)的混合溶液，其中PEI浓度为0.15mg/mL，CPEG与PEI的摩尔比为2：1。选用绿色荧光蛋白报告基因pEGFP(4733bp)为目的基因，配置浓度为100μg/mL的缓冲溶液。取250μl上述PEI与CPEG的混合溶液加入到等体积DNA溶液中，漩涡混合并静置30分钟，获得表面含PEG链段的聚乙烯亚胺类基因纳米粒子。
实施例2：
配置pH为5.0的醋酸钠/醋酸缓冲溶液，将壳聚糖(粘度55mPa.s，脱乙酰度大于92％)与聚乙二醇—聚丙二醇—聚乙二醇共聚物(PEO-PPO-PEO)溶于上述溶液中，使壳聚糖浓度达到1mg/ml，PEO-PPO-PEO与壳聚糖的摩尔比为5：1。配置浓度为500μg/mL的pEGFP缓冲溶液。取250μl上述壳聚糖与PEO-PPO-PEO的缓冲溶液加入到等体积的DNA溶液中，漩涡混合并静置，制备PEO-PPO-PEO共混改性的壳聚糖基因超分子组装体。
实施例3：
将胆固醇—聚乙二醇(CPEG，分子量1706)与聚赖氨酸(PLL，分子量为20000)溶解于pH为7.4的25mM Tris缓冲溶液中，其中PLL浓度为0.2mg/mL，CPEG与PLL的摩尔比为1：1～2：1。配置200μg/mL的pEGFP缓冲溶液。取250μl上述PLL与CPEG的缓冲溶液加入到等体积DNA溶液中，漩涡混合并静置30分钟，制得表面含PEG链段的非病毒基因传递体系。
实施例4：
配置NaCl浓度为20mM、pH为6.0、浓度为20mM的N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸(HEPEs)缓冲溶液。采用该缓冲溶液，配置聚乙烯亚胺(PEI，分子量为25000)与聚氧乙烯硬脂酸盐(Polyoxyethylene 40 stearate)的混合溶液，其中PEI浓度为0.1mg/mL，聚氧乙烯硬脂酸盐与聚乙烯亚胺的摩尔比为1：1。配置浓度为50μg/mL的pEGFP(4733bp)溶液。取250μl上述阳离子聚合物的混合溶液加入到等体积的质粒DNA溶液中，漩涡混合并静置，制得表面含PEG链段的非病毒基因传递体系。
实施例5：
按实施例1制备的胆固醇—聚乙二醇(CPEG)共混改性聚乙烯亚胺类基因纳米粒子，由于表面PEG链段的存在导致ξ-电位显著降低。采用动态光散射、原子力显微镜及紫外—可见光谱研究组装体在生理盐条件下的稳定性。未经CPEG共混改性的PEI25k/DNA组装体在生理盐条件下仅放置1小时，就形成很大的聚集体；而按实施例1制备的胆固醇—聚乙二醇(CPEG)共混改性的基因组装体在测定的4h时间内，尺寸依然保持在150—300nm间。
实施例6：
按实施例2制备的PEO-PPO-PEO共混改性的壳聚糖基因组装体，在生理溶液中的溶解性和稳定性显著提高，生物相容性得到很大改善。由于壳聚糖仅溶于酸性溶液中，在pH为7.4的生理条件下，未经共混改性的Chitason/DNA基因组装体易从溶液中沉析出来。而经PEO-PPO-PEO共混改性的壳聚糖基因组装体由于表面的PEO链段具有很强的水合作用，在生理盐溶液壳聚糖组装体的溶解性及稳定性得到很大提高，从而提高壳聚糖基因传递体系的体内循环时间，提高其生物相容性。
实施例7：
按实施例3制备的CPEG共混改性的聚赖氨酸基因组装体，采用动态光散射、原子力显微镜及紫外—可见光谱研究组装体研究发现在生理盐条件下的稳定性得到很大提高，能延长体内循环时间，生物相容性得到有效改善。
实施例8：
按实施例4制备的聚氧乙烯硬脂酸盐共混改性的基因组装体，由于表面PEG链段的存在导致ξ-电位显著降低。动态光散射、原子力显微镜及紫外—可见光谱的研究结果表明，组装体在生理盐条件下的稳定性显著提高。凝胶电泳测定结果表明，组装体能有效保护DNA分子，避免酶解。
实施例9：
按实施例1制备的胆固醇—聚乙二醇(CPEG)共混改性聚乙烯亚胺类基因纳米粒子的基因转染实验。
首先将本发明实施例1制备的CPEG共混改性聚乙烯亚胺类基因纳米粒子与未共混改性的基因纳米粒子在生理盐溶液中放置4h，体外转染HEK293T细胞，转染36h后，在倒置荧光显微镜下观察实验结果。
图1、图2为未经CPEG共混改性的PEI25k/DNA基因组装体在生理盐溶液中放置4h后的pEGFP的转染结果。由于组装体在生理盐溶液中发生聚集，达到微米尺寸，绿色荧光蛋白的表达效率不高。
图3、图4为CPEG共混改性后的PEI25k/CPEG/DNA基因组装体在生理盐溶液中放置4h后的pEGFP的转染结果。由于组装体的生物相容性得到很大改善，在生理盐溶液中尺寸保持稳定，绿色荧光蛋白的表达效率显著提高。
Claims (4)
1.一种制备生物相容性非病毒基因传递体系的方法，其特征在于，它的步骤如下：
(1)配置含聚乙二醇链段的两亲聚合物与阳离子聚合物的混合溶液，其中阳离子聚合物浓度为0.1～1mg/mL，两亲聚合物与阳离子聚合物的摩尔比为1：1～5：1；
(2)配置浓度为50～500μg/mL的质粒DNA溶液；
(3)步骤(1)溶液加入到等体积的步骤(2)溶液中，漩涡混合并静置。
2.根据权利要求1所述的一种制备生物相容性非病毒基因传递体系的方法，其特征在于所述的阳离子聚合物为聚乙烯亚胺、聚赖氨酸或壳聚糖。
3.根据权利要求1所述的一种制备生物相容性非病毒基因传递体系的方法，其特征在于所述的含聚乙二醇链段的两亲聚合物为胆固醇—聚乙二醇、聚乙二醇—聚丙二醇—聚乙二醇或聚氧乙烯硬脂酸盐。
4.根据权利要求1所述的一种制备生物相容性非病毒基因传递体系的方法，其特征在于所述的质粒DNA为pEGFP。
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| 超分子组装构建非病毒基因传递体系的研究进展. 王幽香等.科学通报，第49卷第9期. 2004 |
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