CN101235384B - 一种新型非病毒阳离子型基因载体的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种新型非病毒阳离子型基因载体及其制备方法。首先使用氧阴离子聚合方法合成聚阳离子型电解质和含聚阴离子型电解质的嵌段共聚物，然后，通过静电力作用使聚阳离子型电解质与DNA在pH 7.4的盐溶液或缓冲溶液中相互复合，实现聚阳离子型电解质对DNA的包裹，且形成的“DNA/聚阳离子”复合物，其表面带正电荷，向体系中加入含聚阴离子型电解质的嵌段共聚物MePEO-b-PMAA，通过静电力作用与氢键作用使带负电荷的PMAA链段吸附在“DNA/聚阳离子”复合物表面，实现对复合物的包裹。本发明具有聚合反应条件温和、分子量可控以及分子量分布窄、基因载体制备方法简单、稳定性和生物相容性高、毒性低等特点。
Description
技术领域
本发明涉及生物医用高分子材料技术领域，具体涉及一种新型非病毒阳离子型基因载体的制备方法。
背景技术
基因治疗是一种对各种与基因相关、威胁到人类生命的疾病有重要潜在治疗作用的一种新的治疗方法。基因治疗在四十多年的发展道路上取得了很多惊人的成就，也遇到了很多困难。基因治疗要真正进入临床应用，还有一些根本问题没有解决，其中最重要的是安全、高效及可控的基因载体的构建。
目前基因治疗领域主要有三种不同的基因输送体系：(1)物理转染技术体系，如电穿孔和粒子轰击技术等，它们的使用一般局限于体表组织，并有一定的损伤，裸DNA注射的转染效率相对较低。(2)病毒载体，包括反转录病毒，腺体病毒和腺体相关病毒等，已在体外实验中显示了较高的转导效率；然而，病毒载体大多需要保留野生病毒的外壳和感染机制，在安全性方面存在某些隐患，如对载体外壳的免疫反应，基因随机整合的致癌性和潜在内源病毒重组等问题；同时，病毒载体缺乏体内的靶向机制，可控性比较差，如在肿瘤基因治疗中，病毒载体肿瘤基因治疗方案主要针对一些身体浅表可及的肿瘤，如皮肤癌，头颈部肿瘤等，进行瘤内或瘤周注射。(3)非病毒载体，主要依靠带正电荷的聚合物(如阳离子聚合物，带正电荷的脂质体等)将DNA包载成一定大小的DNA复合物进行传输。与病毒载体相比，利用非病毒载体进行DNA输送有许多优点：对受转移的DNA大小和数目没有限制；制备相对简单；低毒性；不发生外源基因随机整合；免疫原性问题较小以及安全性较高等。更重要的是在非病毒载体中可以根据具体应用设计相应的靶向作用机制，有效地降低毒副作用，提高作用效率。研究发现一些阳离子聚合物能将DNA包载成一定大小的DNA复合物，并帮助DNA转染(Miller，A.D.，Angew.Chem.，Int.Ed.1998，37，1768)，如聚赖氨酸(polylysine)，聚乙烯基亚胺(polyethylenimine)，聚氨基胺树型高分子(PAMAM dendrimer)，等等。
阳离子聚合物已广泛应用在体外基因传输中，例如公开号为CN101024090A的中国发明专利申请《一种基因传递复合物及其制备方法》，公开了一种由细菌纳米磁小体、聚乙烯亚胺和目的DNA组成的基因传递复合物；公开号为CN1757738A的中国发明专利《双靶向于成纤维细胞生长因子受体和整合素的转基因载体》，公开了一种双靶向于成纤维细胞生长因子受体和整合素的转基因载体，包括与碱性成纤维细胞生长因子受体特异结合的多肽CR16、与整合素特异结合的多肽CP9、CR16/CP9/阳离子多聚物PEI/外源DNA的基因转移非病毒载体复合物系统；公开号为CN101085356A的中国发明专利申请《一种非病毒基因转染载体、其与质粒DNA复合物颗粒及制备方法和用法》提供了一种含有苯环的疏水单元的水溶性聚乙烯亚胺改性物作为非病毒基因转染载体。
虽然有关阳离子聚合物与DNA相互作用形成DNA复合物的过程以及DNA复合物的物化性质的研究受到了很大重视，也有不少的报道，但是目前常用的阳离子聚合物作为基因载体的一个很大的局限性在于聚合物分子的大小和价态的非均一性，这种非均一性直接导致所制备的载体组成和结构的不同，给生物体内的释放研究带来巨大的困难。
此外，由于非病毒载体/DNA复合物的体内输送最主要的方式是血液传输，因此，必须制备在血液中稳定、在体内能长时间循环的基因输送载体，将载体包载的DNA复合物通过静脉给药的方式，将治疗基因靶向输送到特定的组织和细胞中。为了解决复合物稳定性与相容性问题，文献报道了大量的方法，主要包括两大类方式：一、聚合物的化学修饰，以甲基丙烯酸-2-(二甲氨基)乙酯(PDMAEMA)为例：DMAEMA(Biomacromolecules 2003，4，683)，PDMAEMA-co-PMMA，PDMAEMA-co-PtriEGMA，PDMAEMA-co-PNVP(J.Control.Release.1998，53，145)，PDMAEMA-b-POEGMA，PDMAEMA-b-PEG，PDMAEMA-stat-PEGMA(J.Control.Release.2001，73，359；Langmuir 2006，22，3744)，PDMAEMA-b-PMPC(Langmuir 2005，21，3591；J.Control.Release.2004，100，293)，PDMAEMA-b-Pluronic L92(Bioconjugate Chem.2005，16，626)，上述聚合物的合成多采用活性聚合的方法，如最常用的是采用ATRP引发体系，虽然分子量以及分子量分布得到了控制，但是存在反应后体系的金属盐类难以除去以及合成难度较大等问题。二、复合物的包埋方法，包埋方法主要通过以下方式进行：首先聚阳离子聚合物与DNA形成复合物，然后使用阴性或中性的脂质体对其包裹。这种包埋的方法简单，解决了生物体的相容性问题，但同时体外细胞转染表明，它的转染效率却有所降低。
因此，结合聚合物的化学后修饰与脂质体包埋两种方法的优点，设计出一种合成方法简单、包载容易、生物相容性好、转染效率高的基因载体，将有助于推动基因治疗的发展。
发明内容
本发明的目的在于提出一种新型非病毒阳离子型基因载体及其制备方法，以及利用基因载体负载DNA的技术方案。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种新型非病毒基因载体的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)采用氧阴离子聚合法合成聚阳离子型电解质，即端基为生物基团的聚甲基丙烯酸-2-(烷基取代的氨基)乙酯；
(2)采用氧阴离子聚合法合成含聚阴离子型电解质的嵌段共聚物，即聚乙二醇单甲醚与聚甲基丙烯酸的嵌段共聚物MePEO-b-PMAA；
(3)将步骤(1)所得聚阳离子型电介质溶解于pH 7.4的缓冲溶液中，超声分散，缓慢滴加DNA水溶液，搅拌2小时以上，实现聚阳离子对DNA的包裹，形成DNA/聚阳离子复合物溶液，该步骤中聚阳离子型电介质中的N原子个数与DNA中P原子个数比为4∶1～10∶1；
(4)将步骤(2)所得MePEO-b-PMAA共聚物溶解于pH 7.4的缓冲的溶液中，超声分散，缓慢滴加到步骤(3)所得DNA/聚阳离子复合物溶液中，搅拌2小时以上，实现聚阴离子PMAA链段对DNA/聚阳离子复合物的包裹，该步骤中聚阴离子PMAA链段中羧基的数目与聚阳离子中氮原子的数目比为1∶1～6∶1。
本发明中所述的聚阳离子型电解质由下列通式表达：
式中，n为10～120；
Rbio-OH选自
中的一种；
即：(1)维生素A1；(2)维生素A2；(3)维生素D3；(4)胆固醇；
(5)维生素D2；(6)橙花油醇；(7)薄荷醇；
R1选自
为了合成上述聚阳离子电解质，本发明采用氧阴离子引发聚合方法，包括下列步骤：
(1)制备引发剂：以四氢呋喃为溶剂，使含生物基团醇(RbioOH)与等物质量的氢化钾(KH)搅拌反应4～12小时，形成生物基团氧阴离子(RbioO-K+)，作为引发剂；
(2)将引发剂与单体甲基丙烯酸-2-(烷基取代的氨基)乙酯以摩尔比1∶10至1∶120构成聚合体系，搅拌，反应0.5～1.5小时；
(3)用甲醇终止反应，提纯，即获得所需的端基为生物基团(Rbio-)的聚甲基丙烯酸-2-(烷基取代的氨基)乙酯。
在中性及弱酸性介质中，聚甲基丙烯酸(烷基取代的氨基)乙酯的侧基易被质子化，形成聚阳离子型电解质。
上述技术方案中，在生成引发剂时，必须保持RbioOH与KH等物质的量反应，温度保持在45℃左右，体系处于氩气氛中，保持无水无氧状态。
在实际制备时，为保证产物的纯度，可以先对原料进行精制，其方法是，甲基丙烯酸-2-(烷基取代的氨基)乙酯使用前用活化的碱性Al2O3柱处理，然后用CaH2干燥12h以上，在高纯的N2保护下进行减压蒸馏；KH封存在矿物油中备用；溶剂四氢呋喃(THF)用氢氧化钾干燥三天，加入二苯甲酮作为指示剂，用钠丝进行无氧回流，直至呈深紫色，使用前蒸出。
本发明中所述含聚阴离子型电解质的嵌段共聚物MePEO-b-PMAA，由下列通式表达：
式中，x为10～400；y为10～120。
为合成上述嵌段共聚物MePEO-b-PMAA，使用以下合成方案：采用氧阴离子引发聚合方法，引发甲基丙烯酸叔丁酯，然后对其水解，具体包括下列步骤：
(1)制备引发剂：以四氢呋喃为溶剂，使MePEO与等物质量的氢化钾搅拌反应4～6小时，形成MePEO链末端氧阴离子，作为引发剂，温度保持在45℃左右，体系处于氩气氛中，保持无水无氧状态；
(2)将引发剂与单体以摩尔比1∶10至1∶120构成聚合体系，搅拌，反应0.5～1.5小时；
(3)用甲醇终止反应，提纯；
(4)以二氯甲烷为溶剂，在三氟乙酸存在的条件下，对聚合物水解，提纯，即获得所需的在中性或弱碱性条件下含聚阴离子链段的共聚物MePEO-b-PMAA。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：
1.本发明利用氢化钾与等物质量的含羟基生物基团搅拌反应后，形成氧阴离子，利用氧阴离子引发的聚合方法，可以根据需要合成不同链长的聚阳离子，在聚合物中很容易地引入生物基团，合成步骤简单，反应速度快，转化率趋近100％，分子量可控，分子量分布较窄，而且产物纯净。
2.本发明利用MePEO末端羟基与氢化钾等物质量反应，形成氧阴离子，经聚合、水解反应，合成不同链长的含聚阴离子链段的共聚物MePEO-b-PMAA。聚阴离子PMAA链段可包裹“DNA/聚阳离子”复合物，而MePEO链段具有很好的亲水性和抗血栓性能。
3.本发明基于静电力作用与氢键作用，利用合成的聚电解质负载DNA，制备方法简单，条件易于控制。
具体实施方式
结合实施例一至四，描述合成聚阳离子型电解质的方法
实施例一：Chol(胆固醇)-PDMAEMA30的制备方法
(1)KH的准备：将搅拌转子预先放入干燥的反应瓶中，用翻口橡皮塞塞紧。然后用针头、乳胶管与真空泵相连，边抽真空边充入高纯氩气，如此反复操作三次。反应瓶内移入一定量的KH后，用干燥注射器注入5ml干燥的四氢呋喃(THF)，搅拌洗涤，静止后用注射器吸出含矿物油的THF，如此反复三次，最后用高纯氩气吹干残余的THF溶液。利用减量法精确称量反应瓶中KH的量(0.2～0.3g约5.0～7.5mmol)。
(2)引发剂的制备：将一定量的THF注射到装有KH的聚合瓶中。将反应瓶置入油浴中(45℃左右)，磁力搅拌，同时注入与KH等物质量的胆固醇(预先溶解在无水的THF中，氩气保护)，反应8～12h，使胆固醇和KH充分反应生成氧阴离子。
(3)聚合反应：接着将反应瓶移入25℃恒温油浴中，用干燥的注射器加入单体甲基丙烯酸-2-(二甲氨基)乙酯(DMAEMA)，与引发剂的摩尔比为30∶1，反应1～1.5h，最后用干燥的甲醇终止反应。反应后的聚合物，在60～70℃条件下，旋蒸除去溶剂，继续用冷的正己烷进行沉淀纯化，重复三次，最后在真空烘箱40～50℃干燥至恒重。得到所需产物，测得产率大于98％。产物经凝胶渗透色谱(GPC)和核磁共振氢谱(1H NMR)检测其分子量、分子量分布及聚合物的结构，证明获得了目标产物。
实施例二：Vitamin A(维生素A1)-PDMAEMA60的制备方法
(1)KH的准备：同实施例一。
(2)引发剂的制备：将一定量的THF注射到装有KH的聚合瓶中。将反应瓶置入冰水浴中，磁力搅拌，同时注入与KH等物质量的维生素A(预先溶解在无水的THF中，氩气保护)，反应2～4h，使维生素A与KH充分反应生成氧阴离子。
(3)聚合反应：接着将反应瓶移入25℃的恒温油浴中，用干燥的注射器加入单体甲基丙烯酸-2-(二甲氨基)乙酯(DMAEMA)，与引发剂的摩尔比为60∶1，反应1～1.5h，最后用干燥的甲醇终止反应。反应后的聚合物，在30～40℃条件下，旋蒸除去溶剂，继续用冷的正己烷进行沉淀纯化，重复三次，最后在真空烘箱20～30℃干燥至恒重。得到所需产物，测得产率大于98％。产物经凝胶渗透色谱(GPC)和核磁共振氢谱(1H NMR)检测其分子量、分子量分布及聚合物的结构，证明获得了目标产物。
实施例三：Nerol(橙花醇)-PDMAEMA120的制备方法
(1)KH的准备：同实施例一
(2)引发剂的制备：同实施例二
(3)聚合反应：接着将反应瓶移入25℃的恒温油浴中，用干燥的注射器加入单体甲基丙烯酸-2-(二甲氨基)乙酯(DMAEMA)，与引发剂的摩尔比为120∶1，反应2～3h，最后用干燥的甲醇终止反应。反应后的聚合物，在30～40℃条件下，旋蒸除去溶剂，继续用冷的正己烷进行沉淀纯化，重复三次，最后在真空烘箱20～30℃干燥至恒重。得到所需产物，测得产率大于97％。产物经凝胶渗透色谱(GPC)和核磁共振氢谱(1H NMR)检测其分子量、分子量分布及聚合物的结构，证明获得了目标产物。
实施例四：Chol(胆固醇)-PDMAEMA80的制备方法
(1)KH的准备：同实施例一
(2)引发剂的制备：同实施例一
(3)聚合反应：接着将反应瓶移入25℃的恒温油浴中，用干燥的注射器加入单体甲基丙烯酸-2-(二甲氨基)乙酯(DMAEMA)，与引发剂的摩尔比为80∶1，反应1～2h，最后用干燥的甲醇终止反应。反应后的聚合物，在50～60℃条件下，旋蒸除去溶剂，继续用冷的正己烷进行沉淀纯化，重复三次，最后在真空烘箱40～50℃干燥至恒重。得到所需产物，测得产率大于99％。产物经凝胶渗透色谱(GPC)和核磁共振氢谱(1H NMR)检测其分子量、分子量分布及聚合物的结构，证明获得了目标产物。
结合实施例五至八，描述含聚阴离子电解质聚合物的合成方法
实施例五：MePEO50-PMAA30的制备
(1)KH的准备：将搅拌转子预先放入干燥的反应瓶中，用翻口橡皮塞塞紧。然后用针头、乳胶管与真空泵相连，边抽真空边充入高纯氩气，如此反复操作三次。反应瓶内移入一定量的KH后，用干燥注射器注入5ml干燥的THF，搅拌洗涤，静止后用注射器吸出含矿物油的THF，如此反复三次，最后用高纯氩气吹干残余的THF溶液。利用减量法精确称量反应瓶中KH的量(0.2～0.3g约5.0～7.5mmol)。
(2)引发剂的制备：将一定量的THF注射到装有KH的聚合瓶中。将反应瓶置入油浴中(45℃左右)，磁力搅拌，同时注入与KH等物质量的MePEO50(预先溶解在无水的THF中，氩气保护)，反应4～6h，使KH和MePEO50充分反应生成氧阴离子。
(3)聚合反应：接着将反应瓶移入25℃的恒温油浴中，用干燥的注射器加入单体甲基丙烯酸叔丁酯(t-BMA)，与引发剂的摩尔比为30∶1，反应2～3h，最后用干燥的甲醇终止反应。反应后的聚合物，在60～70℃条件下，旋蒸除去溶剂，继续用冷的正己烷进行沉淀纯化，重复三次，最后在真空烘箱20～30℃干燥至恒重。得到所需产物，测得产率大于97％。产物经凝胶渗透色谱(GPC)和核磁共振氢谱(1H NMR)检测其分子量、分子量分布及聚合物的结构，证明获得了目标产物。
(4)水解反应：将聚合物溶解于二氯甲烷中，反应瓶至于冰水浴中，通过恒压滴液漏斗滴加一定量的三氟乙酸，2小时滴加完毕，在室温的条件下水解12小时，在30～40℃条件下，旋蒸除去溶剂，用冷的正己烷进行沉淀纯化，重复三次，最后在真空烘箱40～50℃干燥至恒重。产物经凝胶渗透色谱(GPC)和核磁共振氢谱(1H NMR)检测其分子量、分子量分布及聚合物的结构，证明获得了目标产物。
实施例六：MePEO200-PMAA60的制备
(1)KH的准备：同实例五。
(2)引发剂的制备：将一定量的THF注射到装有KH的聚合瓶中。将反应瓶置入油浴中(45℃左右)，磁力搅拌，同时注入与KH等物质量的MePEO200(预先溶解在无水的THF中，氩气保护)，反应8～10h，使KH和MePEO200充分反应生成氧阴离子。
(3)聚合反应：接着将反应瓶移入25℃的恒温油浴中，用干燥的注射器加入单体甲基丙烯酸叔丁酯(t-BMA)，与引发剂的摩尔比为60∶1，反应2～3h，最后用干燥的甲醇终止反应。反应后的聚合物，在60～70℃条件下，旋蒸除去溶剂，继续用冷的正己烷进行沉淀纯化，重复三次，最后在真空烘箱20～30℃干燥至恒重。得到所需产物，测得产率大于97％。产物经凝胶渗透色谱(GPC)和核磁共振氢谱(1H NMR)检测其分子量、分子量分布及聚合物的结构，证明获得了目标产物。
(4)水解反应：同实例五。
实施例七：MePEO400-PMAA120的制备
(1)KH的准备：同实例五。
(2)引发剂的制备：将一定量的THF注射到装有KH的聚合瓶中。将反应瓶置入油浴中(45℃左右)，磁力搅拌，同时注入与KH等物质量的MePEO400(预先溶解在无水的THF中，氩气保护)，反应8～10h，使KH和MePEO400充分反应生成氧阴离子。
(3)聚合反应：接着将反应瓶移入25℃的恒温油浴中，用干燥的注射器加入单体甲基丙烯酸叔丁酯(t-BMA)，与引发剂的摩尔比为120∶1，反应2～3h，最后用干燥的甲醇终止反应。反应后的聚合物，在60～70℃条件下，旋蒸除去溶剂，继续用冷的正己烷进行沉淀纯化，重复三次，最后在真空烘箱20～30℃干燥至恒重。得到所需产物，测得产率大于97％。产物经凝胶渗透色谱(GPC)和核磁共振氢谱(1H NMR)检测其分子量、分子量分布及聚合物的结构，证明获得了目标产物。
(4)水解反应：同实例五。
实施例八：MePEO17-PMAA10的制备
(1)KH的准备：同实例五。
(2)引发剂的制备：将一定量的THF注射到装有KH的聚合瓶中。将反应瓶置入油浴中(45℃左右)，磁力搅拌，同时注入与KH等物质量的MePEO17(预先溶解在无水的THF中，氩气保护)，反应3～4h，使KH和MePEO17充分反应生成氧阴离子。
(3)聚合反应：接着将反应瓶移入25℃的恒温油浴中，用干燥的注射器加入单体甲基丙烯酸叔丁酯(t-BMA)，与引发剂的摩尔比为10∶1，反应2～3h，最后用干燥的甲醇终止反应。反应后的聚合物，在60～70℃条件下，旋蒸除去溶剂，继续用冷的正己烷进行沉淀纯化，重复三次，最后在真空烘箱20～30℃干燥至恒重。得到所需产物，测得产率大于97％。产物经凝胶渗透色谱(GPC)和核磁共振氢谱(1H NMR)检测其分子量、分子量分布及聚合物的结构，证明获得了目标产物。
(4)水解反应：同实例五
下面结合实施例九至十二，描述新型非病毒阳离子型转基因载体负载包裹DNA的方法
实施例九：小牛胸腺DNA/Chol-PDMAEMA30/MePEO50-PMAA30
(1)通过静电力作用实现Chol-PDMAEMA30对小牛胸腺DNA的包裹：将Chol-PDMAEMA30溶解于pH 7.4磷酸盐缓冲溶液中，超声分散20分钟，缓慢滴加小牛胸腺DNA水溶液，并不断搅拌使之结合2小时以上，形成“小牛胸腺DNA/Chol-PDMAEMA30”复合物。该步骤中聚阳离子中N原子个数与DNA中P原子个数比为10∶1，通过溴乙锭取代实验与凝胶电泳实验证明Chol-PDMAEMA30对小牛胸腺DNA实现了有效的包裹。
(2)通过静电力作用和氢键作用实现MePEO50-PMAA30对上述“小牛胸腺DNA/Chol-PDMAEMA30”复合物的包裹：将MePEO50-PMAA30溶解于pH 7.4磷酸盐缓冲溶液中，超声分散20分钟，缓慢滴加到“小牛胸腺DNA/Chol-PDMAEMA30”复合物的溶液中，搅拌使之充分结合2小时以上，实现聚阴离子对复合物的包裹，该步骤中聚阴离子中羧基的数目与聚阳离子中氮原子的数目比为3∶1，通过Zeta电位测试、粒径测试、血小板粘附实验证明MePEO50-PMAA30对复合物实现了有效的包裹，屏蔽了复合物表面的正电荷，稳定了复合物纳米粒子。
实施例十：小牛胸腺DNA/Chol-PDMAEMA60/MePEO200-PMAA60
(1)通过静电力作用实现Chol-PDMAEMA60对小牛胸腺DNA的包裹：将Chol-PDMAEMA60溶解于生理盐水中，超声分散20分钟，缓慢滴加小牛胸腺DNA水溶液，并不断搅拌使之结合2小时以上，形成“小牛胸腺DNA/Chol-PDMAEMA60”复合物。该步骤中聚阳离子中N原子个数与DNA中P原子个数比为10∶1，通过溴乙锭取代实验与凝胶电泳实验证明Chol-PDMAEMA60对小牛胸腺DNA实现了有效的包裹。
(2)通过静电力作用和氢键作用实现MePEO200-PMAA60对上述“小牛胸腺DNA/Chol-PDMAEMA60”复合物的包裹：将MePEO200-PMAA60溶解于生理盐水中，超声分散20分钟，缓慢滴加到上述复合物的溶液中，搅拌使之充分结合2小时以上，实现聚阴离子对复合物的包裹。该步骤中聚阴离子中羧基的数目与聚阳离子中氮原子的数目比为1∶1，通过Zeta电位测试、粒径测试、血小板粘附实验证明MePEO200-PMAA60对复合物实现了有效的包裹，屏蔽了复合物表面的正电荷，稳定了复合物纳米粒子。
实施例十一：小牛胸腺DNA/Chol-PDMAEMA120/MePEO400-PMAA120
(1)通过静电力作用实现Chol-PDMAEMA120对小牛胸腺DNA的包裹：将Chol-PDMAEMA120溶解于生理盐水中，超声分散20分钟，缓慢滴加小牛胸腺DNA水溶液，并不断搅拌使之结合2小时以上，形成“小牛胸腺DNA/Chol-PDMAEMA120”复合物，该步骤中聚阳离子中N原子个数与DNA中P原子个数比为10∶1，通过溴乙锭取代实验与凝胶电泳实验证明Chol-PDMAEMA120对小牛胸腺DNA实现了有效的包裹。
(2)通过静电力作用和氢键作用实现MePEO400-PMAA120对上述“小牛胸腺DNA/Chol-PDMAEMA120”复合物的包裹：将MePEO400-PMAA120溶解于生理盐水中，超声分散20分钟，缓慢滴加到上述复合物的溶液中，搅拌使之充分结合2小时以上，实现聚阴离子对复合物的包裹。该步骤中聚阴离子中羧基的数目与聚阳离子中氮原子的数目比为4∶1，通过Zeta电位测试、粒径测试、血小板粘附实验证明MePEO400-PMAA120对复合物实现了有效的包裹，屏蔽了复合物表面的正电荷，稳定了复合物的纳米粒子。
实施例十二：小牛胸腺DNA/Chol-PDMAEMA10/MePEO17-PMAA10
(1)通过静电力作用实现Chol-PDMAEMA10对小牛胸腺DNA的包裹：将Chol-PDMAEMA10溶解于pH 7.4磷酸盐缓冲溶液中，超声分散20分钟，缓慢滴加小牛胸腺DNA水溶液，并不断搅拌使之结合2小时以上，形成“DNA/Chol-PDMAEMA10”复合物。该步骤中聚阳离子中N原子个数与DNA中P原子个数比为10∶1，通过溴乙锭取代实验与凝胶电泳实验证明Chol-PDMAEMA10对小牛胸腺DNA实现了有效的包裹。
(2)通过静电力作用和氢键作用实现MePEO17-PMAA10对上述“小牛胸腺DNA/Chol-PDMAEMA10”复合物的包裹：将MePEO17-PMAA10溶解于pH 7.4磷酸盐缓冲溶液中，超声分散20分钟，缓慢滴加到上述复合物的溶液中，搅拌使之充分结合2小时以上，实现聚阴离子对复合物的包裹。该步骤中聚阴离子中羧基的数目与聚阳离子中氮原子的数目比为2∶1，通过Zeta电位测试、粒径测试、血小板粘附实验证明MePEO17-PMAA10对复合物实现了有效的包裹，屏蔽了复合物表面的正电荷，稳定了复合物纳米粒子。
Claims (4)
1.一种新型非病毒阳离子型基因载体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)采用氧阴离子聚合法合成聚阳离子型电解质，即端基为生物基团的聚甲基丙烯酸-2-(烷基取代的氨基)乙酯，所述生物基团的醇形式选自维生素A1，维生素A2，维生素D3，胆固醇，维生素D2，橙花油醇，薄荷醇中的一种，所述烷基取代的氨基选自
(2)采用氧阴离子聚合法合成含聚阴离子型电解质的嵌段共聚物，即聚乙二醇单甲醚与聚甲基丙烯酸的嵌段共聚物MePEO-b-PMAA；制备方法包括以下步骤：
(2-1)以四氢呋喃为溶剂，使聚乙二醇单甲基醚MePEO与等物质量的氢化钾搅拌反应4～6小时，形成MePEO链末端氧阴离子，作为引发剂；
(2-2)将引发剂与单体甲基丙烯酸叔丁酯(t-BMA)以摩尔比1∶10至1∶120构成聚合体系，搅拌，反应0.5～3小时；
(2-3)用甲醇终止反应，提纯；
(2-4)以二氯甲烷为溶剂，在三氟乙酸存在的条件下，对共聚物MePEO-b-PtBMA水解，提纯，即获得所需的共聚物MePEO-b-PMAA；
(3)将步骤(1)所得聚阳离子型电介质溶解于pH7.4的缓冲溶液中，超声分散，缓慢滴加DNA水溶液，搅拌2小时以上，实现聚阳离子对DNA的包裹，形成DNA/聚阳离子复合物溶液，该步骤中聚阳离子型电介质中的N原子个数与DNA中P原子个数比为4∶1～10∶1；
(4)将步骤(2)所得MePEO-b-PMAA共聚物溶解于pH 7.4的缓冲溶液中，超声分散，缓慢滴加到步骤(3)所制得的DNA/聚阳离子复合物溶液中，搅拌2小时以上，实现聚阴离子PMAA链段对DNA/聚阳离子复合物的包裹，该步骤中聚阴离子PMAA链段中羧基的数目与聚阳离子中氮原子的数目比为1∶1～6∶1；
所述聚阳离子型电解质的制备方法包括以下步骤：
(1)以四氢呋喃为溶剂，使氢化钾与等物质量的含生物基团醇RbioOH搅拌反应4～12小时，形成生物基团氧阴离子RbioO-K+，作为引发剂，所述生物基团醇RbioOH选自维生素A1，维生素A2，维生素D3，胆固醇，维生素D2，橙花油醇，薄荷醇中的一种；
(2)将引发剂与单体甲基丙烯酸-2-(烷基取代的氨基)乙酯以摩尔比1∶10至1∶120构成聚合体系，搅拌，反应0.5～1.5小时，所述单体甲基丙烯酸-2-(烷基取代的氨基)乙酯选自甲基丙烯酸-2-(二甲氨基)乙酯、甲基丙烯酸-2-(二乙氨基)乙酯、甲基丙烯酸-2-(二异丙基氨基)乙酯中的一种；
(3)用甲醇终止反应，提纯，即获得所需的聚阳离子型电解质。
2.根据权利要求1所述新型非病毒阳离子型基因载体的制备方法，其特征在于所述pH 7.4的溶液为盐溶液，是生理盐水。
3.根据权利要求1所述新型非病毒阳离子型基因载体的制备方法，其特征在于所述pH 7.4的溶液为缓冲溶液，是磷酸盐溶液。
4.一种用于制备非病毒阳离子型基因载体的含聚阴离子型电解质的嵌段共聚物，其特征在于聚阴离子型电解质为聚甲基丙烯酸(PMAA)链段，由下列通式表达：
式中，x为10～400；y为10～120。
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