CN102276829B

CN102276829B - 一种非病毒基因载体材料及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN102276829B
Application number: CN2011101350210A
Authority: CN
Inventors: 高建青; 陈煜哲; 姚醒蕾
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2011-05-24
Filing date: 2011-05-24
Publication date: 2012-11-21
Anticipated expiration: 2031-05-24
Also published as: CN102276829A

Abstract

本发明公开了一种非病毒基因载体材料的制备方法，包括：将多元醇丙烯酸酯和氨基醇通过迈克尔反应制备未修饰的聚合物；将制备的未修饰的聚合物与含二氨基化合物反应制得含酯键的非病毒基因载体材料。该方法具有制备简单，可控性好，制备的非病毒基因载体材料具有高效率低毒性的特点。本发明公开了一种非病毒基因载体材料在转染细胞中的应用，包括：将非病毒基因载体材料与基因混合，经孵育后制得非病毒基因载体与基因的复合物；向受体细胞加制得的非病毒基因载体与基因的复合物，完成基因在细胞内的转染。本发明非病毒基因载体与基因的复合物对转染细胞具有较高的基因转染效率，且对于转染细胞的生物安全性良好。

Description

一种非病毒基因载体材料及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及基因载体、基因载体的制备和基因载体转染的应用领域，具体涉及一种非病毒基因载体材料及其制备方法和通过非病毒载体与基因的复合物的制备对肿瘤细胞、骨髓间充质干细胞及树突状细胞等细胞的基因转染的应用。

背景技术

基因治疗(gene therapy)是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，以达到治疗目的。也就是将外源基因通过基因转移技术将其插入受体细胞中，使外源基因制造的产物能治疗某种疾病。基因治疗中的一个关键任务是寻找一种安全高效的基因转移技术，即基因转运载体的构建。基因治疗转运载体主要包括病毒载体(viral vector)与非病毒载体(non-viral vector)两大类。病毒载体具有转导效率高，基因表达持续时间长等优点，但其也存在病毒相关蛋白引起机体免疫性及与宿主基因组整合引起突变风险等方面的问题。非病毒载体因其制备方便和生物安全性好等优点而成为基因给药载体重要的研究发展方向。然而，非病毒载体普遍存在转染效率低，材料毒性大等问题，这些方面限制了此类载体在临床上的广泛应用。开发新型非病毒基因载体的关键是高效率低毒性。提高转染效率与降低毒性是两个密切相关的概念，一种基因转染载体真正应用于基因治疗临床必须同时具有这两个特性。这是因为高效高毒的基因转染载体由于其毒性破坏了受体细胞的生存能力从而使其效率无法发挥；然而低效低毒的基因转染载体由于其效率低，从而无法体现基因治疗相对于传统治疗的优越性。

树突状细胞(DC)是目前发现的功能最强的抗原递呈细胞(APC)，在诱导包括肿瘤免疫的细胞免疫反应中起关键作用。它能够摄取内源和外源抗原，处理加工后将抗原递呈给T细胞，从而介导相关的免疫反应。树突状细胞可通过转染目的基因制备成各种抗肿瘤疫苗，其预后效果较好。然而，树突状细胞转染制备疫苗过程中的最大障碍是各种现有基因载体转染效率低下，从而无法制备出高效特异的树突状细胞疫苗，存在着技术问题。

近期基于聚合物基因转染载体的研究表明，在聚合物材料结构中引入诸如酯类等可降解成分，能够有效地提高基因复合物载体的生物相容性及DNA释放能力。

发明内容

本发明提供了一种非病毒基因载体材料的制备方法，通过多元醇丙烯酸酯和氨基醇迈克尔加成反应制备未修饰的聚合物，再通过氨基修饰剂对未修饰的聚合物修饰得到含酯键的非病毒基因载体材料，该方法具有制备简单，可控性好的优点。

本发明还提供了一种非病毒基因载体材料，通过上述方法制备的非病毒基因载体材料具有高效率低毒性的特点。

本发明还提供了一种非病毒基因载体材料的应用，具有较高的细胞转染效率。

一种非病毒基因载体材料的制备方法，包括以下步骤：

1)、将多元醇丙烯酸酯和氨基醇通过迈克尔加成反应制备未修饰的聚合物；

2)、将步骤1)制备的未修饰的聚合物与含二氨基化合物反应制得含酯键的非病毒基因载体材料。

本发明采用在多元醇丙烯酸酯和氨基醇通过迈克尔加成反应制得未修饰的聚合物结构中引入诸如酯类等可降解成分，制得的非病毒基因载体材料含酯键，能够有效地提高非病毒基因载体与基因的复合物的生物相容性及DNA释放能力。迈克尔加成是亲核试剂对α，β-不饱和羰基化合物β位碳原子发生的加成反应。该反应不仅是构筑碳链最常用方法之一而且是最有价值的有机合成反应之一。发明人利用该反应合成了一类化合物，并利用氨基化合物进行了封端修饰。所合成的含酯键的非病毒基因载体材料不仅表现出高的转染效率而且毒性较低，是一种能应用到体内外转染的基因载体，具有广阔的前景。

为了达到更好的发明效果，进行进一步地优选：

所述的多元醇丙烯酸酯为1，4-丁二醇二丙烯酸酯、1，5-戊二醇二丙烯酸酯等中的一种。所述的氨基醇为5-氨基-1-戊醇、4-氨基-1-丁醇、3-氨基-1-丙醇等中的一种。所述的含二氨基化合物为1，3-丙二胺、2，2-二甲基-1，3-丙二胺、1，3-二氨基戊烷中的一种。这些多元醇丙烯酸酯与氨基醇通过迈克尔加成反应得到的未修饰的聚合物无毒且有一定的基因转染效率，再通过含二氨基化合物对未修饰的聚合物进行末端修饰，可进一步提高非病毒基因载体材料的基因转染效率。

所述的步骤1)中的反应和步骤2)中的反应在有机溶剂中进行，所述的有机溶剂为三氯甲烷、二氯甲烷或二甲基亚砜。

步骤1)中，所述的多元醇丙烯酸酯与氨基醇的摩尔比为1∶1.6～1.6∶1；所述的迈克尔加成反应的条件为：反应时间12h～24h、反应温度80℃～100℃。有机溶剂能将多元醇丙烯酸酯、氨基醇及迈克尔加成反应所生成的未修饰聚合物充分溶解并形成均一溶液，为反应提供很好的反应环境，促使反应进行完全。较长的反应时间保证了反应充分进行。

步骤2)中，所述的未修饰的聚合物与含二氨基化合物的质量比为6∶1～20∶1；所述的反应的条件为：反应时间为12h～24h、反应温度为20℃～30℃。有机溶剂能将未修饰的聚合物、含二氨基化合物及非病毒基因载体材料充分溶解并形成均一溶液，为反应提供很好的反应环境，促使反应进行完全。较长的反应时间保证了反应充分进行。

所述的制备方法制备的非病毒基因载体材料，是一种转染效率高、毒性低的基因载体材料。非病毒基因载体材料的保存温度为-20℃～-80℃，反复冻融或较高温度保存条件下，所合成聚合物材料会聚集析出，转染效果会下降。

所述的非病毒基因载体材料在作为细胞内基因转染载体中的应用，所述的应用包括以下步骤：

a)、将非病毒基因载体材料与基因混合，经孵育后制得非病毒基因载体与基因的复合物；

b)、向受体细胞加步骤a)中制得的非病毒基因载体与基因的复合物，完成基因在细胞内的转染。

步骤a)中，所述的基因与非病毒基因载体材料的质量比为1∶10～1∶50，在这一比例范围内，非病毒基因载体材料就能充分包裹DNA，从而充分携载基因。非病毒基因载体材料与基因混合要加入缓冲液，以使具有更好的孵育的效果，缓冲液可选用磷酸缓冲液或醋酸钠缓冲液，所述的孵育的时间为10min～20min，确保了非病毒基因载体与基因的复合物的形成。由于非病毒基因载体材料含有可水解酯键，故孵育时间延长会导致非病毒基因载体材料从而影响转染效果。

步骤b)中，本发明非病毒基因载体与基因的复合物对受体细胞的种类没有过多的限制，优选地，所述的受体细胞为肿瘤细胞、骨髓间充质干细胞、树突状细胞中一种或多种，所述的转染的时间为24h～48h，受体细胞转染的时间需确保非病毒基因载体与基因的复合物对转染细胞作用充分。该非病毒基因载体与基因的复合物在不同的受体细胞上转染效率会有所不同。

本发明非病毒基因载体材料可适用于包括编码虫荧光素酶、绿色荧光蛋白等报告基因，以及各种其他实验所需功能目的基因等所有类型的质粒基因。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明方法未修饰的聚合物的制备及未修饰的聚合物的化学修饰简单，采用的反应试剂和得到的产物无毒无污染，容易获得且成本低廉，具有可推广性。合成反应中无需额外加入特殊的缩合剂及催化剂，反应条件温和，副反应产物少，且纯化简单。合成反应进行充分，可根据反应试剂的比例变化控制反应产物的生成及反应产物的分子量，反应中通过不同化学修饰提高材料对各种细胞的转染效率，具有很好的可控性和适用性。本发明方法制备简单，可控性好，操作性强，重现性好，适用对象广，生产成本低，易于工业化生产，具有很好的经济效益。

本发明方法制备的非病毒基因载体材料是含有可水解酯键的高分子化合物，能够有效地提高非病毒基因载体与基因的复合物的生物相容性及DNA释放能力。经实验证明，该材料制备的基因复合物具有良好的非病毒转染特性，能够高效转染肿瘤细胞、骨髓间充质干细胞和树突状细胞等多种细胞，其转染效果明显优于Lipofectamine2000(瑞士罗氏)等常用市售转染试剂，且材料的细胞毒性较低。因此，本发明方法制备的非病毒基因载体材料在非病毒基因转染领域具有良好的研究和应用前景。

附图说明

图1为实施例1制备的未修饰的聚合物的核磁共振氢谱；

图2为实施例1制备的非病毒基因载体材料的核磁共振氢谱；

图3为实施例1制备的非病毒基因载体材料与目的基因不同的质量比对HeLa细胞的转染效率的效果对比图；

图4为实施例3制备的非病毒基因载体材料与目的基因不同的质量比对骨髓间充质干细胞的转染效率的效果对比图；

图5为实施例4制备的非病毒基因载体材料与目的基因不同的质量比对树突状细胞的转染效率的效果对比图；

图6为实施例1制备的非病毒基因载体材料与目的基因不同的质量比对HeLa细胞的毒性效果对比图。

具体实施方式

实施例1

(1)将4mmol的1，4-丁二醇二丙烯酸酯与3.3mmol的5-氨基-1-戊醇混合溶于4ml三氯甲烷，于90℃搅拌反应24小时获得式I(n＝7～8)结构的未修饰的聚合物；

将1000mg未修饰的聚合物与52mg 1，3-丙二胺混合溶于4ml三氯甲烷，室温下搅拌反应12小时得到约含1050mg式II(n＝7～8)非病毒基因载体材料的溶液；

(2)更换步骤(1)中含非病毒基因载体材料的溶液中的溶剂为二甲基亚砜配制成100mg/mL溶液，经pH＝5.2醋酸钠缓冲液稀释至浓度1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml的溶液，与待转染DNA(目的基因)用pH＝7.4的磷酸缓冲液稀释成0.1mg/ml的溶液等体积混合，室温孵育15分钟配制成非病毒基因载体与基因的复合物(目的基因与非病毒基因载体的质量比为1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，w/w)，再用与复合物等体积pH＝7.4磷酸缓冲液混合稀释。

(3)将步骤(2)中的非病毒基因载体与基因的复合物滴加到预先种有HeLa细胞的含无血清培养液的细胞培养板或培养皿内，共同作用转染6小时后，更换培养液为含血清培养液，继续培养48小时，进行基因转染效率测定。

将实施例1中制备的未修饰的聚合物与非病毒基因载体材料溶于氘代二甲基亚砜中，用核磁共振测定仪测量未修饰的聚合物与非病毒基因载体材料¹H化学位移，结果如图1所示和图2所示。由核磁共振¹H谱的化学位移解析可知，图1中所合成的未修饰的聚合物及图2中修饰后的非病毒基因载体材料各峰归属：¹H-NMR(d6-DMSO)：δ1.2-1.4(m，-NCH₂(CH₂)₃CH₂OH)，δ1.6(bs，-N(CH₂)₂COOCH₂CH₂-与CH₂CHCOOCH₂CH₂-)，δ2.3-2.4(m，-COOCH₂CH₂N-与-NCH₂(CH₂)₄OH)，δ2.6-2.7(m，-COOCH₂CH₂N-)，δ3.4(bs，-N(CH₂)₄CH₂OH)，δ4.0(bs，-N(CH₂)₂-COOCH₂CH₂-)，δ4.1(m，CH₂CHCOOCH₂CH₂-)，δ4.4(bs，-N(CH₂)₅OH)，δ5.9(m，CH₂CHCOOCH₂CH₂-)，δ6.1-6.2(m，CH₂-CHCOOCH₂CH₂-)，δ6.3-6.4(m，CH₂CHCOOCH₂CH₂-)。由核磁共振¹H谱的化学位移解析可知，通过图1与图2比较后发现，代表CH₂CHCOOCH₂CH₂-基团的δ5.9(m，CH₂CHCOOCH₂CH₂-)，δ6.1-6.2(m，CH₂-CHCOOCH₂CH₂-)，δ6.3-6.4(m，CH₂CHCOOCH₂CH₂-)峰消失，证明图1端基峰消失，氨基修饰反应已进行过，说明非病毒基因载体材料合成成功。

实施例2

(1)将3.3mmol的1，5-戊二醇二丙烯酸酯与4mmol的5-氨基-1-戊醇的三氯甲烷混合溶于4ml，于90℃搅拌反应24小时获得式III(n＝7～8)结构的未修饰聚合物；

将1000mg未修饰的聚合物与65mg 2，2-二甲基-1，3-丙二胺混合溶于4ml三氯甲烷溶液，室温下搅拌反应12小时得到约含1060mg式IV(n＝7～8)非病毒基因载体材料的溶液；

(3)将步骤(2)中的非病毒基因载体与基因的复合物滴加到预先种有人体肝癌细胞株(HepG2)细胞的含无血清培养液的细胞培养板或培养皿内，共同作用转染6小时后，更换培养液为含血清培养液，继续培养48小时，进行基因转染效率测定。

实施例3

(1)将4mmol的1，4-丁二醇二丙烯酸酯与3.3mmol的5-氨基-1-戊醇混合溶于4ml三氯甲烷，于90℃搅拌反应24小时获得式V(n＝7～8)结构的未修饰的聚合物；

将1000mg未修饰的聚合物与52mg 1，3-丙二胺混合溶于4ml三氯甲烷，室温下搅拌反应12小时得到约含1050mg式VI(n＝7～8)非病毒基因载体材料的溶液；

(2)更换步骤(1)中含非病毒基因载体材料的溶液中的溶剂为二甲亚砜配制成100mg/mL溶液，经pH＝5.2醋酸钠缓冲液稀释至浓度1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml的溶液，与待转染DNA(目的基因)用pH＝7.4的磷酸缓冲液稀释成0.1mg/ml的溶液等体积混合，室温孵育15分钟配制成非病毒基因载体与基因的复合物(目的基因与非病毒基因载体的质量比为1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，w/w)，再用与复合物等体积pH＝7.4磷酸缓冲液混合稀释。

(3)将步骤(2)中的非病毒基因载体与基因的复合物滴加到预先种有骨髓间充质干细胞的含无血清培养液的细胞培养板或培养皿内，共同作用转染6小时后，更换培养液为含血清培养液，继续培养48小时，进行基因转染效率测定。

实施例4

(1)将4mmol的1，4-丁二醇二丙烯酸酯与3.3mmol的5-氨基-1-戊醇混合溶于4ml三氯甲烷，于90℃搅拌反应24小时获得式VII(n＝7～8)结构的未修饰的聚合物；

将1000mg未修饰的聚合物与52mg 1，3-丙二胺混合溶于4ml三氯甲烷，室温下搅拌反应12小时得到约含1050mg式VIII(n＝7～8)非病毒基因载体材料的溶液；

(2)更换步骤(1)中含非病毒基因载体材料的溶液中的溶剂为二甲亚砜配制成100mg/mL溶液，经pH＝5.2醋酸钠缓冲液稀释至浓度为1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml的溶液，与待转染DNA(目的基因)用pH＝7.4的磷酸缓冲液稀释成0.1mg/ml的溶液等体积混合，室温孵育15分钟配制成非病毒基因载体与基因的复合物(目的基因与非病毒基因载体的质量比为1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，w/w)，再用与复合物等体积pH＝7.4磷酸缓冲液混合稀释。

(3)将步骤(2)中的非病毒基因载体与基因的复合物滴加到预先种有树突状细胞的含无血清培养液的细胞培养板或培养皿内，共同作用转染6小时后，更换培养液为含血清培养液，继续培养48小时，进行基因转染效率测定。

HeLa细胞的转染效率效果对比实验

取含实施例1制备的非病毒基因载体材料的二甲基亚砜溶液(100mg/mL)，用pH＝5.2醋酸钠缓冲液稀释至浓度为1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL，分别与待转染荧光素酶报告基因载体(pGL3)目的基因用pH＝7.4磷酸缓冲液稀释成0.1mg/mL的溶液等体积混合，在室温下孵育15分钟以获得实验组1～5的非病毒基因载体与基因的复合物。市售转染试剂(Lipofectamine2000)用pH＝5.2醋酸钠缓冲液稀释至浓度为0.3mg/mL，与待转染荧光素酶报告基因载体(pGL3)目的基因用pH＝7.4磷酸缓冲液稀释成0.1mg/mL的溶液等体积混合，在室温下孵育15分钟以获得实验组6的非病毒基因载体与基因的复合物。实验组1～6的非病毒基因载体与基因的复合物中，目的基因与非病毒基因载体的质量比分别为1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶3，再用与实验组1～6的非病毒基因载体与基因的复合物等体积的pH＝7.4磷酸缓冲液混合稀释，得到实验组1～6稀释后的非病毒基因载体与基因的复合物。

将HeLa细胞以每孔10万个细胞的数量种在24孔板中培养24h，除去培养液，以pH＝7.4的磷酸缓冲溶液清洗两遍，加入0.5ml不含胎牛血清的DMEM高糖培养液(美国GIBCO公司，12800干粉)，将实验组1～6稀释后的非病毒基因载体与基因的复合物分别按每孔40μl加入到细胞中，放入37℃的CO₂培养箱培养。转染6小时后更换培养液为含质量百分数为10％胎牛血清的DMEM高糖培养液(美国GIBCO公司，12800干粉)，继续培养42小时。

培养好后，吸去24孔板中培养液，pH＝7.4的磷酸缓冲溶液清洗两次，每孔加入200μl细胞裂解液，室温静置30分钟，小心吹打，分别得到实验组1～6的上清液。取实验组1～6的上清液20μl，加入100μl虫荧光素酶底物用化学发光仪测定实验组1～6的荧光强度。

配制浓度为0.5mg/ml的蛋白质水溶液，用蒸馏水分别稀释至浓度25μg/ml，50μg/ml，100μg/ml，200μg/ml，300μg/ml，400μg/ml，500μg/ml，以每孔20μl加入到96孔板中，每孔再加入200μl BCA工作液(碧云天生物技术有限公司，BCA蛋白浓度测定试剂盒)，595nm紫外测吸光度，绘标准曲线。

将实验组1～6的上清液各另取10μl，稀释到20μl，加入200μl BCA工作液测吸光光度值，带入标准曲线得到实验组1～6的蛋白质含量。采用相对光单位与蛋白质量的比值作为转染效率的评价指标，反映荧光素酶的活性，即通过计算得到实验组1～6的荧光强度与实验组1～6的蛋白质含量的对应比值，计算结果如图3所示。

骨髓间充质干细胞的转染效率效果对比实验

取含实施例3制备的非病毒基因载体材料的二甲基亚砜溶液(100mg/mL)，用pH＝5.2醋酸钠缓冲液稀释至浓度2mg/mL、3mg/mL，分别与待转染荧光素酶报告基因载体(pGL3)目的基因用pH＝7.4磷酸缓冲液稀释成0.1mg/mL的溶液等体积混合，在室温下孵育15分钟以获得实验组1～2的非病毒基因载体与基因的复合物，再用与复合物等体积pH＝7.4磷酸缓冲液混合稀释，得到实验组1～2稀释后的非病毒基因载体与基因的复合物，其中，目的基因与非病毒基因载体的质量比分别为1∶20，1∶30。

取含实施例3制备的未修饰聚合物的二甲基亚砜溶液(100mg/mL)，用pH＝5.2醋酸钠缓冲液稀释至浓度3mg/mL与待转染荧光素酶报告基因载体(pGL3)目的基因用pH＝7.4磷酸缓冲液稀释成0.1mg/mL的溶液等体积混合，在室温下孵育15分钟以获得实验组3的未修饰聚合物与基因的复合物，再用与复合物等体积pH＝7.4磷酸缓冲液混合稀释，得到实验组3稀释后的未修饰聚合物与基因的复合物，其中，目的基因与未修饰聚合物的质量比为1∶30。

市售转染试剂(Lipofectamine2000)用pH＝5.2醋酸钠缓冲液稀释至浓度0.3mg/mL，与待转染荧光素酶报告基因载体(pGL3)目的基因用pH＝7.4磷酸缓冲液稀释成0.1mg/mL的溶液等体积混合，在室温下孵育15分钟以获得实验组4的非病毒基因载体与基因的复合物，再用与复合物等体积pH＝7.4磷酸缓冲液混合稀释，得到实验组4稀释后的非病毒基因载体与基因的复合物，其中，目的基因与非病毒基因载体的质量比为1∶3。

将骨髓间充质干细胞(MSC)以每孔10万个细胞的数量种在24孔板中培养24h，除去培养液，以pH＝7.4的磷酸缓冲溶液清洗两遍，加入0.5ml不含胎牛血清的DMEM高糖培养液(美国GIBCO公司，12800干粉)，将实验组1～2稀释后的非病毒基因载体与基因的复合物、实验组3稀释后的未修饰聚合物与基因的复合物和实验组4稀释后的非病毒基因载体与基因的复合物分别按每孔40μl加入到细胞中，放入37℃的CO₂培养箱培养。转染6小时后更换培养液为含质量百分数为10％胎牛血清的DMEM高糖培养液(美国GIBCO公司，12800干粉)，继续培养42小时。

培养好后，吸去24孔板中培养液，pH＝7.4的磷酸缓冲溶液清洗两次，每孔加入200μl细胞裂解液，室温静置30分钟，小心吹打，分别得到实验组1～4的上清液。取实验组1～4的上清液20μl，加入100μl虫荧光素酶底物用化学发光仪测定实验组1～4的荧光强度。

配制浓度为0.5mg/ml的蛋白质水溶液，蒸馏水稀释至浓度25μg/ml，50μg/ml，100μg/ml，200μg/ml，300μg/ml，400μg/ml，500μg/ml，以每孔20μl加入到96孔板中，每孔再加入200μl BCA工作液(碧云天生物技术有限公司，BCA蛋白浓度测定试剂盒)，595nm紫外测吸光度，绘标准曲线。

将实验组1～4的上清液各另取10μl，稀释到20μl，加入200μl BCA工作液测吸光光度值，带入标准曲线得到实验组1～4的蛋白质含量。采用相对光单位与蛋白质量的比值作为转染效率的评价指标，反映荧光素酶的活性，即通过计算得到实验组1～4的荧光强度与实验组1～4的蛋白质含量的对应比值，计算结果如图4所示。

树突状细胞的转染效率效果对比实验

取含实施例4制备的非病毒基因载体材料的二甲基亚砜溶液(100mg/mL)，用pH＝5.2醋酸钠缓冲液稀释至浓度2mg/mL、3mg/mL，分别与待转染荧光素酶报告基因载体(pGL3)目的基因用pH＝7.4磷酸缓冲液稀释成0.1mg/mL的溶液等体积混合，在室温下孵育15分钟以获得实验组1～2非病毒基因载体与基因的复合物，再用与复合物等体积pH＝7.4磷酸缓冲液混合稀释，得到实验组1～2稀释后的非病毒基因载体与基因的复合物，其中，目的基因与非病毒基因载体的质量比分别为1∶20，1∶30。

取含实施例4制备的未修饰聚合物的二甲基亚砜溶液(100mg/mL)，用pH＝5.2醋酸钠缓冲液稀释至浓度3mg/mL与待转染荧光素酶报告基因载体(pGL3)目的基因用pH＝7.4磷酸缓冲液稀释成0.1mg/mL的溶液等体积混合，在室温下孵育15分钟以获得实验组3的未修饰聚合物与基因的复合物，再用与复合物等体积pH＝7.4磷酸缓冲液混合稀释，得到实验组3稀释后的未修饰聚合物与基因的复合物，其中，目的基因与未修饰聚合物的质量比为1∶30。

将树突状细胞以每孔10万个细胞的数量种在24孔板中培养24h，除去培养液，以pH＝7.4的磷酸缓冲溶液清洗两遍，加入0.5ml不含胎牛血清的DMEM高糖培养液(美国GIBCO公司，12800干粉)，将实验组1～2稀释后的非病毒基因载体与基因的复合物、实验组3稀释后的未修饰聚合物与基因的复合物和实验组4稀释后的非病毒基因载体与基因的复合物分别按每孔40μl加入到细胞中，放入37℃的CO₂培养箱培养。转染6小时后更换培养液为含质量百分数为10％胎牛血清的DMEM高糖培养液(美国GIBCO公司，12800干粉)，继续培养42小时。

将实验组1～4的上清液各另取10μl，稀释到20μl，加入200μl BCA工作液测吸光光度值，带入标准曲线得到实验组1～4的蛋白质含量。采用相对光单位与蛋白质量的比值作为转染效率的评价指标，反映荧光素酶的活性，即通过计算得到实验组1～4的荧光强度与实验组1～4的蛋白质含量的对应比值，计算结果如图5所示。

细胞存活率实验

将实施例1制备的非病毒基因载体材料配制成100mg/ml的二甲基亚砜溶液，用pH＝5.2醋酸钠缓冲液稀释至浓度为1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml，与待转染荧光素酶报告基因载体(pGL3)目的基因用pH＝7.4磷酸缓冲液稀释成0.1g/ml的溶液等体积混合，室温孵育15分钟配制成实验组1～4的非病毒基因载体与基因的复合物，再用与复合物等体积pH＝7.4磷酸缓冲液混合稀释，得到实验组1～4稀释后的非病毒基因载体与基因的复合物，其中，目的基因与非病毒基因载体的质量比分别为1∶10，1∶20，1∶30，1∶40。

将HeLa细胞以每孔1万个细胞的数量种在96孔板中培养24h，除去培养液，以PBS缓冲液清洗两遍，加入100μl不含胎牛血清的DMEM培养液(美国GIBCO公司，12800干粉)，将实验组1～4稀释后的非病毒基因载体与基因的复合物分别按每孔10μl加入到细胞中，空白对照组加10μl纯水，放入37℃的CO₂培养箱培养。转染6小时后更换培养液为含质量百分数为10％胎牛血清的培养液，继续培养42小时。

除去培养液，PBS缓冲液清洗两次，每孔加入20μl噻唑兰(MTT)水溶液(浓度5mg/ml)和80μl培养液，4h后吸去培养液，每孔加入150μl二甲基亚砜(DMSO)，振摇10min，在酶标仪上于570nm下测定OD值(opticaldensity，光密度)。按以下公式计算细胞生存率，细胞生存率(％)＝(样品的OD值/对照组的OD值)×100％。

转染HeLa细胞的存活率结果，如图6所示。由图6可知本发明合成非病毒基因载体与基因的复合物转染HeLa细胞时，细胞存活率良好，此转染方法不会对细胞的生长产生抑制。

通过转染效率效果对比实验和细胞存活率实验表明，本发明合成非病毒基因载体与基因的复合物对转染细胞具有较高的基因转染效率，且对于转染细胞的生物安全性良好。

Claims

1.一种非病毒基因载体材料的制备方法，包括以下步骤：

将3.3mmol的1,5-戊二醇二丙烯酸酯与4mmol的5-氨基-1-戊醇混合溶于4ml三氯甲烷，于90℃搅拌反应24小时获得式III结构的未修饰聚合物，式III中n=7～8；

将1000mg未修饰的聚合物与65mg 2,2-二甲基-1,3-丙二胺混合溶于4ml三氯甲烷，室温下搅拌反应12小时得到含1060mg式IV结构的非病毒基因载体材料的溶液，式IV中n=7～8；