CN103290046A - 基于氟化物修饰的树形高分子基因转染载体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种基于氟化物修饰的树形高分子基因转染载体，其包括树形高分子骨架以及含氟化合物功能基团，所述含氟化合物功能基团共价连接在树形高分子表面；所述树形高分子包括聚酰胺-胺树形高分子和聚丙烯亚胺树形高分子。本发明还提供所述基因转染载体的制备方法及其作为核酸分子输送载体的应用。本发明还提供包括所述基因转染载体的复合物。本发明简单高效，产率高，在细胞转染过程中可以低氮磷比达到高效转染效果，成本低，细胞毒性小，能有效且安全地将基因分子输送到细胞中，是兼具高效、低毒、价格低廉、合成简易等优点的基因转染载体。

Description

基于氟化物修饰的树形高分子基因转染载体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及高分子化学以及生物材料技术领域，具体涉及一种基于氟化物修饰改性的树形高分子的基因转染载体及其制备方法和应用。

背景技术

基因转染是指将外源基因导入细胞或组织并表达的过程。这种技术广泛应用于科学研究和疾病治疗。在这个过程中，基因转染载体扮演了很重要的角色。一般来说，基因转染载体主要可以分为两类：病毒类载体和非病毒类载体。利用病毒转染方法可以获得长期高效表达外源DNA的细胞或组织，但病毒类载体存在细胞株适用性，携带基因能力有限，容易引起细胞免疫反应以及安全性隐患等问题。目前安全，低毒，操作简便的非病毒基因转染方法受到了人们的广泛关注，包括聚丙烯亚胺(PEI)，聚精氨酸，L-聚赖氨酸(PLL)，脂质体等非病毒转染载体以及其经过修饰所得到的载体已经得到了广泛的研究。不过虽然这类方法提供了相对安全和较强可用性的基因转染方式，但是相对较低的转染效率和较高的细胞毒性限制了其在医学临床上的广泛应用。

聚酰胺-胺树形高分子(polyamidoamine，PAMAM)是Tomalia D.A.于1985年首次报道的具有几何分支的椭圆形结构的树形大分子。其高效低毒安全的特点已经在基因转染中被广泛研究和应用，得到了人们的广泛关注。1993年，Meijer等用外向发散法合成出来的聚丙烯亚胺(PPI)树形高分子首次实现了大规模合成和商业化，为树形高分子的广泛研究和应用奠定了基础。树形高分子的特殊结构使其易于结合基因质粒片段，并且其内部三级胺结构可以起到“质子海绵”的作用，促进其在细胞内涵体的逃逸行为，有效将确保基因不在细胞内的稳定性。近年来，将聚酰胺-胺以及聚丙烯亚胺树形高分子表面氨基进行化学修饰成为主要修饰形式之一。例如在表面氨基上共价连接环糊精、氨基酸、PEG等修饰基团，可以获得相对较好的基因转染效果。还有一类修饰方案是在聚酰胺-胺树形高分子表面氨基上修饰生物素、糖基、多肽片段和蛋白质等基团，可以使载体具有靶向转染效果。这些修饰方式可以优化增强聚酰胺-胺树形高分子基因转染效果同时提高细胞相容性。目前，以聚酰胺-胺树形高分子为基础的基因转染载体如

和

已经成功商业化应用。但是，基于树形高分子的基因转染载体有比较复杂的合成路线、高昂的材料成本以及高的细胞毒性，仍然是制约这些材料在生物医学领域广泛应用的主要因素。

为了解决这些问题，获得更好的转染效果以及生物相容性，我们制备了基于树形高分子表面化学共价修饰氟化物的基因转染载体。从以前的研究工作中我们了解到，在聚酰胺-胺树形高分子表面修饰疏水性分子可以提高转染功效。例如，在聚酰胺-胺树形高分子表面修饰脂质官能团，如Josél. Santos et al.2010报道，疏水基团促使基因复合物保持稳定，也可以帮助复合物从内涵体逃逸。氟化物作为一种修饰成分在之前较早的基因转染研究中已经体现了一定的优势，如

Gaucheron et al.2001报道的在精胺脂(DOGS)分子上修饰含有氟烃基的脂肪链，能够提高精胺脂的转染效率。由于氟化物具有疏水和疏脂的性质，我们认为，氟化物修饰基团可以起到稳定结合的DNA，有效保护DNA并且促进基因复合物的细胞摄入和胞内内涵体逃逸，确保DNA分子高效表达。基于表面修饰的氟化物的特点，这类载体可以有效降低转染过程中其与基因复合转染时的氮磷比，其带来的作用既可以减少材料的用量，节省了细胞转染成本，又从而降低了细胞毒性，提高了基因转染载体的生物适用度。同时由于其疏水疏脂的性质，不易于蛋白结合，可以有效帮助避免血清中蛋白质干扰载体与基因的结合以及DNA的降解，因此这种基因转染载体可以在血清存在的条件下实现高效、低毒的细胞转染效果，不仅便于细胞转染实验的操作，还提高了细胞的存活率。这样可以有效解决目前商业化的转染试剂不能有效抗血清转染的问题(如Lipofectamine2000、Fugene等)。另外，这种氟化物部分表面修饰的树形高分子的合成工艺十分成熟并且操作简易，合成速度快，产率高，实验周期短，无需繁琐的纯化步骤即可快速获得高产率的基因转染载体，其简易的合成方法为其提供了商业化的良好基础。因此，这类部分氟化物表面修饰的树形高分子具有高效转染、低细胞毒性、简易的合成方法及高产率等优点，可以开发为一类新的基因转染材料并具有被商业化的潜力。我们将在分子、细胞水平揭示这类材料的转染机理，初步阐明这类材料结构与功能的关系，构建基于树形高分子的高效、低毒基因转染载体，并致力于将这类材料推向商业化，搭建一个成熟的基因转染平台。

发明内容

本发明克服现有技术树形高分子类基因转染材料的不足，本发明创新利用合成的氟改性的聚酰胺-胺树形高分子用于基因转染。以含氟化合物修饰的树形高分子进行结合DNA并用于基因转染。本发明高效、安全、合成步骤简洁，在低氮磷比的条件下，获得细胞毒性较小，

同时具备高转染效率的优点的基因转染载体。

本发明提供一种新的如式(Ia)、式(Ib)所示的基于氟化物修饰的树形高分子基因转染载体。本发明基于氟化物修饰的树形高分子基因转染载体，包括树形高分子骨架以及含氟化合物功能基团，所述含氟化合物功能基团共价连接在树形高分子表面；包括聚酰胺-胺或聚丙烯亚胺树形高分子以及带有含氟化合物的修饰基团，所述聚酰胺-胺和聚丙烯亚胺树形高分子表面的伯胺基团与所述含氟化合物的修饰基团进行酰化、磺酸化等反应，以酰胺键、氨基磺酸键等化合键连接，其结构如式(Ia)、式(Ib)所示：

式(Ia)、式(Ib)中，X为NH，O，CO，SO₂，或CH₂等基团。z为树形高分子表面共价连接的含氟化合物修饰基团的数量，z为1-1024的整数，a为0-8的整数，b为1-3的整数，c为1-8的整数；R是如式(II)所示的聚酰胺-胺树形高分子或如式(III)所示的聚丙烯亚胺树形高分子，式(II)和式(III)如下所示：

式(II)和式(III)中，M是树形高分子的核心，其组成包括氨、乙二胺、丁二胺、己二胺、辛二胺、葵二胺，或1，12-十二烷二胺；n是1-10的整数；m是2-4的整数。

具体例子之一为，当X为CO时，所述基因转染载体的结构如下所示：

本发明中，是由聚酰胺-胺或聚丙烯亚胺树形高分子和含氟化合物共价连接，在树形高分子表面进行修饰，构成一种新型的高分子基因转染载体，所述聚酰胺-胺树形高分子为以乙二胺及丙烯酸甲酯作为单体合成的树形高分子，该聚酰胺-胺树形高分子的末端基团为伯氨基团，n是1-10的整数；m是2-4的整数。所述聚丙烯亚胺为以丁二胺及丙二胺作为单体合成的树形高分子，该聚酰胺-胺树形高分子的末端基团为伯氨基团，n是1-10的整数；m是2-4的整数。

本发明中，“含氟化合物”是指含氟烃基及其衍生物或含氟苯基及其衍生物的化合物，例如三氟乙酸酐、五氟丙酸酐、七氟丁酸酐、九氟丁基磺酸酐等，带有可以与氨基反应的活性基团的类含氟化合物。所述可与氨基反应的活性基团，包括卤素(F、Cl、Br、I)、羟基、羧基、磺酸酐键、双键、巯基等，结构如以下所示：

其中，X＝卤素(F、Cl、Br、I)、羟基、羧基、双键、巯基等可以与伯氨基反应的活性基团，a为0-8的整数，b为1-3的整数。

本发明还提出了一种新的基于氟化物修饰的树形高分子基因转染载体的制备方法，将含氟化合物及树形高分子溶解于水或有机溶剂，加入碱或催化剂，搅拌，通过反应将含氟化合物功能基团共价连接到树形高分子表面，得到如式(Ia)、式(Ib)所示的基因转染载体。具体地，基于聚酰胺-胺或聚丙烯亚胺树形高分子基因转染载体的制备方法，以所述树形高分子和所述含氟化合物为原料，首先将所述树形高分子溶于水或有机溶液中，之后向该溶液中逐滴滴加反应所需碱，再向溶液中按照一定的比例逐滴滴加含氟化合物修饰剂。滴加完成后将该反应溶液在一定温度下搅拌反应一段时间，得到如式(Ia)、式(Ib)所示的部分全氟烷烃基修饰的基于树形高分子的新型基因转染载体。

本发明制备方法中，所述有机溶剂为水或甲醇，乙醇，二甲亚砜，N，N-二甲基甲酰胺，或四氢呋喃等有机溶剂，是溶有所述含氟化合物例如三氟乙酸酐、五氟丙酸酐、七氟丁酸酐、九氟丁基磺酸酐等的溶液。

本发明制备方法中，所述反应时间为1-120小时。所述反应温度为0-37摄氏度左右。

本发明制备方法中，将树形高分子和含氟化合物，例如三氟乙酸酐、五氟丙酸酐、七氟丁酸酐、九氟丁基磺酸酐等含氟化合物活性基团按照一定的比例反应共价连接到树形高分子表面形成带有含氟化合物基团修饰的树形高分子结构制备而成。

目前的技术合成的树形高分子以及基于树形高分子所合成的基因转染载体不仅合成工艺复杂，耗时耗力严重，而且效果不尽如人意，细胞毒性制约了其发展。与现有技术及市场上高代数同类产品比较，本发明如式(Ia)、式(Ib)所示的基于聚酰胺-胺或聚丙烯亚胺树形高分子的新型基因转染载体修饰上含氟化合物基团，能够有效且安全地将基因分子输送到细胞中，并且由于含氟化合物具有疏水疏脂性质，不易结合蛋白，因此本材料具有抗血清转染功效。本材料合成周期短，制备方法简便，转染效率高，毒性低等优点。另外，由于转染时材料与DNA复合物只需要在低N/P条件下即可获得非常高的转染效率，节省载体和DNA等材料，降低成本。

本发明还提出了一种基于含氟化合物修饰的聚酰胺-胺树形高分子的基因转染载体在体外或体内作为核酸分子的输送载体的应用。所述核酸包括DNA、siRNA、shRNA或经修饰后的核酸等。

本发明还提出了一种复合物，其包括含有式(Ia)、式(Ib)所示的基于含氟化合物修饰的聚酰胺-胺或聚丙烯亚胺树形高分子的基因转染载体以及核酸。

以绿色荧光蛋白基因和荧光素酶基因作为报告基因，利用本发明转染载体输送质粒，实验表明本发明具有以下优点：本发明在保持高的基因转染效率的同时，保持较好的生物相容性。通过基因转染实验发现，在氮磷比为较低的条件下转染荧光素酶和绿色荧光蛋白的效率远远高于第五代聚酰胺-胺树形高分子的转染效率和bPEI(25kD)在优化条件下氮磷比为8∶1时的转染效率，并相当甚至超过Lipofectamine2000在优化条件下的转染效率，这体现了本发明材料在细胞转染应用中低氮磷比且高效转染的特点；通过MTT细胞毒性检测实验发现，本发明转染基因载体的细胞毒性较小，在高转染效率的浓度下细胞存活率大于90％，具有良好的生物相容性。本发明基因转染载体合成方法简单高效，产率高，在细胞转染过程中可以低氮磷比达到高效转染的效果，成本低，细胞毒性小，能够有效且安全地将基因分子输送到细胞中。本发明基因转染载体可以用作为一种兼具高效、低毒、价格低廉、合成简易等优点的基因转染载体。

附图说明

图1为实施例1-9中所制备的基于表面修饰含氟化合物的第五代聚酰胺-胺的基因转染载体的合成路线及基因载体结构图。

图2为实施例1-9中所得的基于表面修饰含氟化合物的第五代聚酰胺-胺的基因转染载体的一维核磁共振图谱(¹H NMR)。

图3为实施例1-9中所得的基于表面修饰含氟化合物的第五代聚酰胺-胺的基因转染载体的茚三酮检测数据与核磁共振计算数据对比图。

图4为实施例1中所得的基因转染载体G5-F3-26与其他转染载体在HEK293细胞中转染绿色荧光蛋白基因的转染效率对比图。

图5为实施例2中所得的基因转染载体G5-F3-44与其他转染载体在HEK293细胞中转染绿色荧光蛋白基因的转染效率对比图。

图6为实施例3中所得的基因转染载体G5-F5-36与其他转染载体在HEK293细胞中转染绿色荧光蛋白基因的转染效率对比图。

图7为实施例4中所得的基因转染载体G5-F5-48与其他转染载体在HEK293细胞中转染绿色荧光蛋白基因的转染效率对比图。

图8为实施例5-6中所得的基因转染载体G5-F7-49以及G5-F7-68与DNA形成的复合物的琼脂糖凝胶电泳图(a)，以及基因转染载体G5-F7-49以及G5-F7-68与DNA形成的复合物在肝素钠的竞争结合下的琼脂糖凝胶电泳图(b)。

图9为实施例5-6中所得的基因转染载体G5-F7-68以及G5-F7-68与DNA形成的复合物的动态光散射检测数据图。

图10为实施例5-6中所得的基因转染载体G5-F7-68以及G5-F7-68与DNA形成的复合物的zeta电势检测数据图。

图11为实施例5中所得的基因转染载体G5-F7-49与其他转染载体在(a)HEK293，(b)HeLa细胞中转染绿色荧光蛋白基因的转染效率对比图。

图12为实施例5-6中所得的基因转染载体G5-F7-49与G5-F7-68其它转染载体在(a)HEK293，(b)HeLa细胞中转染荧光素酶基因的转染效率对比图。

图13为实施例6中所得的基因转染载体G5-F7-68与其他转染载体在(a)HEK293，(b)HeLa细胞中转染绿色荧光蛋白基因的转染效率对比图。

图14为实施例6中所得的基因转染载体G5-F7-68与其他转染载体在HeLa细胞中在不同血清含量的培养基中转染绿色荧光蛋白基因的转染效率对比图。

图15为实施例5-6中所得的基因转染载体G5-F7-49与G5-F7-68其它转染载体对(a)HEK293，(b)HeLa细胞的毒性对比图。

图16为实施例5-6中所得的基因转染载体G5-F7-49与G5-F7-68其它转染载体在与DNA形成复合物后对(a)HEK293，(b)HeLa细胞的毒性对比图。

图17为实施例5-6中所得的基因转染载体G5-F7-49与G5-F7-68与其它转染载体在CHO细胞中转染绿色荧光蛋白基因的转染效率对比图。

图18为实施例5-6中所得的基因转染载体G5-F7-49与G5-F7-68与其它转染载体对CHO细胞的毒性对比图。

图19为实施例5-6中所得的基因转染载体G5-F7-49与G5-F7-68与其它转染载体在COS-7细胞中转染绿色荧光蛋白基因的转染效率对比图。

图20为实施例5-6中所得的基因转染载体G5-F7-49与G5-F7-68与其它转染载体对COS-7细胞的毒性对比图。

图21为实施例5-6中所得的基因转染载体G5-F7-49与G5-F7-68与其它转染载体在NIH3T3细胞中转染绿色荧光蛋白基因的转染效率对比图。

图22为实施例5-6中所得的基因转染载体G5-F7-49与G5-F7-68与其它转染载体对NIH3T3细胞的毒性对比图。

图23为实施例8中所得的基因转染载体G5-F9-32与其他转染载体在HEK293细胞中转染绿色荧光蛋白基因的转染效率对比图。

图24为实施例9中所得的基因转染载体G5-F9-54与其他转染载体在HEK293细胞中转染绿色荧光蛋白基因的转染效率对比图。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

实施例1：以1∶32的比例制备基于三氟乙酰化的第五代聚酰胺-胺树形高分子的基因转染新材料。

以基于共价连接三氟乙酰化修饰的第五代聚酰胺-胺树形高分子的材料为例，其结构如下所示：

其中，a的理论预期为32，G5为第五代聚酰胺-胺树形高分子，其中，中心核M为乙二胺，末端基团为128个伯胺基团，其结构式如下：

制备合成方法：取50毫克的第五代聚酰胺-胺树形高分子，将其溶于2毫升甲醇溶液，向该溶有树形高分子的甲醇溶液中缓慢滴加9.25微升三乙胺，再向该溶液中逐滴滴加溶有7.68微升的三氟乙酸酐甲醇溶液1毫升，滴加完成后将该反应混合溶液在室温下继续搅拌反应12小时，即可得到外观为白色粉末的基于表面三氟乙酰化修饰的第五代聚酰胺-胺树形高分子材料并命名为G5-F3-32。

以茚三酮检测法表征检测G5-F3-32基因转染载体：以茚三酮检测法表征检测所制备的基因转染载体G5-F3-32的三氟乙酰化效率。

具体实施方法：向1.5毫升的EP管中分别加入体积为0，12.5，25，37.5，50，62.5，75，87.5，100微升的0.2毫克/毫升的PAMAM树枝形分子溶液。然后，每一个管中加入100微升的乙酸钠缓冲液(0.2摩尔/升，pH＝5.4)和100微升的茚三酮溶液，用双蒸水补充到最终体积300微升，然后沸水中加热10分钟。用紫外可见分光光度计在570纳米处比色，测定各个样品的吸收。以G5PAMAM树形高分子的浓度为横坐标，样品的在570纳米的吸收为纵坐标，作标准曲线。

将14.11克的乙酸钠溶解在86毫升的双蒸水中，得到2摩尔/升的乙酸钠水溶液，然后加入14毫升的2摩尔/升的乙酸，调节pH值使pH＝5.4。将85毫克的还原茚三酮和15毫克的茚三酮溶解在10毫升的乙二醇甲醚溶液中。在1.5毫升的EP管中加入100微升的样品和100微升的乙酸钠缓冲液，混匀后加入100微升的还原茚三酮溶液。将EP管在沸水中加热10分钟，冷却后每管加入300微升60∶40乙醇水溶液。用紫外可见分光光度计在570纳米处比色，测定各个样品的吸收。参照以G5PAMAM树形高分子制作的标准曲线，计算出表面伯氨基的数量，进而以差量的形式计算出树形高分子表面三氟乙酰化的效率。

以NMR法表征检测G5-F3-32基因转染载体：以一维核磁氢谱(¹H NMR)检测表征所制备的基因转染载体G5-F3-32的三氟乙酰化效率。

具体方法为：取5毫克实施例1中合成的基因转染载体，溶于2毫升甲醇溶液，向该溶有树枝形分子的甲醇溶液中分别滴加41微升三乙胺，再向该溶液中缓慢逐滴滴加溶有23微升的乙酸酐甲醇溶液1毫升，滴加完成后将该反应溶液在室温下继续搅拌反应12小时，得到表面完全乙酰化的基于三氟乙酰化的第五代聚酰胺-胺树形高分子材料，并命名为Ac-G5-F3-32。

将所制备的基因转染载体Ac-G5-F3-32溶于D₂O，浓度大约5毫克/毫升，进行核磁共振分析。根据¹H NMR图谱，如图2所示，计算氨基乙酰化的比例，以差量的形式计算树形高分子表面三氟乙酰化的效率。如图3所示，得到的结果和用茚三酮检测法中紫外可见分光光度计比色法得到的结果计算比较。

实验结果：如图3所示，两种方法测定的结果比较吻合。根据计算对比，每个树形高分子表面连接了26个三氟乙酰化基团，因此修改基于三氟乙酰化的第五代聚酰胺-胺树形高分子的名称为G5-F3-26。

基因转染载体G5-F3-26的基因转染效率：将本实施例中所制备的基因转染试剂G5-F3-26和绿色荧光蛋白质粒DNA在室温下形成复合物，然后在HEK293细胞中进行转染，以通过流式细胞术检测绿色荧光蛋白的表达量来评估载体的基因转染效率。

具体方法为：将HEK293细胞培养在24孔板中孵育24小时，将0.8微克绿色荧光蛋白质粒DNA与G5-F3-26以氮磷比为14的比例混合后加入到含10％血清的培养基中混匀，体积为100微升，静置半小时后加入150微升含10％血清的培养基。含有复合物的培养基与细胞一起孵育6小时后加入含10％血清的培养基500微升。48小时后处理细胞，用胰酶消化，并用300微升PBS缓冲液重悬，立即用流式细胞仪检测成功转染绿色荧光蛋白的细胞百分比。第五代聚酰胺-胺树形高分子作为阴性对照，bPEI25kD作为阳性对照。

实验结果：如图4所示的基因转染载体G5-F3-26与其它转染载体在HEK293细胞中转染绿色荧光蛋白基因的转染效率对比图，其中，N/P为氮磷比。图4表明，以G5-F3-26为基因载体，绿色荧光蛋白基因为报告基因，在氮磷比为14∶1时转染HEK293细胞的效率(14.17％)不及商业化试剂bPEI25kD在优化条件下氮磷比为8∶1时的转染效率(32.24％)的效果，但是此结果高于第五代聚酰胺-胺树形高分子在最优条件下氮磷比为8∶1时的转染效率(2.89％)。如图4所示，基因转染载体G5-F3-26在氮磷比为14∶1时转染绿色荧光蛋白平均荧光强度(363.59)不及商业化试剂bPEI25kD在优化条件下氮磷比为8∶1时的绿色荧光蛋白平均荧光强度(1334.35)，但是超过第五代聚酰胺-胺树形高分子在最优条件下氮磷比为8∶1时的绿色荧光蛋白平均荧光强度(205.12)。因此这种材料能够提高树形分子在HEK293细胞中的基因转染效果。

实施例2：以1∶64的比例制备基于三氟乙酰化的第五代聚酰胺-胺树形高分子的基因转染新材料。

以基于在表面共价连接三氟乙酰化修饰的第五代聚酰胺-胺树形高分子的材料为例，其结构如下所示：

其中，a的理论预期为64，G5为第五代聚酰胺-胺树形高分子，其中，中心核M为乙二胺，末端基团为128个伯胺基团，其结构式如下：

制备合成方法：取50毫克的第五代聚酰胺-胺树形高分子，将其溶于2毫升甲醇溶液，向该溶有树形高分子的甲醇溶液中缓慢滴加18.57微升三乙胺，再向该溶液中缓慢逐滴滴加溶有15.43微升的三氟乙酸酐甲醇溶液1毫升，滴加完成后将该反应溶液在室温下继续搅拌反应12小时，即可得到外观为白色粉末的基于表面三氟乙酰化修饰的第五代聚酰胺-胺树形高分子材料并命名为G5-F3-64。

以茚三酮检测法表征检测本实施例中制备的G5-F3-64基因转染载体：以茚三酮检测法表征检测所制备的基因转染载体G5-F3-64的三氟乙酰化效率。

具体实施方法：向1.5毫升的EP管中分别加入体积为0，12.5，25，37.5，50，62.5，75，87.5，100微升的0.2毫克/毫升的PAMAM树枝形分子水溶液。然后，每一个管中加入100微升的乙酸钠缓冲液(0.2摩尔/升，pH＝5.4)和100微升的茚三酮溶液，用双蒸水补充到最终体积300微升，然后沸水中加热10分钟。用紫外可见分光光度计在570纳米处比色，测定各个样品的吸收。以G5PAMAM树形高分子的浓度为横坐标，样品的在570纳米的吸收为纵坐标，作标准曲线。

将14.11克的乙酸钠溶解在86毫升的双蒸水中得到2摩尔/升的乙酸钠溶液，然后加入14毫升的2摩尔/升的乙酸，调节pH值使pH＝5.4。将85毫克的还原茚三酮和15毫克的茚三酮溶解在10毫升的乙二醇甲醚溶液中。在1.5毫升的EP管中加入100微升的样品和100微升的乙酸钠缓冲液，混匀后加入100微升的还原茚三酮溶液。将EP管在沸水中加热10分钟，冷却后每管加入300微升60∶40乙醇水溶液。用紫外可见分光光度计在570纳米处比色，测定各个样品的吸收。参照以G5PAMAM树形高分子制作的标准曲线，计算出表面伯氨基的数量，进而以差量的形式计算出树形高分子表面三氟乙酰化的效率。

以NMR法表征检测G5-F3-64基因转染载体：以一维核磁氢谱(¹H NMR)检测表征所制备的基因转染载体G5-F3-64的三氟乙酰化效率。

具体方法为：取5毫克实施例2中合成的基因转染载体，溶于2毫升甲醇溶液，向该溶有树枝形分子的甲醇溶液中分别滴加41微升三乙胺，再向该溶液中逐滴滴加溶有23微升的乙酸酐甲醇溶液1毫升，滴加完成后将该反应溶液在室温下继续搅拌反应12小时，得到表面完全乙酰化的基于三氟乙酰化的第五代聚酰胺-胺树形高分子材料，并命名为Ac-G5-F3-64。

将所制备的基因转染载体Ac-G5-F3-64溶于D₂O，浓度大约5毫克/毫升，进行核磁共振分析。根据¹H NMR图谱，如图2所示，计算氨基乙酰化的比例，以差量的形式计算树形高分子表面三氟乙酰化的效率。如图3所示，得到的结果和用茚三酮检测法中紫外可见分光光度计比色法得到的结果计算比较。

实验结果：如图3所示，两种方法测定的结果比较吻合。根据计算对比，每个树形高分子表面连接了44个三氟乙酰化基团，因此修改基于三氟乙酰化的第五代聚酰胺-胺树形高分子的名称为G5-F3-44。

基因转染载体G5-F3-44的基因转染效率：将本实施例中所制备的基因转染试剂G5-F3-44和绿色荧光蛋白质粒DNA在室温下形成基因复合物，然后在HEK293细胞中进行转染，通过检测绿色荧光蛋白的表达量来评估载体的基因转染效率。

具体方法为：将HEK293细胞培养在24孔板中孵育24小时，将0.8微克绿色荧光蛋白质粒DNA与G5-F3-44以氮磷比为14的比例混合后加入到含10％血清的培养基中混匀，体积为100微升，静置半小时后加入150微升含10％血清的培养基。含有复合物的培养基与细胞一起孵育6小时后加入含10％血清的培养基500微升。48小时后处理细胞，用胰酶消化，并用300微升PBS缓冲液重悬，立即用流式细胞术检测成功转染绿色荧光蛋白的细胞百分比。第五代聚酰胺-胺树形高分子作为阴性对照，bPEI25kD作为阳性对照。

实验结果：如图5所示的基因转染载体G5-F3-44与其它转染载体在HEK293细胞中转染绿色荧光蛋白基因的转染效率对比图，其中，N/P为氮磷比。图5表明，以G5-F3-44为载体，绿色荧光蛋白基因为报告基因，氮磷比为14∶1时转染HEK293细胞的效率(15.42％)与商业化试剂bPEI25kD在优化条件下氮磷比为8∶1时的转染效率(32.24％)相比没有超过bPEI25kD的效果，但是此结果高于第五代聚酰胺-胺树形高分子在最优条件下氮磷比为8∶1时的转染效率(2.89％)。如图5所示，基因转染载体G5-F3-44在氮磷比为14∶1时转染绿色荧光蛋白平均荧光强度(415.24)没有超过商业化试剂bPEI25kD在优化条件下氮磷比为8∶1时的绿色荧光蛋白平均荧光强度(1334.35)，但是高于第五代聚酰胺-胺树形高分子在最优条件下氮磷比为8∶1时的绿色荧光蛋白平均荧光强度(205.12)。因此这种材料能够提高树形分子在HEK293细胞中的基因转染效果。

实施例3：以1∶32的比例制备基于五氟丙酰化的第五代聚酰胺-胺树形高分子的基因转染新材料。

以基于共价连接五氟丙酰化修饰的第五代聚酰胺-胺树形高分子的材料为例，其结构如下所示：

其中，a的理论预期为32，G5为第五代聚酰胺-胺树形高分子，其中心核为乙二胺，末端基团为128个伯胺基团，其结构式如下：

制备合成方法：取50毫克的第五代聚酰胺-胺树形高分子，将之溶于2毫升甲醇溶液，向该溶有树枝形分子的甲醇溶液中滴加9.25微升三乙胺，再向该溶液中逐滴滴加溶有10.95微升的五氟丙酸酐甲醇溶液1毫升，滴加完成后将该反应溶液在室温下继续搅拌反应12小时，即可得到外观为白色粉末的基于表面五氟丙酰化修饰的第五代聚酰胺-胺树形高分子材料并命名为G5-F5-32。

以茚三酮检测法表征检测G5-F5-32基因转染载体：以茚三酮法表征检测所制备的基因转染载体G5-F5-32的五氟丙酰化效率。

具体实施方法：向1.5毫升的EP管中分别加入体积为0，12.5，25，37.5，50，62.5，75，87.5，100微升的0.2毫克/毫升的PAMAM树枝形分子溶液。然后，每一个管中加入100微升的乙酸钠缓冲液(0.2摩尔/升，pH＝5.4)和100微升的茚三酮溶液，用双蒸水补充到最终体积300微升，然后沸水中加热10分钟。用紫外可见分光光度计在570纳米处比色，测定各个样品的吸收。以G5PAMAM树形高分子的浓度为横坐标，样品的在570纳米的吸收为纵坐标，作标准曲线。

将14.11克的乙酸钠溶解在86毫升的双蒸水中得到2摩尔/升的乙酸钠溶液，然后加入14毫升的2摩尔/升的乙酸，调节pH值使pH＝5.4。将85毫克的还原茚三酮和15毫克的茚三酮溶解在10毫升的乙二醇甲醚溶液中。在1.5毫升的EP管中加入100微升的样品和100微升的乙酸钠缓冲液，混匀后加入100微升的还原茚三酮溶液。将EP管在沸水中加热10分钟，冷却后每管加入300微升60∶40乙醇水溶液。用紫外可见分光光度计在570纳米处比色，测定各个样品的吸收。参照以G5PAMAM树形高分子制作的标准曲线，计算出表面伯氨基的数量，进而以差量的形式计算出树形高分子表面五氟丙酰化的效率。

以NMR法表征检测G5-F5-32基因转染载体：以一维核磁氢谱(¹H NMR)检测表征所制备的基因转染载体G5-F5-32的五氟丙酰化效率。

具体方法为：取5毫克实施例3中合成的基因转染载体，溶于2毫升甲醇溶液，向该溶有树枝形分子的甲醇溶液中分别滴加41微升三乙胺，再向该溶液中逐滴滴加溶有23微升的乙酸酐甲醇溶液1毫升，滴加完成后将该反应溶液在室温下继续搅拌反应12小时，得到表面完全乙酰化的基于五氟丙酰化的第五代聚酰胺-胺树形高分子材料，并命名为Ac-G5-F5-32。

将所制备的基因转染载体Ac-G5-F5-32溶于D₂O，浓度大约5毫克/毫升，进行核磁共振分析。根据¹H NMR图谱，如图2所示，计算氨基乙酰化的比例，以差量的形式计算树形高分子表面五氟丙酰化的效率。如图3所示，得到的结果和用茚三酮检测法中紫外可见分光光度计比色法得到的结果比较。

实验结果：如图3所示，两种方法测定的结果比较吻合，根据计算对比，每个树形高分子表面连接了36个五氟丙酰化基团，因此修改基于五氟丙酰化的第五代聚酰胺-胺树形高分子的名称为G5-F5-36。

基因转染载体G5-F5-36的基因转染效率：将本实施例中所制备的基因转染试剂G5-F5-36和绿色荧光蛋白质粒DNA在室温下形成基因复合物，然后在HEK293细胞中进行转染，通过检测绿色荧光蛋白的表达量来评估载体的基因转染效率。

具体方法为：将HEK293细胞培养在24孔板中孵育24小时，将0.8微克绿色荧光蛋白质粒DNA与G5-F5-36以氮磷比为8混合后加入到含10％血清的培养基中混匀，体积为100微升，静置半小时后加入150微升含10％血清的培养基。含有复合物的培养基与细胞一起孵育6小时后加入含10％血清的培养基500微升。48小时后处理细胞，用胰酶消化，并用300微升PBS缓冲液重悬，立即用流式细胞仪检测成功转染绿色荧光蛋白的细胞百分比。第五代聚酰胺-胺树形高分子作为阴性对照，bPEI25kD作为阳性对照。

实验结果：如图6所示的基因转染载体G5-F5-36与其它转染载体在HEK293细胞中转染绿色荧光蛋白基因的转染效率对比图，其中，N/P为氮磷比。图6表明，用G5-F5-36为载体，绿色荧光蛋白基因为报告基因，氮磷比为8∶1时转染HEK293细胞的效率(12.13％)与商业化试剂bPEI25kD在优化条件下氮磷比为8∶1时的转染效率(32.24％)相比没有超过bPEI25kD的效果，但是高于第五代聚酰胺-胺树形高分子在最优条件下氮磷比为8∶1时的转染效率(2.89％)。如图6所示，基因转染载体G5-F3-44在氮磷比为8∶1时转染绿色荧光蛋白平均荧光强度(266.52)没有超过商业化试剂bPEI25kD在优化条件下氮磷比为8∶1时的绿色荧光蛋白平均荧光强度(1334.35)，但是超过第五代聚酰胺-胺树形高分子在最优条件下氮磷比为8∶1时的绿色荧光蛋白平均荧光强度(205.12)。因此这种材料能够提高树形分子在HEK293细胞中的基因转染效果。

实施例4：以1∶64的比例制备基于五氟丙酰化的第五代聚酰胺-胺树形高分子的基因转染新材料。

以基于共价连接五氟丙酰化修饰的第五代聚酰胺-胺树形高分子的材料为例，其结构如下所示：

其中，a的理论预期为64，G5为第五代聚酰胺-胺树形高分子，其中中心核为乙二胺，末端基团为128个伯胺基团，其结构式如下：

制备合成方法：取50毫克的第五代聚酰胺-胺树形高分子，将其溶于2毫升甲醇溶液，向该溶有树枝形分子的甲醇溶液中滴加18.57微升三乙胺，再向该溶液中逐滴滴加溶有21.91微升的五氟丙酸酐甲醇溶液1毫升，滴加完成后将该反应溶液在室温下继续搅拌反应12小时，即可得到外观为白色粉末的基于五氟丙酰化修饰的第五代聚酰胺-胺树形高分子材料并命名为G5-F5-64。

以茚三酮检测法表征检测G5-F5-64基因转染载体：以茚三酮检测法表征检测所制备的基因转染载体G5-F5-64的五氟丙酰化效率。

具体实施方法：向1.5毫升的EP管中分别加入体积为0，12.5，25，37.5，50，62.5，75，87.5，100微升的0.2毫克/毫升的PAMAM树枝形分子溶液。然后，每一个管中加入100微升的乙酸钠缓冲液(0.2摩尔/升，pH＝5.4)和100微升的茚三酮溶液，用双蒸水补充到最终体积300微升，然后沸水中加热10分钟。用紫外可见分光光度计在570纳米处比色，测定各个样品的吸收。以G5PAMAM树形高分子的浓度为横坐标，样品的在570纳米的吸收为纵坐标，作标准曲线。

将14.11克的乙酸钠溶解在86毫升的双蒸水中得到2摩尔/升的乙酸钠溶液，然后加入14毫升的2摩尔/升的乙酸，调节pH值使pH＝5.4。将85毫克的还原茚三酮和15毫克的茚三酮溶解在10毫升的乙二醇甲醚中。在1.5毫升的EP管中加入100微升的样品和100微升的乙酸钠缓冲液，混匀后加入100微升的还原茚三酮溶液。将EP管在沸水中加热10分钟，冷却后每管加入300微升60∶40乙醇水溶液。用紫外可见分光光度计在570纳米处比色，测定各个样品的吸收。参照以G5PAMAM树形高分子制作的标准曲线，计算出表面伯氨基的数量，进而计算出树形高分子表面五氟丙酰化的效率。

以NMR法表征检测G5-F5-64基因转染载体：以一维核磁氢谱(¹H NMR)检测表征所制备的基因转染载体G5-F5-64的五氟丙酰化效率。

具体方法为：取5毫克本实施例中合成的基因转染载体，溶于2毫升甲醇溶液，向该溶有树枝形分子的甲醇溶液中分别滴加41微升三乙胺，再向该溶液中逐滴滴加溶有23微升的乙酸酐甲醇溶液1毫升，滴加完成后将该反应溶液在室温下继续搅拌反应12小时，得到表面完全乙酰化的基于五氟丙酰化的第五代聚酰胺-胺树形高分子材料，并命名为Ac-G5-F5-64。

将所制备的基因转染载体Ac-G5-F5-64溶于D₂O，浓度大约5毫克/毫升，进行核磁共振分析。根据¹H NMR图谱，如图2所示，计算氨基乙酰化的比例，反推树形高分子表面五氟丙酰化的效率。如图3所示，得到的结果和用茚三酮检测法中紫外可见分光光度计比色法得到的结果比较。

实验结果：如图3所示，两种方法测定的结果比较吻合。根据计算对比，每个树形高分子表面连接了48个五氟丙酰化基团，因此修改基于五氟丙酰化的第五代聚酰胺-胺树形高分子的名称为G5-F5-48。

基因转染载体G5-F5-48的基因转染效率：将本实施例中所制备的基因转染试剂G5-F5-48和绿色荧光蛋白质粒DNA在室温下形成复合物，然后在HEK293细胞中进行转染，通过检测绿色荧光蛋白的表达量来评估载体的基因转染效率。

具体方法为：将HEK293细胞培养在24孔板中孵育24小时，将0.8微克绿色荧光蛋白质粒DNA与G5-F5-48以氮磷比为11混合后加入到含10％血清的培养基中混匀，体积为100微升，静置半小时后加入150微升含10％血清的培养基。含有复合物的培养基与细胞一起孵育6小时后加入含10％血清的培养基500微升。48小时后处理细胞，用胰酶消化，并用300微升PBS缓冲液重悬，立即用流式细胞仪检测成功转染绿色荧光蛋白的细胞百分比。第五代聚酰胺-胺树形高分子作为阴性对照，bPEI25kD作为阳性对照。

实验结果：如图7所示的基因转染载体G5-F5-48与其它转染载体在HEK293细胞中转染绿色荧光蛋白基因的转染效率对比图，其中，N/P为氮磷比。图7表明G5-F5-48成功转染绿色荧光蛋白的细胞百分比高于bPEI25kD和第五代聚酰胺-胺树形高分子。用G5-F5-48为载体，绿色荧光蛋白基因为报告基因，氮磷比为11∶1时转染HEK293细胞的效率(30.36％)与商业化试剂bPEI25kD在优化条件下氮磷比为8∶1时的转染效率(32.24％)相当，但是明显高于第五代聚酰胺-胺树形高分子在各自最优条件下氮磷比为8∶1时的转染效率(2.89％)。如图7所示，基因转染载体G5-F5-48在氮磷比为11∶1时转染绿色荧光蛋白平均荧光强度(811.73)没有超过商业化试剂bPEI25kD在优化条件下氮磷比为8∶1时的绿色荧光蛋白平均荧光强度(1334.35)，但是超过第五代聚酰胺-胺树形高分子在最优条件下氮磷比为8∶1时的绿色荧光蛋白平均荧光强度(205.12)。因此这种材料能够提高树形分子在HEK293细胞中的基因转染效果。

实施例5：以1∶32的比例制备基于七氟丁酰化的第五代聚酰胺-胺树形高分子的基因转染新材料。

以基于共价连接七氟丁酰化修饰的第五代聚酰胺-胺树形高分子的材料为例，其结构如下所示：

其中，a，理论预期为32，G5为第五代聚酰胺-胺树形高分子，中心核为乙二胺，末端基团为128个伯胺基团，其结构式如下：

制备合成方法：取50毫克的第五代聚酰胺-胺树形高分子溶于2毫升甲醇溶液，向该溶有树枝形分子的甲醇溶液中滴加9.25微升三乙胺，再向该溶液中逐滴滴加溶有13.6微升的五氟丙酸酐甲醇溶液1毫升，滴加完成后将该反应溶液在室温下继续搅拌反应12小时，即可得到外观为白色粉末的基于表面七氟丁酰化修饰的第五代聚酰胺-胺树形高分子材料并命名为G5-F7-32。

以茚三酮法表征检测G5-F7-32基因转染载体：以茚三酮法表征检测所制备的基因转染载体G5-F7-32的七氟丁酰化效率。

具体实施方法：向1.5毫升的EP管中分别加入体积为0，12.5，25，37.5，50，62.5，75，87.5，100微升的0.2毫克/毫升的PAMAM树枝形分子溶液。然后，每一个管中加入100微升的乙酸钠缓冲液(0.2摩尔/升，pH＝5.4)和100微升的茚三酮溶液，用双蒸水补充到最终体积300微升，然后沸水中加热10分钟。用紫外可见分光光度计在570纳米处比色，测定各个样品的吸收。以G5PAMAM树形高分子的浓度为横坐标，样品的在570纳米的吸收为纵坐标，作标准曲线。

将14.11克的乙酸钠溶解在86毫升的双蒸水中得到2摩尔/升的乙酸钠溶液，然后加入14毫升的2摩尔/升的乙酸，调节pH值使pH＝5.4。将85毫克的还原茚三酮和15毫克的茚三酮溶解在10毫升的乙二醇甲醚中。在1.5毫升的EP管中加入100微升的样品和100微升的乙酸钠缓冲液，混匀后加入100微升的还原茚三酮溶液。将EP管在沸水中加热10分钟，冷却后每管加入300微升60∶40乙醇水溶液。用紫外可见分光光度计在570纳米处比色，测定各个样品的吸收。参照以G5PAMAM树形高分子制作的标准曲线，计算出表面伯氨基的数量，进而计算出树形高分子表面七氟丁酰化的效率。

以NMR法表征检测G5-F7-32基因转染载体：以一维核磁氢谱(¹H NMR)检测表征所制备的基因转染载体G5-F7-32的七氟丁酰化效率。

具体方法为：取5毫克本实施例中合成的基因转染载体，溶于2毫升甲醇溶液，向该溶有树枝形分子的甲醇溶液中分别滴加41微升三乙胺，再向该溶液中逐滴滴加溶有23微升的乙酸酐甲醇溶液1毫升，滴加完成后将该反应溶液在室温下继续搅拌反应12小时，得到完全乙酰化的基于七氟丁酰化的第五代聚酰胺-胺树形高分子材料，并命名为G5-F7-32。

将所制备的基因转染载体G5-F7-32溶于D₂O，浓度大约5毫克/毫升，进行核磁共振分析。根据¹H NMR图谱，如图2所示，计算氨基乙酰化的比例，以差量的形式计算树形高分子表面七氟丁酰化的效率。如图3所示，得到的结果和用茚三酮检测中紫外可见分光光度计比色法得到的结果比较。

实验结果：如图3所示，两种方法测定的结果比较吻合。根据计算对比，每个树形高分子表面连接了49个七氟丁酰化基团，因此修改基于七氟丁酰化的第五代聚酰胺-胺树形高分子的名称为G5-F7-49。

基因转染载体G5-F7-49与DNA复合物的稳定性：将在本实施例中所制备的基因转染载体G5-F7-49和绿色荧光蛋白质粒DNA(pEGFP-1)在室温下形成基因复合物，通过琼脂糖凝胶电泳检测基因转染试剂G5-F7-49复合DNA的能力。

具体方法为：将基因转染试剂G5-F7-49与绿色荧光蛋白质粒DNA(pEGFP-1)按不同的氮磷比(分别为0∶1，0.5∶1，1∶1，2∶1，4∶1和8∶1)室温下混合，孵育30分钟，然后用DNA上样缓冲液稀释，最后将样品在90伏特电压下进行琼脂糖凝胶电泳实验，实验时间为50分钟，琼脂糖凝胶的浓度为1％。实验中以单独的绿色荧光蛋白质粒DNA(pEGFP-1)作为对照。实验结果：如图8所示的基因转染载体G5-F7-49与DNA形成的复合物的琼脂糖凝胶电泳图，其中，N/P为氮磷比。图8表明基因转染试剂G5-F7-49与DNA以0.5∶1以上的氮磷比混合时形成稳定的复合物。

基因转染载体G5-F7-49动态光散射尺寸以及zeta电势的检测：将在本实施例中所制备的基因转染试剂G5-F7-49和绿色荧光蛋白质粒DNA(pEGFP-1)在室温下形成复合物，通过动态光散射以及zeta电势检测基因转染试剂G5-F7-49复合DNA的能力及特征。具体方法为：将在本实施例中所制备的基因转染试剂G5-F7-49与绿色荧光蛋白质粒DNA(pEGFP-1)按不同的氮磷比(分别为0∶1，0.5∶1，1∶1，2∶1，4∶1和8∶1)室温下混合成水溶液，其中DNA含量为1.6微克/1.5毫升。孵育30分钟，检测动态光散射尺寸以及zeta电势。如图9所示，裸DNA分子在溶液中的尺寸在1200纳米左右，而DNA分子与基因转染载体G5-F7-49能够形成复合物，在0.5∶1至8∶1的氮磷比条件下形成尺寸在200纳米左右或以下的复合物。如图10所示，当氮磷比在0.5∶1时，复合物的水溶液中的电势为负，当氮磷比等于或大于1时，复合物的水溶液中的电势为正。这说明在低氮磷比的条件下，基因转染载体G5-F7-49能够与绿色荧光蛋白质粒DNA(pEGFP-1)形成200纳米左右的复合物。

基因转染载体G5-F7-49的基因转染效率：将基因转染载体G5-F7-49和荧光素酶或绿色荧光蛋白质粒DNA在室温下形成复合物，然后在HEK293细胞或者HeLa细胞中进行转染，通过检测绿色荧光蛋白的表达量评估载体的基因转染效率。

具体方法为：将HEK293细胞或者HeLa细胞培养在24孔板中孵育24小时，将0.8微克荧光素酶或绿色荧光蛋白质粒DNA与G5-F7-49以氮磷比为7混合后加入到含10％血清的培养基中混匀，体积为100微升，静置半小时后加入150微升含10％血清的培养基。含有复合物的培养基与细胞一起孵育6小时后加入含10％血清的培养基500微升。48小时后处理细胞，用胰酶消化，荧光素酶表达量的检测方法参照出厂商(Promega公司)提供的使用说明。以第五代聚酰胺-胺树形高分子作为阴性对照，Lipofectamine2000作为阳性对照。在绿色荧光蛋白质粒的转染实验中，采用流式细胞仪定量分析转染绿色荧光蛋白的效率。具体方法为：绿色荧光蛋白基因转染24小时后，用胰酶将细胞消化，并用300微升PBS缓冲液重悬，随后立即用流式细胞仪检测成功转染绿色荧光蛋白的细胞百分比。以第五代聚酰胺-胺树形高分子作为阴性对照，Lipofectamine2000作为阳性对照。

实验结果：(1)如图11所示的基因转染载体G5-F7-49与其它转染载体在HEK293(a)、HeLa(b)细胞中转染绿色荧光蛋白基因的转染效率对比图，其中，N/P为氮磷比。图11(a)表明G5-F7-49成功转染绿色荧光蛋白的细胞百分比高于商业化试剂bPEI25kD以及Lipofectamine2000，以及第五代聚酰胺-胺树形高分子。用G5-F7-49为载体，绿色荧光蛋白基因为报告基因，氮磷比为7∶1时转染HEK293细胞的效率(49.83％)高于bPEI25kD在优化条件下氮磷比为10∶1时的转染效率(32.24％)，虽然不能超过商业化转染试剂Lipofectamine2000的转染效率(70.84％)，但是远高于第5代聚酰胺-胺树形高分子在优化条件下氮磷比为8∶1时的转染效率(2.89％)。如图11(a)所示，基因转染载体G5-F7-49在氮磷比为7∶1时转染绿色荧光蛋白平均荧光强度(1341.79)与商业化试剂bPEI25kD在优化条件下氮磷比为8∶1时的绿色荧光蛋白平均荧光强度(1334.35)以及Lipofectamine2000(1237.33)相当，远超过第五代聚酰胺-胺树形高分子在最优条件下氮磷比为8∶1时的绿色荧光蛋白平均荧光强度(205.12)。如图11(b)，在HeLa细胞中，G5-F7-49在氮磷比为7时，成功转染绿色荧光蛋白的细胞百分比(32.1％)不及商业化试剂Lipofectamine2000(64.2％)相当，但远高于第5代聚酰胺-胺树形高分子在优化条件下氮磷比为8∶1时的转染效率(3.78％)。以G5-F7-49为载体，氮磷比为7时，转染绿色荧光蛋白平均荧光强度(330)与商业化试剂Lipofectamine2000(331)相当，远超过第五代聚酰胺-胺树形高分子在最优条件下氮磷比为8∶1时的绿色荧光蛋白平均荧光强度(28.295)。此结果说明本实施例的基因转染载体G5-F7-49能够提高第5代聚酰胺-胺树形高分子的基因转染效率，可媲美商业化试剂Lipofectamine2000。

(2)如图12所示的基因转染载体G5-F7-49与其它转染载体在HEK293(a)、HeLa(b)细胞中转染荧光素酶基因的转染效率对比图，其中，N/P为氮磷比。图12(a)表明在HEK293细胞中，G5-F7-49的转染效率与市场化的转染试剂Lipofectamine2000的效率相当，并远高于第五代聚酰胺-胺树形高分子的效率。在HeLa细胞中，G5-F7-49的转染效率超过市场化的转染试剂Lipofectamine2000，并远高于第五代聚酰胺-胺树形高分子的效率。用G5-F7-49为载体，荧光素酶基因为报告基因，氮磷比为7时转染HEK293细胞的转染效率与Lipofectamine2000效率相当，并远高于第5代聚酰胺-胺树形高分子在优化条件下氮磷比为8∶1时的转染效率。图12(b)表明，氮磷比为6、7、8时，用G5-F7-49为载体，转染HeLa细胞的转染效率超过Lipofectamine2000效率，并远高于第5代聚酰胺-胺树形高分子在优化条件下氮磷比为8∶1时的转染效率。以上两个结果说明本实施例合成的基因转染载体能够提高树形分子在HEK293、HeLa细胞中的基因转染效果，能够媲美甚至超过商业化试剂Lipofectamine2000。

基因转染载体G5-F7-49的细胞毒性以及G5-F7-49与DNA形成复合物后对细胞活性的影响：研究基因转染载体G5-F7-49以及其与DNA形成的复合物对细胞的活性影响。

具体实验方法是：在96孔板中孵育HEK293或HeLa细胞，细胞密度为10⁴细胞/孔，培养12小时后将培养基移出，加入100微升含一定量G5-F7-49或G5-F7-49/DNA复合物的新鲜培养基(含10％血清)，培养48小时。通过MTT法检测细胞活性。

实验结果：(1)如图15所示的基因转染载体G5-F7-49与其它转染载体对(a)HEK293，(b)HeLa细胞的毒性对比图。图15表明在细胞转染条件下，基因转染载体G5-F7-49相对于Lipofectmine2000和第五代聚酰胺-胺树形高分子具有较低的细胞毒性，细胞存活率为90％以上，在HeLa细胞和HEK293细胞中都表现出较低的细胞毒性。

(2)如图16所示的基因转染载体G5-F7-49与其它转染载体在与DNA形成复合物后对HEK293(a)、HeLa(b)细胞的毒性对比图，图16表明G5-F7-49与DNA形成复合物后并没有产生额外的细胞毒性，细胞存活率为90％以上，说明本发明基因转染载体具有较高的生物安全性。

实施例6：以1∶64的比例制备基于七氟丁酰化的第五代聚酰胺-胺树形高分子的基因转染新材料。

以基于共价连接七氟丁酰化修饰的第五代聚酰胺-胺树形高分子的材料为例，其结构如下：

其中，a的理论预期为64，G5为第五代聚酰胺-胺树形高分子，其中，中心核为乙二胺，末端基团为128个伯胺基团，其结构式如下：

制备合成方法：取50毫克的第五代聚酰胺-胺树形高分子溶于2毫升甲醇溶液，向该溶有树枝形分子的甲醇溶液中缓慢滴加18.57微升三乙胺，再向该溶液中缓慢逐滴滴加溶有27.19微升的五氟丙酸酐甲醇溶液1毫升，滴加完成后将该反应溶液在室温下继续搅拌反应12小时，即可得到外观为白色粉末的基于表面七氟丁酰化修饰的第五代聚酰胺-胺树形高分子材料并命名为G5-F7-64。

以茚三酮检测法表征检测G5-F7-64基因转染载体：以茚三酮检测法表征检测所制备的基因转染载体G5-F7-64的七氟丁酰化效率。

具体实施方法：向1.5毫升的EP管中分别加入体积为0，12.5，25，37.5，50，62.5，75，87.5，100微升的0.2毫克/毫升的PAMAM树枝形分子溶液。然后，每一个管中加入100微升的乙酸钠缓冲液(0.2摩尔/升，pH＝5.4)和100微升的茚三酮溶液，用双蒸水补充到最终体积300微升，然后沸水中加热10分钟。用紫外可见分光光度计在570纳米处比色，测定各个样品的吸收。以G5PAMAM树形高分子的浓度为横坐标，样品的在570纳米的吸收为纵坐标，作标准曲线。

将14.11克的乙酸钠溶解在86毫升的双蒸水中得到2摩尔/升的乙酸钠溶液，然后加入14毫升的2摩尔/升的乙酸，调节pH值使pH＝5.4。将85毫克的还原茚三酮和15毫克的茚三酮溶解在10毫升的乙二醇甲醚中。在1.5毫升的EP管中加入100微升的样品和100微升的乙酸钠缓冲液，混匀后加入100微升的还原茚三酮溶液。将EP管在沸水中加热10分钟，冷却后每管加入300微升60∶40乙醇水溶液。用紫外可见分光光度计在570纳米处比色，测定各个样品的吸收。参照以G5PAMAM树形高分子制作的标准曲线，计算出表面伯氨基的数量，进而以差量的形式计算出树形高分子表面七氟丁酰化的效率。

以NMR法表征检测G5-F7-64基因转染载体：以一维核磁氢谱(¹H NMR)检测表征所制备的基因转染载体G5-F7-64的七氟丁酰化效率。

具体方法为：取5毫克本实施例中合成的基因转染载体，溶于2毫升甲醇溶液，向该溶有树枝形分子的甲醇溶液中分别滴加41微升三乙胺，再向该溶液中逐滴滴加溶有23微升的乙酸酐甲醇溶液1毫升，滴加完成后将该反应溶液在室温下继续搅拌反应12小时，得到表面完全乙酰化的基于七氟丁酰化的第五代聚酰胺-胺树形高分子材料，并命名为G5-F7-64。

将所制备的基因转染载体G5-F7-64溶于D₂O，浓度大约5毫克/毫升，进行核磁共振分析。根据¹H NMR图谱，如图2所示，计算氨基乙酰化的比例，以差量的形式计算树形高分子表面七氟丁酰化的效率。如图3所示，得到的结果和用茚三酮检测中紫外可见分光光度计比色法得到的结果计算比较。

实验结果：如图3所示，两种方法测定的结果比较吻合。根据计算对比，每个树形高分子表面连接子68个七氟丁酰化基团，因此修改基于七氟丁酰化的第五代聚酰胺-胺树形高分子的名称为G5-F7-68。

基因转染载体G5-F7-68与DNA复合物的稳定性：将在本实施例中所制备的基因转染试剂G5-F7-68和绿色荧光蛋白质粒DNA(pEGFP-1)在室温下形成复合物，通过琼脂糖凝胶电泳检测基因转染试剂G5-F7-68复合DNA的能力。

具体方法为：将基因转染试剂G5-F7-68与绿色荧光蛋白质粒DNA(pEGFP-1)按不同的氮磷比(分别为0∶1，0.5∶1，1∶1，2∶1，4∶1和8∶1)室温下混合，孵育30分钟，然后用DNA上样缓冲液稀释，最后将样品在90伏特电压下进行琼脂糖凝胶电泳实验，实验时间为50分钟，琼脂糖凝胶的浓度为1％。实验中以单独的绿色荧光蛋白质粒DNA(pEGFP-1)作为对照。通过聚阴离子竞争法进一步分析G5-F7-68/DNA复合物的稳定性：将基因转染试剂G5-F7-68与绿色荧光蛋白质粒DNA(pEGFP-1)以氮磷比为4的比例室温下混合，孵育30分钟。将G5PAMAM树形高分子与绿色荧光蛋白质粒DNA(pEGFP-1)以氮磷比为8的比例室温下混合，孵育30分钟。分别以电荷比为0、1/0.4、1/0.8、1/2、1/4的比例配置肝素钠与氮磷比为4的G5-F7-68/DNA复合物的混合溶液，室温孵育10分钟，实验中以单独的绿色荧光蛋白质粒DNA(pEGFP-1)作为对照。最后将样品在90伏特电压下进行琼脂糖凝胶电泳实验，实验时间为50分钟，琼脂糖凝胶的浓度为1％。

实验结果：(1)如图8(a)所示的基因转染载体G5-F7-68与DNA形成的复合物的琼脂糖凝胶电泳图，其中，N/P为氮磷比。图8表明基因转染试剂G5-F7-68与DNA以0.5∶1以上的氮磷比混合时形成稳定的复合物。

(2)如图8(b)所示，基因转染载体G5-F7-68与DNA形成的复合物在较低电荷比的肝素竞争下相比G5PAMAM树形高分子先释放DNA，基因转染载体G5-F7-68与DNA形成的复合物结构相对G5PAMAM树形高分子较为松散。这不仪是因为配置的样品中基因转染载体G5-F7-68与DNA的电荷密度小于G5PAMAM树形高分子，也因为其疏水疏脂的性质引起DNA的释放。以上结果说明，这说明基因转染载体G5-F7-68可以有效地结合质粒DNA，且相对于G5PAMAM树形高分子较易释放DNA分子，有利于细胞转染中DNA在保内的释放以及表达。

基因转染载体G5-F7-68动态光散射尺寸以及zeta电势的检测：将在本实施例中所制备的基因转染试剂G5-F7-68和绿色荧光蛋白质粒DNA(pEGFP-1)在室温下形成复合物，通过动态光散射以及zeta电势检测基因转染试剂G5-F7-68复合DNA的能力及特征。

具体方法为：将在本实施例中所制备的基因转染试剂G5-F7-68与绿色荧光蛋白质粒DNA(pEGFP-1)按不同的氮磷比(分别为0∶1，0.5∶1，1∶1，2∶1，4∶1和8∶1)室温下混合成水溶液，其中DNA含量为1.6微克/1.5毫升。孵育30分钟，检测动态光散射尺寸以及zeta电势。

实验结果：如图9所示，裸DNA分子在溶液中的尺寸在1200纳米左右，而DNA分子与基因转染载体G5-F7-68能够形成复合物，在0.5∶1至8∶1的氮磷比条件下形成尺寸在200纳米左右或以下的复合物。如图10所示，当氮磷比在0.5∶1时，复合物的水溶液中的电势为负，当氮磷比等于或大于1时，复合物的水溶液中的电势为正。这说明在低氮磷比的条件下，基因转染载体G5-F7-68能够与绿色荧光蛋白质粒DNA(pEGFP-1)形成200纳米左右的复合物。

基因转染载体G5-F7-68的基因转染效率：将基因转染载体G5-F7-68和绿色荧光蛋白质粒DNA在室温下形成复合物，然后在HEK293细胞以及HeLa细胞中进行转染，通过检测绿色荧光蛋白的表达量评估载体的基因转染效率。

具体方法为：将HEK293细胞或者HeLa细胞培养在24孔板中孵育24小时，将0.8微克荧光素酶或绿色荧光蛋白质粒DNA与G5-F7-68以氮磷比为2混合后加入到含10％血清的培养基中混匀，体积为100微升，静置半小时后加入150微升含10％血清的培养基。含有复合物的培养基与细胞一起孵育6小时后加入含10％血清的培养基500微升。48小时后处理细胞，用胰酶消化，荧光素酶表达量的检测方法参照出厂商(Promega公司)提供的使用说明。以第五代聚酰胺-胺树形高分子作为阴性对照，Lipofectamine2000作为阳性对照。在绿色荧光蛋白质粒的转染实验中，采用流式细胞仪定量分析转染绿色荧光蛋白的效率。具体方法为：绿色荧光蛋白基因转染24小时后，用胰酶将细胞消化，并用300微升PBS缓冲液重悬，随后立即用流式细胞仪检测成功转染绿色荧光蛋白的细胞百分比。以第五代聚酰胺-胺树形高分子，作为阴性对照，Lipofectamine2000作为阳性对照。

实验结果：(1)如图13所示的基因转染载体G5-F7-68与其它转染载体在HEK293(a)、HeLa(b)细胞中转染绿色荧光蛋白基因的转染效率对比图，其中，N/P为氮磷比。图13(a)表明G5-F7-68成功转染绿色荧光蛋白的细胞百分比高于商业化试剂bPEI25kD，Lipofectamine2000以及第五代聚酰胺-胺树形高分子。用G5-F7-68为载体，绿色荧光蛋白基因为报告基因，氮磷比为2∶1时转染HEK293细胞的效率(90.97％)高于bPEI25kD在优化条件下氮磷比为8∶1时的转染效率(32.24％)，和商业化转染试剂Lipofectamine2000的转染效率(70.84％)，远高于第5代聚酰胺-胺树形高分子在优化条件下氮磷比为8∶1时的转染效率(2.89％)。如图13(a)所示，基因转染载体G5-F7-68在氮磷比为2∶1时转染绿色荧光蛋白平均荧光强度(4223.12)超过商业化试剂bPEI25kD在优化条件下氮磷比为8∶1时的绿色荧光蛋白平均荧光强度(1334.35)以及Lipofectamine2000(1237.33)，同时超过第五代聚酰胺-胺树形高分子在最优条件下氮磷比为8∶1时的绿色荧光蛋白平均荧光强度(205.12)。如图13(b)，以G5-F7-68为载体，在HeLa细胞中，G5-F7-68在氮磷比为3时，成功转染绿色荧光蛋白的细胞百分比(89.56％)超过商业化试剂Lipofectamine2000(64.2％)，远高于第5代聚酰胺-胺树形高分子在优化条件下氮磷比为8∶1时的转染效率(3.78％)。以G5-F7-68为载体，氮磷比为3时，转染绿色荧光蛋白平均荧光强度(662)是商业化试剂Lipofectamine2000(331)的两倍，远超过第五代聚酰胺-胺树形高分子在最优条件下氮磷比为8∶1时的绿色荧光蛋白平均荧光强度(28.295)。此结果说明本实施例的基因转染载体G5-F7-68能够提高第5代聚酰胺-胺树形高分子的基因转染效率，效果可以超过商业化试剂Lipofectamine2000。(2)如图12所示的基因转染载体G5-F7-68与其它转染载体在HEK293(a)、HeLa(b)细胞中转染荧光素酶基因的转染效率对比图，其中，N/P为氮磷比。图12(a)表明G5-F7-68的转染效率超过市场化的转染试剂Lipofectamine2000的效率，并远高于第五代聚酰胺-胺树形高分子的效率。用G5-F7-68为载体，荧光素酶基因为报告基因，氮磷比为2时转染HEK293细胞的转染效率超过市场化的转染试剂Lipofectamine2000的效率，并远高于第五代聚酰胺-胺树形高分子在优化条件下氮磷比为8∶1时的转染效率。图12(b)表明，在HeLa细胞中，以G5-F7-68为基因转染载体的转染效率超过市场化的转染试剂Lipofectamine2000，并远高于第五代聚酰胺-胺树形高分子的效率。用G5-F7-68为载体，荧光素酶基因为报告基因，氮磷比为2、2.5、3时，转染HeLa细胞的转染效率超过Lipofectamine2000效率，并远高于第5代聚酰胺-胺树形高分子在优化条件下氮磷比为8∶1时的转染效率。以上结果说明本实施例合成的基因转染载体能够提高树形分子在HEK293、HeLa细胞中的基因转染效果，能够超过商业化试剂Lipofectamine2000。

基因转染载体G5-F7-68在转染过程中的抗血清行为：研究基因转染载体G5-F7-68与DNA形成的复合物在较高血清的条件下的转染效率。

具体实施方法为：将Hela细胞接种在24孔细胞培养板中，孵育24小时，将0.8微克荧光蛋白质粒DNA与G5-F7-68以氮磷比为2的条件下，分别使用不同血清浓度(0％，10％，30％，50％)的DMEM培养基与绿色荧光蛋白基因进行复合，体积为100微升。复合30分钟之后，静置半小时后分别加入150微升含不同血清浓度(0％，10％，30％，50％)血清的培养基。含有复合物的培养基与细胞一起孵育6小时后加入含10％血清的培养基500微升。48小时后处理细胞。采用流式细胞仪定量分析转染绿色荧光蛋白的效率。具体方法为：绿色荧光蛋白基因转染48小时后，用胰酶将细胞消化，并用300微升PBS缓冲液重悬，随后立即用流式细胞仪检测成功转染绿色荧光蛋白的细胞百分比。以第五代聚酰胺-胺树形高分子，作为阴性对照，Lipofectamine2000作为阳性对照。

实验结果：如图14所示，基因转染载体G5-F7-68和Lipofectamine2000在含10％血清的培养基中细胞转染效率相对无血清培养基有较大提高，但是当血清浓度再次升高，至30％和50％，商业化基因转染试剂Lipofectamine2000的转染效率迅速下降(含50％血清培养基，转染效率为3.90％，绿色荧光蛋白平均荧光强度为46.35)，而实施例中制备的基因转染载体G5-F7-68在含有高浓度血清的条件下依然可以保持相对较高的基因转染效率(含50％血清培养基，转染效率为55.41％，绿色荧光蛋白平均荧光强度为674.29)，证实本实施例中所合成的基于表面修饰七氟丁酰化的聚酰胺-胺树形高分子基因转染载体G5-F7-68具有一定的抗血清转染效果。

基因转染载体G5-F7-68的细胞毒性以及G5-F7-68与DNA形成复合物后对细胞活性的影响：研究基因转染载体G5-F7-68以及其与DNA形成的复合物对细胞的活性影响。

具体实验方法是：在96孔板中孵育HEK293或HeLa细胞，细胞密度为10⁴细胞/孔，培养12小时后将培养基移出，加入100微升含一定量G5-F7-68或G5-F7-68/DNA复合物的新鲜培养基(含10％血清)，培养48小时。通过MTT法检测细胞活性。

实验结果：(1)如图15所示的基因转染载体G5-F7-68与其它转染载体对HEK293(a)、HeLa(b)细胞的毒性对比图。图15表明在细胞转染条件下，基因转染载体G5-F7-68相对于Lipofectmine2000和第五代聚酰胺-胺树形高分子具有较低的细胞毒性，细胞存活率为90％以上，在HeLa细胞和HEK293细胞中都表现出较低的细胞毒性。

(2)如图16所示的基因转染载体G5-F7-68与其它转染载体在与DNA形成复合物后对HEK293(a)、HeLa(b)细胞的毒性对比图，图16表明G5-F7-68与DNA形成复合物后并没有产生额外的细胞毒性，细胞存活率为90％以上，说明本发明基因转染载体具有较高的生物安全性。

实施例7：实施例5-6中所制备的基于表面修饰七氟丁酰化的第五代聚酰胺-胺树形高分子的基因转染新材料在CHO、COS-7、NIH3T3细胞中的转染效率检测以及毒性评估。

以实施例5-6中基于共价连接七氟丁酰化修饰的第五代聚酰胺-胺树形高分子的材料为例，其结构如下所示：

其中，a的值分别为49、68，G5为第五代聚酰胺-胺树形高分子，其中中心核为乙二胺，末端基团为128个伯胺基团，分别命名为G5-F7-49、G5-F7-68其结构式如下：

基因转染载体G5-F7-49、G5-F7-68在CHO细胞中的基因转染效率：将基因转染载体

G5-F7-68和绿色荧光蛋白质粒DNA在室温下形成复合物，然后在CHO细胞中进行转染，通过检测绿色荧光蛋白的表达量评估载体的基因转染效率。

具体方法：将CHO细胞培养在24孔板中孵育24小时，将0.8微克绿色荧光蛋白质粒DNA与G5-F7-49、G5-F7-68分别以氮磷比为2、2.5、3和5、6、7混合后加入到含10％血清的培养基中分别混匀，体积为100微升，静置半小时后加入150微升含10％血清的培养基。含有复合物的培养基与细胞一起孵育6小时后加入含10％血清的培养基500微升。48小时后处理细胞。在绿色荧光蛋白质粒的转染实验中，采用流式细胞仪定量分析转染绿色荧光蛋白的效率。具体方法为：绿色荧光蛋白基因转染24小时后，用胰酶将细胞消化，并用300微升PBS缓冲液重悬，随后立即用流式细胞仪检测成功转染绿色荧光蛋白的细胞百分比。以第五代聚酰胺-胺树形高分子，作为阴性对照，Lipofectamine2000作为阳性对照。

实验结果：如图17所示的基因转染载体G5-F7-49、G5-F7-68与其它转染载体在CHO细胞中转染绿色荧光蛋白基因的转染效率对比图，其中，N/P为氮磷比。图17表明G5-F7-49、G5-F7-68成功转染绿色荧光蛋白的细胞百分比高于第五代聚酰胺-胺树形高分子。用G5-F7-68为载体，绿色荧光蛋白基因为报告基因，氮磷比为3∶1时转染HEK293细胞的效率大大超过第五代聚酰胺-胺树形高分子在优化条件下氮磷比为8∶1时的转染效率，和商业化转染试剂Lipofectamine2000的转染效率相比与Lipofectamine2000较为相当。

基因转染载体G5-F7-49、G5-F7-68对CHO细胞的毒性：检测基因转染载体G5-F7-49、G5-F7-68在转染条件下对CHO细胞的毒性评估。

具体方法：在96孔板中孵育CHO细胞，细胞密度为104细胞/孔，培养12小时后将培养基移出，加入100微升含一定量基因转染载体G5-F7-49、G5-F7-68的新鲜培养基(含10％血清)，培养48小时。通过MTT法检测细胞活性。

实验结果：如图18所示的基因转染载体G5-F7-49、G5-F7-68与其它转染载体对CHO细胞的毒性对比图。图18表明在细胞转染条件下，基因转染载体G5-F7-49、G5-F7-68相对于Lipofectmine2000和第五代聚酰胺-胺树形高分子具有较低的细胞毒性，细胞存活率为90％以上，表现了极好的生物相容性。

基因转染载体G5-F7-49、G5-F7-68在COS-7细胞中的基因转染效率：将基因转染载体G5-F7-49、G5-F7-68和绿色荧光蛋白质粒DNA在室温下形成复合物，然后在COS-7细胞中进行转染，通过检测绿色荧光蛋白的表达量评估载体的基因转染效率。

具体方法：将COS-7细胞培养在24孔板中孵育24小时，将0.8微克绿色荧光蛋白质粒DNA与G5-F7-49、G5-F7-68分别以氮磷比为2、2.5、3和5、6、7混合后加入到含10％血清的培养基中分别混匀，体积为100微升，静置半小时后加入150微升含10％血清的培养基。含有复合物的培养基与细胞一起孵育6小时后加入含10％血清的培养基500微升。48小时后处理细胞。在绿色荧光蛋白质粒的转染实验中，采用流式细胞仪定量分析转染绿色荧光蛋白的效率。具体方法为：绿色荧光蛋白基因转染24小时后，用胰酶将细胞消化，并用300微升PBS缓冲液重悬，随后立即用流式细胞仪检测成功转染绿色荧光蛋白的细胞百分比。以第五代聚酰胺-胺树形高分子，作为阴性对照，Lipofectamine2000作为阳性对照。

实验结果：如图19所示的基因转染载体G5-F7-49、G5-F7-68与其它转染载体在COS-7细胞中转染绿色荧光蛋白基因的转染效率对比图，其中，N/P为氮磷比。图19表明G5-F7-49、G5-F7-68成功转染绿色荧光蛋白的细胞百分比高于第五代聚酰胺-胺树形高分子。用G5-F7-49、G5-F7-68为载体，绿色荧光蛋白基因为报告基因，氮磷比分别为2、2.5、3和5、6、7时转染COS-7细胞的效率大大超过第五代聚酰胺-胺树形高分子在优化条件下氮磷比为8∶1时的转染效率。G5-F7-49、G5-F7-68和商业化转染试剂Lipofectamine2000的转染效率相比与Lipofectamine2000较为相当，甚至当G5-F7-49氮磷比为5、6、7时以及当G5-F7-68氮磷比为2时细胞转染效率超过Lipofectamine2000。

基因转染载体G5-F7-49、G5-F7-68对COS-7细胞的毒性：检测基因转染载体G5-F7-49、G5-F7-68在转染条件下对COS-7细胞的毒性评估。

具体方法：在96孔板中孵育COS-7细胞，细胞密度为10⁴细胞/孔，培养12小时后将培养基移出，加入100微升含一定量基因转染载体G5-F7-49、G5-F7-68的新鲜培养基(含10％血清)，培养48小时。通过MTT法检测细胞活性。

实验结果：如图20所示的基因转染载体G5-F7-49、G5-F7-68与其它转染载体对COS-7细胞的毒性对比图。图20表明在细胞转染条件下，基因转染载体G5-F7-49、G5-F7-68相对于Lipofectmine2000和第五代聚酰胺-胺树形高分子具有较低的细胞毒性，细胞存活率为90％以上，表现了极好的生物相容性。

基因转染载体G5-F7-49、G5-F7-68在NIH3T3细胞中的基因转染效率：将基因转染载体G5-F7-49、G5-F7-68和绿色荧光蛋白质粒DNA在室温下形成复合物，然后在NIH3T3细胞中进行转染，通过检测绿色荧光蛋白的表达量评估载体的基因转染效率。

具体方法：将NIH3T3细胞培养在24孔板中孵育24小时，将0.8微克绿色荧光蛋白质粒DNA与G5-F7-49、G5-F7-68分别以氮磷比为2、2.5、3和5、6、7混合后加入到含10％血清的培养基中分别混匀，体积为100微升，静置半小时后加入150微升含10％血清的培养基。含有复合物的培养基与细胞一起孵育6小时后加入含10％血清的培养基500微升。48小时后处理细胞。在绿色荧光蛋白质粒的转染实验中，采用流式细胞仪定量分析转染绿色荧光蛋白的效率。具体方法为：绿色荧光蛋白基因转染24小时后，用胰酶将细胞消化，并用300微升PBS缓冲液重悬，随后立即用流式细胞仪检测成功转染绿色荧光蛋白的细胞百分比。以第五代聚酰胺-胺树形高分子，作为阴性对照，Lipofectamine2000作为阳性对照。

实验结果：如图21所示的基因转染载体G5-F7-49、G5-F7-68与其它转染载体在NIH3T3细胞中转染绿色荧光蛋白基因的转染效率对比图，其中，N/P为氮磷比。图21表明G5-F7-49、G5-F7-68成功转染绿色荧光蛋白的细胞百分比高于第五代聚酰胺-胺树形高分子。用G5-F7-49、G5-F7-68为载体，绿色荧光蛋白基因为报告基因，氮磷比分别为2、2.5、3和5、6、7时转染NIH3T3细胞的效率大大超过第五代聚酰胺-胺树形高分子在优化条件下氮磷比为8∶1时的转染效率。当G5-F7-68氮磷比为2、2.5、3时细胞转染效率超过Lipofectamine2000。

基因转染载体G5-F7-49、G5-F7-68对NIH3T3细胞的毒性：检测基因转染载体G5-F7-49、G5-F7-68在转染条件下对NIH3T3细胞的毒性评估。

具体方法：在96孔板中孵育NIH3T3细胞，细胞密度为10⁴细胞/孔，培养12小时后将培养基移出，加入100微升含一定量基因转染载体G5-F7-49、G5-F7-68的新鲜培养基(含10％血清)，培养48小时。通过MTT法检测细胞活性。

实验结果：如图22所示的基因转染载体G5-F7-49、G5-F7-68与其它转染载体对NIH3T3细胞的毒性对比图。图22表明在细胞转染条件下，基因转染载体G5-F7-49、G5-F7-68相对于Lipofectmine2000和第五代聚酰胺-胺树形高分子具有较低的细胞毒性，细胞存活率为90％以上，表现了极好的生物相容性。

根据以上结果，基于表面氟化物共价修饰的第五代聚酰胺-胺基因转染载体G5-F7-49、G5-F7-68对于多种细胞相对第五代聚酰胺-胺在基因转染效率有明显的提高，并且能够相当于、甚至超过商业化的试剂Lipofectamine2000。并且具有良好的生物相容性，具有很好的应用前景。

实施例8：以1∶32的比例制备基于九氟丁基璜酰酐的第五代聚酰胺-胺树形高分子的基因转染新材料。

以基于共价连接九氟丁基璜酰化修饰的第五代聚酰胺-胺树形高分子的材料为例，其结构如下所示：

其中，a的理论预期为32，G5为第五代聚酰胺-胺树形高分子，其中中心核为乙二胺，末端基团为128个伯胺基团，其结构式如下：

制备合成方法：取50毫克的第五代聚酰胺-胺树形高分子溶于2毫升甲醇溶液，向该溶有树枝形分子的甲醇溶液中滴加9.25微升三乙胺，再向该溶液中逐滴滴加溶有18.27微升的九氟丁基璜酰酐甲醇溶液1毫升，滴加完成后将该反应溶液在室温下继续搅拌反应12小时，即可得到外观为白色粉末的基于九氟丁基璜酰化修饰的第五代聚酰胺-胺树形高分子材料并命名为G5-F9-32。

以茚三酮检测法表征检测G5-F9-32基因转染载体：以茚三酮检测法表征检测所制备的基因转染载体G5-F9-32的九氟丁基璜酰化效率。

具体实施方法：向1.5毫升的EP管中分别加入体积为0，12.5，25，37.5，50，62.5，75，87.5，100微升的0.2毫克/毫升的PAMAM树枝形分子溶液。然后，每一个管中加入100微升的乙酸钠缓冲液(0.2摩尔/升，pH＝5.4)和100微升的茚三酮溶液，用双蒸水补充到最终体积300微升，然后沸水中加热10分钟。用紫外可见分光光度计在570纳米处比色，测定各个样品的吸收。以G5PAMAM树形高分子的浓度为横坐标，样品的在570纳米的吸收为纵坐标，作标准曲线。

将14.11克的乙酸钠溶解在86毫升的双蒸水中得到2摩尔/升的乙酸钠溶液，然后加入14毫升的2摩尔/升的乙酸，调节pH值使pH＝5.4。将85毫克的还原茚三酮和15毫克的茚三酮溶解在10毫升的乙二醇甲醚中。在1.5毫升的EP管中加入100微升的样品和100微升的乙酸钠缓冲液，混匀后加入100微升的还原茚三酮溶液。将EP管在沸水中加热10分钟，冷却后每管加入300微升60∶40乙醇水溶液。用紫外可见分光光度计在570纳米处比色，测定各个样品的吸收。参照以G5PAMAM树形高分子制作的标准曲线，进而以差量的形式计算出表面伯氨基的数量，进而计算出树形高分子表面九氟丁基璜酰化的效率。

以NMR法表征检测G5-F9-32基因转染载体：以一维核磁氢谱(¹H NMR)检测表征所制备的基因转染载体G5-F9-32的九氟丁基璜酰化效率。

具体方法为：取5毫克本实施例中合成的基因转染载体，溶于2毫升甲醇溶液，向该溶有树枝形分子的甲醇溶液中分别滴加41微升三乙胺，再向该溶液中逐滴滴加溶有23微升的乙酸酐甲醇溶液1毫升，滴加完成后将该反应溶液在室温下继续搅拌反应12小时，得到表面完全乙酰化的基于九氟丁基璜酰化的第五代聚酰胺-胺树形高分子材料，并命名为G5-F9-32。

将所制备的基因转染载体G5-F9-32溶于D₂O，浓度大约5毫克/毫升，进行核磁共振分析。根据¹H NMR图谱，如图2所示，计算氨基乙酰化的比例，以差量的形式计算树形高分子表面九氟丁基璜酰化的效率。如图3所示，得到的结果和用茚三酮检测中紫外可见分光光度计比色法得到的结果计算比较。

实验结果：如图3所示，两种方法测定的结果比较吻合，每个树形高分子表面连接了32个九氟丁基璜酰化基团，因此修改基于九氟丁基璜酰化的第五代聚酰胺-胺树形高分子的名称为G5-F9-32。

基因转染载体G5-F9-32的基因转染效率：将本实施例中所制备的基因转染试剂G5-F9-32和绿色荧光蛋白质粒DNA在室温下形成复合物，然后在HEK293细胞中进行转染，通过检测绿色荧光蛋白的表达量来评估载体的基因转染效率。

具体方法为：将HEK293细胞培养在24孔板中孵育24小时，将0.8微克绿色荧光蛋白质粒DNA与G5-F9-32以氮磷比为8混合后加入到含10％血清的培养基中混匀，体积为100微升，静置半小时后加入150微升含10％血清的培养基。含有复合物的培养基与细胞一起孵育6小时后加入含10％血清的培养基500微升。48小时后处理细胞，用胰酶消化，并用300微升PBS缓冲液重悬，立即用流式细胞仪检测成功转染绿色荧光蛋白的细胞百分比。第五代聚酰胺-胺树形高分子作为阴性对照，bPEI25kD作为阳性对照。

实验结果：如图17所示的基因转染载体G5-F9-32与其它转染载体在HEK293细胞中转染绿色荧光蛋白基因的转染效率对比图，其中，N/P为氮磷比。图17表明G5-F9-32成功转染绿色荧光蛋白的细胞百分比与商业化试剂bPEI25kD相当，并且高于第五代聚酰胺-胺树形高分子。用G5-F9-32为载体，绿色荧光蛋白基因为报告基因，氮磷比为8∶1时转染HEK293细胞的效率(12.89％)不及商业化试剂bPEI25kD在优化条件下氮磷比为8∶1时的转染效率(32.24％)，但是明显高于第五代聚酰胺-胺树形高分子在各自最优条件下氮磷比为8∶1时的转染效率(2.89％)。用G5-F9-32为载体在氮磷比为2∶1时转染绿色荧光蛋白平均荧光强度(272.83)不及商业化试剂bPEI25kD在优化条件下氮磷比为8∶1时的绿色荧光蛋白平均荧光强度(1334.35)，但是超过第五代聚酰胺-胺树形高分子在最优条件下氮磷比为8∶1时的绿色荧光蛋白平均荧光强度(205.12)。因此这种材料能够提高树形分子在HEK293细胞中的基因转染效果。

实施例9：以1∶64的比例制备基于九氟丁基璜酰酐的第五代聚酰胺-胺树形高分子的基因转染新材料。

以基于共价连接九氟丁基璜酰化修饰的第五代聚酰胺-胺树形高分子的材料为例，如下所示：

其中，a的理论预期为64，G5为第五代聚酰胺-胺树形高分子，其中心核为乙二胺，末端基团为128个伯胺基团，其结构式如下：

制备合成方法：取50毫克的第五代聚酰胺-胺树形高分子溶于2毫升甲醇溶液，向该溶有树枝形分子的甲醇溶液中滴加9.25微升三乙胺，再向该溶液中逐滴滴加溶有18.27微升的九氟丁基璜酰酐甲醇溶液1毫升，滴加完成后将该反应溶液在室温下继续搅拌反应12小时，即可得到外观为白色粉末的基于表面九氟丁基璜酰化修饰的第五代聚酰胺-胺树形高分子材料并命名为G5-F9-64。

以茚三酮法表征检测G5-F9-94基因转染载体：以茚三酮法表征检测所制备的基因转染载体G5-F9-64的九氟丁基璜酰化效率。

具体实施方法：向1.5毫升的EP管中分别加入体积为0，12.5，25，37.5，50，62.5，75，87.5，100微升的0.2毫克/毫升的PAMAM树枝形分子溶液。然后，每一个管中加入100微升的乙酸钠缓冲液(0.2摩尔/升，pH＝5.4)和100微升的茚三酮溶液，用双蒸水补充到最终体积300微升，然后沸水中加热10分钟。用紫外可见分光光度计在570纳米处比色，测定各个样品的吸收。以G5PAMAM树形高分子的浓度为横坐标，样品的在570纳米的吸收为纵坐标，作标准曲线。

将14.11克的乙酸钠溶解在86毫升的双蒸水中得到2摩尔/升的乙酸钠溶液，然后加入14毫升的2摩尔/升的乙酸，调节pH值使pH＝5.4。将85毫克的还原茚三酮和15毫克的茚三酮溶解在10毫升的乙二醇甲醚中。在1.5毫升的EP管中加入100微升的样品和100微升的乙酸钠缓冲液，混匀后加入100微升的还原茚三酮溶液。将EP管在沸水中加热10分钟，冷却后每管加入300微升60∶40乙醇水溶液。用紫外可见分光光度计在570纳米处比色，测定各个样品的吸收。参照以G5PAMAM制作的标准曲线，计算出表面伯氨基的数量，进而以差量的形式计算出树形高分子表面九氟丁基璜酰化的效率。

以NMR法表征检测G5-F9-64基因转染载体：以一维核磁氢谱(¹H NMR)检测表征所制备的基因转染载体G5-F9-64的九氟丁基璜酰化效率。

具体方法为：取5毫克本实施例中合成的基因转染载体，溶于2毫升甲醇溶液，向该溶有树枝形分子的甲醇溶液中分别滴加41微升三乙胺，再向该溶液中逐滴滴加溶有23微升的乙酸酐甲醇溶液1毫升，滴加完成后将该反应溶液在室温下继续搅拌反应12小时，得到表面完全乙酰化的基于九氟丁基璜酰化的第五代聚酰胺-胺树形高分子材料，并命名为G5-F9-64。

将所制备的基因转染载体G5-F9-64溶于D₂O，浓度大约5毫克/毫升，进行核磁共振分析。根据¹H NMR图谱，如图2所示，计算氨基乙酰化的比例，以差量的形式反推树形高分子表面九氟丁基璜酰化的效率。如图3所示，得到的结果和用茚三酮检测中紫外可见分光光度计比色法得到的结果计算比较。

实验结果：由图可见，两种方法测定的结果比较吻合。根据计算对比，每个树形高分子表面连接了32个九氟丁基璜酰化基团，因此修改基于九氟丁基璜酰化的第五代聚酰胺-胺树形高分子的名称为G5-F9-54。

基因转染载体G5-F9-54的基因转染效率：将本实施例中所制备的基因转染试剂G5-F9-54和绿色荧光蛋白质粒DNA在室温下形成复合物，然后在HEK293细胞中进行转染，通过检测绿色荧光蛋白的表达量来评估载体的基因转染效率。

具体方法为：将HEK293细胞培养在24孔板中孵育24小时，将0.8微克绿色荧光蛋白质粒DNA与G5-F9-54以氮磷比为8混合后加入到含10％血清的培养基中混匀，体积为100微升，静置半小时后加入150微升含10％血清的培养基。含有复合物的培养基与细胞一起孵育6小时后加入含10％血清的培养基500微升。48小时后处理细胞，用胰酶消化，并用300微升PBS缓冲液重悬，立即用流式细胞仪检测成功转染绿色荧光蛋白的细胞百分比。第五代聚酰胺-胺树形高分子作为阴性对照，bPEI25kD作为阳性对照。

实验结果：如图18所示的基因转染载体G5-F9-54与其它转染载体在HEK293细胞中转染绿色荧光蛋白基因的转染效率对比图，其中，N/P为氮磷比。图18表明G5-F9-54成功转染绿色荧光蛋白的细胞百分比与商业化试剂bPEI25kD相当，并且高于第五代聚酰胺-胺树形高分子。用G5-F9-54为载体，绿色荧光蛋白基因为报告基因，氮磷比为8∶1时转染HEK293细胞的效率(32.66％)与商业化试剂bPEI25kD在优化条件下氮磷比为8∶1时的转染效率(32.24％)相当，但是明显高于第五代聚酰胺-胺树形高分子在各自最优条件下氮磷比为8∶1时的转染效率(2.89％)。用G5-F9-54为载体在氮磷比为8∶1时转染绿色荧光蛋白平均荧光强度(1015.34)不及商业化试剂bPEI25kD在优化条件下氮磷比为8∶1时的绿色荧光蛋白平均荧光强度(1334.35)，但是超过第五代聚酰胺-胺树形高分子在最优条件下氮磷比为8∶1时的绿色荧光蛋白平均荧光强度(205.12)。因此这种材料能够提高树形分子在HEK293细胞中的基因转染效果。

上述实施例只是为了说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让本领域内的普通技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡是根据本发明内容的实质所作出的等效的变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种基于氟化物修饰的树形高分子基因转染载体，其特征在于，其结构如式(Ia)、式(Ib)所示；其包括树形高分子骨架以及含氟化合物功能基团，所述含氟化合物功能基团共价连接在树形高分子表面；其中，所述树形高分子包括如式(II)所示的聚酰胺-胺树形高分子和如式(III)所示的聚丙烯亚胺树形高分子；所述树形高分子表面为伯胺基团；

式(Ia)、式(Ib)中，X为NH、O、CO、SO₂、或CH₂基团；z为树形高分子表面共价连接的含氟化合物修饰基团的数量，z为1-1024的整数；a为0-8的整数；b为1-3的整数；c为1-8的整数；R是如式(II)所示的聚酰胺-胺树形高分子或如式(III)所示的聚丙烯亚胺树形高分子；

式(II)和式(III)中，M是树形高分子的核心，其包括氨、乙二胺、丁二胺、己二胺、辛二胺、葵二胺、或1，12-十二烷二胺；n是1-10的整数；m是2-4的整数。

2.一种基于氟化物修饰的树形高分子基因转染载体的制备方法，其特征在于，将含氟化合物及树形高分子溶解于水或有机溶剂，加入碱或催化剂，搅拌，通过反应将含氟化合物功能基团共价连接到树形高分子表面，得到如式(Ia)、式(Ib)所示的基因转染载体。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述含氟化合物为含氟烃基及其衍生物的化合物，包括三氟乙酸酐、五氟丙酸酐、七氟丁酸酐、九氟丁基璜酰酐及其衍生物。

4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述碱或催化剂为氢氧化钠、碳酸氢钠、三乙胺、N-羟基琥珀酰亚胺、二环己基碳二亚胺。

5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂包括甲醇乙醇二甲亚砜N，N-二甲基甲酰胺或四氢呋喃。

6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述反应时间为1-120小时。

7.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述反应温度为0-37摄氏度。

8.如式(Ia)、式(Ib)所示的基因转染载体在体外或体内作为核酸分子的输送载体的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述核酸是DNA、siRNA、shRNA或修饰的核酸。

10.一种复合物，其特征在于，包括式(Ia)、式(Ib)所示的基因转染载体和核酸，由所述基因转染载体携带所述核酸。

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