CN103172776A

CN103172776A - 荧光星形聚合物、其制备方法及应用

Info

Publication number: CN103172776A
Application number: CN2013101198373A
Authority: CN
Inventors: 沈杰; 何碧程; 尤树森; 尹梅贞
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2013-04-08
Filing date: 2013-04-08
Publication date: 2013-06-26
Anticipated expiration: 2033-04-08
Also published as: CN103172776B

Abstract

本发明提供了一种荧光星形聚合物作为核酸物质载体应用于活体培养细胞和昆虫的方法。以苝类衍生物及其类似物作为荧光核，采用“发散法”制备出了不同代数、携带阳离子基团的荧光星形聚合物。该类荧光星形聚合物具有很好的生物相容性和很低的细胞毒性，分子外围携有带正电荷的氨基，能够进入活体培养细胞，并且能够与带负电荷的DNA或RNA结合，形成一个稳定的复合体，作为载体携带并保护外源核酸进入活体培养细胞。通过食物饲喂或体腔注射该类载体与DNA或RNA的混合物，该类载体能够快速携带DNA或RNA进入活体昆虫体内细胞中，便于这些核酸发挥作用、干扰昆虫靶标基因的正常表达，从而导致昆虫生长发育异常直至生病或死亡。

Description

荧光星形聚合物、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及化合物制备及基因载体领域，具体地说，涉及一种荧光星形聚合物、其制备方法及应用。

背景技术

伴随先进生物技术疗法的发展，基因导入体系变得越来越重要。目前常用的基因载体主要有病毒载体和非病毒载体两大类，病毒载体虽然具有较高的转染效率，但是存在免疫反应、细胞毒性等安全问题，限制了它们的应用范围。近年来，高分子材料在基因药物载体系统中的发展十分迅速，作为新型的非病毒载体，克服了病毒载体的缺陷，开拓了许多新领域，引起了人们的广泛关注。其中非病毒载体体系主要包括阳离子聚合物、可生物降解的聚合物、多复合物脂质体、热敏型聚合物等。而研究比较多的阳离子聚合物基因载体有PEI（聚乙烯亚胺）、PLL（聚赖氨酸）和PAMAM（聚酰胺-胺型树枝状高分子）。

苝酰亚胺类化合物是一类荧光性很强的化合物，荧光量子效率非常高(接近1)，并且具有很好的光、热和化学稳定性。凭借其优越的染色性能，一直被广泛应用于有机光电器件、激光染料以及生物荧光探针领域。

近年来，此类化合物开始应用于生物领域，如蛋白质靶向标记和细胞特异性标记等。然而水溶性差这一缺点，直接影响了其在此领域的应用。因此提高这类化合物的水溶性及在水溶液中保持高荧光量子产率具有非常重要的意义。

星形聚合物是树状聚合物中最简单的一种拓扑结构，与其他结构相比合成周期短，容易设计合成，且在采用ATRP活性聚合的条件下，可以控制聚合物分子链的长度，从而控制聚合物的分子量。另外，星形聚合物还具有其它一些优点，如分子内部具有空腔结构、官能团密度高等。这些优点使其在药物载体和基因载体等方面具有广阔的应用前景。因而，发明一种简单、高效的方法用于制备水溶性苝类荧光星形聚合物，研究这类荧光星形聚合物在生物医药领域（如细胞标记、基因或药物载体等）的应用，将具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种光、热、化学稳定性好、水溶性好、结构可设计的荧光星形聚合物、其制备方法及应用。

为了实现本发明目的，本发明的一种荧光星形聚合物，其结构如式（IV）所示：

其中，n=1-100。

制备上述荧光星形聚合物的方法，包括以下步骤：

1）以四氯苝酐(4Cl-PDA)为原料，经过酰胺化反应合成四氯苝酰亚胺（4Cl-PDI），然后通过取代反应在苝核的“海岛”位置上接入乙羟基，从而得到携带有四个羟基的苝酰亚胺类化合物1，其结构如式（I）所示：

2）将化合物1溶于无水四氢呋喃（无水THF）中，冷却至0℃，在氮气保护下加入相同物质的量的三乙胺和2-溴异丁酰溴，其中化合物1与2-溴异丁酰溴的摩尔比为1：20-40，搅拌过夜，得到化合物2，即ATRP引发剂（四臂引发剂），其结构如式（II）所示：

3）将化合物2与单体甲基丙烯酸-2-（叔氧羰基）氨乙酯（Boc-AEMA）溶于丁酮中，单体浓度为0.1-0.3g/mL，加入与引发剂相同物质的量的CuBr后，进行3-4次冷冻抽排循环，然后在氮气保护下，加入配体叔丁基联吡啶（DTB-bipy），再次冷冻抽排后，搅拌10-15min，使CuBr与配体完全络合，在60-70℃下反应，得到荧光星形聚合物3，其结构如式（III）所示：

其中，n=1-100。

ATRP聚合是一种活性自由基聚合方法，可通过改变反应条件来调控聚合物链长。根据这一原理，使用相同的原料配比，在不同的反应时间条件下，得到了不同链长的星形聚合物，n值在1-100范围内。

上述得到的星形聚合物侧链上的氨基官能团处于被保护状态，需用三氟乙酸/二氯甲烷（v/v=1:1）混合液进行特异性去保护，然后经过多次洗涤，并调节pH值呈中性，最终得到携带氨基的荧光星形聚合物4，其结构如式（IV）所示。

具体地，将上述荧光星形聚合物3溶于二氯甲烷中，并加入相同体积的三氟乙酸，室温搅拌2h，然后浓缩溶液，用乙醚沉淀数次，即得到结构如式（IV）所示的水溶性荧光星形聚合物4。

本发明还提供所述荧光星形聚合物作为核酸载体的应用：将荧光星形聚合物4与含有DNA或RNA片段的溶液混合，然后与细胞共孵育，通过细胞内吞作用使携带有DNA或RNA片段（优选dsRNA）的荧光星形聚合物4载体进入细胞内，或通过注射或喂饲昆虫的方法，使携带有DNA或RNA片段的荧光星形聚合物载体进入昆虫体内。（图1）

本发明进一步提供一种干扰细胞或昆虫靶基因表达的方法：以所述荧光星形聚合物4作为核酸载体，该载体携带DNA或RNA（优选dsRNA）进入细胞内或昆虫体内，从而干扰靶基因表达。

具体地，将氨基星形聚合物作为外源核酸物质的载体，应用于培养细胞和昆虫：

（1）将上述荧光星形聚合物4以一定的浓度加入到细胞培养液中，培养活体细胞一段时间后，该类化合物迅速通过细胞内吞作用进入细胞内，通过荧光显微镜拍照分析，清晰观察该类化合物分子在细胞内的分布状况。将该类化合物与DNA或RNA片段在试管内混合形成复合体，然后同上述方法，与细胞一起孵育一段时间后，该类化合物发挥核酸载体功能，携带DNA或RNA快速进入细胞，便于DNA或RNA在细胞内发挥作用。

（2）将上述荧光星形聚合物4以一定的浓度加入到昆虫饲料中，供昆虫取食一段时间后，该类化合物在昆虫肠道内迅速通过围食膜屏障进入肠细胞内，通过荧光显微镜拍照分析，清晰观察该类化合物分子在肠细胞内的分布状况。将上述荧光星形聚合物4以一定的浓度直接注射到昆虫体腔中，该类化合物迅速进入昆虫细胞内，通过荧光显微镜拍照分析，清晰观察该类化合物分子在昆虫各器官细胞内的分布状况。将该类化合物与DNA或RNA片段在试管内混合形成复合体，然后同上述方法，注射或喂饲昆虫，该类化合物发挥核酸载体功能，携带DNA或RNA快速进入昆虫细胞内，便于DNA或RNA在细胞内发挥作用。

（3）将该类化合物与RNAi基因表达干扰技术结合,将该类化合物与dsRNA（双链RNA）在试管内混合形成复合体，然后同上述方法，注射或喂饲昆虫，该类化合物发挥核酸载体功能，携带dsRNA快速进入昆虫细胞内，便于dsRNA在细胞内发挥作用，干扰靶标基因的表达，使昆虫发育异常、生病、直至死亡。

本发明提供了一种荧光星形聚合物作为核酸物质载体应用于活体培养细胞和昆虫的方法。以苝类衍生物及其类似物作为荧光核，采用“发散法”制备出了不同代数、携带阳离子基团的荧光星形聚合物。该类荧光星形聚合物具有很好的生物相容性和很低的细胞毒性，分子外围携有带正电荷的氨基，能够进入活体培养细胞，并且能够与带负电荷的DNA或RNA结合，形成一个稳定的复合体，作为载体携带并保护外源核酸进入活体培养细胞。通过食物饲喂或体腔注射该类载体与DNA或RNA的混合物，该类载体能够快速携带DNA或RNA进入活体昆虫体内细胞中，便于这些核酸发挥作用、干扰昆虫靶标基因的正常表达，从而导致昆虫生长发育异常直至生病或死亡。作为一种新型的可荧光追踪的核酸载体，此类化合物在昆虫基因功能的科研领域和害虫防治领域具有很好的应用价值。

本发明的优点在于：

（一）通过分子设计，合成出具有荧光发色基团的大分子引发剂，然后采用ATRP聚合方法得到功能性荧光星形聚合物。该类聚合物还具有良好的光、热、化学稳定性、结构可设计性、优异的生物相容性等特性。

（二）制备荧光星形聚合物的步骤简单易行：一方面可通过改变引发剂的代数，控制聚合物的臂数；另一方面可通过调整加料比例或反应时间调控聚合物链长。

（三）本发明制备得到的荧光星形聚合物具有很好的生物相容性和很低的细胞毒性。分子外围携有带正电荷的氨基，能够进入活细胞，并且能够与带负电荷的核酸物质如DNA或RNA结合，形成一个稳定的复合物，可以作为基因载体携带并保护外源核酸进入活细胞。该类载体分子还能够络合dsRNA（双链RNA），利用RNAi抑制昆虫体内的靶标基因，使其生长发育产生紊乱从而导致生病或死亡。因此，该类载体作为一种新型的荧光高分子基因载体在生物科研领域和农业害虫防治领域具有很好的应用价值。

（四）通过对苝的外围进行水溶性功能基团修饰，可提高其水溶性。通过水溶性星状聚合物或树枝状聚合物包裹苝荧光基团的方法，既可以改善苝的水溶性，又可以使其荧光最大发射峰发生很大红移，从而更好的避开细胞背景荧光，具有广阔的生物应用前景。

附图说明

图1为本发明荧光星形聚合物作为核酸物质载体应用于活体培养细胞和昆虫的示意图。

图2为本发明实施例1化合物2（ATRP引发剂）的合成路线图。

图3为本发明实施例1PDI-NH₂荧光星形聚合物（荧光星形聚合物4）的合成路线图。

图4为本发明实施例1荧光星形聚合物的紫外吸收和荧光光谱图。

图5显示本发明实施例1载体分子进入活细胞及基因转染；其中，A：不同浓度的载体分子进入活细胞所用的时间；B：载体分子在细胞内荧光强度的减弱说明细胞的外排作用；C-C'：只有DNA没有载体的荧光成像图，C'为CXR蓝色荧光染料（CXR Reference Dye）标记的DNA在荧光下的成像；D-D"：载体/DNA复合物（0.05μM载体，100μMDNA，N/P=2:1）在细胞内的荧光成像图，D'为荧光下载体成像图，D"为荧光下CXR蓝色荧光染料标记的DNA成像图；E：不同N/P比条件下DNA在细胞内的荧光强度。

图6为本发明实施例1载体分子的细胞毒性检测；其中，A：载体分子与细胞孵育48h后加入标记凋亡细胞的染料（Tali^TM细胞活力试剂盒，Dead Cell Green）后的荧光成像图，细胞核呈绿色的表示凋亡细胞；B：载体在不同浓度下的细胞存活率。

图7为本发明实施例1载体进入某种昆虫幼虫肠细胞；其中，A：昆虫幼虫肠的平面结构图；B：饲喂正常食物的昆虫幼虫的肠；C-C'：饲喂含有载体的食物后昆虫幼虫的肠在荧光下的成像图，C'为荧光下载体成像图。

图8为本发明实施例1饲喂载体/dsRNA复合体后以及对照实验中幼虫的生长状况对比图。

图9为PDI及可替代PDI的荧光核类似物的结构。

图10为可用作荧光核的两类PDI衍生物的结构。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1利用ATRP聚合方法合成星形PAEMA（聚甲基丙烯酸氨乙酯）

1.1PDI-OH（化合物1）的合成

将4Cl-PDI（1.70g，2mmol），对羟基苯乙醇（2.76g，20mmol）以及K₂CO₃（1.38g，10mmol）加入250mL三口烧瓶中，加入80mLNMP（N-甲基吡咯烷酮）使反应物完全溶解。随后通氮气15min，排除空气，将烧瓶加入90℃油浴中开始反应，用薄层色谱监测反应程度，24h后停止反应。将反应物在水/甲醇/浓盐酸（v/v/v=5:40:2）混合溶液中沉淀，抽滤除去NMP，得到粗产物。以乙酸乙酯为淋洗剂用柱色谱分离，最终得到2.20g产物（化合物1），产率88%。

化合物1

1.2PDI-Br（化合物2）的合成

将化合物1（400mg，0.32mmol）溶于40mL THF，转移至250mL三口烧瓶，通氮气15min，排除空气，将烧瓶加入冰浴中，直至降温并保持在0℃附近，先加入三乙胺（1.80mL，12.8mmol），然后逐滴滴加2-溴异丁酰溴（1.60mL，12.8mmol）。搅拌10min之后，逐渐升温至室温开始反应。使用薄层色谱检测反应程度，48h后结束反应。用水洗的方法除去反应物中的盐类，得到粗产物。使用二氯甲烷做淋洗剂，柱色谱分离得到纯产物450mg(化合物2)，产率76%。

化合物2

化合物2（ATRP引发剂）的合成路线如图2所示。

1.3ATRP法聚合P（Boc-AEMA）（荧光星形聚合物3）

将引发剂化合物2（17.6mg，9.6μmol），催化剂CuBr（5.5mg，38.4μmol）单体Boc-AEMA（880mg，3.84mmol）加入25mL反应管中，用2mL2-丁酮溶解，经过3次冷冻抽排过程达到除氧的目的，在惰性气体的保护下,加入配体DTB-bipy（特丁基联吡啶，20.6mg，76.8μmol），随后用塞子密封，经过搅拌CuBr和配体完全络合后，将反应管加入65℃油浴中开始反应。经过10min-3h可得到荧光星形聚合物3（n值与反应时间成正比）。反应物经过中性氧化铝柱子将铜盐除去，之后在甲醇和水的混合溶剂中沉淀3遍，真空干燥至恒重，得到荧光星形聚合物3。

荧光星形聚合物3

1.4P（Boc-AEMA）的去保护

取400mg荧光星形聚合物3，用10mL CH₂Cl₂将其溶解于100mL圆底烧瓶中，加入相同体积的TFA（三氟乙酸），常温下搅拌2h。随后在大量乙醚中沉淀3次，真空干燥至恒重，得到210mg去保护产物（荧光星形聚合物4）。

荧光星形聚合物4

PDI-NH₂荧光星形聚合物（荧光星形聚合物4）的合成路线如图3所示，其紫外吸收和荧光光谱图如图4所示。

1.5活细胞摄取和外排

将合成的氨基星形聚合物载体分子（荧光星形聚合物4）与培养细胞一起孵育，发现载体分子能够快速高效地进入活细胞，表现出良好的生物相容性和低毒性。0.1μM载体分子培养0.75h后，就能穿透活细胞细胞膜进入细胞。随后，换掉含有载体分子的细胞培养液加入新的不含载体分子的培养液，通过对细胞内荧光强度的研究表明，载体分子会被细胞排出，在一定程度上避免了细胞毒性。

1.6基因转染

利用本发明的荧光星形聚合物载体分子携带DNA转染培养细胞，考察了DNA与载体复合的比例，即载体分子铵盐数目与DNA分子磷酸根的数目比（N/P）对细胞转染的影响。通过研究以不同N/P比（1:1，2:1，4:1，8:1）形成的载体分子和DNA复合物转染细胞的结果发现，载体分子在所有N/P比条件下均显示出转染活性。当N/P比为2：1时(0.05μM载体，100μM DNA)，载体分子显示出最好的转染效率。

载体分子进入活细胞及基因转染如图5所示，细胞毒性检测如图6所示。

1.7活体昆虫上RNAi的应用

1.7.1载体分子能够进入昆虫幼虫的肠细胞

将载体分子混入昆虫饲料中，饲喂昆虫的一龄幼虫，3天后解剖昆虫幼虫的肠，在荧光显微镜下可以观察到载体分子存在于肠细胞中。并且，载体分子对昆虫的生长发育无影响，用含有载体分子饲喂的昆虫幼虫可以正常羽化发育成成虫及产生子代。

图7显示载体进入某种昆虫幼虫肠细胞。

1.7.2载体分子结合dsRNA对昆虫的一种基因产生干扰而导致昆虫生病死亡

在4oC条件下，将4μg载体分子和4μg一种基因的dsRNA混合，半小时后，加入16mg昆虫饲料中，与饲料混匀后单独饲喂刚孵化出的一龄幼虫。24h、48h、72h、96h、120h后观察拍照，并量其体长和体重。共设置三个对照组，分别为：载体分子/GFP-dsRNA，一种基因-dsRNA，GFP-dsRNA。72h后，经观察发现：载体分子/一种基因-dsRNA饲喂的幼虫虫体体长和体重比其他两个对照组开始减小。120h后，载体分子/一种基因-dsRNA饲喂的幼虫幼虫虫体长度和体重相比于其他对照组显著减小。另外，还发现载体分子/一种基因-dsRNA饲喂的幼虫不能正常蜕皮，虫体大小一直未变，最终死亡。因此，载体分子结合dsRNA进入幼虫的肠细胞内，dsRNA发挥作用抑制了靶标基因的正常表达，从而干扰了昆虫的正常发育，导致生病和死亡。

图8显示载体/dsRNA对昆虫一种基因的抑制。饲喂载体/dsRNA复合体后以及对照实验中幼虫的生长状况对比图。

1.8PDI及可替代PDI的荧光核类似物

PDI及可替代PDI的荧光核类似物的结构如图9所示。

可用作荧光核的两类PDI衍生物的结构如图10所示。

实施例2荧光星形聚合物3(n=50)的合成

将引发剂化合物2（17.6mg，9.6μmol），催化剂CuBr（5.5mg，38.4μmol），单体Boc-AEMA（880mg，3.84mmol）加入25mL反应管中，用2mL2-丁酮溶解，经过3次冷冻抽排过程达到除氧的目的，在惰性气体的保护下加入配体DTB-bipy（20.6mg，76.8μmol），随后用橡胶塞密封，经过搅拌CuBr和配体完全络合后，将反应管加入65℃油浴中开始反应。经过50min反应，反应物经过中性氧化铝柱子将催化剂除去，之后在甲醇和水的混合溶剂（v:v=1:1）中沉淀3遍，真空干燥至恒重，得到430mg荧光星形聚合物3（链长n=50）。

荧光星形聚合物3（n=50）的去保护：取400mg荧光星形聚合物3，用10mLCH₂Cl₂将其溶解于100mL圆底烧瓶中，加入相同体积的三氟乙酸，常温下搅拌2小时。随后在大量乙醚中沉淀3次，真空干燥至恒重，得到210mg去保护产物荧光星形聚合物4（n=50）。

实施例3荧光星形聚合物3(n=1)的合成

将引发剂化合物2（35.2mg，19.2μmol），催化剂CuBr（11mg，76.8μmol），单体Boc-AEMA（880mg，3.84mmol）加入25mL反应管中，用2mL2-丁酮溶解，经过3次冷冻抽排过程达到除氧的目的，在惰性气体的保护下加入配体DTB-bipy（20.6mg，76.8μmol），随后用橡胶塞密封，经过搅拌CuBr和配体完全络合后，将反应管加入65℃油浴中开始反应。经过5min反应，反应物经过中性氧化铝柱子将催化剂除去，之后在甲醇和水的混合溶剂（v:v=1:1）中沉淀3遍，真空干燥至恒重，得到52mg荧光星形聚合物3（链长n=1）。

荧光星形聚合物3（n=1）的去保护：取50mg荧光星形聚合物3，用10mLCH₂Cl₂将其溶解于100mL圆底烧瓶中，加入相同体积的三氟乙酸，常温下搅拌2小时。随后在大量乙醚中沉淀3次，真空干燥至恒重，得到38mg去保护产物荧光星形聚合物4（n=1）。

实施例4荧光星形聚合物3(n=100)的合成

将引发剂化合物2（8.8mg，4.8μmol），催化剂CuBr（2.8mg，19.2μmol），单体Boc-AEMA（880mg，3.84mmol）加入25mL反应管中，用2mL2-丁酮溶解，经过3次冷冻抽排过程达到除氧的目的，在惰性气体的保护下加入配体DTB-bipy（10.3mg，38.4μmol），随后用橡胶塞密封，经过搅拌CuBr和配体完全络合后，将反应管加入65℃油浴中开始反应。经过50min反应，反应物经过中性氧化铝柱子将催化剂除去，之后在甲醇和水的混合溶剂（v:v=1:1）中沉淀3遍，真空干燥至恒重，得到420mg荧光星形聚合物3（链长n=100）。

荧光星形聚合物3（n=100）的去保护：取400mg荧光星形聚合物3，用10mLCH₂Cl₂将其溶解于100mL圆底烧瓶中，加入相同体积的三氟乙酸，常温下搅拌2小时。随后在大量乙醚中沉淀3次，真空干燥至恒重，得到200mg去保护产物荧光星形聚合物4（n=100）。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种荧光星形聚合物，其结构如式（IV）所示：

其中，n=1-100。

2.权利要求1所述荧光星形聚合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）以四氯苝酐为原料，经过酰胺化反应合成四氯苝酰亚胺，然后通过取代反应合成携带有四个羟基的苝酰亚胺类化合物1，其结构如式（I）所示：

2）将化合物1溶于无水四氢呋喃中，冷却至0℃，在氮气保护下加入相同物质的量的三乙胺和2-溴异丁酰溴，其中化合物1与2-溴异丁酰溴的摩尔比为1：20-40，搅拌过夜，得到化合物2，即ATRP引发剂，其结构如式（II）所示：

3）将化合物2与单体甲基丙烯酸-2-（叔氧羰基）氨乙酯溶于丁酮中，单体浓度为0.1-0.3g/mL，加入与引发剂相同物质的量的CuBr后，进行3-4次冷冻抽排循环，然后在氮气保护下，加入配体叔丁基联吡啶，再次冷冻抽排后，搅拌10-15min，使CuBr与配体完全络合，在60-70℃下反应，得到荧光星形聚合物3，其结构如式（III）所示：

其中，n=1-100；

4）将所述荧光星形聚合物3溶于二氯甲烷中，并加入相同体积的三氟乙酸，室温搅拌2h，然后浓缩溶液，用乙醚沉淀数次，即得到结构如式（IV）所示的水溶性荧光星形聚合物。

3.权利要求1所述荧光星形聚合物作为核酸载体的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，将荧光星形聚合物与含有DNA或RNA片段的溶液混合，然后与细胞共孵育，通过细胞内吞作用使携带有DNA或RNA片段的荧光星形聚合物载体进入细胞内，或通过注射或喂饲昆虫的方法，使携带有DNA或RNA片段的荧光星形聚合物载体进入昆虫体内。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述RNA片段为dsRNA。

6.一种干扰细胞或昆虫靶基因表达的方法，其特征在于，以权利要求1所述荧光星形聚合物作为核酸载体，该载体携带DNA或RNA进入细胞内或昆虫体内，从而干扰靶基因表达。