CN110583581A - 一种新型烟粉虱若虫rna干扰方法构建 - Google Patents
一种新型烟粉虱若虫rna干扰方法构建 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110583581A CN110583581A CN201910647380.0A CN201910647380A CN110583581A CN 110583581 A CN110583581 A CN 110583581A CN 201910647380 A CN201910647380 A CN 201910647380A CN 110583581 A CN110583581 A CN 110583581A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- bemisia tabaci
- cotton
- dsrna
- nymph
- nymphs
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000254127 Bemisia tabaci Species 0.000 title claims abstract description 50
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 45
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 title claims abstract description 31
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 title claims abstract description 31
- 241000819999 Nymphes Species 0.000 title claims abstract description 21
- 238000010276 construction Methods 0.000 title description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims abstract description 36
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 claims abstract description 26
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 claims abstract description 26
- 241000219146 Gossypium Species 0.000 claims abstract description 26
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims abstract description 15
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims abstract description 13
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 claims abstract description 13
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 11
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 claims abstract description 10
- 230000034994 death Effects 0.000 claims abstract description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 230000035515 penetration Effects 0.000 claims abstract description 5
- 238000009395 breeding Methods 0.000 claims abstract description 4
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 claims abstract description 4
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 claims abstract description 4
- 235000012343 cottonseed oil Nutrition 0.000 claims description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 6
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 3
- 238000007664 blowing Methods 0.000 claims description 3
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 claims description 3
- 238000009331 sowing Methods 0.000 claims description 3
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 claims description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 abstract description 6
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000035699 permeability Effects 0.000 abstract description 2
- 239000012466 permeate Substances 0.000 abstract description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 9
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 7
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 241000254123 Bemisia Species 0.000 description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 3
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 3
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 3
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 3
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 3
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 3
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 3
- 238000003762 quantitative reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 2
- 241000255967 Helicoverpa zea Species 0.000 description 2
- 241000258937 Hemiptera Species 0.000 description 2
- 206010020710 Hyperphagia Diseases 0.000 description 2
- 239000005906 Imidacloprid Substances 0.000 description 2
- 241000254158 Lampyridae Species 0.000 description 2
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 2
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 2
- 241000255588 Tephritidae Species 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 2
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 2
- YWTYJOPNNQFBPC-UHFFFAOYSA-N imidacloprid Chemical compound [O-][N+](=O)\N=C1/NCCN1CC1=CC=C(Cl)N=C1 YWTYJOPNNQFBPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940056881 imidacloprid Drugs 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 208000022530 polyphagia Diseases 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- 241000256118 Aedes aegypti Species 0.000 description 1
- 241000256173 Aedes albopictus Species 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241000254124 Aleyrodidae Species 0.000 description 1
- 241001124076 Aphididae Species 0.000 description 1
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 1
- 241000219193 Brassicaceae Species 0.000 description 1
- 241000244203 Caenorhabditis elegans Species 0.000 description 1
- 241001414720 Cicadellidae Species 0.000 description 1
- 241000254173 Coleoptera Species 0.000 description 1
- 235000015001 Cucumis melo var inodorus Nutrition 0.000 description 1
- 240000002495 Cucumis melo var. inodorus Species 0.000 description 1
- 241000219104 Cucurbitaceae Species 0.000 description 1
- 102000000634 Cytochrome c oxidase subunit IV Human genes 0.000 description 1
- 108050008072 Cytochrome c oxidase subunit IV Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000381325 Diabrotica virgifera zeae Species 0.000 description 1
- 240000002395 Euphorbia pulcherrima Species 0.000 description 1
- 241000220485 Fabaceae Species 0.000 description 1
- 241001468872 Fumagospora capnodioides Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 240000002024 Gossypium herbaceum Species 0.000 description 1
- 235000004341 Gossypium herbaceum Nutrition 0.000 description 1
- 241001147381 Helicoverpa armigera Species 0.000 description 1
- 101000685323 Homo sapiens Succinate dehydrogenase [ubiquinone] flavoprotein subunit, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 241000255777 Lepidoptera Species 0.000 description 1
- 241001414826 Lygus Species 0.000 description 1
- 241000255908 Manduca sexta Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 101150053185 P450 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000500437 Plutella xylostella Species 0.000 description 1
- 241000722249 Rhodnius prolixus Species 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000208292 Solanaceae Species 0.000 description 1
- 241000985245 Spodoptera litura Species 0.000 description 1
- 102100023155 Succinate dehydrogenase [ubiquinone] flavoprotein subunit, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 241000254113 Tribolium castaneum Species 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000012271 agricultural production Methods 0.000 description 1
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 1
- KLOHDWPABZXLGI-YWUHCJSESA-M ampicillin sodium Chemical compound [Na+].C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C([O-])=O)(C)C)=CC=CC=C1 KLOHDWPABZXLGI-YWUHCJSESA-M 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000009025 developmental regulation Effects 0.000 description 1
- 208000036526 difference of sexual differentiation Diseases 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000014493 regulation of gene expression Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 230000020509 sex determination Effects 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 238000010583 slow cooling Methods 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/033—Rearing or breeding invertebrates; New breeds of invertebrates
- A01K67/0333—Genetically modified invertebrates, e.g. transgenic, polyploid
- A01K67/0337—Genetically modified Arthropods
- A01K67/0339—Genetically modified insects, e.g. Drosophila melanogaster, medfly
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2207/00—Modified animals
- A01K2207/05—Animals modified by non-integrating nucleic acids, e.g. antisense, RNAi, morpholino, episomal vector, for non-therapeutic purpose
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/70—Invertebrates
- A01K2227/706—Insects, e.g. Drosophila melanogaster, medfly
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种烟粉虱若虫体壁渗透法RNA干扰的方法，包括如下步骤：1）棉花苗的培育；2）接虫产卵；3）采用体壁渗透法进行RNA干扰：准备好的dsRNA和外源对照基因dsEGFP，以1：1的体积比将星型聚合物的纳米材料和dsRNA混匀，小心地滴在若虫上，待液滴被虫体吸收后将棉叶插回装有清水的瓶中，放入培养箱中继续饲养，2天后记录死亡数并收集若虫样本。本发明方法利用新型纳米材料的强渗透性，使得dsRNA经体壁快速渗透进烟粉虱体内，显著降低了死亡率，提高了干扰效率，具有很高的时效性和良好的重复性。此外，本发明方法所用到的dsRNA量非常少，约0.3μl/头，在保证干扰效率的同时，大大降低了实验成本，具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物领域，涉及一种新型烟粉虱若虫RNA干扰方法构建。
背景技术
烟粉虱Bemisia tabaci属于半翅目Hemiptera，粉虱科Aleyrodidae，作为一种世界性的农业害虫，广泛分布于中国、日本、马来西亚、印度、美国等国。烟粉虱是一个快速进化的复合种，B烟粉虱于1949年首次传入我国，并于20世纪90年代暴发成灾，给我国农业生产带来巨大经济损失。Q烟粉虱于2003年首次在我国云南省被发现，目前Q烟粉虱已取代B烟粉虱成为我国主要危害种。烟粉虱属多食性害虫，寄主谱广，其寄主植物涉及74科420种，主要包括十字花科、葫芦科、豆科、茄科等。它对寄主植物的危害包括直接取食植物汁液，造成植株衰弱；分泌蜜露，诱发煤污病；作为植物病毒载体，传播植物病毒病。鉴于烟粉虱危害的严重性，对它的防治工作已经到了刻不容缓的地步。传统的防治方法多采用化学防治，而长期依赖化学杀虫剂，势必导致烟粉虱抗性的产生。在美国、西班牙、希腊等地已发现烟粉虱对吡虫啉产生严重的抗药性。而在我国浙江、江苏、湖北等地也已发现烟粉虱吡虫啉的中高抗品系。因此开展新防治方法的理论基础研究和应用基础研究势在必行。
RNA干扰(RNA interference，RNAi)是生物进化过程中一种高度保守的基因表达调节机制。它是由与靶基因序列同源的双链RNA(dsRNA)诱发的，特异性基因表达沉默现象。RNAi现象最早是在研究秀丽隐杆线虫Caenorhabditis elegans反义RNA(antisense RNA)的过程中被发现，此后陆续在真菌、果蝇、拟南芥、昆虫、小鼠等多种真核生物中发现。它在真核生物中参与抵御病毒感染、抑制转座子活性、调控基因的表达，且在机体的发育调控及生理代谢方面具有重要的生物学意义。目前对昆虫进行RNAi的操作技术已经比较成熟，将dsRNA或siRNA导入昆虫体内主要有3种方法，即注射、饲喂和组织培养。注射法已成功应用于果蝇Drosophila、赤拟谷盗Tribolium castaneum、家蚕Bombyx mori、烟草天蛾Manducasexta、斜纹夜蛾Spodoptera litura、小菜蛾Plutella xylostella和棉铃虫Helicoverpaarmigera，也曾尝试用于烟粉虱的成虫，但其成活率仅有50％～60％。饲喂法已成功应用于长红锥蝽Rhodnius prolixus、棉铃虫和玉米根萤叶甲Diabrotica virgifera，且在烟粉虱成虫RNAi中有较好的表现。组织培养法由于其培养条件难以掌握，目前仅在果蝇、白纹伊蚊Aedes albopictus和埃及伊蚊Aedes aegypti中有应用。
RNAi技术作为基因沉默的工具，被广泛应用于基因功能的研究，而且在农作物害虫防治方面展现出良好的应用前景，目前已在鳞翅目和鞘翅目昆虫中试验成功。通过对棉铃虫幼虫饲喂表达P450基因(CYP6AE14)和谷胱甘肽基因GST1dsRNA的棉花，诱导RNAi并阻碍了幼虫发育，这一技术为田间害虫控制开辟了新领域；Baum及其同事利用含特定dsRNA的人工饲料饲喂玉米根萤叶甲，沉默了其14个特定基因，该RNAi为利用表达Bt毒素蛋白的玉米、棉花和大豆等作物来控制害虫，提供了一个独特的模式。RNAi应用于防治刺吸式的昆虫如半翅目蚜虫、叶蝉和粉虱同样具有极大的发展潜力。
目前，对烟粉虱成虫进行RNAi的操作技术已经比较成熟，但国内外关于烟粉虱若虫的RNAi的成熟经验太少，本实验采用新型纳米材料，以烟粉虱的3-4龄若虫为实验对象，成功建立一套成熟的RNAi技术。
发明内容
本发明方法
本发明提供的技术方案是：一种烟粉虱若虫体壁渗透法RNA干扰的方法，该方法包括如下步骤：
1)棉花苗的培育：将浸种过的棉籽播种到苗盆里，待棉苗长出1片直径1.5-2.5cm真叶时，将棉苗连根拔起待用；
2)接虫产卵：将棉苗放于2个接壤在一起的瓶中，瓶盖上设有透气孔，瓶中放入若干对烟粉虱成虫，产卵后将成虫吹走，将接完卵的棉苗放入培养箱中，待卵孵化并发育到3-4龄若虫后，记录若虫个数；
3)采用体壁渗透法进行RNA干扰：准备好1μg/μl的dsRNA和外源对照基因dsEGFP，以1：1的体积比将星型聚合物的纳米材料和dsRNA混匀，将附有3-4龄若虫的棉叶取出，用移液器吸取混合液，小心地滴在若虫上，液滴以刚好包裹住虫体为宜，待液滴被虫体吸收后将棉叶插回装有清水的瓶中，放入培养箱中继续饲养，2天后记录死亡数并收集若虫样本。其中，所述星型聚合物的纳米材料见中国专利申请201810350562.7(发明名称:一种星型聚合物及其制备方法和应用)中所述的纳米材料，优选是其实施例一和实施例二中所述星型聚合物P1和P2，其在水溶液中可自组装形成纳米微球。
其中星型聚合物P1的化学结构式为：
星型聚合物P2的化学结构式为：
所述的方法，其中第1)步中，待棉苗长出1片直径2cm真叶时，将棉苗连根拔起待用。
所述的方法，其中第2)步中，将棉苗放于2个接壤在一起的直径5.5cm，高15cm的塑料瓶中，瓶盖上开一个直径3cm的圆孔，用直径4cm的100目纱网将孔封上，用于透气，所述塑料瓶中放入15对烟粉虱成虫，产卵72小时后将成虫吹走；培养箱中的温度25±1℃、湿度70％±10％、光照周期16h：8h(L：D)。
本发明还提供一种用于制备烟粉虱成虫RNA(dsRNA)的PCR引物对，其是dsIX-F5和dsIX-R5，其序列如下：
dsIX-F5：TAATACGACTCACTATAGGCCAGTTCCTCAAGCTCCATC
dsIX-R5：TAATACGACTCACTATAGGTTTGGTAACGGCTCAGTCCT。
本发明方法相对于其他烟粉虱RNA干扰方法的优势如下：
烟粉虱属于刺吸式小型昆虫，3龄和4龄若虫体长约0.6-0.9mm。应用显微注射的方法进行RNA干扰，死亡率较高，而采用植物叶片饲喂的方法，受叶片影响较大，重复性较差。
本发明方法利用新型纳米材料的强渗透性，使得dsRNA经体壁快速渗透进烟粉虱体内，显著降低了死亡率，提高了干扰效率，具有很高的时效性和良好的重复性。此外，本发明方法所用到的dsRNA量非常少，约0.3μl/头，在保证干扰效率的同时，大大降低了实验成本，具有很好的应用前景。
附图说明
图1为本发明方法中的塑料瓶装置。
图2烟粉虱Btix RNA干扰，Adult:烟粉虱成虫；N3:3龄若虫；N4:4龄若虫；Nymph:烟粉虱若虫。
具体实施方式
下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。
实验材料和方法
供试昆虫
Q烟粉虱最早于2009年6月采自北京中蔬大森林花卉市场所售一品红(Euphorbiapulcherrima Willd.)上，而后在玻璃温室中于棉花(Gossypium herbaceumL.cv.Zhongmian49)上继代饲养。为了保持种群的纯度，每隔2-3代用线粒体细胞色素氧化酶(mtCOI)进行监测。
供试试剂
RNA提取试剂Trizol(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，cDNA反转录试剂盒RT reagent Kit(Takara Biotech)，dsRNA合成试剂盒T7RiboMAXTM ExpressRNAi System，荧光定量试剂盒SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)(TIANGEN，Beijing，China)和胶回收试剂盒(Promega)，星型聚合物的纳米材料(中国专利申请201810350562.7(发明名称:一种星型聚合物及其制备方法和应用)中实施例二中星型聚合物P2在水溶液中自组装成的90nm的微球)，DNA分子量标准、X-Gal和IPTG(TIANGEN，Beijing，China)，氨苄青霉素钠盐(Amresco)，琼脂糖(北京擎科)，pEASY-T1vector(北京全式金)，ES-Taq Mix DNA聚合酶。其它实验室常用化学试剂(分析纯)均为市售。
主要仪器
荧光定量PCR仪(ABI QuantStudio 3)，PCR仪(Bio-Rad S1000)，Nanodrop(ThermoScientific Nanodrop 2000)，离心机(Eppendorf 5417R)，水浴锅(北京六一制造厂)，电泳仪和凝胶成像系统(Bio-Rad)，恒温箱和高压灭菌锅(SanYo)，组织研磨仪(上海净信科技)，移液器(Eppendorf)，超纯水仪(ZMQ55VOTI Mini Q)，超净工作台(苏州净化科技有限公司)。
RNA提取及cDNA合成
利用Trizol试剂提取烟粉虱总RNA，具体步骤如下：
1)取烟粉虱若虫40头，立即放入液氮中冷冻，防止RNA降解。
2)向烟粉虱样品中加入1ml Trizol和1粒研磨珠，于预冷的组织研磨仪中研磨2-3min，使其充分匀浆，冰上静置5min。
3)加入300μl氯仿，漩涡振荡器剧烈振荡30s，使其充分混匀，冰上静置5min，4℃12000rpm离心15min。
4)轻轻吸取400μl的上清液于干净的离心管中。
5)加入等体积预冷的异丙醇，缓慢颠倒混匀，冰上放置10min以沉淀RNA，4℃12000rpm离心10min。
6)倒去上清液，加入1ml提前配置的预冷75％无水乙醇进行漂洗，4℃8000rpm离心5min。
7)倒去乙醇，并小心吸去遗留的液体，室温晾干，加入10μl预冷的DEPC水溶解，用Nanotrop测定RNA的浓度及OD260/OD280的比值，并且用1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。
根据说明书的指示用TaKaRa公司的反转录试剂盒RT reagent Kit进行cDNA合成，步骤如下：
1)去除基因组DNA:
按如下表1的用量将试剂盒中的各组分加入到干静的离心管中，适度混匀后分装。置于PCR仪中42℃反应2min。
表1
2)合成cDNA
按如下表2将试剂盒中其它组分轻柔混匀，离心后放入PCR仪中37℃反应15min，85℃反应5s，产物保存于-20℃备用。
表2
荧光定量PCR分析
Intersex基因是性别决定级联的末端基因，在包括果蝇、家蚕、乳草蝽等多种昆虫中都被报道参与雌虫的体细胞性别分化。探究烟粉虱Btix基因的功能，有助于我们了解烟粉虱的性别决定机制，并为筛选防治烟粉虱的靶标基因，开发新的烟粉虱防治方法提供理论依据。通过分析室内饲养的Q型烟粉虱Btix基因在各个龄期的表达水平，发现Btix在卵期出现表达高峰，其次是3龄若虫期，而成虫期表达量低。由此，我们针对该基因开展若虫干扰实验。
1.荧光定量引物的筛选：利用Primer Premier 5.0软件设计符合荧光定量试验要求的特异性引物(退火温度≈60℃，产物大小100-200bp之间，避开干扰片段)，然后以烟粉虱成虫cDNA为模板，利用所设计的引物，首先进行普通PCR，电泳检测PCR产物，确定产物大小正确且为单一明亮条带，并送公司测序以检验引物的特异性。
本发明中设计的引物见表3，PCR反应体系见表4。
表3引物
表4
利用ABI QuantStudio 3实时荧光定量仪进行RT-qPCR，将模板浓度梯度稀释，按照荧光定量试剂盒推荐的体系和程序进行操作，对引物的扩增效率进行检测。反应体系见表5，反应程序见表6。
表5
表6
在72℃延伸的时候获得熔解曲线，最后筛选出合适的荧光定量引物(表3)。
2.内参基因的选择，选择SDHA作为本发明的内参基因。
3.数据分析：利用ABI处理RT-qPCR数据，根据2-ΔΔCt计算得到各个基因的相对表达量，其中，目的引物的扩增效率(E)的计算公式为E＝[10(-1/斜率)-1]×100％。
dsRNA合成
将验证后的Btix基因全长序列输入果蝇基因中的siRNA结合位点网站http://www.flyrnai.org/cgi-bin/RNAi_find_primers.pl设计相应的dsRNA引物(表3)。利用该引物，以烟粉虱成虫的cDNA为模板进行PCR，跑胶鉴定，回收与目的条带大小一致的片段，进行测序验证。然后用dsRNA合成试剂盒T7RiboMAXTM Express RNAi System合成dsRNA。
1)dsRNA合成
使用干净的RNA专用1.5ml离心管，依次加入的试剂见表7。
表7
37℃温育30min(温育时间可延长至2-6h，以增加产量)，70℃10min，然后室温放置20min，缓慢冷却形成dsRNA。
2)DNA和单链RNA消除
每20μl体系中加入新稀释的1/200的RNase和RQ1RNase-Free DNase各1.0μl，37℃温育30min，以除去反应体系中的DNA和单链RNA。
3)dsRNA纯化
每管加入0.1倍体积的3M Sodium Acetate(pH 5.2)和1倍体积的异丙醇，缓慢上下颠倒混匀后冰上放置5min，然后4℃15000rpm离心15min。加入预先配好的预冷70％乙醇0.5ml进行漂洗，8000rpm离心5min，然后室温晾干约15min，加入1-2倍体积的Nuclease-Free Water，存储在-20℃(-80℃长期保存)。
烟粉虱若虫体壁渗透法RNA干扰
1)棉花苗的培育：将浸种过的棉籽播种到苗盆里，待棉苗长出1片直径2cm左右真叶时，将棉苗连根拔起待用。
2)接虫产卵：将棉苗放于2个接壤在一起的直径5.5cm，高15cm的塑料瓶中，瓶盖上开一个直径约3cm的圆孔，用剪好的直径约4cm的100目纱网将孔封上，用于透气(图1)。塑料瓶中放入15对烟粉虱成虫，产卵72小时后将成虫吹走。将接完卵的棉苗放入培养箱中(温度25±1℃、湿度70％±10％、光照周期16h：8h(L：D))，待卵孵化并发育到3-4龄若虫后，用显微镜记录其若虫个数，采用体壁渗透法进行RNA干扰。
3)体壁渗透法：准备好1μg/μl的dsRNA和外源对照基因dsEGFP，以1：1的体积比将纳米材料和dsRNA混匀，尽量避免沉淀的产生。将附有3-4龄若虫的棉叶取出，用10μl的移液器吸取混合液，小心地滴在若虫上，注意枪头不要触碰虫体，液滴以刚好包裹住虫体为宜，约0.3μl。待液滴被虫体吸收后将棉叶插回装有清水的塑料瓶中，放入培养箱中继续饲养，2天后记录死亡数并收集若虫样本。
两种烟粉虱RNA干扰方法的比较
分别利用烟粉虱成虫饲喂法和若虫体壁渗透法对Btix进行RNA干扰实验，以外源基因EGFP为对照，每个实验设置3个生物学重复。干扰两天后，利用RT-qPCR检测Btix的干扰效率，同时统计死亡率。实验结果表明，两种方法在保证烟粉虱存活率的前提下，均能有效降低Btix的表达量，且若虫体壁渗透法的干扰效率大于成虫饲喂法(用若虫体壁渗透法，Btix的表达量分别下降了59％和64％，而用成虫饲喂法，Btix的表达量只下降了23％)(图2)。
Claims (5)
1.一种烟粉虱若虫体壁渗透法RNA干扰的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）棉花苗的培育：将浸种过的棉籽播种到苗盆里，待棉苗长出1片直径1.5-2.5cm真叶时，将棉苗连根拔起待用；
2）接虫产卵：将棉苗放于2个接壤在一起的瓶中，瓶盖上设有透气孔，瓶中放入若干对烟粉虱成虫，产卵后将成虫吹走，将接完卵的棉苗放入培养箱中，待卵孵化并发育到3-4龄若虫后，记录若虫个数；
3）采用体壁渗透法进行RNA干扰：准备好1μg/μl的dsRNA和外源对照基因dsEGFP，以1：1的体积比将星型聚合物的纳米材料和dsRNA混匀，将附有3-4龄若虫的棉叶取出，用移液器吸取混合液，小心地滴在若虫上，液滴以刚好包裹住虫体为宜，待液滴被虫体吸收后将棉叶插回装有清水的瓶中，放入培养箱中继续饲养；，2天后记录死亡数并收集若虫样本；
其中，所述星型聚合物的纳米材料中星型聚合物P1或P2在水溶液中可自组装形成纳米微球，且星型聚合物P1的化学结构式为：
星型聚合物P2的化学结构式为：
。
2.如权利要求1所述的方法，其中第1）步中，待棉苗长出1片直径2cm真叶时，将棉苗连根拔起待用。
3.如权利要求1所述的方法，其中第2）步中，将棉苗放于2个接壤在一起的直径5.5cm，高15cm的塑料瓶中，瓶盖上开一个直径3cm的圆孔，用直径4cm的100目纱网将孔封上，用于透气，所述塑料瓶中放入15对烟粉虱成虫，产卵72小时后将成虫吹走。
4.如权利要求1所述的方法，其中第2）步中，培养箱中的温度25±1℃、湿度70%±10%、光照周期16h：8h（L：D）。
5.一种用于制备烟粉虱成虫RNA（dsRNA）的PCR引物对，其是dsIX-F5和dsIX-R5，其序列如下：
dsIX-F5：TAATACGACTCACTATAGGCCAGTTCCTCAAGCTCCATC
dsIX-R5：TAATACGACTCACTATAGGTTTGGTAACGGCTCAGTCCT。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910647380.0A CN110583581A (zh) | 2019-07-17 | 2019-07-17 | 一种新型烟粉虱若虫rna干扰方法构建 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910647380.0A CN110583581A (zh) | 2019-07-17 | 2019-07-17 | 一种新型烟粉虱若虫rna干扰方法构建 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110583581A true CN110583581A (zh) | 2019-12-20 |
Family
ID=68852786
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910647380.0A Pending CN110583581A (zh) | 2019-07-17 | 2019-07-17 | 一种新型烟粉虱若虫rna干扰方法构建 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110583581A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111647573A (zh) * | 2020-04-13 | 2020-09-11 | 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 | 酚糖酰基转移酶基因BtPMaT1、及其特异性dsRNA在烟粉虱防控中的应用 |
| CN116267811A (zh) * | 2023-03-06 | 2023-06-23 | 佛山科学技术学院 | 一种烟粉虱卵的rna干扰方法 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007080127A2 (en) * | 2006-01-12 | 2007-07-19 | Devgen N.V. | Dsrna as insect control agent |
| CN103172776A (zh) * | 2013-04-08 | 2013-06-26 | 中国农业大学 | 荧光星形聚合物、其制备方法及应用 |
| CN103385220A (zh) * | 2013-07-25 | 2013-11-13 | 任伟 | 丽蚜小蜂的规模繁殖方法 |
| CN105646752A (zh) * | 2015-10-29 | 2016-06-08 | 中国农业大学 | 一种荧光星形聚合物及其制备方法与应用 |
| CN106434653A (zh) * | 2016-08-13 | 2017-02-22 | 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 | 一种快速简便烟粉虱成虫rna干扰方法 |
| CN108165582A (zh) * | 2017-12-20 | 2018-06-15 | 中国农业大学 | 一种通过昆虫体壁渗透dsRNA干扰昆虫基因表达的方法 |
| CN108794710A (zh) * | 2018-04-18 | 2018-11-13 | 中国农业大学 | 一种星型聚合物及其制备方法和应用 |
-
2019
- 2019-07-17 CN CN201910647380.0A patent/CN110583581A/zh active Pending
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007080127A2 (en) * | 2006-01-12 | 2007-07-19 | Devgen N.V. | Dsrna as insect control agent |
| CN103172776A (zh) * | 2013-04-08 | 2013-06-26 | 中国农业大学 | 荧光星形聚合物、其制备方法及应用 |
| CN103385220A (zh) * | 2013-07-25 | 2013-11-13 | 任伟 | 丽蚜小蜂的规模繁殖方法 |
| CN105646752A (zh) * | 2015-10-29 | 2016-06-08 | 中国农业大学 | 一种荧光星形聚合物及其制备方法与应用 |
| CN106434653A (zh) * | 2016-08-13 | 2017-02-22 | 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 | 一种快速简便烟粉虱成虫rna干扰方法 |
| CN108165582A (zh) * | 2017-12-20 | 2018-06-15 | 中国农业大学 | 一种通过昆虫体壁渗透dsRNA干扰昆虫基因表达的方法 |
| CN108794710A (zh) * | 2018-04-18 | 2018-11-13 | 中国农业大学 | 一种星型聚合物及其制备方法和应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Y.LIU ET AL.: "Genome-wide dissection of sex determination genes in the highly invasive whitefly species Bemisia tabaci Q/MED", 《INSECT MOLECULAR BIOLOGY》 * |
| 柳洋: "中国烟粉虱生物型分布、带毒率及抗药性监测", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》 * |
| 郭利桃: "基于transformer2和doublesex级联互作的烟粉虱性别决定机制研究", 《中国博士学位论文全文数据库 农业科技辑》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111647573A (zh) * | 2020-04-13 | 2020-09-11 | 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 | 酚糖酰基转移酶基因BtPMaT1、及其特异性dsRNA在烟粉虱防控中的应用 |
| CN111647573B (zh) * | 2020-04-13 | 2021-09-14 | 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 | 酚糖酰基转移酶基因BtPMaT1、及其特异性dsRNA在烟粉虱防控中的应用 |
| CN116267811A (zh) * | 2023-03-06 | 2023-06-23 | 佛山科学技术学院 | 一种烟粉虱卵的rna干扰方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20200140884A1 (en) | Down-regulating gene expression in insect plants | |
| CN107012174A (zh) | CRISPR/Cas9技术在获得家蚕锌指蛋白基因突变体中的应用 | |
| CN104178490B (zh) | 用于生物防控的禾谷孢囊线虫RNAi位点序列及其载体和应用 | |
| AU2011321846A1 (en) | Hollow fiber membrane filtration device and method for washing hollow fiber membrane module | |
| CN110592117B (zh) | 高致死基因vATPase B及其防瓢虫应用 | |
| CN110468137B (zh) | 一种茄二十八星瓢虫高致死基因及其在防治瓢虫的应用 | |
| CN110583581A (zh) | 一种新型烟粉虱若虫rna干扰方法构建 | |
| CN105274122B (zh) | 小菜蛾TOR基因的RNAi表达载体及其构建方法和应用 | |
| CN108795940A (zh) | 一种运用RNAi有效防治鳞翅目害虫的方法 | |
| CN110628789B (zh) | 一种抗虫低酚棉花品种的育种方法 | |
| CN102851297B (zh) | 一种烟蚜hunchback基因cDNA及其应用 | |
| CN107663522B (zh) | 一种利用二化螟小rna培育抗虫水稻的方法 | |
| CN104313031B (zh) | 青虾蜕皮抑制激素基因及其在加速青虾蜕皮和生长中的应用 | |
| CN104561055B (zh) | 一种朱砂叶螨细胞色素p450基因及其应用 | |
| CN110951730B (zh) | 青翅蚁形隐翅甲V-ATPase-A基因的dsRNA及其人工饲料和应用 | |
| CN106367428A (zh) | 一种绿盲蝽V‑ATPase‑D基因cDNA及其应用 | |
| CN102352357B (zh) | 抑制FLPs神经肽基因的dsRNA及其应用 | |
| CN104232645B (zh) | 一种过氧化物酶基因dsRNA及其在防治麦长管蚜中的应用 | |
| CN112175962B (zh) | 荻草谷网蚜基因zx-5及其在害虫防控中的应用 | |
| CN102329817B (zh) | 一种农杆菌介导的培育转基因吴屯杨植株的方法 | |
| CN108041069A (zh) | 一种生物源杀虫剂 | |
| CN109077028B (zh) | 对西花蓟马进行rna干扰的方法及装置 | |
| CN116515831A (zh) | 沉默昆虫体内的wa基因在用于防治昆虫的应用 | |
| CN106318956A (zh) | 一种绿盲蝽V‑ATPase‑A基因cDNA及其应用 | |
| CN116267811A (zh) | 一种烟粉虱卵的rna干扰方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20191220 |