CN116267811A - 一种烟粉虱卵的rna干扰方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种烟粉虱卵的RNA干扰方法，包括以下步骤：将dsRNA、星型聚合物纳米材料和表面活性剂混匀，得到干扰试剂；将干净的棉花苗置于温室养虫笼中接卵12h‑48h，取出棉花苗并记录所述棉花苗上卵的个数；用移液器吸取所述干扰试剂并滴加在卵体上，滴加过程保持移液器不触碰卵体，待液滴被卵体吸收，将带卵的棉花苗放置回温室养虫笼中继续饲养；饲养预设时间后取部分卵的样本，提取RNA，进行RNA干扰效率鉴定，余下的卵则在温室养虫笼中正常饲养至成虫羽化，记录羽化成虫数，并观察成虫表型变化。本发明所述烟粉虱卵的RNA干扰方法能够消除显微注射对卵的伤害，在保证卵的孵化率的同时，实现对目的基因的干扰，突破了烟粉虱卵的干扰技术的瓶颈。

Description

一种烟粉虱卵的RNA干扰方法
技术领域
本发明涉及昆虫RNA干扰方法技术领域，尤其涉及一种烟粉虱卵的RNA干扰方法。
背景技术
烟粉虱Bemisia tabaci属于半翅目Hemiptera，粉虱科Aleyrodidae，作为一种世界性的重要农业害虫，广泛分布于中国、日本、马来西亚、印度、美国等国。烟粉虱是一个快速进化的复合种，B烟粉虱于1949年首次传入我国，并于20世纪90年代暴发成灾，给我国农业生产带来巨大经济损失。Q烟粉虱于2003年首次在我国云南省被发现，目前Q烟粉虱已取代B烟粉虱成为我国主要危害种。烟粉虱属多食性害虫，寄主谱广，其寄主植物涉及74科420种，主要包括十字花科、葫芦科、豆科、茄科等。它对寄主植物的危害包括直接取食植物汁液，造成植株衰弱；分泌蜜露，诱发煤污病；作为植物病毒载体，传播植物病毒病。鉴于烟粉虱危害的严重性，对它的功能基因解析或是遗传学控制研究已经刻不容缓。
RNA干扰(RNA interference，RNAi)是生物进化过程中一种高度保守的基因表达调节机制。它是由与靶基因序列同源的双链RNA(dsRNA)诱发的，特异性基因表达沉默现象。目前对昆虫进行RNAi的操作技术已经比较成熟，将dsRNA或siRNA导入昆虫体内主要有3种方法，即注射、饲喂和组织培养。注射法和饲喂法是目前最普遍的将dsRNA分子导入细胞的方法。注射法对虫体的机械创伤和术后感染不可避免，且对注射仪器和操作技术要求较高，多用于中、大型昆虫的实验室研究，对于体积微小、体液较多的昆虫如烟粉虱等，操作难度高，实验效果不佳。饲喂法相对于注射法具有操作简便，创伤小且耗时少等优点，在针对烟粉虱成虫的RNAi实验中有较好的应用。而组织培养法由于其培养条件难以掌握，目前仅在果蝇、白纹伊蚊Aedes albopictus和埃及伊蚊Aedes aegypti中有应用。除此之外，还有技术表明可以利用体壁渗透的方法实现dsRNA的导入，这种方法可以穿透昆虫体壁进入靶标细胞中正确靶向目的基因，调控基因表达。该方法被尝试应用于烟粉虱若虫的干扰，且已取得初步成效。
经过多年的研究，烟粉虱成虫的RNAi技术已经比较成熟。而对烟粉虱若虫的RNAi操作技术也有相关报道。但是，国内外尚无针对烟粉虱卵的RNAi成功经验。这主要是因为，对烟粉虱卵进行RNAi操作，存在以下困难：1、烟粉虱的卵仅0.2mm长，肉眼几乎不可见，一切实验操作需在显微镜下完成，对实验人员的操作技术要求极高；2、烟粉虱的卵端部有卵柄，通过产卵器插入叶表裂缝中，无法在保证卵孵化率的同时实现卵的离体操作；3、相较于烟粉虱的若虫和成虫，烟粉虱的卵很难实现将dsRNA或siRNA导入昆虫体内。除此之外，卵的特殊生理阶段，也导致其无法采用饲喂法实现dsRNA的导入。再加上卵壳的结构复杂，卵壳内有卵细胞分泌的疏水性蜡层，可防止卵内水分蒸发和水溶性物质的侵入。卵壳外又有雌虫附腺分泌的粘胶层，亦可阻止外来物的侵入。这就导致卵的干扰难以照搬若虫的体壁渗透系统。综合以上原因，目前本领域技术人员仍未解决烟粉虱卵干扰的技术瓶颈问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，提供一种烟粉虱卵的RNA干扰方法，其能免除显微注射对卵的伤害，在保证卵的孵化率的同时，实现对目的基因的干扰。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种烟粉虱卵的RNA干扰方法，包括以下步骤：
将dsRNA、星型聚合物纳米材料和表面活性剂混匀，得到干扰试剂；
将干净的棉花苗置于温室养虫笼中接卵12h-48h，取出棉花苗并记录所述棉花苗上卵的个数；
用移液器吸取所述干扰试剂并滴加在卵体上，滴加过程保持移液器不触碰卵体，待液滴被卵体吸收，将带卵的棉花苗放置回温室养虫笼中继续饲养；
饲养预设时间后取部分卵的样本，提取RNA，进行RNA干扰效率测定，余下的卵则在温室养虫笼中正常饲养至成虫羽化，记录羽化成虫数，并观察成虫表型变化。
在一种实施方式中，所述dsRNA由dsTra-F2引物和dsTra-R3引物合成得到，所述dsTra-F2引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述dsTra-R3引物的核苷酸序列如SEQID NO：2所示。
在一种实施方式中，所述干扰试剂中，所述dsRNA：所述星型聚合物纳米材料：所述表面活性剂的加入质量比为1：1：1。
在一种实施方式中，所述dsRNA的浓度为0.5μg/μl-1μg/μl。
在一种实施方式中，所述表面活性剂为烷基糖苷。
在一种实施方式中，所述干扰试剂滴加在卵体上的滴加量为0.2μl/卵-0.4μl/卵。
实施本发明，具有如下有益效果：
本发明提供所述的烟粉虱卵的RNA干扰方法，能够免除显微注射对卵的伤害，在保证卵的孵化率的同时，实现对目的基因的干扰，突破了烟粉虱卵的干扰技术的瓶颈。此外，本发明所用到的dsRNA量非常少，低至0.2μl/卵，在保证干扰效率的同时，大大降低了实验成本，具有很好的应用前景。
附图说明
图1为烟粉虱成虫和烟粉虱卵的Bttra RNA干扰效率。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明作进一步地详细描述。
本发明提供了烟粉虱卵的RNA干扰方法，包括以下步骤：
将dsRNA、星型聚合物纳米材料和表面活性剂混匀，得到干扰试剂；
将干净的棉花苗置于温室养虫笼中接卵12h-48h，取出棉花苗并记录所述棉花苗上卵的个数；
用移液器吸取所述干扰试剂并滴加在卵体上，滴加过程保持移液器不触碰卵体，待液滴被卵体吸收，将带卵的棉花苗放置回温室养虫笼中继续饲养；
饲养预设时间后取部分卵的样本，提取RNA，进行RNA干扰效率检测，余下的卵则在温室养虫笼中正常饲养至成虫羽化，记录羽化成虫数，并观察成虫表型变化。
在一种实施方式中，所述dsRNA由dsTra-F2引物和dsTra-R3引物合成得到，所述dsTra-F2引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述dsTra-R3引物的核苷酸序列如SEQID NO：2所示。需要说明的是，Transformer基因是昆虫性别决定中一个古老而保守的关键基因。它通过调控下游doublesex和fruitless基因的性特异可变剪接参与性别调控。Transformer基因在雌性发育中占有重要地位，干扰胚胎前期的雌虫，会导致doublesex出现雄性剪接，雌性后代出现不完全发育或不同程度的雄性化。探究transformer在烟粉虱性别决定级联中的作用，有助于了解烟粉虱的性别决定机制，为探明烟粉虱的性别分化奠定基础，也为烟粉虱性别遗传操控提供理论依据。利用本发明的针对烟粉虱卵的干扰方法对胚胎前期的transformer基因展开功能验证，有利于更好地了解烟粉虱的性别决定机制。另外，发明人发现，绝大多数性别决定基因都在烟粉虱卵里面高表达，在若虫及成虫阶段表达量较低，甚至没有。因此，对于transformer基因展开的功能验证，需要对烟粉虱卵进行干扰。
但是，由于烟粉虱的卵个头小，卵壳薄，应用显微注射的方法进行RNA干扰，死亡率极高。而用若虫的体壁渗透法进行干扰，干扰效率不高。目前尚未找到合适的方法对烟粉虱的卵进行RNA干扰。
本发明利用特定成分的干扰试剂，通过将干扰试剂滴加在卵体上，并且液滴能够被卵体吸收，从而突破了烟粉虱卵的干扰技术的瓶颈。其中，所述星型聚合物纳米材料具有较强的渗透性，结合表面活性剂的亲和性，将dsRNA成功渗透进烟粉虱的卵中，免除了显微注射对卵的伤害，在保证卵的孵化率的同时，对目的基因进行了干扰，解决了烟粉虱卵的干扰难题。
进一步地，由于卵的特殊生理阶段，导致其无法采用饲喂法实现dsRNA的导入。另外，烟粉虱卵壳的结构复杂，卵壳内有防止卵内水分蒸发和水溶性物质侵入的疏水性蜡层，卵壳外亦有阻止外来物侵入的粘胶层，导致卵的干扰难以照搬若虫的体壁渗透系统。因此，在干扰试剂的组成成分上，烟粉虱卵不能效仿烟粉虱成虫及若虫的干扰试剂体系，而是需要采用特定的干扰试剂体系，才能够，在保证烟粉虱卵成活率的同时，实现dsRNA分子的稳定导入。
在一种实施方式中，所述表面活性剂为烷基糖苷，所述烷基糖苷可选用APG0810。需要说明的是，本发明列举的上述表面活性剂是一种性能较全面的新型非离子表面活性剂，兼具普通非离子和阴离子表面活性剂的特性，具有高表面活性、良好的生态安全性和相溶性，是国际公认的首选“绿色”功能性表面活性剂。在本试验中加入APG能增加星型聚合物纳米材料的渗透性，促进dsRNA分子的稳定导入。其它表面活性剂会破坏卵壳的蛋白质稳定性，造成烟粉虱卵的成活率降低。
在一种实施方式中，所述星型聚合物纳米材料包括星型聚合物P1和/或星型聚合物P2，所述星型聚合物P1或星型聚合物P2在水溶液中可自组装形成纳米微球，所述星型聚合物P1的化学结构式如式(A)所示：
Figure BDA0004112587840000051
式(A)
所述星型聚合物P2的化学结构式如式(B)所示：
Figure BDA0004112587840000052
在一种实施方式中，所述dsRNA的浓度为0.5μg/μl-1μg/μl。所述干扰试剂中，所述dsRNA：所述星型聚合物纳米材料：所述表面活性剂的加入质量比为1：1：1。其中，所述dsRNA加入量过多或过少都会影响干扰效率；所述星型聚合物纳米材料加入量过多将影响烟粉虱的存活率；所述表面活性剂加入量过多将影响卵的正常孵化。
综上，本发明提供所述的烟粉虱卵的RNA干扰方法，能够免除显微注射对卵的伤害，在保证卵的孵化率的同时，实现对目的基因的干扰，突破了烟粉虱卵的干扰技术的瓶颈。此外，本发明所用到的dsRNA量非常少，在一种实施方式中，所述干扰试剂滴加在卵体上的滴加量为0.2μl/卵-0.4μl/卵。在保证干扰效率的同时，大大降低了实验成本，具有很好的应用前景。
下面以具体实施例进一步说明本发明：
实施例1
烟粉虱卵的RNA干扰方法
实验材料和方法
供试昆虫
Q烟粉虱最早于2009年6月采自北京中蔬大森林花卉市场所售一品红(Euphorbiapulcherrima Willd.)上，而后在玻璃温室中于棉花(Gossypium herbaceumL.cv.Zhongmian 49)上继代饲养。为了保持种群的纯度，每隔2-3代用线粒体细胞色素氧化酶I(mtCOI)进行监测。
供试试剂
RNA提取试剂Trizol(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，cDNA反转录试剂盒
Figure BDA0004112587840000061
RT reagent Kit(Takara Biotech)，dsRNA合成试剂盒T7RiboMAXTMExpress RNAi System，荧光定量试剂盒SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)(TIANGEN，Beijing，China)和胶回收试剂盒(Promega)，星型聚合物的纳米材料(中国专利申请201810350562.7(发明名称：一种星型聚合物及其制备方法和应用)中实施例二中星型聚合物P2在水溶液中自组装成的90nm的微球)，烷基糖苷(万淇，APG0810)，DNA marker(TIANGEN，Beijing，China)，琼脂糖(北京擎科)，ES-Taq Mix DNA聚合酶。其它实验室常用化学试剂(分析纯)均为市售。
主要仪器
荧光定量PCR仪(ABI QuantStudio 3)，PCR仪(Bio-Rad S1000)，Nanodrop(ThermoScientific Nanodrop 2000)，离心机(Eppendorf 5417R)，水浴锅(北京六一制造厂)，电泳仪和凝胶成像系统(Bio-Rad)，恒温箱和高压灭菌锅(SanYo)，组织研磨仪(上海净信科技)，移液器(Eppendorf)，超纯水仪(ZMQ55VOTI Mini Q)，超净工作台(苏州净化科技有限公司)。
RNA提取及cDNA合成
利用Trizol试剂提取烟粉虱总RNA，具体步骤如下：
1)用解剖针挑取烟粉虱的卵约300颗于1.5ml离心管中，放入液氮中冷冻，防止RNA降解。
2)向烟粉虱样品中加入1ml Trizol和1粒研磨珠，于预冷的组织研磨仪中研磨2-3min，使其充分匀浆，冰上静置5min。
3)加入300μl氯仿，漩涡振荡器剧烈振荡30s，使其充分混匀，冰上静置5min，4℃12000rpm离心15min。
4)轻轻吸取400μl的上清液于干净的离心管中。
5)加入等体积预冷的异丙醇，缓慢颠倒混匀，冰上放置10min以沉淀RNA，4℃12000rpm离心10min。
6)倒去上清液，加入1ml提前配置的预冷75％无水乙醇进行漂洗，4℃8000rpm离心5min。
7)倒去乙醇，并小心吸去遗留的液体，室温晾干，加入10μl预冷的DEPC水溶解，用Nanotrop测定RNA的浓度及OD260/OD280的比值，并且用1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。
根据说明书的指示用TaKaRa公司的反转录试剂盒
Figure BDA0004112587840000071
RT reagent Kit进行cDNA合成，产物保存于-20℃备用。
荧光定量PCR分析
Transformer基因是昆虫性别决定中一个古老而保守的关键基因。它通过调控下游doublesex及fruitless的性特异可变剪接参与性别调控。同时它被报道在雌性发育中占有重要地位。干扰胚胎前期的雌虫，会导致doublesex出现雄性剪接，雌性后代出现不完全发育或不同程度的雄性化。探究transformer在烟粉虱性别决定级联中的作用，有助于我们了解烟粉虱的性别决定机制，为探明烟粉虱的性别分化奠定基础，也为烟粉虱性别遗传操控提供理论依据。因此，我们利用新发明的针对烟粉虱卵的干扰方法对胚胎前期的transformer基因展开功能验证。
1.荧光定量引物的筛选：利用Primer Premier 5.0软件设计符合荧光定量试验要求的特异性引物(退火温度≈60℃，产物大小100-200bp之间，避开干扰片段)，然后以烟粉虱卵cDNA为模板，利用所设计的引物，首先进行普通PCR，电泳检测PCR产物，确定产物大小正确且为单一明亮条带，并送公司测序以检验引物的特异性。
表1引物列表
Figure BDA0004112587840000081
表2PCR反应体系
Figure BDA0004112587840000082
利用ABI QuantStudio 3实时荧光定量PCR仪进行RT-qPCR，将模板浓度梯度稀释，按照荧光定量试剂盒推荐的体系和程序进行操作，对引物的扩增效率进行检测。反应体系见表3，反应程序见表4。
表3
Figure BDA0004112587840000091
表4
Figure BDA0004112587840000092
在72℃延伸的时候获得熔解曲线，最后筛选出合适的荧光定量引物(表1)。
2.内参基因的选择，选择SDHA作为本发明的内参基因。
3.数据分析：利用ABI处理RT-qPCR数据，根据2-ΔΔCt计算得到各个基因的相对表达量，其中，目的引物的扩增效率(E)的计算公式为E＝[10(-1/斜率)-1]×100％。
dsRNA合成
将验证后的transformer基因全长序列输入果蝇基因中的siRNA结合位点网站http://www.flyrnai.org/cgi-bin/RNAi_find_primers.pl设计相应的dsRNA引物。利用该引物，以烟粉虱卵的cDNA为模板进行PCR，跑胶鉴定，回收与目的条带大小一致的片段，进行测序验证。验证完成后，根据说明书的指示，用dsRNA合成试剂盒T7 RiboMAXTM ExpressRNAi System进行dsRNA的合成，产物保存于-20℃备用。
烟粉虱卵的RNA干扰
1)干扰试剂制备：利用已筛选的dsRNA引物，合成dsRNA。将新合成的dsRNA稀释至1μg/μl，按1：1：1的体积比将星型聚合物的纳米材料、烷基糖苷和dsRNA混匀备用。
2)棉花苗的培育：将浸种过的棉籽播种到苗盆里，待棉苗长出1片直径约2cm的真叶，将棉苗连根拔起待用。
3)棉苗接卵：在显微镜下检查棉花苗，保证苗上无其它烟粉虱若虫及卵。将干净的棉苗置于温室养虫笼中接卵24小时。取出棉苗，用显微镜记录卵的个数。
4)卵的干扰：用10μl的移液器吸取制备好的干扰试剂，在显微镜下小心地滴在卵上，注意枪头不要触碰卵身。待液滴被卵体吸收，将带卵的棉花苗放置小型养虫笼中继续饲养。
5)表型观察：干扰2天后取部分卵的样本，提取RNA，进行RNA干扰效率测定。余下的卵则在小型养虫笼中正常饲养至成虫羽化，记录羽化成虫数，并用显微镜观察成虫表型变化。
两种烟粉虱RNA干扰方法的比较
分别利用烟粉虱成虫饲喂法和烟粉虱卵的干扰方法对Bttra进行RNA干扰实验，以外源基因EGFP为对照，每个实验设置3个生物学重复。干扰两天后，利用RT-qPCR检测Bttra的干扰效率。实验结果如图1所示，其中，Egg表示烟粉虱卵，Adult表示烟粉虱成虫。由图1可知，两种方法均能有效降低Bttra的表达量。
综上，本发明提供所述的烟粉虱卵的RNA干扰方法，能够免除显微注射对卵的伤害，在保证卵的孵化率的同时，实现对目的基因的干扰，突破了烟粉虱卵的干扰技术的瓶颈。此外，本发明所用到的dsRNA量少，在保证干扰效率的同时，大大降低了实验成本，具有很好的应用前景。
以上所述是发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种烟粉虱卵的RNA干扰方法，其特征在于，包括以下步骤：
将dsRNA、星型聚合物纳米材料和表面活性剂混匀，得到干扰试剂；
将干净的棉花苗置于温室养虫笼中接卵12h-48h，取出棉花苗并记录所述棉花苗上卵的个数；
用移液器吸取所述干扰试剂并滴加在卵体上，滴加过程保持移液器不触碰卵体，待液滴被卵体吸收，将带卵的棉花苗放置回温室养虫笼中继续饲养；
饲养预设时间后取部分卵的样本，提取RNA，进行RNA干扰效率测定，余下的卵则在温室养虫笼中正常饲养至成虫羽化，记录羽化成虫数，并观察成虫表型变化。
2.根据权利要求1所述的烟粉虱卵的RNA干扰方法，其特征在于，所述dsRNA由dsTra-F2引物和dsTra-R3引物合成得到，所述dsTra-F2引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述dsTra-R3引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
3.根据权利要求1所述的烟粉虱卵的RNA干扰方法，其特征在于，所述干扰试剂中，所述dsRNA：所述星型聚合物纳米材料：所述表面活性剂的加入质量比为1：1：1。
4.根据权利要求1所述的烟粉虱卵的RNA干扰方法，其特征在于，所述dsRNA的浓度为0.5μg/μl-1μg/μl。
5.根据权利要求1所述的烟粉虱卵的RNA干扰方法，其特征在于，所述表面活性剂为烷基糖苷。
6.根据权利要求1所述的烟粉虱卵的RNA干扰方法，其特征在于，所述干扰试剂滴加在卵体上的滴加量为0.2μl/卵-0.4μl/卵。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106434653A (zh) * 2016-08-13 2017-02-22 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 一种快速简便烟粉虱成虫rna干扰方法
CN109957572A (zh) * 2019-04-08 2019-07-02 湖南省植物保护研究所 烟粉虱致死基因及其应用、rna干扰剂及rna干扰剂的制备方法和应用
CN110583581A (zh) * 2019-07-17 2019-12-20 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 一种新型烟粉虱若虫rna干扰方法构建
CN113508783A (zh) * 2021-04-28 2021-10-19 天津市农业科学院 利用棉花苗和med烟粉虱大量繁殖桨角蚜小蜂的方法

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Title
唐朝晖: "《生命科学综合设计实验指南》", vol. 1, 30 September 2018, 华中科技大学出版社, pages: 145 - 149 *

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