CN108570100A - 棉纤维伸长期表达的转录因子GhbHLH18及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种棉纤维伸长期表达的转录因子GhbHLH18及其应用，属于植物分子生物学及基因工程领域，公开了一个与棉花纤维发育相关在纤维伸长过程中起到重要作用的转录因子GhbHLH18及其应用，所述转录因子GhbHLH18的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的GhbHLH18转录因子具有如下特性：A、在棉花组织以及纤维伸长过程中纤维细胞中的表达情况十分明确，该转录因子在棉花等植物上没有报道；B、本发明涉及的转录因子在棉花纤维伸长过程中起到重要的调节作用，并影响棉花纤维品质。

Description

棉纤维伸长期表达的转录因子GhbHLH18及其应用

技术领域

本发明涉及植物分子生物学及基因工程领域，具体地，涉及一种棉纤维伸长期表达的转录因子GhbHLH18及其应用，更具体为一种能够在棉花纤维中表达并影响棉花纤维品质的转录因子GhbHLH18以及该转录因子在植物遗传改良上的应用。

背景技术

棉花纤维是最重要的天然纺织原料，研究纤维分化和发育的特点，有助于探讨纤维早期分化和发育的特点，为从事遗传改良和育种提供依据。棉花纤维实质上是由位于子房内的胚珠表皮细胞发育分化而来的一种单细胞结构。棉花纤维主要是有多糖(纤维素、半纤维素)、木质素、细胞壁蛋白及一些次生物质(果胶)等组成。棉花纤维细胞的发育过程一般分为四个相互重叠又独立的时期：起始期、伸长期(初生壁形成)、次生壁合成期以及成熟阶段。

真核生物的转录过程需要转录因子的引导才能进行。在植物中，转录因子参与调节植物的生长发育、形态建成和抗逆反应等多种生理生化过程。在棉花纤维发育的过程中，转录因子通过与启动子的结合与否、强弱变化调节大量基因的表达过程，调控棉花纤维细胞的分化和发育。因此，分离克隆有关特异的转录因子可以有效调节基因的转录水平，包括基因在不同组织以及不同环境条件下的表达。此外，获得具有重要调控作用的转录因子对于转基因作物的研究以及农业产业化都具有重大意义。

有研究表明，拟南芥表皮毛的起始是由MYB-bHLH-WD40复合体来控制的。棉花纤维细胞实质上是由胚珠表皮单细胞伸长突出发育而来的种子毛，其启动机制与拟南芥单细胞表皮毛的发育启动机制非常相似。在棉花中已经克隆到了在纤维细胞中高表达的bHLH转录因子。

研究表明，棉纤维GhbHLH1转录因子编码一个与拟南芥AtMYC2同源的bHLH类转录因子，在纤维快速伸长期表达水平较高。GhDEL65基因编码1个bHLH类转录因子，可能参与调控棉花纤维的起始分化。拟南芥中bHLH类转录因子TTG1在表皮细胞分化发育过程中起重要的调节作用，还参与了种皮粘液和花色素的合成。棉花中GhTTG1、GhTTG3可能在调控表皮毛及纤维发育方面有相似功能。然而，这些转录因子是否对棉花纤维生长发育具有调控作用还有待深入研究。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种棉花纤维伸长期表达的转录因子 GhbHLH18及其应用。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

第一方面，本发明提供一种GhbHLH18转录因子，所述转录因子的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。所述转录因子GhbHLH18在棉花各器官及不同发育阶段的胚珠中表达。

优选地，编码所述GhbHLH18转录因子的核苷酸序列(核苷酸GhbHLH18)如SEQ IDNO.1所示。该序列通过PCR和酶切的方法从棉花的基因组中进行克隆获得。

第二方面，本发明提供一种用于扩增GhbHLH18转录因子的核苷酸序列的引物对，所述引物对的序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示。

第三方面，本发明提供一种用于在GhbHLH18转录因子的核苷酸序列的两端加入attB接头的引物对，所述引物对的序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示。

第四方面，本发明提供一种重组载体，包含权利要求1所述的GhbHLH18转录因子。如实施例1中的连接核苷酸GhbHLH18的pMD19-T载体等。

第五方面，本发明提供一种棉花转化体，所述转化体采用干扰所述的GhbHLH18转录因子的表达后获得。

第六方面，本发明提供一种GhbHLH18转录因子在植物育种中的应用。

第七方面，本发明提供一种GhbHLH18转录因子在棉花纤维伸长发育中的应用。

第八方面，本发明提供一种GhbHLH18转录因子的制备方法，所述制备方法为生物克隆法，具体包括如下步骤：

S1、提取棉花RNA,进行反转录得到cDNA；

S2、以所述cDNA为模板，利用引物对进行扩增，得到扩增产物；所述引物对的序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示；

S3、将所述扩增产物进行电泳检测，切胶回收，即得GhbHLH18转录因子。

优选地，所述电泳检测采用琼脂糖凝胶电泳检测

第九方面，本发明提供一种所述的GhbHLH18转录因子的亚细胞定位方法，包括如下步骤：

A1、构建GhbHLH18转录因子的亚细胞定位载体；

A2、将所述亚细胞定位载体转化农杆菌，得到农杆菌转化体；

A3、将所述农杆菌转化体瞬时转化烟草，得到烟草转化体；

A4、将烟草转化体进行DAPI核染色，观察烟草蛋白亚细胞定位。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

1、本发明首次采用分子克隆方法，从陆地棉(Gossypium hirsutum)基因组中分离获得了新的GhbHLH18转录因子，并且通过转基因实验证实了它在棉花不同组织器官中的表达模式，以及在纤维快速伸长期的表达动态，从而达到了本发明目的。

2、本发明的GhbHLH18转录因子具有如下特性：A)在棉花各器官组织的表达情况十分明确，该转录因子在棉花等植物还没有报道；B)GhbHLH18转录因子在棉花纤维伸长过程中起到重要的调节作用，并影响棉花纤维品质。

3、GhbHLH18转录因子为调控基因在棉花纤维发育过程中的表达提供了新的途径，因而具有巨大的应用前景。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为GhbHLH18转录因子干扰载体的构建示意图；

图2为GhbHLH18转录因子瞬时转化烟草的亚细胞定位分析图；其中，A： GhbHLH18-YFP，B：对照，表达35S::YFP；C：GhbHLH18-YFP，DAPI共定位；例尺：标尺为50μm；

图3为GhbHLH18在徐州142及其突变体间不同组织及胚珠不同时期的定量检测差异结果；

图4为纤维发育的不同时期，GhbHLH18在对照和干扰植株中的定量检测。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989) 中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1转录因子GhbHLH18的克隆

(一)陆地棉(Gossypium hirsutum)RNA提取及反转

(1)陆地棉RNA提取

实验室利用CTAB-LiCl法抽提棉花RNA，减少次生代谢产物对RNA提取的影响，再利用过柱法纯化RNA，用于后续实验。以下为具体实验步骤：

1)准备：枪头，管子，EP管，盛放试剂用玻璃瓶均用0.1％DEPC水浸泡8小时后高压灭菌两次。实验用研钵，研杵，镊子，药匙放入150℃鼓风干燥箱烤4小时。

2)吸取20mLRNA提取工作液加入50mL离心管中，放入65℃金属水浴锅预热。

3)立刻将采集的实验样品放入装有液氮的研钵中，快速研磨成粉末后转移至预热过的50mL离心管中，震荡30秒，置于65℃水浴锅中，温浴30分钟。

4)从水浴锅中取出样品，加入等体积氯仿，震荡混匀10分钟。10000rpm，室温离心10分钟。

5)吸取上清转移至新的50mL离心管中，加入四分之一体积的10mol/L LiCl溶液(-80℃预冷10分钟)，-80℃冷冻10分钟。10000rpm，4℃离心30分钟，弃上清液取沉淀。

6)在沉淀中加入0.5％SDS溶液500μL，使其溶解，将溶液转移至1.5mL EP管中，加入等体积氯仿，震荡混匀10分钟。10000rpm，4℃离心10分钟。取上清转移至1.5 mL EP管中。

7)在EP管中加入二分之一体积无水乙醇，混匀后转移到吸附柱上，室温静置2分钟。13000转/分钟，室温离心1分钟。弃去上清液。

8)吸附柱中加入350μL去蛋白液RW1。13000rpm，室温离心1分钟，弃液。

9)吸附柱中加入500μL去漂洗液RW，静置2分钟。13000rpm，室温离心1分钟，弃液。

10)重复步骤9一次。

11)13000rpm，室温离心2分钟。将吸附柱放入新1.5mL EP管中。室温放置15 分钟。

12)在吸附柱中心加入50μL RNase-free水。室温放置2分钟。13000rpm，室温离心2分钟，所得溶液含棉花Total RNA。-80℃储存备用。

13)使用NanoDrop2000检测RNA浓度(浓度:260/280,260/230)和质量。

14)Total RNA电泳检测。

(2)陆地棉cDNA反转

实验选用的是产自Takara公司的PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNAEraser试剂盒。实验步骤如下：

1)去除基因组DNA反应：在200μL EP管中配制反应体系如下表所示：

冰上混匀后42℃水浴2min，冰上保存备用。

2)反转录反应：在200μL EP管中配制反应体系如下表所示：

冰上混匀后37℃水浴30min，85℃水浴5s，-20℃保存备用。

(二)GhbHLH18转录因子序列克隆

以棉花基因组cDNA为模板，用引物进行扩增，所述引物如SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3 所示：

SEQ ID NO.2：ATGAGGATCCAAAAACATTTCAA；

SEQ ID NO.3：CTATGATTGATGTTGTTGAACAATTT；

对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，得到一条约390bp的DNA序列。回收后连接pMD19-T载体，得重组载体，送交生物公司测序检测。该序列即为GhbHLH18转录因子，核苷酸序列见SEQ ID NO.1，氨基酸序列见SEQ ID NO.6。

实施例2：Getaway方法构建pHELLSGATE12-GhbHLH18载体

(1)含attB接头的基因片断获取

首先，设计加入attB接头的基因引物，引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.4、SEQID NO.5所示。用实施例1中回收的片段，用加了attB接头的引物PCR扩增获得含attB 接头的基因片断。PCR产物经过凝胶电泳，切胶回收，即得PCR获得片段。

(2)BP反应构建入门载体

利用Invitrogrn公司的BP Clonase构建入门载体。反应体系如下：

16℃反应2个小时，构建得到入门载体。

(3)LR反应构建干扰载体

载体选用pHELLSGATE12vector。酶切体系如下：

16℃反应2个小时。构建所得pHELLSGATE12-GhbHLH18载体(即干扰载体)结构如图1所示，其中，干扰载体的关键表达区域如图中35S promoter到OCSterminator 区域所示。

实施例3：GhbHLH18转录因子RNAi植株的获得

1)pHELLSGATE12-GhbHLH18载体转化农杆菌

挑选实施例2中测序正确的干扰载体，提取干扰载体用于后续农杆菌转化。与转化大肠杆菌类似。取10μL干扰载体加入100μL农杆菌GV3101感受态细胞中，轻轻混匀后冰上静置30分钟。液氮处理3分钟后立即37℃热激10分钟，随后冰浴1～3分钟。加入800μL LB无抗性液体培养基，28℃摇床180转/分钟培养3～5小时。4000rpm 离心3分钟后弃掉大部分上清液，将菌体悬浮后均匀涂布于固体LB抗性平板上，28℃培养箱，培养2～3天。

挑单克隆菌以抗性LB液体培养基28℃摇床培养过夜，取2μL菌液进行PCR扩增检测，阳性菌株加25％甘油于-80℃保存。

2)转化棉花胚轴

由武汉天问生物科技有限公司执行。具体实施方法如下：

农杆菌活化：将上一步中所得的阳性克隆菌株从-80℃取出，于相应抗性LB平板上划线，在28℃培养箱中培养2d后，挑取单克隆，接种到相应抗性的液体培养基中，活化12-16h，调节OD＝0.6,然后用于转基因。

棉花下胚轴侵染：无菌条件下将生长6d左右的棉花幼苗下胚轴切成0.5-1cm长的切段，转入到活化的农杆菌菌液中，搅匀，静置3-5min，倒掉菌液，滤纸吸干残余菌液，吹10min使表面稍微干燥，分散放置在垫有滤纸的共培养培养基中，共培养36h。

愈伤组织诱导、增殖、分化：将共培养后的下胚轴切段接种在2,4-D诱导培养基上，培养30d，挑选两端膨大的切段继代到新的IBA培养基上；愈伤组织继代3到4次之后，挑选米粒状愈伤组织转入分化培养基上，进一步分化成胚状体。

成苗生根培养：将分化出的小苗继代到1/2MS培养基中，成苗生长。

练苗：将生根良好的小苗打开三角瓶封口膜，练苗2-3天，移栽到小土钵中，遮阴缓苗一周左右移栽大田。

3)GhbHLH18基因干扰植株的表型数据分析和纤维品质数据分析

下表1和表2分别为GhbHLH18基因干扰植株的表型数据分析和纤维品质数据分析，从表中可知GhbHLH18基因干扰植株的株高、分枝、籽指、衣指、衣分较对照没有显著改变，而GhbHLH18基因干扰植株棉纤维的上半部平均长度、断裂比强度、伸长率显著提高。说明GhbHLH18基因会负影响植株的纤维品质，当GhbHLH18基因干扰后，有利于提高棉植株的纤维品质。

表1

GhbHLH18 RNAi植株表型数据的统计分析

表2

GhbHLH18 RNAi纤维品质数据的统计分析

图4为纤维发育的不同时期，GhbHLH18在对照和干扰植株中的定量检测(DPA，表示开花后)，由图4可知GhbHLH18基因在棉花纤维伸长早期0、3、6DPA表达量不断提高，在6DPA达到最高，之后表达量开始下降。

实施例4：GhbHLH18转录因子的表达特征与亚细胞定位分析

(一)GhbHLH18转录因子的表达特征

选取两种棉花植株品种，即陆地棉徐州142及其无毛突变体(其无毛突变体属于生态型，自然界突变)，将陆地棉徐州142及其无毛突变体的营养器官(根、茎、叶) 及开花后不同天数(DPA，表示开花后)的棉花胚珠(0DPA，1DPA，3DPA，6DPA， 9DPA，12DPA)材料抽提总RNA。不同组织的总RNA利用试剂盒进行反转录成一链的 cDNA作为qRT-PCR模板。利用qRT-PCR定量检测GhbHLH18在棉花中的表达。

图3为qRT-PCR分析GhbHLH18基因的表达模式，具体为GhbHLH18在徐州142及其突变体间不同组织及胚珠不同时期的定量检测差异结果，图中FL代表无毛突变体；结果表明GhbHLH18在根中表达量很低，茎、叶中表达量相对较高，在胚珠的伸长发育阶段有优势表达。

(二)GhbHLH18转录因子的亚细胞定位分析

图2为GhbHLH18转录因子瞬时转化烟草的亚细胞定位分析图；图中，从左至右第一列为暗场图片，第二列为相应的明场，第三列为融合场；从上至下，A：GhbHLH18-YFP，GhbHLH18蛋白连接黄色荧光蛋白B：对照，表达35S::YFP，35S驱动黄色荧光蛋白；C：GhbHLH18-YFP、DAPI共定位；例尺：标尺为50μm。通过瞬时注射烟草和DAPI染色，在激光共聚焦显微镜下观察发现，如图2A，黄色荧光信号集中分布在细胞核区域，暗示GhbHLH18转录因子定位于细胞核区域；如图2B，35S驱动黄色荧光蛋白不仅分布于细胞核中，也分布于细胞膜上；如图2C，黄色荧光信号和DAPI染料具有相同的定位，都在细胞核区域，进一步说明GhbHLH18转录因子在细胞核内表达。

具体实施方法如下：

一)Getaway方法构建GhbHLH18转录因子的亚细胞定位载体。

(1)含attB接头的基因片断获取

首先，设计加入attB接头的基因引物。用实施例1中回收的片段，用加了attB 接头的引物PCR扩增获得含attB接头的基因片断。PCR产物经过凝胶电泳，切胶回收。

(2)BP反应构建入门载体

利用Invitrogrn公司的BP Clonase构建入门载体。反应体系如下：

16℃反应2个小时。构建得到入门载体。

(3)LR反应构建亚细胞定位载体

载体选用pEarleyGate 101vector。酶切体系如下：

16℃反应2个小时。构建得到pEarleyGate 101vector-GhbHLH18-YFP亚细胞定位载体。

二)转化农杆菌及验证

(1)制备农杆菌感受态

农杆菌选用菌株为EHA105，农杆菌感受态制备步骤如下：

1)将－70℃保存的农杆菌菌种用接种环划线接种到含相应抗生素(利福平，链霉素)LB平板上，28℃恒温培养箱培养。

2)用接种环在平板上挑取生长良好的单菌落，接种在1.5mL含相应抗生素的LB 液体培养基中，28℃，200转/分钟培养过夜。

3)将步骤2中摇好的菌液按1：100比例将其加入新LB抗性液体培养基中扩大培养至150mL，28℃，200转每分钟培养至OD600≈0.6。

4)将菌液在冰上放置30分钟，4℃，4000rpm，离心10分钟。收集离心管管底菌体，弃上清。

5)加入10mL4℃冰箱预冷的0.1mol/L CaCl2溶液重悬农杆菌。

6)将菌液在冰上放置30分钟，4℃，4000rpm，离心10分钟。收集离心管管底菌体，弃上清。

7)加入1mL4℃冰箱预冷的0.1mol/L CaCl2+20％甘油重悬农杆菌。

8)制备好的农杆菌感受态置于-80度冰箱，冷冻保存。

(2)转化农杆菌

农杆菌转化步骤如下：

1)将制备好的农杆菌感受态细胞从-80度冰箱拿出，放在冰上解冻，解冻后每 100μL感受态细胞中加入5μL步骤一)所构建的亚细胞定位载体，混匀。冰浴30分钟。

2)置液氮中快速冷却约4分钟，后迅速转入37℃金属水浴锅中热激6分钟。

3)在超净工作台中加入600μL LB无抗性液体培养基。

4)恒温培养箱28℃，200转/分钟培养4小时。

5)室温下，4000rpm，离心10分钟。弃上清，加入200μL LB0液体培养基，重悬菌体。

6)吸取全部菌液于固体LB抗性平板上用灭过菌的涂布棒均匀涂布。

7)倒置平板，28℃恒温培养48小时。

8)挑取单菌落，利用抗性液体LB培养基培养并进行PCR验证。

(3)菌液PCR验证

菌液PCR反应体系如下表所示：

PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳，利用凝胶成像仪检测扩增片断大小是否一致。

三)烟草瞬时转化

本实验选用农杆菌注射法进行烟草蛋白亚细胞定位。

1)首先，在含有相应抗生素的LB培养基上培养步骤二)所得农杆菌。

2)2-3天后挑取单个菌落到含有适量抗生素的LB液体培养基中，28℃培养过夜。

3)将培养液以1:100的体积比例稀释到新的含有适量抗生素的LB液体培养基中28℃培养过夜。

4)将菌液慢速离心4000转每分钟*10分钟。将沉淀用MgCl2溶液稀释至OD600＝0.6。

5)菌液中加入MES和As(pH 5.6)至终浓度分别为200μM、10mM。室温下静置至少3小时。

6)分别将含有pEarleyGate 101vector-GhbHLH18-YFP载体的农杆菌菌液和含有pEarleyGate 101vector的农杆菌菌液与P19等体积混合，得到两种混合菌液。

7)用注射器分别吸取两种混合菌液，分别缓慢注射到完全展开的平整烟草叶片背面，2-5天后注射的烟草叶片可用于激光共聚焦扫描显微镜观察烟草蛋白亚细胞定位。

四)DAPI核染色

1)配制工作液：用PBS稀释DAPI母液，配制成所需要的工作浓度(5μg/ml)。

2)用注射器吸取DAPI，缓慢注射到已经注射步骤二)所得农杆菌的烟草叶片背面，30min后注射的烟草叶片可用于激光共聚焦扫描显微镜观察烟草蛋白亚细胞定位。

五)激光共聚焦观察

1)制片：用干净的剪刀剪下烟草注射创口附近区域叶片，大小约为0.5*0.5cm2，置于载玻片上加无菌水盖上盖玻片。

2)观察：将制作好的切片，倒置于激光共聚焦扫描显微镜的载物台上观察YFP信号。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海交通大学

<120> 棉纤维伸长期表达的转录因子GhbHLH18及其应用

<130> DAG35905

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 390

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial sequence

<400> 1

atgaggatcc aaaaacattt caaaaaccca atgaagaaat cgaaaagaaa atcatcaaca 60

atgagaagta gagcaagaaa agtggctagg aaacgagttg tgtgcagcag taagagaaga 120

aggatttgca gcaagtcttg ttctaagtcg aaggaggtaa tttccgagaa gctcgcagct 180

ttgaagagtt taattcctgg taataatgtc agaaacggaa gtaatgggat agttaaagta 240

gaacagctgt tccaagaaac tgcagattac atcattgtgt tgaagaccca agctgttctt 300

ttgcaaaagc ttattgattt ttatgatcat ggtgatgaag ggtctaataa tgaaatgcag 360

caccaaattg ttcaacaaca tcaatcatag 390

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial sequence

<400> 2

atgaggatcc aaaaacattt caa 23

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial sequence

<400> 3

ctatgattga tgttgttgaa caattt 26

<210> 4

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial sequence

<400> 4

aaaaagcagg ctatgaggat ccaaaaacat ttcaa 35

<210> 5

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial sequence

<400> 5

gaaagctggg tctatgattg atgttgttga acaattt 37

<210> 6

<211> 129

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial sequence

<400> 6

Met Arg Ile Gln Lys His Phe Lys Asn Pro Met Lys Lys Ser Lys Arg

1 5 10 15

Lys Ser Ser Thr Met Arg Ser Arg Ala Arg Lys Val Ala Arg Lys Arg

20 25 30

Val Val Cys Ser Ser Lys Arg Arg Arg Ile Cys Ser Lys Ser Cys Ser

35 40 45

Lys Ser Lys Glu Val Ile Ser Glu Lys Leu Ala Ala Leu Lys Ser Leu

50 55 60

Ile Pro Gly Asn Asn Val Arg Asn Gly Ser Asn Gly Ile Val Lys Val

65 70 75 80

Glu Gln Leu Phe Gln Glu Thr Ala Asp Tyr Ile Ile Val Leu Lys Thr

85 90 95

Gln Ala Val Leu Leu Gln Lys Leu Ile Asp Phe Tyr Asp His Gly Asp

100 105 110

Glu Gly Ser Asn Asn Glu Met Gln His Gln Ile Val Gln Gln His Gln

115 120 125

Ser

Claims (10)

1.一种GhbHLH18转录因子，其特征在于，所述转录因子的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

2.根据权利要求1所述的GhbHLH18转录因子，其特征在于，编码所述GhbHLH18转录因子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.一种用于扩增权利要求1所述的GhbHLH18转录因子的核苷酸序列的引物对，其特征在于，所述引物对的序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示。

4.一种用于在权利要求1所述的GhbHLH18转录因子的核苷酸序列的两端加入attB接头的引物对，其特征在于，所述引物对的序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示。

5.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求1所述的GhbHLH18转录因子。

6.一种棉花转化体，其特征在于，所述转化体采用干扰权利要求1所述的GhbHLH18转录因子的表达后获得。

7.一种根据权利要求1所述的GhbHLH18转录因子在植物育种中的应用。

8.一种根据权利要求1所述的GhbHLH18转录因子在棉花纤维伸长发育中的应用。

9.一种根据权利要求1所述的GhbHLH18转录因子的制备方法，其特征在于，所述制备方法为生物克隆法，具体包括如下步骤：

S1、提取棉花RNA,进行反转录得到cDNA；

S2、以所述cDNA为模板，利用引物对进行扩增，得到扩增产物；所述引物对的序列如SEQID NO.2、SEQ ID NO.3所示；

S3、将所述扩增产物进行电泳检测，切胶回收，即得GhbHLH18转录因子。

10.一种根据权利要求1所述的GhbHLH18转录因子的亚细胞定位方法，其特征在于，包括如下步骤：

A1、构建GhbHLH18转录因子的亚细胞定位载体；

A2、将所述亚细胞定位载体转化农杆菌，得到农杆菌转化体；

A3、将所述农杆菌转化体瞬时转化烟草，得到烟草转化体；

A4、将烟草转化体进行DAPI核染色，观察烟草蛋白亚细胞定位。