CN107723297A - 蝴蝶兰R3‑MYBx1基因及其在花色调节中的应用 - Google Patents

Abstract

本申请属于植物品种培育技术领域，具体涉及一个蝴蝶兰R3‑MYBx1基因及其在花色调节中的应用专利申请。该基因的开放阅读框含有162bp碱基，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。MYBx1基因参与花瓣的呈色过程，但是无论在白色花瓣还是红色花瓣都可以表达，蝴蝶兰花瓣的呈色可能受多个转录因子的影响，MYBx1是其中一个调控因子，参与花瓣呈色过程。矮牵牛中超表达应用该基因表明，该基因与花青素含量相关，其表达越强，抑制花青素合成能力越强。MYBx1是首个研究表明在花瓣中具有明显的、特异性的花青素降解功能的基因，通过在植物中超表达该基因可以创制具有新的花瓣呈色特征的新品种。

Description

蝴蝶兰R3-MYBx1基因及其在花色调节中的应用

技术领域

本申请属于植物品种培育技术领域，具体涉及一个蝴蝶兰R3-MYBx1基因及其在花色调节中的应用专利申请。

背景技术

植物花瓣颜色是重要观赏性状之一，而蝴蝶兰（Phalaenopsis aphrodite）花瓣颜色也是其主要价值体现方式之一。研究表明，花瓣呈色主要是由花青素在花瓣细胞中的积累造成的。

花青素是一类类黄酮物质，植物体中控制花青素合成的基因有花青素合成结构基因和花青素合成调控基因。在控制花青素合成的调控基因中，已经发现编码R2R3-MYB（拟南芥 TT2，玉米ZmC1，矮牵牛AN2、AN4、DPL、PHZ等）、bHLH（拟南芥GL3，玉米ZmR、ZmB，矮牵牛AN1等）和WD40（拟南芥TTG1、矮牵牛AN11）等类型的转录因子可以通过相互作用，形成MBW复合体（the MBW complex）协调激活花青素合成的结构基因，它们在调节花青素结构基因转录上具有一定的保守性。

在拟南芥中发现一个编码R3-MYB蛋白的基因-CPC是促进皮毛和根毛形成的重要调控因子，并且该基因编码的蛋白可以通过与MBW相互作用抑制花青素的合成。在番茄中进行的转基因研究表明，该基因可以抑制叶片、茎段等组织中花青素的积累，但是不能改变番茄果实颜色的变化。另外，与该基因同类型的成员在改变花瓣呈色中的研究还未见报道。

总之，由于花瓣颜色调控对于花卉价值具有重要影响，因而加强对于花瓣颜色调控有关基因的深入研究具有十分重要的学术理论价值和重要的经济应用意义。

发明内容

本申请目的在于提供一个蝴蝶兰的R3-MYBx1基因（MYBx1基因），通过对基因的初步研究，该基因与植物花色调节相关，从而可以用于花卉新品种培育。

本申请所采取的技术方案详述如下。

一个蝴蝶兰的R3-MYBx1基因，该基因的开放阅读框含有162bp碱基，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示，具体如下：

ATGTCCAAACCTAACTTCACAGAGGAAGAAGACGACCTCATTGCCAGAATGTATAAGCTCGTTGGAGACAGATGGTCTCTGATTGCTGGAAGGATCCCAGGAAGAACAAGTGAGGAGATTGAGAAATACTGGAAGTCAAAAAATTCTACCTCGTCTAGTTAA。

所述蝴蝶兰R3-MYBx1基因，在花瓣中表达，但是花色与MYBx1基因的表达没有明显的正相关关系。

所述蝴蝶兰R3-MYBx1基因在花色调节中的应用，该基因与花青素含量相关，该基因的表达强弱与花色表型有一定的相关性，其表达越强，抑制花青素合成能力越强（或者说超表达后，可以抑制花青素的合成积累）；

进一步而言，MYBx1基因超表达后，CHSa、F3H、DFR等花青素合成过程中的关键基因的表达受到明显抑制，而与花青素调控相关的基因AN1、AN2、AN4、JAF、PHZ、DPL、PH3和AN11等不受影响；

更进一步而言，MYBx1基因只与bHLH类型转录因子相互作用，MYBx1介导花青素合成调控作用机制是通过与bHLH类型的转录因子相互作用，抑制或竞争了R2R3-MYB或WD40蛋白的作用靶点，从而抑制了花青素的合成。

所述蝴蝶兰R3-MYBx1基因所编码的蛋白质，包括53个氨基酸，氨基酸序列如SEQID NO.2所示，具体如下：

MSKPNFTEEEDDLIARMYKLVGDRWSLIAGRIPGRTSEEIEKYWKSKNSTSSS。

所述蝴蝶兰R3-MYBx1基因的PCR扩增方法，具体包括如下步骤：

（1）提取蝴蝶兰花瓣总RNA，并反转录为cDNA；提取蝴蝶兰RNA时可以采用Trizol法提取；

（2）设计引物，进行PCR扩增，PCR扩增时，引物设计如下：

F：5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTATGTCCAAACCTAACTTCACAG-3'，

R：5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTATTAACTAGACGAGGTAGAATTTTTTG-3'；

以步骤（1）中所制备cDNA为模板，进行PCR扩增即可。

一种转基因矮牵牛新品种培育方法，所述转基因矮牵牛中转入有蝴蝶兰MYBx1基因，具体制备步骤如下：

（1）利用Gateway技术，将蝴蝶兰MYBx1基因转入表达载体pK2GW7.0/rfa中，构建获得重组载体pK2GW7.0::MYBx1；

（2）将步骤（1）中构建成功的重组载体转化至农杆菌菌株Agl1，并制备转染液；

所述转染液，具体配比例如为：5mL转化重组载体的农杆菌菌株Agl1培养液、10 μL浓度为20µM的乙酰丁香酮、10mL的灭菌水；

（3）采用叶盘法，利用步骤（2）中所制备转染液对矮牵牛进行转化，然后转至培养基上进行组培培养，转化时，将切割完成的矮牵牛叶盘置于转染液中浸染10~15min；

所述组培培养，具体过程可参考如下：

浸染完成后在共培养培养基上培养2~3天，再移至筛选培养基上培养40~50天，至矮牵牛幼芽长出；再将矮牵牛幼芽移至生根培养基上培养20~30天，至矮牵牛长出健壮的根；生根后的矮牵牛移至营养钵中进行炼苗培养；组培期间，培养条件为：25~30℃、光照条件为6000~10000lx；

所述共培养培养基，配方为：MS+20g蔗糖+10g葡萄糖+0.1 mg/L 萘乙酸+1 mg/L 玉米素+2 mg/L的6-苄基腺嘌呤及8g的琼脂粉，pH值为5.7；

所述筛选培养基，配方为：MS+20g蔗糖+10g葡萄糖+0.1 mg/L 萘乙酸+1 mg/L 玉米素+2 mg/L的6-苄基腺嘌呤及+8g琼脂粉+100mg/L的卡那霉素+250 mg/L的头孢霉素，pH值为5.7；

所述生根培养基，配方为：MS+20g蔗糖+10g葡萄糖+50mg/L的卡那霉素+250 mg/L的头孢霉素+8g琼脂粉，pH值为5.7。

本申请中，我们通过生物信息分析结合RT-PCR手段在蝴蝶兰（Phalaenopsis）中克隆鉴定了2个CPC同源基因MYBx1、MYBx2，对他们的进化关系、氨基酸结构进行分析，发现它们与拟南芥CPC基因同源。在蝴蝶兰中的表达特性表明MYBx2只在根和花梗中表达而在花瓣中没有呈现明显的表达特性；而MYBx1只在花的器官中表达，不在根、茎等营养器官中表达。表达模式的研究分析表明，MYBx1基因参与花瓣呈色过程，但是其表达与花瓣的呈色没有直接的正相关关系，无论白色花瓣还是红色花瓣都可以表达，蝴蝶兰花瓣的呈色可能受多个转录因子的影响，MYBx1是其中一个调控因子，参与花瓣呈色过程。

进一步，通过在矮牵牛中进行转基因超表达研究发现， MYBx1可以抑制矮牵牛花瓣花青素的合成，但在花脉中的抑制效果不明显，从而改变了矮牵牛花瓣的呈色方式，超表达该基因后，可使花瓣中花青素的含量明显降低。

总之，MYBx1是首个研究表明在花瓣中具有明显的、特异性的花青素降解功能的基因，该基因可以特异性的抑制花瓣中花青素的合成，而对花脉花青素的积累没有影响。通过在植物中超表达该基因可以创制具有新的花瓣呈色特征的新品种，因此在进行花瓣呈色相关的分子育种改良过程中具有重要的应用价值。

附图说明

图1为蝴蝶兰MYBx1基因编码的氨基酸序列比对图（PhMYBx1和PhMYBx2为蝴蝶兰R3-MYB，PiMYBx为矮牵牛R3-MYB，AtCPC和AtECT3为拟南芥R3-MYB，SiECT1为芝麻R3-MYB，箭头所指位置为R3-MYB结构域内保守的氨基酸）；

图2为蝴蝶兰MYBx基因与其他植物R3-MYB基因进化特征图（星号位置为蝴蝶兰MYBx1和MYBx2）；

图3为MYBx1基因在不同蝴蝶兰品种的表达模式（1、蝴蝶兰‘大辣椒’，2、蝴蝶兰‘V3’，3、蝴蝶兰‘阳光彩绘’，4、蝴蝶兰‘富乐夕阳’）；

图4为矮牵牛转MYBx1基因植物的表型（1~6#分别是不同的转基因矮牵牛株系，S代表花瓣的发育时期）；

图5为转基因矮牵牛的PCR检测（a为MYBx1在转基因植物中的表达特征，b为DNA检测MYBx1; N代表阴性对照，P代表阳性对照）；

图6 为不同株系转基因矮牵牛花瓣的花青素含量（花瓣发育的第7时期）；

图7为不同株系转基因矮牵牛花瓣的pH值（花瓣发育的第7时期）；

图8花青素合成结构基因在MYBx1转基因矮牵牛中的表达特点（‘M1 × R27’代表对照，OE5#代表第5#转基因株系）；

图9花青素合成调控基因在MYBx1转基因矮牵牛中的表达特点（花瓣发育的第7时期）；

图10为蝴蝶兰MYBx1与矮牵牛AN1、JAF13、AN2、AN11及蝴蝶兰bHLH1的酵母双杂交结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明，在介绍具体实施例前，就下述实施例中涉及的部分生物材料、实验试剂等实验背景情况简要介绍说明如下。

生物材料：

蝴蝶兰材料：实施例中所用蝴蝶兰品种“大辣椒”、“富乐夕阳”、“V3”和“阳光彩绘”等品种，均为普通商业化品种，可从市场购买获得；

矮牵牛材料：实施例中转基因所用的矮牵牛材料“M1 × R27”是由M1和R27两个品种通过常规杂交育种所获得的F1代；而矮牵牛材料M1、R27两个品种，由荷兰阿姆斯特丹大学Ronald Koes教授实验室赠送；

载体：pDONR207载体购自赛默飞世尔科技公司，转基因载体pK2GW7.0/rfa及酵母双杂交载体pGADT7/GW和pGBKT7/GW分别由荷兰阿姆斯特丹大学Ronald Koes教授实验室和兰州大学何凯教授实验室赠送；

引物及测序：由北京六合华大基因科技有限公司提供完成。

实验试剂：

氨苄青霉素（Amp）、卡那霉素（Kan）、利福平（Rif）、庆大霉素（Gen）、头孢霉素（Cef）、壮观霉素（Spe）等抗生素购自郑州久是生物技术有限公司；

BP、LR酶制剂购自赛默飞世尔科技公司；

基因克隆所用的高保真Taq酶-PrimeSTAR®GXL DNA Polymerase、RT-PCR及普通PCR采用的Taq酶-Taq DNA Polymerase及提取DNA、RNA所用的Ribonuclease A、DNase，反转录试剂盒PrimeScript™II1st Strand cDNA Synthesis Kit、DNA电泳Marker、大肠杆菌感受态、荧光定量试剂盒SYBR Premix Ex Taq II等购自大连宝生物公司；

LB液体培养基（无抗生素）：10g/L 胰蛋白胨+5g/L 酵母提取物+10g/L 氯化钠；

LB固体培养基（无抗生素）：10g/L 胰蛋白胨+5g/L 酵母提取物+10g/L 氯化钠+15g/L琼脂；

大肠杆菌（含重组质粒）培养用培养基：LB培养基+抗生素，抗生素为：100 mg/L Kan，20mg/L Gen，100 mg/L Spe，100 mg/L Amp；

农杆菌（含重组质粒）培养用培养基：LB培养基+抗生素，抗生素为：100 mg/L Spe+10050 mg/L Rif；

酵母杂交用YEPD培养基（pH5.8）：蛋白胨 10g/L，酵母提取物5g/L，葡萄糖10g/L；

酵母杂交用SD培养基（PH5.8）：酵母基本培养基（Yeast Nitrogen Base） + 缺失氨基酸混合物（配方参照Clotech说明书）；

矮牵牛遗传转化共培养所用培养基：MS+20g蔗糖+10g葡萄糖+0.1 mg/L 萘乙酸+1 mg/L 玉米素+2 mg/L的6-苄基腺嘌呤及8g的琼脂粉，pH值为5.7；

矮牵牛遗传转化筛选培养基：MS+20g蔗糖+10g葡萄糖+0.1 mg/L 萘乙酸+1 mg/L 玉米素+2 mg/L的6-苄基腺嘌呤及8g琼脂粉，pH值为5.7；抗生素为100mg/L的卡那霉素及250mg/L的头孢霉素；

矮牵牛遗传转化生根培养基：MS+20g蔗糖+10g葡萄糖，8g琼脂粉，pH值为5.7；抗生素为50mg/L的卡那霉素及250 mg/L的头孢霉素。

实施例1

本实施例主要介绍一下蝴蝶兰R3-MYB基因（包括蝴蝶兰MYBx1、MYBx2两个基因产物）的克隆获得过程，并就其在蝴蝶兰植物体内的表达模式进行了初步分析，具体过程简介如下。

（1）提取蝴蝶兰花瓣总RNA，并反转录为cDNA，具体过程介绍如下。

采用Trizol法提取蝴蝶兰RNA，具体过程如下：

加入1.5mL的Trizol至2mL离心管中，取1g～2g液氮速冻后的蝴蝶兰‘大辣椒’花瓣样品，研磨后加入离心管中，快速混匀，漩涡震荡2min～3min；25℃水浴10min；

加入300μL氯仿，漩涡震荡混匀2min～3min，4℃、12000rpm离心15min；

缓慢吸取850μL上清到新1.5mL离心管中，加入850μL异丙醇，颠倒数次混匀，-20℃静置2h左右；

4℃、12000rpm离心10min；吸除上清，倒扣沥干余液1min左右；

加入70 %酒精700μL，颠倒数次后，震荡仪25℃、750rpm震荡30min；

4℃、12000rpm离心1min，吸除酒精；倒扣晾干1min左右；

加入494μL的ddH₂O，轻弹离心管至RNA完全溶解；

加入5μL的DNase buffer（100×）和1μL的DNase混匀，37℃温育60min，去除DNA；

加入500μL的P/C（氯仿/水饱和酚混合液），混匀漩涡震荡5min；

4℃、12000rpm离心10min；

取上清液400μL至新1.5 mL 离心管，加入400μL异丙醇和40μL的3M的NaAC溶液，颠倒混匀数分钟，-20℃放置30min左右；

4 ℃、12000rpm离心10min，吸除上清，倒扣在滤纸上3-5min，至余液完全除净；

加入70 %酒精700μL，颠倒数次后，震荡仪25℃、750rpm震荡30min；

4℃、12000rpm离心1min，吸除酒精；倒扣晾干1min左右；

加入50μL的ddH₂O，震荡仪30min左右，至RNA完全溶解；

提取的RNA采用凝胶电泳和核酸浓度检测仪测定质量、浓度和纯度后，-20 ℃保存备用。

对所提取的RNA定量后，采用Takara Primer Script TM II 1st Strand cDNASynthesis Kit试剂盒进行反转录，制备cDNA，参考试剂盒说明书进行操作即可，或者具体可参考如下操作步骤：

取400ng所制备RNA至新的1.5 mL无RNA酶离心管中，加入1μL的Oligo（dT）和1μL的dNTP，补ddH₂O至11μL，将试剂混合均匀；65 ℃反应5 min，迅速转移至冰上骤冷；

加入4 μL PrimeScript II Buffe（5×）、3.5 μL Rnase free H₂O、0.5 μL RnaseInhibitor、1 μL PrimeScript II Rtase；

置于PCR仪上42℃反应60 min，再95℃反应5 min，以完成反转录过程；将反转录所制备cDNA -20 ℃保存备用。

（2）设计引物，进行PCR扩增，具体而言：

设计PCR扩增用引物序列，以步骤（1）中所制备cDNA为模板进行PCR扩增，以获得蝴蝶兰MYBx1、蝴蝶兰MYBx2两个基因产物；

扩增MYBx1基因时，PCR扩增引物设计如下：

F：5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTATGTCCAAACCTAACTTCACAG-3'，

R：5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTATTAACTAGACGAGGTAGAATTTTTTG-3'；

扩增MYBx2基因时，PCR扩增引物设计如下：

F：5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTATGTTAGAAGGTCTCTTCTTG-3'，

R：5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTATTAATTTTTCGACTTCCAATAC-3'。

PCR扩增时，采用大连宝生物公司的PrimeSTAR®GXL DNA Polymerase试剂盒进行操作即可，或者具体可参考如下操作步骤：

50μL反应体系设计如下：

5×PrimeSTAR Buffer，10μL；

dNTP Mixture，4μL；

上、下游引物，各0.5μ L (10mM)；

DNA Polymerase，0.5μL；

cDNA模板，2μL；

补水至50μL；

PCR仪上进行反应，PCR反应步骤为：95℃条件预变性10s，95℃变性15s，55℃退火40s，延伸1min，共35个循环。

需要解释的是，前期研究工作中，发明人利用拟南芥R3-MYB家族中的CPC基因在蝴蝶兰基因组中进行了BLAST检索比对，从而初步获得了蝴蝶兰MYBx1、蝴蝶兰MYBx2两个基因的基本信息，据此基本信息才进行了进一步的引物设计和PCR扩增；结果只有MYBx1获得了PCR扩增。

对PCR扩增产物进行进一步提纯、分析和测序后，即可获得蝴蝶兰MYBx1基因的碱基序列。

其中蝴蝶兰MYBx1基因碱基序列为：开放阅读框含有162bp碱基，与基因组数据库中的MYBx1核酸序列只有4个碱基的SNP位点，开放阅读框序列如SEQ ID NO.1所示，具体如下：

ATGTCCAAACCTAACTTCACAGAGGAAGAAGACGACCTCATTGCCAGAATGTATAAGCTCGTTGGAGACAGATGGTCTCTGATTGCTGGAAGGATCCCAGGAAGAACAAGTGAGGAGATTGAGAAATACTGGAAGTCAAAAAATTCTACCTCGTCTAGTTAA。

对蝴蝶兰MYBx1基因进行分析，可知蝴蝶兰MYBx1基因编码53个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体如下：

MSKPNFTEEEDDLIARMYKLVGDRWSLIAGRIPGRTSEEIEKYWKSKNSTSSS。

通过在SMART数据库中 (http://smart.embl-heidelberg.de/)进行比对，并与其他植物编码的R3-MYB蛋白比对，结果表明，MYBx1编码典型的R3-MYB类型蛋白，具有保守的(D/E)Lx2(R/K)x3Lx6Lx3R结构，（比对结果如图1所示）。

进一步地，利用MEGA 6.0软件，将蝴蝶兰MYBx1基因与拟南芥AtETC1(AT1G01380)、AtETC2 (AT2G30420)、AtTRY (AT5G53200)、AtTCL1 (AT2G30432)、矮牵牛MYBx、葡萄VvETC1 (XM_002267633.2)、麻风树JcETC1 (XM_012230970.1)、芝麻SiETC1(XM_011101996.1)等R3-MYB基因，构建进化树，进行同源分析。

分析结果表明：蝴蝶兰MYBx1与矮牵牛MYBx基因位于同一个进化分支上，是典型的R3-MYB类型的转录因子（如图2所示）。

以“大辣椒”、“富乐夕阳”、“V3”和“阳光彩绘”等蝴蝶兰品种为例，利用RT-PCR技术，以Actin作为内参基因，对蝴蝶兰MYBx1基因在蝴蝶兰植物体中的表达模式进行了分析。

首先，进行蝴蝶兰材料的RNA提取及反转录（参见前述操作）；

其次，设计RT-PCR反应引物序列如下：

MYBx1-F：5'-GTCCAAACCTAACTTCACAGAGG-3'，

MYBx1-R：5'- TCTCCTCACTTGTTCTTCCTGG-3'；

Actin-F：5'- ATTCTGGCGATGGTGTCAGT-3'，

Actin-R：5'- CTGTATTTCCTCTCTGGCGGA-3'；

采用的rTaq酶（大连宝生物公司）进行PCR，25μL反应体系设计如下：

10× Buffer，2.5μL；

dNTP Mixture，2μL；

上、下游引物，各0.125μL (10mM)；

DNA Polymerase（rTaq酶），0.125μL；

cDNA模板，1.5μL；

补水至25μL；

PCR反应程序为：94℃预变性1min，94℃变性30s，58℃退火40s，72℃延伸1min，若干循环（其中Actin基因反应共25个循环，MYBx1反应共35个循环），4℃终止反应。

将PCR扩增产物与DNA分子Marker在1×TAE缓冲液条件下，用加入少许溴化乙锭的1.0%琼脂糖凝胶分离，并在紫外凝胶成像仪中观察检测结果。

结果表明：MYBx1无论在红色花瓣品种“大辣椒”还是在纯白色蝴蝶兰品种“V3”中，都明显表达；而在“阳光彩绘”蝴蝶兰品种，只有侧瓣和唇瓣表达，“富乐夕阳”中虽然都有表达，但是明显在唇瓣中的表达量偏高（如图3所示）。说明MYBx1基因虽然在花瓣中表达，但是蝴蝶兰的花色与MYBx1基因的表达没有明显的正相关关系；意味着蝴蝶兰花瓣的最终呈色是由多基因控制的生物学过程。

进一步地，对MYBx2基因表达情况进行了检测，结果表明，MYBx2基因在所有四个蝴蝶兰品种中都没有检测到表达活性，该结果与转录组数据中的结果（下表）一致， 即MYBx2不在花瓣中表达，只在花梗和根中微弱表达，

。

实施例2

为进一步研究和确定蝴蝶兰MYBx1基因在蝴蝶兰花色调控方面的作用，利用gateway技术，发明人进一步构建了相关转基因载体，并转化了矮牵牛，相关实验简要介绍如下。

（1）载体构建

首先，通过Gateway™ BP Clonase™ II Enzyme mix酶将MYBx1基因的PCR产物整合至入门克隆pDONR207中，操作步骤参考如下：

反应体系：PCR产物4 μL（实施例1） + pDONR207 载体1 μL + BP 酶 1μL；室温过夜（或25℃ 1小时）；

反应液中加入1μL的 protein kinase，37℃反应10min。

将反应产物转化至大肠杆菌JM109，该过程参考Takara公司的JM109感受态转化说明书进行操作即可，或者具体可参考如下操作步骤：

在冰上溶解大肠杆菌JM109感受态；将上述反应产物3 μL加入至50 μL的大肠杆菌，轻弹混合均匀，冰浴30min，再42℃热激1min，最后迅速置冰上冷却2min；

向上述大肠杆菌感受态中加入800 μL的LB液体培养基，37℃震荡培养60min；

高速离心10s，丢弃上清，留余50μL液体，轻轻混匀菌体，在含有庆大霉素抗生素的LB固体培养基上进行涂板，置37℃培养箱中培养12~14小时左右；

挑取1到2个阳性克隆，在含有庆大霉素抗生素的LB液体培养基上培养6小时左右；

将菌液送至北京六合华大基因科技有限公司进行测序，测序验证正确后，表明将基因成功构建至了入门载体pDONR207，提取质粒备用。

其次，LR反应采用Gateway™ LR Clonase™ Enzyme Mix试剂盒进行；LR反应体系如下：

入门载体pDONR207（重组MYBx1）1μL + pK2GW7.0/rfa（表达载体）1μL + LR酶0.5 μL，室温过夜或25℃ 1小时；

反应液中加入0.5μL的 protein kinase，37℃反应10min。反应产物转化至大肠杆菌JM109；筛选阳性克隆（在含有壮观霉素的LB培养基上进行），扩增培养后进行PCR检测，对检测验证正确的阳性克隆提取质粒保存备用（相关操作参考前述操作即可）。

（2）转化农杆菌

将步骤（1）中构建成功的载体转化至农杆菌菌株Agl1；方法如下：

将农杆菌Agl1感受态在冰上融化；向农杆菌Agl1感受态中加入2 μL的MYBx1与pK2GW7.0/rfa的重组载体（即步骤（1）最终所构建的重组质粒pK2GW7.0::MYBx1），冰浴30min，再置液氮中1min，从液氮中取出后，37℃活化农杆菌5min，再置冰上冷却2min；

之后加入800 μL的LB液体培养基，28℃培养3小时；

2700rpm离心5min，丢弃上清，留余50μL液体，轻轻混匀菌体后，在含有壮观霉素和利福平抗生素的LB固体培养基上进行涂板，置28℃培养箱中培养2天；

挑取1到2个阳性克隆在含有壮观霉素和利福平抗生素的LB液体培养基28℃过夜培养，将菌液进行PCR检测，检测是否是阳性克隆，PCR验证正确后，表明将重组载体成功转化至了农杆菌，-80℃保存备用。

（3）矮牵牛遗传转化

矮牵牛的遗传转化采用叶盘法（具体参照Conner et al. (2009)，Transformationand regeneration of petunia. In Petunia: Evolutionary, Developmental andPhysiological Genetics, T. Gerats and J. Strommer, eds (New York: Springer),pp. 395-409），对矮牵牛“M1 × R27”进行遗传转化，或参照以下步骤进行。

剪取10~15片健康的矮牵牛叶片，在70%酒精中消毒2s，在灭菌水中冲洗1次，然后将叶片放置在0.5%次氯酸钠中消毒10min，在灭菌水中冲洗3次，在灭过菌的滤纸上用刀片切割成5cm×5cm左右大小的，呈方形的叶盘；

取5mL的过夜培养的新鲜菌液（步骤（2）中转化农杆菌）、10 μL浓度为20µM的乙酰丁香酮及10mL的灭菌水均匀混合组成浸染液（转染液）；

将切割完成的矮牵牛叶盘放置在浸染液（转染液）中浸染10~15min，期间轻轻混匀2-3次；浸染后的叶片轻轻放置在共培养培养基上培养2天；

然后将叶片从共培养培养基上移至在筛选培养基上培养40~50天，至矮牵牛幼芽长出；

再将矮牵牛幼芽移至生根培养基上培养20~30天，至矮牵牛长出健壮的根；

生根后的矮牵牛移至营养钵中进行炼苗培养，培养条件为：25~30℃、光照条件为6000~10000lx；培养炼苗期间注意用薄膜保湿；在培养间（或温室）中培养70~90天，至矮牵牛花瓣开放，观察并记录表型（部分结果如图4所示）。

（4）矮牵牛转基因后代鉴定

对转化成功的具有抗性的矮牵牛植株进行PCR检测验证。具体过程如下。

首先，采用2×CTAB方法提取矮牵牛材料的DNA，参考如下步骤进行操作：

取0.1g的新鲜的矮牵牛叶片放入1.5mL离心管中，研磨成浆，并在离心管中加入650μL的2×CTAB，放入65℃恒温水浴锅中水浴10min，期间需将离心管拿出上下颠倒2~3次；

取出离心管，向其加入450μL的三氯甲烷/水饱和酚的混合液，轻轻上下颠倒混匀5min；混匀后于12000 rpm离心10min；吸上清400μL于预先标好顺序的1.5ml离心管中，向装有上清液的离心管中加入等体积的异丙醇，颠倒混匀后，室温放置1h；

离心10min，弃上清液，室温下干燥5min；加入75%的乙醇700μL，震荡30min，使DNA充分洗涤；12000rpm离心2min，弃上清液，室温下干燥DNA，加入100uL ddH₂O充分震荡，使DNA充分溶解；

加入2μL的RNase buffer（200×）和1μL的RNase I混匀，37℃温育60min，去除RNA，65℃温育10min，使RNase I失活，保存DNA至-20℃备用。

其次，以提取的DNA为模板进行PCR检测，并以MYBx1重组质粒作阳性对照、以未转化的矮牵牛DNA作为阴性对照；

PCR反应时，扩增MYBx1时引物序列同实施例1（引物MYBx1-F、MYBx1-R），同时以Actin作为对照，PCR扩增用引物序列设计如下：

Actin-F（Petunia）：5'- GAATGGTCAAGGCTGGGTTTG-3'，

Actin-R（Petunia）：5'- TCAGTGAGCAGAACAGGATGT-3'；

PCR反应时，25μL反应体系设计如下：

10× Buffer，2.5μL；

dNTP Mixture，2μL；

上、下游引物，各0.125μL (10mM)；

DNA Polymerase，0.125μL；

DNA模板，2μL；

补水至25μL；

PCR反应程序如下：94℃预变性1min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30sec，30个循环；4℃终止反应。

将PCR扩增产物与DNA分子Marker在1×TAE缓冲液条件下，用加入少许溴化乙锭的1.0%琼脂糖凝胶分离，并在紫外凝胶成像仪中观察检测结果。

凝胶电泳结果如图所示，矮牵牛Actin基因和蝴蝶兰MYBx1基因同时被扩增，而阴性对照中蝴蝶兰MYBx1基因没有被扩增，说明MYBx1基因成功转化到了矮牵牛（如图5所示）。

进一步地，对转基因植株中的MYBx1表达量进行RT-PCR检测（相关操作参考实施例1及前述相关操作即可）。

结果表明：转基因植株1#、2#、3#和5#（编号为发明人自行编号，无特殊意义）中的MYBx1基因表达最强，其花瓣表型呈现出明显的花色减弱特征，而花脉中的花色没有明显的减弱，说明MYBx1的表达强弱与矮牵牛的花色表型有一定的相关性，其表达越强，抑制矮牵牛花青素合成能力越强。

对花瓣中花青素含量进行测定，采取分光光度计方法进行(Mirecki andTeramura, 1984，Effects of ultraviolet-B irradiation on soybean: V. Thedependence of plants sensitivity on the photosynthetic photon flux densityduring and after leaf expansion. Plant Physiology, 74, 475–480.)，具体参考如下步骤：

每个测定样品分别剪去两个完全开放的花瓣，研磨后放入10mL的提取液中（甲醇:水:盐酸=79:20:1）静置10min，5000rpm离心10min，吸取上清液至干净的试管作为待测样品；

然后在分光光度计530 nm 和 657 nm波长下分别测取吸光度，记录，根据公式：

Q = (A530 - 0.25 × A657) × M-1，

计算样品的花青素含量（其中A530、A657分别是样品的吸光度，M为样品的质量）。

检测MYBx1转基因后代中花瓣花青素含量，结果表明，2#、3#和5#转基因植物花瓣中的花青素含量只有10mg（1g鲜重），而对照可达50mg，说明MYBx1基因的超表达可以抑制转基因植物花瓣中花青素的积累（结果如图6所示）。

对花瓣pH值测定根据Quattrocchio et al. (2006，PH4 of Petunia is anR2R3-MYB protein that activates vacuolar acidification through interactionswith basic-helix-loop-helix transcription factors of the anthocyaninpathway.)的方法进行；测定步骤为：分别剪取待测样品的2个完全开放的花瓣，液氮研磨后快速放置含有6mL纯净水（ddH₂O）的试管，充分混匀后，快速用pH计进行测量，数值稳定后记录数值。

需要注意的是，由于花瓣pH受外在环境的影响（由于空气中的二氧化碳会干扰测定结果），因此所有测试样品须在1min之内完成。

结果表明，转基因矮牵牛花瓣中的pH值与对照相比，没有明显差异（结果如图7所示）。

基于上述结果，进一步通过荧光定量PCR技术进一步检测了转基因矮牵牛中花青素合成相关基因（结构基因和调控基因）AN2、PH4、PHZ、DPL1、AN1、AN4、PH3、JAF13、AN11、CHSa、CHIa、F3H、DFR、AS、AN9、AAT及蛋白酶基因CAC16.5a的表达，以此判定MYBx1与花青素合成之间的相关性。

荧光定量分析采用SYBR® Green I嵌合荧光法进行，以矮牵牛Actin基因作为内标，试剂为大连宝生物公司的荧光定量反应试剂盒SYBR Premix Ex ，PCR反应在荧光定量PCR仪（ABI公司）上进行。以提取的反转录后的矮牵牛cDNA为模板进行荧光定量PCR检测，其中以未转化的矮牵牛cDNA作为阴性对照。

荧光定量PCR时，具体引物序列设计如下：

荧光定量PCR时，20μL反应体系设计如下：

2×SYBR® Premix Ex Taq™ (Tli RNaseH Plus) ，10μL；

上、下游引物，各0.25μL (10mM)；

cDNA模板，2μL；

补水至20μL；

PCR反应程序如下：94℃预变性15s；94℃变性30s，60℃退火及延伸1min，40个循环；16℃终止反应。

综合结果表明，CHSa、F3H、DFR等花青素合成过程中的关键结构基因的表达受到明显抑制；而与花青素调控相关的基因AN1、AN2、AN4、JAF、PHZ、DPL、PH3和AN11等没有受到转录水平的影响（结果如图8、图9所示）。

实施例3

本实施例中，采用gateway技术，构建了酵母双杂交载体，进而对MYBx1是否作用于花青素的生物合成调控MBW复合体的元件进行了初步分析。相关实验简要介绍如下。

首先，用MYBx1基因与pDONR207的融合载体（入门载体），通过LR反应将MYBx1交换至pGBKT7/GW和pGADT7/GW中，创建酵母双杂交所用的目的载体（具体操作参考实施例2），其他酵母双杂交载体为本实验室前期保存的载体。

但需要注意的是，pGBKT7/GW和pGADT7/GW载体中所融合的GAL4基因位于目的基因的下游，因此，构建pDONR207融合载体所用的PCR产物为不含有终止密码子的MYBx1全长基因序列，PCR克隆所用引物如下：

F：5'- GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTATGTCCAAACCTAACTTCACAG-3'，

R：5'- GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTATACTAGACGAGGTAGAATTTTTTG-3'。

其次，将构建好的目的载体共转化至酵母细胞AH109，酵母转化实验步骤如下：

接种酵母细胞AH109于5mL液体YPED，30℃下振荡培养过夜；用分光光度计计数过夜培养物细胞密度，以最终5×10⁶个/mL的细胞密度接种于50 mL 的YPED培养液；置30℃，200rpm振荡培养至2×10⁷个细胞/mL（通常需要3-5h，该培养物的细胞足够供十次转化用）；

用50mL无菌离心管以3000g（2500 rpm）离心5min，收获细胞；弃培养液，把细胞悬浮在25 mL无菌水中，再同上离心；

用移液器将水弃掉，用1mL的100mM醋酸锂重新把细胞悬浮，转悬浮物到一个无菌1.5mL离心管；高速离心5秒钟沉淀细胞，用微量移液器吸出醋酸锂；用400μL的100mM醋酸锂重新悬浮酵母细胞（最终大约含500μL体积）；振荡细胞悬浮液，取50μL样品加到标记的离心管中，离心沉淀细胞，用微量取样器除去醋酸锂；

将1mL单链载体DNA（carrier DNA）样品煮沸5分钟，快速在冰水中冷却；

基本“转化混合液”由下列成分组成，小心按下列顺序混合转化液：240μL 的PEG（50%w/v），36μL的1.0mol/L 醋酸锂，25μL 单链载体DNA（2.0mg/mL），50μL 水和质粒DNA（0.1~10μg）；

用振荡器剧烈振荡每个反应管直到细胞完全混匀，通常需要1分钟左右；

置30℃培养箱保温30分钟；再置42℃水浴中热激20~25分钟；以8000 rpm室温离心15s，用移液器除去转化混合液；

用移液器吸取0.2~1.0 mL无菌水加到反应管中，然后用移液器上下轻轻抽提以悬浮沉淀；最后将等份的200μL转化混合液（即pGBKT7::MYBx1载体）均匀涂抹选择平板。

转化有pGBKT7::MYBx1载体的酵母细胞AH109，在营养缺失（亮氨酸）的SD培养基上筛选生长3天后，选取3个阳性克隆分别在同样营养缺失的SD平板上划线生长2天。

同上操作，将将pGADT7-其他基因（矮牵牛AN1、JAF13、AN2、AN11及蝴蝶兰bHLH1）用同样的方法转化至上述成功转化的含有pGBKT7::MYBx1载体的酵母细胞中，转化后在两缺（亮氨酸、苏氨酸）的SD培养基上筛选培养2~3天。

鉴定两个蛋白之间有无相互作用是通过将转化成功的酵母细胞分别在四缺SD培养基（亮氨酸、苏氨酸、组氨酸及硫酸腺嘌呤）上培养3~5天的生长情况进行判断。

结果表明，MYBx1只与bHLH类型转录因子相互作用，并且该作用机制在矮牵牛和蝴蝶兰中相对保守，矮牵牛中的AN1、JAF13和蝴蝶兰中的bHLH类型转录因子与MYBx1之间都有相互作用（如图10所示）。但是，MYBx1与R2R3-MYB转录因子AN2，以及WD40类型转录因子AN11都没有相互作用。这些结果说明MYBx1介导花青素合成调控作用机制是通过与bHLH类型的转录因子相互作用，抑制或竞争了R2R3-MYB或WD40蛋白的作用靶点，从而抑制了花青素的合成。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南省农业科学院

<120> 蝴蝶兰R3-MYBx1基因及其在花色调节中的应用

<130> none

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 162

<212> DNA

<213> Phalaenopsis aphrodite

<400> 1

atgtccaaac ctaacttcac agaggaagaa gacgacctca ttgccagaat gtataagctc 60

gttggagaca gatggtctct gattgctgga aggatcccag gaagaacaag tgaggagatt 120

gagaaatact ggaagtcaaa aaattctacc tcgtctagtt aa 162

<210> 2

<211> 53

<212> PRT

<213> Phalaenopsis aphrodite

<400> 2

Met Ser Lys Pro Asn Phe Thr Glu Glu Glu Asp Asp Leu Ile Ala Arg

1 5 10 15

Met Tyr Lys Leu Val Gly Asp Arg Trp Ser Leu Ile Ala Gly Arg Ile

20 25 30

Pro Gly Arg Thr Ser Glu Glu Ile Glu Lys Tyr Trp Lys Ser Lys Asn

35 40 45

Ser Thr Ser Ser Ser

50

Claims (8)

1.一个蝴蝶兰的R3-MYBx1基因，其特征在于，该基因的开放阅读框含有162bp碱基，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示，具体如下：

ATGTCCAAACCTAACTTCACAGAGGAAGAAGACGACCTCATTGCCAGAATGTATAAGCTCGTTGGAGACAGATGGTCTCTGATTGCTGGAAGGATCCCAGGAAGAACAAGTGAGGAGATTGAGAAATACTGGAAGTCAAAAAATTCTACCTCGTCTAGTTAA。

2.权利要求1所述蝴蝶兰R3-MYBx1基因在花色调节中的应用，其特征在于，该基因与花青素含量相关，其表达越强，抑制花青素合成能力越强。

3.如权利要求2所述蝴蝶兰R3-MYBx1基因在花色调节中的应用，其特征在于，MYBx1基因超表达后，CHSa、F3H、DFR这些花青素合成过程中的关键基因的表达受到明显抑制，而与花青素调控相关的基因AN1、AN2、AN4、JAF、PHZ、DPL、PH3和AN11不受影响。

4.权利要求1所述蝴蝶兰R3-MYBx1基因所编码的蛋白质，其特征在于，包括53个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体如下：

MSKPNFTEEEDDLIARMYKLVGDRWSLIAGRIPGRTSEEIEKYWKSKNSTSSS。

5.对权利要求1所述蝴蝶兰R3-MYBx1基因的PCR扩增方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

（1）提取蝴蝶兰花瓣总RNA，并反转录为cDNA；

（2）设计引物，进行PCR扩增，PCR扩增时，引物设计如下：

F：5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTATGTCCAAACCTAACTTCACAG-3'，

R：5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTATTAACTAGACGAGGTAGAATTTTTTG-3'；

以步骤（1）中所制备cDNA为模板，进行PCR扩增即可。

6.利用权利要求1所述蝴蝶兰R3-MYBx1基因的一种转基因矮牵牛新品种培育方法，其特征在于，所述转基因矮牵牛中转入有蝴蝶兰MYBx1基因，具体制备步骤如下：

（1）利用Gateway技术，将蝴蝶兰MYBx1基因转入表达载体pK2GW7.0/rfa中，构建获得重组载体pK2GW7.0::MYBx1；

（2）将步骤（1）中构建成功的重组载体转化至农杆菌菌株Agl1，并制备转染液；

（3）采用叶盘法，利用步骤（2）中所制备转染液对矮牵牛进行转化，然后转至培养基上进行组培培养，转化时，将切割完成的矮牵牛叶盘置于转染液中浸染10~15min。

7.如权利要求6所述转基因矮牵牛新品种培育方法，其特征在于，所述组培培养，具体过程如下：

浸染完成后在共培养培养基上培养2~3天，再移至筛选培养基上培养40~50天，至矮牵牛幼芽长出；再将矮牵牛幼芽移至生根培养基上培养20~30天，至矮牵牛长出健壮的根；生根后的矮牵牛移至营养钵中进行炼苗培养。

8.如权利要求7所述转基因矮牵牛新品种培育方法，其特征在于，

所述共培养培养基，配方为：MS+20g蔗糖+10g葡萄糖+0.1 mg/L 萘乙酸+1 mg/L 玉米素+2 mg/L的6-苄基腺嘌呤及8g的琼脂粉，pH值为5.7；

所述筛选培养基，配方为：MS+20g蔗糖+10g葡萄糖+0.1 mg/L 萘乙酸+1 mg/L 玉米素+2 mg/L的6-苄基腺嘌呤+100mg/L的卡那霉素+250 mg/L的头孢霉素及8g琼脂粉，pH值为5.7；；

所述生根培养基，配方为：MS+20g蔗糖+10g葡萄糖+50mg/L的卡那霉素+250 mg/L的头孢霉素+8g琼脂粉，pH值为5.7。