CN114015703B

CN114015703B - 油菜BnC3H基因在提高植物生物自发光强度中的应用

Info

Publication number: CN114015703B
Application number: CN202111228803.9A
Authority: CN
Inventors: 都浩; 钟静玲; 葛杰瑜; 郑鹏
Original assignee: ZJU Hangzhou Global Scientific and Technological Innovation Center
Current assignee: ZJU Hangzhou Global Scientific and Technological Innovation Center
Priority date: 2021-10-21
Filing date: 2021-10-21
Publication date: 2023-05-26
Anticipated expiration: 2041-10-21
Also published as: CN114015703A

Abstract

本发明公开了油菜BnC3H基因在提高植物生物自发光强度中的应用，属于生物技术领域。所述BnC3H基因的CDS序列如SEQ ID NO.1所示。所述应用包括：(1)利用多基因组装技术依次将Hisps基因、CPH基因、H3H基因、NPGA基因、Luz基因和BnC3H基因整合到受体载体中，构建获得多基因载体；(2)利用转基因技术将目标基因片段导入受体植株中，获得生物自发光强度增强的转基因植株。本发明首次公开BnC3H基因与参与植物自发光的Hisps基因、CPH基因、H3H基因、NPGA基因、Luz基因共同表达，可以显著提升植物的生物自发光强度。本发明为可持续发光植物的育种和生产提供了一个可行的技术方案。

Description

油菜BnC3H基因在提高植物生物自发光强度中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及油菜BnC3H基因在提高植物生物自发光强度中的应用。

背景技术

生物发光是一种自然现象，可以在800个属约10000个物种中观测到。能够自然发光的生物包括细菌、真菌、藻类、无脊椎动物和昆虫等，以海生生物为多(Haddock et al,2010)。大多数情况下，生物发光的功能在于传达视觉信号，用以警示掠食者、吸引猎物或者求偶。进一步科学研究后，还有望研发出自发光“树灯”来代替路灯照亮道路，以起到减少城市道路照明耗电量、节约能源的作用。

有关自发光植物的研究，已有相关报道。2013年，斯坦福大学的合成生物学家与植物学家就提出了“可持续发光植物”的商业开发项目，将荧光素酶基因导入到拟南芥基因组中；2014年，研究报道将海洋发光细菌发光基因插入烟草叶绿体DNA中，成功培育出了世界上第一株发光植物(Fleiss and Sarkisyan,2019)。但这些项目目前都没有取得根本性突破，尚未投入生产。

长期以来，人们推测真菌生物发光系统(Elucidation of the FungalBioluminescent Pathway，FBP)至少由四种成分组成：分子氧、荧光素、依赖于NAD(P)H的羟化酶和荧光素酶。2015年，Purtov等证明FBP中荧光素的化学成分是3-羟基组氨酸(Purtovet al,2015)。2017年，Kaskova等阐明了真菌氧化荧光素的结构(Kaskova et al,2017)。2018年，Kotlobay等鉴定了FBP中的真菌荧光素酶及其他三种关键酶，阐明了真菌荧光素的生物合成循环以及发光机制(Kotlobay et al,2018)。这是第一个来自真核生物的可编码发光系统，也被认为是目前发光植物构建的核心代谢循环。

将FBP应用于植物的关键是原料咖啡酸。咖啡酸是生产木质素和其他关键植物代谢物的关键中间体，广泛存在于植物中(Deng and Lu,2017),咖啡酸循环在外源真核生物毕赤酵母(Pichia pastoris)中成功表达。相对简单的系统、易得的底物和已有的实践为咖啡酸循环应用于植物奠定了基础。

Khakhar A等将构巢曲霉(Aspergillus nidulans)基因组中的NPGA(4’-phosphopantetheinyl transferase)基因、光茸菌(Neonothopanus nambi)基因组中的H3H(hispidin-3-hydroxylase)基因和Hisps(Hispidin synthase)基因，以及真菌荧光素酶(Luz)基因整合到Moclo质粒中(Engler et al,2014)，再将质粒导入根瘤农杆菌(A.tumefaciens)中，并与经过预处理的茎外植体进行混合培养，以将生物自发光元件整合入植株基因组中。从而使植株体内来自苯丙氨酸生物合成途径的咖啡酸(caffeic acid)经Hisps蛋白酶(Hispidin synthase)激活后转化为牛奶树碱(Hispidin)。牛奶树碱经牛奶树碱3-羟基化酶(hispidin-3-hydroxylase，H3H)催化产生3-羟基牛奶树碱(3-hydroxyhispidin)。荧光素酶(Luz)会将3-羟基牛奶树碱氧化成荧光素3-羟基牛奶树碱。而荧光素3-羟基牛奶树碱在释放能量变成咖啡酰丙酮酸(caffeylpyruvic acid)的过程中会释放出波长在520nm的可见光。随后，CPH(Caffey pyruvate hydrolase)编码的蛋白酶将咖啡酰丙酮酸转化成咖啡酸，从而实现植物自发光循环，使植物持续产生光(Khakhar et al,2020；Mitiouchkina et al,2020)。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够提升植物生物自发光强度的基因，将其应用到可持续发光植物的选育当中。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了油菜BnC3H基因在提高植物生物自发光强度中的应用，所述BnC3H基因的CDS序列如SEQ ID NO.1所示或与SEQ ID NO.1所示序列具有至少70％同源性且编码的蛋白在功能上等价。

本发明研究发现，相较于由Hisps基因、CPH基因、H3H基因、NPGA基因、Luz基因整合入植株基因组中获得的自发光植株，进一步整合油菜BnC3H基因可以显著提高植物自发光强度。

BnC3H基因来源于油菜基因组，编码p-香豆酸3-羟化酶(p-coumaric acid 3-hydroxylase)。该基因的CDS序列全长1527bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

BnC3H基因编码的蛋白质酶由508个氨基酸残基组成，其氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

进一步的，所述应用包括以下步骤：

(1)利用多基因组装技术将Hisps基因、CPH基因、H3H基因、NPGA基因、Luz基因和所述BnC3H基因整合到受体载体中，构建获得多基因载体；

(2)利用转基因技术将多基因载体中的目标基因片段导入受体植株中，培育，获得生物自发光强度增强的转基因植株。

所述Hisps基因、CPH基因、H3H基因、NPGA基因、Luz基因编码的蛋白酶在植物体内参与咖啡酸循环，实现植物自发光。

进一步的，Hisps基因的编码序列如SEQ ID NO.3所示，所述CPH基因的编码序列如SEQ ID NO.4所示，所述H3H基因的编码序列如SEQ ID NO.5所示，所述NPGA基因的编码序列如SEQ ID NO.6所示，所述Luz基因的编码序列如SEQ ID NO.7所示。

进一步的，所述多基因载体中各目的基因的上游均含有35S启动子序列。具体的，所述35S启动子为CaMV 35S启动子。

进一步的，步骤(1)中，采用TransGene Stacking II系统进行多基因组装。所述TransGene Stacking II系统为多基因组装载体系统，参见申请号为2017103841977的中国专利。

进一步的，以pYL322d1作为供体载体Ⅰ，pYL322d2作为供体载体Ⅱ，pYLTAC380GW作为受体载体。

具体的，所述多基因载体的构建方法包括以下步骤：

1)将Hisps基因片段、H3H基因片段、Luz基因片段分别插入供体载体pYL322d1的多克隆位点中获得供体载体pYL322d1-Hisps，pYL322d1-H3H，pYL322d1-Luz；

将CPH基因片段、NPGA基因片段和BnC3H基因片段分别插入供体载体pYL322d2的多克隆位点中获得供体载体pYL322d2-CPH，pYL322d2-NPGA，pYL322d2-BnC3H；

2)将供体载体pYL322d1-Hisps和受体载体pYLTAC380GW按1:1至2:1混合，共转入大肠杆菌NS3529感受态细胞中，涂布于含卡那霉素(kanamycin)和氯霉素(chloramphenicol)的双抗培养基中培养，取阳性菌株提取质粒；

3)使用归巢酶I-Sce I对步骤2)提取的质粒进行酶切，再转化大肠杆菌菌株XL10或NEB10-β，培养，筛选，提取质粒，获得含有目的基因Hisps的阳性克隆pYLTAC380GW-Hisps；

4)将供体载体pYL322d2-CPH和步骤3)制备的受体载体pYLTAC380GW-Hisps按1:1至2:1混合，共转入大肠杆菌NS3529感受态细胞中，涂布于含卡那霉素(kanamycin)和氨苄霉素(ampicillin)的双抗培养基中培养，取阳性菌株提取质粒；

5)使用归巢酶PI-Sce I对步骤4)提取的质粒进行酶切，再转化大肠杆菌菌株XL10或NEB10-β，培养，筛选，提取质粒，获得含目的基因Hisps和CPH的阳性克隆pYLTAC380GW-Hisps-CPH；

6)重复步骤2)-5)，以上一步骤获得的含有目的基因的新质粒作为受体载体，交叉使用含不同基因的d1、d2供体载体进行重组，直至所有目的基因组装到受体载体上，最后一步BP重组反应连入去除筛选标记基因表达盒元件，构建得到多基因载体pYLTAC380GW-Hisps-CPH-H3H-NPGA-Luz-BnC3H。

步骤(2)中，将构建的多基因片段导入受体植株中，使其在植株体内表达，表达的各蛋白酶参与咖啡酸循环，使植物持续产生光。

进一步的，采用农杆菌介导技术将多基因片段导入受体植株。所述农杆菌采用EHA105。

进一步的，所述受体植株为蝴蝶兰、烟草、油菜或水稻。

本发明具备的有益效果：

本发明首次公开油菜BnC3H基因与参与植物自发光的Hisps基因、CPH基因、H3H基因、NPGA基因、Luz基因共同表达，可以显著提升植物的生物自发光强度。本发明为可持续发光植物的育种和生产提供了一个可行的技术方案。

附图说明

图1为基础型生物发光模块pYLTAC380GW-7G载体示意图。

图2为增强型生物发光模块pYLTAC380GW-8G载体示意图。

图3为基础型生物发光模块pYLTAC380GW-7G载体酶切检测示意图。

图4为增强型生物发光模块pYLTAC380GW-8G载体酶切检测示意图。

图5为在蝴蝶兰花瓣中瞬时转化pYLTAC380GW-7G/8G发光模块载体48小时后相机拍照观察。

图6为在农杆菌介导烟草转基因阳性筛选阶段发光模块载体pYLTAC380GW-7G/8G荧光表达情况分析。

图7为烟草转基因植株苗期叶片在发光检测系统下检测发光模块载体pYLTAC380GW-7G/8G荧光表达情况的照片。

图8为图7中烟草转基因植株苗期叶片的荧光强度比较图，**表示P≤0.01。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。以下实施例仅用于说明本发明，不用来限制本发明的适用范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明的范围。

下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

pYL322d1、pYL322d2和pYLTAC380GW为华南农业大学刘耀光教授实验室馈赠，其构建方法参见申请号为2017103841977的中国专利。

实施例1大片段生物自发光模块DNA载体pYLTAC380GW-7G/8G构建过程

本研究使用TransGene Stacking II系统进行多基因组装。将构巢曲霉(Aspergillus nidulans)基因组中的NPGA(4’-phosphopantetheinyl transferase)基因、光茸菌(Neonothopanus nambi)基因组中的H3H(hispidin-3-hydroxylase)基因和Hisps(Hispidin synthase)基因，CPH(Caffey pyruvate hydrolase)基因，35S启动子驱动的油菜p-香豆酸3-羟化酶BnC3H(p-coumaric acid 3-hydroxylase)以及真菌荧光素酶(Luz)基因整合到pYLTAC380GW质粒中，最后通过一步BP重组反应连入去除筛选标记基因表达盒元件，从而构成基础型载体

pYLTAC380GW-Hisps-CPH-H3H-NPGA-Luz(pYLTAC380GW-7G)(图1)，增强型载体

pYLTAC380GW-Hisps-CPH-H3H-NPGA-Luz-BnC3H(pYLTAC380GW-8G)，增强性载体包含超量表达的油菜BnC3H基因(图2)。

其中Hisps的序列信息见基因登录号：QJQ48095.1；CPH的序列信息见基因登录号：QJQ48093.1；H3H的序列信息见基因登录号：QJQ48094.1；NPGA的序列信息见基因登录号：QJQ48097.1；Luz的序列信息见基因登录号：QJQ48096.1；BnC3H的序列信息见基因登录号：XP_009133464.2。

对上述基因的编码序列进行密码子优化后合成相应的基因片段。具体的，Hisps基因的CDS序列如SEQ ID NO.3所示，CPH基因的CDS序列如SEQ ID NO.4所示，H3H基因的CDS序列如SEQ ID NO.5所示，NPGA基因的CDS序列如SEQ ID NO.6所示，Luz基因的CDS序列如SEQID NO.7所示，BnC3H基因的CDS序列如SEQ ID NO.1所示。

基础型载体pYLTAC380GW-7G/增强型载体pYLTAC380GW-8G的具体构建过程如下：

(1)构建供体载体，pYL322d1-Hisps，pYL322d2-CPH，pYL322d1-H3H，pYL322d2-NPGA，pYL322d1-Luz，pYL322d2-BnC3H；

(2)将供体载体pYL322d1-Hisps和受体载体pYLTAC380GW(按1:1至2:1)混合在NS3529感受态中进行共转，采用热激法，冰浴30min，热激90s，冰浴2-3min，在不含抗生素的LB中，37℃，200rpm，2h复活，涂在含kanamycin(Km,25mg/L)和chloramphenicol(Chl,15mg/L)的LA板上，约18h后长出单克隆，用ddH₂O将所有单克隆冲洗至管中，抽提混合质粒。

(3)取约50-100ng混合质粒用0.5uL I-Sce I(NEB)在10uL体系中酶切4-5h，转化大肠杆菌菌株XL10(Vazyme)或NEB10-β(博迈德生物科技有限公司)，涂在含kanamycin(Km,25mg/L)的LA板上，37℃，15h后挑单克隆，在LB(含25mg/L Km和0.5mM IPTG)中培养，并进行菌液PCR鉴定，使用Green Taq Mix，将能扩增出亮带的进一步抽提质粒，各取200ng使用0.2uL Not l在20uL反应体系中酶切验证，出现四条带，含目的基因6.2k bp即为所需阳性克隆pYLTAC380GW-Hisps。

(4)将供体载体pYL322d2-CPH和(3)中受体载体pYLTAC380GW-Hisps(按1:1至2:1)混合在NS3529感受态中进行共转，按照(2)方法转化，涂在含kanamycin(Km,25mg/L)和ampicillin(Amp,70mg/L)的LA板上，约18h后长出单克隆，用ddH₂O将所有单克隆冲洗至管中，抽提混合质粒。

(5)取约40-90ng混合质粒用0.5uL PI-Sce I(NEB)，加0.5uL BSA在10uL体系中酶切4-5h，随后按照(3)中方法进行转化及验证，出现五条带，含目的基因1.7k bp CPH与6.2kbp Hisps即为阳性克隆pYLTAC380GW-Hisps-CPH。

(6)更多回合的重组，交叉使用含不同基因的d1、d2供体载体与上一轮构建完成的受体载体进行共转，构建完成pYLTAC380GW-7G/8G；

最后通过BP反应，25℃，将pYLTAC380GW-7G/8G(200ng)与PYLMFH-Bnmlpro(100ng)在5μl反应中用1μL的5×BP酶混合物混合5小时。然后加入1μL proteinase K溶液以在37℃下终止反应10分钟。转入NEB10-β(博迈德生物科技有限公司)感受态，挑单克隆鉴定。用Not1酶切检测，正确的阳性终载体pYLTAC380GW-7G/8G分别有11和12条目的DNA条带(图3和图4)，挑取阳性克隆做全质粒测序分析，选取正确pYLTAC380GW-7G/8G载体用于后续实验。

实施例2生物自发光模块瞬时转化蝴蝶兰花瓣后发光强度分析

1、将含有已验证正确的载体质粒pYLTAC380GW-7G/8G的EHA105菌液分别在LA+Kana+Rif板上划线活化，28℃，36h，从每板上挑取菌落，分别转入LB+Kana+Rif+15μM As培养基中，28℃，200rpm培养至OD₆₀₀＝0.8-1.0，4000rpm，10min收集菌体，用侵染液(含10mMMgCl，10mM MES，150μM As)悬浮农杆菌菌体，室温静置2～3h。

2、蝴蝶兰花瓣中瞬时表达验证，用1mL的针头在蝴蝶兰花瓣表面轻轻点开一个小口，再用去掉针头的针管吸取菌液，从蝴蝶兰花瓣伤口处注射进入花瓣。室内正常培养48h，用相机拍摄，可得到蝴蝶兰的生物自发光成像图。

结果如图5所示，蝴蝶兰花瓣瞬时转化pYLTAC380GW-8G载体模块发光强度显著高于pYLTAC380GW-7G载体模块。

实施例3农杆菌介导的烟草生物自发光模块转基因植株发光强度分析

1、将含有已验证正确的载体质粒pYLTAC380GW-7G/8G的EHA105菌液在LA+Rif+Kana平板上划线，28℃、36h，挑单克隆至3-5ml LB培养基中200rpm，28℃，36h，按照1:100-1:50的比例扩大培养50ml 3-5h至OD＝0.6，然后将菌液离心，用MS0液体培养基(MS+3％Sucrose+PH5.8，50ml)悬浮菌体至OD＝0.6用于侵染；

2、选取完全展开的烟草健康叶片(4-5周)，用手术刀切成0.5cm见方大小(切掉叶缘避开主脉)，叶片上表面朝下在MS1固体培养基(MS+0.5mg/L IAA+2.0mg/L BA+3％sucrose+0.6-0.8％Phytagel，PH＝5.8)上，25℃暗培养2-3天；

3、将预培养过的烟草叶片加入到菌液中，涡旋振荡确保叶片切口被菌液浸没，静止5-30min，用无菌滤纸吸去附着的菌液；将侵染过的叶片上表面朝下置于MS1固体培养基上28℃、暗培养2d；将叶片上表面朝上放入含有Timentin和hygromycin的MS1筛选培养基上，25℃光培养；当叶缘长出芽并可以分离时(1cm以上)，将芽切下转移至含有抗生素(TM+HygB)的MS2(MS+0.5mg/L IAA+3％sucrose+0.6-0.8％Phytagel，PH＝5.8)固体培养基中，两周后长出根，打开育苗盒的盖子练苗一周后转入种植土中培养，同时切取叶片一角在全自动发光检测系统下拍照分析。

结果如图6-8所示，转基因烟草稳定超量表达pYLTAC380GW8G载体模块发光强度显著高于pYLTAC380GW-7G载体模块。

序列表

<110> 浙江大学杭州国际科创中心

<120> 油菜BnC3H基因在提高植物生物自发光强度中的应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1527

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgtcgtggt ttcttatagc ggcggcgatt gtcgctgccg tcgtctcata caaccttatc 60

caacgtctga gattcaagct cccaccaggc ccacgaccta agcctatcgt cggtaacctc 120

tacgacataa aacctgtccg gttcagatgc tactatgagt gggctcaaac ctacggacca 180

atcatatcgg tctggatcgg ttctatctta aacgtggtcg tatcaagcgc cgagctagcc 240

aaagaagtcc tcaaagagca cgaccagaaa ctcgccgacc gtcaccggaa cagatccaca 300

gaagcattca gccgcaacgg tcaggatctg atatgggctg attatggtcc ccactacgtg 360

aaggttagaa aagtgtgcac gcttgagctc ttcacaccaa aaagactcga gtctcttaga 420

cctatccgtg aagatgaggt tactgccatg gtcgagtccg tctttagaga ctgtaacctt 480

cctgagaaca gagtgaaagg attacaactg aggaagtact taggagcggt tgcgttcaac 540

aacataacgc ggctagcgtt tggcaaacgt tttatgaacg cagaaggtgt gatggacgag 600

caagggcttg agttcaaggc cattgtatcc aacggtctaa agctaggtgc ttcactgtcg 660

atagctgaac acatcccctg gctccggtgg atgtttccag ccgatgagaa ggcttttgct 720

aagcacggag ctcgccgtga catcctcacg cgagctatca tggaggaaca cactttggcc 780

cgtcaaaagt ctagtggagc taagcagcat ttcgttgatg cgttgcttac gttaaaggat 840

cagtatgatc ttagtgaaga caccatcatt ggtcttctat gggacatgat cacagcgggt 900

atggacacaa cagctataac agcagaatgg gccatggcag agatgatcaa gaacccaaga 960

gtgcaacaaa aggtacaaga agagttcgac agagttgttg gactagaccg ggtcgtaacc 1020

gagccagact tctcacgctt accctacctc caatgcgtgg ttaaagaatc attcagactc 1080

caccctccaa cgcctctaat gcttcctcac agatccaacg cacacgtcaa gatcggaggc 1140

tacgacatcc ccaaaggctc aaacgtccac gtgaacgtct gggcggtggc tagagacccg 1200

gccgtgtgga aaaacccatt agagtttaga ccagagaggt tcttggaaga agatgttgac 1260

atgaaaggtc atgattttag gctgcttccg ttcggagcag gaagaagggt ttgtcccggt 1320

gcacaacttg ggattaactt ggtgacttct atgatgagtc atttgcttca ccatttcgtt 1380

tggacaccgc ctcaggggac taaactagat gagattgaca tgtctgaaaa ccctggactc 1440

gttacttaca tgcgtgttcc tgttcaagcc gtggccacgc ctcggttgcc ttctgatctg 1500

tataaacgtg tgccttatga aatgtaa 1527

<210> 2

<211> 508

<212> PRT

<213> 油菜(Brassica napus)

<400> 2

Met Ser Trp Phe Leu Ile Ala Ala Ala Ile Val Ala Ala Val Val Ser

1 5 10 15

Tyr Asn Leu Ile Gln Arg Leu Arg Phe Lys Leu Pro Pro Gly Pro Arg

20 25 30

Pro Lys Pro Ile Val Gly Asn Leu Tyr Asp Ile Lys Pro Val Arg Phe

35 40 45

Arg Cys Tyr Tyr Glu Trp Ala Gln Thr Tyr Gly Pro Ile Ile Ser Val

50 55 60

Trp Ile Gly Ser Ile Leu Asn Val Val Val Ser Ser Ala Glu Leu Ala

65 70 75 80

Lys Glu Val Leu Lys Glu His Asp Gln Lys Leu Ala Asp Arg His Arg

85 90 95

Asn Arg Ser Thr Glu Ala Phe Ser Arg Asn Gly Gln Asp Leu Ile Trp

100 105 110

Ala Asp Tyr Gly Pro His Tyr Val Lys Val Arg Lys Val Cys Thr Leu

115 120 125

Glu Leu Phe Thr Pro Lys Arg Leu Glu Ser Leu Arg Pro Ile Arg Glu

130 135 140

Asp Glu Val Thr Ala Met Val Glu Ser Val Phe Arg Asp Cys Asn Leu

145 150 155 160

Pro Glu Asn Arg Val Lys Gly Leu Gln Leu Arg Lys Tyr Leu Gly Ala

165 170 175

Val Ala Phe Asn Asn Ile Thr Arg Leu Ala Phe Gly Lys Arg Phe Met

180 185 190

Asn Ala Glu Gly Val Met Asp Glu Gln Gly Leu Glu Phe Lys Ala Ile

195 200 205

Val Ser Asn Gly Leu Lys Leu Gly Ala Ser Leu Ser Ile Ala Glu His

210 215 220

Ile Pro Trp Leu Arg Trp Met Phe Pro Ala Asp Glu Lys Ala Phe Ala

225 230 235 240

Lys His Gly Ala Arg Arg Asp Ile Leu Thr Arg Ala Ile Met Glu Glu

245 250 255

His Thr Leu Ala Arg Gln Lys Ser Ser Gly Ala Lys Gln His Phe Val

260 265 270

Asp Ala Leu Leu Thr Leu Lys Asp Gln Tyr Asp Leu Ser Glu Asp Thr

275 280 285

Ile Ile Gly Leu Leu Trp Asp Met Ile Thr Ala Gly Met Asp Thr Thr

290 295 300

Ala Ile Thr Ala Glu Trp Ala Met Ala Glu Met Ile Lys Asn Pro Arg

305 310 315 320

Val Gln Gln Lys Val Gln Glu Glu Phe Asp Arg Val Val Gly Leu Asp

325 330 335

Arg Val Val Thr Glu Pro Asp Phe Ser Arg Leu Pro Tyr Leu Gln Cys

340 345 350

Val Val Lys Glu Ser Phe Arg Leu His Pro Pro Thr Pro Leu Met Leu

355 360 365

Pro His Arg Ser Asn Ala His Val Lys Ile Gly Gly Tyr Asp Ile Pro

370 375 380

Lys Gly Ser Asn Val His Val Asn Val Trp Ala Val Ala Arg Asp Pro

385 390 395 400

Ala Val Trp Lys Asn Pro Leu Glu Phe Arg Pro Glu Arg Phe Leu Glu

405 410 415

Glu Asp Val Asp Met Lys Gly His Asp Phe Arg Leu Leu Pro Phe Gly

420 425 430

Ala Gly Arg Arg Val Cys Pro Gly Ala Gln Leu Gly Ile Asn Leu Val

435 440 445

Thr Ser Met Met Ser His Leu Leu His His Phe Val Trp Thr Pro Pro

450 455 460

Gln Gly Thr Lys Leu Asp Glu Ile Asp Met Ser Glu Asn Pro Gly Leu

465 470 475 480

Val Thr Tyr Met Arg Val Pro Val Gln Ala Val Ala Thr Pro Arg Leu

485 490 495

Pro Ser Asp Leu Tyr Lys Arg Val Pro Tyr Glu Met

500 505

<210> 3

<211> 5097

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgaactcat ctaagaaccc accatctact ctcctcgatg ttttcctcga tactgctaga 60

aacctcgata ctgcttcaag aaacgttttg gagtgtggtg agcatagatg gtcatacagg 120

gagctggata ctgtgtcatc agctctcgct caacatctta ggtacactgt gggattgtca 180

cctactgtgg ctgttatctc agagaaccat ccatacatcc tcgctcttat gctcgctgtt 240

tggaagttgg gtggaacttt cgctccaatc gatgtgcatt caccagctga gctggtggct 300

ggaatgctta acatcgtgtc accatcatgt ctcgttatcc catcttctga tgtgactaac 360

caaactttgg cttgtgattt gaacatccca gtggtggctt tccatccaca tcaatcaact 420

atccctgagt tgaacaagaa gtaccttact gattcacaaa tctcaccaga tttgccattc 480

cctgatccaa acaggccagc tttgtacctt ttcacttctt cagctacttc taggtcaaac 540

cttaagtgtg tgccattgac tcatactttc atcctcagaa actctttgtc taagagggct 600

tggtgtaaga gaatgagacc agagactgat ttcgatggaa tcagggtttt gggatgggct 660

ccctggtcac atgttttggc tcacatgcaa gatattggtc cacttactct tttgaacgct 720

ggatgttacg ttttcgctac tactccatct acttacccta ctgagttgaa ggatgatagg 780

gatgttatct catgtgctgc taacgctgtt atgtacaagg gagtgaagtc attcgcttgt 840

ttgccattcg ttttgggagg acttaaggct ctctgtgagt ctgagccatc agtgaaggct 900

caattgcaag ttgaggagag ggctcaactc cttaagtcat tgcaacacat gaaaatatta 960

gaatgtggtg gagctatgtt ggaggtgtca gtggcttcat gggctatcga gaacagaatc 1020

ccaatctcaa tcggaatcgg tatgactgag actggtggtg cgcttttcgc tggtccagtg 1080

caagctatcc aaactggttt ctcttctgag gataagttca tcgaggatgc tacttacctc 1140

ctcgtgaagg atgattacga gtcacatgct gaggaggata ttaacgaggg tgaattagtt 1200

gttaagtcca gaatgttgcc taggggttac ctcggataca acgatccatc attctcagtg 1260

gatgatgctg gttgggtgac tttcaagact ggtgataggt actcagtgac tccagatgga 1320

aagttctcat ggctcggtag aaacactgat ttcatccaaa tgacttctgg tgagactctt 1380

gatcctagac caatcgagtc actcctctgt gagtcttcac ttatctctag ggcttgtgtt 1440

atcggtgata agttccttaa cggaccagct actgctgtgt gtgctatcat cgagttggag 1500

ccaactactg ttgagaaggg acaagctcat tctagggaca tagctagaat cttcgctcca 1560

atcaacaggg atttgccacc accacttaga atcgcttggt cacatgtttt ggttttgcaa 1620

ccttctgaga agatccctat gactaagaag ggaactatct tcagaaagaa gatcgagcaa 1680

gttttcggtt cagctctcgg tggatcttct ggtgataact cacaagctac tactgatgct 1740

tcagtggtta gaagggatga gttgtctaac actgtgaagc atatcatcag cagagttctc 1800

ggagtgtctg atgatgagtt gctctggact ttgtcattcg ctgagttggg tatgacttct 1860

gctctcgcta ctagaatcgc taacgagttg aacgaggttt tggtgggagt gaacctccct 1920

atcaacgctt gttacatcca tgttgatttg ccttcattgt caaacgctgt gtacgctaag 1980

ttggctcatt tgaagttgcc agatagaact ccagagccta gaaaggctcc agtggagaac 2040

cctggtggaa aggagatcgt tatcgtggga caggcattca gattgccagg ttctatcaac 2100

gatgtggctt cacttaggga tgctttcctt gctaggcagg cctcttctat catcactgag 2160

atcccaccag atagatggga tcatgcttct ttctacccta aggacatcag gttcaacaag 2220

gctggacttg ttgatatagc taactacgat cattctttct tcggtttgac tgctactgag 2280

gctctttacc tttcaccaac tatgagactc gctcttgagg tgtctttcga ggctctggaa 2340

aacgctaaca tcccagtgtc acaattgaag ggttcacaaa ctgctgttta cgtggctact 2400

actgatgatg gtttcgagac tctccttaac gctgaggctg gttacgatgc ttacactagg 2460

ttctacggaa ctggtagggc tgcttcaact gcttctggta gaatctcata ccttttggat 2520

gtgcatggtc catcaatcac tgtggatact gcttgttcag gaggagctgt gtgtatcgat 2580

caagctatcg attacctcca atcttcatca gctgctgata ctgctatcat ctgtgcttct 2640

aacactcatt gttggcctgg ttcattcatg ttcctctcag ctcaaggtat ggtgtcttct 2700

ggaggtaggt gtgctacttt cactactgat gctgatggat acgtgccatc tgagggtgct 2760

gtggctttca tccttaagac tagagaggct gctatgaggg ataaggatac tatcctcgct 2820

actatcaagg ctactcaaat ctcacataac ggtaggtcac aaggtcttgt ggctccaaac 2880

gttaactcac aagctgattt gcataggtca ctcctccaaa aggctggttt gtcaccagct 2940

gatatacatt tcatcgaggc tcatggtact ggaacttcac tcggtgattt gtcagagatc 3000

caagctatca acgatgctta cacttcatca caacctagga ctgctggacc acttatcgtg 3060

tcagcttcta agactgttat cggacatact gagcctgctg gaccactcgt gggtatgttg 3120

tcagttttga actcattcaa ggagggagct gtgccaggtc ttgctcattt gactgctgat 3180

aaccttaacc cagctctcga ttgttcttca gtgccattgc ttatcccata ccaaccagtg 3240

catttggctg ctccaaagcc acatagggct gctgttatgt catacggatt ctcaggaact 3300

ctcggtggaa tcgttttgga ggctccagat gaggagagac ttgaggagga gccaccaaac 3360

gataagccta tgttgttcgt ggtgtcagct aagactcata ctgctcttat cgagtacctt 3420

ggtcggtatc ttgagttcct tttgcaagct aacccacaag atttctgtga tatatgttac 3480

acttcttgtg tgggtagaga gcattacagg tacaggttcg cttgtgtggc taacgatatg 3540

gaggatttga tcggacaatt gcaaaagaga ttgggttcta aggtgccacc aaagccatct 3600

tacaagaggg gcgcactcgc tttcgctttc tctggacaag gaactcaatt caggggaatg 3660

gctactgagc tggctaaggc ttactcaggt ttcagaaaga tcgtgtcaga tttggctaag 3720

agagcttctg agttgtctgg acatgctatc gataggttcc tcctcgctta cgatattggt 3780

gctgagaacg tggctccaga ttcagaggct gatcaaatct gtatcttcgt ttaccaatgt 3840

tctgttctta gatggttgca aactatggga atcaggccat cagctgttat cggacattca 3900

ctcggagaaa tatctgcttc agttgctgct ggagctttgt cacttgattc agctctcgat 3960

ctcgttatct ctagggctag actccttagg tcttctacta acgctcctgc tggaatggct 4020

gctatgtctg cttcacaaga tgaggtggtt gagttgatcg gaaagttgga tctcgataag 4080

gctaactcat tgtctgtgtc agttatcaac ggaccacaaa acactgttgt gtctggatct 4140

tcagctgcta tcgagtcaat cgtggctctt gctaagggta gaaagatcaa ggcttctgct 4200

cttaacatca accaggcctt ccattcacca tacgttgatt cagctgtgcc tggacttagg 4260

gcttggtcag agaagcatat ctcttcagct aggccactcc aaatcccatt gtactctact 4320

cttttgggtg ctcaagtgtc tgagggacaa atgttgaacc cagatcattg ggttgatcat 4380

gctagaaagc ctgtgcaatt cgctcaagct gctactatca tgaaggagtc attcactgga 4440

gttatcatcg acataggacc acaagtggtg gcttggtcac ttttgttgtc taacggattg 4500

acttcagtga ctgctttggc tgctaagagg ggtaggtcac aacaagtggc tttcctctca 4560

gctctcgctg atttgtacca agattacgga gtggtgccag atttcgttgg attgtacgct 4620

caacaagagg atgcatcacg gcttaagaaa actgacattc ttacttaccc attccaaagg 4680

gttagacggt atccatcatt catcccatca agaagggctc caactcatgc tcatgtgcaa 4740

gatgaggaga ctttgtcttc aggttcttca actccaactc ttgagaacac tgatttggat 4800

tcaggtaagg agtcacttat gggacctact aggggtctgc ttagagttga tgatcttaga 4860

gattcaatcg tgtcttcagt taaggatgtt ttggagttga agtctaacga ggatcttgat 4920

ttgtcagagt cacttaacgc tttgggtatg gattctatca tgttcgctca attgagaaag 4980

agaatcggtg agggtcttgg attgtcagtg cctatggttt tcctttctga tgctttctca 5040

atcggagaga tggtgtctaa cctcgttgag caagctgagg cttcagagga taactaa 5097

<210> 4

<211> 921

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atggctccta tctcatctac ttggtctagg cttatcagat tcgtggctgt tgagacttca 60

ctcgtgcata tcggtgagcc aatcgatgct actatggatg tgggactcgc tagaagagag 120

ggtaagacta tccaggccta cgagatcatc ggttcaggtt cagctcttga tttgtctgct 180

caagtgtcta agaacgtttt gactgttagg gaacttctta tgccattgtc tagggaggag 240

atcaagactg ttaggtgttt gggtcttaac tacccagtac acgctactga ggctaacgtt 300

gctgtgccta agttcccaaa ccttttctac aagccagtga cttcactcat cggaccaggt 360

ggattgatca ctatcccttc agttgtgcaa ccaccaaagg agcatcaatc tgattacgag 420

gctgaattgg tgatcgttat cggaaaggct gctaagaacg tgtcagagga tgaggctctc 480

gattacgttt tgggatacac tgctgctaac gacatatctt tcaggaagca tcaactcgct 540

gtgtcacaat ggtcattctc aaagggtttc gatggtacta acccattggg tccatgtctt 600

gtgtcagctt cttctatccc tgatccacaa gatattccta tccaatgtaa gttgaacggt 660

ggagttgtgc aaaacggaaa cactagagat caaatcttca acgtgaagaa aactatctca 720

ttcctctcac aaggtactac gctcgaacct ggttcaatca tcctcactgg tactccagat 780

ggagtgggat tcgttagaaa cccacctctt taccttaagg atggtgatga ggttatgact 840

tggatcggtt ctggaatcgg aactttggct aacactgtta gagaggagca aacttgtttc 900

gcttctggtg gacatgagta a 921

<210> 5

<211> 1269

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atggcttcat tcgagaactc attgtcagtt cttatcgttg gtgctggact aggtggactc 60

gctgctgcta tcgctcttag aaggcaagga catgttgtta agatttacga ttcatcttca 120

ttcaaggctg agttgggagc tggacttgct gtgccaccaa acactcttag gtcactccaa 180

caattgggat gtaacactga gaaccttaac ggtgttgata acctttgttt cactgctatg 240

ggttacgatg gttctgtggg tatgatgaac aacatgactg attacaggga ggcttacggt 300

acttcttgga tcatggtgca tagagtggat ttgcataacg agcttatgag agtggctctc 360

gatcctggag gcttgggacc accagctact ttgcatttga accatagggt gactttctgt 420

gatgttgatg cttgtactgt gactttcact aacggtacta ctcaatctgc tgatcttatc 480

gtgggagctg atggaatcag gtctactatc agaagattcg tactggagga ggatgtgact 540

gttccagctt ctggaatcgt gggtttcagg tggctcgtgc aagctgatgc tctcgatcca 600

tacccagagt tggattggat cgttaagaag cctccactcg gagctagact tatctcaact 660

ccacaaaacc cacaatctgg tgttggactt gctgatagaa gaactatcat catctacgct 720

tgtaggggag gtactatggt taacgttttg gctgtgcatg atgatgagag ggatcaaaac 780

actgctgatt ggtcagtgcc agcttctaag gatgatttgt tcagagtttt ccatgattac 840

catcctagat tccgcaggct ccttgaatta gctcaagaca ttaacctctg gcaaatgaga 900

gttgtgccag tgttgaagaa gtgggtgaac aagagggtgt gtcttttggg agatgctgct 960

catgcttcat tgcctacttt gggacaaggt ttcggaatgg gtcttgaaga tgctgtggct 1020

ctcggaactc tcctcccaaa gggaactact gcttcacaaa tcgagactag gctcgctgtt 1080

tacgagcaac ttagaaagga tagggctgag ttcgtggctg ctgagtcata cgaggagcaa 1140

tacgtgccag agatgagggg tttgtacctc aggtctaagg agcttagaga tagagttatg 1200

ggttacgaca taaaggttga gtcagagaag gttcttgaga ctctccttag gtcatctaac 1260

tcagcttga 1269

<210> 6

<211> 1041

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atggtgcaag atacttcatc tgcttcaact tcaccaatct tgactagatg gtacatcgat 60

actaggccat tgactgcttc tactgctgct ttgcctctcc ttgagacttt gcaaccagct 120

gatcaaatct ctgtgcaaaa gtactaccat ttgaaggata agcacatgtc actcgcttct 180

aacctcctta agtacctttt cgtgcataga aactgtagaa tcccttggtc atctatcgtt 240

atctctagga ctcctgatcc acatagaagg ccatgttaca tcccaccttc tggatcacaa 300

gaggattcat tcaaggatgg ttacactgga atcaacgttg agttcaacgt gtcacatcaa 360

gcctctatgg ttgctatcgc tggaactgct ttcactccaa actcaggagg tgattctaag 420

ttgaagcctg aggtgggtat cgatataact tgtgtgaacg agagacaagg tagaaacgga 480

gaggagaggt cattggagtc tcttaggcaa tacatcgaca ttttctcaga ggttttctca 540

actgctgaga tggctaacat ccgtagactc gatggagtgt cttcttcatc attgtcagct 600

gatagactcg ttgattacgg ttacagattg ttctacactt actgggctct taaggaggct 660

tacatcaaga tgactggaga ggctctcctc gctccgtggc tcagggagct ggagttctca 720

aacgttgtgg ctccagctgc tgtggctgag tctggtgatt cagctggtga tttcggtgag 780

ccatacactg gagttaggac tactttgtac aagaacctcg ttgaggatgt tagaatcgag 840

gttgctgctt tgggtggtga ttaccttttc gctactgctg ctaggggtgg tggaatcgga 900

gcttcatcta ggccaggtgg tggaccagat ggatcaggta tcaggtcaca agatccttgg 960

agaccattca agaagctcga tattgagagg gatatacaac catgtgctac tggtgtttgt 1020

aactgtttgt ctaggggatg a 1041

<210> 7

<211> 804

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atgagaatca acatctcact ctcttctctt ttcgagagat tgtcaaagtt gtcatctagg 60

tcaatcgcta tcacttgtgg tgtggttttg gcttctgcta tcgctttccc aatcatcaga 120

agggattacc agactttctt agaagttgga ccttcttacg ctccacagaa cttcaggggt 180

tacatcatcg tgtgtgtttt gtcattgttc agacaggagc agaagggttt agctatctac 240

gatagattgc ctgagaagag aagatggctt gctgatttgc cattcaggga gggtactagg 300

ccttcaatca cttcacatat catccagaga cagagaactc agctcgtgga tcaggagttc 360

gctactaggg agcttatcga taaggttatc cctagagtgc aggctaggca tactgataag 420

actttcttgt ctacttcaaa gttcgagttc catgctaagg ctatcttcct cctcccttca 480

atcccaatca acgatcctct taacatccca tctcatgata ctgttagaag gactaagagg 540

gagatcgctc acatgcatga ttaccatgat tgtactctcc atttggctct tgctgctcag 600

gatggtaagg aggtgcttaa gaagggatgg ggacagaggc atccactcgc tggacctggt 660

gtgcctggac caccaactga gtggactttc ctttacgctc ctaggaacga ggaggaggct 720

agagtggttg agatgatcgt tgaggcttct atcggataca tgactaacga tccagctgga 780

aagatcgttg agaacgctaa gtaa 804

Claims

1.油菜BnC3H基因在提高植物生物自发光强度中的应用，其特征在于，所述BnC3H基因的CDS序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述BnC3H基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：

(1)利用多基因组装技术将Hisps基因、CPH基因、H3H基因、NPGA基因、Luz基因和所述BnC3H基因整合到受体载体中，构建获得多基因载体；

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：步骤(1)中，所述Hisps基因的编码序列如SEQID NO.3所示，所述CPH基因的编码序列如SEQ ID NO.4所示，所述H3H基因的编码序列如SEQID NO.5所示，所述NPGA基因的编码序列如SEQ ID NO.6所示，所述Luz基因的编码序列如SEQ ID NO.7所示。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于：步骤(1)中，所述多基因载体中各目的基因的上游均含有35S启动子序列。

6.如权利要求3所述的应用，其特征在于：步骤(1)中，采用TransGene Stacking II系统进行多基因组装。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于：步骤(1)中，所述多基因载体的构建方法包括以下步骤：

2)将供体载体pYL322d1-Hisps和受体载体pYLTAC380GW按1:1至2:1混合，共转入大肠杆菌NS3529感受态细胞中，涂布于含卡那霉素和氯霉素的双抗培养基中培养，取阳性菌株提取质粒；

3)使用归巢酶I-Sce I对步骤2)提取的质粒进行酶切，再转化大肠杆菌菌株XL10或NEB10-β，培养，筛选，提取质粒，获得含有目的基因Hisps的阳性克隆pYLTAC380GW-Hisps；

4) 将供体载体pYL322d2-CPH和步骤3)制备的受体载体pYLTAC380GW-Hisps按1:1至2:1混合，共转入大肠杆菌NS3529感受态细胞中，涂布于含卡那霉素和氨苄霉素的双抗培养基中培养，取阳性菌株提取质粒；

5) 使用归巢酶PI-Sce I对步骤4)提取的质粒进行酶切，再转化大肠杆菌菌株XL10或NEB10-β，培养，筛选，提取质粒，获得含目的基因Hisps和CPH的阳性克隆pYLTAC380GW-Hisps-CPH；

6) 重复步骤2)-5)，以上一步骤获得的含有目的基因的新质粒作为受体载体，交叉使用含不同基因的供体载体进行重组，直至所有目的基因组装到受体载体上，最后一步BP重组反应连入去除筛选标记基因表达盒元件，构建得到多基因载体pYLTAC380 GW-Hisps-CPH-H3H-NPGA-Luz-BnC3H。

8.如权利要求3所述的应用，其特征在于：步骤(2)中，采用农杆菌介导技术将多基因片段导入受体植株。

9.如权利要求3所述的应用，其特征在于：步骤(2)中，所述受体植株为蝴蝶兰、烟草、油菜或水稻。