CN1678746A - 类黄酮3’,5’羟化酶基因序列及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明总体上涉及编码具有类黄酮F3′，5′H－羟化酶(F3′5′H)活性的多肽的遗传序列，并且，特别涉及将所述遗传序列和/或它的相应多肽序列用于操纵花或它的其他部分或其他植物组织颜色的用途。更具体地讲，所述F3′5′H具有调控二氢堪非醇(DHK)代谢以及诸如二氢五羟黄酮(DHQ)，柑桔黄素和圣草酚的其他底物代谢的能力。更具体地讲，本发明提供了编码当在蔷薇或大丁草或植物学上相关的植物中表达时具有F3′5′H活性的多肽的遗传序列。本发明还涉及相当于所述主题遗传序列或它的转录物的全部或一部分的反义和有义分子或RNAi－诱导分子。本发明还涉及能够在诸如蔷薇，大丁草或植物学上相关的植物中有效工作的启动子。

Description

类黄酮3′，5′羟化酶基因序列及其用途

发明背景

发明领域

本发明总体上涉及编码具有类黄酮F3′，5′H-羟化酶(F3′5′H)活性的多肽的遗传序列，以及将所述遗传序列和/或它的相应的多肽序列用于操纵花或花的部分或其他植物组织的颜色的用途。更具体地讲，F 3′5′H具有调控二氢堪非醇(DHK)代谢以及诸如二氢栎皮酮(DHQ)，柑桔黄素和圣草酚的其他物质代谢的能力。更具体地讲，本发明提供了编码当在蔷薇或大丁草或植物学上相关的植物中表达时具有F3′5′H活性的多肽的遗传序列。本发明还涉及相当于所述主题遗传序列或它的转录物的全部或部分的反义和有义分子或RNAi-诱导分子，并且涉及遗传学修饰过的植物以及切花，来自所述植物的部分和繁殖组织。本发明还涉及能够在诸如蔷薇，大丁草或植物学上相关的植物中有效工作的启动子。

现有技术的说明

对本说明书中任何现有技术的引用都不是，并且，不应当被理解成或以任何形式暗示该现有技术构成了任何国家的一般公知技术的部分。

在本说明书的结尾部分列举了在本说明书中提供的参考文献的文献细节。

花卉或观赏植物行业致力于开发新的不同品种的花和/或植物。创造这种新品种的一种有效途径是通过操纵花的颜色。传统的育种技术，业已被用于生产当今可以获得的几乎所有商业化花和/或植物品种的多种颜色，并且取得了某些成功。不过，这种方法受到了特定物种基因库的约束的限制，并且由于这种原因，很少有可能一个物种具有所有颜色品种。例如，植物或诸如花，叶和茎的植物部分的新颜色品种的育成，在切花和观赏市场上提供了重大机遇。在花卉或观赏植物行业中，诸如蔷薇，菊花，郁金香，百合，康乃馨，大丁草，兰花，lisianthus，秋海棠属，蝴蝶草，老鹳草，矮牵牛，赛亚麻，天竺葵属，鸢尾属，凤仙花和仙客来的主要花卉物种的新花色品种的育成，具有重大的价值。更具体的例子是用于切花市场的蓝玫瑰或大丁草的培育。

另外，诸如营养体，果实和种子的植物部分的新颜色品种的培育，将会在农业上提供重要的机会。例如，新颜色的种子可以用作植物的专有标记。此外，对浆果或包括葡萄和苹果在内的果实所共有的类黄酮的修饰，以及包括酒在内的它们的汁液的修饰，具有赋予所述果实和副产品行业以改变了的特有价值风格的潜力。

花的颜色主要是由三种类型的色素决定的：类黄酮，类葫萝卜素和betalains。在这三种色素中，类黄酮是最常见的，并且产生了从黄色到红色到蓝色的多种颜色。对花的颜色作出主要贡献的类黄酮分子是花色素苷(它是花青素的糖基化衍生物)，以及它的甲基化衍生物甲基花青素，翠雀素或翠雀素-型分子和它的甲基化衍生物矮牵牛苷配基和花葵素和花葵素。花色素苷定位于花瓣的表皮细胞的液泡中或叶片的亚表皮细胞的液泡中。

类黄酮色素是phenylpropanoid途径的次级代谢产物。如图1A和B所示，业已完善了类黄酮色素生物合成途径(类黄酮途径)(Holton和Cornish，Plant Cell 7：1071-1083，1995；Mol等，Tr末端PlantSci.3：212-217，I998；Winkel-Shirley，Plant Physiol.126：485-493，2001a；和Winkel-Shirley，Plant Physicol，127：1399-1404，2001b)。有三种反应和酶与苯丙氨酸向对香豆酰-CoA(它是类黄酮途径中的最关键的底物之一)的转化相关。所述酶是苯丙氨酸氨裂解酶(PAL)，肉桂酸4-羟化酶(C4H)和4-香豆酸：CoA连接酶(4CL)。该途径的第一个关键步骤涉及三个丙二酰-CoA分子(通过乙酰CoA羧化酶(ACC)对乙酰CoA和CO₂的作用提供)与一个对香豆酰-CoA分子的缩合。该反应是通过查耳酮合成酶(CHS)催化的。该反应的产物2′，4，4′，6′，四羟基-查耳酮，在正常情况下能够被查耳酮黄烷酮异构酶(CHI)快速异构化，以便产生柑桔黄素，随后柑桔黄素的中央环上的3’位置被黄烷酮3-羟化酶(F3H)羟基化，产生二氢堪非醇(DHK)。

二氢堪非醇(DHK)B-环的羟基化形式，在决定花瓣颜色方面发挥关键作用。所述B-环可以在3′位置，或同时在3′和5′位置上羟基化，分别产生二氢五羟黄酮(DHQ)或二氢杨梅酮(DHM)。与该途径的这一部分相关的两种关键的酶是类黄酮3′-羟化酶和类黄酮3′，5′-羟化酶，二者均是细胞色素P450类的酶。细胞色素P450酶广泛分布在自然界中，并且业已从脊椎动物，昆虫，酵母，真菌，细菌和植物中分离了它的基因并且进行了测序。

类黄酮3′-羟化酶(F3′H)是产生花青素-型色素的类黄酮途径中的关键酶，它在很多植物物种(例如，蔷薇，石竹，矮牵牛，秋海棠属，樱草属，凤仙花属，牵牛花和菊花)中产生了红色和粉红色的花色。

类黄酮3′，5′-羟化酶(F3′5′H)是导致产生翠雀素-型色素的类黄酮途径中的关键酶，在很多植物物种(例如，矮牵牛，堇菜，Lisianthus spp.，龙胆，裸柱菊(Sollya spp.)，鼠尾草，蝶豆，Kennedia spp.，风铃草，薰衣草，马鞭草，蝴蝶草，翠雀属，茄属植物，瓜叶菊植物，葡萄，条叶狒狒花(Babiana stricta)，松树，云杉，落叶松，菜豆，越橘，仙客来，鸢尾，天竺葵，Liparieae，老鹳草，豌豆，山黧豆，长春花，锦葵(Malvia spp.)，黧豆，野豌豆，非洲紫罗兰，紫薇，bouchina spp.，白花丹，Hypocalypius spp.，杜鹃花，亚麻，大翼豆，木槿，绣球花属(Cymbidium spp.)，崖豆藤，岩黄芪，胡枝子，天门冬属，珊瑚藤，豌豆(Piusm)spp.，小苍兰，夏枯草(Brunella)，克拉花等)中产生紫色和蓝色花色。诸如蔷薇，大丁草，菊花和康乃馨的很多植物物种都不能产生翠雀素-型色素，因为它们缺乏P3′5′H活性。

所述途径的下一个步骤，导致了由二氢黄酮醇(DHK，DHQ，DHM)产生有色的花色素苷，该步骤中包括导致无色花色苷产生的二氢黄酮醇-4-还原酶(DFR)。所述无色花色苷随后被转化成花色素，花葵素，花青素和翠雀素或翠雀素-型分子。这种类黄酮分子在正常生理学条件下是不稳定的，并且通过糖基转移酶的作用而在3-位置上的糖基化使这种花色素分子稳定化，从而能够积累所述花色素苷。一般而言，糖基转移酶能将糖部分从UDP糖转移到类黄酮分子上，并且表现出对糖基化位置的高度专一性，和对受体底物的较低的专一性(Seitz和Hinderer，花色素苷。参见：Cell Culture and Somatic Cell Geneticsof Plants.Constabel，F.和Vasil，I.K.(eds.)，Academic Press，New York，USA，5：49-76，1988)。花色素苷能够以与葡萄糖，半乳糖，鼠李糖，阿拉伯糖和木糖相结合的3-一糖苷，3-二糖苷和3-三糖苷以及3，5-二糖苷和3，7-二糖苷形式存在(Strack和Wray，参见：The Flavonoids-Advances in Research since 1986.Harborne，J.B.(ed)，Chapman和Hall，London，UK，1-22，1993)。

与花色素分子稳定化相关的糖基转移酶包括UDP葡萄糖：类黄酮3-葡萄糖基转移酶(3GT)，它能将葡萄糖部分从UDP葡萄糖转移到花色素分子的3-O-位置，产生花色素3-O-葡糖苷。

在矮牵牛和三色堇(以及其它)中，花色素3-O-葡糖苷通常是通过另一种糖基转移酶，即UDP鼠李糖：花色素3-葡糖苷鼠李糖转移酶(3RT)糖基化的，它能将鼠李糖基添加到花色素苷分子的3-O-结合的葡萄糖上，产生花色素3-芸香糖苷，并且，一旦酰化，就可以被UDP：葡萄糖花色素苷5葡萄糖基转移酶(5GT)进一步修饰。不过，在蔷薇(以及其它)中，花色素3-O-葡糖苷一般是由另一种糖基转移酶，即UDP：葡萄糖花色素苷5葡萄糖基转移酶(5GT)糖基化的，产生花色素3，5二葡糖苷。

很多花色素糖苷以酰化衍生物的形式存在。修饰花色素糖苷的酰基根据它们的结构可以分成两种主要类型。脂族酰基包括丙二酸或琥珀酸，而芳族类型包括羟基肉桂酸，如对香豆酸，咖啡酸和阿魏酸，以及诸如对羟基苯甲酸之类的苯甲酸类。

还可以在花色素糖苷的B-环的3′和5′位置上发生甲基化。花青素-型色素的甲基化导致了甲基花青素的产生。翠雀素-型色素的3′位置的甲基化导致了矮牵牛苷配基的产生，而3′和5′位置的甲基化导致了花葵素的产生。花葵素的甲基化还可发生在5-O和7-O位置上，产生capensinin(5-O-甲基花葵素)和5，7-二-O-甲基花葵素。

除了上述修饰之外，存在色素的液泡或区室的pH以及与诸如黄酮醇和黄酮的其他类黄酮的共同着色可以影响花瓣颜色。黄酮醇和黄酮还可以是芳族酰化的(Brouillard和Dangles，参见：TheFlavonoids-Advances in Research since 1986.Harborne，J.B.(ed)，Chapman和Hall，London，UK，1-22，1993)。

在开花植物中控制F 3′5′H活性或与类黄酮途径相关的其他酶的能力，提供了操纵诸如花瓣，果实，叶片，萼片，种子等的植物部分的颜色的方法。因此，可以产生一个栽培品种的不同颜色的形式，并且在某些场合下，一个物种能够产生较广泛的颜色。

业已克隆了编码矮牵牛F3′5′Hs的两种核苷酸序列(在本文中被称作SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3)(参见国际专利申请号PCT/AU92/00334和Holton等，Nature，366：276-279，1993a)。在矮牵牛(参见被收作本文参考的国际专利申请号PCT/AU92/00334和Holton等，1993a，同上)，烟草(参见被收作本文参考的国际专利申请号PCT/AU92/00334)和康乃馨(参见被收作本文参考的国际专利申请号PCT/AU96/00296)中，所述序列能有效调控类黄酮的3′，5′羟基化。不过，令人吃惊的是，在标准表达框中包括所述序列并不会导致通过RNA或Northern印迹分析可以检测到的完整的或全长的转录物的产生，因此，在蔷薇中并不产生3′，5′-羟基化的类黄酮。因此，有必要鉴定编码F3′5′Hs的其他遗传序列，它能够有效积累，并且随后能够在蔷薇和其他重要商业化植物物种中调节诸如花色素苷等的类黄酮的3′，5′羟基化。

发明概述

在本说明书中，除非上下文有其他需要，单词″包含″，或诸如″包括″的变化形式，被理解成包括指明的要素或整数或者要素或整数的组，不过，不排除任何其他的要素或整数或者要素或整数的组。

核苷酸和氨基酸序列是通过序列鉴别号(SEQ ID NO：)表示的。SEQ ID Nos：在数字上相当于序列标识符<400>1(SEQ ID NO：1)，<400>2(SEQ ID NO：2)等。

业已从多种植物物种中鉴定并且克隆了编码遗传序列F3′5′H的遗传序列。当所述F 3′5′H遗传序列在蔷薇花瓣组织中表达时，产生可以通过层析技术如薄层层析(TLC)或高效液相层析(HPLC)测定的可检测水平的翠雀素或翠雀素-型分子。作为替代或补充，所述遗传序列在蔷薇花瓣组织中的表达，产生了足够水平和长度的能够翻译成F3′5′H的转录物。它可以简便地以翠雀素或翠雀素-型分子利用诸如TLC或HPLC的层析技术检测到。本发明的遗传序列可以调控编码这种酶的基因的表达，例如，从头表达，超量表达，抑制，反义抑制，核酶活性，RNAi-诱导或甲基化-诱导。在植物中，更具体地讲，在蔷薇或大丁草中控制F3′5′H合成的能力，使得能够调控各花色素苷的组成，以及黄酮醇和花色素苷的相对含量的改变，从而能够操纵诸如花瓣，叶片，种子，萼片，果实等植物组织和/或器官的颜色。

因此，本发明的一个方面提供了分离的核酸分子，它包括编码或互补于编码类黄酮3′，5′羟化酶(F3′5′H)或具有F3′5′H活性的多肽的序列的核苷酸序列，其中，所述核酸分子在蔷薇花瓣组织中的表达产生了可以通过层析技术测定的可检测水平的翠雀素或翠雀素-型分子。

本发明的另一方面涉及分离的核酸分子，它包括编码或互补于编码F3′5′H或具有F3′5′H活性的多肽的序列的核苷酸序列，其中，所述核酸分子在蔷薇花瓣组织中的表达，产生了足够水平和长度的转录物，它被翻译成可以通过层析技术测定的可检测水平的翠雀素或翠雀素-型分子的F3′5′H。

因此，本发明的分离的核酸分子编码F3′5′H，按照蔷薇花瓣中翠雀素的生产测知，与由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3所示出的核苷酸序列编码的F3′5′H相比，该分子所编码的F3′5′H在蔷薇中能更有效地将DHK转化成DEM。

本发明所使用的效率，涉及在蔷薇细胞(在诸如大丁草的任何商业上重要的植物的细胞中)中F3′5′H酶将它的底物DHK或DHQ转化成DHM的能力。这种转化给所述植物提供了该植物中存在的类黄酮途径中的其他酶的底物(DHM)，以便进一步修饰所述底物。这种修饰可以包括，例如糖基化，酰化，鼠李糖化和/或甲基化，产生各种花色素苷，它们导致了各种颜色的产生。因此，这样能够调控蔷薇中的3′，5′-羟基化的花色素苷。效率可方便地通过选自下列一组的一种或多种参数评估：F3′5′H转录水平，它可通过所产生的完整F3′5′HmRNA的量确定(通过Northern印迹分析确定)；F3′5′HmRNA翻译程度，由所产生的翻译产物的量测定；F3′5′H酶活性水平，通过包括翠雀素或翠雀素-型色素在内的DHQ或DHM的花色素苷衍生物的产生测定(通过TLC或HPLC)；对花色影响的程度。

业已吃惊地确定了在康乃馨和矮牵牛中有功能的启动子和F3′5′H基因序列的某些组合，在蔷薇中是无功能性的。令人吃惊的是，只有特定类型的启动子和F3′5′H基因序列组合能在蔷薇花中产生3′，5′-羟基化的类黄酮。其中包括堇菜，鼠尾草，薰衣草和裸柱菊中分离的F3′5′H序列。另外，发现堇菜属F3′5′(或三色堇F3′5′H)序列，能导致3′，5′-羟基化的类黄酮在蔷薇中最高水平的积累。这种新的启动子和F3′5′H基因序列组合，可特别应用于调控植物或植物部分的颜色或香味或其他特征，所述植物部分例如、但不局限于花，果实，坚果，根，茎，叶或种子。因此，本发明是一种培育具有改变了的颜色特征的植物品种的新方法。其他用途包括，例如，生产F3′5′H转化植物的新的提取物，其中，所述提取物可用作例如芳香剂或食品添加剂或保健食品或饮料或果汁或着色剂。饮料可以包括，但不局限于酒类，酒精饮料，茶，咖啡，牛奶和乳制品。

因此，在优选实施方案中，本发明提供了分离的核酸分子，它包括编码或互补于编码三色堇F3′5′H，鼠尾草F3′5′H，薰衣草F3′5′H，kennedia F3′5′H或裸柱菊属F3′5′H或所述酶的功能性衍生物的序列的核苷酸序列。

编码三色堇F3′5′H(SEQ ID NOs：9和11)，鼠尾草F3′5′H(SEQID NOs：13和15)，裸柱菊属F3′5′H(SEQ ID NO：17)，薰衣草F3′5′H(SEQ ID NO：31)和kennedia F3′5′H(SEQ ID NO：26)的核苷酸序列，是由在括号中标明的序列标识符确定的。在表1中示出了序列标识符的概述。

因此，本发明的另一方面提供了包括基本上如SEQ ID NO：9(三色堇)或SEQ ID NO：11(三色堇)或SEQ ID NO：13(鼠尾草)或SEQ ID NO：15(鼠尾草)或SEQ ID NO：17(裸柱菊属)或SEQ ID NO：31(薰衣草)或SEQ ID NO：26(kennedia)所示出的核苷酸序列或互补的核苷酸序列，或与它具有至少大约50％的相似性，或能够在低严格条件下与SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：13或SEQ.ID NO：15或SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：26所示出的序列杂交的核酸分子。

在SEQ ID NO：10(三色堇)或SEQ ID NO：12(三色堇)或SEQID NO：14(鼠尾草)或SEQ ID NO：16(鼠尾草)或SEQ ID NO：18(裸柱菊属)或SEQ ID NO：32(薰衣草)或SEQ ID NO：27(kennedia)中示出了优选的F3′5′H酶的氨基酸序列。

本发明的另一方面提供了用于生产能够合成F3′5′H的转基因显花植物的方法，该方法包括用包括编码所述F3′5′H的核苷酸序列的核酸序列稳定地转化合适植物的细胞，转化是在能够最终表达所述核酸序列的条件下进行的，由所述细胞再生转基因植物，并且让所述转基因植物在足以进行所述核酸序列表达的条件下生长一定时间。所述核酸序列的表达，一般会导致编码F3′5′H的足够水平和长度的转录。这可以简便地通过用诸如TLC或HPLC的层析技术测定的可检测水平的翠雀素或翠雀素-型分子确定。因此，所述转基因植物能够产生非天然的F3′5′H，其含量相对相当的非转基因植物的表达量而言较高。这通常会导致所述植物或植物部分或优选所述植物的花序或花的肉眼可观察到的颜色改变。

本发明的另一方面涉及用于生产具有减弱了的F3′5′H活性的转基因植物的方法，该方法包括用包括编码或互补于编码F3′5′H活性的序列的核苷酸序列的核酸分子稳定转化合适植物的细胞，由所述细胞再生转基因植物，并且，在必要时，在足以表达所述核酸序列的条件下生长所述转基因植物。

本发明的另一方面涉及用于生产具有减弱了的F3′5′H活性的遗传修饰过的植物的方法，该方法包括通过与导入所述植物细胞的适当改变了的F3′5′H基因或它的衍生物或它的一部分同源重组，对内源序列进行修饰而改变F3′5′H基因，并且由所述细胞再生出遗传修饰过的植物。

本发明的另一方面涉及用于生产具有改变了的花或花序特征的转基因显花植物的方法，该方法包括用本发明的核酸序列稳定地转化合适植物的细胞，由所述细胞再生转基因植物，并且在足以进行所述核酸序列表达的条件下让所述转基因植物生长一定时间。

本发明的另一方面涉及用于生产具有改变了的花或花序特性的转基因显花植物的方法，该方法包括通过与导入所述植物细胞的适当改变了的F3′5′H基因或它的衍生物或它的一部分同源重组对核苷酸序列进行修饰而改变F3′5′H基因，并且由所述细胞再生遗传修饰过的植物。

本发明的另一方面涉及用于生产能够表达编码F3′5′H或它的一部分的重组基因或携带基本上互补于编码所述F3′5′H的mRNA分子的全部或一部分的核苷酸序列的转基因植物的方法，所述方法包括用包括编码或互补于编码F3′5′H的序列的核苷酸序列稳定地转化合适植物的细胞，其中，必要时在能够允许最终表达所述分离的核酸分子的条件下进行，并且由所述细胞再生转基因植物。

本发明的另一方面涉及包括本发明核酸序列的全部或部分，或它的反义形式和/或它的任何同系物或相关形式的转基因植物的全部或转基因植物的部分或所述转基因植物的后代，特别是具有改变了的花或花序特性的转基因植物。

本发明的另一方面涉及包括本发明核酸序列的全部或部分，或它的反义形式和/或它的任何同系物或相关形式的转基因植物的全部或转基因植物的部分或转基因植物的后代，特别是具有改变了的植物地上部分，如果实，浆果，萼片，苞叶，叶柄，花梗，子房，花药或茎秆特性的转基因植物。

本发明的另一方面涉及将来自包括本发明核酸序列的全部或部分的转基因植物的全部或转基因植物的植物部分或转基因植物的后代的提取物的用途，特别是来自所述转基因植物的提取物用作芳香剂或食品添加剂或保健品或饮料或果汁或着色剂的用途。

本发明的另一方面涉及重组形式的F3′5′H。

本发明的另一方面涉及将本文所披露的遗传序列用于生产能够表达F3′5′H或下调植物固有的F3′5′H酶的遗传构建体的用途。

本发明的另一方面涉及具有质粒形式的以染色体外形式编码F3′5′H的遗传序列的原核或真核生物。

本发明的另一方面涉及重组多肽，其中包含基本上如SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：16或SEQ IDNO：18或SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：27所示出的氨基酸序列或与SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：27具有至少大约50％相似性的氨基酸序列或所述多肽的衍生物。

本发明还提供了能够在诸如蔷薇，大丁草或植物学上相关的植物中有效工作的启动子。所述启动子包括蔷薇CHS启动子，菊花CHS启动子和CaMV 35S启动子。

在表1中提供了用于本说明书中的序列标识符的概述：

序列标识符的概述

SEQ ID NO：	名称	物种	序列类型	描述
					1	petHf1.nt	Petunia hybrida	核苷酸	F3′5′H cDNA
2	petHf1.aa	Petunia hybrida	氨基酸	F3′5′H cDNA的翻译
					3	petHf2.nt	Petunia hybrida	核苷酸	F3′5′H cDNA
4	petHf2.aa	Petunia hybrida	氨基酸	F3′5′H cDNA的翻译
					5	RoseCHS promoter	Rosa hybrida	核苷酸	启动子片段
6	D8 oligo#2	Petunia hybrida	核苷酸	寡核苷酸
					7	D8 oligo#4	Petunia hybrida	核苷酸	寡核苷酸
8	chrysanCHSATG	菊花	核苷酸	寡核苷酸
					9	BP#18.nt	堇菜(Viola spp.)	核苷酸	F3′5′H cDNA
10	BP#18.aa	堇菜(Viola spp.)	氨基酸	F3′5′H cDNA的翻译
					11	BP#40.nt	堇菜(Viola spp.)	核苷酸	F3′5′H cDNA
12	BP#40.aa	堇菜(Viola spp.)	氨基酸	F3′5′H cDNA的翻译
					13	Sal#2.nt	鼠尾草(Salviaspp.)	核苷酸	F3′5′H cDNA
14	Sal#2.aa	鼠尾草	氨基酸	F3′5′H cDNA的翻译
					15	Sal#47.nt	鼠尾草	核苷酸	F3′5′H cDNA
16	Sal#47.aa	鼠尾草	氨基酸	F3′5′H cDNA的翻译
					17	Soll#5.nt	Sollya spp.	核苷酸	F3′5′H cDNA
18	Soll#5.aa	Sollya spp.	氨基酸	F3′5′H cDNA的翻译
					19	FLS-Nco	蝶豆	核苷酸	寡核苷酸
20	BpeaHF2.nt	蝶豆	核苷酸	F3′5′H cDNA
					21	BpeaHF2.aa	蝶豆	氨基酸	F3′5′H cDNA的翻译
22	Gen#48.nt	三花龙胆	核苷酸	F3′5′H cDNA
					23	Gen#48.aa	三花龙胆	氨基酸	F3′5′H cDNA的翻译
24	PetD8 5′	Petunia hybrida	核苷酸	寡核苷酸
					25	Bpea primer	蝶豆	核苷酸	寡核苷酸
26	Kenn#31.nt	Kennedia spp.	核苷酸	F3′5′H cDNA
					27	Kenn#31.aa	Kennedia spp.	氨基酸	F3′5′H cDNA的翻译
28	chrysCHS.nt	菊花	核苷酸	CHS cDNA
					29	chrysCHS.aa	菊花	氨基酸	CHS cDNA的翻译
30	chrysCHS启动子	菊花	核苷酸	启动子片段
					31	LBG.nt	Lavandula nil	核苷酸	F3′5′H cDNA
32	LBG.aa	Lavandula nil	氨基酸	F3′5′H cDNA的翻译

附图的简要说明

图1A和1B是类黄酮色素生物合成途径的示意图。图1A表示花色素3-葡糖苷的一般生产过程，它出现在能产生花色素苷的大部分植物中。图1B表示出现在矮牵牛中的花色素苷的进一步修饰。参与所述途径的酶表示如下：PAL＝苯丙氨酸氨裂解酶；C4H＝肉桂酸4-羟化酶；4CL＝4-香豆酸：CoA连接酶；CHS＝查耳酮合成酶；CHI＝查耳酮黄烷酮异构酶；F3H＝黄烷酮3-羟化酶；DFR＝二氢黄酮醇-4-还原酶；ANS＝花色素合成酶，3GT＝UDP-葡萄糖：类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶；3RT＝UDP鼠李糖：花色素3-葡糖苷鼠李糖转移酶，AR-AT＝花色素-芸香糖苷酰基转移酶，5GT＝花色素苷5-葡萄糖基转移酶；3′OMT＝花色素苷3′O-甲基转移酶，3′5′OMT＝花色素苷3′，5′O-甲基转移酶。其他缩写形式包括：DHK＝二氢堪非醇，DHQ＝二氢栎皮酮，DHM＝二氢杨梅酮。

表2：在图2-52中使用的缩略语的说明

缩略语	说明
		Amp	赋予对抗生素氨苄青霉素的抗性的氨苄青霉素抗性基因
ColElori	质粒复制起点
		f1 ori(+)	f1丝状噬菌体复制起点
GcntR	赋予对抗生素氨苄庆大霉素的抗性的氨苄庆大霉素抗性基因
		LB III	T-DNA的左边界
npt	赋予对抗生素卡那霉素的抗性的新霉素磷酸转移酶III基因
		ori pRi	质粒复制起点
ori 322	质粒复制起点
		pACYC ori	来自大肠杆菌的pACYC 184的经修饰复制子
pVS1	来自铜绿假单胞菌的质粒的广谱宿主复制起点
		rev	序列分析中使用的M13反向引物位点的大致定位
RB	T-DNA的右侧边界

TetR	赋予对抗生素氨苄四环素的抗性的氨苄四环素抗性基因
		-20	序列分析中使用的M13-20引物位点的大致定位
RK2	广谱宿主范围的革兰氏阴性质粒RK2的起点

图2是含有来自矮牵牛栽培品种OGB的矮牵牛F3′5′H petHf1cDNA克隆的质粒pCGP602，pCGP601和pCGP176的示意图。将矮牵牛F3′5′H petHf1片段用于制备含有矮牵牛F3′5′H cDNA克隆的构建体。将³²P-标记过的1.6kb BspHI/FspI片段用于检测花瓣cDNA文库。对选定的限制性内切核酸酶位点进行标记。有关缩略语的说明参见表2和表4。

图3是含有来自矮牵牛栽培品种OGB的矮牵牛F3′5′H petHf2cDNA克隆的质粒pCGP175的示意图。对选定的限制性内切核酸酶位点进行标记。有关缩略语的说明参见表2和表4。

图4是含有来自pCGP601的矮牵牛F3′5′H petHf1 cDNA克隆的亚克隆的质粒pCGP1303的示意图。在实施例4中披露了pCGP1303的构建。对选定的限制性内切核酸酶位点进行标记。有关缩略语的说明参见表2和表4。

图5是二元质粒pCGP1452的示意图。将来自pCGP485的AmCHS5′：petHf1：petD83′基因沿与嵌合的SuRB基因串联的方向克隆到二元载体pWTT2132(DNAP)上。在实施例4中披露了pCGP1452的构建。对选定的限制性内切核酸酶位点进行标记。有关缩略语的说明参见表2和表4。

图6含有35S 5′：SuRB选择标记基因和多克隆位点的二元质粒pWTT2132(DNAP)的示意图。在实施例4中提供了对pWTT2132的说明。对选定的限制性内切核酸酶位点进行标记。有关缩略语的说明参见表2和表4。

图7是质粒pCGP725的示意图。将来自pCGP485的AmCHS5′-petHF1：petD8 3′基因克隆到pBluescript II(KS(+)载体上。在实施例4中披露了pCGP725的构建。对选定的限制性内切核酸酶位点进行标记。有关缩略语的说明参见表2和表4。

图8是二元质粒pCGP1453的示意图。将来自pCGP628的Mac：petHf1：mas 3′基因沿与嵌合的SuRB基因串联的方向克隆到二元载体pWTT2132(DNAP)上。在实施例4中披露了pCGP1453的构建。对选定的限制性内切核酸酶位点进行标记。有关缩略语的说明参见表2和表4。

图9是二元质粒pCGP1457的示意图。将来自pCGP1107的PetD85′：petHf1：petD83′基因沿与嵌合的SuRB基因串联的方向克隆到二元载体pWTT2132(DNAP)上。在实施例4中披露了pCGP1457的构建。对选定的限制性内切核酸酶位点进行标记。有关缩略语的说明参见表2和表4。

图10是二元质粒pCGP1461的示意图。将来自pCGP497的短的petFLS 5′：petHf1：petFLS3′基因沿与嵌合的SuRB基因串联的方向克隆到二元载体pWTT2132(DNAP)上。在实施例4中披露了pCGP1461的构建。对选定的限制性内切核酸酶位点进行标记。有关缩略语的说明参见表2和表4。

图11是二元质粒pCGP1616的示意图。将来自pCGP846的petRT5′：petHf1：nos 3′基因沿与嵌合的SuRB基因串联的方向克隆到二元载体pWTT2132(DNAP)上。在实施例4中披露了pCGP1616的构建。对选定的限制性内切核酸酶位点进行标记。有关缩略语的说明参见表2和表4。

图12是二元质粒pCGP1623的示意图。将来自pCGP1619的mas/35S：petHf1：ocs 3′基因沿与嵌合的SuRB基因串联的方向克隆到二元载体pWTT2132(DNAP)上。在实施例4中披露了pCGP1623的构建。对选定的限制性内切核酸酶位点进行标记。有关缩略语的说明参见表2和表4。

图13是二元质粒pCGP1638的示意图。将来自pCGP1636的CaMV35S：petHf1：nos 3′基因沿与嵌合的SuRB基因串联的方向克隆到二元载体pWTT2132(DNAP)上。在实施例4中披露了pCGP1636的构建。对选定的限制性内切核酸酶位点进行标记。有关缩略语的说明参见表2和表4。

图14是二元质粒pCGP1860的示意图。将来自pCGP200的蔷薇CHS 5′：petHf1：nos 3′基因沿与嵌合的SuRB基因串联的方向克隆到二元载体pWTT2132(DNAP)上。在实施例4中披露了pCGP1860的构建。对特定的限制性内切核酸酶位点进行标记。有关缩略语的说明参见表2和表4。

图15是二元质粒pCGP2123的示意图。将来自pCGP2109的CaMV35S：petHf2：ocs 3′基因沿与嵌合的SuRB基因串联的方向克隆到二元载体pCGP1988上。在实施例4中披露了pCGP2123的构建。对特定的限制性内切核酸酶位点进行标记。有关缩略语的说明参见表2和表4。

图16是二元质粒pCGP1988的示意图。用来自pNEB193(NewEngland Biolabs)的多克隆位点取代二元载体pWTT2132(DNAP)的多克隆位点。在实施例4中披露了pCGP1988的构建。对特定的限制性内切核酸酶位点进行标记。有关缩略语的说明参见表2和表4。

图17是质粒pCGP2105的示意图。在启动子和终止子片段之间具有多个限制性内切核酸酶位点的35S 5′：ocs 3′表达框位于pBluescript SK(+)载体主链上。在实施例4中披露了pCGP2105的构建。对特定的限制性内切核酸酶位点进行标记。有关缩略语的说明参见表2和表4。

图18是二元质粒pCGP1307的示意图。将来自pCGP 1106的petD85′：GUS：petD8 3′基因沿与嵌合的nptII选择标记基因串联的方向克隆到二元载体pCGN1548上。在实施例6中披露了pCGP1307的构建。对特定的限制性内切核酸酶位点进行标记。有关缩略语的说明参见表2和表4。

图19是二元质粒pCGP1506的示意图。将来自pCGP496的长的petFLS 5′：GUS：petFLS 3′基因沿与嵌合的nptII选择标记基因串联的方向克隆到二元载体pBIN19上。在实施例6中披露了pCGP1506的构建。有关缩略语的说明参见表2和表4。

图20是二元质粒pCGP1626的示意图。将来自pCGP1622的ChrysCHS 5′：GUS：nos 3′基因沿与嵌合的SuRB基因串联的方向克隆到二元载体pWTT2132上。在实施例6中披露了pCGP1626的构建。对特定的限制性内切核酸酶位点进行标记。有关缩略语的说明参见表2和表4。

图21是二元质粒pCGP1641的示意图。将来自pCGP1628的petRT5′：petRT3′基因沿与嵌合的SuRB基因串联的方向克隆到二元载体pWTT2132上。在实施例6中披露了pCGP1641的构建。对特定的限制性内切核酸酶位点进行标记。有关缩略语的说明参见表2和表4。

图22是二元质粒pCGP1861的示意图。将来自pCGP197的蔷薇CHS 5′：GUS：nos 3′基因沿与嵌合的SuRB基因串联的方向克隆到二元载体pWTT2132上。在实施例6中披露了pCGP1861的构建。有关缩略语的说明参见表2和表4。

图23是二元质粒pCGP1953的示意图。将来自pCGP1952的AmCHS 5′：GUS：petD8 3′基因沿与嵌合的SuRB基因串联的方向克隆到二元载体pWTT2132上。在实施例6中披露了pCGP1953的构建。有关缩略语的说明参见表2和表4。

图24是含有沿与嵌合的SuRB选择标记基因汇合的方向的35S5′：GUS：ocs 3′基因的二元质粒pWTT2084(DNAP)的示意图。在实施例6中提供了pWTT2084的说明。有关缩略语的说明参见表2和表4。

图25是在pBluescript SK II(+)主链上含有来自堇菜栽培品种Black Pansy的F3′5′H BP#18 cDNA克隆的质粒pCGP1959的示意图。在实施例7中提供了pCGP1959的说明。对特定的限制性内切核酸酶位点进行标记。有关缩略语的说明参见表2和表4。

图26是含有存在于pBluescript SK II(+)主链上的来自堇菜栽培品种Black Pansy的F3′5′H BP#40 cDNA克隆的质粒pCGP1961的示意图。在实施例7中提供了pCGP1961的说明。对特定的限制性内切核酸酶位点进行标记。有关缩略语的说明参见表2和表4。

图27是二元质粒pCGP1972的示意图。将来自pCGP1970的AmCHS5′：BP#18：petD8 3′基因沿与嵌合的SuRB基因串联的方向克隆到二元载体pWTT2132(DNAP)上。在实施例7中披露了pCGP1972的构建。对特定的限制性内切核酸酶位点进行标记。有关缩略语的说明参见表2和表4。

图28是二元质粒pCGP1973的示意图。将来自pCGP1971的AmCHS5′：BP#40：petD8 3′基因沿与嵌合的SuRB基因串联的方向克隆到二元载体pWTT2132(DNAP)上。在实施例7中披露了pCGP1973的构建。对特定的限制性内切核酸酶位点进行标记。有关缩略语的说明参见表2和表4。

图29是二元质粒pCGP1967的示意图。将来自pCGP1965的CaMV35S：BP#18：ocs 3′基因沿与嵌合的SuRB基因串联的方向克隆到二元载体pWTT2132(DNAP)上。在实施例7中披露了pCGP1967的构建。对特定的限制性内切核酸酶位点进行标记。有关缩略语的说明参见表2和表4。

图30是二元质粒pCGP1969的示意图。将来自pCGP1966的CaMV35S：BP#40：ocs 3′基因沿与嵌合的SuRB基因串联的方向克隆到二元载体pWTT2132(DNAP)上。在实施例7中披露了pCGP1969的构建。对特定的限制性内切核酸酶位点进行标记。有关缩略语的说明参见表2和表4。

图31是在pBluescript SK II(+)主链上含有来自鼠尾草的F3′5′H Sal#2 cDNA克隆的质粒pCGP1995的示意图。在实施例7中提供了pCGP1995的说明。对特定的限制性内切核酸酶位点进行标记。有关缩略语的说明参见表2和表4。

图32是在pBluescript SK II(+)主链上含有来自鼠尾草的F3′5′H Sal#47 cDNA克隆的质粒pCGP1999的示意图。在实施例7中提供了pCGP1999的说明。对特定的限制性内切核酸酶位点进行标记。有关缩略语的说明参见表2和表4。

图33是二元质粒pCGP2121的示意图。将来自pCGP2116的AmCHS 5′：Sal#2：petD83′基因沿与嵌合的SuRB基因串联的方向克隆到二元载体pCGP1988上。在实施例7中披露了pCGP2121的构建。对特定的限制性内切核酸酶位点进行标记。有关缩略语的说明参见表2和表4。

图34是二元质粒pCGP2122的示意图。将来自pCGP2117的AmCHS5′：Sal#47：petD8 3′基因沿与嵌合的SuRB基因串联的方向克隆到二元载体pCGP1988上。在实施例7中披露了pCGP2122的构建。对特定的限制性内切核酸酶位点进行标记。有关缩略语的说明参见表2和表4。

图35是二元质粒pCGP2120的示意图。将来自pCGP2112的CaMV35S：Sal#2：ocs3′基因沿与嵌合的SuRB基因串联的方向克隆到二元载体pCGP1988上。在实施例7中披露了pCGP2120的构建。对特定的限制性内切核酸酶位点进行标记。有关缩略语的说明参见表2和表4。

图36是二元质粒pCGP2119的示意图。将来自pCGP2111的CaMV35S：Sal#47：ocs 3′基因沿与嵌合的SuRB基因串联的方向克隆到二元载体pCGP 1988上。在实施例7中披露了pCGP2119的构建。对特定的限制性内切核酸酶位点进行标记。有关缩略语的说明参见表2和表4。

图37是在pBluescript SK II(+)主链上含有来自裸柱菊的F3′5′H Soll#5 cDNA克隆的质粒pCGP2110的示意图。在实施例7中提供了pCGP2110的说明。对特定的限制性内切核酸酶位点进行标记。有关缩略语的说明参见表2和表4。

图38是二元质粒pCGP2130的示意图。将来自pCGP2128的AmCHS5′：Soll#5：petD8 3′基因沿与嵌合的SuRB基因串联的方向克隆到二元载体pCGP1988上。在实施例7中披露了pCGP2130的构建。有关缩略语的说明参见表2和表4。

图39是二元质粒pCGP2131的示意图。将来自pCGP2129的CaMV35S：Soll#5：ocs3′基因沿与嵌合的SuRB基因串联的方向克隆到二元载体pCGP1988上。在实施例7中披露了pCGP2131的构建。有关缩略语的说明参见表2和表4。

图40是在pBluescript SK II(+)主链上含有来自Kennedia spp.的F3′5′H Kenn#31cDNA克隆的质粒pCGP2231的示意图。在实施例7中提供了pCGP2231的说明。对特定的限制性内切核酸酶位点进行标记。有关缩略语的说明参见表2和表4。

图41是二元质粒pCGP2256的示意图。将来自pCGP2242的AmCHS5′：Kenn#31：petD8 3′基因沿与嵌合的SuRB基因串联的方向克隆到二元载体pCGP1988上。在实施例7中披露了pCGP2256的构建。有关缩略语的说明参见表2和表4。

图42是二元质粒pCGP2252的示意图。将来自pCGP2236的CaMV35S：Kenn#31：ocs 3′基因沿与嵌合的SuRB基因串联的方向克隆到二元载体pCGP1988上。在实施例7中披露了pCGP2252的构建。有关缩略语的说明参见表2和表4。

图43是在pBluescript SK II(+)主链上含有来自蝶豆的全长的F3′5′H BpeaHF2 cDNA克隆的质粒pBHF2F的示意图。在实施例7中提供了对pBHF2F的说明。对特定的限制性内切核酸酶位点进行标记。有关缩略语的说明参见表2和表4。

图44是二元质粒pCGP2135的示意图。将来自pCGP2133的AmCHS 5′：BpeaHF2：petD8 3′基因沿与嵌合的SuRB基因串联的方向克隆到二元载体pCGP1988上。在实施例7中披露了pCGP2135的构建。对特定的限制性内切核酸酶位点进行标记。有关缩略语的说明参见表2和表4。

图45是二元质粒pBEBF5的示意图。通过用来自pBHF2F的蝶豆F3′5′H BpeaHF2 cDNA克隆取代来自pBE2113-GUSs的GUS片段构建eCaMV 35S：BpeaHF2：nos 3′基因。在实施例7中披露了pBEBF5的构建。有关缩略语的说明参见表2和表4。

图46是二元质粒pCGP2134的示意图。将来自pCGP2132的CaMV35S：BpeaHF2：ocs 3′基因沿与嵌合的SuRB基因串联的方向克隆到二元载体pCGP1988上。在实施例7中披露了pCGP2134的构建。有关缩略语的说明参见表2和表4。

图47是在pBluescript SK II(+)主链上含有来自三花龙胆的F3′5′HGen#48cDNA克隆的质粒pG48的示意图。在实施例7中提供了pG48的说明。对特定的限制性内切核酸酶位点进行标记。有关缩略语的说明参见表2和表4。

图48是二元质粒pCGP1498的示意图。将来自pCGP1496的AmCHS 5′：Gen#48：petD8 3′基因沿与嵌合的SuRB基因串联的方向克隆到二元载体pCGP1988上。在实施例7中披露了pCGP1498的构建。对特定的限制性内切核酸酶位点进行标记。有关缩略语的说明参见表2和表4。

图49是二元质粒pBEGHF48的示意图。通过用来自pG48的龙胆属F3′5′H Gen#48 cDNA克隆取代来自pBE2113-GUSs的GUS片段构建eCaMV 35S：Gen#48：nos 3′基因。在实施例7中披露了pBEGHF48的构建。对特定的限制性内切核酸酶位点进行标记。有关缩略语的说明参见表2和表4。

图50是二元质粒pCGP1982的示意图。将来自pCGP1981的CaMV35S：Gen#48：ocs 3′基因沿与嵌合的SuRB基因串联的方向克隆到二元载体pWTT2132(DNAP)上。在实施例7中披露了pCGP1982的构建。有关缩略语的说明参见表2和表4。

图51是在pBluescript SK II(+)主链上含有来自Lavandula nil的F3′5′H LBG cDNA克隆的质粒pLFH8的示意图。在实施例7中提供了pLFH8的说明。对特定的限制性内切核酸酶位点进行标记。有关缩略语的说明参见表2和表4。

图52是二元质粒pBELF8的示意图。通过用来自pLHF8的薰衣草属F3′5′H LBG CDNA克隆取代来自pBE2113GUSs的GUS片段构建eCaMV 35S：LBG：nos 3′基因。在实施例7中披露了pBELF8的构建。有关缩略语的说明参见表2和表4。

优选实施方案的详细说明

根据本发明，业已鉴定、克隆并且评估了编码具有F3′5′H活性的多肽的遗传序列。本发明的重组遗传序列能够调控编码这种酶的基因的表达，例如，通过从头表达，过量表达，有义抑制，反义抑制，核酶，minizyme和DNA酶活性，RNAi-诱导或甲基化-诱导或者其他转录或转录后沉默活性来实现。RNAi-诱导包括遗传学分子，如发卡，短的双链DNA或RNA，以及具有一个或两个单链核苷酸突出部分的部分双链DNAs或RNAs。控制F3′5′H在植物中合成的能力，使得能够调控各花色素苷的组成，以及改变黄酮醇和花色素苷的相对含量，从而能够操纵花瓣颜色。另外，本发明涉及植物，以及植物的繁殖部分或营养部分，包括花，果实，种子，营养体，叶片，和茎秆等。本发明还涉及观赏性转基因或遗传修饰过的植物，术语“转基因”还包括植物后代和来自随后的遗传学和/或它与原始转基因植物杂交的植物。

因此，本发明的一个方面提供了分离的核酸分子，它包括编码或互补于编码F3′5′H或具有F3′5′H活性的多肽的序列的核苷酸序列，其中，所述核酸分子在蔷薇花瓣组织中的表达产生了通过层析技术测定的可检测水平的翠雀素或翠雀素-型分子。

本发明的另一方面涉及分离的核酸分子，它包括编码或互补于编码F3′5′H或具有F3′5′H活性的多肽的序列的核苷酸序列，其中，所述核酸分子在蔷薇花瓣组织中的表达产生了被翻译成所述F3′5′H的足够水平和长度的转录物，这种翻译可通过层析技术测定的可检测水平的翠雀素或翠雀素-型分子确定。

本发明的另一方面涉及分离的核酸分子，它包括编码或互补于编码F3′5′H或具有F3′5′H活性的多肽的序列的核苷酸序列，其中，所述核酸分子在蔷薇花瓣组织中的表达产生了全长的转录物，这种转录物可以通过对从蔷薇花瓣中分离的总RNA进行Northern印迹分析检测到。

下面参考编码作用于DHK和DHQ的F3′5′H的遗传序列的鉴定，克隆和操作，对本发明进行说明和解释。F3′5′H酶优选是三色堇；鼠尾草，裸柱菊属，薰衣草或kennedia F3′5′H。所述F3′5′H酶还可以被视为具有F3′5′H活性或F3′5′H样活性的多肽或蛋白。后者包括具有改变了的F3′5′H活性的衍生物。

因此，本发明的优选方面涉及分离的核酸分子，它包括编码或互补于编码F3′5′H或它的功能性变体，衍生物，部分，片段，同系物或类似物的序列的核苷酸序列，其中，所述核酸分子具有以下特征：

(i)在蔷薇花瓣组织中的F3′5′H转录物具有足以编码F3′5′H的含量和长度，在蔷薇花瓣组织中产生了通过层析方法(例如TLC或HPLC)测定可检测的翠雀素或翠雀素-型分子；

(ii)蔷薇花瓣组织中的F3′5′H转录物是全长的，并且可以通过对从蔷薇花瓣组织中分离的总RNA进行Northern印迹分析检测；

(iii)蔷薇花瓣组织中的F3′5′H产生了通过(例如TLC或HPLC)测定可检测的翠雀素或翠雀素-型分子；和/或

(iv)F3′5′H导致了蔷薇花瓣组织的可见的颜色改变。

术语翠雀素-型色素包括花色素，翠雀素或它的任何衍生物，包括、但不局限于糖基化的，酰化的，甲基化的或其他修饰形式。翠雀素的甲基化形式包括，但不局限于花色素矮牵牛苷配基(在3′-位置上甲基化)，花葵素(在3′和5′位置上甲基化)，5-O甲基花葵素(在5，3′和5′位置上甲基化)，5，7-O二甲基花葵素(在5，7，3′和5′位置上甲基化)。甲基化的花色素还可以通过糖基化和酰化修饰。术语花色素苷表示相应的花色素的糖基化形式。

术语“核酸分子”表示处在非天然存在状态下的遗传序列。一般地，它表示是从它的天然状态分离的或合成的或在非天然存在的环境下衍生的。更具体地讲，它包括在体外形成或保持的核酸分子，包括基因组DNA片段重组体或合成分子以及与异源核酸组合的核酸。它还涉及相对于其自身启动子或另一启动子而言处于相反方向的编码F3′5′H或其部分的基因组DNA或cDNA或它的一部分。它还涉及相对其他核酸序列而言至少部分纯化的天然存在的序列。

本文所使用的术语″遗传序列″具有它的最普通的含义，并且包括任何连续系列的核苷酸碱基，这些碱基直接或通过互补系列的碱基编码F3′5′H酶的氨基酸序列。所述氨基酸的序列可以构成全长的F3′5′H，如在SEQ ID NO：10(三色堇)或SEQ ID NO：12(三色堇)或SEQ ID NO：14(鼠尾草)或SEQ ID NO：16(鼠尾草)或SEQ IDNO：18(裸柱菊属)或SEQ ID NO：32(薰衣草)或SEQ ID NO：27(kennedia)中所示出的序列，或它的活性截短形式，或可以相当于特定的区域，如所述酶的N-末端、C-末端或内部部分。遗传序列还可以表示核苷酸的序列或核苷酸序列，并且包括两种或两种以上序列的重组融合体。

根据本发明的上述方面，提供了包括基本上如SEQ ID NQ：9(三色堇)或SEQ ID NO：11(三色堇)或SEQ ID NO：13(鼠尾草)或SEQ ID NO：15(鼠尾草)或SEQ ID NQ：17(裸柱菊属)或SEQ ID NO：31(薰衣草)或SEQ ID NO：26(kennedia)所示的核苷酸序列或互补核苷酸序列或与它具有至少大约50％的相似性或能够在低严格条件下与SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：26所示出的序列杂交的核苷酸序列或互补核苷酸序列的核酸分子。

表1提供了序列标识符的概述。

本发明所涉及的其他百分相似性和相同性(在核苷酸或氨基酸水平上)包括至少大约60％或至少大约65％或至少大约70％或至少大约75％或至少大约80％或至少大约85％或至少大约90％或以上，如大约95％或大约96％或大约97％或大约98％或大约99％，如至少大约60％，61％，62％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，100％。

在特别优选的实施方案中，提供了分离的核酸分子，它包括大体上如SEQ ID NO：9(三色堇)或SEQ ID NO：11(三色堇)或SEQ IDNO：13(鼠尾草)或SEQ ID NO：15(鼠尾草)或SEQ ID NO：17(裸柱菊属)或SEQ ID NO：31(薰衣草)或SEQ ID NO：26(kennedia)所示出的核苷酸序列或互补核苷酸序列、或与它具有至少大约50％的相似性或者能够在低严格条件下与SEQ ID NO：1(矮牵牛)或SEQ IDNO：3(矮牵牛)所示出的序列或他们中任意一个序列的互补链杂交的核苷酸序列或互补核苷酸序列，其中，所述核苷酸序列编码具有F3′5′H活性的多肽。

为了确定严格性水平，以便确定能够与SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：13或SEQ ID NQ：15或SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：26杂交的核酸分子，这里所提到的低严格性包括并且涉及将至少大约0％-至少大约15％v/v甲酰胺和至少大约1M-至少大约2M盐用于杂交，和将至少大约1M-至少大约2M盐用于洗涤条件。一般地，低严格性为大约25-30℃-大约42℃。所述温度可以改变，并且可采用较高的温度来替代甲酰胺的使用和/或提供替代的严格条件。在必要时可以使用替代的严格条件，如中度严格性，它包括并且涉及将至少大约16％v/v-至少大约30％v/v甲酰胺和至少大约0.5M-至少大约0.9M的盐用于杂交，和将至少大约0.5M-至少大约0.9M的盐用于洗涤条件，或高严格性，它包括并且涉及将至少大约31％v/v-至少大约50％v/v甲酰胺和至少大约0.01M-至少大约0.15M的盐用于杂交，和将至少大约0.01M-至少大约0.15M的盐用于洗涤条件。一般地，洗涤是在T_m＝69.3+0.41(G+C)％的条件下进行的(Murmur和Doty，J Mot.Biol.5：109，1962)。不过，错配碱基对的数量每增加1％，双链DNA的T_m就降低1℃(Bonner和Laskey，Eur.J.Biochem.46：83，1974)。在上述杂交条件下，甲酰胺是任选使用的。因此，特别优选的严格性水平定义如下：低严格性为6×SSC缓冲液，1.0％w/v SDS，温度为25-42℃；中等严格性为2×SSC缓冲液，1.0％w/vSDS，温度在20℃-65℃范围内；高严格性为0.1×SSC缓冲液，0.1％w/vSDS，温度为至少65℃。

本发明的另一方面提供了核酸分子，它包括编码或互补于编码基本上如SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：14或SEQ IDNO：16或SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：27所示出的氨基酸序列的序列的核苷酸序列，或与它具有至少大约50％相似性的氨基酸序列。

本文所使用的术语相似性包括比较的序列在核苷酸或氨基酸水平上完全相同。当在核苷酸水平上存在不相同性时，相似性包括序列之间的差别，这种差别导致了不同的氨基酸，不过，这些氨基酸彼此在结构，功能，生物化学和/或构象水平上是相关的。不过，当在氨基酸水平上存在不相同性时，相似性包括彼此在结构，功能，生物化学和/或构象水平上相关的氨基酸。在特别优选的实施方案中，核苷酸和序列比较是在相同性水平、而不是相似性水平上进行的。

用于表述两个或两个多核苷酸或多肽之间的序列关系的术语包括″参考序列″，″比较窗口″，″序列相似性″，″序列相同性″，″序列相似性的百分比′，″序列相同性的百分比″，″大体上相似″和″大体上相同″。″参考序列″是长度为至少12，不过通常为15-18，并且通常为至少25或以上，如30个单体单位，包括核苷酸和氨基酸残基。由于两种多核苷酸可能各自包括(1)在所述两种多核苷酸之间相似的序列(即仅为完整多核苷酸序列的一部分)，(2)在所述两种多核苷酸之间有差别的序列，两种(或两种以上)多核苷酸之间的序列比较通常是通过在″比较窗口″上比较这两种多核苷酸的序列、以鉴定和比较局部区域的序列相似性进行的。″比较窗口″表示与参考序列相比较的通常为12个连续残基的概念性片段。为了对两个序列进行最佳比对，所述比较窗口与参考序列(它不包括添加或缺失)相比，可以包括大约20％或更少的添加或缺失(即缺口)。用于排列比较窗口的序列的最佳比对，可以通过计算机化的程序执行(Wisconsin Genetics SoftwarePackage Release 7.0中的GAP，BESTFIT，FASTA，和TFASTA，GeneticsComputer Group，575 Science Drive Madison，WI，USA)或通过检查进行，并且选择出通过多种方法中任意一种产生的最佳比对(即在所述比较窗口上产生最高百分比的同源性)。还可以参考BLAST家族的程序，例如，由Altschul等所披露的(AM.Acids Res.25：3389-3402，199，7)。有关序列分析的详细讨论，可以参见Ausubel等的著作的Unit 19.3(″Current Protocols in Molecular Biology″John Wiley & Sons Inc，1994-1998，Chapter 15，1998)。

本文所使用的术语″序列相似性″和″序列相同性″，表示所述序列沿着比较窗口在核苷酸与核苷酸的基础上或氨基酸与氨基酸的基础上相同或者功能或结构上相似的程度。因此，举例来说，″序列相同性的百分比″是通过以下方式计算的：沿着比较窗口比较两个最佳比对的序列，确定在两个序列上出现相同的核酸碱基(例如A，T，C，G，I)或相同的氨基酸残基(例如Ala，Pro，Ser，Thr，Gly，Val，Leu，Ile，Phe，Tyr，Trp，Lys，Arg，His，Asp，Glu，Asn，Gln，Cys和Met)的位置数，以便得到匹配位置的数目，用比较窗口上的总位置数除匹配位置数，并且将所得到的结果乘以100，得到序列相同性的百分比。对于本发明来说，″序列相同性″应当被理解成表示通过DNASIS计算机程序(Version2.5 for windows；可以从Hitachi Softwareengineering Co.，Ltd.，South San Francisco，California，USA获得)、使用在该软件中所附带的参考手册中使用的标准默认值计算的“匹配百分比”。类似的说明可应用于序列相似性。

本发明的核酸分子的特征还在于，与编码F3′5′H的核酸分子相比，具有或在衍生化以前具有总体上较低的AT含量(或较高的GC含量)、但不会在蔷薇花瓣组织中产生可检测的完整的转录物，或在表达时不会产生通过TLC或HPLC之类的层析方法测定时可检测的翠雀素或翠雀素-型分子。另外，在密码子的第三个位置上A或T的百分比同样比其他F4′5′H酶低。本文所提到的层析方法包括相关的方法。“相关的”表示在技术上相关的方法或能提供类似结果的方法。相关方法的例子包括其他形式的层析方法(例如气相层析)。

另外，可以对不能在蔷薇组织中很好表达的核苷酸序列进行修饰，如降低AT的总体％，或至少降低密码子第三个位置处的AT的％含量。这样，提高了在蔷薇组织中的表达。

本发明所涉及的核酸序列还包括可用作遗传学探针用于扩增反应、或用作能够调控相应基因在植物中的表达的反义或有义分子的寡核苷酸。有义分子包括发卡构建体，短的双链DNAs和RNAs，以及具有一个或多个单链核苷酸突出部分的部分双链DNAs和RNAs。本文所说的反义分子，还可能涵盖遗传构建体，其中包括相对于它的启动子或另一启动子而言处于相反定向的结构基因组或cDNA基因或它的一部分。它还可能涉及同源遗传序列。反义或有义分子还可能涉及编码具有F3′5′H活性的多肽的基因的末端部分或内部部分或者涉及上述部分的组合，从而减弱或消除所述基因的表达。

就本发明的这一方面而言，提供了具有5-50个核苷酸，如5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55个核苷酸的寡核苷酸，它与具有SEQ ID NO：9或SEQ IDNO：11或SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：26所示出的核苷酸序列的分子的一部分或片段具有实质性相似性。在这里所说的实质性相似性或互补性，表示在寡核苷酸杂交所专用的低、或者并且优选中等和/或者并且最优选高严格性条件下可杂交的相似性(Sambrook等，MolecularCloning：A Laboratory Manual，2^nd edition，Cold Spring HarborLaboratories，Cold Spring Harbor，NY，USA，1989)。例如，将所述寡核苷酸用于从各种来源中筛选F3′5′H遗传序列，或用于在转基因植物中监测导入的遗传序列。所述优选的寡核苷酸涉及保守的F3′5′H遗传序列或在植物属、植物种和/或植物品种内保守的序列。

在本发明的一个方面，所述寡核苷酸对应于F3′5′H遗传序列的5′或3′末端。为了方便起见，5′末端在这里被视为形成了大体上位于结构基因的起始密码子至该基因的中央部分之间的区域，而3′末端被视为形成了基本上位于该基因的中央部分和所述结构基因的终止密码子之间的区域。因此，显而易见的是，寡核苷酸或探针可以与5′末端或3′末端或5′和3′末端所共有的区域杂交，本发明涉及所有这样的探针。

在一种实施方案中，将编码F3′5′H或它的各种功能性衍生物的核酸序列用于降低内源F3′5′H的水平(例如，通过共抑制或反义介导的抑制)，或其他转录后基因沉默(PTGS)过程，包括RNA i，或将编码这种酶或它的各种衍生物或部分的核酸序列沿有义或反义方向使用，以便降低F3′5′H的水平。在诱导PTGS反应方面，有义链，双链或部分单链，如具有发卡环的构建体的使用是特别有用的。在其他替代方案中，核酶，minizymes或DNAzymes可用于使靶核酸序列失活。

另一种实施方案涉及转录后抑制，以便减少多肽材料的翻译。另一种实施方案涉及专一性地诱导或消除甲基化。

本文所说的改变F3′5′H活性，涉及将正常的内源或现存的活性水平提高或降低高达30％或更优选30-50％，或更优选50-75％或更优选75％或以上。所述提高或降低可以被称作F3′5′H酶活性的调控。一般地，调控是在F3′5′H遗传序列的转录或翻译水平上进行的。

本发明的核酸可以是核糖核酸或脱氧核糖核酸，单链或双链以及线性或共价闭合的环状分子。所述核酸分子优选是cDNA。本发明还涉及其他核酸分子，它能在低、优选在中等、最优选在高严格性条件下与本发明的核酸分子杂交，特别是与SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：17或SEQ IDNO：31或SEQ ID NO：26所示出的核苷酸序列或它的一部分或区域杂交。在最优选的实施方案中，本发明涉及具有SEQ ID NO：9或SEQ IDNO：11或SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：26所示出的核苷酸序列的核酸分子，或涉及在核苷酸或氨基酸序列水平上与SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：17或SEQ IDNO：31或SEQ ID NO：26所示出的序列的至少一个或多个区域具有至少40％，更优选至少45％，更优选至少55％，更优选至少65％-70％，更优选超过85％的相似性的分子。其中，所述核酸编码或者互补于编码具有F3′5′H活性的酶的序列。不过，应当指出的是，核苷酸或氨基酸序列可能具有低于上述特定百分比的相似性，并且仍然编码F3′5′H活性，在它们具有序列保守性的区域时，这样的分子仍然被视为属于本发明的范围。本发明还涉及寡核苷酸引物或探针形式的核酸分子，它能够在低，中等，最优选在高严格性条件下与上面所提到的核酸分子，特别是在SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：13.或SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：26中所示出的核酸分子的一部分杂交。优选的是，所述部分相当于所述基因的5′或3′末端。为了方便起见，所述5′末端在这里被视为形成了大体上位于所述结构遗传序列的起始密码子到所述基因的中央部分之间的区域，而所述3′末端在这里被视为形成了大体上位于所述基因的中央部分和所述结构遗传序列的终止密码子之间的区域。因此，显而易见的是，寡核苷酸或探针能够与5′末端或3′末端或者与5′末端和3′末端所共有的部分杂交。本发明涉及所有这样的探针。

术语基因是以它的最广义的含义使用的，并且包括相当于基因的外显子的cDNA。因此，本文所提到的基因包括：

(i)典型的基因组基因，包括转录和/或翻译调控序列和/或编码区和/或非翻译序列(即内含子，5′-和3′-非翻译序列)；或

(ii)mRNA或cDNA，相当于所述基因的编码区(即外显子)和5′-和3′-非翻译序列。

术语基因还被用于描述编码表达产物的全部或一部分的合成的或融合分子。在具体实施方案中，术语核酸分子和基因可以交换使用。

核酸或它的互补形式可以编码全长的酶或它的一部分或衍生物。“衍生物”表示相对天然存在的酶存在任何单个或多个氨基酸取代，缺失，和/或添加，并且它保持了F3′5′H活性。就此而言，所述核酸包括编码F3′5′H的天然存在的核苷酸序列，或者可以包括对所述天然存在的序列的一个或多个核苷酸取代，缺失，和/或添加。本发明的核酸或它的互补形式还可以编码F3′5′H的“一部分”，无论它是有活性的或无活性的，并且可以将这样的核酸分子用作寡核苷酸探针，用于聚合酶链式反应的引物，或用于各种诱变技术中，或用于制备反义分子。

这里所说的核酸分子、核苷酸序列或氨基酸序列的“一部分”，如果合适的话，优选涉及包括至少大约10个连续的核苷酸或5个连续的氨基酸的分子。

本发明的F3′5′H的氨基酸插入衍生物，包括氨基和/或羧基末端融合体，以及一个或多个氨基酸的内部序列插入。插入氨基酸序列变体是这样的，其中，将一个或多个氨基酸残基导入有关蛋白的预定位点，不过，随机插入也是可行的，并适当筛选所得到的产物。缺失变体以从所述序列上去掉了一个或多个氨基酸为特征。取代氨基酸变体是这样的变体，其中，业已将所述序列中的至少一个残基除去，并且将不同的残基插入它的位置。典型的取代是按照表3所示形式进行的。

表3用于氨基酸取代的合适的残基

原始残基	例示性的取代
		Ala	Ser
Arg	Lys
		Asn	Gln；His
Asp	Glu
		Cys	Ser
Gln	Asn；Glu
		Glu	Asp
Gly	Pro
		His	Asn；Gln
Ile	Leu；Val
		Leu	Ile；Val
Lys	Arg；Gln；Glu
		Met	Leu；Ile；Val
Phe	Met；Leu；Tyr
		Ser	Thr
Thr	Ser
		Trp	Tyr
Tyr	Trp；Phe
		Val	Ile；Leu；Met

当F3′5′H是通过氨基酸取代衍生的时候，所述氨基酸通常是由具有类似特性(如疏水性、亲水性、电负性、和大型侧链等)的其他氨基酸取代的。氨基酸取代通常是单个残基的取代。氨基酸插入通常是以大约1-10个氨基酸残基的规模进行的，而缺失是以大约1-20个残基的规模进行的。缺失或插入点优选是以相邻的对的形式进行的，即两个残基的缺失或两个残基的插入。

上述所提到的氨基酸变体可以利用本领域众所周知的肽合成技术，如固相肽合成(Meliifield，J..Am.Chem.Soc.85：2149，1964)等，或通过重组DNA操作方便地制备。用于在具有已知或部分已知序列的DNA上的预定位点产生取代突变的技术为本领域所熟知，并且包括例如M13诱变。产生表现为取代、插入或缺失变体的变体蛋白的DNA序列的操作，披露于例如Sambrook等(1989，同上)中。

本发明的F3′5′H酶的重组或合成变体和衍生物的其他例子包括诸如碳水化合物，脂类，蛋白或多肽的与所述酶相关的任何分子的单个或多个取代，缺失和/或添加。

术语″类似物″和″衍生物″还涉及F3′5′H的任何功能性化学等同物，并且还涉及上述任何氨基酸衍生物。为了方便起见，本文所提到的F3′5′H包括它的任何功能性变体，衍生物，部分，片段，同系物或类似物。

本发明是利用源于三色堇，鼠尾草，裸柱菊属(sollya)或薰衣草或kennedia的核酸序列进行说明的，因为它们是迄今为止最常见的和优选的材料来源。不过，本领域技术人员很容易理解的是，可以从多种来源的任意一种中分离类似的序列，如其他植物或某些微生物。本发明包括直接或间接编码F3′5′H的所有这样的核酸序列，而无论它们的来源是什么。编码F3′5′H的基因的其他合适来源包括，但不局限于葡萄属(Vitis spp.)，条叶狒狒花，松树，云杉，落叶松，菜豆，越桔(Vaccinium spp.)，仙客来，鸢尾，天竺葵，Liparieae，老鹳草，豌豆，山黧豆，蝶豆，长春花，锦葵，黧豆，野豌豆(Vicia spp.)，非洲堇，紫薇，bouchina spp.，白花丹，hypocalyptus spp.，杜鹃，亚麻，大翼豆，木槿，绣球花，兰花，崖豆藤属(Millettia spp)，岩黄芪，胡枝子，天门冬属，珊瑚藤，小苍兰，夏枯草(Brunella spp.)，克拉花(Clarkia spp.)等。

根据本发明，可以将编码F3′5′H的核酸序列沿任意方向导入转基因植物并且表达，以便提供将合适的底物(如果在植物细胞中合成的话)最终转化成DHM，或者通过减弱或消除内源或现有F3′5′H活性而抑制这种代谢物转化的手段。所述3′，5′-羟基化底物的生产随后被转化成翠雀素-型色素，它能改变花瓣颜色，并且可能导致产生蓝色。所述核酸序列在植物中的表达可能是组成型的、诱导型的或发育型的，并且还可以是组织专一性的。单词“表达”是以它的最广义的含义使用的，包括RNA或RNA和蛋白的生产。它还延伸到核酸分子的部分表达。

根据本发明的这一方面，提供了用于生产能够合成F3′5′H的转基因显花植物的方法，该方法包括用包括编码所述F3′5′H的核苷酸序列的核酸序列转化合适植物的细胞，转化是在允许最终表达所述核酸序列的条件下进行的，由所述细胞再生转基因植物，并且让所述转基因植物在足以允许所述核酸序列表达的条件下生长一定时间。因此，所述转基因植物相对于在相当的非转基因植物中的表达量而言，能产生较高水平的非内源F3′5′H。

本发明的另一方面涉及用于生产具有降低了的天然或现有类黄酮3′，5′-羟化酶活性的转基因植物的方法，该方法包括用包括编码或互补于编码F3′5′H活性的核苷酸序列的核酸分子稳定地转化合适植物的细胞，由所述细胞再生转基因植物，并且，必要时让所述转基因植物在足以允许所述核酸表达的条件下生长。

本发明的另一方面涉及用于生产具有降低了的天然或现有F3′5′H活性的遗传修饰过的植物的方法，该方法包括通过与导入所述植物细胞的适当改变了的F3′5′H基因或它的衍生物或一部分同源重组来修饰所述天然序列，从而改变F3′5′H基因，并且由所述细胞再生遗传修饰过的植物。

在本文中，所说的“天然”酶是这样的酶，它是在特定细胞中是然的或天然表达的。“非天然”酶是对所述细胞来说是不天然的酶，而是通过将遗传材料导入植物细胞，例如通过转基因表达的。“内源”酶是由细胞产生的酶，不过，对所述细胞来说，它可能是或者不是天然的。

在优选实施方案中，本发明涉及用于生产具有改变了的花或花序特性的转基因显花植物的方法，该方法包括用本发明的核酸序列稳定地转化合适植物的细胞，由所述细胞再生转基因植物，并且让所述转基因植物在足以允许所述核酸序列表达的条件下生长一定时间。

另外，所述方法可以包括用本发明的核酸序列或它的互补序列稳定地转化合适植物的细胞，由所述细胞再生转基因植物，并且让所述转基因植物在足以改变天然或现有F3′5′H活性水平的条件下生长一定时间。所述改变的水平优选低于F3′5′H活性在相当的非转基因植物中的天然或现有水平。并非要限定本发明，一种作用模式的理论是F3′5′H活性的降低需要所述导入的核酸序列或它的互补序列的表达。不过，可能并不需要所述导入的遗传序列或其互补体的表达来获得希望的作用：即，具有改变了的花或花序特性的显花植物。

在一种相关实施方案中，本发明涉及用于生产具有改变了的花或花序特性的显花植物的方法，该方法包括通过与导入所述植物细胞的适当改变了的F3′5′H基因或它的衍生物或部分同源重组来修饰天然序列，从而改变类黄酮3′，5′-羟化酶基因，并且由所述细胞再生遗传修饰过的植物。

所述改变了的花或花序优选包括不同色调的蓝色或紫色或红色花或其他颜色的产生，这取决于受体植物的基因型和生理学状态。

因此，本发明涉及用于生产能够表达编码F3′5′H或它的一部分的重组基因或具有大体上互补于编码F3′5′H的mRNA分子的全部或一部分的核酸序列的转基因植物的方法，该方法包括用分离的核酸分子稳定地转化合适植物的细胞，所述核酸分子包括编码或互补于编码F3′5′H的序列的核苷酸序列，如果必要的话，在允许最终表达所述分离的核酸分子的条件下进行转化，并且，由所述细胞再生转基因植物。合适的植物表示能够生产DHK，并且具有形成需要的颜色所必需的生理学特性的植物。

本领域技术人员能够很好地理解，可应用于本发明方法中的变化形式，如增加或减弱天然存在于目标植物中的酶的表达，产生不同色调的颜色，如不同色调的蓝色、紫色或红色。

因此，本发明涉及包括本发明核酸序列的全部或一部分或它的反义形式和/或它的任何同系物或相关形式的转基因植物或其后代的全部或其部分或细胞，特别是具有改变了的花或花序特性的转基因植物。所述转基因植物可以包括导入的核酸分子，该分子包括编码或互补于编码F3′5′H的序列的核苷酸序列。一般地，所述核酸被稳定地导入所述植物基因组，不过，本发明还涉及将F3′5′H核苷酸序列导入能自主复制的核酸序列，如能够在植物细胞中复制的DNA或RNA病毒中。本发明还涉及来自所述转基因植物的种子。这种种子，特别是如果有色的话，可用作植物的专有标记。用于将遗传材料导入植物细胞的任何和所有方法，包括但不局限于农杆菌属介导的转化，biolistic粒子轰击等，都属于本发明的范围。

本发明的另一方面涉及将来自含有本发明核酸序列的全部或一部分的转基因植物或来自所述转基因植物的植物部分或细胞或所述转基因植物后代的提取物的用途，特别是将来自所述转基因植物的提取物用作香味剂或食品添加剂或保健品或饮料或果汁或着色剂的用途。

本发明所涉及的植物部分包括，但不局限于花，果实，营养体，坚果，根，茎，叶或种子。

可以多种不同方法由所述植物或植物部分或细胞获得本发明的提取物，这些方法包括，但不局限于化学提取或热萃取或过滤或挤压或粉碎。

所述植物、来自所述植物的植物部分或细胞或提取物，能够以多种不同的方式使用，如用于生产芳香剂(例如食品香精)，食品添加剂(例如，稳定剂，着色剂)或保健品(例如，抗氧化剂，片剂)，饮料(例如，酒，酒精饮料，茶)或果汁(例如，果汁)或着色剂(例如，食品着色剂，织物着色剂，染料，油漆，颜料)。

本发明的另一方面涉及重组形式的F3′5′H。所述重组形式的酶能提供用于研究的材料的来源，例如活性更高的酶，并且可用于开发用于生产有色化合物的体外系统。

本发明的另一方面涉及将本文所披露的遗传序列用于生产能够在植物中表达F3′5′H或下调天然F3′5′H酶的遗传构建体。

术语遗传构建体在本说明书中业已与“融合分子”，“重组分子”，“重组核苷酸序列”互换使用。遗传构建体可以包括单个核酸分子，其中包括编码信号蛋白的核苷酸序列，或者可以包括编码两种或两种以上蛋白的多个开放读框。它还可以包括可操作地与一个或多个开放读框连接的启动子。

本发明的另一方面涉及携带质粒形式的编码F3′5′H的染色体外遗传序列的原核或真核生物。

本发明还涉及包括大体上如SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：27所示出的氨基酸序列或与SEQ ID NO：10或SEQID NO：12或SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：32或SEQ NO：27具有大约50％相似性的氨基酸序列的重组多肽，或所述多肽的衍生物。

″重组多肽″表示由通过人类干预直接或间接导入细胞或导入亲本或所述细胞的其他相关的或前体形式中的核苷酸序列所编码的多肽。重组多肽还可以用无细胞的体外转录系统制备。术语″重组多肽″包括分离的多肽或存在于细胞或细胞制剂中的多肽。它还可以存在于由产生所述多肽的细胞再生的植物或植物部分中。

“多肽”包括肽或蛋白，并且，属于术语“酶”的范畴。

所述重组多肽还可以是包括两种或两种以上异源氨基酸序列的融合分子。

将通过以下非限定性实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

一般方法

一般地，下面的方法披露于以下文献中：Sambrook等(1989，同上)或Sambrook和Russell，Molecular Cloning：A LaboratoryManual 3^rd edition，Cold Spring Harbor Laboratories，Cold SpringHarbor，NY，USA，2001或Plant Molecular Biology Manual(2ndedition)，Gelvin和Schilperoot(eds)，Kluwer Academic Publisher，The Netherlands，1994或Plant Molecular Biology Labfax，Croy(ed)，Bios scientific Publishers，Oxford，UK，1993。

克隆载体pBluescript和PCR script是从Stratagene，USA获得的。pCR7 2.1是从Invitrogen，USA获得的。

大肠杆菌转化

所使用的大肠杆菌菌株为：

DH5α

supE44，Δ(lacZYA-ArgF)U169，(φ801acZΔM15)，hsdR17(I_k ^-，m_k ⁺)，

recA1，endA1，gyrA96，thi-1，relA1，deoR.(Hanahan，J.Mol.Biol.166：557，1983)

XL1-Blue

supE44，hsdR17(I_k ^-，m_k ⁺)，recA1，EndA1，gyrA96，thi-1，relA1，

lac^-，[F′proAB，lac1^q，lacZΔM15，Tn10(tet^R)](Bullock等，Biotechniques 5：376，1987)。

BL21-CodonPlus-RIL菌株

ompT hsdS(Rb-mB-)dcm⁺Tet^rgal endA Hte[argU ileY leuWCam^r]

M15大肠杆菌来自大肠杆菌K12，并且具有以下表型：Nal^s，Str^s，Rif^s，Thi^-，Ara⁺，Gal⁺，Mtl^-，F^-，RecA⁺，Uvr⁺，Lon⁺。

大肠杆菌菌株的转化，是按照Inoue等(Gene 96：23-28，1990)的方法进行的。

根癌土壤杆菌菌株和转化

所使用的失去活性(disarmed)的根癌土壤杆菌菌株是AGLO(Lazo等Bio/technology 9.963-967，1991)。

通过将5μg质粒DNA添加到100μL感受态AGLO细胞中，将质粒DNA导入所述根癌土壤杆菌菌株，所述细胞是通过接种50mL LB培养物(Sambrook等，1999，同上)，并且在28℃下摇晃培养16小时制备的。然后使所述细胞沉淀，重新悬浮在0.5mL的85％(v/v)100mM CaCl₂/15％(v/v)甘油中。通过在液态氮气中放置2分钟，将所述DNA-农杆菌属混合物冷冻，然后通过在37℃下培养5分钟进行解冻。然后再将DNA/细菌混合物在冰上放置10分钟。将所述细胞与1mL的LB(sambrook等，1989同上)培养基混合，并且在28℃摇晃培养16小时。在含有诸如50μg/mL四环素或100μg/mL庆大霉素的合适抗生素的LB琼脂平板上，筛选携带有所述质粒的根癌土壤杆菌细胞。通过对从所述抗生素抗性转化体中分离的DNA进行限制性内切核酸酶作图，证实根癌土壤杆菌中的质粒。

DNA连接

DNA连接是利用Amersham连接试剂盒或Promega连接试剂盒按照所述生产商推荐的方法进行的。

DNA片段的分离和纯化

片段通常是在1％(w/v)琼脂糖凝胶上分离，并且使用QIAEX II凝胶萃取试剂盒(Qiagen)或Bresaclean试剂盒(Bresatec，Australia)按照生产商推荐的方法进行的。

在限制性内切核酸酶消化之后修补突出末端

利用DNA聚合酶(Klenow片段)，按照标准方法(Sambrook等，1989同上)修补突出的5′末端。利用T4 DNA聚合酶，按照标准方法(Sambrook等，1989同上)修补突出的3′末端。

从核酸上除去磷酰基

通常按照生产商的说明将小虾碱性磷酸酶(SAP)(USB)用于从克隆载体上除去磷酰基，以便避免环化。

聚合酶链反应(PCR)

除非另有说明，用质粒DNA作模板的PCR条件包括使用2ng的质粒DNA，100ng的每一种引物，2μL 10mM dNTP混合物，5μL 10×TaqDNA聚合酶缓冲液，0.5μL Taq DNA聚合酶，总体积为50μL。循环条件包括在94℃5分钟的起始变性步骤，然后进行35轮95℃20秒、50℃30秒和72℃1分钟，最后在72℃下处理10分钟，然后在4℃下保存。

PCR是在Perkin Elmer Gene Amp PCR系统9600中进行的。

DNA探针的 ³² P-标记

使用Gigaprime试剂盒(Geneworks)，用50μCi的[α-³²P]-dCTP对DNA片段(50-100ng)进行放射性标记。通过在Sephadex G-50(Fine)柱或Microbiospin P-30Tris层析柱(BioRad)上层析，除去未掺入的[α-³²P]-dCTP。

质粒分离

通过接种具有合适的抗生素筛选(例如100μg/mL氨苄青霉素或10-50μg/mL四环素等)的LB营养液(Sambrook等，1989，同上)，并且在37℃(用于大肠杆菌)或25℃(用于根癌土壤杆菌)下摇晃培养所述液体培养物大约16小时，由此对单菌落分析插入片段情况。通过碱性裂解方法(Sambrook等，1989，同上)或使用WizardPlus SVminipreps DNA纯化系统(Promega)或Qiagen质粒Mini Kit(Qiagen)纯化质粒DNA。一旦确定了插入片段的存在，就使用所述碱性裂解方法(Sambrook等，1989，同上)或QIAfilter Plasmid Midi kit(Qiagen)按照生产商推荐的条件从50mL的过夜培养物中制备较大量的质粒DNA。

DNA序列分析

DNA测序是使用由Applied Biosystems提供的PRISM(商标)ReadyReaction Dye Primer Cycle Sequencing Kits进行的。采用了由生产商提供的方法。循环测序反应是使用Perkin Elmer PCR仪(GeneAmpPCR System 9600)进行的。测序操作通常是通过位于Walter and ElizaHall Institute of Medical Research(Melbourne，Australia)的Australian genome Research Facility或在本部用自动化373A DNA测序仪(Applied Biosystems)进行的。

使用MacVector^TM应用(version6.5.3)(Oxford MolecularLtd.，Oxford，England)进行序列分析。

对Genbank，SWISS-PROT和EMBL数据库进行的同源性检索，是使用FASTA和TFASTA程序(Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(8)：2444-2448，1988)或BLAST程序(Altschul等，J Mol.Biol 215(3)：403-410，1900)进行的。百分序列相似性是通过使用MacVector^TM应用(Oxford MolecularLtd.，England)内的LALIGN程序(Huang和Miller，Adv.App，Math.12：373-381，1991)或ClustaIW程序(Thompson等，Nucleic Acids Research 22：4673-4680，1994)，采用默认参数获得的。

多重序列比对是使用ClustalW(Thompson等1994，同上)采用默认参数产生的。

实施例2

植物转化

矮牵牛(Petunia hybrida)转化(Sw63×Skr4)

按照Holton等(1993a，同上)所披露的或通过本领域众所周知的任何其他方法进行。

蔷薇(Rosa hybrida)转化

按照在以下文献中所披露的或通过本领域众所周知的任何其他方法进行：美国专利申请号542,841(PCT/US91/04412)或Robinson和Firoozabady(Scientia Horticulturae，55：83-99，1993)，Rout等(Scientia Horticulturae，81：201-238，1999)或Marchant等(Molecular Breeding 4；187-194，1998)。

Rosa hybrida的切花通常是从Van Wyk和Son Flower Supply，Victoria获得的。

香石竹(Dianthus caryophyllus)转化

国际专利申请号PCT/US92/02612(康乃馨转化)。按照在以下文献：国际专利申请号PCT/AU96/00296(紫色康乃馨)，Lu等(Bio/Technology 9：864-868，1991)，Robinson和Firoozabady(1993，同上)中所披露的或通过本领域所熟知的任何其他方法。

香石竹栽培品种Kortina Chanel或Monte Lisa的切花，是从Van Wyk和Son Flower Supply，Victoria获得的。

例3

转基因分析

颜色编码

将皇家园艺协会的比色卡(Kew，UK)用于提供对观察颜色的描述。他们提供了其他方式，借此可描述观察到的颜色表型。不过，所确定的数字，应当仅仅被视为察觉到的颜色的指南，并且不应当被视为限定有可获得的可能的颜色。

层析分析

薄层层析(TLC)和高效液相层析(HFLC)分析，大体上是按照Brugliera等(Plant J，5，81-92，1994)披露的方法进行的。

花色素的提取

在HPLC分析之前，对存在于花瓣和雄蕊提取物中的花色素苷和黄酮醇分子进行酸水解，以便从花色素或黄酮醇核心中除去糖基部分。将花色素和黄酮醇标准物用于帮助鉴定存在于花提取物中的化合物。

通过HPLC分析反应混合物中的花色素，包括用50％B-60％B的梯度条件经10分钟时间进行梯度洗脱，然后用60％B洗涤10分钟，最后用60％B-100％B经5分钟时间洗脱，其中，溶剂A由TFA∶H₂O(5∶995)组成，而溶剂B由乙腈∶TFA∶H₂O(500∶5∶495)组成。将AsahiPac ODP-50药筒柱(250mm×4.6mm ID)用于反相层析分离。流速为1mL/分钟，温度为40℃，花色素化合物的检测是使用ShimadzuSPD-M6A三维检测仪在400-650nm波长下进行的。

通过参照已知标准，即翠雀素或翠雀素-型分子，矮牵牛苷配基，花葵素，花青素和甲基花青素，鉴定所述花色素峰。

花发育的阶段

矮牵牛

矮牵牛栽培品种Skr4×Sw63花是在以下发育阶段收获的：

阶段1：无颜色的，闭合的花芽。

阶段2：有颜色的，闭合的花芽。

阶段3：有颜色的花芽，具有露出的花冠。

阶段4：有颜色的，开放的花，具有完整的花药(开裂之前)。

阶段5：完全开放的花，所有花药开裂。

为了进行TLC或HPLC分析，花瓣是从第4阶段的花上采集的，在该阶段积累的色素最多。

为了进行Northern印迹分析，花瓣是从第2-3阶段的花中采集的，在所述阶段类黄酮途径基因的表达最强。

康乃馨

香石竹花在以下发育阶段收获：

阶段1：闭合的花芽，花瓣不可见。

阶段2：花芽开放，花瓣的顶端可见。

阶段3：几乎所有花瓣的顶端外露。″漆刷期″。

阶段4：外侧花瓣与茎秆呈45度角。

阶段5：花完全开放。

为了进行TLC或HPLC分析，花瓣是从第4阶段的花上采集的，在此阶段色素的积累最多。

为了进行Northern印迹分析，从第3阶段的花中采集花瓣，在此阶段类黄酮途径基因的表达最强。

蔷薇

Rosa hybrida花发育的阶段限定如下：

阶段1：无颜色的，紧密闭合的花芽。

阶段2：有颜色的，紧密闭合的花芽。

阶段3：有颜色的闭合的花芽；萼片刚刚开始开放。

阶段4：花芽开始开放；花瓣有很重的颜色；萼片业已分离。

阶段5：萼片完全打开；有些卷曲；花瓣有很重的颜色并且展开。

为了进行TLC或HPLC分析，从第4阶段的花中采集花瓣，在此阶段色素的积累量最大。

为了进行Northern印迹分析，采集第3-第4阶段的花的花瓣，在此阶段色素类黄酮途径基因的表达最强(Tanaka等，Plant CellPhysiol.，36(6)：1023-1031，1995)。

通过分光光度法测定进行花色素苷/黄酮醇测定

将大约200mg的新鲜花瓣组织添加到2mL的甲醇/1％(v/v)的HCl中，并且在4℃下培养大约16小时。然后制备1∶20的稀释液(例如，将50μL稀释到1000μL)，并且记录350nrn和530nm下的吸收值。

然后按照以下公式，计算近似的黄酮醇和花色素苷含量(纳摩尔/克)：

花色素苷含量

(A ₅₃₀ /34,000)×提取缓冲液体积(mL)×稀释倍数×10 ⁶花瓣组织质量(克)

黄酮醇含量

(A ₃₅₀ /14,300)×提取缓冲液体积(mL)×稀释倍数×10 ⁶花瓣组织质量(克)

Northern/RNA印迹分析

通过分离RNA并且评估预期的转录物的数量和大小，监测被转移基因的转录。将Northern印迹分析用于监测特定转录物在花瓣中的稳态水平。根据由所使用的基因估算的预期大小，确定转录物是完整的或全长的。一般地，当将cDNAs用作编码序列时，预期的转录物的大小是cDNA的大小加上融合的启动子片段的任何5′非翻译部分加上来自融合终止子片段的任何3′非翻译序列。在某些场合下，当cDNA区包括推测的聚腺苷酸化位点并且终止子区包括推测的聚腺苷酸化位点时，可以检测到两种转录物。其中的一种转录物的大小与在所述cDNA序列内的聚腺苷酸化位点下游发生的聚腺苷酸化一致。第二种转录物较大，并且与在位于终止子片段内的聚腺苷酸化位点之后被聚腺苷酸化的转录物一致。

使用RNAeasy试剂盒(QIAGEN)，按照生产商推荐的方法，从花瓣或叶片中分离总RNA。对于蔷薇样品来说，将1％(w/v)PVP添加到提取缓冲液中。

通过使用含有40mM吗啉代丙磺酸(pH 7.0)，5mM乙酸钠，0.1mM EDTA(pH8.0)的电泳缓冲液，用2.2M甲醛/1.2％w/v琼脂糖凝胶对RNA样品(5μg)进行电泳。用溴化乙锭对RNA染色，并且在紫外线下面观察。通常将核糖体RNA用作证实RNA没有被内源或外源细胞核糖核酸酶降解的指标。将所述RNA转移到Hybond-N滤膜(Amersham)上，并且按照生产商披露的方法处理。

在RNA凝胶上包括对照样品，以作为放射性标记过的探针的完整性的指标，并且作为预期的转录物大小的指标。petHf1或petHf2基因的对照包括从矮牵牛OGB花瓣(第3-4阶段)中分离的RNA或者从以前业已证实能积累petHf1转录物的转基因康乃馨花中分离的RNA。其他F3′5′H基因的对照通常包括来自从中分离了F3′5′H序列的相同物种的花瓣中分离的RNA。

用³²P-标记过的片段检测RNA印迹。所述滤膜的预杂交(在42℃下进行1小时)和杂交(在42℃下进行16小时)是在50％v/v甲酰胺，1M NaCl，1％w/v SDS，10％w/v硫酸葡聚糖中进行的。通常在65℃下用2×SSC，1％w/v SDS洗涤所述滤膜1-2小时，然后用0.2×SSC、1％w/v SDS在65℃洗涤0.5-1小时。通常，在-70℃下用滤膜对Kodak XAR胶片进行曝光16-72小时，并且使用增感屏。

实施例4

将嵌合的矮牵牛F3′5′H基因导入蔷薇

正如在前言部分所披露的，花色素分子的B环的羟基化形式在决定花瓣颜色方面起着重要作用。二氢黄酮醇DHM的生产，导致了紫色/兰色翠雀素-型色素在诸如矮牵牛的植物中的产生。业已将F3′5′H活性的缺乏与很多植物物种中蓝色花的缺乏关联在一起，这些物种例如有蔷薇属，大丁草(Gerbera)，金鱼草属(Antirrhihum)，石竹属(Dianthus)和菊属(Dendranthema)。

根据在突变型矮牵牛品系(Holton等，1993a，同上，和国际专利申请号PCT/AU92/00334)，在烟草花(国际专利申请号PCT/AU92/00334)和康乃馨花(国际专利申请号PCT/AU96/00296)中生产翠雀素-型色素取得的成功，同样将类似的嵌合矮牵牛F3′5′H基因导入了蔷薇，以便生产新型翠雀素-型色素，并且改变花的颜色。

嵌合的矮牵牛F3′5′H基因构建体的制备

在表4中列举了用于制备构建体的启动子、终止子和编码片段的概述和相应的缩略语。

表4用于构建体制备的缩略语

缩略语	说明
		AmCHS 5′	来自金鱼草查尔酮合成酶(CHS)基因的1.2kb启动子片段(Sommerand Saedler，Mol Gen.Gent.，202：429-434，1986)
CaMV 35S	～0.2kb整合的Bgl II片段，包括来自花椰菜花叶病毒35S(CaMV35S)基因的启动子区(Franck et al.，Cell21：285-294，1980，Guilley et al.，Cell，30：763-773.1982)
		35S 5′	来自CaMV35S基团的启动子片段(Frank等，1980，同上)，以及来自矮牵牛叶绿素a/b结合蛋白基因(cab 22基因)的～60bp 5′非翻译前导序列(Harpster等，MGG，212：182-190，1988)
chrysCHS 5′	来自菊花的CHS基因的启动子区(SEQ ID NO：30)
		eCaMV 35S	强化CaMV35S启动子，参见Mitsuhara et al.，Plant Cell Physiol.37：49-59，1996
GUS	β-葡糖糖醛酸苷酸(GUS)编码序列(Jefferson，et al.，BMBOJ.6：3901-3907，1987)
		Mac	包括来自甘露氨酸合成酶(mas)基因和CaMV35S增强子区的杂合

	启动子(Comai et al.，Plant Mol.Biol.15：373-381，1990)
		mas/35S	杂合启动子，包括来自CaMV35S基因的启动子和根癌土壤杆菌的甘露氨酸合成酶(mas)基因的启动子片段(Janssen andGardner，Plant Molecular Biology，14：61-72，1989)
mas 5′	来自根癌土壤杆菌的mas的启动子区
		mas 3′	来自根癌土壤杆菌的mas的终止子区
nos 5′	来自根癌土壤杆菌的胭脂碱合成酶(nos)基因的启动子区(Depicker et al.，J Mol.and Appl.Genetics 1：561-573，1982)
		nos 3′	来自根癌土壤杆菌的基因的终止子区(Depicker et al.，1982，同上)
npt II	卡那霉素抗性基因(编码新霉素磷酸转移酶，它能使诸如卡那霉素、新霉素和G418的氨基糖苷抗生素失活)
		ocs 3′	来自根癌土壤杆菌章鱼碱合酶基因的～1.6kb终止子片段
petD 8 5′	来自矮牵牛的磷脂转移蛋白基因(D8)的～3.2kb启子子区(Holton，从矮牵牛中分离和表征花瓣专一性基因、博士论文，University ofMelbourne，Australia，1992)(SEQ ID NO.24)
		petD 8 3′	来自矮牵牛栽培品种OGB的磷脂转移蛋白基因(D8)的～0.7kb终止子区(Holton，1992，同上)
长petFLS 5′	包括来自矮牵牛黄酮醇合成酶(FLS)基因启动子区的～4.0kb片段
		短petFLS 5′	包括来自矮牵牛FLS基因启动子区的～2.2kb片段
petFLS 3′	包括来自矮牵牛FLS基因终止子区的～0.95kb片段
		petHf1	矮牵牛F3′5′H Hf1 cDNA克隆(Holton等，1993a，同上)
petHf2	矮牵牛F3′5′H Hf2 cDNA克隆(Holton等，1993a，同上)
		petRT 5′	来自矮牵牛的花色素-3-葡糖苷鼠李糖转移酶(3RT)基因的启动子区(Brugliera，分离自矮牵牛的花特异性基因的鉴定。RMIT，澳大利亚，博士论文，1994)
petRT 3′	来自矮牵牛3RT基因的终止子区(Brugliera，1994，同上)
		蔷薇CHS 5′	包括来自Rosa hybrida CHS基因启动子区的～2.8kb片段(SEQ ID：5)

SuRB	来自烟草的Chlorsulfuron抗性基因(编码乙酰乳酸合成酶)及其自身的终止子(Lee等，EMBO J.7：1241-1248，1988)

为了在蔷薇花瓣中生产翠雀素或翠雀素-型分子，利用矮牵牛F3′5′H cDNA片段和各种启动子和终止子片段，制备了多种二元载体构建体。业已证实了嵌合的矮牵牛F3′5′H基因能在康乃馨和矮牵牛中产生可检测的完整的F3′5′H转录物(通过Northern印迹分析检测)，并且产生了翠雀素或翠雀素-型分子色素。表5中归纳了含有矮牵牛F3′5′H cDNA片段的二元载体构建体的列表。

表5用于转化蔷薇的二元载体构建体中包含的嵌合矮牵牛F3′5′H基因表达盒的概述(有关缩略语的解释参见表4)。

质粒	F3′5′H基因	选择标记基因
			pCGP1452	AmCHS 5′：petHf1：petD8 3′	35S 5′：SuRB
pCGP1453	Mac：petHf1：mas 3′	35S 5′：SuRB
			pCGP1457	petD8 5′：petHf1：petD8 3′	35S 5′：SuRB
pCGP1461	short petFLS5′：petHf1：petFLS3′	35S 5′：SuRB
			pCGP1616	petRT5′：petHf1：nos3′	35S 5′：SuRB
pCGP1638	CaMV-S：petHf1：ocs 3′	35S 5′：SuRB
			pCGP1623	mas35S：petHf1：ocs 3′	35S 5′：SuRB
pCGP1860	RoseCHS5′：petHf1：nos 3′	35S 5′：SuRB
			pCGP2123	CaMV35S：petHf2：ocs 3′	35S 5′：SuRB

矮牵牛F3′5′H cDNA克隆(petHf1和petHf2)的分离

在国际专利申请号PCT/AU92/00334和Holton等(1993a，同上)中业已披露了矮牵牛F3′5′H的cDNA克隆的分离和表征(分别包含在CGP602(图2)和pCGP175(图3)中的petHf1和petHf2)(分别为pSEQ ID No：1和SEQ ID NO：3)。

质粒pCGP601(图2)，pCGP602(图2)，pCGP176(图2)包括矮牵牛petHf1 F3′5′H cDNA克隆的同系物。质粒pCGP601包括矮牵牛F3′5′H petHf1同系物，它包括52bp的5′非翻译序列。质粒pCGP602包括矮牵牛F3′5′H petHf1同系物，它包括125bp的5′非翻译序列(SEQ ID NO：1)。质粒pCGP176(参见Holton等，1993a同上)包括矮牵牛F3′5′H petHf1同系物，它包括27bp的5′非翻译序列，以及另一个大约127bp的3′非翻译序列，它位于pCGP602的矮牵牛F3′5′HpetHf1 cDNA克隆上。

pCGP130 3(存在于pUC19主链上的petHf1)的构建

在质粒pCGP601上所包含的矮牵牛F3′5′H cDNA克隆(如上文所述)(图2)包括52bp的5′非翻译序列和141bp的3′非翻译序列(包括16bp的poly A尾)。首先通过用限制性内切核酸酶BspHI消化使质粒pCGP601(图2)线性化。修复它们的末端，并且通过用限制性内切核酸酶FspI消化释放矮牵牛F3′5′H petHf1 cDNA克隆。BspHI识别序列包括推测的翻译起始密码子，而Fspl识别序列始于终止密码子下游2bp。纯化含有矮牵牛F3′5′H petHf1 cDNA克隆的1.6kb片段，并且与pUC19(New England Biolabs)的修复的EcoRI末端连接。通过对从氨苄青霉素抗性转化体中分离的DNA进行限制性内切核酸酶分析，确定所述片段的正确插入。所得到的质粒被命名为pCGP1303(图4)。

pCGP627(存在于pBluescript主链上的短的petHf1)的构建

用限制性内切核酸酶SpeI和EcoRI消化质粒pCGP176(Holton等，1993a，同上)(图2)。然后修复它们的末端，并且进行再连接。所得到的质粒被命名为pCGP627，并且包括与pCGP176中相同的cDNA克隆，所不同的是从pBluescript载体中cDNA克隆5′末端的多克隆位点处除去了限制性内切核酸酶位点PstI，BamHI和SmaI切除。

二元载体pCGP1452(AmCHS 5′：petHf1：petD8 3′)

质粒pCGP1452(图5)包括嵌合的矮牵牛F3′5′H(petHf1)基因，该基因受来自金鱼草(Antirrhinum majus)查耳酮合成酶基因(CHS)(Sommer和Saedler，1986，同上)的启动子片段的控制，具有来自矮牵牛磷脂转移蛋白(PLTP)基因的终止子片段(petD8 3′)(Holton，1992，同上)上。嵌合的矮牵牛F3′5′H盒是沿相对二元载体pWTT2132(DNA Plant Technologies，USA＝DNAP)(图6)的35S 5′：SuRB基因的串联方向的。

制备二元pCGP1452的中间体

二元载体pWTT2132

二元载体质粒pWTT2132(DNAP)(图6)包括嵌合的基因，该基因包括35S 5′启动子序列(Franck等，1980，同上)，它与编码区以及来自烟草SuRB基因座的乙酰乳酸合成酶(ALS)基因的终止子序列(Lee等，1988，同上)连接。来自矮牵牛叶绿素a/b结合蛋白基因(Cab22基因)的大约60bp的5′非翻译前导序列(Harpster等，MGG，212：182-190，1988)包含在35S 5′启动子片段和SuRB序列之间。

pCGP 725的构建(存在于pBluescript上的AmCHS 5′：petHf1： petD8 3′)

受金鱼草CHS(AmCHS 5′)启动子和矮牵牛PLTP终止子(petD83′)控制的嵌合矮牵牛F3′5′H基因，是通过将来自pCGP602(Holton等，1993a，同上)(图2)(Sommer和Saedler，1986，同上)的1.6kb BclI/FspI矮牵牛F3′5′H(petHf1)片段克隆到位于翻译起始位点5′侧的1.2kb金鱼草CHS基因片段和来自pCGP13ΔBam(Holton，1992，同上)的位于推测的终止密码子3′侧的0.7kb SmaI/XhoI PLTP片段(petD8 3′)之间而构建的，所得到的存在于pBluescript IIKS(Stratagene，USA)主链载体上的质粒被命名为pCGP725(图7)。

pCGP485和pCGP1452(AmCHS 5′：petHf1：petD8 3′二元载体) 的构建

将来自pCGP725(图7)的嵌合F3′5′H基因克隆到含有nptII选择标记基因盒的二元载体pCGN1547上(McBride和Summerfelt，Plant Molecular Biology 14：269-276，1990)，以便制备pCGP485。通过用限制性内切核酸酶PstI消化pCGP485释放含有AmCHS 5′：petHf1：petD8 3′框的3.5kb片段。修补突出末端，并且将纯化的3.5kb片段与二元载体pWTT2132(DNAP)的SmaI末端连接。通过对从四环素抗性转化体中分离的质粒DNA进行限制性内切核酸酶分析，确定相对于35S 5′：SuRB选择标记基因框而言以串联方向正确插入的片段。所述质粒被命名为pCGP1452(图5)。

用pCGP1452转化植物

通过农杆菌属介导的转化，将二元载体质粒pCGP1452(图5)中所包含的T-DNA导入蔷薇。

二元载体pCGP1453(Mac：petHf1：mas 3′)

质粒pCGP1453(图8)包括嵌合的矮牵牛F3′5′H(petHf1)基因，它受Mac启动子(Comai等，1990，同上)和来自农杆菌属的甘露氨酸合成酶基因的终止子片段(mas 3′)的控制。嵌合的矮牵牛F3′5′H框相对于二元载体pWTT2132(DNAP)的35S 5′：SuRB选择标记基因框而言是串联方向的(图6)。

通过用限制性内切核酸酶PstI消化，从质粒pCGP628(参见国际专利申请号PCT/AU94/00265)上释放包括Mac：petHf1：mas3′基因的3.9kb片段。修补突出的末端，并且将纯化的片段与pWTT2132(DNAP)的SmaI末端连接。通过对从四环素抗性转化体中分离的质粒DNA进行限制性内切核酸酶分析，确定Mac：petHf1：mas 3′基因相对于35S 5′：SuRB选择标记基因框而言以串联方向的正确插入。所述质粒被命名为pCGP1453(图8)。

用pCGP1453转化植物

通过农杆菌属介导的转化，将二元载体质粒pCGP1453(图8)中所包含的T-DNA导入蔷薇。

二元载体pCGP1457(petD8 5′：petHf1：pet D8 3′)

质粒pCGP1457(图9)包括嵌合的矮牵牛F3′5′H(petHf1)基因，该基因受来自矮牵牛PLTP基因的启动子片段(petD8 5′)和来自矮牵牛PLTP基因的终止子片段(petD8 3′)的控制。嵌合的矮牵牛F3′5′H框相对于二元载体pWTT2132(DNAP)(图6)的35S5′：SuRB而言处于串联方向。

制备二元载体pCGP1457的中间产物

矮牵牛D8基因组克隆的分离

在λ2001中制备矮牵牛栽培品种OGB(Old Glory Blue)基因组文库

使用基因组DNA的Sau3A部分消化物，参见Holton，1992(同上)所述方法，从矮牵牛栽培品种OGB DNA在载体λ2001中构建基因组DNA文库(Kam等，Gene 32：217-224，1984)。筛选OGB基因组文库中的矮牵牛D8基因的方法参见Holton，1992.同上。

D8基因组克隆OGB2.6的分离

进行PCR，以便寻找表示D8的非-突变型基因组克隆。将Oligo#2(5′→3′GTTCTCGAGGAAAGATAATACAAT)(SEQ ID NO：6)和Oligo#4(5′→3′CAAGATCGTAGGACTGCATG)(SEQ ID NO：7)用于扩增横跨内含子区的D8基因片段其中使用来自从OGB基因组文库的原始筛选中分离的克隆的4μL噬菌体悬浮液。该反应是在50μL的总体积中进行的，反应物中包括1×扩增缓冲液(Cetus)，0.2mM dNTP混合物，＜1μg的模板DNA，50pmoles的每一种引物，和0.25μl的Taq聚合酶(5单位/μL-Cetus)。用30μL的矿物油覆盖所述反应混合物，并且使用Gene Machine(Innovonics)进行温度循环。使用以下条件将所述反应循环30次：94℃1分钟，55℃50秒，72℃2分钟。使用TAE电泳缓冲液，在琼脂糖凝胶上对四分之一的反应混合物进行电泳。

三种克隆：λOGB-2.4，λOGB-2.5，和λOGB-2.6产生了大约1kb的片段，而突变克隆λOGB-3.2(参见Holton，1992，同上)产生了1.25kb的产物。选择λOGB-2.6克隆作进一步分析。

pCGP382

基因组克隆λOGB-2.6包括一个3.9kb XbaI片段，它能与D8cDNA杂交。分离并且纯化该XbaI片段，并且与pBluescript II KS-(Stratagene，USA)的XbaI末端连接。对该克隆进行限制作图，发现了距离3’末端350bp的内部PstI位点。不过，pCGP13上的“突变型”基因组克隆在靠近编码区的推测起始“ATG”(距离它的3’末端大约1.5kb)处具有内部PstI。PstI位点在两种克隆上的位置的差别，暗示了λOGB-2.6XbaI片段不包括D8的完整的基因组序列。对经PstI消化的λOGB-2.6DNA进行Southern印迹分析，发现2.7kb的片段能够与D8 cDNA杂交。限制性核酸内切酶作图证实了该片段包括3’编码区和旁侧序列。

为了获得包括完整D8基因组序列的片段，进行了多个克隆步骤。纯化2.7kb的λOGB-2.6 PstI片段，并且与pBluescript II KS-(Stratagene，USA)的PstI末端连接。用XbalI消化所得到的克隆，以便消除350bp的PstI/XbaI片段。用来自λOGB-2.6的3.9kbXbaI片段取代该片段，产生质粒pCGP382。

通过用限制性内切核酸酶HandIII和NcoI消化，释放pCGP382中包含来自D8 2.6基因的启动子区的3.2kb片段。纯化该片段，并且与pJB1的4.8kbNcoI/HandIII片段连接(Bodeau，Bronze-2和其他玉米花色素基因的分子和遗传学调控。Dissertation，斯坦福大学，美国，1994)，产生含有petD8 5′：GUS：nos3′框的pCGP1101。

通过用限制性内切核酸酶BspHI和BamHI消化，从质粒pCGP602上释放1.6kb的矮牵牛F3′5′H petHF1片段(Holton等，1993a，同上)(SEQ ID.NO：1)(图2)。纯化该片段，并且与pCGP1101的6.2kb NcoI/BamHI片段连接，产生含有petD8 5′：petHF1 nos3′表达框的pCGP1102。

从质粒pCGP13ΔBamHI中纯化0.75kb的BamHI petD83′片段(Holton，1992，同上)，并且与pCGP1102的BamHl/BglII末端连接，产生含有petD8 5′：petHf1：petD8 3′表达框的质粒pCGP1107。

通过用限制性内切核酸酶XbaI消化使质粒pCGP1107线性化。修复突出末端，然后通过用限制性内切核酸酶PstI消化而释放含有petD8 5′：petHf1：petD8 3′表达框的5.3kb片段。纯化该片段，并且与二元载体pWTT2132(DNAP)(图6)的SmaI/PstI末端连接。通过对从四环素抗性转化体中分离的质粒DNA进行限制性内切核酸酶分析，确定petD85′：petHf1：petD8 3′基因相对于35S 5′：SuRB选择标记基因框处于串联方向的正确插入。所述质粒被命名为pCGP1457(图9)。

用pCGP1457转化植物

通过农杆菌属介导的转化，将包含在二元载体质粒pCGP1457(图9)上的T-DNA导入蔷薇。

二元载体pCGP1461(短的petFLS 5′：petHf1：pet FLS 3′)

质粒pCGP1461(图10)包括嵌合的矮牵牛F3′5′H(petHf1)基因，该基因受来自矮牵牛黄酮醇合成酶(FLS)基因的启动子片段(短的petFLS 5′)和来自矮牵牛FLS基因的终止子片段(petFLS 3′)的控制。嵌合的矮牵牛F3′5′H基因相对于二元载体pWTT2132(图6)的35S 5′：SuRB基因处于串联方向。

制备二元载体pCGP1461的中间体

矮牵牛FLS基因的分离

矮牵牛栽培品种Th7基因组文库的制备

按照Sambrook等(1989，同上)的方法，使用基因组DNA的Sau3A部分消化产物制备矮牵牛栽培品种Th7基因组文库。将部分消化的DNA克隆到EMBL-3λ载体(Stratagene，USA)上。

采用高严格性条件，用³²P-标记的矮牵牛FLS cDNA克隆片段筛选Th7基因组DNA文库(Holton等，Plant J.4：1003-1010，1993b)。

选择两个基因组克隆(FLS2和FLS3)作进一步的分析，发现其中包括位于矮牵牛FLS编码区的推测起始甲硫氨酸上游的序列，其中FLS2与FLS3相比包含更长的启动子区。。

pCGP486

通过用限制性内切核酸酶XhoI消化基因组克隆FLS2，释放6kb的片段。纯化具有短的矮牵牛FLS基因的片段，并且与pBluescript SK(Stratagene，USA)的XhoI末端连接。通过对从氨苄青霉素抗性转化体中分离的DNA进行限制性内切核酸酶分析，确定所述片段的正确插入。所得到的质粒被命名为pCGP486。

pCGP487

通过用限制性内切核酸酶XhoI消化基因组克隆FLS，释放9kb的片段。纯化具有矮牵牛FLS基因的片段，并且与pBluescript SK(Stratagene，USA)的XhoI末端连接。通过对从氨苄青霉素抗性转化体中分离的DNA进行限制性内切核酸酶分析，确定所述片段的正确插入。所得到的质粒被命名为pCGP487。

pCGP717

通过用限制性内切核酸酶XhoI和PstI消化，从质粒pCGP487上释放位于推测的翻译起始位点上游的2.2kb矮牵牛FLS启动子片段。纯化所产生的片段，并且与pBlueseript II KS+(Stratagene，USA)的XhoI/PstI末端连接。通过对从氨苄青霉素抗性转化体中分离的DNA进行限制性内切核酸酶分析，确定所述片段的正确插入。所得到的质粒被命名为pCGP717。

pCGP716

通过用限制性内切核酸酶HindIII和SacI消化，从质粒pCGP487上释放位于推测的翻译终止位点下游的0.95kb矮牵牛FLS终止子片段。纯化所产生的片段，并且与pBlueseript II KS+(Stratagene，USA)的HindIII/SacI末端连接。通过对从氨苄青霉素抗性转化体中分离的DNA进行限制性内切核酸酶分析，确定所述片段的正确插入。所得到的质粒被命名为pCGP716。

pCGP493(短的petFLS 5′：petFLS3′表达框)的构建

通过PCR扩增包括短的矮牵牛FLS启动子片段的1.8kb片段，其中用质粒pCGP717作模板，并且使用T3引物(Stratagene，USA)和FLS-Nco引物(5′AAA ATC GAT ACC ATG GTC TTT TTT TCT TTG TCTATA C3′)(SEQ ID.NO：19)。用限制性内切核酸酶XhoI和ClaI消化所述PCR产物，并且将纯化的片段与pCGP716的XhoI/ClaI末端连接在一起。通过对从氨苄青霉素抗性转化体中分离的DNA进行限制性内切核酸酶分析，确定所述片段的正确插入。所得到的质粒被命名为pCGP493。

pCGP497(短的petFLS 5′：petHf1：petFLS3′表达框)的构建

通过用限制性内切核酸酶BspHI和FspI消化，从质粒pCGP627(如上文所述)上释放矮牵牛F3′5′H(petHf1)cDNA克隆。BspHI识别序列包括推测的翻译起始密码子，而FspI识别序列始于所述终止密码子下游2bp处。纯化所产生的矮牵牛F3′5′H petHfI片段，并且与质粒pCGP493的ClaI(修复的末端)/NcoI末端连接。通过对从氨苄青霉素抗性转化体中分离的DNA进行限制性内切核酸酶分析，确定所述片段的正确插入。所得到的质粒被命名为pCGP497。

pCGP1461(短的petFLS 5′：petHf1：petFLS3′二元载体)的构 建

通过用限制性内切核酸酶SacI消化，使质粒pCCP497线性化。修复突出末端，并且通过用限制性内切核酸酶KpnI消化释放含有短的pet FLS5′：petHf1：petFLS3′基因表达框的4.35kb片段。纯化所产生的片段，并且与二元载体pWTT2132(DNAP)(图6)的PstI(修复的末端)/KpnI末端连接。通过对从四环素抗性转化体中分离的质粒DNA进行限制性内切核酸酶分析，确定所述片段相对于pWTT2132的35S5′：SuRB选择标记基因框处于串联方向的正确插入。所得到的质粒被命名为pCGP1461(图10)。

用pCGP1461进行植物转化

通过农杆菌属介导的转化，将包含在二元载体质粒pCGP1461(图10)上的T-DNA导入蔷薇。

二元载体pCGP1616(petRT 5′：petHf1：nos 3′)

质粒pCGP1616(图11)包括嵌合的矮牵牛F3′5′H(petHfI)基因，该基因受来自矮牵牛3RT基因的启动子片段(petRT 5′)(Brugliera，1994，同上)和来自农杆菌属的胭脂碱合成酶基因的终止子片段(nos 3′)(Depicker等，1982，同上)的控制。嵌合的矮牵牛F3’5’H框相对于二元载体pWTT2132(DNAP)(图6)的35S 5′：SuRB基因处于串联方向。

制备二元载体pCGP1616的中间体

矮牵牛3RT基因的分离

在EMBL3中构建矮牵牛栽培品种Th7基因组DNA文库

矮牵牛栽培品种Th7基因组文库是按照Sambrook等(1989，同上)的方法，使用基因组DNA的Sau3A部分消化产物制备的。将部分消化的DNA克隆到EMBL-3λ载体(Stratagene，USA)上。按照披露于以下文献中的方法从Th7基因组文库中筛选矮牵牛3RT基因：Brugliera，1994，同上。

用限制性内切核酸酶PstI和BamHI消化，从质粒pCGP846上释放含有petRT 5′：petHf1：nos 3′框的3kb片段(参见Brugliera，1994，同上)。将纯化的片段与pWTT2132(DNAP)(图6)的PstI/BamHI末端连接。通过对从四环素抗性转化体中分离的质粒DNA进行限制性内切核酸酶分析，确定所述片段相对于35S 5′：SuRB选择标记基因框处于串联方向的正确插入。所得到的质粒被命名为pCGP1616(图11)。

用pCGP1616进行植物转化

通过农杆菌属介导的转化，将包含在二元载体质粒pCGP1616(图11)上的T-DNA导入蔷薇。

二元载体pCGP1623(mas/35S：petHf1：ocs 3′)

质粒pCGP1623(图12)包括嵌合的矮牵牛F3′5′H(petHf1)基因，该基因受pKIWI 101(Janssen和Gardner，1989，同上)中包含的表达框的控制，该表达框包括来自花椰菜花叶病毒35S基因的启动子片段(35S5′)和来自农杆菌甘露氨酸合成酶基因(mas)的启动子的增强序列，以及来自农杆菌章鱼碱合成酶基因的终止子片段(ocs3′)。嵌合的矮牵牛F3’5’H框相对于二元载体pWTT2132(DNAP)(图6)的35S 5′：SuRB基因处于串联方向。

制备二元载体pCGP1623的中间产物

通过用限制性内切核酸酶BspHI和SmaI消化，释放包含在质粒pCGP1303(图4)上的矮牵牛F3′5′H petHf1 cDNA克隆的大约1.6kb片段。纯化矮牵牛F3′5′H petHf1片段，并且与pKIWI101(Janssen和Gardner，1989，同上)的大约5.9kb NcoI/EcoRI(修复的末端)片段连接，产生质粒pCGP1619。

用限制性内切核酸酶XhoI部分消化质粒pCGP1619，释放了包括mas/35S：petHF1：ocs 3′表达框的4.9kb片段。纯化该片段，并且与pWTT2132(DNAP)(图6)的SalI末端连接。通过对从四环素抗性转化体中分离的质粒DNA进行限制性内切核酸酶分析，确定所述片段相对于35S5′：SuRB选择标记基因框处于串联方向的正确插入。所述质粒被命名为pCGP1623(图12)。

用pCGP1623进行植物转化

通过农杆菌属介导的转化，将在二元载体质粒pCGP1623(图12)上包含的T-DNA导入蔷薇。

二元载体pCGP1638(35S 5′：petHf1：ocs 3′)

质粒pCGP1638(图13)包括嵌合的矮牵牛F3′5′H petHf1基因，该基因受CaMV 35S启动子(35S5′)和章鱼碱合成酶终止子(ocs3′)的控制。将来自矮牵牛叶绿素a/b结合蛋白基因(Cab 22基因)(Harpster等，1988，同上)的约60bp 5′非翻译前导序列插入CaMV35S启动子片段和矮牵牛F3′5′H petHf1 cDNA克隆之间。所述嵌合的矮牵牛F3′5′H框相对于二元载体pWTT2132(图6)的35S 5′：SuRB选择标记基因框处于串联方向。

制备二元载体pCGP1638的中间产物

pCGP1273的构建

质粒pCGP1273是通过亚克隆包括来自二元载体pJJ3499(Jones等，Transgeneic Research，1：285-297，1992)的35S5′：GUS：ocs 3′基因的大约3kb HindIII/HpaI片段与质粒pBluescript KS II(+)(Stratagene，USA)的HindIII/SmaI末端而构建的。

pCGP1634的构建

从pCGP1273上分离包括3555′：GUS：ocs3′基因的大约3kbHindIII/BamHI片段，并且与克隆载体pUC19(New England Biolabs)的HindIII/BamHI末端连接，制备质粒pCGP1634。

pCGP1636的构建

通过用限制性内切核酸酶NcoI和XbaI消化pCGP1634，从质粒pCGP1634上除去GUS片段，并且纯化包括35S5′启动子片段、ocs3′终止子片段和pUC19载体主链的大约3.7kb片段。

通过用限制性内切核酸酶BspHI和XbalI消化，从pCGP1303(图4)上释放矮牵牛F3′5′H petHf1 cDNA克隆，纯化所得到的大约1.6kb的片段，并且与来自pCGP1634的大约3.7kbNcoI/XbaI片段连接。通过对从氨苄青霉素抗性转化体中分离的质粒DNA进行限制性内切核酸酶分析，确定矮牵牛F3′5′H petHf1片段的正确插入。所得到的包括35S5′：petHf1：ocs3′基因的质粒被命名为pCGP1636。

pCGP1638的构建

通过用限制性内切核酸酶PstI和EcoRI消化pCGP1636，从质粒pCGP1636上释放35S5′：petHfI：ocs3′基因。修复它的末端，并且纯化大约2.6kb的片段，将该片段与二元载体pWTT2132(DNAP)的Sam末端连接。通过对从四环素抗性转化体中分离的质粒DNA进行限制性内切核酸酶分析，确定35S5′：petHf1：ocs3′基因相对于35S5′：SuRB选择标记基因框处于串联方向的正确插入。所述质粒被命名为pCGP1638(图13)。

用pCGP1638进行植物转化

通过农杆菌介导的转化，将二元载体质粒pCGP1638(图1)上所包含的T-DNA导入蔷薇。

二元载体pCGP1860(蔷薇CHS5′：petHf1：nos3′)

质粒pCGP1860(图14)包括嵌合的矮牵牛F3′5′H(petHf1)基因，该基因受Rosa hybrida查耳酮合成酶基因的启动子片段(蔷薇CHS5′)和农杆菌胭脂碱合成酶基因的终止子片段(nos3′)的控制。嵌合的矮牵牛F3′5′H框相对于二元载体pWTT2132(DNAP)(图6)的35S 5′：SuRB选择标记基因框处于串联方向。

制备二元载体pCGP1860的中间产物

蔷薇CHS启动子的分离

用从Rosa hybrida栽培品种Kardinal的幼叶中分离的基因组DNA制备蔷薇基因组DNA文库。

用包含在质粒pCGP634上的³²P-标记的蔷薇CHS cDNA克隆片段筛选Kardinal基因组DNA文库。用矮牵牛CHS cDNA片段作探针(包含在pCGP701上的克隆IF11，参见Brugliera等，1994，同上)，筛选由从Rosa hybrida栽培品种Kardinal中分离的RNA制备的花瓣cDNA文库，分离蔷薇CHS cDNA克隆(Tanaka等，1995，同上)。条件参见Tanaka等，1995(同上)。

选择蔷薇基因组克隆(蔷薇CHS20λ)作进一步的分析，发现其中包括位于蔷薇CHS编码区的推测起始甲硫氨酸上游的大约6.4kb序列。

将位于翻译起始位点上游的大约6.4kb片段克隆到pBluescript KS(-)(Stratagene)上，并且将所述质粒命名为pCGP1114。

用限制性内切核酸酶HindIII和EcoRV消化质粒pCGP1114，以便释放2.7-3.0kb的片段，纯化该片段，并且与pUC19(New EnglandBiolabs)的HindIII/SmaI末端连接。通过对从氨苄青霉素抗性转化体中分离的DNA进行限制性内切核酸酶分析，确定蔷薇CHS启动子片段的正确插入。所得到的质粒被命名为pCGP1116。利用pCGP1116作模板(SEQ ID NO：5)确定蔷薇CHS启动子片段的DNA序列。

pCGP197(存在于pUC18主链上的蔷薇CHS 5′：GUS：nos 3′) 的构建

通过用限制性内切核酸酶HindIII和Asp718消化，从质粒pCGP1116上释放包括蔷薇查耳酮合成酶启动子(蔷薇CHS5′)的大约3.0kb片段。纯化该片段，并且与来自pJB1(Bodeau，1994，同上)的含有载体主链、β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)和nos 3′片段的HindII/Asp718片段连接。通过对从氨苄青霉素抗性转化体中分离的DNA进行限制性内切核酸酶分析，确定蔷薇CHS启动子片段正确插入了GUS编码序列上游。所得到的质粒被命名为pCGP197。

pCGP200(存在于pUC18主链上的蔷薇CHS 5′：petHf1：nos 3′) 的构建

通过用限制性内切核酸酶BspHI和SacI消化，从质粒pCGP1303(如上文所述)(图4)上释放包括矮牵牛F3′5′H(petHf1)片段的1.8kb片段。纯化矮牵牛F3′5′H petHf1片段，并且与pCGP197的NcoI/SacI末端连接。通过对从氨苄青霉素抗性转化体中分离的DNA进行限制性内切核酸酶分析，确定矮牵牛F3′5′H petHf1片段在蔷薇CHS启动子和nos3′片段之间的正确插入。所得到的质粒被命名为pCGP200。

pCGP1860(存在于二元载体上的蔷薇CHS 5′：petHf1：nos 3′) 的构建

通过用限制性内切核酸酶BglII消化，从质粒pCGP200上释放包括蔷薇CHS 5′：petHf1：nos 3′框的大约4.9kb片段。纯化该片段，并且与二元载体pWTT2132(DNAP)(图6)的BamHI末端连接。

通过对从四环素抗性转化体中分离的质粒DNA进行限制性内切核酸酶分析，确定所述片段相对于pWTT2132的35S5′：SuRB选择标记基因框处于串联方向的正确插入。所得到的质粒被命名为pCGP1860(图13)。

用pCGP1860进行植物转化

通过农杆菌属介导的转化，将包含在二元载体质粒pCGP1860(图14)上的T-DNA导入蔷薇。

二元载体pCGP2123(CaMV 35S：petHf2：ocs 3′)

质粒pCGP2123(图15)包括嵌合的矮牵牛F3′5′H(petHf2)基因，该基因受CaMV 35S启动子和来自农杆菌章鱼碱合成酶基因的终止子片段(ocs 3′)的控制。嵌合的矮牵牛F3′5′H框相对于二元载体pCGP1988(图16)的35S 5′：SuRB选择标记基因框处于串联方向。

制备二元载体pCGP2123的中间产物

pCGP1988(二元载体pWTT2132的衍生物)的构建

二元载体pCGP1988(图16)是以二元载体pWTT2132(DNAP)(图6)为基础的，不过，它包括来自pNEB193(New England Biolabs)的多克隆位点。首先，通过用限制性内切核酸酶EcoRI消化对质粒pNEB193线性化。修复突出末端，并且通过用限制性内切核酸酶PstI消化，释放多克隆片段。纯化所述片段，并且与二元载体pWTT2132(DNAP)的SalI(修复的末端)/PstI末端连接。通过对四环素抗性转化体中分离的质粒DNA进行限制性内切核酸酶分析，确定所述多克隆片段在pWTT2132内的正确插入。所得到的质粒被命名为pCGP1988(图16)。

pCGP2000(存在于pBluescript上的CaMV 35S启动子片段)的 构建

质粒pCGP2000是中间质粒，它在pBluescript SK(Stratagene，USA)主链上包含花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子片段。通过用限制性内切核酸酶Xbal和PstI消化，从pKIWI101(Janssen和Gardner，1989，同上)上释放CaMV 35S启动子片段。纯化所产生的大约0.35kb的片段，并且与载体pBluescript SK的XbaI/PstI末端连接。通过对从氨苄青霉素抗性转化体中分离的质粒DNA进行限制性内切核酸酶分析，确定所述片段的正确插入。所述质粒被命名为pCGP2000。

pCGP2105(存在于pBluescript上的CaMV 35S 5′和ocs 3′片 段)的构建

质粒pCGP2105(图17)包括CaMV 35S启动子片段和来自农杆菌章鱼碱合成酶基因的终止子片段(ocs 3′)，它们都来自pKIWI101(Janssen和Gardner，1989，同上)。

首先通过用限制性内切核酸酶EcoRI消化质粒pKIWI101(Janssen和Gardner，1989，同上)，然后修复突出末端，最后用限制性内切核酸酶XhoI消化，释放出1.6kb片段，从而从pKIWI101中分离ocs 3′片段。然后将该片段与pCGP2000的HincII/XhoI末端连接。通过对从氨苄青霉素抗性转化体中分离的质粒DNA进行限制性内切核酸酶分析，确定所述片段的正确插入。所述质粒被命名为pCGP2105(图17)。

pCGP2109(存在于pBluescript上的CaMV 35S：petHf2：ocs3′ 基因)的构建

质粒pCGP2109包括存在于pBluescript主链上的CaMV 35S：petHf2：ocs3′表达基因框。

通过用限制性内切核酸酶XbaI和SspI消化，从pCGP175(Holton等，1993a，同上)上释放1.8kb的矮牵牛F3′5′H petHf2 cDNA克隆。修复突出末端，并且将纯化的片段与pCGP2105(如上文所述)(图17)的PstI(末端修复)/EcoRV末端连接。通过对从氨苄青霉素抗性转化体中分离的质粒DNA进行限制性内切核酸酶分析，确定所述片段的正确插入。所述质粒被命名为pCGP2109。

pCGP2123(CaMV 35S：petHf2：ocs 3′二元载体)的构建

通过用限制性内切核酸酶Asp718和XbaI消化，从pCGP2109上释放CaMV 35S：petHf2：ocs 3′框。修复突出末端，并且纯化所得到的含有CaMV 35S：petHf2：ocs 3′基因的大约3.7kb片段，并且与二元载体pCGP1988(图16)的Asp718的修复末端连接。通过对从四环素抗性转化体中分离的质粒DNA进行限制性内切核酸酶分析，确定CaMV 35S：petHf2：ocs 3′基因相对于35S 5′：SuRB选择标记基因框处于串联方向的正确插入。所述质粒被命名为pCGP2123(图15)。

用pCGP2123进行植物转化

通过农杆菌介导的转化，将包含在二元载体质粒pCGP2123(图15)上的T-DNA导入蔷薇。

实施例5

转基因蔷薇的分析

让在实施例4中所披露的实验中生产的转基因蔷薇生长到开花。收集花，并且利用皇家园艺协会比色卡(RHSCC)对花瓣的颜色进行分析。提取花色素苷，并且通过TLC和/或HPLC分析花色素(特别是翠雀素或翠雀素-型分子的存在)。还从花瓣组织中分离了总RNA，并且利用Northern印迹分析检测矮牵牛F3′5′H转基因、内源蔷薇CHS基因和SuRB转基因的转录物。转基因分析的结果归纳在表6中。

尽管生产了超过250种转基因Kardinal蔷薇(表6)，但没有一个能产生具有颜色改变的花。TLC和/或HPLC分析没有检测到翠雀素或翠雀素-型分子色素的积累，证实了有效的F3′5′H活性的缺乏。随后对从所述转基因蔷薇的花瓣组织中分离的总RNA进行的Northern分析发现，既没有可检测的完整的矮牵牛F3′5′H(petHf1或petHf2)转录物，或者在某些场合下(参见脚注)也没有降解的转录物。相同的膜与选择标记基因(SuRB)或与内源蔷薇CHS cDNA探针的杂交显示了不连续的杂交转录物，这表明所分离的总RNA没有被降解。SuRB转基因转录物的检测证实了所述蔷薇是转基因的。

表6用来自各种矮牵牛F3′5′H(petHf1或petHf2)基因表达框的T-DNA转化的蔷薇花瓣的转基因分析结果

质粒	F3′5′H基因	事件	DEL	RNA
					pCGP1452	AmCHS 5′：petHf1：petD8 3′	34	0/28	0/341
pCGP1453	Mac：petHf1：mas 3′	16	0/14	0/132
					pCGP1457	petD8 5′：petHf1：petD8 3′	11	0/11	0/11
pCGP1461	short petFLS 5′：petHf1：petFLS  3′	11	0/11	0/11
					pCGP1616	petRT 5′：petHf1：nos 3′	4	0/4	0/4
pCGP1623	mas/35S：petHf1：ocs 3′	27	0/20	0/123
					pCGP1638	CaMV 35S：petHf1：ocs 3′	22	0/14	0/14
pCGP1860	RoseCHS 5′：petHf1：nos 3′	15	0/13	0/13
					pCGP2123	CaMV 35S：petHf2：ocs 3′	40	0/26	0/10

事件＝所产生的独立转基因事件的数量

DEL＝在分析的事件总数中检测(通过TLC或HPLC)到翠雀素或翠雀素-型分子的转基因事件的数量

RNA＝在分析的事件总数中通过Northern印迹分析在从蔷薇花瓣中分离的总RNA中检测到完整F3′5′H(petHf1或petHf2)的转基因事件的数量

1＝在分析过的34个事件中有5个检测到降解的转录物

2＝在分析过的13个事件中有8个中检测到降解的转录物

3＝在分析过的12个事件中有8个中检测到降解的转录物

在用上述T-DNAs转化的转基因蔷薇花瓣中从来没有检测到完整的矮牵牛F3′5′ H(petHf1或petHf2)转录物这一事实(表6)，暗示了多种可能性：

1.分离的RNA被降解了。这是不可能的，因为业已通过溴化乙锭对RNA进行了染色，并且在紫外线下观察。将完整的可见的核糖体RNA条带用作分离RNA的质量的标记。另外，内源蔷薇CHS和SuRB转基因的全长转录物的检测证实了所述RNA制剂没有被降解。

2.所评估的嵌合F3′5′H基因转录没有起始。对于分析的某些表达框来说，这是一种可能性，因为通过Northern分析没有检测到F3′5′H转录物。不过，在诸如康乃馨和矮牵牛的其他植物中，业已证实了所有矮牵牛F3′5′H表达框都是有功能的(即导致完整的转录物产生，生成了翠雀素-型色素)。

3.矮牵牛F3′5′H petHf1和petHf2 mRNAs在蔷薇中是不稳定的。这同样是一种可能性，因为通过Northern分析，在从某些事件的花瓣中分离的总RNA中检测到降解的矮牵牛F3′5′H转录物。不过，业已证实，矮牵牛petHf1和petHf2 mRNAs在诸如康乃馨和矮牵牛的其他植物中是稳定的。这种不稳定性可能是由于异常翻译所致，导致了mRNA的转变，所述序列的某些特征在蔷薇细胞中固有的不稳定性，以及某些其他因素。

因此，有必要寻找能有效驱动基因在蔷薇花瓣中表达的合适的启动子片段，并且寻找能导致完整的转录物在蔷薇花瓣中积累、从而产生有功能的F3′5′H活性以及产生翠雀素-型色素的合适的F3′5′H序列。

实施例6

评估蔷薇中的启动子

GUS基因表达框的开发

启动子和终止子片段的评估是使用GUS报道基因进行的。因此，将多个启动子连接在β-葡糖醛酸糖苷酶报道基因(GUS)(Jefferson等，1987，同上)上，并且导入蔷薇，以期鉴定能有效启动在蔷薇花中的转录的表达框。

在表7中提供了评估的启动子和终止子片段的概述

表7在蔷薇中评估的嵌合GUS基因表达框的列表

质粒	GUS表达框	选择标记基因	主链载体
				pCGP1307	petD8 5′：GUS：petD8 3′	mas 5′：nptII：mas 3′	pCGN1548
pCGP1506	long petFLS 5′：GUS：petFLS 3′	nos 5′：nptII：nos 3′	pBIN19
				pCGP1626	chrysCHS 5′：GUS：petRT 3′	35S 5′：SuRB	pWTT2132
pCGP1641	petRT 5′：GUS：petRT 3′	35S 5′：SuRB	pWTT2132
				pCGP1861	RoseCHS 5′：GUS：nos 3′	35S 5′：SuRB	pWTT2132
pCGP1953	AmCHS 5′：GUS：petD8 3′	35S 5′：SuRB	pWTT2132
				pWTT2084	35S 5′：GUS：ocs 3′	35S 5′：SuRB	pWTT2132

二元载体 pCGP1307(petD8 5′：GUS：petD8 3′)

质粒pCGP1307(图12)包括嵌合的GUS基因，该基因受矮牵牛PLTP基因的启动子和终止子片段(分别为petD8 5′和petD8 3′)的控制。该嵌合的GUS报道基因框相对于二元载体pCGN1548(McBride和Summerfelt，1990，同上)的mas 5′：nptII：mas 3′选择标记基因框处于串联方向。

制备二元载体pCGP1307的中间产物

用0.75kb petD8 3′片段(Holton，1992，同上)取代pCGP1101(参见实施例4)的nos 3′片段，产生包括petD8 5′：GUS：petD8 3′表达框的质粒pCGP1106。

通过用限制性内切核酸酶HindIII和PstI消化，从质粒pCGP1106上释放包括petD8 5′：GUS：petD8 3′表达框的5.3kb片段。纯化所述片段，并且与二元载体pCGN1548(McBride和Surnmerfelt，1990，同上)的HindIII/PstI末端连接，通过对从庆大霉素抗性转化体中分离的DNA进行限制性内切核酸酶分析，确定所述片段的正确插入。所得到的质粒被命名为pCGP1307(图18)。

用pCGP1307进行植物转化

通过农杆菌介导的转化，将包含二元载体质粒pCGP1307(图18)上的T-DNA导入蔷薇。

二元载体pCGP1506(长的petFLS 5′：GUS：petFLS 3′)

质粒pCGP1506(图19)包括嵌合的GUS基因，该基因受来自矮牵牛黄酮醇合成酶基因的启动子和终止子片段(分别为petFLS 5′和petFLS 3′)的控制。嵌合的GUS报道基因框相对于二元载体pBIN19(Bevan，Nucleic Acids Res 12：8711-8721，1984)的nos 5′：nptII：nos 3′选择标记基因框处于串联方向。

制备二元载体pCGP1506的中间产物

通过用限制性内切核酸酶XhoI和PstI消化，从质粒pCGP486(参见实施例4)上释放位于推测的翻译起始位点上游的4kb长的矮牵牛FLS启动子片段。纯化所产生的片段，并且与pBluescript II KS+(Stratagene，USA)的XhoI/PstI末端连接。通过对从氨苄青霉素抗性转化体分离的DNA进行限制性内切核酸酶分析，确定所述片段的正确插入。所得到的质粒被命名为pCGP715。

pCGP494(长的petFLS 5′：petFLS3′表达框)的构建

通过PCR扩增包括长的矮牵牛FLS启动子片段的4.0kb片段，其中用质粒pCGP715作模板，并且使用T3引物(Stratagene，USA)和FLS-Nco引物(5′AAA ATC GAT ACC ATG GTC TTT TTT TCT TTG TCTATA C 3′)(SEQ ID NO：19)。用限制性内切核酸酶XhoI和ClaI消化所述PCR产物，并且将纯化的片段与pCGP716(参见实施例4)的XhoI/ClaI末端连接。通过对从氨苄青霉素抗性转化体中分离的DNA进行限制性内切核酸酶分析，确定所述片段的正确插入。所得到的质粒被命名为pCGP494。

pCGP496(长的petFLS 5′：GUS：petFLS 3′表达框)的构建

通过用限制性内切核酸酶NcoI和SmaI消化，从质粒pJB1(Bodeau，1994，同上)上释放GUS编码序列。纯化所产生的GUS片段，并且与质粒pCGP494的CIaI(修复末端)/NcoI末端连接。通过对从氨苄青霉素抗性转化体中分离的DNA进行限制性内切核酸酶分析，确定所述片段的正确插入。所得到的质粒被命名为pCGP496。

pCGP1506(长的petFLS 5′：GUS：petFLS 3′二元载体)的构 建

首先通过用限制性内切核酸酶XhoI消化，将质粒pCGP496线性化。部分修复突出末端(在修复反应中仅使用dTTP和dCTP)，并且通过用限制性内切核酸酶SacI消化，释放包括长的petFLS5′：GUS：petFLS 3′基因表达框的6.7kb片段。纯化产生的片段，并且与二元载体pBIN19的BamHI(在修复反应中用dGTP和dATP部分修复的末端)/SacI末端连接。通过对从卡那霉素抗性转化体中分离的质粒DNA进行限制性内切核酸酶分析，确定所述片段相对于nos 5′：nptII：nos3′选择标记基因框处于串联方向的正确插入。所得到的质粒被命名为pCGP1506(图19)。

用pCGP1506对植物进行转化

通过农杆菌介导的转化，将包含在二元载体质粒pCGP1506(图19)上的T-DNA导入蔷薇。

二元载体pCGP1626(chrysCHS 5′：GUS：petRT 3′)

质粒pCGP1626(图20)包括嵌合的GUS基因，该基因受来自菊花查耳酮合成酶基因的启动子片段(chrysCHS 5′)和来自矮牵牛3RT基因的终止子片段(petRT 3′)的控制(Brugliera，1994，同上)。嵌合的GUS报道基因框相对于二元载体pWTT2132(DNAP)(图6)的35S 5′：SuRB选择标记基因框处于串联方向。

制备二元载体pCGP1626的中间产物

菊花CHS启动子的分离

用从菊花栽培品种Hero的幼叶材料中分离的基因组DNA制备菊花基因组DNA文库。

采用高严格性条件，用菊花CHS cDNA克隆(SEQ ID NO：28)(包含在质粒pCGP856上)的³²P-标记的片段筛选菊花基因组DNA文库。质粒pCGP856包括从花瓣cDNA文库中分离的CHS的1.5kb cDNA克隆，所述文库是用从菊花栽培品种Dark Pink Pom Pom中分离的RNA制备的。

选择基因组克隆(CHS5)作进一步的分析，并且发现包括位于菊花CHS编码区的推测的起始甲硫氨酸上游的大约3kb序列。

通过用限制性内切核酸酶HindIII消化基因组克隆CHS5，释放4kb的片段。纯化包括菊花CHS启动子的片段，并且与pBluescriptSK(Stratagene，USA)的HindIII末端连接。通过对从氨苄青霉素抗性转化体中分离的DNA进行限制性内切核酸酶分析，确定所述片段的正确插入。所得到的质粒被命名为pCGP1316。

通过PCR扩增位于推测的翻译起始位点上游的2.6kb菊花CHS启动子片段，其中使用pCGP1316作模板，并且使用引物″chrysanCHSATG″(5′-GTTAAGGAAGCCATGGGTGT-3′)(SEQ ID NO：8)和M13反向引物(Stratagene，USA)。引物″chrysanCHSATG″将NcoI限制性内切核酸酶识别序列掺入到推测的翻译起始位点处，以便于克隆。纯化所述PCR片段，并且与pBluescript KS的EcoRV(dT-尾巴)末端连接(Holton和Graham，Nuc.Acids Res.19：1156，1990)。通过对从氨苄青霉素抗性转化体中分离的DNA进行限制性内切核酸酶分析，确定所述片段的正确插入。所得到的质粒被命名为pCGP1620。在pCGP1620上所包含的菊花CHS启动子片段的核苷酸序列如SEQ IDNO：30所示。

pCGP1622(存在于pUC主链上的chrysCHS 5′：GUS：nos 3′) 的构建

通过用限制性内切核酸酶NcoI和PstI消化，从质粒pCGP1620上释放包括菊花CHS启动子的大约2.5kb片段。纯化该片段，并且与pJB1的4.8kbNcoI/PstI片段连接(Bodeau，1994，同上)，该片段包括主链载体以及GUS和nos 3′片段。通过对从氨苄青霉素抗性转化体中分离的DNA进行限制性内切核酸酶分析，确定所述片段的正确插入。所得到的质粒被命名为pCGP 1622。

pCGP1626(存在于二元载体上的chrysCHS 5′：GUS：nos 3′)的 构建

通过用限制性内切核酸酶PstI和Bgl II消化，从质粒pCGP1622上释放包括chrysCHS 5′：GUS：nos 3′框的大约4.6kb片段。纯化该片段，并且与二元载体pWTT2132(DNAP)(图6)的PstI/BamHI末端连接。通过对从四环素抗性转化体中分离的DNA进行限制性内切核酸酶分析，确定所述框相对于35S 5′：SuRB选择标记基因框处于串联方向的正确插入。所得到的质粒被命名为pCGP1626(图20)。

用pCGP1626进行植物转化

通过农杆菌介导的转化，将包含在二元载体质粒pCGP1626(图20)上的T-DNA导入蔷薇。

二元载体pCGP1641(petRT 5′：GUS：petRT 3′)

质粒pCGP1641(图21)包括嵌合的GUS基因，该基因受覆盖推测的3RT翻译起始密码子上游的1.1kb矮牵牛3RT启动子(petRT5′)和覆盖3RT终止密码子下游的2.5kb3RT终止子(petRT3′)的控制。嵌合的GUS框相对于二元载体pWTT2132(DNAP)(图6)的35S5′：SuRB选择标记基因框处于串联方向。

制备二元载体pCGP1641的中间产物

矮牵牛3RT基因的分离

业已披露了相当于矮牵牛Rt基因座的矮牵牛3RT基因的分离，参见Brugliera，1994，同上。

pCGP1625(CaMV 35S：GUS：petRT3′框)的构建

中间质粒pCGP1625包括存在于pUC主链上的CaMV 35S：GUS：petRT 3′框。通过用限制性内切核酸酶BamHI和SacI消化，从质粒pCGP1610(参见Brugliera，1994，同上)上释放包括petRT终止子序列的2.5kb片段。纯化该片段，并且与pJB1(Bodeau，1994，同上)的BglII/SacI 4.9kb片段连接，该片段包括所述载体主链和CaMV35S启动子和GUS片段。通过对从氨苄青霉素抗性转化体中分离的DNA进行限制性内切核酸酶分析，确定所述矮牵牛3RT终止子片段正确插入了CUS片段下游。所得到的质粒被命名为pCGP1625。

pCGP1628(petRT 5′：GUS：pet RT 3′框)的构建

通过用限制性内切核酸酶NocI和PstI消化，从质粒pCGP1611(参见Brugliera，1994，同上)上释放1.1kb petRT启动子片段。将纯化的片段与pCGP1625的7kb片段的NcoI/PstI末端连接，该片段包括所述载体主链和GUS与petRT 3′片段。通过对从氨苄青霉素抗性转化体中分离的DNA进行限制性内切核酸酶分析，确认petRT启动子片段正确插入了GUS片段的上游。所得到的质粒被命名为pCGP1628。

pCGP1641(petRT 5′：GUS：petRT 3′二元载体)的构建

通过用限制性内切核酸酶PstI消化，从pCGP1628上释放包括petRT 5′：GUS：petRT 3′框的5.4kb片段。纯化所述片段，并且与二元载体pWTT2132(DNAP)(图6)的PstI末端连接。通过对从四环素抗性转化体中分离的质粒DNA进行限制性内切核酸酶分析，确定所述片段相对于35S 5′：SuRB选择标记基因框处于串联方向的正确插入。所得到的质粒被命名为pCGP 1641(图21)。

用pCGP1641进行植物转化

通过农杆菌介导的转化，将包含在二元载体质粒pCGP1641(图21)上的T-DNA导入蔷薇。

二元载体pCGP1861(蔷薇CHS 5′：GUS：nos 3′)

质粒pCGP1861(图22)包括嵌合的GUS基因，该基因受来自蔷薇CHS基因的启动子片段(蔷薇CHS 5′)和来自农杆菌nos基因的终止子片段(nos 3′)的控制。嵌合的GUS报道基因相对于二元载体pWTT2132(图6)的35S 5′：SuRB选择标记基因框处于串联方向。

通过用限制性内切核酸酶BglII消化，从pCGP197(参见例4)上释放包括蔷薇CHS 5′：GUS：nos 3′框的大约5kb片段。纯化该片段，并且与二元载体pWTT2132(DNAP)的BamHI末端连接。通过对从四环素抗性转化体中分离的DNA进行限制性内切核酸酶分析，确定所述片段相对于35S 5′：SuRB选择标记基因框处于串联方向的正确插入。所得到的质粒被命名为pCGP1861(图22)。

用pCGP1861进行植物转化

通过农杆菌介导的转化，将包含在二元载体质粒pCGP1861(图22)上的T-DNA导入蔷薇。

二元载体pCGP1953(AmCHS 5′：GUS：petD8 3′)

质粒pCGP1953(图23)包括嵌合的GUS基因，该基因受来自金鱼草CES基因的启动子片段(AmCHS 5′)和矮牵牛PLTP终止子(petD83′)的控制。嵌合的GUS报道基因框相对于二元载体pWTT2132(DNAP)(图6)的35S 5′：SuRB选择标记基因框处于串联方向。

制备二元载体pCGP1953的中间产物

用限制性内切核酸酶NcoI使质粒pJB1(Bodeau，1994，同上)线性化。修复突出末端，并且通过用BamHI消化释放1.8kb的GUS片段。纯化所述GUS片段，并且与pCGP726的5kb XbaI(修复末端)/BamHI片段连接，该片段包括pBlueseript主链载体和AmCHS 5′与petD8 3′片段(参见实施例4)。通过对从氨苄青霉素抗性转化体中分离的质粒DNA进行限制性内切核酸酶分析，确定GUS片段在AmCHS 5′和petD8 3′片段之间的正确插入。所述质粒被命名为pCGP1952。

通过用限制性内切核酸酶EagI和PstI消化，从质粒pCGP1952上释放包括AmCHS  5′：GUS：petD8 3′表达框的3.8kb片段。修复突出末端，并且将纯化的片段与Asp718消化过的pWTT2132二元载体(图6)的修复末端相连接。通过对从四环素抗性转化体中分离的质粒DNA进行限制性内切核酸酶分析，确定所述片段相对于35S5′：SuRB选择标记基因框处于串联方向的正确插入。所述质粒被命名为pCGP1953(图23)。

用pCGP1953进行植物转化

通过农杆菌介导的转化，将包含在二元载体质粒pCGP1953(图23)上的T-DNA导入蔷薇。

二元载体pWTT2084(35S 5′：GUS：ocs 3′)

质粒pWTT2084(DNAP)(图24)包括嵌合的GUS基因，该基因受CaMV 35S启动子(35S 5′)和章鱼碱合成酶终止子(ocs3′)的控制。将来自矮牵牛叶绿素a/b结合蛋白基因(Cab22基因)(Harpster等，1988，同上)的大约60bp的5′非翻译前导序列，插入CaMV 35S启动子片段和GUS克隆之间。嵌合的GUS框相对于二元载体pWTT2084的35S 5′：SuRB选择标记基因框处于串联方向。

用pWTT2084进行植物转化

通过农杆菌介导的转化，将包含在二元载体质粒pWTT2084(图24)上的T-DNA导入蔷薇。

用GUS表达框转化的蔷薇的转基因分析

对从用各种GUS表达框的T-DNA转化的转基因Kardinal蔷薇的发育阶段3-4的花瓣中分离的总RNA进行Northern印迹分析。通过Northern印迹杂交，没有发现转录物的积累或具有预期的1.8kb大小的完整的全长转录物。记录了在蔷薇花瓣中积累的GUS转录物的相对含量(参见表8)。

表8对包括GUS构建体的转基因Kardinal蔷薇花(开放的花芽阶段)进行的Northern分析的概述。

质粒	GUS报导基因	选择标记基因	GUS转录物水平
				pCGP1307	petD8 5′：GUS：petD8 3′	mas 5′：nptII：mas 3′	-
pCGP1506	petFLS 5′：GUS：petFLS 3′	nos  5′：nptII：nos3′	-
				pCGP1626	chrysCHS 5′：GUS：petRT 3′	35S 5′：SuRB	++至+++
pCGP1641	petRT 5′：GUS：petRT 3′	35S 5′：SuRB	-
				pCGP1861	RoseCHS 5′：GUS：nos 3′	35S 5′：SuRB	++++
pCGP1953	AmCHS 5′：GUS：petD8 3′	35S 5′：SuRB	-
				pWTT2084	35S 5′：GUS：ocs 3′	35S 5′：SuRB	+++++

1＝未检测到转录物

+至+++++＝通过Northern印迹分析检测到的全长GUS转录物的相对水平(从低到高)

根据以上结果(表8)，CaMV 35S(35S 5′)和蔷薇CHS(蔷薇CHS5′)启动子，似乎能在蔷薇花瓣中驱动较高水平的转录。菊花CHS启动子(chrysCHS 5′)似乎也能导致高的转录物水平，不过不如用CaMV 35S或蔷薇CHS启动子获得的转录水平高。令人吃惊的是，金鱼草属(金鱼草)CHS(AmCHS 5′)，矮牵牛3RT(petRT 5′)，矮牵牛FLS(petFLS 5′)和矮牵牛PLTP-(petD8 5′)启动子似乎不能在蔷薇花瓣中发挥作用，因为用掺入了所述启动子的表达框没有检测到GUS转录物。不过，以前业已证实了，与petHf1和/或-GUS基因融合的这些相同的启动子，能在康乃馨和矮牵牛中起作用，产生相对较高水平的全长转录物，并且对于petHf1基因来说，产生了翠雀素或翠雀素-型分子色素。用与所述GUS基因融合的金鱼草属CHS启动子(AmCHS5′)获得的结果更令人吃惊，因为来自两个其他物种(蔷薇和菊花)的同源基因的启动子区似乎能在蔷薇中较好地发挥作用。业已将金鱼草CHS启动子成功地应用于与矮牵牛F3′5′H(petHf1)相组合，以便产生新的紫色康乃馨Florigene Moondust(参见国际专利申请号PCT/AU96/00296)。

与GUS基因融合的启动子和终止子片段的评估，还提供了暗示矮牵牛F3′5′H petHf1和petHf2序列在蔷薇中不稳定的其他证据，因为包括与CaMV 35S、-蔷薇CHS和菊花CHS启动子(它们确实在蔷薇中发挥作用)连接的矮牵牛F3′5′H序列的构建体在蔷薇中不能产生完整的矮牵牛F3′5′H petHf1或petHf2转录物(参见表6)。

实施例7

从除了矮牵牛以外的物种中分离F3′5′H序列

由于业已证实了矮牵牛F3′5′H序列能够在诸如康乃馨、矮牵牛和烟草的各种植物中起作用，并最终导致翠雀素-型色素的产生，有理由推测这些序列同样能够在蔷薇中发挥作用。有人假设所述酶活性可能依物种背景而改变，实际上，在导入了矮牵牛F3′5′H的特定物种的栽培品种之间确实有所不同。不过，并未预计到全长的重组矮牵牛F3′5′H mRNA不会积累。对矮牵牛F3′5′H核苷酸序列(petHf1和petHf2)进行分析，没有发现任何可能导致不稳定性和随后的降解的序列(Johnson等，In A look beyondtransemption，ASPP，USA，Bailey-Serres and Gallie，eds，1998)，内含子：外显子剪接结合(Brendel等，In A look beyond transcription，ASPP，USA，Bailey-Serres andGallie，eds，1998)，或在迄今为止的科技文献中报导的任何自我催化性或降解诱发序列(A look beyondtranscription，ASPP，USA，Bailey-Serres andGallie，eds，1998)。上述令人吃惊的结果表明，存在会导致矮牵牛F3′5′H序列不稳定的对蔷薇特异的因子。

由于尚不清楚为什么矮牵牛F3′5′H序列在蔷薇中不稳定，而在康乃馨、矮牵牛或烟草中稳定，从多种科中分离了多种F3′5′H序列，以期确定是否有任何F3′5′H序列在蔷薇中是稳定的，并且随后鉴定出有可能导致稳定的F3′5′H转录物和F3′5′H活性的合成的任何F3′5′H序列，并最终在蔷薇中产生翠雀素-型色素，导致花颜色的改变。

花瓣cDNA文库的构建

从在表9中所披露的各种植物的花芽至开花阶段的花瓣中分离RNA，用这种RNA制备花瓣cDNA文库。Rosa hybrida属于蔷薇科，蔷薇目，蔷薇亚纲，因此，选择出能产生翠雀素-型色素、并且包括功能性F3′5′H、属于蔷薇亚纲的物种。矮牵牛的分类属于茄科，茄目，Asteridae亚纲，并且同样选择出来自Asteridae亚纲的能产生翠雀素-型色素的物种。

表9用于分离制备花瓣cDNA文库的总RNA的花的列表。信息是从截止2003年8月的国家生物技术信息中心(NCBI)网站的Taxonomy浏览器browser(TaxBrowser)中获得的。

花	种	科	目	亚纲
					龙胆	龙胆	龙胆科	龙胆目	Asteridae
薰衣草	薰衣草	唇形科	Lamiales	Asteridae
					鼠尾草	鼠尾草	唇形科	Lamiales	Asteridae
裸柱菊	裸柱菊	Pittosporaceae	Apiales	Asteridae
					kennedia	蝶豆	Fabaceae	Fabales	Rosidae
蝴蝶豆	kennedia spp.	Fabaceae	Fabales	Rosidae
					三色紫罗兰	堇菜	堇菜科	金虎尾目	Rosidae

除非另有说明，使用Turpen和Griffith的方法(Biotechniques4：11-15，1986)，从紫色/蓝色花的花瓣组织中分离总RNA。使用oligotex-dT^TM(Qiagen)或进行三轮oligo-dT纤维素层析(Aviv和Leder，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69：1408，1972)，从总RNA中筛选Poly(A)⁺RNA。

一般地，利用λZAPII/Gigapack II克隆试剂盒(Stratagene，USA)(Short等，Nucl.Aci Res.16：7583-7600，1988)，使用从花瓣中分离的大约5μgpoly(A)⁺RNA作模板，在λZAPII中构建定向花瓣cDNA文库。所获得的重组体的总数总体上在1×10⁵-1×10⁶数量级上。

在转染XL1-Blue MRF′细胞之后，将包装的cDNA混合物以大约每个15cm直径的平板50,000pfu的密度铺平板。在37℃下培养所述平板8小时，并且用100mM NaCl，8mM MgSO₄，50mM Tris-HCl pH8.0，0.01％(w/v)明胶(噬菌体保存缓冲液(PSB))洗脱所述噬菌体(Sambrook等，1989，同上)。添加氯仿，并且将所述噬菌体作为扩增的文库在4℃下保存。

一般地，在转染XL1-Blue MRF′细胞之后，以每个15cm的平板大约100,000pfu的密度，将100,000pfu的扩增的文库铺平板到NZY平板上(Sambrook等，1989，同上)，并且在37℃下培养8小时。在4℃下培养过夜，然后将印迹重复吸印到Colony/PlaqueScreen^TM滤膜(DuPont)上，并且按照生产商推荐的方法处理。

质粒分离

采用生产商披露的方法，将辅助噬菌体R408(Stratagene，USA)用于从扩增的λZAPII或λZAP cDNA文库中切除含有cDNA插入片段的pBluescript噬菌粒。

筛选花瓣cDNA文库

在杂交之前，在65℃下用预洗涤溶液(50mM Tris-HCI pH7.5，1M NaCl，1mM EDTA，0.1％(w/v)肌氨酸)洗涤重复的噬菌体印膜30分钟；然后在65℃下用0.4M氢氧化钠洗涤30分钟，然后在65℃下用0.2M Tris-HCl pH8.0，0.1×SSC，0.1％(w/v)SDS的溶液洗涤30分钟，并且最终用2×SSC，1.0％(w/v)SDS漂洗。

让来自花瓣cDNA文库的膜印迹与pCGP602(图2)的1.6kbBspHI/FspI片段(SEQ ID NO：1)的³²P-标记片段杂交，所述片段中包括矮牵牛F3′5′H petHf1 cDNA克隆(Holton等，1993a，同上)。

杂交条件包括预杂交步骤，该步骤在42℃下，在10％v/v甲酰胺，1MNaCl，10％w/v硫酸葡聚糖，1％w/v SDS中进行至少1小时。然后将³²P-标记的片段(分别为1×10⁶cpm/mL)添加到杂交溶液中，并且在42℃下再进行杂交16小时。然后在42℃下，用2×SSC，1％w/vSDS洗涤所述滤膜2×1小时，并且在-70℃下对Kodak XAR胶片曝光16小时，其中使用增感屏。

将强杂交的噬菌斑挑取到PSB(Sambrook等，1989，同上)中，并且采用所披露的用于初步筛选所述cDNA文库的铺平板和杂交条件再次筛选，以便分离纯化的噬菌斑。回收包含在λZAPII或λZAP细菌噬菌体载体中的质粒，并且从cDNA插入片段的3′和5′末端获得序列数据。根据与矮牵牛F3′5′H petHf1 cDNA克隆的序列相似性，鉴定新的F3′5′H cDNA克隆。

对所分离的cDNA克隆给出如表10所述的质粒命名编号。

表10从各种物种中分离的F3′5′H cDNA克隆的质粒编号和SEQID NO.

物种	克隆	质粒编号	附图编号	SEQ ID NO.
					堇菜	BP#18	pCGP1959	25	9
堇菜	BP#40	pCGP1961	26	11
					鼠尾草	Sal#2	pCGP1995	31	13
鼠尾草	Sal#47	pCGP1999	32	15
					Sollya spp.	Soll#5	pCGP2110	37	17
Kennedia spp.	Kenn#31	pCGP2231	40	26
					蝶豆	BpeaHF2	pBHF2F4	43	20
三花龙胆	Gen#48	pG48	47	22
					Lavandula nil	LBG	pLHF8	51	31

堇菜(三色堇)F3′5′H构建体

从堇菜(三色堇)的花瓣中分离F3′5′H cDNA克隆

按上述方法，从堇菜栽培品种Black Pansy幼芽的花瓣中分离总RNA和poly(A)⁺RNA。利用λZAPII/GigapackII克隆试剂盒(Stratagene，USA)构建花瓣cDNA文库，并且按上述方法筛选。通过与矮牵牛F3′5′H petHf1 cDNA克隆(SEQ BD NO：1)的序列相似性，鉴定两种全长的三色堇F3′5′H cDNA克隆(分别存在于pCGP1959(图25)和pCGP1961(图26)上的BP#18(SEQ ID NO：9)和BP#40(SEQ ID NO：11))。BP#18和BP#40在核苷酸水平上具有82％的相同性。对三色堇F3′5′H克隆(BP#18和BP#40)的核苷酸序列和矮牵牛F3′5′H的核苷酸序列进行比较，发现了与矮牵牛F3′5′H petHf1克隆具有大约60％的相同性，而与矮牵牛F3′5′H petHf2克隆具有62％的相同性。

二元载体pCGP1972和pCGP1973(AmCHS 5′：BP#18或BP#40： petD8 3′)

质粒pCGP1972(图27)和pCGP1973(图28)包括位于A.majus(金鱼草)CHS启动子片段(AmCHS5′)和矮牵牛PLTP终止子片段(petD8 3′)之间的三色堇F3′5′H cDNA克隆(分别为BP#18和BP#40)。嵌合的F3′5′H基因相对于二元载体pWTT2132(DNAP)(图6)的35S5′：SuRB选择标记基因框处于串联方向。

通过最初用限制性内切核酸酶BamHI消化pCGP725，除去存在于pCGP725(参见实施例4)(图7)上的矮牵牛F3′5′H(petHf1)cDNA克隆。修复它的末端，并且用限制性内切核酸酶XbaI进一步消化线性化的质粒。纯化包括所述载体与AmCHS 5′和petD8 3′片段的大约4.9kb片段，并且与分别包括来自pCGP1959或pCGP1961的三色堇F3′5′H BP#18或BP#40 cDNA克隆的大约1.6kb KpnI(修复末端)/XbaI片段连接，分别产生pCGP1970和pCGP1971。然后，通过首先用限制性内切核酸酶NotI消化，从pCGP1970或pCGP1971中分离AmCHS5′：三色堇F3′5′H：petD8 3′框。修复线性化的质粒的末端，然后通过用限制性内切核酸酶EcoRV消化，释放嵌合的F3′5′H基因。然后将纯化的片段与二元载体pWTT2132(DNAP)的Asp718(修复末端)连接。通过对从四环素抗性转化体中分离的质粒DNA进行限制性内切核酸酶分析，确定所述片段的正确插入。所得到的质粒分别被命名为pCGP1972(图27)和pCGP 1973(图28)。

用pCGP1972和1973转化康乃馨和矮牵牛

通过农杆菌介导的转化，将包含在二元载体质粒pCGP1972(图27)和pCGP1973(图28)上的T-DNAs分别导入康乃馨栽培品种Kortina Chanel和Monte Lisa以及矮牵牛栽培品种Skr4×Sw63中。

二元载体pCGP1967和pCGP1969(CaMV 35S：三色堇F3′5′H： ocs3′)

二元载体pCGP1967(图29)和pCGP1969(图30)包括嵌合的CaMV 35S：三色堇F3′5′H：ocs3′基因，该基因相对于二元载体pWTT2132(DNAP)(图6)的35S5′：SuRB选择标记基因框处于串联方向。

制备二元载体pCGP1967和pCGP1969的中间产物

首先通过用限制性内切核酸酶KpnI消化，将质粒pCGP1959(图25)和pCGP1961(图26)线性化，并且修复突出的KpnI末端。通过用限制性内切核酸酶PstI消化，释放三色堇F3′5′H cDNA克隆BP#18和BP#40。将产生的大约1.6kb的片段与pKIWI101(Janssen和Pardner，1989，同上)的大约5.9kb EcoRI(修复末端)/PstI片段连接。通过对从氨苄青霉素抗性转化体中分离的质粒DNA进行限制性内切核酸酶分析，确定每一个片段的正确插入。所得到的质粒被分别命名为pCGP1965和pCGP1966。

首先用限制性内切核酸酶XhoI对质粒pCGP1965和pCGP1966进行部分消化。所得到的片段用限制性内切核酸酶XbaI进一步消化。修复突出末端，分离包括CaMV 35S：三色堇F3′5′H：ocs3′嵌合基因的3.6kb片段，并且与pWTT2132(图6)的Asp718修复末端连接。通过对从四环素抗性转化体中分离的质粒DNA进行限制性内切核酸酶分析，确定每一个片段的正确插入。所得到的质粒分别被命名为pCGP1967(图29)和pCGP1969(图30)。

用pCGP1967和pCGP1969转化蔷薇

通过农杆菌介导的转化，将包含在二元载体质粒pCGP1967(图29)和pCGP1969(图31)上的T-DNAs分别导入Rosa hybrida栽培品种Kardinal和Soft Promise中。通过农杆菌介导的转化，将包含在二元载体质粒pCGP1969(图31)上的T-DNA同样导入Rosa hybrida栽培品种Pamela和Medeo中。

鼠尾草F3′5′H构建体

从鼠尾草的花瓣中分离F3′5′H cDNA克隆

按上述方法，从鼠尾草(从苗圃购买)的花瓣幼芽中分离总RNA和poly(A)⁺RNA。用λZAPII/Gigapack II克隆试剂盒(Stratagene，USA)构建花瓣cDNA文库。通过与矮牵牛F3′5′H petHf1 cDNA克隆的序列相似性，鉴定出两种全长的鼠尾草F3′5′H cDNA克隆(存在于pCGP1995(图31)上的Sal#2(SEQ ID NO：13)和存在于pCGP1999(图32)上的Sal#47(SEQ ID NO：15))。Sal#2和Sal#47在核苷酸水平上具有95％的相同性。将鼠尾草F3′5′H克隆(Sal#2和Sal#47)的核苷酸序列和矮牵牛F3′5′H的核苷酸序列相比较，发现了与矮牵牛F3′5′H petHf1克隆(SEQ ID NO：1)具有大约57％的相同性，而与矮牵牛F3′5′H petHf2克隆(SEQ ID NO：3)具有58％的相同性。

二元载体pCGP2121和pCGP2122

(AmCHS 5′：鼠尾草F3′5′H#2或#47：petD8 3′)

质粒pCGP2121(图33)和pCGP2122(图34)包括位于金鱼草(snapdragon)CHS启动子片段(AmCHS 5′)和矮牵牛PLTP终止子片段(petD8 3′)之间的鼠尾草F3′5′H cDNA克隆(分别为Sal#2和Sal#47)，它相对于二元载体pWTT2132(DNAP)(图6)的35S5′：SuRB选择标记基因框处于串联方向。

通过首先用限制性内切核酸酶BamHI消化pCGP725，除去pCGP725(参见实施例4)(图7)上的矮牵牛F3′5′H(petHf1)cDNA克隆。修复它的末端，并且用限制性内切核酸酶XbaI进一步消化线性化的质粒。纯化包括具有AmCHS5′和petD8 3′片段的载体的大约4.9kb片段，并且分别与来自pCGP1995(图31)的包括鼠尾草F3′5′H#2的大约1.6kb XhoI/BamHI(修复末端)片段或来自pCGP1999(图32)的包括鼠尾草F3′5′H#47的1.6kb XhoI/EcoRI(修复末端)片段连接，以便分别产生pCGP2116和pCGP2117。

首先，通过用限制性内切核酸酶NotI消化，从pCGP2116或pCGP2117中分离AmCHS5′：鼠尾草F3′5′H：petD8 3′框。修复线性化质粒的末端，然后通过用限制性内切核酸酶EcoRV消化，释放嵌合的F3′5′H基因框。然后将大约3.6kb的纯化片段与二元载体pCGP1988(图16)(参见实施例4)的Asp718修复末端连接。通过对从四环素抗性转化体中分离的质粒DNA进行限制性内切核酸酶分析，确定每一个片段的正确插入。所得到的质粒分别被命名为pCGP2121(图33)和pCGP2122(图34)。

用pCGP2121和pCGP2122转化康乃馨和矮牵牛

通过农杆菌介导的转化，将包含在二元载体质粒pCGP2121(图33)和pCGP2122(图34)上的T-DNAs分别导入康乃馨栽培品种Kortina Chanel和Monte Lisa以及矮牵牛栽培品种Skr4×Sw63中。

二元载体pCGP2120和pCGP2119(CaMV 35S：鼠尾草F3′5′H： ocs3′)

二元载体pCGP2120(图35)和pCGP2119(图36)包括嵌合的CaMV 35S：鼠尾草F3′5′H：ocs3′基因框，其与二元载体pCGP1988(图16)的35S5′：SuRB选择标记基因框处于串联方向。

制备二元载体pCGP2120和pCGP2119的中间产物

首先通过用限制性内切核酸酶XhoI消化，使质粒pCGP1995(图31)和pCGP1999(图32)线性化，修复突出的XhoI末端，然后通过用限制性核酸内切酶EcoRI消化，释放鼠尾草F3′5′H cDNA克隆Sal#2或Sal#47。对于pCGP1995来说，用EcoRI进行部分消化。将大约1.7kb的片段与pCGP2105(图17)的CiaI(修复末端)/EcoRI末端连接。通过对从氨苄青霉素抗性转化体中分离的质粒DNA进行限制性内切核酸酶分析，确定每一个片段的正确插入。所得到的质粒分别被命名为pCGP2112和pCGP2111。

用限制性内切核酸酶XhoI和XbaI消化质粒pCGP2112和pCGP2111。修复所得到的突出末端，并且分离包括CaMV 35S：鼠尾草F3′5′H：ocs3′嵌合基因的大约3.6kb片段，与二元载体pCGP1988(参见实施例4)的Asp718修复末端连接。通过对从四环素抗性转化体中分离的质粒DNA进行限制性内切核酸酶分析，确定每一个片段的正确插入。所得到的质粒分别被命名为pCGP2120(图35)和pCGP2119(图36)。

用pCGP2120和pCGP2119转化蔷薇

通过农杆菌介导的转化，将包含在二元载体质粒pCGP2120(图35)和pCGP2119(图36)上的T-DNAs分别导入Rosa hybrida栽培品种Kardinal中。

裸柱菊F3′5′H构建体

从裸柱菊(Sollya spp.)的花瓣中分离F3′5′H cDNA克隆

按上述方法从裸柱菊(从苗圃购买)的花瓣幼芽中分离总RNA和poly(A)⁺RNA。用λZAPII/Gigapack II克隆试剂盒(Stratagene，USA)构建花瓣cDNA文库。通过与矮牵牛F3′5′H petHf1 cDNA克隆的序列相似性，鉴定出一个全长裸柱菊F3′5′H cDNA克隆(存在于pCGP2110(图37)上的Soll#5(SEQ ID NO：17))。将裸柱菊F3′5′H克隆的核苷酸序列与矮牵牛F3′5′H的核苷酸序列进行比较，发现与矮牵牛F3′5′H petHf1克隆(SEQ ID NO：1)具有大约48％的相同性，而与矮牵牛F3′5′H petHf2克隆(SEQ ID NO：3)具有52％的相同性。

二元载体pCGP2130(AmCHS5′：裸柱菊F3′5′H：petD8 3′)

质粒pCGP2130(图38)包括位于金鱼草CHS启动子片段(AmCHS5′)和矮牵牛PLTP终止子片段(pet8 3′)之间的裸柱菊F3′5′H Soll#5cDNA克隆，它相对于二元载体pCGP1998(图16)的35S 5′：SuRB选择标记基因框处于串联方向。

通过首先用限制性内切核酸酶XbaI和BamHI消化pCGP725，除去pCGP725(参见实施例4)(图7)上的矮牵牛F3′5′H(petHf1)cDNA克隆。修复它的末端，并且纯化含有载体和AmCHS5′与petD8 3′片段的大约4.9kb片段，与来自pCGP2110的包括裸柱菊F3′5′H cDNA克隆的大约1.6kb Asp718/PstI片段的修复末端连接，产生pCGP2128。通过限制性内切核酸酶作图，证实裸柱菊F3′5′H片段相对于AmCHS5′和petD8 3′片段处于串联方向。

然后通过首先用限制性内切核酸酶NotI消化，从pCGP2128中分离AmCHS5′：裸柱菊F3′5′H：petD8 3′基因框。修复线性化的质粒的末端，然后通过用限制性内切核酸酶EcoRV消化，释放嵌合的F3′5′H基因。然后将大约3.5kb的纯化片段与二元载体pCGP1998(参见实施例4)(图16)的Asp718(修复末端)连接。通过对从四环素抗性转化体中分离的质粒DNA进行限制性内切核酸酶分析，确定所述片段的正确插入。所得到的质粒被命名为pCGP2130(图38)。

用DCGP2130转化康乃馨和矮牵牛

通过农杆菌介导的转化，将包含在二元载体质粒pCGP2130(图38)上的T-DNA导入康乃馨栽培品种Kortina Chanel和Monte Lisa以及矮牵牛栽培品种Skr4×Sw63中。

二元载体pCGP2131(CaMV 35S：裸柱菊F3′5′H：ocs3′)

二元载体pCGP2131(图39)包括嵌合的CaMV 35S：裸柱菊F3′5′H：ocs 3′基因，它相对于二元载体pCGP1988(图16)的35S 5′：SuRB选择标记基因框处于串联方向。

制备二元载体pCGP2131的中间产物

首先通过用限制性内切核酸酶Asp718消化将质粒pCGP2110线性化。修复突出末端，然后通过用限制性内切核酸酶PstI消化释放裸柱菊F3′5′H cDNA克隆。将大约1.7kb的片段与pCGP2105(图17)的EcoRV/PstI末端连接。通过对从氨苄青霉素抗性转化体中分离的质粒DNA进行限制性内切核酸酶分析，确定所述片段的正确插入。所得到的质粒被命名为pCGP2129。

通过用限制性内切核酸酶Asp718和XbaI消化，释放包括CaMV35S：裸柱菊F3′5′H：ocs3′嵌合基因的3.6kb片段。修复突出末端，并且将纯化的片段与二元载体pCGP1988(图16)的Asp718修复末端连接。通过对从四环素抗性转化体中分离的质粒DNA进行限制性内切核酸酶分析，确定所述片段的正确插入。所得到的质粒被命名为pCGP2131(图39)。

用pCGP2131转化蔷薇

通过农杆菌介导的转化，将包含在二元载体质粒pCGP2131(图39)中的T-DNA导入Rosa hybrida栽培品种Kardinal中。

Kennedia F3′5′H构建体

从Kennedia spp.的花瓣中分离F3′5′H cDNA克隆

按上述方法从Kennedia spp.(从苗圃购买)的花瓣幼芽中分离总RNA和poly(A)⁺RNA。用λZAPII/Gigapack II克隆试剂盒(Stratagene，USA)构建花瓣cDNA文库。通过与矮牵牛F3′5′HpetHf1 cDNA克隆的序列相似性，鉴定出一个全长kennedia F3′5′HcDNA克隆(存在于pCGP2231(图40)中的Kenn#31)(SEQ ID NO：26)。将kennedia F3′5′H克隆的核苷酸序列和矮牵牛F3′5′H的核苷酸序列进行比较，发现与矮牵牛F3′5′H petHf1克隆(SEQ ID NO：1)具有大约64％的相同性，而与矮牵牛F3′5′H petHf2克隆(SEQ ID NO：3)具有60％的相同性。

二元载体pCGP2256(AmCHS5′：kennedia F3′5′H：petD8 3′)

质粒pCGP2256(图41)在金鱼草CHS启动子片段(AmCHS5′)和矮牵牛PLTP终止子片段(petD8 3′)之间包含kennedia F3′5′H(kenn#31)cDNA克隆，它相对于二元载体pCGP1988(图16)的35S5′：SuRB选择标记基因框处于串联方向。

通过首先用限制性内切核酸酶XbaI和BamHI消化pCGP725，除去pCGP725(参见实施例4)(图7)中的矮牵牛F3′5′H(petHf1)cDNA克隆。修复末端，并且纯化包括所述载体和AmCHS5′与petD8 3′片段的大约4.9kb片段，与来自pCGP2231的包括kennedia F3′5′H cDNA克隆的大约1.8kb XhoI/BamHI片段的修复末端连接，产生pCGP2242。通过限制性内切核酸酶作图，证实kennedia F3′5′H片段相对于AmCHS5′和petD8 3′片段处于串联方向的正确插入。

然后通过用限制性内切核酸酶Not I和EcoRI消化，从pCGP2242中分离AmCHS5′：kennedia F3′5′H：petD8 3′框。修复它的末端，并且将大约3.7kb的纯化片段与二元载体pCGP1988(参见实施例4)(图16)的Asp718修复末端连接。通过对从四环素抗性转化体中分离的质粒DNA进行限制性内切核酸酶分析，确定所述片段的正确插入。所得到的质粒被命名为pCGP2256(图41)。

用pCGP2256转化矮牵牛

通过农杆菌介导的转化，将包含在二元载体质粒pCGP2256(图41)上的T-DNA导入矮牵牛栽培品种Skr4×Sw63。

二元载体pCGP2252(CaMV 35S：kennedia F3′5′H：ocs3′)

二元载体pCCP2252(图42)包括嵌合的CaMV 35S：kennediaF3′5′H： ocs3′基因，它相对于二元载体pCGP1988(图16)的35S5′：SuRB选择标记框处于串联方向。

制备二元载体pCGP2252的中间产物

首先通过用限制性内切核酸酶XhoI消化，将质粒pCGP2231线性化。修复突出末端，然后通过用限制性内切核酸酶PstI消化释放kennediaF′3′5′H cDNA克隆。将大约1.7kb的片段与pCGP2105(图17)的ClaI(修复末端)/PstI末端连接。通过对从氨苄青霉素抗性转化体中分离的质粒DNA进行限制性内切核酸酶分析，确定所述片段的正确插入。所得到的质粒被命名为pCGP2236。

通过用限制性内切核酸酶XhoI和NotI消化，从质粒pCGP2236上释放包括CaMV 35S：kennedia F3′5′H：ocs3′嵌合基因框的3.6kb片段。修复突出末端，并且将纯化的片段与二元载体pCGP1988(图16)的Asp718修复末端连接。通过对从四环素抗性转化体中分离的质粒DNA进行限制性内切核酸酶分析，确定所述片段的正确插入。所得到的质粒被命名为pCGP2252(图42)。

用pCGP2252转化蔷薇

通过农杆菌介导的转化，将包含在二元载体质粒pCGF2252(图42)上的T-DNA导入Rosa hybrida栽培品种Kardinal。

蝶豆F3′5′H构建体

从蝶豆的花瓣中分离F3′5′H cDNA克隆

蝶豆花瓣cDNA文库的构建

将蓝色蝶豆品种(蝶豆，种子是由大阪植物园馈赠的)种植在大阪的大田中。按照上述方法从前开花期阶段的新鲜的和有颜色的花瓣中分离总RNA。按照生产商推荐的方法，使用Oligotex(Takara)制备Poly A⁺RNA。使用定向λZAP-cDNA合成试剂盒(Stratagene，USA)，按照生产商的方法，用所述polyA⁺RNA构建蝴蝶豆的花瓣cDNA文库。

在蝴蝶豆cDNA文库中筛选F3′5′H cDNA克隆

按照以前披露的方法(Tanaka等，Plant Cell Physiol.37：711-716，1996)用DIG-标记的矮牵牛F3′5′H petHf1 cDNA克隆筛选蝴蝶豆花瓣cDNA文库。鉴定出了与矮牵牛F3′5′H petHf1具有高度序列相似性的两个cDNA克隆。包括最长的cDNA克隆的质粒被命名为pBHF2，并且对所述cDNA克隆进行测序。对蝴蝶豆F3′5′H克隆和矮牵牛F3′5′H petHf1克隆(SEQ ID NO：2)的推测的氨基酸序列进行比对，发现蝴蝶豆F3′5′H cDNA(包含在pBHF2上)不是全长的cDNA，并且缺少推测的起始密码子的前两个碱基。按照以前披露的方法(Yonekura-Sakakibara等，Plant Cell Physiol.41：495-502，2000)，使用PCR和合成引物5′-GGGATCCAACAATGTTCCTTCTAAGAGAAAAT-3′[SEQ ID NO：25]将这两个碱基和BamHI限制性内切核酸酶识别位点一起添加到所述cDNA克隆上。用限制性内切核酸酶BamHI和PstI消化所得到的片段，并且随后回收大约200bp的DNA片段。将所述DNA片段与经BamHI/EcoRI消化的pBHF2的3.3kb片段连接，以便得到pBHF2F(图43)。对该DNA序列进行证实，以排除在PCR期间产生的错误(SEQ ID NO：20)。对蝴蝶豆F3′5′H克隆(SEQ ID NO：20)的核苷酸序列和矮牵牛F3′5′H的核苷酸序列进行比较，发现与矮牵牛F3′5′H petHf1克隆(SEQ ID NO：1)具有大约59％的相同性，而与矮牵牛F3′5′H petHf2克隆(SEQ IDNO：3)具有62％的相同性。

二元载体pCGP2135(AmCHS5′：蝴蝶豆F3′5′H：petD8 3′)

质粒pCGP2135(图44)包括位于金鱼草CHS启动子片段(AmCHS5′)和矮牵牛PLTP终止子片段(petD8 3′)之间的蝴蝶豆F3′5′H cDNA克隆，它相对于二元载体pCGP1988(图16)的35S 5′：SuRB选择标记基因框处于串联方向。

通过首先用限制性内切核酸酶XbaI和BamHI消化pCGP725，从pCGP725(参见实施例4)(图7)上除去矮牵牛F3′5′H(petHf1)cDNA克隆。修复末端，并且纯化包括载体和AmCHS5′与petD8 3′片段的大约4.9kb片段，与来自pBHF2F(图43)的包括蝴蝶豆F3′5′H cDNA克隆的大约1.6kb XhoI/BamHI片段的修复末端连接，产生pCGP2133。通过限制性内切核酸酶作图证实蝴蝶豆F3′5′H片段相对于AmCHS5′和petD8 3′片段处于串联方向的正确插入。

然后通过首先用限制性内切核酸酶NotI消化，从pCGP2133上分离AmCHS5′：蝴蝶豆F3′5′H：petD83′框。修复线性化的质粒的末端，然后通过用限制性内切核酸酶EcoRV消化，释放嵌合的F3′5′H基因。将大约3.6kb的纯化片段与二元载体pCGP1988(参见实施例4)(图16)的Asp718修复末端连接。通过对从四环素抗性转化体中分离的质粒DNA进行限制性内切核酸酶分析，确定所述片段的正确插入。所得到的质粒被命名为pCGP2135(图44)。

用pCGP2135转化康乃馨和矮牵牛

通过农杆菌介导的转化，将包含在二元载体质粒pCGP2135(图44)上的T-DNA导入康乃馨栽培品种Kortina Chanel和Mote Lisa以及矮牵牛栽培品种Skr4×Sw63。

二元载体pBEBF5(eCaMV 35S：蝴蝶豆F3′5′H：nos3′)

二元载体pBE2113-GUS包括位于pBI121二元载体(Mintsuhara等，1996，同上)上的强化CaMV 35S启动子和nos终止子之间的GUS编码区。用限制性内切核酸酶SacI消化质粒pBE2113-GUS，修复突出末端，并且与SalI接头连接，产生pBE2113-GUSs。将来自pBHF2F的1.8kb BamHI-XhoI片段与经BamHI-SalI消化的pBE2113-GUSs连接，产生pBEBF5(图45)。

用pBEBF5转化蔷薇

通过农杆菌介导的转化，将包含在二元载体质粒pBEBF5(图45)上的T-DNA导入Rosa hybrida栽培品种Lavande。

二元载体p CGP2134(CaMV 35S：蝴蝶豆F3′5′H：ocs3′)

二元载体pCGP2134(图46)包括嵌合的CaMV 35S：蝴蝶豆F3′5′H：ocs3′基因框，它相对于二元载体pCGP 1988(图16)的35S5′：SuRB选择标记基因框处于串联方向。

制备二元载体pCGP2134的中间产物

通过用限制性内切核酸酶XhoI和BamHI消化质粒pBHF2F(图43)，释放蝴蝶豆F3′5′H cDNA克隆。修复突出末端，并且将大约1.7kb的片段与pCGP2105(参见实施例4)(图17)的Pstl(修复末端)/EcoRV末端连接。通过对从氨苄青霉素抗性转化体中分离的质粒DNA进行限制性内切核酸酶分析，确定所述片段的正确插入。所得到的质粒被命名为pCGP2132。

通过用限制性内切核酸酶XhoI和XbaI消化，释放包括CaMV 35S：蝴蝶豆F3′5′H：ocs3′嵌合基因框的大约3.6kb片段。修复突出末端，并且将纯化的片段与二元载体pCGP1988(参见实施例4)(图16)的Asp718修复末端连接。通过对从四环素抗性转化体中分离的质粒DNA进行限制性内切核酸酶分析，确定所述片段的正确插入。所得到的质粒被命名为pCGP2134(图46)。

用pCGP2134转化蔷薇

通过农杆菌介导的转化，将包含在二元载体质粒pCGP2134(图46)中的T-DNA导入Rosa hybrida栽培品种Kardinal。

龙胆F3′5′H构建体

从三花龙胆(龙胆属)的花瓣中分离F3′5′H cDNA克隆

龙胆花瓣cDNA文库的构建和筛选

以前业已披露了编码F3′5′H的龙胆cDNA的分离(Tanaka等，1996，同上)，并且包含在质粒pG48(图47)上。将包含在质粒pG48(图47)上的龙胆F3′5′H克隆的核苷酸序列(Gen#48)(SEQ ID NO：22)与矮牵牛F3′5′H的核苷酸序列进行比较，发现与矮牵牛F3′5′HpetHf1克隆(SEQ ID NO：I)具有大约61％的相同性，而与矮牵牛F3′5′HpetHf2克隆(SEQ ID NO：3)具有64％的相同性。

二元载体pCGP1498(AmCHS 5′：龙胆F3′5′H：petD8 3′)

质粒pCGP1498(图48)包括位于金鱼草CHS启动子片段(AmCHS5′)和矮牵牛PLTP终止子片段(petD8 3′)之间的龙胆F3′5′H(Gen#48)cDNA克隆，它相对于二元载体pWTT2132(图6)的35S5′SuRB选择标记基因框处于串联方向。

通过首先用限制性内切核酸酶XbaI和BamHI消化pCGP725，除去pCGP725(参见实施例4)(图7)上的矮牵牛F3′5′H(petHf1)cDNA克隆。修复末端，纯化包括所述载体和AmCHS5′与petD8 3′片段的大约4.9kb片段，并且与来自pG48(图47)的包括龙胆F3′5′HcDNA克隆的大约1.7kb XhoI/BamHI片段的修复末端连接，产生pCGP1496。通过限制性内切核酸酶作图，证实龙胆F3′5′H片段相对于AmCHS5′和petD8 3′片段处于串联方向的正确插入。

然后通过首先用限制性内切核酸酶NotI消化，从pCGP1496中分离AmCHS5′：龙胆F3′5′H：petD8 3′框。修复线性化质粒的突出末端，然后通过用限制性内切核酸酶EcoRV消化，释放嵌合的F3′5′H基因。将大约3.6kb的纯化片段与二元载体pWTT2132(图6)的Asp718修复末端连接。通过对从四环素抗性转化体中分离的质粒DNA进行限制性内切核酸酶分析，确定所述片段的正确插入。所得到的质粒被命名为pCGP1498(图48)。

用pCGP1498转化康乃馨和矮牵牛

通过农杆菌介导的转化，将包含在二元载体质粒pCGP1498(图48)上的T-DNA导入康乃馨栽培品种Kortina Chanel和Monte Lisa，以及矮牵牛栽培品种Skr4×Sw63。

二元载体pBEGHF48(eCaMV 35S：：龙胆F3′5′H：nos3′)

通过用限制性内切核酸酶BamHI和XhoI消化质粒pG48，释放龙胆F3′5′H cDNA克隆。分离所得到的大约1.7kb DNA片段，并且与BamHI/SalI消化过的pBE2113-GUSs(Mitsuhara等，1996，同上)连接，产生pBEGHF48(图49)。

用pBEGHF48转化蔷薇

通过农杆菌介导的转化，将包含在二元载体质粒pBEGHF48(图49)上的T-DNA导入Rosa hydrida栽培品种Lavande。

二元载体pCGP1982(CaMV 35S：龙胆F3′5′H：ocs3′)

二元载体pCGP1982(图50)包括嵌合的CaMV 35S：龙胆F3′5′H：ocs3′基因框，它相对于二元载体pWTT2132(图6)的35S 5′SuRB选择标记基因框处于串联方向。

制备二元载体pCGP1982的中间产物

通过用限制性内切核酸酶Asp718消化，使质粒pG48(图47)线性化。修复突出末端，然后通过用限制性内切核酸酶BamHI消化，释放龙胆F3′5′H cDNA克隆(Gen#48)。将大约1.7kb的片段与pKIWI101(Janssen和Gardner，1989，同上)的5.95kb EcoRI(修复末端)/BamHI片段连接。通过对从氨苄青霉素抗性转化体中分离的质粒DNA进行限制性内切核酸酶分析，确定所述片段的正确插入。所得到的质粒被命名为pCGP1981。

通过用限制性内切核酸酶XhoI和XbaI消化质粒pCGP1981，释放包括CaMV 35S：龙胆F3′5′H：ocs3′嵌合基因框的大约3.6kb片段。修复突出末端，并且将纯化的片段与经Asp718消化的二元载体pWTT2132的修复末端连接。通过对从四环素抗性转化体中分离的质粒DNA进行限制性内切核酸酶分析，确定所述片段的正确插入。所得到的质粒被命名为pCGP1982(图50)。

用pCGP1982转化蔷薇

通过农杆菌介导的转化，将包含在二元载体质粒pCGP1982(图50)上的T-DNA导入Rosa hybrida栽培品种Kardinal。

薰衣草F3′5′H构建体

从Lavandula nil(薰衣草)的花瓣中分离F3′5′H cDNA克隆

薰衣草花瓣cDNA文库的构建

紫色品种的Lavandula nil的切花是从养花人那里购买的。按上述方法从新鲜的和有颜色的花瓣中分离总RNA。按照生产商推荐的方法，使用Oligotex(Takara)制备PolyA⁺RNA。使用定向λZAP-cDNA试剂盒(Stratagene，USA)，按照生产商的方法，用polyA⁺RNA构建薰衣草的花瓣cDNA文库。

筛选薰衣草cDNA文库中的F3′5′H cDNA克隆

按以前披露的方法(Tanaka等，1996，同上)，用DIG标记的矮牵牛F3′5′H petHf1 cDNA克隆筛选薰衣草花瓣cDNA文库。鉴定出一个与矮牵牛F3′5′H petHf1具有高度相似性的cDNA克隆(LBG)，并且将质粒命名为pLHF8(图51)。将薰衣草F3′5′H(LBG)cDNA克隆的核苷酸序列命名为SEQ ID NO：31。

将薰衣草F3′5′H克隆的核苷酸序列与矮牵牛F3′5′H cDNA克隆的核苷酸序列进行比较，发现与矮牵牛F3′5′H petHf1克隆(SEQ IDNO：1)具有大约59％的相同性，而与矮牵牛petHf2克隆(SEQ ID NO：3)具有60％的相同性。

二元载体pBELF8(eCaMV 35S：薰衣草F3′5′H：nos3′)

用限制性内切核酸酶BamHI和XhoI消化pLHF8(图51)质粒，以便释放大约为1.8kb的DNA片段。然后将该来自pLHF 8的大约1.8kb纯化片段与质粒pBE2113-GUSs(参见上文)的BamHI-SalI消化末端连接，产生pBELF8(图52)。

用pBELF8转化蔷薇

通过农杆菌介导的转化，将包含在二元载体质粒pBELF8(图52)上的T-DNA导入Rosa hybrida栽培品种Lavande。

实施例8

转基因康乃馨、矮牵牛和蔷薇的分析

使在实施例7中所披露的实验中生产的转基因植物生长到开花。采集花，并且使用皇家园艺协会比色卡(RHSCC)对花瓣的颜色进行编码。提取花色素苷并且通过分光光度法、TLC和/或HPLC分析，进行花色素分析。总RNA同样是从花发育的合适阶段的花瓣组织中分离的，并且利用Northern印迹，分析检测F3′5′H转基因的转录物。所述转基因分析结果归纳在表11、12和13中。

康乃馨

评估在实施例7中披露的F3′5′H基因导致在康乃馨花瓣中产生翠雀素-型色素分子的能力。将两种康乃馨栽培品种Kortina Chanel(KC)和Monte Lisa(ML)用于转化实验。康乃馨栽培品种KortinaChanel能产生粉色花，它通常积累花青素-型花色素苷。因此，这种栽培品种包括康乃馨F3′H和DFR活性，导入的F3′5′H需要竞争底物。康乃馨栽培品种Monte Lisa能产生砖红色花，它通常积累花葵素-型花色素苷。这种栽培品种被认为缺乏完全有功能的F3′5′H活性，且包括DFR，它能够对DHK发生作用，并因此导入的F3′5′H仅需与内源DFR竞争底物。

表11对来自用包括F3′5′H基因表达框(AmCHS5′：F3′5′H：petD83′)的T-DNAs转化的康乃馨的花瓣进行转基因分析的结果。

F3′5′H	pCGP	cv.	#tg	TLC+	HPLC+	最高％del	平均％del	Northern+
									鼠尾草#2	2121	KC	22	2/16	3/4	12.5％	7％	nd
ML	21	17/18	9/9	76％	57％	14/15
							鼠尾草#47	2122			KC	23	6/12	8/8	29％	12％	nd
ML	25	21/22	17/17	88％	56％	12/14
									裸柱菊	2130	KC	30	22/27	17/17	35％	11％	nd
ML	23	14/15	14/14	76％	49％	13/14
							蝴蝶豆	2135			KC	22	0/16	0/1	nd	nd	nd
ML	24	19/20	13/13	23％	10％	14/14
									龙胆	1498	KC	22	0/14	nd	nd	nd	7/8
ML	2	2/2	1/1	nd	nd	1/2
							三色堇BP#18	1972			KC	26	18/20	12/12	14％	9％	19/19
ML	21	15/16	8/8	80％	66％	14/16
									三色堇BP#40	1973	KC	26	11/15	7/8	18％	8％	13/17
ML	33	19/22	20/20	72％	52％	12/15
							矮牵牛petHf1	1452			KC	104	41/64	nd	3.5％	1.3％	15/17
ML	48	39/41	26/26	75％	30％	12/13
									矮牵牛petHf2	1524	ML	27	18/19	17/17	81％	41％	12/14

F3′5′H＝包含在T-DNA上的F3′5′H序列

pCGP＝用于转化实验的二元载体的质粒pCGP编号

cv.＝栽培品种

KC＝康乃馨栽培品种Kortina Chanel(花青素品系)

ML＝康乃馨栽培品种Monte Lisa(花葵素品系)

#tg＝所产生的转基因株的总数

TLC+＝在分析的个体总数中，在花瓣中检测到翠雀素或翠雀素-型分子(通过TLC确定)的单个事件的数量

HPLC+＝在分析的个体事件的总数中，在花瓣中检测到翠雀素或翠雀素-型分子(通过HPLC确定)的单个事件的数量

最高％del＝在转基因事件群体的花瓣中检测到翠雀素或翠雀素-型分子的最高％

平均％del＝在转基因事件群体的花瓣中检测到翠雀素或翠雀素-型分子的平均％

Nothern＝在分析过的事件的总数量中，通过Northern印迹分析在从花瓣中分离的总RNA中检测到特异的完整F3’5’H转录物的个体事件数量

nd＝未进行测定

以上结果表明，评估的所有F3’5’H序列(矮牵牛petHf1，矮牵牛petHf2，鼠尾草Sal#2，鼠尾草Sal#47，裸柱菊属Sol#5，蝶豆BpeaHF2，三色堇BP#18，三色堇BP#40和龙胆Gen#48)在康乃馨中是稳定的，并且导致了在康乃馨花中产生新型翠雀素-型色素。通过Northern印迹分析，在从转基因康乃馨的花瓣中分离的总RNA中检测每一种F3’5’H的完整转录物。

矮牵牛

评估实施例7所述F3’5’H基因导致在矮牵牛花瓣中产生翠雀素-型色素的能力。将Hf1和Hf2纯合隐性的矮牵牛F1杂种Skr4×SW63用于转化实验。尽管Skr4×SW63对于Hf1和Hf2是纯合隐性的，这些突变不会完全阻断内源F3’5’H的产生(参见美国专利号5,349,125)，并且产生了低水平的花葵素，使花瓣分支具有浅紫色。花葵素是3′5’-羟基化的翠雀素或翠雀素-型分子的甲基化衍生物(图1A和1B)。将分光光度法分析用来衡量在来自转基因矮牵牛花的花瓣中积累的总花色素苷。将检测到的较高水平的花色素苷和/或颜色的改变用作评估的F3’5’H基因的效力的指标。

表12对来自用包括F3’5’H基因表达框(AmCHS5′：F3′5′H：petD8 3’)的T-DNAs转化的矮牵牛栽培品种Skr4×SW63植物的花瓣进行转基因分析的结果。

F3′5′H	pCGP	#tg	TLC+	Col	↑A/c	最佳	Av.	Northern+	最佳颜色
										对照	na	na	na	na	na	144-250		0	75C
Gentian#48	1498	22	3/5	18/20	nd			6/6	72B/78A
										蝴蝶豆	2135	24	18/20	22/24	23/24	4427	2397	nd	74A/78A
Kennedia	2256	24	22/24	22/24	22/24	4212	2592	nd	74A/78A
										鼠尾草#2	2121	24	21/24	21/24	21/24	2471	1730	nd	78A
鼠尾草#47	2122	19	17/19	16/19	16/19	2634	1755	nd	78A/80A
										裸柱菊#5	2130	22	14/16	13/16	13/16	3446	1565	nd	78A
三色堇BP#18	1972	22	nd	20/22	nd	nd	nd	9/9	74A/B
										三色堇BP#40	1973	19	8/8	18/19	18/20	2583	1556	nd	74/78A
矮牵牛petHf1	484	16	nd	9/16	8/15	2683	1250	nd	74A/B
										矮牵牛petHf2	1524	20	nd	18/20	8/8	4578	2357	8/8	74A/B

F3′5′H＝包含在T-DNA上的F3′5′H

pCGP＝用于转化实验的二元载体的质粒pCGP编号

#tg＝所产生的转基因株的总数

TLC+＝在分析的各体事件总数中，在花中检测到花葵素(通过TLC测定)的个体事件的数量(高于Skr4×SW63背景的水平)

Col＝在检查的总数量中，与对照相比，产生具有花色改变了的花的个体事件的数量

↑Ac＝在分析的个体事件的总数量中，通过分光光度法分析粗提取物测定的在花瓣中具有较高含量花色素苷的个体事件的数量(以微摩尔/克计)

最佳＝通过对来自个体事件的花的粗制提取物进行分光光度法分析测定的最高花色素苷含量(以微摩尔/克计)

AV＝通过对来自所分析的转基因花群体的花的粗制提取物进行分光光度法分析测定的花色素苷的平均含量(以微摩尔/克计)

Nothern＝通过Northern印迹分析，在从分析的事件总数中的花瓣中分离的总RNA中检测到特异的完整F3’5’H转录物的个体事件的数量。

最佳花色＝对于转基因群体记录到的最明显的颜色改变

nd＝未进行测定

na＝不可用

将F3′5′H基因表达框导入Skr4×SW63导致了从浅紫色到紫色的明显的花色改变，使花瓣中花葵素的产量显著提高。

以上结果表明，实验过的所有F3′5′H序列(矮牵牛petHf1，矮牵牛petHf2，鼠尾草Sal#2，鼠尾草Sal#47，裸柱菊属Sol#5，蝶豆BpeaHF2，三色堇BP#18，三色堇BP#40，龙胆Gen#48，KennediaKenn#31)在矮牵牛花瓣中都是稳定的，并且在Skr4×SW63矮牵牛品系中弥补了HF1或HF2突变，导致花葵素积累水平显著提高，同时伴随着颜色的改变。

蔷薇

评估实施例7所披露的F3′5′H基因导致在蔷薇花瓣中产生翠雀素-型色素的能力。将选择的三种蔷薇栽培品种Kardinal(Kard)，Soft Promise(SP)或Lavande(Lav)用于转化实验。蔷薇栽培品种Kardinal能产生红色花，它通常积累花青素-型花色素苷。因此这种栽培品种包括蔷薇F3′H和DFR活性，导入的F3′5′H需要竞争底物。蔷薇栽培品种Lavande能产生浅红色花，这种花通常积累花青素-型花色素苷。因此，这种栽培品种包括功能性蔷薇F3′H和DFR活性，导入的F3′5′H需要竞争底物。蔷薇栽培品种Soft Promise能产生杏黄色花，它通常积累花葵素。这种栽培品种被认为缺乏完全有功能的蔷薇F3′H活性，并且包括能够对DHK起作用的DER，因此，导入的F3′5′H只需要与内源蔷薇DFR竞争底物。

表13来自用含有F3′5′H基因表达框(CaMY 35S：F3′5′H：ocs3′)的T-DNA转化的蔷薇花瓣的转基因分析结果

F3′5′H	质粒	Cult	#tg	TLC+	HPLC+	最高％del	平均％del	Northern+
									鼠尾草2	pCGP2120	Kard	30	18/20	21/21	12％	5％	18/18
鼠尾草47	pCGP2119	Kard	22	11/16	9/9	7.1％	2％	12/15
									裸柱菊	pCGP2131	Kard	27	0/23	2/2	1％	0.5％	6/6
蝴蝶豆	pCGP2134	Kard	29	0/15	nd	na	na	0/9
									pBEBF5	Lav	25	nd	0/25	0％	0％	nd
	龙胆	pCGP1482	Kard	27	0/23	nd	na	na									0/23
pBEGHF48									Lav	23	nd	0/23	0％	0％	0/23
		三色堇BP18	pCGP1967	Kard	56	30/33	33/34	58％								12％	21/21
SP	36								21/24	18/18	65％	35％	16/21
				三色堇BP40	pCGP1969	Kard	22	15/15						15/15	24％	9％	16/16
SP	37	17/17	16/17						80％	54％	11/13
						矮牵牛petHf1	pCGP1638	Kard				22	0/21	nd	na	na	0/16
pCGP1392	Lav	34	nd	0/34	0％				0％	nd
							矮牵牛petHf2	pCGP2123			Kard	41	0/26	nd	na	na	0/10
薰衣草	pBELF8	Lav	28	nd	4/28	4％			3.5％	nd

F3′5′H＝包含在T-DNA上的F3′5′H序列

质粒＝用于转化实验的二元载体的质粒编号

Cult＝Rosa hydrida栽培品种

Kard＝Kardinal

SP＝Soft Promise

Lav＝Lavande

#tg＝产生的独立转基因事件的数量

TLC+＝在分析的个体事件总数中，在花瓣中积累了可检测的翠雀素或翠雀素-型分子(通过TLC确定)的个体事件数量

HPLC+＝在分析的个体事件总数中，在花瓣中积累了可检测的翠雀素或翠雀素-型分子(通过HPLC确定)的个体事件数量

Nothern＝在分析的事件总数中，通过Northern印迹分析在从花瓣中分离的总RNA中检测到特异的完整F3’5’H转录物的个体事件的数量

nd＝未进行测定

结果令人吃惊的表明，并非所有评估的F3′5′H序列(矮牵牛petHf1，矮牵牛petHf2，鼠尾草Sal#2，Sal#47，裸柱菊属Sol#5，蝴蝶豆BpeaHF2，三色堇BP#18，三色堇BP#40，龙胆Gen#48，Kennedia Kenn#31和薰衣草LBG)都能在蔷薇中发挥作用。实际上，从蝶豆(蝴蝶豆)、三花龙胆(龙胆)和矮牵牛(矮牵牛)中所导入的分离的F3′5′H序列的转录物都不能在蔷薇花瓣中积累。只有来自三色堇，鼠尾草，kennedia，裸柱菊属和薰衣草的F3′5′H能够在蔷薇花瓣中积累。不过，尽管Kennedia F3′5′H转录物确实在蔷薇花瓣中积累，但并没有所述酶的积累，或所产生的酶是没有活性的或不能够与内源蔷薇F3′5′H和DFR酶竞争，以产生翠雀素或翠雀素-型分子色素。的F3′5′H序列中，只有来自鼠尾草(Sal#2和Sal#47)，堇菜(BP#18和BP#40)，裸柱菊(Soll#5)和Lavandula nil(LBG)的cDNA克隆的F3′5′H序列导致了在蔷薇花瓣中产生翠雀素或翠雀素-型分子型色素。根据在蔷薇花瓣中产生的翠雀素或翠雀素-型分子的相对百分比，发现来自三色堇(BP#18和BP#40)的F3′5′H序列在蔷薇花瓣中产生翠雀素或翠雀素-型分子方面是所评估的序列中最有效的。

将堇菜F3′5′H序列导入Rosa hybrida栽培品种Medeo和Pamela

正如在前言部分所披露的，与其他类黄酮的共同着色、进一步修饰了花色素分子以及液泡的pH会对由花色素苷产生的颜色产生影响。因此，选择具有较高含量的黄酮醇和较高液泡pH的蔷薇栽培品种，可通过产生翠雀素或翠雀素-型分子色素而产生颜色更蓝的花色。

蔷薇栽培品种Medeo通常能产生乳白色至浅杏黄色花(RHSCC158C-159A)。对在Medeo蔷薇花瓣中花色素和黄酮醇积累的HPLC分析，发现所述花瓣能积累高含量的黄酮醇(2.32mg/g堪非醇，0.03mg/g栎皮酮)以及非常低含量的花色素苷(0.004mg/g花青素，0.004mg/g花葵素)。Medeo花瓣的估计的液泡pH为大约4.6。

蔷薇栽培品种Pamela能产生白色至非常浅的粉色花。它同样能积累低含量的花色素苷和较高含量的黄酮醇。

同样将在整合了三色堇F3′5′H克隆BP#40的构建体pCGP1969(图30)上的T-DNA导入蔷薇栽培品种Medeo和Pamela，在所述蔷薇中产生超过90％翠雀素或翠雀素-型分子，并且导致了显著的颜色改变和新型花色。在转基因Medeo花中的最明显的颜色改变是RHSCC70b，70c，80c，186b的紫红色/紫色。在转基因Pamela花中最明显的颜色改变是RHSCC 71c，60c，71a，80b的紫红色/紫色。

总之，在将业已证实在矮牵牛和康乃馨中具有功能的基因序列导入蔷薇时，揭示了两种出乎预料的发现。

首先，已在康乃馨中产生新的颜色、并且还证实能导致在矮牵牛中合成有功能的酶的矮牵牛F3′5′H petHf1(和petHf2)序列，不能在蔷薇花瓣中导致全长的(或完整的)转录物积累(可以通过Northern印迹分析检测到)。实际上，没有全长的或完整的转录物的积累，或被检测的转录物被降解了，并且在RNA印迹上以低分子量(或快速移动)的模糊形式出现，表明存在低分子量的异源杂交RNA。因此，为了寻找有可能在蔷薇中积累并且产生有功能的酶的F3′5′H序列，分离了多种F3′5′H序列。同样不清楚哪一种序列能在蔷薇花瓣中产生活性酶。测试了所分离的所有F3′5′H序列在香石竹和/或矮牵牛中的功能性，它们都能导致完整的转录物的积累，并且产生了有功能的F3′5′H活性。不过，只有来自三色堇(BP#18和BP#40)，鼠尾草(Sal#2和Sal#47)，裸柱菊属(Soll#5)，kennedia(Kenn#31)和薰衣草(LBG)的F3′5′H序列导致了完整的全长转录物的积累，并且只有来自三色堇(BP#18和BP#40)，鼠尾草(Sal#2和Sal#47)，裸柱菊属(Soll#5)和薰衣草(LBG)的序列导致了在蔷薇中产生有功能的酶(通过翠雀素或翠雀素-型分子的合成测定)。

其次，不了解哪一种启动子在蔷薇中是有效的。业已实验并且证实能在康乃馨和矮牵牛花中起作用的启动子框不能导致在蔷薇花瓣中积累可检测的转录物。在蔷薇中实验的启动子中，只有CaMV 35S，蔷薇CHS 5′，ChrysCHS 5′，mas 5′和nos 5′启动子在蔷薇花瓣中导致了完整的和可检测的GUS或nptII或SuRB转录物的积累。

表14表示在矮牵牛、康乃馨和蔷薇中评估来自各种物种的F3′5′H序列时获得的结果的概述

表14 F3′5′H序列在矮牵牛、康乃馨和蔷薇中的有效性的概述

F3′5′H	矮牵牛		香石竹		蔷薇
							Mal	RNA	Del	RNA	Del	RNA
	Kennedia(Kenn#31)	+	nd	nd	nd	-							+
龙胆(Gen#48)							+	+	+	+	-	-
	鼠尾草(Sal#2)	+	nd	+	+	+							+
鼠尾草(Sal#7)							+	nd	+	+	+	+
	Sollya(Sol#5)	+	nd	+	+	+							+
蝴蝶豆(BpeaHF2)							+	nd	+	+	-	-
	三色堇(BP#18)	+	+	+	+	+							+
三色堇(BP#40)							+	nd	+	+	+	+
	矮牵牛(petHf1)	+	+	+	+	-							-
矮牵牛(petHf2)							+	+	+	+	-	-
	薰衣草(LBG)	nd	nd	nd	nd	nd							+

nd＝未进行测定

Mal＝通过TLC分析在花瓣中检测到的花葵素

Del＝通过TLC或HPLC分析在花瓣中检测到的翠雀素或翠雀素-型分子

+＝是

-＝否

例9

三色堇F3′5′H序列在除了蔷薇之外的物种中的应用

大丁草

从上面的实施例中可以清楚地看出，三色堇F3′5′H序列，BP#18和BP#40在蔷薇和康乃馨中产生了有功能的F3′5′H活性，并且导致了高水平翠雀素或翠雀素-型分子的产生。

通过农杆菌介导的转化，将来自包括嵌合的CaMV35S：三色堇BP#40 F3′5′H：ocs3′基因表达框的二元构建体pCGP1969(参见实施例8)(图30)的T-DNA导入大丁草栽培品种Boogie，以便检测三色堇F3′5′H序列在大丁草中的功能性。

在迄今为止所生产的六个事件中，一个(#23407)产生了与对照花色(RHSCC38a，38c)相比具有显著颜色改变的花(RHSCC 70c)。

通过TLC检测发现，转基因大丁草的花瓣颜色改变与翠雀素或翠雀素-型分子的存在相关。

其他物种

为了在正常情况下不能产生翠雀素或翠雀素-型分子色素并且不包括含有F3′5′H基因(例如，但不局限于嵌合的堇菜和/或鼠尾草和/或裸柱菊和/或薰衣草和/或Kennedia spp.F3′5′H基因)的类黄酮3′5′-羟化酶构建体的植物中产生翠雀素或翠雀素-型分子色素，将其导入正常情况下不能产生翠雀素-型色素的物种。所述植物可以包括，但不局限于康乃馨，菊花，大丁草，兰花(orchids)，大戟属植物，秋海棠属和苹果。

实施例10

在矮牵牛，康乃馨和蔷薇中评估的F3′5′H序列的表征

简单地讲，真核生物中的基因调控是通过多种因素促进的，这些因素与靠近和远离编码特定多肽的核苷酸序列的多种序列相互作用。用于导入植物以便产生一种或多种性状的工程化表达盒是基于对真核生物总体的、以及在特定场合下对特定植物的基因调控的理解。重要因素包括一系列转录调控序列，通常包括，但不局限于位于转录起始位点上游或5′端的序列。所述元件通常被描述为增强子和启动子，后者靠近转录起始位点。紧靠转录起始位点下游或3′端的是转录的DNA的可变区，该区被称为5′非翻译区(5′utr)，它在转录物稳定性和翻译效率方面发挥作用。所述序列在通过工程方法整合到表达框上之后，通常是嵌合的，并且可能源于天然存在的靠近编码序列和/或靠近特定启动子序列的序列。编码序列(有时候被内含子中断)位于5′utr的3′端，随后是对转录物(mRNA)稳定性和翻译效率重要的3′utr。位于编码区3′端的序列以及位于3′utr本身3′端的序列被称为终止子序列。所有这些因子组成了表达框。在对启动子或其他元件进行直接比较时，重要的是保持表达框的其余元件的一致性。因此，在比较各种F3′5′H序列的效力时，可以将导致不稳定和随后的工程化mRNA的自我降解、继而三羟基化产物(翠雀素或翠雀素-型分子衍生物)的缺乏的序列局限在编码F3′5′H的区域，而与所述表达框中的其他元件，如5′utr和/或3′utr序列无关。

为了鉴定导致了在从蔷薇花中分离的总RNA中检测到全长的转录物、并最终产生了翠雀素或翠雀素-型分子的F3′5′H序列之间的基序或相似性，对多种参数进行了比较。其中包括在核酸和氨基酸水平的序列相同性，序列比对，系统分类，存在于序列上的A或T核苷酸的百分比，在第三个位置上具有A或T的密码子的％等。

系统分类

检查了从中分离F3′5′H序列的每一个物种的分类(表15)。在亚纲分类和F3′5′H序列是否导致了完整的转录产物以及随后在蔷薇中产生翠雀素或翠雀素型分子之间似乎没有明显的联系。

表15：用于分离F3′5′H序列的物种的系统分类，以及所述序列的使用是否在蔷薇花瓣中产生了可以通过RNA印迹分析检测的完整的转录物

花	种	科	目	亚纲	完整的转录物	蔷薇花瓣中的翠雀素
							龙胆属	灌龙胆	龙胆科	Ggentianales	Asteridae	否	否
薰衣草属	Lavandulanil	Lamiaccae	Lamiales	Asteridae	是	是
							鼠尾草属	鼠尾草	Lamiaccae	Lamiales	Asteridae	是	是
裸柱菊尾	裸柱菊	Pittosporaceae	Apiales	Asteridae	是	是
							矮牵牛	矮牵牛	茄科	Solanales	Asteridae	否	否
							kennedia	Kennediaspp.	豆科	Fabales	Rosidae	是	否
蝴蝶豆	蝶豆	豆科	Fabales	Rosidae	否	否
							三色堇	堇菜	Violaceae	Malpighiales	Rosidae	是	是
蔷薇	Rosahybrida	Rosaciae	Rosales	Rosidae	na	na

完整的转录物＝通过Northern印迹分析，在从来自转基因蔷薇的花瓣中分离的总RNA中检测到全长的F3′5′H mRNA

F3′5′H核苷酸序列的比较

使用MacVector^TM version 6.5.3应用程序(Oxford MolecularLtd.，England)(表16)中的ClustaIW程序(Thompson等，1994，同上)确定评估的每一种F3′5′H序列之间的核苷酸序列相同性。在导致在从蔷薇花瓣中分离的RNA中检测到完整的全长转录物的F3′5′H序列与那些不能产生这种结果的序列之间没有显著差别。

表16：从各种物种中分离的F3′5′H的核苷酸序列之间的核酸序列相同性的百分比。在导致从蔷薇花瓣中分离的RNA中检测到完整的转录物的F3′5′H序列下面有划线并且用斜体表示。

	BP18	BP40	Lav	SalA7	Sal2	Soll	Kenn	Bpea	Gent	PetHf1	PetHf2
												BP18	100	82	60	61	62	51	60	62	62	59	62
BP40		100	60	57	58	50	59	62	58	60	62
												Lav			100	68	68	48	57	57	58	59	60
Sal47				100	95	48	56	57	59	57	58
												Sal2					100	49	57	58	60	57	59
Soll						100	48	50	50	48	51
												Kenn							100	70	56	64	60
Bpea								100	59	59	62
												Gent									100	61	64
PetHf1										100	84
												PetHf2											100

F3′5′H翻译核苷酸序列的比较

还利用MacVector^TM version6.5.3应用程序(Oxford MolecularLtd.，England)中的ClustalW程序(Thompson等，1994，同上)测定了评估的每一种F3′5′H序列之间的翻译的核苷酸序列相同性和相似性(表17)。在导致从蔷薇花瓣中分离的RNA中检测到完整的全长转录物的F3′5′H序列与那些不产生这种效果的序列之间没有显著差别。

表17：从各种物种中分离的F3′5′H序列之间的氨基酸序列相同性和相似性百分比(用括号表示)。在导致从蔷薇花瓣中分离的RNA中检测到完整的转录物的F3′5′H序列下面有划线并且用斜体表示。

	BP18	BP40	Lav	Sal47	Sal2	Soll	Kenn	Bpea	Gent	PetHf1	PetHf2
												BP18	100	91(94)	65(77)	65(76)	65(76)	44(63)	69(83)	64(75)	69(80)	74(85)	74(85)
BP40		100	67(89)	66(77)	66(77)	46(64)	69(82)	64(75)	68(79)	74(85)	75(86)
												Lav			100	75(86)	75(86)	45(63)	63(79)	59(74)	66(80)	68(82)	69(83)
Sal47				100	98	45(65)	64(78)	60(72)	64(76)	68(79)	69(81)
												Sal2					100	45(65)	64(78)	60(72)	63(75)	68(79)	69(81)
Soll						100	46(66)	41(61)	44(62)	46(67)	46(66)
												Kenn							100	72(80)	65(75)	71(83)	72(83)
Bpea								100	69(81)	65(75)	65(74)
												Gent									100	73(82)	73(82)
PetHf1										100	93(95)
												PerHf2											100

在F3′5′H DNA序列中核苷酸A或T的百分比

存在某些证据暗示对密码子的选择将影响翻译和mRNA降解的速度。某些密码子的使用不如其他密码子频繁，并且，这可能与同功受体tRNAs的丰度相关。相当于罕见密码子的转移RNAs在大肠杆菌和酵母中的丰度比相当于优选密码子的tRNAs低(van Hoof and Green，Plant Molecular Biology，35：383-387，1997)。改变密码子用法和使基因更“像植物”的例子是细菌B.t.毒素基因(参见Diehu等的综述，Genet engin，18：83-99，1996)和水母gfp基因(Haseloff等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94：2122-2127，1997)。不过，正如在van Hoof和Green，(1997)(同上)的文章中所评论的，消除罕见密码子在B.t.基因中的效果将提高GC含量，从而消除了富AU序列(该序列可能与内含子和聚腺苷酸化位点的不正确识别有关)以及除去不稳定性决定子。水母gfp基因中密码子用法的改变还导致了隐秘内含子的消除(Haseloff等，1996，同上)。检查密码子用法效果和不稳定性因子的研究通常局限于从不同界的物种中分离的基因之间的差别，即细菌与酵母与动物与植物。在植物界中，业已在单子叶植物和双子叶植物之间观察到了差别。对转基因植物的研究业已表明了，用于驱动基因在双子叶植物中表达的启动子片段，在用于单子叶植物时不那么有效(参见Galun和Breiman，Transgenic plants，Imperial College Press，London，England，1997)。在将玉米(单子叶植物)DFR cDNA与大丁草(双子叶植物)DFR cDRA进行比较时，检测到了DFR转基因在矮牵牛(双子叶植物)中的甲基化以及最终表达的差别(Elomaa等，Molecular，and General Genetics，248：649-656，1995)。结论是，大丁草DFR cDNA具有较高的AT含量(较低的GC含量)，并且与矮牵牛的基因组组构更“兼容”，避免它被识别为外源基因而通过甲基化被沉默(蔷薇和康乃馨以及矮牵牛都是双子叶植物，并且测试的F3′5′H基因都是从双子叶植物中分离的)。这些观点旨在说明降解和稳定性机制并没有得到详细理解，并且在植物和其他生物界之间以及在植物界内似乎存在差别。

评估了从蔷薇中分离的F3′5′H cDNAs以及四种类黄酮途径基因(F3′H，DFR，CHS，FLS)的A和T含量(表18)。还检查了每一个密码子(位于开放读框内)的第三个位置，并且计算了在第三个位置上具有A或T的密码子的百分比。

表18：所分离的F3′5′H序列中的A或T双核苷酸的百分比含量以及F3′5′H是否导致了能通过Northern印迹分析在蔷薇花瓣中检测到的全长转录物的概述。

F3′5′Hseq	％AT	第三个位置上A或T的％	RNA	翠雀素
					堇菜属BP#18	50	40	是	是
堇菜属BP#40	51	35	是	是
					鼠尾草属#2	48	33	是	是
鼠尾草属#47	48	34	是	是
					裸柱菊属#5	54	54	是	是
薰衣草属LBG	50	37	是*	是
Kennedia#31	54	47	是	否
矮牵牛Hf1	61	66	否	否
					矮牵牛Hf2	59	65	否	否
龙胆属#48	57	57	否	否
					蝴蝶兰#HF2	57	53	否	否
					蔷薇F3′H	47	34	**	na
蔷薇CHS	52	42	**	na
					蔷薇DFR	53	46	**	na
蔷薇FLS	56	43	**	na

％AT＝在核酸序列上核苷酸A或T的％

在3^rd中A或T的％＝在第三个位置上具有A或T的密码子的百分比

RNA＝通过Northern印迹分析是否在从蔷薇花瓣中分离的总RNA中检测到全长mRNA转录物

Del＝通过TLC或HPLC是否在蔷薇花瓣中检测到任何翠雀素或翠雀素-型分子

YES*＝尽管没有对用薰衣草F3′5′H表达框转化的转基因蔷薇进行Northern印迹分析，可以假定产生了全长的转录物，因为在蔷薇花瓣中检测到了翠雀素或翠雀素-型分子。

蔷薇F3′H(参见国际专利申请号PCT/AU97/00124)

蔷薇DFR(Tanaka等，1995，同上)

蔷薇FLS(GenBank保藏号AB038247)

蔷薇CHS(GenBank保藏号AB038246)

编码类黄酮途径酶的四种蔷薇序列(参见上文)的AT含量在47％和56％之间。一般地，导致在蔷薇花瓣中产生完整转录物的F3′5′H序列的AT含量为48-54％。不过，不能导致在蔷薇花瓣中积累完整转录物的F3′5′H序列通常具有更高的AT含量，为57-61％。因此，导入蔷薇的F3′5′H基因的AT含量可能是是否在蔷薇花瓣中积累完整的转录物并因此导致F3′5′H和翠雀素或翠雀素-型分子的产生的一种因素。

编码类黄酮途径酶的四种蔷薇序列中每一个密码子的第三个位置上的核苷酸碱基通常为A或T的情形占密码子的34-46％。一般地，在蔷薇花瓣中产生完整转录物的F3′5′H序列在每一个密码子上的第三个位置上包括A或T密码子的百分比占密码子的33-54％。不过，不能导致在蔷薇花瓣中积累完整的转录物的F3′5′H序列通常在每一个密码子的第三个位置上包括A或T的百分比占密码子的53-66％。因此，在导入蔷薇的F3′5′H基因的第三个位置上具有A或T的密码子的百分比可能是影响是否能在蔷薇花瓣中积累完整的转录物、并因此导致F3′5′H和翠雀素或翠雀素-型分子产生的一个因素。

可能的情况是，通过改变不能在蔷薇中产生完整转录物的任何F3′5′H DNA序列(包括，但不局限于矮牵牛petHf1，矮牵牛petHf2，蝶豆(蝴蝶豆)BpeaHf2或三花龙胆(龙胆)Gen#48)的核苷酸A和/或T的总体含量，使它的水平与蔷薇基因中存在的水平更为一致，将能够积累完整的转录物，并且导致F3′5′H转录物的有效翻译，并因此导致翠雀素或翠雀素-型分子在蔷薇花瓣中积累。改变DNA序列的AT含量、而不改变它的氨基酸序列的一种方法是利用每一个密码子的第三个位置处的简并性。

本领域技术人员可以理解的是，对本文所披露的本发明可以很容易进行除了本文专门披露的形式以外的改变和改进。应当理解的是，本发明包括所有这样的改变和改进。本发明还包括在本说明书中单独或统一提到或指明的所有步骤，特征，组成和化合物，以及上述步骤或特征的任何两个或两个以上的任何或所有组合。

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Strack和Wray，In：The Flavonoids-Advances in Researchsince 1986.Harborme，J.B.(ed)，Chapman和Hall，London，UK，1-22，1993.

Tanaka等，Plant Cell Physiol.36.1023-1031，1995.

Tanaka等，Plant Cell Physiol.37：711-716，1996.

Thompson等，Nucleic Acids Research 22：4673-4680，1994.

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Winkel-Shirley，Plant Physiol.127：1399-1404，2001b.

Yonekura-Sakakibara等，Plant Cell Physiol.41：495-502，2000.

                            序列表

<110>International Flower Developments Pty.Ltd.

     Brugliera，Filippa(US only)

     Tanaka，Yoshikazu(US only)

     Mason，John(US only)

<120>基因序列及其用途

<130>12322720/EJH

<150>AU 2002951088

<151>2002-08-30

<150>AU 2002952835

<151>2002-09-16

<160>32

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1812

<212>DNA

<213>矮牵牛

<400>1

ctttctacta gctacttcgt tatatatatg taaaattgtg actttgaaaa tcatttaaat  60

tatcataagg ttcattttat cttgatcaaa atatttactt cggccatata cgttttcctt  120

tagtcatgat gctacttact gagcttggtg cagcaacttc aatctttcta atagcacaca  180

taatcatttc aactcttatt tcaaaaacta ccggccggca tctaccgccg gggccaagag  240

ggtggccggt gatcggagca cttccacttt taggagccat gccacatgtt tccttagcta  300

aaatggcaaa aaaatatgga gcaatcatgt atctcaaagt tggaacatgt ggcatggcag  360

ttgcttctac ccctgatgct gctaaagcat tcttgaaaac acttgatatc aacttctcca  420

atcgtccacc taatgcaggt gccactcact tagcttataa tgctcaagac atggtttttg  480

cacattatgg accacgatgg aagttgctaa ggaaattaag caacttgcat atgctagggg  540

gaaaagcctt agagaattgg gcaaatgttc gtgccaatga gctagggcac atgctaaaat  600

caatgtccga tatgagtcga gagggccaga gggttgtggt ggcggagatg ttgacatttg  660

ccatggccaa tatgatcgga caagtgatgc taagcaaaag agtatttgta gataaaggtg  720

ttgaggtaaa tgaatttaag gacatggttg tagagttaat gacaatagca gggtatttca  780

acattggtga ttttattcct tgtttagctt ggatggattt acaagggata gaaaaacgaa  840

tgaaacgttt acataagaag tttgatgctt tattgacaaa gatgtttgat gaacacaaag  900

caactaccta tgaacgtaag gggaaaccag attttcttga tgttgttatg gaaaatgggg  960

acaattctga aggagaaaga ctcagtacaa ccaacatcaa agcacttttg ctgaatttgt  1020

tcacagctgg tacggacact tcttctagtg caatagaatg ggcacttgca gaaatgatga  1080

agaaccctgc cattttgaaa aaagcacaag cagaaatgga tcaagtcatt ggaagaaata  1140

ggcgtttact cgaatccgat atcccaaatc tcccttacct ccgagcaatt tgcaaagaaa  1200

catttcgaaa acacccttct acaccattaa atcttcctag gatctcgaac gaaccatgca  1260

tagtcgatgg ttattacata ccaaaaaaca ctaggcttag tgttaacata tgggcaattg  1320

gaagagatcc ccaagtttgg gaaaatccac tagagtttaa tcccgaaaga ttcttgagtg  1380

gaagaaactc caagattgat cctcgaggga acgattttga attgatacca tttggtgctg  1440

gacgaagaat ttgtgcagga acaagaatgg gaattgtaat ggtggaatat atattaggaa  1500

ctttggttca ttcatttgat tggaaattac caagtgaagt tattgagttg aatatggaag  1560

aagcttttgg cttagctttg cagaaagctg tccctcttga agctatggtt actccaaggt  1620

tacaattgga tgtttatgta ccatagctat agatgtgtat tgtgctataa ttgcgcatgt  1680

tgttggttgt agcatgagat attaaaagga gtacatgaag cgcattgcat gagtttaact  1740

tgtagctcct taatatttta ggtatttttc aattaataag ttcttgttgg ttgggtaaaa  1800

aaaaaaaaaa aa                                                      1812

<210>2

<211>506

<212>PRT

<213>矮牵牛

<400>2

Met Met Leu Leu Thr Glu Leu Gly Ala Ala Thr Ser Ile Phe Leu Ile

1               5                   10                  15

Ala His Ile Ile Ile Ser Thr Leu Ile Ser Lys Thr Thr Gly Arg His

            20                  25                  30

Leu Pro Pro Gly Pro Arg Gly Trp Pro Val Ile Gly Ala Leu Pro Leu

        35                  40                  45

Leu Gly Ala Met Pro His Val Ser Leu Ala Lys Met Ala Lys Lys Tyr

    50                  55                  60

Gly Ala Ile Met Tyr Leu Lys Val Gly Thr Cys Gly Met Ala Val Ala

65                  70                  75                  80

Ser Thr Pro Asp Ala Ala Lys Ala Phe Leu Lys Thr Leu Asp Ile Asn

                85                  90                  95

Phe Ser Asn Arg Pro Pro Asn Ala Gly Ala Thr His Leu Ala Tyr Asn

            100                 105                 110

Ala Gln Asp Met Val Phe Ala His Tyr Gly Pro Arg Trp Lys Leu Leu

        115                 120                 125

Arg Lys Leu Ser Asn Leu His Met Leu Gly Gly Lys Ala Leu Glu Asn

    130                 135                 140

Trp Ala Asn Val Arg Ala Asn Glu Leu Gly His Met Leu Lys Ser Met

145                 150                 155                 160

Ser Asp Met Ser Arg Glu Gly Gln Arg Val Val Val Ala Glu Met Leu

                165                 170                 175

Thr Phe Ala Met Ala Asn Met Ile Gly Gln Val Met Leu Ser Lys Arg

            180                 185                 190

Val Phe Val Asp Lys Gly Val Glu Val Asn Glu Phe Lys Asp Met Val

        195                 200                 205

Val Glu Leu Met Thr Ile Ala Gly Tyr Phe Asn Ile Gly Asp Phe Ile

    210                 215                 220

Pro Cys Leu Ala Trp Met Asp Leu Gln Gly Ile Glu Lys Arg Met Lys

225                 230                 235                 240

Arg Leu His Lys Lys Phe Asp Ala Leu Leu Thr Lys Met Phe Asp Glu

                245                 250                 255

His Lys Ala Thr Thr Tyr Glu Arg Lys Gly Lys Pro Asp Phe Leu Asp

            260                 265                 270

Val Val Met Glu Asn Gly Asp Asn Ser Glu Gly Glu Arg Leu Ser Thr

        275                 280                 285

Thr Asn Ile Lys Ala Leu Leu Leu Asn Leu Phe Thr Ala Gly Thr Asp

    290                 295                 300

Thr Ser Ser Ser Ala Ile Glu Trp Ala Leu Ala Glu Met Met Lys Asn

305                 310                 315                 320

Pro Ala Ile Leu Lys Lys Ala Gln Ala Glu Met Asp Gln Val Ile Gly

                325                 330                 335

Arg Asn Arg Arg Leu Leu Glu Ser Asp Ile Pro Asn Leu Pro Tyr Leu

            340                 345                 350

Arg Ala Ile Cys Lys Glu Thr Phe Arg Lys His Pro Ser Thr Pro Leu

        355                 360                 365

Asn Leu Pro Arg Ile Ser Asn Glu Pro Cys Ile Val Asp Gly Tyr Tyr

    370                 375                 380

Ile Pro Lys Asn Thr Arg Leu Ser Val Asn Ile Trp Ala Ile Gly Arg

385                 390                 395                 400

Asp Pro Gln Val Trp Glu Asn Pro Leu Glu Phe Asn Pro Glu Arg Phe

                405                 410                 415

Leu Ser Gly Arg Asn Ser Lys Ile Asp Pro Arg Gly Asn Asp Phe Glu

            420                 425                 430

Leu Ile Pro Phe Gly Ala Gly Arg Arg Ile Cys Ala Gly Thr Arg Met

        435                 440                 445

Gly Ile Val Met Val Glu Tyr Ile Leu Gly Thr Leu Val His Ser Phe

    450                 455                 460

Asp Trp Lys Leu Pro Ser Glu Val Ile Glu Leu Asn Met Glu Glu Ala

465                 470                 475                 480

Phe Gly Leu Ala Leu Gln Lys Ala Val Pro Leu Glu Ala Met Val Thr

                485                 490                 495

Pro Arg Leu Gln Leu Asp Val Tyr Val Pro

            500                 505

<210>3

<211>1756

<212>DNA

<213>矮牵牛

<400>3

ttgaatccag ctctatctgg ctttagacaa tggtgctact tagtgagctt gctgcagcaa    60

ccttaatctt tctaacaaca catatcttca tttcaactct tctttctata actaacggcc    120

ggcgtctccc gccagggcca agagggtggc cggtgatcgg agcacttcca cttttaggag    180

ccatgccaca tgtttcctta gctaaaatgg caaaaaaata tggagcaatc atgtatctca    240

aagttggaac gtgtggcatg gtagttgctt ctacccctga tgctgctaaa gcgttcttga    300

aaacacttga tctcaacttc tccaatcgtc cacctaatgc aggtgccacc cacttagcct    360

atggtgctca agacatggtt tttgcacatt atggaccaag atggaagttg ctaaggaaat    420

taagcaactt acatatgcta ggggggaaag ccttagaaaa ttgggcaaat gttcgtgcca    480

atgagctagg acacatgcta aaatcgatgt ttgatatgag cagagaaggg gagagagttg    540

tggtggcgga gatgttgaca tttgccatgg cgaatatgat cggacaggtg atacttagca    600

aaagagtatt tgtaaataaa ggtgttgagg taaatgaatt taaggacatg gtggtagagt    660

taatgacaac agcagggtat tttaacattg gtgattttat tccttgttta gcttggatgg    720

atttacaagg gatagaaaaa ggaatgaaac gtttacataa gaagtttgat gctttattga    780

caaagatgtt tgatgaacac aaagcaacta gctatgaacg taaggggaaa ccagattttc    840

ttgattgtgt tatggaaaat agggacaatt ctgaaggaga aaggctcagt acaaccaaca    900

tcaaagcact cttgctgaat ttgttcacag ctggtacaga cacttcttct agtgcaatag    960

aatgggcact tgcagagatg atgaagaacc ctgccatttt aaagaaagca caaggagaaa    1020

tggatcaagt cattggaaac aataggcgtc tgctcgaatc ggatatccca aatctccctt    1080

acctccgagc aatttgcaaa gaaacatttc gaaagcaccc ttctacacca ttaaatctcc    1140

ctaggatctc gaacgaacca tgcattgtcg atggttatta cataccaaaa aacactaggc    1200

ttagtgttaa catatgggca attggaagag atcccgaagt ttgggagaac ccactagagt    1260

tttatcctga aaggttcttg agtggaagaa actcgaagat tgatcctcga gggaacgact    1320

ttgaattgat accatttggt gctggacgaa gaatttgtgc agggacaaga atgggaatcg    1380

taatggtgga atatatatta ggaactttgg tccattcatt tgattggaaa ttaccaagtg    1440

aagttattga gctaaatatg gaagaagctt ttggattagc tttgcagaaa gctgtccctc    1500

ttgaagctat ggttactcca aggctgccta ttgatgttta tgcaccttta gcttgaaaca    1560

tgcctttacg ttggtttcag ttttgggtag tataatgttg tggtgtttgg ctatagaaat    1620

attaataaat gctagtatct tgaaggcgcg tgcaggggga gggggttgtc ttagatagta    1680

gtaatatgtt agccttcctt ttatttcttg tgattgtgag aatcttgata tgttttcttg    1740

gaaaaaaaaa aaaaaa                                                  1756

<210>4

<211>508

<212>PRT

<213>矮牵牛

<400>4

Met Val Leu Leu Ser Glu Leu Ala Ala Ala Thr Leu Ile Phe Leu Thr

1               5                   10                  15

Thr His Ile Phe Ile Ser Thr Leu Leu Ser Ile Thr Asn Gly Arg Arg

            20                  25                  30

Leu Pro Pro Gly Pro Arg Gly Trp Pro Val Ile Gly Ala Leu Pro Leu

        35                  40                  45

Leu Gly Ala Met Pro His Val Ser Leu Ala Lys Met Ala Lys Lys Tyr

    50                  55                  60

Gly Ala Ile Met Tyr Leu Lys Val Gly Thr Cys Gly Met Val Val Ala

65                  70                  75                  80

Ser Thr Pro Asp Ala Ala Lys Ala Phe Leu Lys Thr Leu Asp Leu Asn

                85                  90                  95

Phe Ser Asn Arg Pro Pro Asn Ala Gly Ala Thr His Leu Ala Tyr Gly

            100                 105                 110

Ala Gln Asp Met Val Phe Ala His Tyr Gly Pro Arg Trp Lys Leu Leu

        115                 120                 125

Arg Lys Leu Ser Asn Leu His Met Leu Gly Gly Lys Ala Leu Glu Asn

    130                 135                 140

Trp Ala Asn Val Arg Ala Asn Glu Leu Gly His Met Leu Lys Ser Met

145                 150                 155                 160

Phe Asp Met Ser Arg Glu Gly Glu Arg Val Val Val Ala Glu Met Leu

                165                 170                 175

Thr Phe Ala Met Ala Asn Met Ile Gly Gln Val Ile Leu Ser Lys Arg

            180                 185                 190

Val Phe Val Asn Lys Gly Val Glu Val Asn Glu Phe Lys Asp Met Val

        195                 200                 205

Val Glu Leu Met Thr Thr Ala Gly Tyr Phe Asn Ile Gly Asp Phe Ile

    210                 215                 220

Pro Cys Leu Ala Trp Met Asp Leu Gln Gly Ile Glu Lys Gly Met Lys

225                 230                 235                 240

Arg Leu His Lys Lys Phe Asp Ala Leu Leu Thr Lys Met Phe Asp Glu

                245                 250                 255

His Lys Ala Thr Ser Tyr Glu Arg Lys Gly Lys Pro Asp Phe Leu Asp

            260                 265                 270

Cys Val Met Glu Asn Arg Asp Asn Ser Glu Gly Glu Arg Leu Ser Thr

        275                 280                 285

Thr Asn Ile Lys Ala Leu Leu Leu Asn Leu Phe Thr Ala Gly Thr Asp

    290                 295                 300

Thr Ser Ser Ser Ala Ile Glu Trp Ala Leu Ala Glu Met Met Lys Asn

305                 310                 315                 320

Pro Ala Ile Leu Lys Lys Ala Gln Gly Glu Met Asp Gln Val Ile Gly

                325                 330                 335

Asn Asn Arg Arg Leu Leu Glu Ser Asp Ile Pro Asn Leu Pro Tyr Leu

            340                 345                 350

Arg Ala Ile Cys Lys Glu Thr Phe Arg Lys His Pro Ser Thr Pro Leu

        355                 360                 365

Asn Leu Pro Arg Ile Ser Asn Glu Pro Cys Ile Val Asp Gly Tyr Tyr

    370                 375                 380

Ile Pro Lys Asn Thr Arg Leu Ser Val Asn Ile Trp Ala Ile Gly Arg

385                 390                 395                 400

Asp Pro Glu Val Trp Glu Asn Pro Leu Glu Phe Tyr Pro Glu Arg Phe

                405                 410                 415

Leu Ser Gly Arg Asn Ser Lys Ile Asp Pro Arg Gly Asn Asp Phe Glu

            420                 425                 430

Leu Ile Pro Phe Gly Ala Gly Arg Arg Ile Cys Ala Gly Thr Arg Met

        435                 440                 445

Gly Ile Val Met Val Glu Tyr Ile Leu Gly Thr Leu Val His Ser Phe

    450                 455                 460

Asp Trp Lys Leu Pro Ser Glu Val Ile Glu Leu Asn Met Glu Glu Ala

465                 470                 475                 480

Phe Gly Leu Ala Leu Gln Lys Ala Val Pro Leu Glu Ala Met Val Thr

                485                 490                 495

Pro Arg Leu Pro Ile Asp Val Tyr Ala Pro Leu Ala

            500                 505

<210>5

<211>2934

<212>DNA

<213>蔷薇

<400>5

aagcttcagc aagagttgaa gaaataggga cagagccatc catgtgcttt gatgaatctg    60

atgggataca aaatgtgaaa gattcacttg ctgatttatc cagaatttct tcatatagtg    120

aggagaatgt tgaaagatct aatgatgagc actctgttaa actagacgga attcatgtgc    180

agcacgagtg tcatgagggc agtgaagaag acaaacctga tggtaagagc ggtgagaatg    240

cagttgatct ggctaatcat ggcatggctc gaactgattt ttgtcagata acagaagaga    300

ttgagaatgg agtagtcatc actgagatga gcaacattgc caaccctgat aaaactgata    360

ttccaaacgg ggtgcctcaa aatgagactg atgatggatt taataacact caggatgatg    420

ctaatacaaa ggaagtgaca gaagagaatt ctgacagacg tgcgaaggaa gtgacagaag    480

agaattctga caaagatgtt ttgaagaata tccttgaatt ctcacgtgct tcttctgtgg    540

tggattttga aattccagtg ttggatgtga aatttacttc tcttgaaagt tgcagtgcca    600

cttgttctct tgcagccctt ttgtctgaat cgccggaatc aatgactgaa gcaccttgtg    660

tgaggcaaat tgatgatgtg cccccggttg gtgaggagtc tagcttgatt ttggtggaag    720

atcgggagcc ggttggtcct actcctgatg gtaatttttc tgtggatatg gattactata    780

gtgtagcaga acctttgagc acatgggatg cgaatctgca gtgtgaaaca tcaaatagcc    840

atgagacttt tgctgcaagt ctcatttgat agcttctgtg ttaataactt tgttagtctg    900

tacataaatt tgtctagaca agaattggtc gtgtactatc gtgtgttttt gccgtgcttt    960

agtactcatg aaccaattca gagaaaactg gctgcatatt ttgaggagtc tctgaattct    1020

tcaatgctca actggtatgc atgtaggtgg catatcactt cagggattct tctattcttt    1080

aactttacgc atcttgacat tttgtatata acaaaatcag gtctattggg tgaaagtaat    1140

tggctagaat ggaaagctct acggttttac cgcaggtcaa ttttcatagc tccacaagtg    1200

aattgaaaat gctcataggc tttatgtttg tcctccacct ctggcgacga tgtttgttgg    1260

ggagttaact caaacctacc accaaactcg aacccatctt ccataattta taatacaaat    1320

ttgcgatcat ttgttcatcc aattattgtg acactcggct accacccaaa atatcggtca    1380

cagacccaaa cgtattgtca caacaaatcg tgtctctcgc attaaacaca gctagaaaga    1440

agagttgaac ccacaattcg agcacccact acctatgtac gaagtcatga gttcgagtca    1500

ccataggggt agaagtgaaa tcatttgatc atctttaaag aaataaaagg aagagttgaa    1560

cccacaattg gctcttgtcc caaaaagaac taatagttca gtgcaccgac gtgtatttgc    1620

accgacataa atggattgtt agattatatt aaatacactc ttaggttatt aataaaaata    1680

ttaattataa atatcaaaag ttgagatcat cttataaatg ttgggtcagt tacaccgtcg    1740

gtgcatagaa taatttccaa actatataat agccttcatt ttctgattta gctcatggga    1800

catgattgct ataaataatt gtactcgtag aggcatactt gtgtcttttt atacagttgt    1860

actgaagctc agaaaagttt atgaaggtga gaactgagaa gggcaaggca tttggtagtt    1920

gaggtatatg agagcatgaa ccccatgcat tgcagctacc acctctcttt tttccttctt    1980

cccatacaaa taaaaccaac tcttctcacc taagtctatc atctttattt atggcagctc    2040

ttgcttaatt agctcatcta tattatatta tttatctata atatgtgtca ctctgtctac    2100

ctaccagccc aaaataaaac tgataatagt caatttgatg atattttttg ttttttgttt    2160

tgttttgtct tttttgtatt gattttttta aaattaaaat gacttcattt tttgtttttg    2220

tttttttttc tatttttttt tatagaaaaa ttggcaaact ttcattatct gttattgatg    2280

acaattaagc cattaaaacc tataattaat tatctttcaa ttcgagtaaa tttaaaacgg    2340

tgtaaaatta aaatatgatc gtattcttaa atgaataaaa ctcacttaat aatagtaata    2400

cttgaatcac atctacgaac atagattctt ttcatccagt ctaaccatgt ttgaatatat    2460

agagtttgat tatggttatg tctttgtcca cattttggtt tgtaaataaa tgtgcaacgg    2520

aggtatggta ctgttgctct atcaaattca agtttgaatt aaaagaaaaa aaaaaagacg    2580

atattttgtg cgctttgttt ggtaggtaaa acgagagaac aaacgcattc caaatcatgc  2640

ggattttgat cggcaacaca caccacaaaa aaccgtacac gatgcacgtg ccatttgccg  2700

ggggtttcta acaaggtaat tgggcaggca cgtgatcccc cagctaccca cctctcgctt  2760

cccttctcaa actccttttc catgtatata tacaacccct tttctcagac cattatattc  2820

taacattttt gctttgctat tgtaacgcaa caaaaactgc tcattccatc cttgttcctc  2880

cccattttga tcttctctcg acccttctcc gagatgggta ccgagctcga attc        2934

<210>6

<211>24

<212>DNA

<213>矮牵牛

<400>6

gttctcgagg aaagataata caat                                         24

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>矮牵牛

<400>7

caagatcgta ggactgcatg                                              20

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>菊花

<400>8

gttaaggaag ccatgggtgt                                              20

<210>9

<211>1648

<212>DNA

<213>堇菜

<400>9

agccaatatg gcaattccag tcactgacct tgctgtcgcg gttatccttt tcttgatcac    60

tcgcttccta gttcgttctc ttttcaagaa accaaccgga ccgctcccgc cgggtccttc    120

aggctggccc ttggtgggcg cgctccctct cctaggcgcc atgcctcacg tcacactagc    180

caacctcgct aaaaaatacg gtccgatcat gtacctaaaa atgggcacgt gcgacatggt    240

ggtcgcgtcc actcccgact cggctcgagc cttcctcaaa accctagacc tcaacttctc    300

cgaccgcccg cccaacgccg gcgccaccca tttggcgtac ggcgcgcagg acttggtctt    360

cgcgaagtac ggtccaaggt ggaagaccct aagaaaattg agcaacctcc acatgctagg    420

cgggaaggcg ctggacgatt gggctcacgt gagggctaac gagctaggcc acatgcttaa    480

cgccatgtgc gaggcgagcc ggtgcggaga gcccgtggtg ctggccgaga tgctcacgta    540

cgccatggcc aacatgatcg gtcaagtgat actgagtcgg cgcgtgttcg tcaccaaagg    600

gacagagtcg aacgagttca aagatatggt ggtcgagttg atgacttccg cggggtattt    660

caacattggt gacttcatac cgtcgattgc ttggatggat ttgcaaggga tcgagcgagg    720

gatgaagaaa ttgcacacga aattcgatgt tttgttgacg aagatgatga aggagcacag    780

agcgacgagt catgagcgcg aagggaaatc ggatttcctc gacgtcctct tggaagaatg    840

cgagaataca aatggcgaga agcttaatgt taccaacgtc aaagctgtcc tcttgaactt    900

attcacggcg ggtacggaca catcttcaag cataatcgaa tgggcgttaa ccgaaatgat    960

gaagaatccg acgatcttaa aaaagaccca agaagagatg gatcgagtca tcggtcgcga    1020

tcggagattg ctcgaatccg acgtttcgaa actcccgtat ttacaagcca tagcgaaaga    1080

aacatatcgt aaacacccat cgacacctct aaacctgccg aggattgcga tccaagcatg    1140

tgaagttgat ggctactaca tccccaaaga cacgaggctt agcgtcaaca tttgggcgat    1200

cggtcgggac ccaagtgttt gggagaatcc atcggagttc tcgcctgaaa gattcttgtc    1260

tgaggagaat gggaagatca gtccaggcgg gaatgatttt gagctgattc cgtttggagc    1320

agggaggaga atttgtgctg ggacaaggat gggaatggtc cttgtaagtt atattttggg    1380

cactttggtc cattcttttg attggaaatt accaaatggg gtcagtgaga ttaacatgga    1440

tgagagtttt gggcttgcgt tgcaaaaggc cgtgcctctc tcggctacgg tcagtccacg    1500

attggcccca agcgcgtacg ttatatgagc tgatgggctg ggcctgagcc caaacatatt    1560

gggtgtgttt tatctgtaat ttttaatatt ataaagttcg taattttgta tttatggtta    1620

attatgagtt aaaaaaaaaa aaaaaaaa                                       1648

<210>10

<211>506

<212>PRT

<213>堇菜

<400>10

Met Ala Ile Pro Val Thr Asp Leu Ala Val Ala Val Ile Leu Phe Leu

1               5                   10                  15

Ile Thr Arg Phe Leu Val Arg Ser Leu Phe Lys Lys Pro Thr Gly Pro

            20                  25                  30

Leu Pro Pro Gly Pro Ser Gly Trp Pro Leu Val Gly Ala Leu Pro Leu

        35                  40                  45

Leu Gly Ala Met Pro His Val Thr Leu Ala Asn Leu Ala Lys Lys Tyr

    50                  55                  60

Gly Pro Ile Met Tyr Leu Lys Met Gly Thr Cys Asp Met Val Val Ala

65                  70                  75                  80

Ser Thr Pro Asp Ser Ala Arg Ala Phe Leu Lys Thr Leu Asp Leu Asn

                85                  90                  95

Phe Ser Asp Arg Pro Pro Asn Ala Gly Ala Thr His Leu Ala Tyr Gly

            100                 105                 110

Ala Gln Asp Leu Val Phe Ala Lys Tyr Gly Pro Arg Trp Lys Thr Leu

        115                 120                 125

Arg Lys Leu Ser Asn Leu His Met Leu Gly Gly Lys Ala Leu Asp Asp

    130                 135                 140

Trp Ala His Val Arg Ala Asn Glu Leu Gly His Met Leu Asn Ala Met

145                 150                 155                 160

Cys Glu Ala Ser Arg Cys Gly Glu Pro Val Val Leu Ala Glu Met Leu

                165                 170                 175

Thr Tyr Ala Met Ala Asn Met Ile Gly Gln Val Ile Leu Ser Arg Arg

            180                 185                 190

Val Phe Val Thr Lys Gly Thr Glu Ser Asn Glu Phe Lys Asp Met Val

        195                 200                 205

Val Glu Leu Met Thr Ser Ala Gly Tyr Phe Asn Ile Gly Asp Phe Ile

    210                 215                 220

Pro Ser Ile Ala Trp Met Asp Leu Gln Gly Ile Glu Arg Gly Met Lys

225                 230                 235                 240

Lys Leu His Thr Lys Phe Asp Val Leu Leu Thr Lys Met Met Lys Glu

                245                 250                 255

His Arg Ala Thr Ser His Glu Arg Glu Gly Lys Ser Asp Phe Leu Asp

            260                 265                 270

Val Leu Leu Glu Glu Cys Glu Asn Thr Asn Gly Glu Lys Leu Asn Val

        275                 280                 285

Thr Asn Val Lys Ala Val Leu Leu Asn Leu Phe Thr Ala Gly Thr Asp

     290                295                 300

Thr Ser Set Ser Ile Ile Glu Trp Ala Leu Thr Glu Met Met Lys Asn

305                 310                 315                 320

Pro Thr Ile Leu Lys Lys Thr Gln Glu Glu Met Asp Arg Val Ile Gly

                325                 330                 335

Arg Asp Arg Arg Leu Leu Glu Ser Asp Val Ser Lys Leu Pro Tyr Leu

            340                 345                 350

Gln Ala Ile Ala Lys Glu Thr Tyr Arg Lys His Pro Set Thr Pro Leu

        355                 360                 365

Asn Leu Pro Arg Ile Ala Ile Gln Ala Cys Glu Val Asp Gly Tyr Tyr

    370                 375                 380

Ile Pro Lys Asp Thr Arg Leu Ser Val Asn Ile Trp Ala Ile Gly Arg

385                 390                 395                 400

Asp Pro Set Val Trp Glu Asn Pro Ser Glu Phe Ser Pro Glu Arg Phe

                405                 410                 415

Leu Ser Glu Glu Asn Gly Lys Ile Set Pro Gly Gly Asn Asp Phe Glu

            420                 425                 430

Leu Ile Pro Phe Gly Ala Gly Arg Arg Ile Cys Ala Gly Thr Arg Met

        435                 440                 445

Gly Met Val Leu Val Ser Tyr Ile Leu Gly Thr Leu Val His Set Phe

    450                 455                 460

Asp Trp Lys Leu Pro Asn Gly Val Ser Glu Ile Asn Met Asp Glu Ser

465                 470                 475                 480

Phe Gly Leu Ala Leu Gln Lys Ala Val Pro Leu Set Ala Thr Val Ser

                485                 490                 495

Pro Arg Leu Ala Pro Ser Ala Tyr Val Ile

            500                 505

<210>11

<211>1782

<212>DNA

<213>堇菜

<220>

<221>misc_feature

<222>(307)..(307)

<223>n＝任何核苷酸

<400>11

bgacaacatg gcaattctag tcaccgactt cgttgtcgcg gctataattt tcttgatcac    60

tcggttctta gttcgttctc ttttcaagaa accaacccga ccgctccccc cgggtcctct    120

cggttggccc ttggtgggcg ccctccctct cctaggcgcc atgcctcacg tcgcactagc    180

caaactcgct aagaagtatg gtccgatcat gcacctaaaa atgggcacgt gcgacatggt    240

ggtcgcgtcc acccccgagt cggctcgagc cttcctcaaa acgctagacc tcaacttctc    300

caaccgncca cccaacgcgg gcgcatccca cctagcgtac ggcgcgcagg acttagtctt    360

cgccaagtac ggtccgaggt ggaagacttt aagaaaattg agcaacctcc acatgctagg    420

cgggaaggcg ttggatgatt gggcaaatgt gagggtcacc gagctaggcc acatgcttaa    480

agccatgtgc gaggcgagcc ggtgcgggga gcccgtggtg ctggccgaga tgctcacgta    540

cgccatggcg aacatgatcg gtcaagtgat actcagccgg cgcgtgttcg tgaccaaagg    600

gaccgagtct aacgagttca aagacatggt ggtcgagttg atgacgtccg ccgggtactt    660

caacatcggt gacttcatac cctcgatcgc ttggatggat ttgcaaggga tcgagcgagg    720

gatgaagaag ctgcacacga agtttgatgt gttattgacg aagatggtga aggagcatag    780

agcgacgagt catgagcgca aagggaaggc agatttcctc gacgttctct tggaagaatg    840

cgacaataca aatggggaga agcttagtat taccaatatc aaagctgtcc ttttgaatct    900

attcacggcg ggcacggaca catcttcgag cataatcgaa tgggcgttaa cggagatgat    960

caagaatccg acgatcttaa aaaaggcgca agaggagatg gatcgagtca tcggtcgtga    1020

tcggaggctg ctcgaatcgg acatatcgag cctcccgtac ctacaagcca ttgctaaaga    1080

aacgtatcgc aaacacccgt cgacgcctct caacttgccg aggattgcga tccaagcatg    1140

tgaagttgat ggctactaca tccctaagga cgcgaggctt agcgtgaaca tttgggcgat    1200

cggtcgggac ccgaatgttt gggagaatcc gttggagttc ttgccggaaa gattcttgtc  1260

tgaagagaat gggaagatca atcccggtgg gaatgatttt aagctgattc cgtttggagc  1320

cgggaggaga atttgtgcgg ggacaaggat gggaatggtc cttgtaagtt atattttggg  1380

cactttggtc cattcttttg attggaaatt accaaatggt gtcgctgagc ttaatatgga  1440

tgaaagtttt gggcttgcat tgcaaaaggc cgtgccgctc tcggccttgg tcagcccacg  1500

gttggcctca aacccgtacg caacctgagc taatgggctg ggcctagttt tgtgggccct  1560

aatttagaga cttttgtgtt ttaaggtgtg tactttatta attgggtgct taaatgtgtg  1620

ttttaatttg tatttatggt taattatgac tttattgtat aattatttat ttttcccttc  1680

tgggtatttt atccatttaa tttttcttca gaattatgat catagttatc agaataaaat  1740

tgaaaataat gaatcggaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa                     1782

<210>12

<211>506

<212>PRT

<213>堇菜

<400>12

Met Ala Ile Leu Val Thr Asp Phe Val Val Ala Ala Ile Ile Phe Leu

1               5                   10                  15

Ile Thr Arg Phe Leu Val Arg Ser Leu Phe Lys Lys Pro Thr Arg Pro

            20                  25                  30

Leu Pro Pro Gly Pro Leu Gly Trp Pro Leu Val Gly Ala Leu Pro Leu

        35                  40                  45

Leu Gly Ala Met Pro His Val Ala Leu Ala Lys Leu Ala Lys Lys Tyr

    50                  55                  60

Gly Pro Ile Met His Leu Lys Met Gly Thr Cys Asp Met Val Val Ala

65                  70                  75                  80

Ser Thr Pro Glu Ser Ala Arg Ala Phe Leu Lys Thr Leu Asp Leu Asn

                85                  90                  95

Phe Ser Asn Arg Pro Pro Asn Ala Gly Ala Ser His Leu Ala Tyr Gly

            100                 105                 110

Ala Gln Asp Leu Val Phe Ala Lys Tyr Gly Pro Arg Trp Lys Thr Leu

        115                 120                 125

Arg Lys Leu Ser Asn Leu His Met Leu Gly Gly Lys Ala Leu Asp Asp

    130                 135                 140

Trp Ala Asn Val Arg Val Thr Glu Leu Gly His Met Leu Lys Ala Met

145                 150                 155                 160

Cys Glu Ala Ser Arg Cys Gly Glu Pro Val Val Leu Ala Glu Met Leu

                165                 170                 175

Thr Tyr Ala Met Ala Asn Met Ile Gly Gln Val Ile Leu Ser Arg Arg

            180                 185                 190

Val Phe Val Thr Lys Gly Thr Glu Ser Asn Glu Phe Lys Asp Met Val

        195                 200                 205

Val Glu Leu Met Thr Ser Ala Gly Tyr Phe Asn Ile Gly Asp Phe Ile

    210                 215                 220

Pro Ser Ile Ala Trp Met Asp Leu Gln Gly Ile Glu Arg Gly Met Lys

225                 230                 235                 240

Lys Leu His Thr Lys Phe Asp Val Leu Leu Thr Lys Met Val Lys Glu

                245                 250                 255

His Arg Ala Thr Ser His Glu Arg Lys Gly Lys Ala Asp Phe Leu Asp

            260                 265                 270

Val Leu Leu Glu Glu Cys Asp Asn Thr Asn Gly Glu Lys Leu Ser Ile

        275                 280                 285

Thr Asn Ile Lys Ala Val Leu Leu Asn Leu Phe Thr Ala Gly Thr Asp

    290                 295                 300

Thr Ser Ser Ser Ile Ile Glu Trp Ala Leu Thr Glu Met Ile Lys Asn

305                 310                 315                 320

Pro Thr Ile Leu Lys Lys Ala Gln Glu Glu Met Asp Arg Val Ile Gly

                325                 330                 335

Arg Asp Arg Arg Leu Leu Glu Ser Asp Ile Ser Ser Leu Pro Tyr Leu

            340                 345                 350

Gln Ala Ile Ala Lys Glu Thr Tyr Arg Lys His Pro Ser Thr Pro Leu

        355                 360                 365

Asn Leu Pro Arg Ile Ala Ile Gln Ala Cys Glu Val Asp Gly Tyr Tyr

    370                 375                 380

Ile Pro Lys Asp Ala Arg Leu Ser Val Asn Ile Trp Ala Ile Gly Arg

385                 390                 395                 400

Asp Pro Asn Val Trp Glu Asn Pro Leu Glu Phe Leu Pro Glu Arg Phe

                405                 410                 415

Leu Ser Glu Glu Asn Gly Lys Ile Asn Pro Gly Gly Asn Asp Phe Lys

            420                 425                 430

Leu Ile Pro Phe Gly Ala Gly Arg Arg Ile Cys Ala Gly Thr Arg Met

        435                 440                 445

Gly Met Val Leu Val Ser Tyr Ile Leu Gly Thr Leu Val His Ser Phe

    450                 455                 460

Asp Trp Lys Leu Pro Asn Gly Val Ala Glu Leu Asn Met Asp Glu Ser

465                 470                 475                 480

Phe Gly Leu Ala Leu Gln Lys Ala Val Pro Leu Ser Ala Leu Val Ser

                485                 490                 495

Pro Arg Leu Ala Ser Asn Pro Tyr Ala Thr

            500                 505

<210>13

<211>1659

<212>DNA

<213>鼠尾草

<400>13

catggaagcc caagaaaata tgttgttgat tgctagggca cttgttgtag catccttact    60

ctacattttg atccgtatgt ttatctcaaa attgagcacc accggccacc ctctgccccc    120

ggggccgagg ggctttctag tggtgggctc ccttcccttg ctgggcgaca tgccacatgt    180

cgccctagca aaaatggcca aaacttacgg cccgatcatg tacttgaaaa tgggcacagt    240

cggcatggtc gtggcgtcca cgccagacgc ggcgcgggcg ttcctaaaaa cccacgacgc    300

taatttctcg aaccggccgg tcaacgcggg tgccaccatc ctggcataca atgcccagga    360

catggtgttt gccccgtacg gccccaagtg gagactgctg aggaagctga gcagtctcca    420

catgctgggg agcaaggccc tggaggagtg ggctgacgtc cggacctcgg aggtggggca    480

catgctggcg gcgatgcacg aggccagccg cctgggcgag gccgtggggt tgccggagat    540

gctggtgtac gcgacggcga acatgatcgg gcaggtgata ttgagccgga gagttttcgt    600

gacgaaaggg aaggagatga atgaattcaa ggaaatggtg gtggagctca tgaccacagc    660

tggctatttc aacattggtg atttcattcc atggcttgct tggatggatt tgcaggggat    720

tgagagaggg atgaagaaac tgcacaagaa gtgggaccgc ttgatcggta agatgctgga    780

tgatcgattg aaatcaacct acaaacgcaa cgacaagcca gatcttcttg attctctctt    840

ggcaaatcat gatgatgaga gtaaggatga tgatgaggat tgcaagctca ccaccaccaa    900

tattaaagcc cttttactga atttatttac tgcagggaca gacacatcgt cgagcataat    960

agaatgggca ttagcggaga tgatcaagaa tccaagcatc caaaaaaggg ctcaccaaga    1020

gatggacaga gtcatcggga gagagcggcg tttgctcgaa tccgacatcc caaatctgcc    1080

atacctcaaa gccatatgca aagaggcata ccgaaaacac ccttccacgc cactaaacct    1140

gcctcggatc tccacggatg catgcgtcgt cgatggctac cacatcccca agaacacgag    1200

gttgagcgtc aacatctggg ccataggccg agatcccgac gtttgggaga atccccttga    1260

cttcaaccct gacaggttta tgtcagggtt gcaggggatt gagcccggag ggaatcactt    1320

cgagctcatt ccctttgggg cggggcgcag gatctgcgcc ggcagcagaa tggggattgt    1380

aatagtggag tatttgctgg cgacactcgt gcactctttc gaatgggatt tgccggccgg    1440

ctcagcggag atggacatgg aggaggtgtt cgggctggcc ttgcagaaag ctgtaccact    1500

tgctgctagg ctcactccta ggttgccttc acattgctat gcacctcctt ctatttaatt    1560

tgcatattta catatgttgt gttacattga gcctttgcat atgttgtatc caacctatct    1620

tataacttgt gcatgaaatt gaaaaaaaaa aaaaaaaaa                           1659

<210>14

<211>520

<212>PRT

<213>鼠尾草

<400>14

Gly Thr Ser Met Glu Ala Gln Glu Asn Met Leu Leu Ile Ala Arg Ala

1               5                   10                  15

Leu Val Val Ala Ser Leu Leu Tyr Ile Leu Ile Arg Met Phe Ile Ser

            20                  25                  30

Lys Leu Ser Thr Thr Gly His Pro Leu Pro Pro Gly Pro Arg Gly Phe

        35                  40                  45

Leu Val Val Gly Ser Leu Pro Leu Leu Gly Asp Met Pro His Val Ala

    50                  55                  60

Leu Ala Lys Met Ala Lys Thr Tyr Gly Pro Ile Met Tyr Leu Lys Met

65                  70                  75                  80

Gly Thr Val Gly Met Val Val Ala Ser Thr Pro Asp Ala Ala Arg Ala

                85                  90                  95

Phe Leu Lys Thr His Asp Ala Asn Phe Ser Asn Arg Pro Val Asn Ala

            100                 105                 110

Gly Ala Thr Ile Leu Ala Tyr Asn Ala Gln Asp Met Val Phe Ala Pro

        115                 120                 125

Tyr Gly Pro Lys Trp Arg Leu Leu Arg Lys Leu Ser Ser Leu His Met

    130                 135                 140

Leu Gly Ser Lys Ala Leu Glu Glu Trp Ala Asp Val Arg Thr Ser Glu

145                 150                 155                 160

Val Gly His Met Leu Ala Ala Met His Glu Ala Ser Arg Leu Gly Glu

                165                 170                 175

Ala Val Gly Leu Pro Glu Met Leu Val Tyr Ala Thr Ala Asn Met Ile

            180                 185                 190

Gly Gln Val Ile Leu Ser Arg Arg Val Phe Val Thr Lys Gly Lys Glu

        195                 200                 205

Met Asn Glu Phe Lys Glu Met Val Val Glu Leu Met Thr Thr Ala Gly

    210                 215                220

Tyr Phe Asn Ile Gly Asp Phe Ile Pro Trp Leu Ala Trp Met Asp Leu

225                 230                 235                 240

Gln Gly Ile Glu Arg Gly Met Lys Lys Leu His Lys Lys Trp Asp Arg

                245                 250                 255

Leu Ile Gly Lys Met Leu Asp Asp Arg Leu Lys Ser Thr Tyr Lys Arg

            260                 265                 270

Asn Asp Lys Pro Asp Leu Leu Asp Ser Leu Leu Ala Asn His Asp Asp

        275                 280                 285

Glu Ser Lys Asp Asp Asp Glu Asp Cys Lys Leu Thr Thr Thr Asn Ile

    290                 295                 300

Lys Ala Leu Leu Leu Asn Leu Phe Thr Ala Gly Thr Asp Thr Ser Ser

305                 310                 315                 320

Ser Ile Ile Glu Trp Ala Leu Ala Glu Met Ile Lys Asn Pro Ser Ile

                325                 330                 335

Gln Lys Arg Ala His Gln Glu Met Asp Arg Val Ile Gly Arg Glu Arg

            340                 345                 350

Arg Leu Leu Glu Ser Asp Ile Pro Asn Leu Pro Tyr Leu Lys Ala Ile

        355                 360                 365

Cys Lys Glu Ala Tyr Arg Lys His Pro Ser Thr Pro Leu Asn Leu Pro

    370                 375                 380

Arg Ile Ser Thr Asp Ala Cys Val Val Asp Gly Tyr His Ile Pro Lys

385                 390                 395                 400

Asn Thr Arg Leu Ser Val Asn Ile Trp Ala Ile Gly Arg Asp Pro Asp

                405                 410                 415

Val Trp Glu Asn Pro Leu Asp Phe Asn Pro Asp Arg Phe Met Ser Gly

            420                 425                 430

Leu Gln Gly Ile Glu Pro Gly Gly Asn His Phe Glu Leu Ile Pro Phe

        435                 440                 445

Gly Ala Gly Arg Arg Ile Cys Ala Gly Ser Arg Met Gly Ile Val Ile

    450                 455                 460

Val Glu Tyr Leu Leu Ala Thr Leu Val His Ser Phe Glu Trp Asp Leu

465                 470                 475                 480

Pro Ala Gly Ser Ala Glu Met Asp Met Glu Glu Val Phe Gly Leu Ala

                485                 490                 495

Leu Gln Lys Ala Val Pro Leu Ala Ala Arg Leu Thr Pro Arg Leu Pro

            500                 505                 510

Ser His Cys Tyr Ala Pro Pro Set

        515                 520

<210>15

<211>1617

<212>DNA

<213>鼠尾草

<400>15

agatagtaag catggaagcc caagaaaata tgttgttgat tgctagggca cttgttgtag    60

catccttact ctacattttg atccgtatgt ttatctcaaa attgagcacc cccggccacc    120

ctctgccccc ggggccgagg ggctttccag tggtgggctc ccttcccttg ctgggcgaca    180

tgccacatgt tgccctagca aaaatggcca aaacttatgg cccgatcatg tacttgaaaa    240

tgggcacagt cggcatggtc gtggcgtcca cgccagacgc ggcgcgggcg ttcctaaaaa    300

cccaggacgc taatttctct aaccggccgg tcaacgcggg tgccaccatc ctggcataca    360

atgcccagga catggtgttt gccccgtacg gccccaagtg gagattgctg aggaagctga    420

gcagtctcca catgctgggg agcaaggccc tggaggagtg ggccgacgtc cggacctcgg    480

aggtggggca catgctggcg gcgatgcacg aggccagccg cctggacgag gccgtggggt    540

tgccggagat gctggtgtac gcgacggcga acatgatcgg gaaggtgata ttgagccgga    600

gagttttcgt gacgaaaggg aaggagatga atgagttcaa ggaaatggtg gtggagctca    660

tgaccacagc tggctatttc aacattggtg atttcattcc atggcttgct tggatggatt    720

tgcaggggat tgagagaggg atgaagaaac tgcacaagaa gtgggaccgc ttgatcggta    780

agatgctgga tgatcgattg aaatcaacct acaaacgcaa cgacaagcca gatcttcttg    840

attctctctt ggcaaatcat gatgatgaga gtaaggatga tgatgaggat tgcaagctca    900

ccaccaccaa tattaaagcc cttttactga atttatttac tgcagggaca gacacatcgt    960

cgagcataat agaatgggca ctagcggaga tgatcaagaa tccaagcatc caaaaaaggg    1020

ctcaccaaga gatggacaga gtcatcggga gagagcggcg tttgctcgaa tccgacatcc    1080

caaatctgcc atacctcaaa gccatatgca aagaggcata ccgaaaacac ccttccacgc    1140

cactaaacct gcctcggatc tccacggatg catgcgtcgt cgatggctac cacatcccca    1200

agaacacgag gttgagcgtc aacatctggg ccataggccg agatcccgac gtttgggaga    1260

atccccttga cttcaaccct gacaggttta tgtcagggtt gcaggggatt gagcccggag  1320

ggaatcactt cgagctcatt ccctttgggg cggggcgcag gatctgcgcc ggcagcagaa  1380

tggggattgt aatagtggag tatttgctgg cgacactcgt gcactctttc gaatgggatt  1440

tgccagccgg ctcagcggag atggacatgg aggaggtgtt cgggctggcc ttgcagaaag  1500

ctgtaccact tgctgctagg ctcactccta ggttgccttc acattgctat gcacctcctt  1560

ctatttaatt tgcatattta tatatgttgt gttacattga aaaaaaaaaa aaaaaaa     1617

<210>16

<211>518

<212>PRT

<213>鼠尾草

<400>16

Met Glu Ala Gln Glu Asn Met Leu Leu Ile Ala Arg Ala Leu Val Val

1               5                   10                  15

Ala Ser Leu Leu Tyr Ile Leu Ile Arg Met Phe Ile Ser Lys Leu Ser

            20                  25                  30

Thr Pro Gly His Pro Leu Pro Pro Gly Pro Arg Gly Phe Pro Val Val

        35                  40                  45

Gly Ser Leu Pro Leu Leu Gly Asp Met Pro His Val Ala Leu Ala Lys

    50                  55                  60

Met Ala Lys Thr Tyr Gly Pro Ile Met Tyr Leu Lys Met Gly Thr Val

65                  70                  75                  80

Gly Met Val Val Ala Ser Thr Pro Asp Ala Ala Arg Ala Phe Leu Lys

                85                  90                  95

Thr Gln Asp Ala Asn Phe Ser Asn Arg Pro Val Asn Ala Gly Ala Thr

            100                 105                 110

Ile Leu Ala Tyr Asn Ala Gln Asp Met Val Phe Ala Pro Tyr Gly Pro

        115                 120                 125

Lys Trp Arg Leu Leu Arg Lys Leu Ser Ser Leu His Met Leu Gly Ser

    130                 135                 140

Lys Ala Leu Glu Glu Trp Ala Asp Val Arg Thr Ser Glu Val Gly His

145                 150                 155                 160

Met Leu Ala Ala Met His Glu Ala Ser Arg Leu Asp Glu Ala Val Gly

                165                 170                 175

Leu Pro Glu Met Leu Val Tyr Ala Thr Ala Asn Met Ile Gly Lys Val

            180                 185                 190

Ile Leu Ser Arg Arg Val Phe Val Thr Lys Gly Lys Glu Met Asn Glu

        195                 200                 205

Phe Lys Glu Met Val Val Glu Leu Met Thr Thr Ala Gly Tyr Phe Asn

    210                 215                 220

Ile Gly Asp Phe Ile Pro Trp Leu Ala Trp Met Asp Leu Gln Gly Ile

225                 230                 235                 240

Glu Arg Gly Met Lys Lys Leu His Lys Lys Trp Asp Arg Leu Ile Gly

                245                 250                 255

Lys Met Leu Asp Asp Arg Leu Lys Ser Thr Tyr Lys Arg Asn Asp Lys

            260                 265                 270

Pro Asp Leu Leu Asp Ser Leu Leu Ala Asn His Asp Asp Glu Ser Lys

        275                 280                 285

Asp Asp Asp Glu Asp Cys Lys Leu Thr Thr Thr Asn Ile Lys Ala Leu

    290                 295                 300

Leu Leu Asn Leu Phe Thr Ala Gly Thr Asp Thr Ser Ser Ser Ile Ile

305                 310                 315                 320

Glu Trp Ala Leu Ala Glu Met Ile Lys Asn Pro Ser Ile Gln Lys Arg

                325                 330                 335

Ala His Gln Glu Met Asp Arg Val Ile Gly Arg Glu Arg Arg Leu Leu

            340                 345                 350

Glu Ser Asp Ile Pro Asn Leu Pro Tyr Leu Lys Ala Ile Cys Lys Glu

        355                 360                 365

Ala Tyr Arg Lys His Pro Ser Thr Pro Leu Asn Leu Pro Arg Ile Ser

    370                 375                 380

Thr Asp Ala Cys Val Val Asp Gly Tyr His Ile Pro Lys Asn Thr Arg

385                 390                 395                 400

Leu Ser Val Asn Ile Trp Ala Ile Gly Arg Asp Pro Asp Val Trp Glu

                405                 410                 415

Asn Pro Leu Asp Phe Asn Pro Asp Arg Phe Met Ser Gly Leu Gln Gly

            420                 425                 430

Ile Glu Pro Gly Gly Asn His Phe Glu Leu Ile Pro Phe Gly Ala Gly

        435                 440                 445

Arg Arg Ile Cys Ala Gly Ser Arg Met Gly Ile Val Ile Val Glu Tyr

    450                 455                 460

Leu Leu Ala Thr Leu Val His Ser Phe Glu Trp Asp Leu Pro Ala Gly

465                 470                 475                 480

Ser Ala Glu Met Asp Met Glu Glu Val Phe Gly Leu Ala Leu Gln Lys

                485                 490                 495

Ala Val Pro Leu Ala Ala Arg Leu Thr Pro Arg Leu Pro Ser His Cys

            500                 505                 510

Tyr Ala Pro Pro Ser Ile

        515

<210>17

<211>1730

<212>DNA

<213>sollya

<220>

<221>misc_feature

<222>(1372)..(1372)

<223>n＝任何核苷酸

<400>17

gatggctact accttagaat tcattctatg cttcaccatt actgcacttc cttttctata    60

ttgcatactt aacatgcgca tcctccttaa ccgtcacccg aggtcactcc caccaggtcc    120

aagaccatgg cctattgtag gaaacctccc acaccttggc accaagccac accactccat    180

agctgccatg gctcggaaat acggtcccct cctgcacctc cgcatgggca tcgtgcacgt    240

ggtggttgcc gcctctgctg atgtggcggc acagttcttg aagaatgatg ccaacttctc    300

tagccggcca ccgaattctg gtgctaagca tatggcttat aactatcacg acatggtgtt    360

tgcaccctac ggtccaaggt ggcgcatgtt gaggaaaatt tgtgcccttc atatattctc    420

cgctaaggct ctcgatgatt ttcatcgcgt gcgtgaggag gaggttgcca tactcgcgag    480

gaccctagca cacgcaggcc aaaagccggt gaatttgggg cagttgttct ctacgtgtaa    540

tgctaatgcg ctatcagtgc tgatgctagg caggaggttg ttcagcacag aagttgattc    600

aaaagcatat gatttcaaac aaatggtggt ggagctgatg actctagccg gtgagtttaa    660

cgtcagtgat ttcatcccac ccctcgagtg gctagacttg caaggcgtgg cagcgaaaat    720

gaagaacgtg cacaatcgat tcgatgcgtt tctgaatgta attttggagg agcataagct    780

gaaacttaat aatagtggac atggggaaca aaaacatatg gacttgttga gtacgttgat    840

tttgcttaag gatgatgctg atagtgaggg aggaaaactc actgatactg aaatcaaagc    900

gctgcttttg aatttgtttt ctgctgggac ggacacttca tccagcacaa tagaatgggt    960

tatagctgag cttatacgca atcctaaaat cttagcccaa gcccaaagag agttggactt    1020

ggtggttggt ccaaatagac ttgtaacgga tttggacctc aaacaattaa cctacctaca    1080

agccatcgtc aaagaaacct ttcggctaca tcctgctacc ccactttcac ttccacggat    1140

cgcaaccgaa agctgtgaaa tcaacgggtt ttacattcca aagggctcaa cacttctcgt    1200

taacatatgg gccataggcc gtgatccaaa cacttgggct gaaccattgg tattccgacc    1260

tgaacgattc ttatcggatg gtgaaagtcc taatgttgat gttaaaggac gtaattttga    1320

attgatacca tttggggcgg ggcgaagaat ttgtgctggg atgaactttg gnctacgcat    1380

ggtccagtta gttactgcaa cgttaattca tgcatttaac tgggagttgc cagaagggga    1440

attgccagaa aatatgaata tggaggaaga ctatgggatt agcttgcaac ggacagtgcc    1500

attagttgtt catccaaagc ccagactaga ccatgaagtt tatcagtccc atggagttgt    1560

aaactgagta cattcatgaa ctgacccaga agctgtcaga tgtcgtctta tattgcctta    1620

tgtagtgcga cccttgtgtg ttttttatgt attgttttgt acaaggttga agcccgtgcg    1680

gcgcatggac aattttataa gttaatttta ataaaaaaaa aaaaaaaaaa               1730

<210>18

<211>521

<212>PRT

<213>sollya

<400>18

Met Ala Thr Thr Leu Glu Phe Ile Leu Cys Phe Thr Ile Thr Ala Leu

1               5                   10                  15

Pro Phe Leu Tyr Cys Ile Leu Asn Met Arg Ile Leu Leu Asn Arg His

            20                  25                  30

Pro Arg Ser Leu Pro Pro Gly Pro Arg Pro Trp Pro Ile Val Gly Asn

        35                  40                  45

Leu Pro His Leu Gly Thr Lys Pro His His Ser Ile Ala Ala Met Ala

    50                  55                  60

Arg Lys Tyr Gly Pro Leu Leu His Leu Arg Met Gly Ile Val His Val

65                  70                  75                  80

Val Val Ala Ala Ser Ala Asp Val Ala Ala Gln Phe Leu Lys Asn Asp

                85                  90                  95

Ala Asn Phe Ser Ser Arg Pro Pro Asn Ser Gly Ala Lys His Met Ala

            100                 105                 110

Tyr Asn Tyr His Asp Met Val Phe Ala Pro Tyr Gly Pro Arg Trp Arg

        115                 120                 125

Met Leu Arg Lys Ile Cys Ala Leu His Ile Phe Ser Ala Lys Ala Leu

    130                 135                 140

Asp Asp Phe His Arg Val Arg Glu Glu Glu Val Ala Ile Leu Ala Arg

145                 150                 155                 160

Thr Leu Ala His Ala Gly Gln Lys Pro Val Asn Leu Gly Gln Leu Phe

                165                 170                 175

Ser Thr Cys Asn Ala Asn Ala Leu Ser Val Leu Met Leu Gly Arg Arg

            180                 185                 190

Leu Phe Ser Thr Glu Val Asp Ser Lys Ala Tyr Asp Phe Lys Gln Met

        195                 200                 205

Val Val Glu Leu Met Thr Leu Ala Gly Glu Phe Asn Val Ser Asp Phe

    210                 215                 220

Ile Pro Pro Leu Glu Trp Leu Asp Leu Gln Gly Val Ala Ala Lys Met

225                 230                 235                 240

Lys Asn Val His Asn Arg Phe Asp Ala Phe Leu Asn Val Ile Leu Glu

                245                 250                 255

Glu His Lys Leu Lys Leu Asn Asn Ser Gly His Gly Glu Gln Lys His

            260                 265                 270

Met Asp Leu Leu Ser Thr Leu Ile Leu Leu Lys Asp Asp Ala Asp Ser

        275                 280                 285

Glu Gly Gly Lys Leu Thr Asp Thr Glu Ile Lys Ala Leu Leu Leu Asn

    290                 295                 300

Leu Phe Ser Ala Gly Thr Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ile Glu Trp Val

305                 310                 315                 320

Ile Ala Glu Leu Ile Arg Asn Pro Lys Ile Leu Ala Gln Ala Gln Arg

                325                 330                 335

Glu Leu Asp Leu Val Val Gly Pro Asn Arg Leu Val Thr Asp Leu Asp

            340                 345                 350

Leu Lys Gln Leu Thr Tyr Leu Gln Ala Ile Val Lys Glu Thr Phe Arg

        355                 360                 365

Leu His Pro Ala Thr Pro Leu Ser Leu Pro Arg Ile Ala Thr Glu Ser

    370                 375                 380

Cys Glu Ile Asn Gly Phe Tyr Ile Pro Lys Gly Ser Thr Leu Leu Val

385                 390                 395                 400

Asn Ile Trp Ala Ile Gly Arg Asp Pro Asn Thr Trp Ala Glu Pro Leu

                405                 410                 415

Val Phe Arg Pro Glu Arg Phe Leu Ser Asp Gly Glu Ser Pro Asn Val

            420                 425                 430

Asp Val Lys Gly Arg Asn Phe Glu Leu Ile Pro Phe Gly Ala Gly Arg

        435                 440                 445

Arg Ile Cys Ala Gly Met Asn Phe Gly Leu Arg Met Val Gln Leu Val

    450                 455                 460

Thr Ala Thr Leu Ile His Ala Phe Asn Trp Glu Leu Pro Glu Gly Glu

465                 470                 475                 480

Leu Pro Glu Asn Met Asn Met Glu Glu Asp Tyr Gly Ile Ser Leu Gln

                485                 490                 495

Arg Thr Val Pro Leu Val Val His Pro Lys Pro Arg Leu Asp His Glu

            500                 505                 510

Val Tyr Gln Ser His Gly Val Val Asn

        515                 520

<210>19

<211>37

<212>DNA

<213>矮牵牛

<400>19

aaaatcgata ccatggtctt tttttctttg tctatac                               37

<210>20

<211>1748

<212>DNA

<213>蝶豆

<400>20

ggatccaaca atgttccttc taagagaaat tggggtatca attttgatct tcatgatcac    60

ccatcttgtg attcgtttag ttctgaaaga gaaggaacaa cggaaacttc caccagggcc    120

aaaaggttgg ccaattgtgg gtgcactgcc tctaatggga agcatgcccc atgtcacact    180

ctcagaaatg gctaaaaaat atggacctgt tatgtacctt aaaatgggca caaacaacat    240

ggctgtagca tctactccct ctgcagctcg tgcattcctc aaaacccttg accttaactt    300

ctccaatcgc cccccaaatg ctggggcaac tcacttagct tatgatgccc aggacatggt    360

gtttgctgat tacggatcta ggtggaagtt gcttagaaaa ctaagcaact tacacatgct    420

tggaggaaag gctcttgaag aatggtcaca agttagagag attgagatgg ggcacatgct    480

tcgtgcaatg tacgattgta gtggtggcgg tgacggcaac aacgacaatg atggcaacaa    540

gaaaaagggt actcgtcatg agcctattgt ggtggctgaa atgttaacat acgcgatggc    600

caacatgata ggtcaagtga tcttgagccg tcgtgtattc gagacaaagg gttcggaatc    660

gaacgagttt aaggacatgg tggttcagct catgaccgtt gctggctact ttaacattgg    720

tgattttatt ccctttttgg ctcgcttcga cctccaaggc atcgagcgtg gcatgaaaac    780

tttgcataac aagttcgatg ttttgttgac gacaatgatt catgagcatg tggcttctgc    840

tcataaacga aagggtaaac ctgatttctt ggatgttctc atggctcatc ataccaacga  900

gtctcatgaa ctgtcgctca ccaacatcaa agcactcctc ttaaatctat ttactgcagg  960

cacagataca tcatcaagta tcatagagtg ggcactagca gagatgttga taaacccaaa  1020

aatcatgaag aaagtgcatg aggaaatgga caaagtgata ggcaaggata gaaggctaaa  1080

agaatccgac atagaaaatc tcccttactt gcaggcaatt tgcaaagaga catatagaaa  1140

gcacccatca acgccactca acttgcctag aatctcatcc caagcatgcc aagtgaatgg  1200

ctactacatc ccaaagaaca ctaggcttag tgtcaacatc tgggccattg gaagagaccc  1260

taatgtgtgg gagaaccctt tggagttcaa tccagagagg tttatgggtg ccaataagac  1320

tattgatcca cgtgggaatg attttgagct cattccattt ggtgctggga gaaggatttg  1380

tgctgggaca aggatgggga ttgtgttggt tcaatacatt ttgggcactt tggtacattc  1440

ctttgattgg aagttaccaa atggtgttgt ggagttgaac atggaagaga cttttggcct  1500

tgctttgcag aaaaagatac cactttctgc tttgattacc cctaggttgc ccccaactgc  1560

ttacaatgtt attaattcct aatttgatct tagtactatg gtaagttata accaaataag  1620

taattactgt ttgtattaat gtttctgaat tccgagtgtc tttctttgtt gtatgggaaa  1680

tctgtaccca ccacctggga ttaatgtttt aattaatttt catatgttta aaaaaaaaaa  1740

aaaaaaaa                                                           1748

<210>21

<211>525

<212>PRT

<213>蝶豆

<400>21

Met Phe Leu Leu Arg Glu Ile Gly Val Ser Ile Leu Ile Phe Met Ile

I               5                   10                  15

Thr His Leu Val Ile Arg Leu Val Leu Lys Glu Lys Glu Gln Arg Lys

            20                  25                  30

Leu Pro Pro Gly Pro Lys Gly Trp Pro Ile Val Gly Ala Leu Pro Leu

        35                  40                  45

Met Gly Ser Met Pro His Val Thr Leu Ser Glu Met Ala Lys Lys Tyr

    50                  55                  60

Gly Pro Val Met Tyr Leu Lys Met Gly Thr Asn Asn Met Ala Val Ala

65                  70                  75                  80

Ser Thr Pro Ser Ala Ala Arg Ala Phe Leu Lys Thr Leu Asp Leu Asn

                85                  90                  95

Phe Ser Asn Arg Pro Pro Asn Ala Gly Ala Thr His Leu Ala Tyr Asp

            100                 105                 110

Ala Gln Asp Met Val Phe Ala Asp Tyr Gly Ser Arg Trp Lys Leu Leu

        115                 120                 125

Arg Lys Leu Ser Asn Leu His Met Leu Gly Gly Lys Ala Leu Glu Glu

    130                 135                 140

Trp Ser Gln Val Arg Glu Ile Glu Met Gly His Met Leu Arg Ala Met

145                 150                 155                 160

Tyr Asp Cys Ser Gly Gly Gly Asp Gly Asn Asn Asp Asn Asp Gly Asn

                165                 170                 175

Lys Lys Lys Gly Thr Arg His Glu Pro Ile Val Val Ala Glu Met Leu

            180                 185                 190

Thr Tyr Ala Met Ala Asn Met Ile Gly Pro Ser Asp Leu Glu Pro Ser

        195                 200                 205

Cys Ile Pro Arg Gln Arg Val Arg Asn Arg Thr Ser Leu Arg Thr Trp

    210                 215                 220

Trp Phe Lys Leu Met Thr Val Ala Gly Tyr Phe Asn Ile Gly Asp Phe

225                 230                 235                 240

Phe Pro Phe Leu Ala Arg Arg Arg Arg Gln Gly Ile Glu Arg Gly Met

                245                 250                 255

Lys Thr Leu His Asn Lys Lys Asp Asp Leu Leu Thr Thr Met Ile His

            260                 265                 270

Glu His Val Ala Ser Ala His Lys Arg Lys Gly Lys Pro Pro Phe Leu

        275                 280                 285

Asp Val Leu Met Ala His His Thr Asn Glu Ser His Glu Leu Ser Leu

    290                 295                 300

Thr Asn Ile Lys Ala Leu Leu Leu Asn Leu Phe Thr Ala Gly Thr Asp

305                 310                 315                 320

Thr Ser Ser Ser Ile Ile Glu Trp Ala Leu Ala Glu Met Leu Ile Asn

                325                 330                 335

Pro Lys Ile Met Lys Lys Val His Glu Glu Met Asp Lys Val Ile Gly

            340                 345                 350

Lys Asp Arg Arg Leu Lys Glu Ser Asp Ile Glu Asn Leu Pro Tyr Leu

        355                 360                 365

Gln Ala Ile Cys Lys Glu Thr Tyr Arg Lys His Pro Ser Thr Pro Leu

    370                 375                 380

Asn Leu Pro Arg Ile Ser Ser Gln Ala Cys Gln Val Asn Gly Tyr Tyr

385                 390                 395                 400

Ile Pro Lys Asn Thr Arg Leu Ser Val Asn Ile Trp Ala Ile Gly Arg

                405                 410                 415

Asp Pro Asn Val Trp Glu Asn Pro Leu Glu Phe Asn Pro Glu Arg Phe

            420                 425                 430

Met Gly Ala Asn Lys Thr Ile Asp Pro Arg Gly Asn Asp Phe Glu Leu

        435                 440                 445

Ile Pro Phe Gly Ala Gly Arg Arg Ile Cys Ala Gly Thr Arg Met Gly

    450                 455                 460

Ile Val Leu Val Gln Tyr Ile Leu Gly Thr Leu Val His Ser Phe Asp

465                 470                 475                 480

Trp Lys Leu Pro Asn Gly Val Val Glu Leu Asn Met Glu Glu Thr Phe

                485                 490                 495

Gly Leu Ala Leu Gln Lys Lys Ile Pro Leu Ser Ala Leu Ile Thr Pro

            500                 505                 510

Arg Leu Pro Pro Thr Ala Tyr Asn Val Ile Asn Ser Ser

        515                 520                 525

<210>22

<211>1684

<212>DNA

<213>龙胆

<400>22

tacaaatgtc acccatttac accaccctca cattacacct tgctacagct ctttttctct    60

tctttcatgt ccagaaactt gttcactacc tccacggcaa agccaccggc caccgctgcc    120

gccgccttcc accagggccc accggatggc caatcctagg tgcccttcct cttttgggca    180

acatgccaca tgttactttt gctaacatgg cgaaaaaata tggctcggta atgtacctaa    240

aagtcggtag ccatggctta gcaatagcgt cgacaccgga cgctgctaaa gcgttcctca    300

aaaccctcga tttaaatttc tcgaaccggc caccaaatgc cggagctacc catttagcct    360

ataacgctca agatatggtt tttgcacatt atggtcctaa atggaaattg ttacgtaaac    420

tcagtaactt acacatgcta ggtggcaaag ccttggaaaa ttgggctgat gttagaaaaa    480

cagagcttgg ttatatgctt aaagccatgt ttgaatcgag tcaaaacaat gagccggtga    540

tgatttcgga gatgctaacg tacgccatgg cgaacatgtt aagccaagtt atacttagcc    600

gtcgcgtatt caataaaaaa ggcgcgaaat caaacgagtt taaagatatg gtggtcgaat    660

taatgacgag tgccgggtat ttcaatatag gtgattttat accatcaatt ggttggatgg    720

atttgcaagg gattgaaggt ggaatgaaaa gattgcacaa aaagttcgac gttttgttga    780

ctcgattatt ggatgatcat aaaagaacga gtcaggagcg taaacaaaag cccgattttc    840

ttgattttgt gattgcaaat ggcgataatt ctgatggtga aaggctcaac accgacaaca    900

tcaaggctct tttattgaac ttgtttactg ctggtacgga tacatcatca agcatcattg    960

agtgggcact agcagaactg ctaaagaatc ggacactcct cacccgagcc caggacgaaa    1020

tggatcgggt aatcgggcga gaccgccgtc ttcttgaatc agacatcccc aacttaccat    1080

atcttcaagc aatctgcaaa gaaacattcc gtaaacaccc ttcaacacca ttaaaccttc    1140

caaggaattg catcagaggc catgtggatg taaatgggta ctacattccg aaagggactc    1200

ggctcaacgt caacatatgg gcgattggaa gagacccatc ggtttggggg gataacccga    1260

acgagttcga cccggagagg tttttgtatg ggaggaatgc taagattgat ccacgaggaa    1320

accattttga attgatccca tttggtgctg gacgaagaat ttgtgcagga acaagaatgg    1380

ggatattgct tgttgagtat attttgggga cattggtgca tagttttgat tggaaactgg    1440

gattttctga ggatgagctt aatatggatg agacatttgg gcttgctctg cagaaagctg    1500

tgcctttagc ggccatggtt attccacgcc ttcctcttca tgtttatgct ccttaattca    1560

gagatttaat ttcatgcttt gttttattaa tcattttctt aatatgaatt gatggaggtt  1620

atctagttat gaaaaataat aatggaggat ttgtttatca tcatgcaaaa aaaaaaaaaa  1680

aaaa                                                               1684

<210>23

<211>516

<212>PRT

<213>龙胆

<400>23

Met Ser Pro Ile Tyr Thr Thr Leu Thr Leu His Leu Ala Thr Ala Leu

1               5                   10                  15

Phe Leu Phe Phe His Val Gln Lys Leu Val His Tyr Leu His Gly Lys

            20                  25                  30

Ala Thr Gly His Arg Cys Arg Arg Leu Pro Pro Gly Pro Thr Gly Trp

        35                  40                  45

Pro Ile Leu Gly Ala Leu Pro Leu Leu Gly Asn Met Pro His Val Thr

    50                  55                  60

Phe Ala Asn Met Ala Lys Lys Tyr Gly Ser Val Met Tyr Leu Lys Val

65                  70                  75                  80

Gly Ser His Gly Leu Ala Ile Ala Ser Thr Pro Asp Ala Ala Lys Ala

                85                  90                  95

Phe Leu Lys Thr Leu Asp Leu Asn Phe Ser Asn Arg Pro Pro Asn Ala

            100                 105                 110

Gly Ala Thr His Leu Ala Tyr Asn Ala Gln Asp Met Val Phe Ala His

        115                 120                 125

Tyr Gly Pro Lys Trp Lys Leu Leu Arg Lys Leu Ser Asn Leu His Met

    130                 135                 140

Leu Gly Gly Lys Ala Leu Glu Asn Trp Ala Asp Val Arg Lys Thr Glu

145                 150                 155                 160

Leu Gly Tyr Met Leu Lys Ala Met Phe Glu Ser Ser Gln Asn Asn Glu

                165                 170                 175

Pro Val Met Ile Ser Glu Met Leu Thr Tyr Ala Met Ala Asn Met Leu

            180                 185                 190

Ser Gln Val Ile Leu Ser Arg Arg Val Phe Asn Lys Lys Gly Ala Lys

        195                 200                 205

Ser Asn Glu Phe Lys Asp Met Val Val Glu Leu Met Thr Ser Ala Gly

    210                 215                 220

Tyr Phe Asn Ile Gly Asp Phe Ile Pro Ser Ile Gly Trp Met Asp Leu

225                 230                 235                 240

Gln Gly Ile Glu Gly Gly Met Lys Arg Leu His Lys Lys Phe Asp Val

                245                 250                 255

Leu Leu Thr Arg Leu Leu Asp Asp His Lys Arg Thr Ser Gln Glu Arg

            260                 265                 270

Lys Gln Lys Pro Asp Phe Leu Asp Phe Val Ile Ala Asn Gly Asp Asn

        275                 280                 285

Ser Asp Gly Glu Arg Leu Asn Thr Asp Asn Ile Lys Ala Leu Leu Leu

    290                 295                 300

Asn Leu Phe Thr Ala Gly Thr Asp Thr Ser Ser Ser Ile Ile Glu Trp

305                 310                 315                 320

Ala Leu Ala Glu Leu Leu Lys Asn Arg Thr Leu Leu Thr Arg Ala Gln

                325                 330                 335

Asp Glu Met Asp Arg Val Ile Gly Arg Asp Arg Arg Leu Leu Glu Ser

            340                 345                 350

Asp Ile Pro Asn Leu Pro Tyr Leu Gln Ala Ile Cys Lys Glu Thr Phe

        355                 360                 365

Arg Lys His Pro Ser Thr Pro Leu Asn Leu Pro Arg Asn Cys Ile Arg

    370                 375                 380

Gly His Val Asp Val Asn Gly Tyr Tyr Ile Pro Lys Gly Thr Arg Leu

385                 390                 395                 400

Asn Val Asn Ile Trp Ala Ile Gly Arg Asp Pro Ser Val Trp Gly Asp

                405                 410                 415

Asn Pro Asn Glu Phe Asp Pro Glu Arg Phe Leu Tyr Gly Arg Asn Ala

            420                 425                 430

Lys Ile Asp Pro Arg Gly Asn His Phe Glu Leu Ile Pro Phe Gly Ala

        435                 440                 445

Gly Arg Arg Ile Cys Ala Gly Thr Arg Met Gly Ile Leu Leu ValGlu

    450                 455                 460

Tyr Ile Leu Gly Thr Leu Val His Ser Phe Asp Trp Lys Leu Gly Phe

465                 470                 475                 480

Ser Glu Asp Glu Leu Asn Met Asp Glu Thr Phe Gly Leu Ala Leu Gln

                485                 490                 495

Lys Ala Val Pro Leu Ala Ala Met Val Ile Pro Arg Leu Pro Leu His

            500                 505                 510

Val Tyr Ala Pro

        515

<210>24

<211>3731

<212>DNA

<213>矮牵牛

<400>24

tctagatatg cattttggtc gacgaactca caaatttgta ccaaacatgt aatttttttt    60

ttctttttta cccttttaaa cattacaatt gaataagtag tacaacaaca tacccagttt    120

tattttacag gtgggacctg gggagggtga aatgtacgca caccttacca ccaccaaggt    180

ggagaggcag tttccggtag agcctcggct gaagaaaata tttcgagaac acgtttgaaa    240

aataggacag aaagaacaca ctataaaata ataaaactaa agcatataca tattaaacat    300

atagtagcag taggtataaa ggcactgact acgacagaaa taatctatat ataggagaga    360

agacactcat ccattatcta cccttctact ttaatcattg acctccaagc tttcctatct    420

agggtcatgt cctcggtgat ctagatctgg gccatgtctt atctaatcac ctcggtccag    480

ttcttcttag gtctacctct acctctccgt agacctaaca ctgcgaacct ctcacacctc    540

ctaaccgagc atctggactt ctcctcttta cgtatctgaa ccatctcaat cttgtctctc    600

gcatcttttc tgccactgga gatacgtcca ccttgtctca agtgatctca ttcataatct    660

tgcccctcct agtattccca aacatccatc tgagcattct taattctgcc acaccaaacc    720

ttctaaatgt gtgagttctt gactggcaaa cactcagccc catacaatat agctggtata    780

acgaccatgt ataatataat gaagctaatt aaaatcatta attactactt gtacatatgg    840

cacggaaaag aagttcattg aacaataatg gatataaaaa ttgcggtcaa cacattggtg    900

agggaaatat ttttatcagc acaccaacat ttccaaacat caataaagca atgaagatgg    960

atagatcaag gtgtcctttt tcatcttatt aggaaaataa aatttgaaga tgcaaatcca    1020

aggacgatca tgcattctaa attaatagtt aatgattcta attttcattt atttaaattt    1080

tgatttttgc ggcttcaaat tcatatttga ttttcaacca cataaatatt taattatgac    1140

ttgtgttagg caacaaatac caaaagtctt actactttct tttggagatt gacctttcta    1200

tatctccttc ccaatttgat cgatcgagct ctcgtaatct attgctactg tgtctttttt    1260

gttctggcta gcgaagacag aatattctac gtaaactcta tgtcaagtca aaccgtgcca    1320

cataaaataa aatgtaggga atatagatca attagtgtct aagtgtacaa ctatatatat    1380

gttatctaag aatagattag attacaaaaa tgtatttacc attgattgat cactactttt    1440

cagcgaatta gtcaagaggt cagggttatt tataaaacat gcataatgta tacatatcat    1500

gccgtggcca ttgtacaatt atgttataaa aggtatacat taaatataac ttgtatttat    1560

tttttataca tgtcagcaat gtttgaaagt gtgaagttcc ctggttctta taattcaatc    1620

ttctgataat gtttttaacc ggccagaaca cagcattaac tccattaatc ataccaatta    1680

tgaccatgga atcagattct agtaacaaca tacccggcta tattctacaa gtggggcctg    1740

aggagggtaa ggtatacgta aaccatacac ttaaggtaga gaaattattt ctgaaagatc    1800

ctagactcac acgtttcgaa aaataggttt aaaaaatact tacataaaaa aaaaataata    1860

aaataaagat acagataaag ataaacagag taaacaaaac aacaatggta atatacagac    1920

aaaaagcaag ataaaaatag tatatggaag aaaaatacaa atgcttatat gacagaagtc    1980

gctcgactac cttcaaacgt tctactctaa tccttgacct ccatacactc ctatctaagg    2040

ttatgtcctc gattatccga aagattgaat cttgaatcaa attctatata tacaagaatt    2100

atttaactcc tgtattacaa gttcttatat ttcatcgaac aaccactttt ggttcatcaa    2160

gaatagtgca atatagataa aattatctct aaatactttg gacgagggat tatcatttaa    2220

atgtaataag aaaaatgtcg atggtattgg aagtgcaaac aaagtcccac atcggtagtt    2280

gaaaagtttg gaatccaacg tataaggtgt atgtatctct taatggtgta agacatttta    2340

tgaaaactgt gttggcttag ccaaaagcga acaatatcac tccatttcaa gaatatcttg    2400

gttgttttag tccagcaact ggtatcagag caaatggttt agcaaaatga gtatgttgtg  2460

tagtgattgc gtggggcatg acttagcctt tacccttgac ttggagaggg cccggttaat  2520

gtctttgctc atctacagcc agtttattac ctttccatgt agctttaaag acgcacacag  2580

aggtattcgg ttgatgtggg tgacacacaa taaatctcca aataaaccca atagtggtga  2640

ttggtcatgt gaaacttagt tcgaggggga gattgttgag agtgtgaaca aaaagtccta  2700

catatagatg aaaagtttag gagcctattt ataaggtata tggatctctt aataatgtgg  2760

gggtttatag gaatttagat tttacttata tcgtttataa attgattaga tacgggacca  2820

tccagcttcc taaaatgtag gcacgttcca tgcttcaatg ttccatctga tttgtaggct  2880

ataaaggtag aatacgttta agaaagttta taatttacgt aataatccaa aagtgaaatg  2940

tgtttattta ttggttatac tctaattggt gtttatgtga tctaattttc gtccggatca  3000

gtctccaaag attagccaca aatacatatg tgttcataaa atgttacact tgggaactaa  3060

ctttataggt agctcgatct attagtaatg gtaaaacttc accgtgttat ttgcagcaag  3120

ccaataaatg cacgatatat gattatacat aaatttttat catttgatca tcatggttaa  3180

tacttcaacc gtcccaaaat agatggttag ttttcacttt tttttatcaa aataaatgtt  3240

aatttagaat atcaatgaaa ttactttttt ttttaaccaa tattgtcctt gctattgaaa  3300

aggtagaata tgataattta ttcttttaca tataacaatg aaataaataa gaataattag  3360

gtaaaatata tgtatagtag atacatgttt ttctcaatgg gcataaaaat gtgaaattca  3420

attataacgg gataaggggt atatttctca gctcactcta atacaatttg gtgtaaatac  3480

cgaatgcgag tatttaacct gagtttggta attatgtacc atcagaaatc gcatcgaatg  3540

taactcaaaa atagtacaaa caaattccct cactgctcca ttggccatta atttaggtcc  3600

aattttcact ctataaaagc ccataggatc tctctagctt ttgtactcaa cactcaggca  3660

aaaccattag caatatcgtc cactacttcc tccgactatt ctctccattg tattatcttt  3720

cctcttaaac a                                                       3731

<210>25

<211>31

<212>DNA

<213>蝶豆

<400>25

gggatccaac aatgttcctt ctaagagaaa t                                 31

<210>26

<211>1831

<212>DNA

<213>kennedia

<400>26

cccctgaata tcctcactaa agggaacaaa agctggagct ccaccgcggt ggcggccgct    60

ctagaactag tggatccccc gggctgcagg aattttttaa atattaaaga ttttgataaa    120

atttaaaatc ttagtacggc atggccaact tagatcactt gttccttctc aaagaaattg    180

ctatgtccat tttgatcttc ttgatcactc acctcaccat tcattcactc ttcacaaacc    240

gtcacaaaaa gcttccacca gggcctagag gctggccaat cgtaggtgcc ctccctgtct    300

tgggaagcat gcctcatgtc accctctcta gaatggccaa aaagtatgga cccgtcatgt    360

acctcaagat gggcaccaaa aacatggttg tggcctctac tcccgctgca gctcgtgcat    420

tcctcaaaac ccttgatcaa aacttctcca accgccctcc aaatgctggt gcaactcact    480

tagcttatga ttcacaggac atggtgtttg cccactatgg ctctaggtgg aggttgctta    540

ggaaactgag caacttgcac atgctgggtg gaaaggctct tgatgattgg gcacatgttc    600

gggagaaaga gatgaggtac atgcttggtt caatgtatga ttgtagcaaa aggggtgagg    660

ctgtggtggt ggctgagatg ttgacatatg ctatggccaa tatgattggt caagtgatat    720

tgagccgtcg tgtgttcgag tcaaagggtt cggaatcaaa cgagttcaag gacatggttg    780

ttgagctcat gaccgttgcc gggtacttca acattggaga ttttgtgcct tttcttgcgt    840

ggtttgactt gcaaggcata gagcgtgaga tgaaggcctt gcataagaag tttgatgcgt    900

tgttgacaag gatgattgag gagcatgtgg cttctagatg tcacaaaggt aaaggaaact    960

atgatttcct agacgttgtc atggatcatt ctagcgaaag cagtgatgga gagagactca    1020

cactcaccaa tgtcaaggca ctgctcttga atcttttcac agcaggcact gatacatctt    1080

cgagtgtgat agagtgggca ctagcggaga tgttgaaaaa tccccacata acaaagagag    1140

ctcatgagga aatggaccaa gtcataggca aggatcgacg cctcaaggaa tctgacctaa    1200

ggaaccttcc ttacttgcaa gctatttgca aagaggcatt gagaaagcac ccttcaaccc    1260

cattgaactt gcctagagtc tcatcacaac cgtgccaagt gaatggctat tacatcccca    1320

agaacactag gctgagtgtg aacatatggg ccattggaag agaccccgag gtgtgggaga    1380

acccttgtga gttcaatcct gagaggttta tgagtggaaa aggtgccaaa gttgatccac    1440

atgggaatga ttttgagctg attccgtttg gtgctgggag aagggtgtgt gctgggacaa    1500

ggatggggat tgtgatggtt cagtacatat tgggcacttt ggtgcactca tttgaatgga    1560

agctaccaaa tggggtggtg gagttgaaca tggaagagac ctttgggctt gccttgcaga    1620

aaaaggtgcc actctcggct ttggttagcc ctaggttgca cccaagttct tatattcagt    1680

agagttgggt ttggtttggt tcaccaactc tgttcaaaca ttatgtctag ctatttaaaa    1740

attacaatac atgctttaag gttatgtgac tatatattgc gcaaaccgcg caaataataa    1800

atgtgctttg gatcaaaaaa aaaaaaaaaa a                                   1831

<210>27

<211>513

<212>PRT

<213>kennedia

<400>27

Met Ala Asn Leu Asp His Leu Phe Leu Leu Lys Glu Ile Ala Met Ser

1               5                   10                  15

Ile Leu Ile Phe Leu Ile Thr His Leu Thr Ile His Ser Leu Phe Thr

            20                  25                  30

Asn Arg His Lys Lys Leu Pro Pro Gly Pro Arg Gly Trp Pro Ile Val

        35                  40                  45

Gly Ala Leu Pro Val Leu Gly Set Met Pro His Val Thr Leu Ser Arg

    50                  55                  60

Met Ala Lys Lys Tyr Gly Pro Val Met Tyr Leu Lys Met Gly Thr Lys

65                  70                  75                  80

Asn Met Val Val Ala Ser Thr Pro Ala Ala Ala Arg Ala Phe Leu Lys

                85                  90                  95

Thr Leu Asp Gln Asn Phe Ser Asn Arg Pro Pro Asn Ala Gly Ala Thr

            100                 105                 110

His Leu Ala Tyr Asp Ser Gln Asp Met Val Phe Ala His Tyr Gly Ser

        115                 120                 125

Arg Trp Arg Leu Leu Arg Lys Leu Ser Asn Leu His Met Leu Gly Gly

    130                 135                 140

Lys Ala Leu Asp Asp Trp Ala His Val Arg Glu Lys Glu Met Arg Tyr

145                 150                 155                 160

Met Leu Gly Ser Met Tyr Asp Cys Ser Lys Arg Gly Glu Ala Val Val

                165                 170                 175

Val Ala Glu Met Leu Thr Tyr Ala Met Ala Asn Met Ile Gly Gln Val

            180                 185                 190

Ile Leu Ser Arg Arg Val Phe Glu Ser Lys Gly Ser Glu Ser Asn Glu

        195                 200                 205

Phe Lys Asp Met Val Val Glu Leu Met Thr Val Ala Gly Tyr Phe Asn

    210                 215                 220

Ile Gly Asp Phe Val Pro Phe Leu Ala Trp Phe Asp Leu Gln Gly Ile

225                 230                 235                 240

Glu Arg Glu Met Lys Ala Leu His Lys Lys Phe Asp Ala Leu Leu Thr

                245                 250                 255

Arg Met Ile Glu Glu His Val Ala Ser Arg Cys His Lys Gly Lys Gly

            260                 265                 270

Asn Tyr Asp Phe Leu Asp Val Val Met Asp His Ser Ser Glu Ser Ser

        275                 280                 285

Asp Gly Glu Arg Leu Thr Leu Thr Asn Val Lys Ala Leu Leu Leu Asn

    290                 295                 300

Leu Phe Thr Ala Gly Thr Asp Thr Ser Ser Ser Val Ile Glu Trp Ala

305                 310                 315                 320

Leu Ala Glu Met Leu Lys Asn Pro His Ile Thr Lys Arg Ala His Glu

                325                 330                 335

Glu Met Asp Gln Val Ile Gly Lys Asp Arg Arg Leu Lys Glu Ser Asp

            340                 345                 350

Leu Arg Asn Leu Pro Tyr Leu Gln Ala Ile Cys Lys Glu Ala Leu Arg

        355                 360                 365

Lys His Pro Ser Thr Pro Leu Asn Leu Pro Arg Val Ser Ser Gln Pro

    370                 375                 380

Cys Gln Val Asn Gly Tyr Tyr Ile Pro Lys Asn Thr Arg Leu Ser Val

385                 390                 395                 400

Asn Ile Trp Ala Ile Gly Arg Asp Pro Glu Val Trp Glu Asn Pro Cys

                405                 410                 415

Glu Phe Asn Pro Glu Arg Phe Met Ser Gly Lys Gly Ala Lys Val Asp

            420                 425                 430

Pro His Gly Asn Asp Phe Glu Leu Ile Pro Phe Gly Ala Gly Arg Arg

        435                 440                 445

Val Cys Ala Gly Thr Arg Met Gly Ile Val Met Val Gln Tyr Ile Leu

    450                 455                 460

Gly Thr Leu Val His Ser Phe Glu Trp Lys Leu Pro Asn Gly Val Val

465                 470                 475                 480

Glu Leu Asn Met Glu Glu Thr Phe Gly Leu Ala Leu Gln Lys Lys Val

                485                 490                 495

Pro Leu Ser Ala Leu Val Ser Pro Arg Leu His Pro Ser Ser Tyr Ile

            500                 505                 510

Gln

<210>28

<211>1374

<212>DNA

<213>菊花

<400>28

gaattccgtt gctgtcgcta cttacaaaga tcatatacat tttcgttcac cgatattaaa    60

caccgatggc ttccttaact gacattgcgg ccattagaga ggctcaacgg gctcaaggtc    120

cagctaccat tctagcgatc ggcactgcaa ctccggctaa ttgtgtatat caagctgatt    180

atcccgatta ctattttcgg atcactaaaa gtgaacacat ggtggatctt aaagagaaat    240

tcaagcgcat gtgcgacaag tctatgataa gaaaacgata catgcacctc acggaggagt    300

atcttaaaga gaacccaaac ctttgtgagt acatggctcc gtccctcgat gctcgccagg    360

atgtggtggt cgttgaggtc ccaaagcttg gaaaagaagc cgcaacaaaa gctattaaag    420

aatggggaca accaaaatct aaaatcaccc acctaatctt ctgcaccaca tctggtgtag    480

atatgcccgg ggctgattac caactcacca aactcctcgg cctccgccct tcggtcaaac    540

gttttatgat gtaccaacaa gggtgctttg caggtgggac ggttcttcgt ctagcaaaag    600

acctcgcaga aaacaacaag gatgcacgtg tcctagttgt ttgttccgag attactgcag    660

tcacattccg tggtcctaac gacactcatc ttgattcact cgttggtcaa gctttgtttg    720

gggatggagc tgcggctgtc attgttggtt cagaccctga cttgacaaaa gagcgtccat    780

tgttcgagat gatatctgct gctcaaacta tcttaccaga ctcggaggga gcaatcgatg    840

ggcacttgag ggaagtcggg ctaacatttc atctcctcaa agacgtacct gggttgatct    900

ccaagaacat agagaaggca ttgacacaag ccttttctcc attaggtata agtgactgga    960

actcgatctt ttggatcgct catcctggtg gtccagctat tctggaccaa gttgagctta    1020

agctcggtct caaggaggag aagatgagag ccactagaca cgttcttagt gagtatggaa    1080

acatgtcaag tgcttgtgtt ttgttcatta tggatgaaat gaggaagaaa tcggctgagg    1140

aaggtgcagc cacaaccggt gaagggctag attggggtgt tttattcggg ttcggtcctg    1200

gtttgacggt cgaaaccgtg gtcctccaca gcctcccaac cactgtatcg gttgcaaatt    1260

aatttagttg catggttatg gatataagcg tcttttgttg gaacaattaa atttttactg    1320

tttttgtttt ctactaaata aatgtgtgtt tgcaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa          1374

<210>29

<211>398

<212>PRT

<213>菊花

<400>29

Met Ala Ser Leu Thr Asp Ile Ala Ala Ile Arg Glu Ala Gln Arg Ala

1               5                   10                  15

Gln Gly Pro Ala Thr Ile Leu Ala Ile Gly Thr Ala Thr Pro Ala Asn

            20                  25                  30

Cys Val Tyr Gln Ala Asp Tyr Pro Asp Tyr Tyr Phe Arg Ile Thr Lys

        35                  40                  45

Ser Glu His Met Val Asp Leu Lys Glu Lys Phe Lys Arg Met Cys Asp

    50                  55                  60

Lys Ser Met Ile Arg Lys Arg Tyr Met His Leu Thr Glu Glu Tyr Leu

65                  70                  75                  80

Lys Glu Asn Pro Asn Leu Cys Glu Tyr Met Ala Pro Ser Leu Asp Ala

                85                  90                  95

Arg Gln Asp Val Val Val Val Glu Val Pro Lys Leu Gly Lys Glu Ala

            100                 105                 110

Ala Thr Lys Ala Ile Lys Glu Trp Gly Gln Pro Lys Ser Lys Ile Thr

        115                 120                 125

His Leu Ile Phe Cys Thr Thr Ser Gly Val Asp Met Pro Gly Ala Asp

    130                 135                 140

Tyr Gln Leu Thr Lys Leu Leu Gly Leu Arg Pro Ser Val Lys Arg Phe

145                 150                 155                 160

Met Met Tyr Gln Gln Gly Cys Phe Ala Gly Gly Thr Val Leu Arg Leu

                165                 170                 175

Ala Lys Asp Leu Ala Glu Asn Asn Lys Asp Ala Arg Val Leu Val Val

            180                 185                 190

Cys Ser Glu Ile Thr Ala Val Thr Phe Arg Gly Pro Asn Asp Thr His

        195                 200                 205

Leu Asp Ser Leu Val Gly Gln Ala Leu Phe Gly Asp Gly Ala Ala Ala

    210                 215                 220

Val Ile Val Gly Ser Asp Pro Asp Leu Thr Lys Glu Arg Pro Leu Phe

225                 230                 235                 240

Glu Met Ile Ser Ala Ala Gln Thr Ile Leu Pro Asp Ser Glu Gly Ala

                245                 250                 255

Ile Asp Gly His Leu Arg Glu Val Gly Leu Thr Phe His Leu Leu Lys

            260                 265                 270

Asp Val Pro Gly Leu Ile Ser Lys Asn Ile Glu Lys Ala Leu Thr Gln

        275                 280                 285

Ala Phe Ser Pro Leu Gly Ile Ser Asp Trp Asn Ser Ile Phe Trp Ile

    290                 295                 300

Ala His Pro Gly Gly Pro Ala Ile Leu Asp Gln Val Glu Leu Lys Leu

305                 310                 315                 320

Gly Leu Lys Glu Glu Lys Met Arg Ala Thr Arg His Val Leu Ser Glu

                325                 330                 335

Tyr Gly Asn Met Ser Ser Ala Cys Val Leu Phe Ile Met Asp Glu Met

            340                 345                 350

Arg Lys Lys Ser Ala Glu Glu Gly Ala Ala Thr Thr Gly Glu Gly Leu

        355                 360                 365

Asp Trp Gly Val Leu Phe Gly Phe Gly Pro Gly Leu Thr Val Glu Thr

    370                 375                 380

Val Val Leu His Ser Leu Pro Thr Thr Val Ser Val Ala Asn

385                 390                 395

<210>30

<211>2979

<212>DNA

<213>菊花

<220>

<221>misc_feature

<222>(2051)..(2051)

<223>n＝任何核苷酸

<400>30

ttttaacgcg cattagcctc actaaaggga caaaagctgg agctccccgc ggtggcggcc    60

gctctgaact agtggatccc ccgggctgca ggaattcgat tggatgactc gaacagctat    120

ggccatgatt acttagtacc acatgtaact gagacttgca atggacaagt acttattatc    180

ctacaaccta acttctttgt tgtgtttaag tccaaaaagt tatgcgtgcg gccagaatcc    240

atcaaaatgt gtagcatttg tttcaacaca tgccctttaa cccgtatagt gttatgagtt    300

ggtactccag acaatacatt aagagatata ttgggtatgc attgttgtgt atcatctccc    360

acacatgctc agttatgtca gtatcacaat cttcctcttc caaacacaat tctaattctc    420

cttccttctc atctctaatc tctaaagtaa acatttgacc ttcacactta tgaccatgca    480

tatacttctt atcacgataa aaacatagat tcttagccct cttttcagca tacttttttt    540

tacttaatta ctttctaggt gtaggcatgg tgtttgcaaa ctgtttggtt accaactgag    600

ttgtaggcaa agctaaaata tttgaaatat tttttagtag gataagtcac attcctgttt    660

acattccaat tattattgta cttaggagta ggcaacaatg agacactttt tttcttaaca    720

actgctagcc tagcttcttc catcttagcc caacaataga catcatttaa actagttggt    780

ttaaacatgc taaccagcat aactatttcg tctttcaatc caccaatata caaactaata    840

gcatgagatt cactcaattc caccttattc aataaaactt caaaagaatc ttggtatacc    900

tgaacagtgc tagtttgcct gacatttttc aattccacta taggatcttt aaagactgaa    960

tcaaaccttt tcttgatatg cctttcatac atatcccgag taacaatttc cccatgtctt    1020

tttcataaat tgcttgtttt agttaagggc tttgtcaaac acatgcatag agacaagcct    1080

gatcctaatg aatgaagaac attaacaaaa tcactaaaag aatcaagaac actaacataa    1140

tcactaattg acaagaataa ccaccacctt ttcaggtaca ccagaatata ataccactat    1200

acaattccta aggctaagta gggttggatc agttggaaaa ccccttgcct ctcaaccgag    1260

aggtcagggg ttcgatcctc actccctaca aaaggccgga ggtcctttat acctttggta    1320

gagctggaag cagcctctct accttaggta ggggtaaggt tgtctacatc ttaacctccc    1380

ccatacaccg gaaacggtat tgggtaccca taacctgtgg aagacggtat tgggagttac    1440

ttttactttt ttttatacag ttcctaaggc taagcaaagt cgtgacccaa cacgaccttg    1500

ccacatcagc tttatctctc caatgacccg atgacgacca agttgccaca gtcggtgacc    1560

aagttaaaaa aaaagaaaaa aaagaaagaa ataagtgtgt gtgtgtgtaa aatcgatcga    1620

agaaatgacc gattgtgtgt ttacatgttg ctcaaccgat cctcgacctc gtctccacaa    1680

tggtgtcgac cgactttaaa gtcggtcctt cccctcgacc gaccgatctc tttcagcccg    1740

ctgtgtctag cctaactaac gtgtgtaaga tttgaaaacg gaaatttaat caagaacgat    1800

tttggataag acaaatggtg tagaatgatc agaatttatg tttgtatggt ggttgatcga    1860

agatcaagaa ttgacagtgt accggaaaat gtaacaagat aactgaatta taacataatg    1920

gagttattag ttgtgatcaa atagcatgat gatgctctat tacccattga aatgtactaa    1980

atgtaatgac ttaaccataa tccataagat tgaaagttaa cataatcaaa cacaagaatt    2040

actgaacaag nattgtaact cgaagtgaaa tgataattgg atttgttatt gatcaatgtg    2100

gtttgtcaca aagacttaag agagagcaaa tcatccaaaa actgattacc aaatgaagaa    2160

atgaaaatat ttaaagagaa ttacaaatgg cttgaaaatc ggttatgtgg tttgtttgaa    2220

cttttgaagc tgtcacgtga tataacacat aatatatctt tatctttgtg atgcaccatg    2280

tatgatacaa ctaataagtt gtatcaatat caatttctta aaaactggat atactttttc    2340

ggtaacttat ttaagtccaa tgtattattt agtccctatg aaaagcgtct caatgatatt    2400

tccccaagtc aaatgttaga ttttttattt tatttatttt taaattcagc cataggcaaa    2460

aatattagta agtcagctta tgcgtcccaa atataattgt tatacggctt aaatgatttg    2520

caattactac atttttatgt aatcatatct caatcaacag aattatgaga tgtggttgta    2580

aaggccttct gaaaaattta atcaacagtt acctaatggt agattgatat gaaacaaaaa  2640

cttctggtgt atgcagctgg tcgatgacac tcaaatccgt aaccgaagtg tttaagaatt  2700

atcgtattca cagtcatatc ttacggttaa aactttaaac gaaatcgaac taaactccta  2760

acagatatcg aagctcaatt gtgtaatgtt tttcaatggt ccacaacgtg gcatctatga  2820

ccatcgttcg taaaacttgg gtacgtcata cctaccacac gttccctcta tataagaaac  2880

actcattcac ctaatgtcta ccatcacttg cacttctcta cttacaaaga tcatatacat  2940

tttcgttcac cgatattaaa cacccatggc ttccttaac                         2979

<210>31

<211>1778

<212>DNA

<213>薰衣草

<400>31

ctagtataaa ttttttaata gtaggcatgc aaaatcaaga atctatcttc gtgatagcta    60

gagagctcac tatagcagcc tcaatctact ttctcatccg ctactttctt tcaagaatca    120

tcaccaccat tacccacggc ggcagccacc gactgccgcc agggccgagg ggctttccga    180

ttgtcggtgc acttcctctc ttgggcgaca tgccacatgt cgccctagcc aaaatggcca    240

aaacttacgg ccccatcatc tacctaaaag tcggtgcatg gggcatggcc gtcgcgtcaa    300

cgcctgcctc cgcccgtgcg tttctcaaaa ccctagacac caacttctct gaccgccctc    360

cgaatgcggg tgccaccata ttagcctaca acgcggaaga tatggtgttc gcccgctatg    420

gcccaaagtg gagattgctc agaaaactga ccaatctcca catgttgggg aatcatgctt    480

tagatgggtg ggcaagtgta aggtcctccg agttgggcta catgctccat gcaaggcacg    540

acgccacccg tcatggcgag cccgtggtgc tgccagagat gctcatgtac gccgtgggga    600

atatgctcgg gcaggtgata ttaagtagac ggattttcga gaagaaaggg aaggaggtga    660

atgagttgaa agatatggtg gtggagctca tgacttcagc tggatatttc aatattggtg    720

atttcatccc atggcttgct tggatggatt tgcaggggat agagagtggg atgaagaaat    780

tgcacaataa gttcgacaag ttgatcggca aaatgattga ggatcatttg aaatcagccc    840

acatacgcaa ggccaagccg gatcttcttg attgcctctt ggcaaatcgt gatagctccg    900

atgcggagaa gctcacctca accaacgtca aggccctttt actgaacttg ttcaccgcag    960

ggaccgacac gtcatcaagc ataatagaat gggcattggc cgagatgatc aagaatccaa    1020

ccatcctaaa tagggcccac caagagatgg atagagtcgt tggtagaact cgaaggttgg    1080

tcgaatcgga catcccgaac ctaccctacc tacgagccat atgtaaagaa acatatcgca    1140

agcatccatc cactccccta aatctgcccc gaatcgcgtc cgagccttgc gtcgtggacg  1200

ggtattacat acctaaaaac acccggctca gcgttaacat atgggctatc gggagagacc  1260

ccgacgtgtg ggaaaatcct cttgatttca accccgatag atttctatcg gggaagaacg  1320

agcggattga tccccgcggg aaccacttcg agctcatccc gttcggggct gggcggagga  1380

tctgcgccgg ggcccggatg gggatggtgc ttgtggagta tattttaggc acgttggtgc  1440

acgctttcga atgggaactg ccggccgggg ccggggccgg cacggcggag ttgaacatgg  1500

accacgtgtt tgggctggcg ctgcagaaag ctgtgcctct cacggccatg ctcactccta  1560

ggctgccgtc acattgttat gctccttaat ttctgttaca tttatacgtc tcgtatttta  1620

tcttatcgaa ctagtttacc acccatgcat tttgcgttta tgttattata aattctatta  1680

cattattagt ctcgtatttt attttatcga actagtgtac cactcataca ttttgtgttt  1740

atatatacta taaagatcta ttacattaaa aaaaaaaa                          1778

<210>32

<211>520

<212>PRT

<213>薰衣草

<400>32

Met Gln Asn Gln Glu Ser Ile Phe Val Ile Ala Arg Glu Leu Thr Ile

1               5                   10                  15

Ala Ala Ser Ile Tyr Phe Leu Ile Arg Tyr Phe Leu Ser Arg Ile Ile

            20                  25                  30

Thr Thr Ile Thr His Gly Gly Ser His Arg Leu Pro Pro Gly Pro Arg

        35                  40                  45

Gly Phe Pro Ile Val Gly Ala Leu Pro Leu Leu Gly Asp Met Pro His

    50                  55                  60

Val Ala Leu Ala Lys Met Ala Lys Thr Tyr Gly Pro Ile Ile Tyr Leu

65                  70                  75                  80

Lys Val Gly Ala Trp Gly Met Ala Val Ala Ser Thr Pro Ala Ser Ala

                85                  90                  95

Arg Ala Phe Leu Lys Thr Leu Asp Thr Asn Phe Ser Asp Arg Pro Pro

            100                 105                 110

Asn Ala Gly Ala Thr Ile Leu Ala Tyr Asn Ala Glu Asp Met Val Phe

        115                 120                 125

Ala Arg Tyr Gly Pro Lys Trp Arg Leu Leu Arg Lys Leu Thr Asn Leu

    130                 135                 140

His Met Leu Gly Asn His Ala Leu Asp Gly Trp Ala Ser Val Arg Ser

145                 150                 155                 160

Ser Glu Leu Gly Tyr Met Leu His Ala Arg His Asp Ala Thr Arg His

                165                 170                 175

Gly Glu Pro Val Val Leu Pro Glu Met Leu Met Tyr Ala Val Gly Asn

            180                 185                 190

Met Leu Gly Gln Val Ile Leu Ser Arg Arg Ile Phe Glu Lys Lys Gly

         195                200                 205

Lys Glu Val Asn Glu Leu Lys Asp Met Val Val Glu Leu Met Thr Ser

    210                 215                 220

Ala Gly Tyr Phe Asn Ile Gly Asp Phe Ile Pro Trp Leu Ala Trp Met

225                 230                 235                 240

Asp Leu Gln Gly Ile Glu Ser Gly Met Lys Lys Leu His Asn Lys Phe

                245                 250                 255

Asp Lys Leu Ile Gly Lys Met Ile Glu Asp His Leu Lys Ser Ala His

            260                 265                 270

Ile Arg Lys Ala Lys Pro Asp Leu Leu Asp Cys Leu Leu Ala Asn Arg

        275                 280                 285

Asp Ser Ser Asp Ala Glu Lys Leu Thr Ser Thr Asn Val Lys Ala Leu

    290                 295                 300

Leu Leu Asn Leu Phe Thr Ala Gly Thr Asp Thr Ser Ser Ser Ile Ile

305                 310                 315                 320

Glu Trp Ala Leu Ala Glu Met Ile Lys Asn Pro Thr Ile Leu Asn Arg

                325                 330                 335

Ala His Gln Glu Met Asp Arg Val Val Gly Arg Thr Arg Arg Leu Val

            340                 345                 350

Glu Ser Asp Ile Pro Asn Leu Pro Tyr Leu Arg Ala Ile Cys Lys Glu

        355                 360                 365

Thr Tyr Arg Lys His Pro Ser Thr Pro Leu Asn Leu Pro Arg Ile Ala

    370                 375                 380

Ser Glu Pro Cys Val Val Asp Gly Tyr Tyr Ile Pro Lys Asn Thr Arg

385                 390                 395                 400

Leu Ser Val Asn Ile Trp Ala Ile Gly Arg Asp Pro Asp Val Trp Glu

                405                 410                 415

Asn Pro Leu Asp Phe Asn Pro Asp Arg Phe Leu Ser Gly Lys Asn Glu

            420                 425                 430

Arg Ile Asp Pro Arg Gly Asn His Phe Glu Leu Ile Pro Phe Gly Ala

        435                 440                 445

Gly Arg Arg Ile Cys Ala Gly Ala Arg Met Gly Met Val Leu Val Glu

    450                 455                 460

Tyr Ile Leu Gly Thr Leu Val His Ala Phe Glu Trp Glu Leu Pro Ala

465                 470                 475                 480

Gly Ala Gly Ala Gly Thr Ala Glu Leu Asn Met Asp His Val Phe Gly

                485                 490                 495

Leu Ala Leu Gln Lys Ala Val Pro Leu Thr Ala Met Leu Thr Pro Arg

            500                 505                 510

Leu Pro Ser His Cys Tyr Ala Pro

        515                 520

Claims (92)

1.分离的核酸分子，包括编码或互补于编码类黄酮3′，5′羟化酶(F3′5′H)或具有F3′5′H活性之多肽的序列的核苷酸序列，其中，所述核酸分子在蔷薇花瓣组织中的表达，产生了通过层析技术测定可检测水平的翠雀素或翠雀素型分子。

2.分离的核酸分子，包括编码或互补于编码F3′5′H或具有F3′5′H活性之多肽的序列的核苷酸序列，其中，所述核酸分子在蔷薇花瓣组织中的表达，产生了足够水平和长度的被翻译成所述F3′5′H的转录物，它是通过层析技术测定的可检测水平的翠雀素或翠雀素型分子确定的。

3.如权利要求1或2的分离的核酸分子，其中所述核酸分子在所述蔷薇花瓣中的表达，产生了视觉上可检测的颜色改变。

4.如权利要求1-3中任意一项的分离的核酸分子，其中，所述核酸分子来自选自下列一组的植物：堇菜，鼠尾草，裸柱菊，薰衣草，和Kennedia spp。

5.如权利要求4的分离的核酸分子，其中，所述核酸分子来自堇菜植物。

6.如权利要求5的分离的核酸分子，其中，所述核酸分子来自堇菜栽培品种Black Pansy。

7.如权利要求5或6中任意一项的分离的核酸分子，其中，所述核苷酸序列编码F3′5′H，它包括选自SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、与SEQ ID NO：10具有至少大约40％相似性的氨基酸序列，以及与SEQ ID NO：12具有至少大约40％相似性的氨基酸序列中的氨基酸序列。

8.如权利要求7的分离的核酸分子，其中包括选自SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、与SEQ ID NO：9具有至少大约40％相同性的核苷酸、与SEQ ID NO：11具有至少大约40％相同性的核苷酸序列、能够在低严格条件下与SEQ ID NO：9或它的互补体杂交的核苷酸序列以及能够在低严格条件下与SEQ ID NO：11或它的互补体杂交的核苷酸序列。

9.如权利要求8的分离的核酸分子，其中包括SEQ ID NO：9所示出的核苷酸序列。

10.如权利要求8的分离的核酸分子，其中包括SEQ ID NO：11所示出的核苷酸序列。

11.如权利要求4的分离的核酸分子，其中，所述核酸分子来自鼠尾草。

12.如权利要求11的分离的核酸分子，其中，所述核苷酸序列编码F3′5′H，它包括选自SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、与SEQ IDNO：14具有至少大约40％相似性的氨基酸序列和与SEQ ID NO：16具有至少大约40％相似性的氨基酸序列中的氨基酸序列。

13.如权利要求12的分离的核酸分子，其中包括选自SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：15、与SEQ ID NO：13具有至少大约40％相同性的核苷酸序列、与SEQ ID NO：15具有至少大约40％相同性的核苷酸序列、能够在低严格条件下与SEQ ID NO：13或它的互补体杂交的核苷酸序列、以及能够在低严格条件下与SEQ ID NO：15或它的互补体杂交的核苷酸序列中的核苷酸序列。

14.如权利要求13的分离的核酸分子，其中包括如SEQ ID NO：13所示出的核苷酸序列。

15.如权利要求13的分离的核酸分子，其中包括SEQ ID NO：15所示出的核苷酸序列。

16.如权利要求14的分离的核酸分子，其中，所述核酸分子来自裸柱菊。

17.如权利要求16的分离的核酸分子，其中，所述核苷酸序列编码F3′5′H，它包括选自SEQ ID NO：18以及与SEQ ID NO：18具有至少大约40％相似性的氨基酸序列中的氨基酸序列。

18.如权利要求17的分离的核酸分子，其中包括选自SEQ ID NO：17、与SEQ ID NO：17具有至少大约40％相同性的核苷酸序列，以及能够在低严格条件下与SEQ ID NO：17或它的互补体杂交的核苷酸序列中的核苷酸序列。

19.如权利要求18的分离的核酸分子，其中包括如SEQ ID NO：17所示出的核苷酸序列。

20.如权利要求4的分离的核酸分子，其中，所述核酸分子来自Kennedia spp.。

21.如权利要求20的分离的核酸分子，其中，所述核苷酸序列编码F3′5′H，它包括选自SEQ ID NO：27以及与SEQ ID NO：27具有至少大约40％相似性的氨基酸序列中的氨基酸序列。

22.如权利要求21的分离的核酸分子，其中包括选自SEQ ID NO：26、与SEQ ID NO：26具有至少大约40％相同性的核苷酸，以及能够在低严格条件下与SEQ ID NO：26或它的互补体杂交的核苷酸序列中的核苷酸序列。

23.如权利要求22的分离的核酸分子，其中包括如SEQ ID NO：26所示出的核苷酸序列。

24.如权利要求4的分离的核酸分子，其中，所述核酸分子来自薰衣草。

25.如权利要求24的分离的核酸分子，其中，所述核苷酸序列编码F3′5′H，它包括选自SEQ ID NO：32以及与SEQ ID NO：32具有至少大约40％相似性的氨基酸序列中的氨基酸序列。

26.如权利要求25的分离的核酸分子，其中包括选自SEQ ID NO31、与SEQ ID NO：31具有至少大约40％相同性的核苷酸序列以及能够在低严格条件下与SEQ ID NO：31或它的互补体杂交的核苷酸序列中的核苷酸序列。

27.如权利要求26的分离的核酸分子，其中包括如SEQ ID NO：31所示出的核苷酸序列。

28.如权利要求1-4中任意一项的分离的核酸分子，其中，所述核苷酸序列包括在每一个密码子的第三个位置上含有以下核苷酸的总体百分比低于或等于54％

(i)A，或

(ii)T，或

(iii)A和T。

29.一种包括核苷酸序列的构建体，它包括：

(i)能够在蔷薇花瓣组织中工作的启动子，并且，其中所述启动子可操作地连接了

(ii)编码F3′5′H或者互补于编码F3′5′H或具有F3′5′H活性之多肽的序列的核酸分子，其中，所述核酸分子在蔷薇花瓣组织中的表达产生了通过层析技术测定为可检测水平的翠雀素或翠雀素-型分子，并且，所述核酸分子来自选自下列一组的植物：堇菜，鼠尾草，裸柱菊，薰衣草和Kennedia spp.。

30.一种包括核苷酸序列的构建体，其中包括：

(i)能够在蔷薇花瓣组织中工作的启动子，并且，其中所述启动子可操作地连接了

(ii)编码F3′5′H或者互补于编码F3′5′H或具有F3′5′H活性之多肽的序列的核酸分子，其中，所述核酸分子在蔷薇花瓣组织中的表达产生了足够水平和长度的被翻译成所述F3′5′H的转录物，它是通过层析技术测定为可检测水平的翠雀素或翠雀素-型分子而确定的。

31.如权利要求29或30的构建体，其中，所述构建体在所述蔷薇花瓣中的表达产生了视觉上可检测的颜色改变。

32.如权利要求29-31中任意一项的构建体，其中，所述启动子选自蔷薇CHS，菊花CHS和CaMV 35S。

33.如权利要求29-31中任意一项的构建体，其中，所述启动子包括SEQ ID NO：5，或它的功能性等同物。

34.如权利要求29-31中任意一项的构建体，其中，所述启动子包括SEQ ID NO：30或它的功能性等同物。

35.如权利要求29-34中任意一项的构建体，其中，所述核酸分子来自堇菜。

36.如权利要求35的分离的核酸分子，其中，所述核苷酸序列编码F3′5′H，它包括选自SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、与SEQ IDNO：10具有至少大约40％相似性的氨基酸序列以及与SEQ ID NO：12具有至少大约40％相似性的氨基酸序列中的氨基酸序列。

3 7.如权利要求36的分离的核酸分子，其中包括选自SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、与SEQ ID NO；9具有至少大约40％的相同性的核苷酸序列，与SEQ ID NO：11具有至少大约40％相同性的核苷酸序列，能够在低严格条件下与SEQ ID NO：9或它的互补体杂交的核苷酸序列以及能够在低严格条件下与SEQ ID NO：11或它的互补体杂交的核苷酸序列中的核苷酸序列。

38.如权利要求37的分离的核酸分子，其中，所述基因包括如SEQ ID NO：9所示出的核苷酸序列。

39.如权利要求37的分离的核酸分子，其中，所述基因包括如SEQ ID NO：11所示出的核苷酸序列。

40.如权利要求29-34中任意一项的分离的核酸分子，其中，所述核酸分子来自鼠尾草。

41.如权利要求40的分离的核酸分子，其中，所述基因包括编码F3′5′H的核苷酸序列，它包括选自SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、与SEQ ID NO：14具有至少大约40％相似性的氨基酸序列以及与SEQ ID NO：16具有至少大约40％相似性中的氨基酸序列，。

42.如权利要求41的分离的核酸分子，其中，所述基因包括选自SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、与SEQ ID NO：13具有至少大约40％相同性的核苷酸序列、与SEQ ID NO：15具有至少大约40％相同性的核酸序列、能够在低严格条件下与SEQ ID NO：13或它的互补体杂交的核苷酸序列以及能够在低严格条件下与SEQ ID NO：15或它的互补体杂交的核苷酸序列中的核苷酸序列。

43.如权利要求42的分离的核酸分子，其中，所述基因包括如SEQ ID NO：13所示出的核苷酸序列。

44.如权利要求42的分离的核酸分子，其中，所述基因包括如SEQ ID NO：15所示出的核苷酸序列。

45.如权利要求29-34中任意一项的分离的核酸分子，其中，所述基因来自裸柱菊。

46.如权利要求45的分离的核酸分子，其中，所述基因编码F3′5′H，它包括选自SEQ ID NO：18以及与SEQ ID NO：18具有至少大约40％相似性的氨基酸序列中的氨基酸序列。

47.如权利要求46的分离的核酸分子，其中，所述基因包括选自SEQ ID NO：17、与SEQ ID NO：17具有至少大约40％相同性的核苷酸序列以及能够在低严格条件下与SEQ ID NO：17或它的互补体杂交的核苷酸序列中的核苷酸序列。

48.如权利要求47的分离的核酸分子，其中，所述基因包括如SEQ ID NO：17所示出的核苷酸序列。

49.如权利要求29-34中任意一项的分离的核酸分子，其中，所述基因来自Kennedia spp.。

50.如权利要求49的分离的核酸分子，其中，所述基因编码F3′5′H，它包括选自SEQ ID NO：27以及与SEQ ID NO：27具有至少大约40％相似性的氨基酸序列中的氨基酸序列。

51.如权利要求50的分离的核酸分子，其中，所述基因包括选自SEQ ID NO：26、与SEQ ID NO：26具有至少大约40％相同性的核苷酸序列以及能够在低严格条件下与SEQ ID NO：26或它的互补体杂交的核苷酸序列中的核苷酸序列。

52.如权利要求51的分离的核酸分子，其中，所述基因包括如SEQ ID NO：26所示出的核苷酸序列。

53.如权利要求29-34中任意一项的分离的核酸分子，其中，所述基因来自薰衣草。

54.如权利要求53的分离的核酸分子，其中，所述基因编码F3′5′H，它包括选自SEQ ID NO：32以及与SEQ ID NO：32具有至少大约40％相似性的氨基酸序列中的氨基酸序列。

55.如权利要求54的分离的核酸分子，其中，所述基因包括选自SEQ ID NO：31与SEQ ID NO：31具有至少大约40％相同性的核苷酸以及能够在低严格条件下与SEQ ID NO：31或它的互补体杂交的核苷酸序列中的核苷酸序列。

56.如权利要求55的分离的核酸分子，其中，所述基因包括如SEQ ID NO：31所示出的核苷酸序列。

57.一种用于生产能够合成F3′5′H的转基因显花植物的方法，该方法包括用权利要求1-28中任意一项所限定的核酸序列在允许所述核酸序列最终表达的条件下稳定地转化合适植物的细胞，由所述细胞再生转基因植物，并且让所述转基因植物在足以允许所述核酸序列表达的条件下生长一定时间。

58.一种用于生产具有减弱了的天然的或现有F3′5′H活性的转基因植物的方法，该方法包括用权利要求1-28中任意一项所限定的核酸分子稳定地转化合适植物的细胞，由所述细胞再生转基因植物，并且，在必要的时候，让所述转基因植物在足以允许所述核酸表达的条件下生长。

59.一种用于生产具有减弱了的天然或现有F3′5′H活性的遗传学修饰过的植物的方法，该方法包括通过与导入所述植物细胞的如权利要求1-28任意一项所述的适当改变了的F3′5′H基因或它的衍生物或部分进行同源重组而修饰天然序列由此改变F3′5′H基因，以及由所述细胞再生所述遗传学修饰过的植物。

60.一种用于生产具有改变了的花序特征的转基因显花植物的方法，该方法包括用权利要求1-28中任意一项所限定的核酸序列稳定地转化合适植物的细胞，由所述细胞再生转基因植物，并且在足以允许所述核酸序列表达的条件下生长所述转基因植物一定时间。

61.一种用于生产具有改变了的花序特征的显花植物的方法，该方法包括通过与导入所述植物细胞的适当改变了的F3′5′H基因或它的衍生物或部分进行同源重组而修饰天然序列、由此改变权利要求1-28中任意一项所限定的F3′5′H基因，以及由所述细胞再生遗传学修饰过的植物。

62.一种用于生产表达编码权利要求1-28中任意一项所限定的F3′5′H的重组基因或它的一部分或者具有大体上互补于编码所述F3′5′H的mRNA的全部或一部分的核酸序列的转基因植物的方法，该方法包括用包括编码或互补于编码F3′5′H的序列的核苷酸序列的分离核酸分子稳定地转化合适植物的细胞，如果必要的话，在允许所述分离的核酸分子最终表达的条件下进行转化，以及由所述细胞再生转基因植物。

63.遗传学修饰过的植物或它的一部分或它的细胞，其中包括权利要求1-28中任意一项的分离的核酸分子。

64.遗传学修饰过的植物或它的一部分或它的细胞，其中包括权利要求1-28中任意一项的分离的核酸分子，或包括权利要求1-28中任意一项的核酸分子的降低的表达水平。

65.遗传学修饰过的植物或它的一部分或它的细胞，其中包括权利要求1-28中任意一项的分离的核酸分子，或包括权利要求1-28中任意一项的核酸分子的升高的表达水平。

66.如权利要求63-65中任意一项的遗传学修饰过的植物或它的一部分或它的细胞，其中，所述植物部分选自萼片，苞叶，叶柄，花梗，子房，花药，花，果实，坚果，根，茎，叶片，种子。

67.如权利要求63-66中任意一项的遗传学修饰过的植物或它的一部分或它的细胞，其中，所述植物是园艺植物，农作物或观赏植物。

68.将权利要求1-28中任意一项所限定的分离的核酸分子用于生产能够在植物中表达F3′5′H或下调天然的F3′5′H酶的遗传构建体中的用途。

69.一种基因沉默构建体，其中包括如权利要求1-28中任意一项所限定的分离的核酸分子或它的复合物。

70.如权利要求63-66中任意一项的遗传学修饰过的植物或它的一部分或它的细胞，其中，所述植物选自蔷薇，康乃馨，lisianthus，矮牵牛，百合，三色堇，大丁草，菊花，老鹳草，蝴蝶草，秋海棠属，仙客来，Nierembergia，Catharanthuy，天竺葵属，兰花，葡萄，苹果，大戟属植物或倒挂金钟属。

71.从权利要求63-67和70中任意一项的遗传学修饰过的植物或它的一部分或它的细胞中提取的提取物。

72.如权利要求71的提取物，其中，所述提取物是芳香剂或食品添加剂或保健品或饮料或果汁或着色剂。

73.如权利要求57-62中任意一项的方法，其中，所述遗传学修饰过的植物或它的一部分或它的细胞具有改变了的花序。

74.一种由权利要求1-28中任意一项所限定的核酸分子所编码的分离的重组F3′5′H或具有F3′5′H活性的肽。

75.如权利要求74的分离的重组F3′5′H或具有F3′5′H活性的肽，其中，所述重组F3′5′H或具有F3′5′H活性的肽是包括两种或两种以上异源氨基酸序列的融合分子。

76.一种分离的重组F3′5′H或具有F3′5′H活性的肽，权利要求1-28中任意一项的核酸分子包括两种或两种以上异源核苷酸序列的融合体。

77.一种具有编码权利要求1-28中任意一项的F3′5′H分子的遗传序列的原核生物，它是染色体外的质粒形式的。

78.一种具有编码权利要求1-28中任意一项的F3′5′H分子的遗传序列的真核生物，它是染色体外的质粒形式的。

79.将权利要求1-28中任意一项的核酸分子用于生产遗传学修饰过的植物或它的一部分或它的细胞的用途。

80.权利要求79的遗传学修饰过的植物或它的一部分或它的细胞，其中，所述遗传学修饰过的植物或它的一部分或它的细胞具有改变了的花或花序。

81.将权利要求1-28中任意一项所限定的核酸序列用于生产能够在植物中表达F3′5′H或下调天然的F3′5′H酶的遗传构建体的用途。

82.分离的核酸分子，其中包括编码或互补于编码F3′5′H或具有F3′5′H活性之多肽的序列的核苷酸序列，其中，所述核酸分子来自蝴蝶豆。

83.如权利要求81的分离的核酸分子，其中，所述核苷酸序列编码F3′5′H，它包括选自SEQ ID NO：21以及与SEQ ID NO：21具有至少大约40％相似性的氨基酸序列中的氨基酸序列。

84.如权利要求83的分离的核酸分子，其中包括选自SEQ ID NO：20、与SEQ ID NO：20具有至少大约40％相同性的核苷酸序列、以及能够在低严格条件下与SEQ ID NO：20或它的互补体杂交的核苷酸序列中的核苷酸序列。

85.如权利要求84的分离的核酸分子，其中包括SEQ ID NO：20所示出的核苷酸序列。

86.如权利要求1-4中任意一项的分离的核酸分子，其中，所述核苷酸序列包括总体百分比低于或等于55％的以下核苷酸

(i)A，或

(ii)T，或

(iii)A和T。

87.分离的核酸分子，其中包括SEQ ID NO：5或它的功能性等同物。

88.分离的核酸分子，其中包括SEQ ID NO：30或它的功能性等同物。

89.分离的核酸分子，其已被修饰而包括编码或互补于编码F3′5′H或具有F3′5′H活性之多肽的序列的核苷酸序列，其中，所述核酸分子在蔷薇花瓣组织中的表达产生了通过层析技术测定为可检测水平的翠雀素或翠雀素-型分子，其中，所述核酸分子来自选自矮牵牛、龙胆和蝶豆的植物。

90.分离的核酸分子，其已被修饰而包括编码或互补于编码F3′5′H或具有F3′5′H活性之多肽的序列的核苷酸序列，其中，所述核酸分子在蔷薇花瓣组织中的表达产生了足够水平和长度的被翻译成所述F3′5′H的转录物，它是通过层析技术测定出可检测水平的翠雀素或翠雀素-型分子确定的，其中，所述核酸分子来自选自矮牵牛，龙胆属和蝴蝶豆的植物。

91.将权利要求89或90所限定的核酸序列用于生产能够在植物中表达F3′5′H或下调天然F3′5′H酶的遗传构建体的用途。

92.将权利要求89或90所限定的核酸序列用于生产遗传学修饰过的植物或它的一部分或它的细胞的用途。

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