CN1252097A

CN1252097A - 转基因植物选择方法

Info

Publication number: CN1252097A
Application number: CN98803996A
Authority: CN
Inventors: I·A·多纳尔德森; K·波森; K·约恩森; M·约斯贝
Original assignee: Danisco AS
Current assignee: DuPont Nutrition Biosciences ApS; Danisco US Inc
Priority date: 1997-02-07
Filing date: 1998-02-05
Publication date: 2000-05-03
Also published as: US6444878B1; GB2341863A; GB9918007D0; NZ336925A; AU5997298A; WO1998035047A1; GB9702592D0; CA2280236A1; GB2341863B; EP0970221A1; JP2002514915A; AU739067B2; KR20000070886A; BR9807308A

Abstract

描述了一种用于从细胞群中选择一种或几种选择性遗传转化细胞的选择方法。在此方法中,该细胞群包含选择性遗传转化细胞和可能未转化的细胞。每种选择性遗传转化细胞都含有一个第一可表达性核苷酸序列和任选地一个第二可表达性核苷酸序列。在此方法中,一种成分或其代谢衍生物,当以低浓度存在于培养基中时,对于选择性遗传转化细胞和未转化的细胞都是营养物。在此方法中,该成分或其代谢衍生物当以高浓度存在于培养基中时,对于未转化的细胞是有毒的。该第一核苷酸序列编码一种基因产物,它能够将以高浓度存在于培养基中的该成分或其代谢衍生物转变成选择性遗传转化细胞的营养物。这种方法包括将该细胞群导入一种培养基的步骤;其中该培养基任选地含有高浓度的该成分或其代谢衍生物。在此方法中,该成分或其代谢衍生物对于选择性遗传转化细胞;既是碳水化合物又是氮素的来源。另一方面,在此方法中如果该成分的一部分起代谢物的作用;并被代谢转变成衍生化底物,那么此衍生化底物能够对该基因产物引起别构效应。

Description

转基因植物选择方法

本发明是关于一种选择方法。

本发明还涉及一种酶，以及用于该选择方法的编码这种酶的核苷酸序列。

特别是本发明涉及一种选择(例如鉴别和/或分离)遗传转化细胞的方法，以及用于该方法的化合物和遗传物质。

众所周知，当通过转化作用将所需的核苷酸序列(“NOI”)导入某一细胞群时，只有一定数量的细胞能成功地被转化，即接受了NOI。然后必须鉴别这种遗传转化的细胞，以便可从非转化的细胞群中分离出这些细胞。

通常用于选择法的技术包括，将转化的细胞和未转化的细胞导入一种培养基中，此培养基包含有转化细胞能耐受的物质。在此培养基内，转化的细胞能够存活和生长，而未转化的细胞生长会被抑制，在某些情况下被杀死。

如果使某一植物细胞群经受了遗传转化作用，目前对转化细胞的选择一般采用编码抗生素抗性或除草剂抗性的选择基因。这种选择基因通过与NOI偶联或者与NOI一起共导入而被掺入该植物，这样，二种基因都被掺入到细胞群的某些或全部细胞中。

因为不可能全部细胞都被转化，所以然后须将这些细胞在含有相应抗生素或除草剂的培养基中培养，借助于选择基因，遗传转化细胞对它们具有抗性。在这种培养基中，转化细胞能够生长，这样可从总细胞群中被鉴别出来，因为非转化细胞不含这种抗生素或除草剂抗性基因，生长被抑制或者甚至被杀死。

依赖使用抗生素或除草剂的这些选择法存在许多缺点。例如，某些人如环境组织和政府部门的权威人士，担心将编码抗生素抗性和/或除草剂抗性的基因掺入植物和微生物对环境是否是安全的。对于食品植物和不是设计和/或打算用于一个封闭环境的微生物(例如用于农业的微生物)，以及对于设计用于封闭环境，但是可能自封闭环境中释放的微生物，这种担心特别明显。虽然这些担心可能被证明是没有根据的，然而，每种担心都可能导致政府对在例如植物中使用抗生素抗性基因和/或除草剂抗性基因的限制。

因此希望建立一种新方法，用于选择遗传转化的细胞或含有这种细胞的生物体(或其组成部分)。

根据本发明的第一方面，提供了一种从某一细胞群中选择一种或几种选择性遗传转化细胞的方法，其中该细胞群包含选择性遗传转化细胞和可能未转化的细胞；其中每种选择性遗传转化细胞都包含有一个第一可表达性核苷酸序列和任选地一个第二可表达性核苷酸序列；其中的一种成分或其代谢衍生物，当以低浓度存在于培养基中时，对于选择性遗传转化细胞和未转化的细胞都是营养物；其中该成分或其代谢衍生物，当以高浓度存在于培养基中时，对于未转化的细胞是有毒的；其中的第一核苷酸序列编码一种基因产物，它能够将以高浓度存在于培养基中的该成分或其代谢衍生物转变成选择性遗传转化细胞的营养物；该方法包括将此细胞群导入一种培养基的步骤，其中此培养基任选地包含高浓度的该成分或其代谢衍生物；以及，或者其中该成分或其代谢衍生物对于选择性遗传转化细胞既是碳水化合物又是氮素的来源；或者其中如果该成分的一部分起代谢底物的作用，并被代谢转变成衍生化底物，那么此衍生化底物对该基因产物能够引起别构效应。

根据本发明的第二方面，提供了一种组合物和一种培养基，此组合物包含一个含有选择性遗传转化细胞和可能未转化细胞的细胞群；其中每种选择性遗传转化细胞都包含有一个第一可表达性核苷酸序列，和任选地一个第二可表达性核苷酸序列；其中的一种成分或其代谢衍生物，当以低浓度存在于培养基中时，对于选择性遗传转化细胞和未转化的细胞都是营养物；其中该成分或其代谢衍生物，当以高浓度存在于培养基中时，对于未转化的细胞是有毒的；其中的第一核苷酸序列编码一种基因产物，它能够将以高浓度存在于培养基中的该成分或其代谢衍生物转变成选择性遗传转化细胞的营养物；此培养基任选地含有高浓度的该成分或其代谢衍生物；以及，或者其中该成分或其代谢衍生物对于选择性遗传转化细胞既是碳水化合物又是氮素的来源；或者其中如果该成分的一部分起代谢底物的作用，并被代谢转变成衍生化底物，那么此衍生化底物对该基因产物能够引起别构效应。

根据本发明的第三方面，提供了一个包含选择性遗传转化细胞和可能未转化细胞的细胞群；其中每种选择性遗传转化细胞都包含有一个第一可表达性核苷酸序列和任选地一个第二可表达性核苷酸序列；其中的一种成分或其代谢衍生物，当以低浓度存在于培养基中时，对于选择性遗传转化细胞和未转化的细胞都是营养物；其中该成分或其代谢衍生物，当以高浓度存在于培养基中时，对于未转化的细胞是有毒的；其中的第一核苷酸序列编码一种基因产物，它能够将以高浓度存在于培养基中的该成分或其代谢衍生物转变成选择性遗传转化细胞的营养物；以及，或者其中该成分或其代谢衍生物对于选择性遗传转化细胞既是碳水化合物又是氮素的来源；或者其中如果该成分的一部分起代谢底物的作用，并被代谢转变成衍生化底物，那么此衍生化底物对该基因产物能够引起别构效应。

根据本发明的第四方面，提供了一种选择性遗传转化细胞，它包含一个第一可表达性核苷酸序列和任选地一个第二可表达性核苷酸序列；其中的一种成分或其代谢衍生物，当以低浓度存在于培养基中时，对于选择性遗传转化细胞和未转化的细胞都是营养物；其中该成分或其代谢衍生物当以高浓度存在于培养基中时，对未转化的细胞是有毒的；其中的第一核苷酸序列编码一种基因产物，它能够将以高浓度存在于培养基中的该成分或其代谢衍生物转变成选择性遗传转化细胞的营养物；以及，或者其中该成分或其代谢衍生物对于选择性遗传转化细胞既是碳水化合物又是氮素的来源；或者其中如果该成分的一部分起代谢底物的作用，并被代谢转变成衍生化底物，那么此衍生化底物对该基因产物能够引起别构效应。

根据本发明的第五方面，提供了一种构建物，可用于遗传转化未转化的细胞而产生选择性遗传转化细胞，此构建物包含一个第一可表达性核苷酸序列和任选地一个第二可表达性核苷酸序列；其中的一种成分或其代谢衍生物，当以低浓度存在于培养基中时，对于选择性遗传转化细胞和未转化的细胞是营养物；其中该成分或其代谢衍生物当以高浓度存在于培养基中时，对未转化的细胞是有毒的；其中的第一核苷酸序列编码一种基因产物，它能够将以高浓度存在于培养基中的该成分或其代谢衍生物转变成选择性遗传转化细胞的营养物；以及，或者其中该成分或其代谢衍生物对于选择性遗传转化细胞既是碳水化合物又是氮素的来源；或者其中如果该成分的一部分起代谢底物的作用，并被代谢转变成衍生化底物，那么此衍生化底物对该基因产物能够引起别构效应。

根据本发明的第六方面，提供了一种载体，它含有一个用于遗传转化未转化的细胞而产生选择性遗传转化细胞的构建物；此构建物包含一个第一可表达性核苷酸序列和任选地一个第二可表达性核苷酸序列；其中的一种成分或其代谢衍生物当以低浓度存在于培养基中时，对于选择性遗传转化细胞和未转化的细胞是营养物；其中该成分或其代谢衍生物当以高浓度存在于培养基中时，对未转化的细胞是有毒的；其中的第一核苷酸序列编码一种基因产物，它能够将以高浓度存在于培养基中的该成分或其代谢衍生物转变成选择性遗传转化细胞的营养物；以及，或者其中该成分或其代谢衍生物对于选择性遗传转化细胞既是碳水化合物又是氮素的来源；或者其中如果该成分的一部分起代谢底物的作用，并被代谢转变成衍生化底物，那么此衍生化底物对该基因产物能够引起别构效应。

根据本发明的第七方面，提供了一种质粒，它含有用于遗传转化未转化的细胞而产生选择性遗传转化细胞的构建物；此构建物包含一个第一可表述性核苷酸序列和任选地一个第二可表达性核苷酸序列；其中的一种成分或其代谢衍生物当以低浓度存在于培养基中时，对于选择性遗传转化细胞和未转化的细胞是营养物；其中该成分或其代谢衍生物当以高浓度存在于培养基中时，对未转化的细胞是有毒的；其中的第一核苷酸序列编码一种基因产物，它能够将以高浓度存在于培养基中的该成分或其代谢衍生物转变成选择性遗传转化细胞的营养物；以及，或者其中该成分或其代谢衍生物对于选择性遗传转化细胞既是碳水化合物又是氮素的来源；或者其中如果该成分的一部分起代谢产物的作用，并被代谢转变成衍生化底物，那么此衍生化底物对该基因产物能够引起别构效应。

根据本发明的第八方面，提供了一种含有选择性遗传转化细胞的生物体，其中的选择性遗传转化细胞包含有一个第一可表达性核苷酸序列和任选地一个第二可表达性核苷酸序列；其中的一种成分或其代谢衍生物当以低浓度存在于培养基中时，对于选择性遗传转化细胞和未转化的细胞是营养物；其中该成分或其代谢衍生物当以高浓度存在于培养基中时，对未转化的细胞是有毒的；其中的第一核苷酸序列编码一种基因产物，它能够将以高浓度存在于培养基中的该成分或其代谢衍生物转变成选择性遗传转化细胞的营养物；以及，或者其中该成分或其代谢衍生物对于选择性遗传转化细胞既是碳水化合物又是氮素的来源；或者其中如果该成分的一部分起代谢底物的作用，并被代谢转变成衍生化底物，那么此衍生化底物对该基因产物能够引起别构效应。

根据本发明的第九方面，提供了一种试剂盒，此试剂盒包括一个用于遗传转化未转化的细胞而产生选择性遗传转化细胞的构建物(如当包含在其中或者在载体上或质粒中时)和一种培养基；此构建物包含有一个第一可表达性核苷酸序列和任选地一个第二可表达性核苷酸序列；其中的一种成分或其代谢衍生物当以低浓度存在于培养基中时，对于选择性遗传转化细胞和未转化的细胞是营养物；其中该成分或其代谢衍生物当以高浓度存在于培养基中时，对未转化的细胞是有毒的；其中的第一核苷酸序列编码一种基因产物，它能够将以高浓度存在于培养基中的该成分或其代谢衍生物转变成选择性遗传转化细胞的营养物；此培养基任选地含有高浓度的该成分或其代谢衍生物；以及，或者其中该成分或其代谢衍生物对于选择性遗传转化细胞既是碳水化合物又是氮素的来源；或者其中如果该成分的一部分起代谢底物的作用，并被代谢转变成衍生化底物，那么，此衍生化底物对该基因产物能够引起别构效应。

根据本发明的第十方面，提供了一种植株或植物细胞，它们是按照或者包含本发明的上述方面而产生的。

根据本发明的第十一方面，提供了一种植株或植物细胞，它们含有一种异源性酶和/或编码这种酶的核苷酸序列，其中该异源性酶是葡糖胺-6-磷酸脱氨基酶。

本发明的这一方面是非常有利的。关于这点，不仅这种酶本身可作为某些转化细胞(如马铃薯细胞)的选择手段，并且在限制氮素可利用性的状态下，对糖蛋白的代谢活动产生有益的影响。在豆科植物幼苗苗萌发过程中，在它们与微生物(例如细菌)建立共生关系而能够固定空气氮之前，种子中糖蛋白的代谢活动是后一种有利方面的实例。在这种情况下，例如糖蛋白将被转变成N-乙酰-葡糖胺，然后再转变成葡糖胺-6-磷酸，然后借助于葡糖胺-6-磷酸脱氨基酶被转变成果糖-6-磷酸。

根据本发明的第十二方面，提供了一种食品或食物，它们是按照或者包括本发明的上述方面而产生的。

在本发明的每一方面中，优选代谢底物被转化细胞代谢转变成衍生化底物。

如果培养基中存在某种成分或其代谢底物，那么，该成分或其代谢衍生物的存在量不会对较大部分的转化细胞产生有害的影响。

优选地情况是，如果培养基中存在某种成分或其代谢衍生物，那么该成分或其代谢衍生物的存在量基本上不会对绝大多数的转化细胞产生有害的影响。

更优选的情况是，如果培养基中存在某种成分或其代谢衍生物，那么，该成分或其代谢衍生物的存在量基本上不会对所有的转化细胞产生有害的影响。

在本发明的一个实施方案中，培养基中含有高浓度的该成分或其代谢衍生物。

但是，在另一个实施方案中，培养基中不一定必须含有高浓度的该成分或其代谢衍生物。

另一方面，我们甚至惊奇地发现，在某些情况下培养基中不需要含有任何附加量的本发明的成分或其代谢衍生物。例如，在根据本发明的转基因马铃薯植株中观察到这种惊人的发现，其中的那些植株包含具有nagB基因(将在此论述)的细胞。关于这点，据认为是由于该植株暴露于所使用的特殊生长培养基的结果，使之已经存在有足够高水平的葡糖胺和/或葡糖胺-6-磷酸(包括内源性水平)，致使转化的马铃薯细胞可能代谢任何内源性葡糖胺-6-磷酸，而对于野生型植株，这种水平的内源性葡糖胺-6-磷酸是足够有毒的，以致将破坏它们的存活力。

因此，本发明的其它方面包括：

用葡糖胺-6-磷酸脱氨基酶作为选择手段，用于在未转化的细胞中选择遗传转化细胞。

用编码葡糖胺-6-磷酸脱氨基酶的基因，为在未转化的细胞中选择遗传转化细胞提供选择手段。

一种提供选择手段，用于在未转化的细胞中选择遗传转化细胞的基因；其中该基因可从NCIMB 40852或NCIMB 40853或NCIMB 40854获得。

用从NCIMB 40852或NCIMB 40853或NCIMB 40854获得的基因，为在未转化的细胞中选择遗传转化细胞提供选择手段。

NCIMB 40852或NCIMB 40853或NCIMB 40854。

本发明的另几方面包括：

一种使基因或基因产物失活的方法，这种基因或基因产物当存在于原核生物中时，对此原核生物可能是有害的，该方法通过将至少一个内含子插入此基因(特别是插入其编码区)，从而可对此原核生物使这种基因或基因产物失活。

一种原核生物，它包含有当存在于此原核生物中时，可能对其有害的基因，但是其中该基因含有至少一个使原核生物中这种基因或其产物失活的内含子-特别是当其中的内含子存在于此基因的编码区内时。

对于本发明的这些附加方面，优选地是将至少一种内含子插入该基因的保守区，优选地是编码区内的保守区。

葡糖胺-6-磷酸脱氨基酶也可称为α-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖-6-磷酸乙酮醇异构酶(脱氨基)。此酶具有酶指定号EC5.3.1.10。

在上述几方面中，措词“…用于在未转化的细胞中选择遗传转化的细胞…”，可以按另一种方式表达为例如“…用于从一种或几种未转化的细胞中选择遗传转化的细胞…”。

因此，本发明的一个方面是提供了一个选择系统，用于从培养基内的细胞群中选择至少一种遗传转化细胞；其中的至少一种遗传转化细胞是以编码一种基因产物的核苷酸序列转化的，此基因产物能够将一种以对未转化细胞是有毒的水平存在于培养基中的成分，转变成对于至少一种转化细胞的营养物；其中该成分对转化细胞提供氮素和碳水化合物的来源，以及/或者其中该成分起代谢底物作用，它的至少一种代谢物对此基因产物具有别构作用。本发明还提供了用于此选择系统的酶和核苷酸。

优选地，该成分或其代谢衍生物对于选择性遗传转化细胞既是碳水化合物又是氮素的来源；并且其中如果该成分的一部分起代谢底物的作用，并被代谢转变成衍生化底物，那么此衍生化底物能够对该基因产物引起别构效应。

优选地，该成分能够对选择性遗传转化细胞提供碳水化合物以及氮素的来源。

优选地，该成分或其代谢衍生物含有氨基。

该成分优选地是葡糖胺。

优选地是，对未转化细胞有毒的该成分的代谢衍生物含有磷酸基，以及/或者是由否则将被野生型细胞有效利用的磷酸基构成。按另一种方式或者此外，对未转化细胞有毒的该成分的代谢衍生物，可导致否则将被野生型细胞有效利用的磷酸基发生螯合作用。

优选地，对未转化细胞有毒的该成分的代谢衍生物含有氨基。

优选地是，对未转化细胞有毒的该成分的代谢衍生物能够对选择性遗传转化细胞提供碳水化合物以及氮素的来源。

优选地，对未转化细胞有毒的该成分的代谢衍生物是葡糖胺-6-磷酸。

优选地，该衍生化底物含有氨基和/或磷酸基。

优选地，该衍生化底物是N-乙酰-葡糖胺-6-磷酸。

优选地该第一核苷酸序列含有一个内含子。

优选地该基因产物是一种酶。

优选地这种酶能够修饰糖蛋白前体。

优选地这种酶能够使糖蛋白前体脱氨基。

优选地这种酶是葡糖胺-6-磷酸脱氨基酶。

优选地这种酶是从微生物获得的葡糖胺-6-磷酸脱氨基酶。

优选地这种酶是从细菌获得的葡糖胺-6-磷酸脱氨基酶。

优选地这种酶是从大肠杆菌获得的葡糖胺-6-磷酸脱氨基酶。

优选地此葡糖胺-6-磷酸脱氨基酶具有如SEQ ID NO：3显示的氨基酸序列，或者是它的变异体，同系物或片断。

优选地此葡糖胺-6-磷酸脱氨基酶，或者是由如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，或者其变异体，同系物或片断，或者是与其杂交的互补序列编码的，或者是由如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，或其变异体，同系物或片断，或者是与其杂交的互补序列编码的。

优选地此葡糖胺-6-磷酸脱氨基酶或者编码这种酶的基因是从NCIMB 40852或NCIMB 40853或NCIMB 40854获得。

优选地该选择性遗传转化的一种或几种细胞是在体外培养，或者在生物体体内。

优选地该选择性遗传转化的一种或几种细胞是选择性遗传转化的植物细胞。

优选地是存在第二核苷酸序列，并且其中该第二核苷酸序列编码一种所需的核苷酸序列。

优选地这种植物能够对人类或动物提供食品。

优选地这种植物(或者它的一部分，包括它的细胞)是单子叶植物或双子叶植物(包括豆科植物)。

优选地这种植物(或者它的一部分，包括它的细胞)是瓜尔豆，马铃薯或玉米中的任何一种。

因此，本发明提供了一种选择遗传转化细胞的方法，例如选择已掺入了所需核苷酸序列(“NOI”)的细胞，用于提供具有选择性优势的转化细胞。

本发明的方法不依赖于产生包含有编码抗生素或除草剂抗性的核苷酸序列作为选择手段的遗传转化植物。然而，如果需要，例如如果希望产生已经或者将用若干种NOIs转化的细胞，本发明的方法可以同以前的选择方法一起使用。

如果需要，例如如果希望产生已经用若干种NOIs转化的细胞，本发明的选择法还可以同一种或几种其它已知的选择法一起使用，如在WO93/05163(其内容在此被引入作为参考)中和/或在WO94/20627(其内容在此被引入作为参考)中所述的选择法。

此外，如果需要，例如如果希望产生已经用若干种NOIs转化的细胞，本发明的选择法还可以同一种或几种本发明的其它选择法一起使用。

本发明选择法组合的另一个有益用途是可形成非常有效的多重筛选技术。如上已所指出的，培养基中存在某种成分或其代谢衍生物是一个任选的特征。而且在某些情况下，可不必对培养基加入此成分或其代谢衍生物。本发明的这两方面可用于一种包括二个筛选步骤的组合选择法。关于这点，举例来说，在利用本发明选择法的第一步筛选中，培养基不含有外加量的该成分或其代谢衍生物。借助于此第一步筛选，至少可从多数未转化的细胞中选择出可选择性转化细胞。然后如果例如在第一步筛选中偶然还有未转化的细胞，那么可进行第二步筛选。在第二步筛选中，被选择的细胞群将经受本发明的第二选择法，但是其中在培养基中存在该成分或其代谢衍生物，优选地是以高浓度存在。在第二步筛选中，只有转化的细胞能保持存活。

按照本发明的这种组合方式，因此，本发明初始状态的细胞群可以是预选择的(例如预筛选的)细胞群，其中该细胞群以前已经由一种或几种选择法，如本发明的选择法，选择过。

本发明的这种组合方式可按另一种方式表达为：一种用于从细胞群中选择一种或几种选择性遗传转化细胞的选择方法，其中该细胞群包含有选择性遗传转化细胞和可能的未转化细胞；其中每种选择性遗传转化细胞都包含一个第一可表达性核苷酸序列和任选一个第二可表达性核苷酸序列；其中的一种成分或其代谢衍生物，当以低浓度存在于培养基中时，对于选择性遗传转化细胞和未转化的细胞都是营养物；其中该成分或其代谢衍生物，当以高浓度存在于培养基中时，对未转化的细胞是有毒的；其中的第一核苷酸序列编码一种基因产物，它能够将以高浓度存在于培养基中的该成分或其代谢衍生物转变成对于选择性遗传转化细胞的营养物；以及，或者其中该成分或其代谢衍生物对于选择性遗传转化细胞既是碳水化合物又是氮素的来源；或者其中如果该成分的一部分起代谢底物的作用，并被代谢转变成衍生化底物，那么此衍生化底物对该基因产物能够引起别构效应，该方法包括将此细胞群导入一种培养基，然后从未转化的细胞中选择至少一部分转化细胞的步骤；以及随后将此至少一部分转化细胞导入含有高浓度该成分或其代谢衍生物的培养基中。

本发明还包括用于本发明这种组合方式的组合物和试剂盒，例如本发明的基因或基因产物，不含有该成分或其代谢衍生物的第一培养基，以及含有高浓度该成分或其代谢衍生物的第二培养基。

而且，本发明的选择法可以同另一些选择法一起使用，其中的另一些选择法是本发明的一种或几种其它选择法和已知的一种或几种选择法-如依赖于抗生素或除草剂抗性的选择法和/或WO93/05163和/或WO94/20627中所述选择法的组合形式。

在WO93/05163和/或WO94/20627的选择法中，来自大肠杆菌，编码甘露糖-6-磷酸异构酶(E.C.5.3.2.8)的manA基因被用作可选择性标记。这种选择标记特别适合于Solanum tuberosum(马铃薯)的转化，对甘露糖的存在赋予阳性选择。更详细地说，是将manA的编码区连接于CaMV 35S表达盒中，并导入一个二元载体中进行由根瘤土壤杆菌介导的植物转化。为了能够使卡那霉素选择同根据甘露糖的选择进行比较，此载体还包含有卡那霉素抗性基因nptII。为了鉴定转化体，此构建物还包含有β-葡糖醛酸酶组织化学标记物uidA。对manA基因的稳定整合可通过DNA印迹试验显示。以此构建体转化的，并根据甘露糖选择的植物，其提取物显示的甘露糖-6-磷酸异构酶的比活性，大约是对照植物的500倍。转化细胞中对manA的表达可解除通常由甘露糖引起的代谢麻痹，同时还可以将它作为转化体的碳水化合物来源。这些作用结合起来强化了有利于转化细胞的严格选择压力，使之能够以非常低的遗漏出现率回收转化体。根据甘露糖选择后显示为转基因细菌的百分数，大约是据卡那霉素选择细菌的二倍。已证明根据甘露糖选择的转化体，从块茎繁殖三代以上的植株是稳定的。

因此，本发明初始状态的细胞群可以是预选择的(例如预筛选的)细胞群，其中该细胞群已经用一种或几种本发明的选择法和/或一种或几种其它选择法预先选择过。

此外或按另一种方式，用本发明的选择法选择的转化细胞，随后可以再经受一种或几种本发明的选择法和/或一种或几种其它选择法。

本发明还提供了一个表达系统，能够对转化细胞借助于本发明的选择法进行选择。此表达系统可以是正在表达，或者可以是能够表达本发明的第一核苷酸序列。此表达系统可能是一个或几个载体，构建物，质粒，细胞或生物体。

如果细胞还要用一种NOI转化，那么该表达系统将包含那种NOI，它的NOI可能存在于同第一核苷酸序列相同的载体，构建体，质粒，细胞或生物体中。按另一种方式，此NOI可能存在于与第一核苷酸序列不同的载体，构建体，质粒，细胞或生物体中。优选地该NOI是存在于同第一核苷酸序列相同的载体，构建体，质粒，细胞或生物体中。

如果细胞将用一种或几种NOI以及一种或几种其它遗传转化，用于一种或几种其它选择法(如本发明的另一种选择法和/或已知的选择法)，那么这些其它的核苷酸序列可能存在于同第一核苷酸序列相同的载体，构建物，质粒，细胞或生物体中。按另一种方式，这些一种或几种其它的核苷酸序列可能存在于与第一核苷酸序列不同的载体，构建体，质粒，细胞或生物体中。优选的这些其它的核苷酸序列存在于同第一核苷酸序列相同的载体，构建物，质粒，细胞或生物体中。这使工作者可容易地产生和容易地选择已用若干种NOI等转化的细胞。

名词“细胞”意指应用本发明方法可从中鉴别和分离单独遗传转化细胞的任何形式的细胞。这类细胞的例子包括植物细胞，动物细胞和微生物如细菌、真菌、酵母菌等。名词“细胞”还意指包括原生质体，即包裹在膜内但没有细胞壁的细胞原生质。尽管预期本发明的选择法可用于任何形式的细胞，但是已发现本方法特别适合于选择遗传转化的植物细胞。

名词“细胞群”指的是已经受了遗传转化的任何种类细胞，并且希望从其中鉴别已被遗传转化的细胞，以及从未遗传转化的细胞中分离出遗传转化的细胞。这种细胞群可能是例如组织，器官或其一部分，在基质中的单独细胞群如微生物细胞培养物，例如在溶液或悬液中的一群细胞，或者整个生物体如整株植物。

名词“选择”是指用本发明的方法从未遗传转化的细胞中鉴别和/或分离出遗传转化细胞的过程。

名词“对未转化细胞有毒”包括抑制未转化细胞生长，以及使它死亡。

名词“培养基”包括能够对转化的细胞提供选择性优势如选择性生长优势的任何培养基。例如，这种培养基可能含有生长培养基的一般成分，但其中的某些成分是以仅使转化细胞选择性生长的量存在。在本发明的某些实施方案中，这种培养基将含有根据本发明的一种成分或其代谢前体物，并且优选地是以高浓度存在。

关于这点，该成分-如加入的成分或从所加入的前体物产生的成分-或者其代谢衍生物，当以低浓度存在时对未转化的细胞是营养物，而其中该成分或其代谢衍生物当以高浓度存在时对未转化的细胞是有毒的。

名词“低浓度”优选地意指大于0μM-小于25μM。低浓度的一般优选的实例是在μM范围内。

名词“高浓度”优选地意指至少25μM-100mM(或者在某些情况下甚至更高)。高浓度的一般优选的实例是在mM范围内。

名词“营养物”包括能够直接或间接(例如通过其代谢物)提供能量或原子的物质，并能有效地用于细胞、组织、器官或生物体的维持和/或生长和/或繁殖等活动。例如，此名词包括在使转化的细胞能够生长、增殖、或将维持有生命形式的代谢途径中，可以有效地被代谢和/或有效地被利用的基质。

名词“遗传转化的”包括应用重组DNA技术的转化作用。

措词“将细胞群导入培养基”意指将细胞群加到培养基中或者相反。

如果该成分的一部分起代谢底物的作用，并被代谢转变成衍生化底物，其中该衍生化底物能够对该基因产物引起别构效应，那么这种代谢转变可以是一步代谢转变过程，或者可以是多步代谢转变过程。

本发明的该成分可能由其代谢前体物产生。

名词“未转化的细胞”意指不含有本发明第一核苷酸序列的细胞。当此遗传转化的细胞包含有二种不同的第一核苷酸序列时，该名词还包括不含有另一种第一核苷酸序列的细胞。该名词还包括任何一种以前转化的细胞，但是其中这种以前转化的细胞不含有本发明的第一核苷酸序列，或者不含有同转化的细胞相同数目的第一核苷酸序列。

在一个高度优选的实施方案中，该第一核苷酸序列不是在其天然环境中。关于这点，该第一核苷酸序列对细胞或生物体可能不是天然的(即外来的)。此外，该第一核苷酸序列对细胞或生物体可能是天然的，但是其中该第一核苷酸序列被有效地连接于一个对此第一核苷酸序列是异源性的启动子。

该第一核苷酸序列可能是DNA或RNA。优选地该第一核苷酸序列是DNA。更优选地该第一核苷酸序列是重组DNA。

同样，该第二核苷酸序列可能是DNA或RNA。优选地该第二核苷酸序列是DNA，更优选地该第二核苷酸序列是重组DNA。

名词“所需核苷酸序列”(即“NOI”)意指用于掺入所研究的细胞而产生遗传转化细胞的任何所需的核苷酸序列。将核苷酸序列导入植物，微生物和动物已被广泛地实践，据认为对核苷酸序列没有任何限制，通过应用本发明的选择法可选择(例如检测)它们的存在。

通过应用本发明的方法，可测定NOI在遗传转化细胞中的存在，而没有前述与仅仅依赖于抗生素抗性和/或除草剂抗性的选择系统相关联的缺点。

NOI可以是任何所需的核苷酸序列，如任何所需的基因。NOI对于所研究的细胞或生物体(例如特别是植物)可以是或者外来的，或者天然的任何核苷酸序列。NOI典型的例子包括编码修饰代谢和降解过程的蛋白质和酶的基因。NOI可能编码导入或增加对病原体抗性的因子。NOI甚至可以是反义构建物，用于修饰存在于相关组织中的天然转录物的表达。NOI甚至可能编码对动物或人类有益的化合物。NOI的例子包括编码如下任何一种或几种酶或者其组合的核苷酸序列以及它的反义序列：果胶酶，果胶解聚酶，多聚半乳糖醛酸酶，果胶酸裂解酶，果胶裂解酶，鼠李半乳糖醛酸酶，半纤维素酶，内-β-葡聚糖酶，阿拉伯聚糖酶或乙酰酯酶。NOI可能编码给予食物或谷物营养价值的蛋白质。典型的例子包括可抑制抗营养因子形成的植物蛋白和具有较理想氨基酸组成的植物蛋白(例如比非转基因植物有较高的赖氨酸含量)。

NOI甚至可能编码可用于食品加工的酶如凝乳酶，奇甜蛋白和α-半乳糖苷酶。NOI可以是编码如下物质的基因：任何一种害虫毒素，反义转录物如patatin或α-淀粉酶的反义转录物，ADP-葡糖焦磷酸化酶(例如参见EP-A-0455316)，反义蛋白酶，葡聚糖酶或基因组β1，4-内葡聚糖酶。

NOI甚至可编码或含有某特定基因的内含子。在此这种内含子可以是有义或反义取向。在后一种情况，此特定基因可能是编码β-1，4-内葡聚糖酶的DNA。NOI基因外显子或内含子序列的反义表达，意味着天然的β-1，4-内葡聚糖酶表达将被降低或消除，但其中本发明β-1，4-内葡聚糖酶基因的表达将不受影响。

NOI也可以是编码阿拉伯呋喃糖苷酶的核苷酸序列，此酶是PCT专利申请PCT/EP86/01009(在此被引入作为参考)的主题。NOI还可以是编码ADP葡糖焦磷酸化酶的任何一种核苷酸序列，此酶是PCT专利申请PCT/EP94/01082(在此引入作为参考)的主题。NOI还可以是编码α-葡聚糖裂解酶的任何一种核苷酸序列，此酶已在PCT专利申请PCT/EP94/03397(在此被引入作为参考)中被描述。NOI还可以是编码葡聚糖酶的任何一种核苷酸序列，此酶已在PCT专利申请PCT/EP96/01008(在此被引入作为参考)中被描述。

NOI还可以编透性酶或其它转运因子，使化合物或其前体物或其代谢衍生物能够越过细胞膜进入转化细胞内。不是促进摄取化合物进入细胞，而是共导入的核苷酸序列可能按另一种方式引导该成分或其前体物或其代谢衍生物至某一特殊区域如质膜，或者进入液泡中内织网。

可以存在一个以上NOI。

NOI可以同本发明的第一核苷酸序列一起被共导入。

名词“共导入”意指二个核苷酸序列可能相互偶联，或者在一起被导入，按这样一种方式，以致细胞中存在共导入的第一核苷酸序列可指示NOI已被导入进此细胞，也就是说，如果显示第一核苷酸序列已被导入，那么NOI也已被导入的可能性将显著地增加。这二个核苷酸序列可能是同一基因构建体的一部分，并且可能是借助于同一载体导入的。

当共导入的第一核苷酸序列和NOI是单独被导入时，也可以应用在此所述的方法。例如，这可通过如下方法进行：应用同一种菌掺入二种基因至细胞中，以及将比较大量的NOI拷贝掺入细胞中，从而使显示表达第一核苷酸序列的细胞也将包含并表达NOI的机率比较高。

为了使导入的第一核苷酸序列和任选的NOI在转化的细胞中被表达，包含第一核苷酸序列和/或NOI的基因构建体一般，但不是必须，含有使之能表述此核苷酸序列的调节序列，例如已知的启动子和转录终止子。因此，第一核苷酸序列通常将与启动子结合，这种启动子可能是组成型或可调节的启动子，并且NOI通常也将与组成型或可调节的启动子结合。

如前面所述，本发明的基因产物是葡糖胺-6-磷酸脱氨基酶(EC5.3.1.10)。编码葡糖胺-6-磷酸脱氨基酶的基因可从非植物生物体如大肠杆菌获得。这种基因的一个例子被称作nagB基因。Reger，MJet al((1988)基因62：197-207)已克隆和测序了这种基因。但是，那些工作人员并没有表明这种nagB基因能够在植物中表达，更不用说用于选择方法。另一方面，可以从植物如绿豆幼苗中获得葡糖胺-6-磷酸脱氨基酶。Veiga，LA((1968)植物及细胞生理9：1-12)报导了这种活性的一个例子-但是作者没有报导有关任何序列的信息。

该第一核苷酸序列和/或NOI可能含有一个或几个内含子。特别是如果该第一核苷酸序列和/或NOI编码可有害的影响一种细菌的基因产物，并且这种细菌的全部或一部分(例如它的或其中的质粒)被用于或者增殖此NOI，或者作为转化此细胞的一种手段，那么最理想的是此基因产物在细菌中是无活性的。选择性使细菌中此基因产物失活的一种方法是将一个或几个内含子插入该第一核苷酸序列或NOI的核苷酸序列中。这个内含子或这些内含子在细菌中转录之后将不被除去，但是在例如植物等中将被除去。

在一个高度优选的实施方案中，如果该第一核苷酸序列和/或NOI含有至少一个内含子，那么此至少一个内含子存在于第一核苷酸序列或NOI的高度保守区内。在此名词“内含子”按其正常意义使用，意指位于编码序列中的一种核苷酸序列，但是可从其中除去。

我们认为这是第一次公布或提出，对原核生物如细菌有潜在危害的基因或基因产物，通过将至少一个内含子插入此基因，可使之在原核生物内被失活，特别是当这至少一个内含子插入基因的保守区内，更特别是当这至少一个内含子被插入该基因编码区的保守区内。

因此，本发明还提供了一种使基因或基因产物失活的方法，这种基因或基因产物当存在于原核生物内时对原核生物具有潜在性危害，可通过对此基因插入至少一个内含子，从而可对原核生物使此基因或基因产物失活。

优选地，本发明还提供了一种使基因或基因产物失活的方法，这种基因或基因产物当存在于原核生物内时对此原核生物具有潜在性危害，可通过对此基因插入至少一个内含子，从而使此基因或基因产物失活，其中该至少一个内含子是插入基因的保守区。

按另一种方式表述：本发明的这一方面涉及到一种方法，它包括将对原核生物具有潜在性危害的基因或其产物转变成对此原核生物没有潜在性危害的改变的基因或其产物，此方法包括将至少一个内含子插入此潜在性危害基因的步骤，按这种方式而形成了改变的基因，优选地其中该至少一种内含子是被插入基因的保守区，更优选地是当此至少一种内含子被插入基因编码区的保守区内。

本发明还提供了一种原核生物，它包含有一种当存在于此原核生物中，对它具有潜在性危害的基因，但是其中该基因包含至少一个内含子，从而可使原核生物内的此基因或其产物失活。

优选地，本发明还提供了一种原核生物，它含有一种当存在于此原核生物中，对它具有潜在性危害的基因，但是其中该基因包含至少一个内含子，从而可使原核生物内的此基因或其产物失活；并且其中该至少一个内含子是被插入基因的保守区内，更优选地是当此至少一种内含子被插入该基因编码区的保守区内。

本发明还包括可从这种改变的基因表达获得的产物。

在本发明此特殊方面高度优选的实施方案中，提供了一个如SEQID NO：2所显示的核苷酸序列或者其变异体，同系物或片段，或者是与此序列互补的序列。此核苷酸序列相当于nagB基因(见SEQ IDNO：1)的编码区，但是其中特别是一个内含子存在于此序列中。本发明还包括含有或表达此核苷酸序列的构建体，载体，质粒，或转基因生物体(或者其器官，组织或细胞)。优选地该生物体是一种植物，或者其细胞或组织。

本发明还包括如SEQ ID NO：2显示的核苷酸序列或者其变异体，同系物或片断，或者是与其互补的序列，当它有效地连接于启动子，并在启动子控制下时，可使此核苷酸序列表达。对于这方面，该启动子可以是细胞或组织特异性启动子。如果例如，该生物体是一种植物，那么该启动子可以是在任何一种或几种种子，茎，芽，根和叶组织中影响该核苷酸序列表达的启动子。

名词“启动子”按本领域的正常意义使用，例如基因表达的Jacob-Mond理论中的RNA聚合酶结合部位。

该启动子另外还可能包括为保证或增强在适当宿主内表达的一个或几个部件。例如，这些部件可以是保守区如Pribnow盒或TATA盒。该启动子甚至还包含影响(如维持，增强，减少)本发明核苷酸序列表达水平的其它序列。例如，适合的其它序列包括Sh1-内含子或ADH内含子。其它序列包括可诱导性成分如温度，化学的，光或应激反应可诱导性成分。

还可能存在增强转录或翻译的适当成分。后一种成分的例子是TMV5′信号序列(见Sleat，基因217〔1987〕217-225；和Dawson，植物分子生物学23〔1993〕97)。

名词“变异体”，“同系物”或“片断”对于本发明优选酶的氨基酸序列，包括从该序列或者对该序列的任何一个(或几个)氨基酸的取代，改变，修饰，置换，删除或增加，只要所形成的酶具有葡糖胺-6-磷酸脱氨基酶活性，优选地是具有如SEQ ID NO：3所显示酶的至少相同的活性。特别是名词“相似的”包括结构和/或功能方面的相同。对于序列方面的相同，优选地是与SEQ ID NO：3显示的序列有至少75％相同，较优选地是至少85％相同，更优选地是至少90％相同，再优选地是与SEQ ID NO：3显示的序列有至少95％相同，更优选地有至少98％相同。

名词“变异体”，“同系物”，或“片断”对于编码本发明优选酶的核苷酸序列，包括从该序列或者对该序列的任何一个(或几个)核苷酸的取代，改变，修饰，置换，删除或增加，只要所形成的核苷酸序列编码或能够编码具有葡糖胺-6-磷酸脱氨基酶活性的酶，优选地是具有与由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2显示序列所编码的酶至少相同的活性。特别是名词“同系物”包括结构和/或功能方面的同源性，只要所形成的核苷酸序列编码或能够编码具有葡糖胺-6-磷酸脱氨基酶活性的酶。对于序列方面的相同，优选地是与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2显示的序列有至少75％相同，较优选地是至少85％相同，更优选地是至少90％相同，再优选地是与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2显示的序列有至少95％相同，更优选地是至少98％相同。但是，SEQ ID NO：2的“变异体”，“同系物”或“片断”优选地不含有SEQ ID NO：1本身所显示的核苷酸序列。

优选地SEQ ID NO：2的“变异体”，“同系物”或“片断”包含SEQ ID NO：1所显示的核苷酸序列，但是其中至少有一个内含子存在于该序列中。

优选地SEQ ID NO：2的“变异体”，“同系物”或“片断”包含SEQ ID NO：1显示的核苷酸序列，但是其中至少有一个内含子存在于该序列的保守区内。优选地是将此内含子插入编码保守氨基酸序列的区域内。优选地此保守的氨基酸序列是VVTFNMDEY。

名词“变异体”，“同系物”或“片断”与该序列的等位变体是同义的。

名词“变异体”还包括与能够同在此所提供的核苷酸序列杂交的序列的互补序列。对于这方面，名词“变异体”优选地包括与能够在严格条件下(例如65℃和0.1SSC)同在此所提供的核苷酸序列杂交的序列互补的序列。

本发明还包括可同本发明的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。

名词“同源性”在此使用时可等同于名词“同一性”。借助于可购得的计算机程序可以测定序列的相对同源性(即序列的相对同一性)，此程序可以计算二个或几个序列之间的同源性百分数。这样一种计算机程序的典型例子是CLUSTAL。

名词“载体”包括表达载体和转化载体。

名词“表达载体”意指一种能够在体内或体外表达的构建体。

名词“转化载体”意指能够从一种生物转移至另一种生物的构建体，例如从大肠杆菌质粒转移至土壤杆菌，再转移至植物。

名词“组织”包括组织本身和器官。

名词“生物体”对于本发明包括任何一种生物体，它可能含有编码本发明的酶和/或从其中得到的产物的核苷酸序列，并且/或者其中本发明的核苷酸序列当存在于该生物体时可以被表达。该生物体优选地是植物。

对于本发明名词“转基因生物体”包括任何一种生物体，它含有编码本发明的酶和/或从其中得到的产物的核苷酸序列，并且/或者其中本发明的核苷酸序列可以在此生物体中被表达。该核苷酸序列优选地被掺入进生物体的基因组。该转基因生物体优选地是植物。

在高度优选的实施方案中，这种转基因生物体(或它的一部分)不含有启动子和编码本发明酶的核苷酸序列的组合物，其中的启动子和核苷酸序列对此生物体(或它的一部分)都是天然的，并且处于它们的天然环境中。因此，在此高度优选的实施方案中，本发明不包括处于其天然环境中的根据本发明的天然核苷酸编码序列，此时该序列是在也处于其天然环境中的其天然启动子控制之下。此外，在此高度优选的实施方案中，本发明不包括处于其天然环境中的根据本发明的天然酶，并且此时它已经被处于其天然环境中的其天然核苷酸编码序列表达，此时该核苷酸序列是在也处于其天然环境中的其天然启动子控制之下。换句话说，优选的是，该核苷酸序列对此生物体是异源性的，并且/或者是在异源性启动子的控制之下。

如前面所述，本发明的方法特别适用于选择遗传转化的植物细胞，从而能够不必依赖于使用编码抗生素或除草剂抗性的选择基因而对这种细胞进行鉴别和分离。

本发明的选择法可以用于在体外选择细胞，但是，根据它可能选择性地从含有本发明选择系统的细胞，组织等生长成转化的生物体如植物而言，本发明的选择法也可以应用于体内。

鉴于在整株植物或在植株的某些部分进行遗传转化，其中该植株或植株的某些部分包含有转化的和未转化的二种细胞，在体内应用本发明的选择性特别重要，因为在某些情况下，可以不直接损害邻近的未转化细胞而实现对转化细胞的选择。例如，在某些情况下，与未转化的细胞相比较，转化的细胞具有选择性优势-例如能够形成幼苗-但是，就被损伤或杀死而言，象在使用抗生素或除草剂的情况下，未转化的细胞没有经受任何严重的损害。

在某些情况下，例如当要求提高选择成功率时，用不同于第一核苷酸序列的选择基因核苷酸序列转化细胞可能是有利的。这种加入的选择核苷酸序列可能是一个加入的基因，它编码适合于根据本发明选择的酶(或者其它蛋白质或多肽)，或者可能是一个基因，它编码用于已知选择法的酶(或者其它蛋白质或多肽)，例如编码对抗生素或除草剂抗性，或者还可能是一种适合于借助在WO93/05163和/或WO94/20627中所述选择法进行选择的基因。因此，可用组合选择技术选择遗传转化细胞。例如，如果转化细胞还具有编码至少一种抗生素或除草剂抗性的基因，那么其培养基可补充含有至少一种该转化细胞对它有抗性的抗生素或除草剂。特别是我们已发现，本发明的培养基不会削弱依赖于除草剂或抗生素抗性的已知选择法的效果。

本发明转化细胞具有的选择性优势可能是相对于未转化细胞的任何一种差异或优势，它能使转化细胞容易从未转化的细胞中鉴别和分离出。例如，这可能是使之能借助于简单的直观手段鉴别转化细胞的差异或优势，也就是说，不需应用单独的测定法来测定提供选择手段的基因的存在。

如前面所述，本发明的一个方面是关于已经按照上述方法选择的遗传转化细胞，特别是植物细胞，以及从这种遗传转化的植物细胞得到的或可诱导的植株，后代或种子。特别是，经常成为优势的是，这些细胞是遗传转化的植物细胞，它的基因组不含有编码作为选择手段的毒素抗性，抗生素-抗性或除草剂抗性的导入(即非天然的)核苷酸序列。如前面所说明的，有人担心将编码例如抗生素抗性的基因掺入例如食用植物中是否安全。因此在这方面，通过本发明方法选择的不含有例如抗生素抗性选择基因的遗传转化细胞，以及从这种细胞产生的植株，后代和种子无疑是有利的。

可通过本领域已知的技术产生转化细胞。例如，如果转化细胞是转化的植物细胞，可参考EP-B-0470145和CA-A-2006454。

虽然在EP-B-0470145和CA-A-2006454中未公开本发明的选择法，但是，对于可用于产生本发明的转化植物和转基因植物的技术类型，这二篇文献的确提供了些有用的背景评述。这些背景技术中的某些将包括在如下评述中。

构建遗传修饰植物的基本原理是，将遗传信息插入此植物的基因组中，以致获得稳定保持的插入的遗传物质。

有几种技术可用于插入遗传信息，二个主要的原理是直接导入遗传信息和通过使用载体系统导入遗传信息。一般技术的述评可在Potrykus的论文中找到(植物生理学和植物分子生物学年评〔1991〕42：205-225)及Christou(农业-食品工业高技术，1994年3月/4月17-27)。

因此，一方面本发明涉及一个载体系统，它携带有本发明的第一核苷酸序列或构建体，它能够将此核苷酸序列或构建体导入生物体如植物的基因组。

该载体系统可能包含一个载体，但是也可以包含至少二个载体。在二个载体的情况下，通常此载体系统被称为双载体系统。双载体系统的进一步叙述见Gynheung An et al.(1980)，双载体，植物分子生物学手册，A3，1-19。

用于以给定的启动子或核苷酸序列或构建体转化植物细胞的一个广泛采用的系统，是基于使用来自根瘤土壤杆菌的Ti质粒，或来自发根土壤杆菌的Ri质粒(An et al.(1986)，植物生理学81，301-305，及Butcher D.N.et al(1980)，用于植物病理学的组织培养法，edsD.S.Ingrams and J.P.Helgeson，203-208)。

已经构建了几种适合于构建上述植物或植物细胞构建物的不同的Ti和Ri质粒。

本发明的第一核苷酸序列或构建物优选地应该在T-DNA的边缘序列之间，或者在相邻的T-DNA序列插入Ti-质粒，以避免破坏紧紧环绕T-DNA边缘的序列，因为其中的至少一个区域看来对将修饰的T-DNA插入植物基因组是必需的。

根据上面的说明可以理解到，如果该生物体是植物，那么本发明的载体系统优选地是含有感染此植物所必须的序列(例如vir区)以及T-DNA序列的至少一个边缘部分的载体系统，此边缘部分是位于与基因构建体同一载体上。此载体系统优选地是根瘤土壤杆菌Ti-质粒或发根土壤杆菌Ri-质粒，或者是它们的衍化体，因为在构建转基因植物中这些质粒是熟知的，并被广泛地采用，所以存在基于这些质粒或其衍生体的许多种载体系统。

在转基因植物的构建中，可以首先将本发明的启动子或核苷酸序列或构建体构建进一种微生物中，在其中该载体可以复制，并且在插入至植物之前此微生物容易处置。实用的微生物例子是大肠杆菌，但是也可以使用具有上述特性的其它微生物。当在大肠杆菌中已经构建了如上面所限定的载体系统中的一个载体，如果必要可被转移进入适合的土壤杆菌菌株，例如根瘤土壤杆菌。因此，优选地可将携带有本发明第一核苷酸序列或构建物的Ti-质粒转移进入适合的土壤杆菌菌株，例如根瘤土壤杆菌，这样获得携带有本发明启动子或核苷酸序列或构建物的土壤杆菌细胞，随后其DNA可被转移进入待修饰的植物细胞。

如在CA-A-2006454中报导的，已获得了大量的克隆载体，它们含有在大肠杆菌中的复制系统，以及能够选择转化细胞的选择手段。这些载体包括例如pBR322，pUC系列，M13mp系列，pACYC184等。这样，可以将本发明的启动子或核苷酸序列或构建物导入载体中适当的限制性酶切位置。所包含的质粒可用于在大肠杆菌中进行转化作用。将此大肠杆菌细胞在适当的营养培养基中培养，然后收获细胞并使之溶胞。回收质粒，然后进行分析，例如借助于如下的任何一种或几种技术：序列分析，限制性酶切分析，电泳，以及另一些生化-分子生物学方法。在每一步处理之后，对所使用DNA可以作限制性分析，或者借助于PCR技术进行选择性扩增，并与下一个DNA序列连接。可以在相同的或不同的质粒中克隆每个序列。

在植物中本发明的第一核苷酸序列或构建物的每种导入法之后，可能有必要存在和/或插入另外的DNA序列。例如如果将Ti或Ri质粒用于转化植物细胞，至少Ti-和Ri-质粒T-DNA的右边，经常是其左右二边作为导入基因的侧翼区可用于连接。对于用T-DNA转化植物细胞已有透彻的研究，在如下文献有描述：EP-A-120516；Hoekema：双植物载体系统，Offset-drukkerij Kanters B.B.Alblasserdam，1985，第5章；Fraley.et，植物科学评述4：1-46；以及An et al，EMBO J.(1985)4：277-284。

用土壤杆菌直接感染植物组织是已广泛采用的简便技术，被描述在如下文献中：Butcher D.N.et al(1980)，用于植物病理学的组织培养技术，编辑者：D.S.Ingrams and J.P.Helgeson，203-208。关于此论题的另几种技术可参见Potrykus(植物生理学和植物分子生物学年评〔1991〕42：205-225)和Christou(农业-食品-工业高技术，1994年3月/4月17-27)。应用这种技术，可在植物的某一部分或组织对植物进行感染，也就是说，在植物叶、根、茎的一部分或另一部分感染植物。

为了用携带第一核苷酸序列或构建物的土壤杆菌直接感染植物组织，通常是使待感染的植株产生伤口，例如通过用剃刀切割植株，或者是针刺植株，或者用打磨具磨损植株。然后以此土壤杆菌接种伤口。再使接种的植株或植株部分生长在适合的培养基上。

当构建植物细胞时，可按照熟知的组织培养法，使这些细胞生长和任选地保持在本发明的培养基中，例如通过在以必要的生长因子如氨基酸，植物激素，维生素等补充的适当培养基中培养这些细胞，但是，其中该培养基含有本发明的一种成分。应用已知的从细胞或组织培养物再生植株的方法，可实现将此转化的细胞再生成为遗传修饰的植物，例如通过选择转化的幼苗，并通过在含有适当营养物，植物激素等的培养基上对此幼苗进行继代培养。

有关植物转化的另一些技术可在EP-A-0449375中找到。

甚至还可涉及到Spngstad et al的论文(1995植物细胞、组织、器官培养40pp1-15)，因为这些作者提供了关于转基因植物转建的概述。

在高度优选的实施方案中，本发明是基于我们的如下发现，使用含有编码葡糖胺-6-磷酸脱氨基酶的可表达基因的构建物，可能产生转化的细胞，其中可以从未转化的细胞中选择转化的细胞。

此外，本发明还包括含有本发明转化细胞或构建物的转基因植物。

因此，在高度优选的实施方案中，本发明包括含有转化细胞或构建物的转基因植物，此转化的细胞或构建物包含编码葡糖胺-6-磷酸脱氨基酶的可表达基因。

为了更详细地说明本发明的这些高度优选方面，将涉及至少图1-图11。

关于这方面，低浓度(一般为μM浓度)的葡糖胺被代谢成N-乙酰葡糖胺(“NAGA”)，后者又被代谢成N-乙酰葡糖胺-6-磷酸(“NAG6P”)，再被代谢成N-乙酰葡糖胺-1-磷酸，然后再被代谢成UDP-N-乙酰葡糖胺。对于糖蛋白，UDP-N-乙酰葡糖胺是一种有用的生物前体物(Roberts.RM.植物生理学，45：263-267)。此代谢途径图解显示在图1中。因此，葡糖胺在低浓度对植物细胞是营养物。

但是，高浓度(一般为mM浓度)的葡糖胺被代谢成葡糖胺-6-磷酸(“GA6P”)。这是因为当以mM浓度提供葡糖胺时，这种糖的浓度水平在已糖激酶的K_m范围之内，此时发生磷酸化而形成葡糖胺-6-磷酸。此代谢途径图解显示在图1中。

因此，对植物细胞给予μm量葡糖胺，导致形成可被进一步代谢的NAGA，而以mM量供给的葡糖胺导致GA6P积累，GA6P对未转化的细胞是不希望有的(Chen-She.S(1995)，新植物74：383-392)。在这方面，不象NAGA，GA6P对天然植物细胞不是营养物。实际上GA6P对天然植物细胞是有毒的。对此，GA6P的存在可使植物细胞不强壮。在某些情况下，这种细胞甚至可能死亡，因为GA6P不容易进入植物代谢途径。因此，在高浓度时葡糖胺代谢产生一种代谢产物，它的积累对未转化的植物细胞是有毒的。

根据本发明然后我们发现，GA6P可在植物细胞内被酶促转变成营养物，特别是我们发现，在植物细胞内葡糖胺-6-磷酸脱氨基酶(如由nagB基因编码的酶)可将GA6P转变成果糖6-磷酸(“F6P”)。此代谢途径图解显示在图2中。

如所熟知，F6P是非常有益的生物学底物，因为它是EmbdenMeyerhof途径的一种成分。因此，在高浓度时，葡糖胺的潜在毒性代谢产物可被酶促转变成植物细胞有益的营养物。这种酶促转变构成了本发明选择法基础的一个方面。

已知大肠杆菌对葡糖胺6-磷酸的代谢是由葡糖胺-6-磷酸脱氨基酶(E.C.5.3.1.10)促进的。此酶同时催化脱氨基作用和醛/酮糖异构化作用，形成果糖6-磷酸(Wolfe.J.B.& Nakada.H.I(1956)生化生物物理文档64：489-497，Wolfe.J.B.et al(1957)生化生物物理文档66：333-339)。尽管如此，以前并未提议这种酶可能可作选择法的特征，更不用说在植物细胞中被表达。

有趣的是，虽然GA6P转变成F6P导致释放NH₃-太高产生时它对植物是有毒的，但是我们发现，植物细胞未受到有害的影响。因此，尽管在本发明高度优选的选择法中释放了潜在有毒的副产品，但是，这种释放对整个选择法没有不利的影响。这种结果是非常令人吃惊的。

本发明选择法的一个方面是提供了一个补充的有利特征。关于这方面，对于由被nagB编码的葡糖胺-6-磷酸脱氨酶将GA6P转变成F6P，NAG6P具有阳性作用(别构效应)。本发明的这一方面的图解显示在图3中。此惊人的发现是根据用大肠杆菌所作的研究(Calcagno.M.et al(1984)生物化学和生物物理学报787：165-173)。因此，如果有葡糖胺被代谢成NAGA，并且最后又变成NAG6P，那么NAG6P将保证通过葡糖胺-6-磷酸脱氨基酶将GA6P转变成F6P，或者至少有助于此转变步骤。这对于本发明高度优选的选择方法是一个有益的特征。

关于本发明的一个优选方面，是将内含子插入编码葡糖胺-6-磷酸脱氨基酶的基因，特别是插入它的高度保守区。进行这种修饰作用，是为了使葡糖胺-6-磷酸脱氨基酶对细菌如土壤杆菌细胞壁的有害降解作用减至最小或者消除。因为土壤杆菌是常常选择用于转化植物细胞的载体，可能对于此细菌，而不是植物细胞有必要使葡糖胺-6-磷酸脱氨基酶失活。通过将一个内含子插入编码葡糖胺-6-磷酸脱氨基酶的基因，可实现这种失活作用。特别是通过将一个内含子插入编码葡糖胺-6-磷酸脱氨基酶基因的保守区可达到失活目的。

关于这方面，图4显示来自白色念珠菌(nagl基因)，以及来自大肠杆菌(nagB基因)编码的葡糖胺-6-磷酸脱氨基酶的序列。在我们的研究中，我们选择将内含子插入编码保守氨基酸序列的基因区内，在此情况下的氨基酸序列是VVTFNMDEY。

图5、6和7也图解显示了所采用的克隆程序。

图8、9、10和11是所形成质粒的示意图。

下列样品根据布达佩斯条约于1997年1月10日保藏在认可保藏单位英国的国立工业和海洋微生物保藏有限公司(NCIMB)，它位于23St.Machar Drive，Aberdeen，Scotland，United Kingdom，AB21RY：

1.含有质粒pVictorIV GNG E35S nagB IV2的大肠杆菌DH5α，保藏号是NCIMB 40852。此质粒含有带内含子的nagB基因。

2.含有质粒pVictorIV GNG rbc nagB IV2的大肠杆菌DH5α，保藏号是NCIMB 40853。此质粒含有带内含子的nagB基因。

3.含有质粒pVictorIV GNG nagB的大肠杆菌DH5α，保存号是NCIMB 40854。此质粒含有不带内含子的nagB基因。

因此，本发明高度优选的方面是关于可从这些保藏物得到的本发明的第一核苷酸序列，包括含有这些相同序列或质粒的表达载体，构建物，生物体和转基因生物体。

本发明还包括一种选择手段，它使之能够从未转化的细胞中选择出转化的细胞，其中该选择手段可从每种保藏物得到。

例如，本发明包括一种可从保藏号NCIMB 40854保藏物得到的选择手段。对此，该选择手段(即使它能够从未转化的细胞中选择转化细胞的选择手段)可借助于PCR扩增技术(如将在下提到的)，使用如下的引物从这个保藏物得到：

5′-(B134)(38-mer)

TAAGATCTAAACAACAACATGAGACTGATCCCCCTGAC

3′-(B137)(28-mer)

TCCTCGAGCAGGGATAACAATTACAGAC

通过另一个例子，本发明包括一种使之能够从未转化的细胞中选择转化细胞的选择手段，其中该选择手段从保藏号NCIMB 40852或40853保藏物得到。对此，该选择手段借助于PCR扩增技术(如下面提到的)，使用如下的引物从这个保藏物得到：

引物1(B507)29′MER

TGCAGAGATCTAAACAACAACATGAGACT

引物2(B511)27′MER

CATGCCTCGAGCAGGGATAACAATTAC

下面将仅通过实施例对本发明作进行描述，其中将可能参考下面所附图：

图1是代谢途径示意图；

图2是代谢途径示意图；

图3是代谢途径示意图；

图4显示核苷酸序列的比较；

图5显示某些核苷酸序列；

图6显示某些核苷酸序列；

图7显示一个PCR反应方案的示意图；

图8显示一个质粒的示意图；

图9显示一个质粒的示意图；

图10显示一个质粒的示意图；

图11显示一个质粒的示意图；

图12显示一个质粒的示意图；

图13显示电泳研究的照相结果；

图14显示电泳研究的照相结果；

图15显示电泳研究的照相结果；

图16显示电泳研究的照相结果；

图17显示电泳研究的照相结果；

图18显示电泳研究的照相结果；

图19显示电泳研究的照相结果；

图20显示一个曲线图；

图21显示一个曲线图；

图22显示一个质粒示意图；

图23显示电泳研究的照相结果；

图24显示电泳研究的照相结果；

图25显示一个曲线图；

图26显示电泳研究的照相结果；

图27显示电泳研究的照相结果；

图28显示本发明的三个序列表。

首先应注意到，图28提供了本发明的若干序列，关于这方面，SEQID NO：1是编码葡糖胺-6-磷酸脱氨基酶的nagB基因核苷酸序列。SEQ ID NO：2相当于nagB基因的核苷酸序列，此基因编码葡糖胺-6-磷酸脱氨基酶，但其中特别是在序列中存在一个内含子。SEQ ID NO：2有时被称为nagB IV2。SEQ ID NO：3相当于葡糖胺-6-磷酸脱氨基酶的氨基酸序列，此序列有时被称为nagB。制备构建物

可通过PCR从质粒pUC nagB(Altimano，M.M.et al(1991)BBA1076 266-272)扩增nagB基因的编码区。上游PCR引物包含BglII位点。下游PCR引物包含XhoI位点。用这些酶断开此PCR产物，使之能够定向克隆质粒pPS48(见图22)粘性BamHI和SalI位点之间的扩增片段。形成的构建物位于成对的CaMV 35S启动子和CaMV 35S终止子之间的nagB编码区。

因为35S启动子在大肠杆菌中也是有功能的(Bilang et al.基因100(1991)247-250)，所以可通过nagB-缺陷性变异株IBPCS71CR的互补作用实现对转化体的选择。此菌株具有基因型IBPC 5321nagB2，asnB50：Tn5，recA1，Sn1：Tn10。选择可在含有作为可发酵碳源的N-乙酰葡糖胺的平板上进行。扩增nagB编码区

引物：

5′-(B134)(38-mer)

TA AGATCTAAACAACAACA TGAGACTGATCCCCCTGAC

BglII位点被显示为加底线的字体，以粗线字体显示出植物序列的上游区，起始密码子被显示为斜体字母。

3′-(B137)(28-mer)

AC CTCGAGCAGGGATAACAATTACAGAC

XhoI位点被显示为加底线的字体，以粗线字体显示终止密码子。

二个引物都以“三苯甲基-ON”(“trityl-ON”)法合成，并在C.O.P柱上按照厂商(Cruachem Ltd，Glasgow，UK-Brochuremarked USIN-001-RO2)的说明进行纯化，不同的是步骤12以如下步骤代替：将样品对Pharmacia NAP5柱加样，并以500μl等份量水逐步洗脱，收集各500μl等份量水，并作OD₂₆₀测定，以便定位寡核苷酸。扩增反应混合物

10μl无Mg的Amplitaq 10×缓冲液

8μl 25mM MgCl₂

77μl水

0.5μl pUC nagB质粒小量制备物

0.7μl 5′- (B134)

0.91μl 3′-(B137)

2μl dNTP混合物(各为2.5mM)

0.5μl Amplitaq

同时进行以水校准至相同体积的单个引物的对照扩增。扩增反应的条件

循环	模块1	模块2	模块3
循环	模块1	模块2	模块3	1	94℃-5mins	94℃-5mins	94℃-5mins
2-29	94℃-1.5mins	94℃-1.5mins	94℃-1.5mins	1	94℃-5mins	94℃-5mins	94℃-5mins
	94℃-1.5mins	94℃-1.5mins	94℃-1.5mins	50℃-2mins	55℃-2mins	60℃-2mins
	72℃-2mins	72℃-2mins	72℃-2mins	50℃-2mins	55℃-2mins	60℃-2mins
	72℃-2mins	72℃-2mins	72℃-2mins	30	94℃-1.5mins	94℃-1.5mins	94℃-5mins
50℃-2mins	55℃-2mins	60℃-2mins			94℃-1.5mins	94℃-1.5mins	94℃-5mins
50℃-2mins	55℃-2mins	60℃-2mins	72℃-10mins		72℃-10mins	72℃-10mins
31	4℃-至收集	4℃-至收集	72℃-10mins		72℃-10mins	72℃-10mins	4℃-至收集

PCR进行过夜。然后将5μl每种PCR反应混合物与等体积TE(tris-EDTA)pH7.5以及2μl凝胶加样液混合。将总共12μl的每种混合液对在1/2 TBE中的1.2％w/v琼脂糖凝胶加样，在35V下电泳2小时。在样品两旁加入4μl Boehringer分子量标志物III和VI。

在所有3个退火温度下，反应混合物中的产物很好地符合于预测的839个碱基对的大小。仅含3′-引物的对照产生了大约950个碱基对的伪迹带，它在60℃退火温度下非常弱，并且没有双引物(5′3′)反应(见图23)。

然后进行50μl的50℃退火温度双引物(5′3′)反应，并采用如下方案，借助于基因纯化剂(Gene Clean II^TM)(Bio 101 Inc供应)纯化PCR产物。

加入150μl NaI混合液之后，随后加入15μl玻璃容器牛乳。搅拌此混合液，在冰浴上放置5分钟，然后在Ole Dich冷冻离心机内(4℃)，以最大速度离心20秒钟，通过再悬浮于400μl冰冷的New Wash^TM液(Bio 101 Inc供应)中并反复离心，洗沉淀3次。最后将沉淀再悬浮于15μl TE pH7.5中，50℃温育3分钟，然后在Eppendorf离心机中室温下离心1分钟。收集上清液，再以15μl TE pH7.5洗沉淀，并再次离心。得到的上清液同第一次上清液合并，总体积为35μl。

然后在如下反应混合物中37℃作用18小时，使基因-纯化的PCR产物断开。

35μl基因纯化的PCR产物，

5μl 10×Boehringer缓冲液H，

5μl XhI 10U/μl，

5μl BglII 10U/μl，

按如下方式用SalI和BamHI顺序酶切pPS48的制备物。

将下面列出的反应混合物在37℃温育4小时。

5μl pPS48

5μl 10×Boehringer缓冲液H，

35μl水，

5μl SalI 50U/μl，

应用上述基因纯化方案纯化来自此混合物的DNA。使SalI酶切的质粒最后体积为30μl TE pH7.5。

然后将如下反应混合物在37℃温育4小时。

30μl SalI-酶切的pPS48

5μl 10×Boehringer 10×缓冲液B，

10μl水，

5μl Bam HI 50U/μl。

对SalI/BamHI-酶切的pPS48和XhoI/BglII-酶切的PCR产物各加入10μl凝胶加样液(各为50μl)。将此混合物对在IX TAE(三乙酸和EDTA)中的1.2％w/v琼糖凝胶加样，同时以20μl Boehringer分子量标记物III平行加样。在35V下电泳1小时。结果显示在图24中。

切取相当于SalI/BamHI-酶切的pPS48(B600bp)和XhoI/BglII-酶切的PCR产物(839bp)的凝胶带，并在预先称重的Eppendorf小试管内称重。

设定将密度1g/cm³的3体积NaI溶液加到每个切取的凝胶带中。并将此样品在50℃加热5分钟。涡旋混合此小试管，返回至50℃再加热5分钟。各加入15μl玻璃容器牛乳(glass milk)，振荡搅拌此悬液，置冰浴上5分钟。使此玻璃容器牛乳沉淀，用400μl“新洗液”洗3次，如在上述基因纯化方案中进行的。应用纯化的片断，将如下连接混合物在16℃温育20小时。

6μl XhoI/BglII-酶切的PCR产物

5μl SalI/BamHI-酶切的pPS48

4μl 5× BRL连接缓冲液

4μl水

1μl T₄连接酶(BRL)

应用低盐培养基(1％胰蛋白胨，0.5％酵母膏，0.5％NaCl)，形成在LB TET中的5ml大肠杆菌 IBPC57ICR培养物。

按如下制备电转化感受态大肠杆菌细胞(葡糖胺脱氨基酶缺陷的)IBPC 571CR株(IBPC 571CR＝IBPC 5321 nagB2，asnB50：Tn5，recA1，Sal：Tn10)。

1.在此5ml过夜的培养物中取2ml用于接种500ml低盐LB TET培养基(1％胰蛋白胨，0.5％酵母膏，0.5％NaCl，10μg/ml四环素-不调pH)，此培养基先预热至37℃，置于2.5L Erlenmeyer摇瓶中，在有轨摇床上以250rpm的速度振摇。同时采样作平行培养，以便对生长过程作图。将二组培养物返回至37℃摇床。

2.制作生长曲线(见图25)，用于预测A600达到0.5的时间。在此时间立即将培养物置于冰/水融浆中，并在冷室中(4℃)内放置30分钟。

3.将此培养物等分至二个无菌的500ml Beckman离心瓶中，在JA10转子中4℃以5000rpm转速离心15分钟。

4。将此沉淀再悬浮于总量500ml的冷(4℃)无菌水中，等分于二个离心瓶中，然后同步骤3离心。

5.将沉淀再悬浮于300ml无菌冷水中(4℃)，等分于二个离心瓶中，按步骤3再次重复离心。

6.将细胞再悬浮于10ml无菌冷(4℃)的10％v/s甘油中，等分于2个可速盖(snap-capped)的Falcon小试管中，在Sorvall SM24转子中，以6000rpm转速4℃离心15分钟。

7.将此沉淀再悬浮于总量1ml无菌的冷(4℃)10％v/v甘油中。

取样同上述连接混合物一起进行电穿孔，剩余部分以205μl的等分量置于nunc低温小试管中，在液氮中冷冻。

电转化

1.在冷却的电穿孔小杯内，将1μl连接混合物同40μl冷无菌水和40μl电转化感受态IBPC 571CR混合，在冰浴上放置1分钟。

2.将Biorad基因脉冲发生仪设定在25μF，2.48kV，200W。

3.对步骤1的小杯仔细擦拭，擦去电极表面接触面的水份，然后置于仪器内。

4.使样品受脉冲作用(4.5ms)，立即取出小杯，尽可能快地加入1ml SOC。

5.将小杯中的内含物转移至速盖的Falcon小试管内，在设定为250rpm的有轨摇床上37℃温育1小时。

6.将步骤5中Falcon小试管的内含物转移至epperdorf小试管内，13000g离心30秒。除去上清液，将沉淀再悬浮于1ml无菌水中。

7.将步骤6中的细菌悬液按如下量散布在Mcconkey基本琼脂板(Difco)上，此琼脂内含有1％w/v N-乙酰葡糖胺，以及10μg/ml四环素，50μg/ml氨卡青霉素。

100μl未稀释的

50μl转化的细胞悬液+50μl水

10μl转化的细胞悬液+90μl水

将此琼脂板在37℃温育22小时。

在未稀释的接种板上挑出二个阳性菌落，涂布在含有1％w/v N-乙酰葡糖胺，10μg/ml四环素和50μg/ml氨卡青霉素的新McConkey基本琼脂板(Difco)上。将此琼脂板在37℃温育22小时。将从继代培养分离出的菌落用于接种在TB 10μg/ml四环素，100μg/ml氨苄青霉素中的5ml培养物，在有轨摇床上以250rpm速度震摇，37℃温育16小时。

然后收获此全部培养物，应用Qiagen spin柱按照厂商(Qiagen)的说明制备质粒小制备物。

配制如下诊断限制酶切消化物，用于二种质粒小制备物。

1μl 10×Boehringer缓冲液H

5μl水

3μl质粒制备物

1μl PstI 10U/μl

1μl 10×Boehringer缓冲液B

5μl水

3μl质粒制备物

1μl HindIII 50U/μl

1μl 10×Boehringer缓冲液M

5μl水

3μl质粒制备物

1μl SphI 10U/μl

将上面所有的反应混合物在37℃温育2小时。各加入2μl凝胶加样液，全部量对1％w/v琼脂糖凝胶加样，二侧用Boehringer分子量标记物III和IV加样。在1/2 TBE缓冲液中，35V电泳2小时。结果显示在图26中。

小量制备物A和B都显示出相同的限制性酶切模式，与pPS4的35S表达盒内nagB编码区的连接方式相一致。

PstI消化酶切pPS48的MCS(多克隆位点)，并且是在nagB编码区中的634bp位置。5′PCR引物的上游非编码区，以及同nagB编码区一起的pPS48的MCS一部分构成658bp的PstI片段。

HindIII消化切开了整个表达盒，此表达盒具有970bp，没有任何插入片段，并且掺入nagB PCR产物(840bp)时，可观察到相同大小的片段-810bp。而且，其它的2.65kb带与来自pPS48的1810bp切割片断一致。

SphI在pPS48的MCS中切开一个唯一的位点，形成4.45kb的完整线性结构，这与将整个nagB PCR产物克隆进入pPS48相符合。值得注意的是，模糊带的出现，是指示裂解消化不完全，在未酶切的质粒电泳带也有这种表现。

将如下反应混合物在37℃温育6小时，然后置于4℃。

15μl pPS48 nagB小制备物A

1μl水

2μl Boehringer 10×缓冲液B

2μl HindIII 50U/μl

将pPS48 nagB的Hind III限制性消化物同4μl凝胶加样液混合，在1％琼脂糖凝胶中同20μl Boehringer分子量标记物III一起平行电泳，在TAE缓冲液中35V电泳1小时。结果显示在图27中。从凝胶中切取1810bp的HindIII片段，用基因纯化剂II(gene cleanII)，采用上面提到的方案进行纯化。

然后将此纯化的片断连接进入一种植物转化载体(将在后面论述)。

将来自pPS nagB的1810bp的HindIII片断连接进入pVictor IVGNG中，此片断含有nagB的编码区，二侧为35S表达盒。形成的质粒-pVictor IV GNG nagB-显示在图12中。

此构建物被用于转化根瘤土壤杆菌。发现此转化体在琼脂板上比液体培养时生长好得多。通过对适当的对照转化体进行比较，认为这可直接归因于nagB基因的存在。

很可能根瘤土壤杆菌对pVictor IV GNG nagB存在敏感的模式，是由于提高了细菌细胞壁的更新周转，使得细菌对液体培养基的低渗透压敏感。因此，本发明的一个优选的方面是防止细菌转化体中nagB的逆表达，而在它被整合进入植物基因组之后，允许这种表达发生。

所采用的策略是基于曾用于防止根瘤土壤杆菌中组织化学标记基因表达β-葡糖醛酸酶(uidA)的方法，通过将IV2内含子插入该基因的编码区(Vancannegt，C et al(1990)分子基因遗传220：245-250)。已知此内含子是从我们的目标植物，包括瓜尔豆和马铃薯中的uidA构建物中剪接出。将IV2内含子剪接进入nagB的位点，选择在MET70和ASP71的密码子之间，位于包含有VAL VAL THR PHE ASNMET ASP GLU TYR的高度保守区内(Natarajan and DatteAssis(1993)268pp9206-9241)。此剪接点与植物内含子的共有序列一致(Shapiro，M.B & Senapathy.P(1987)NAR 15 7155-7174)。所选择的将IV2内含子插入nagB的方法是SOE(通过重叠延伸剪接的)PCR。应用“OLIGO4”程序(National Biosciences Inc)设计了引物和反应条件。PCR引物

使用了如下引物：

引物1(B507)29′MER

TGCAGAGATCT AAACAACAACAATGAGACT在此BglII位点以粗线型字体显示，以加底线字体显示植物下游共有序列，起始密码子以斜体字显示。

引物2(B506)34′MER

TAGAAGCAGAAACTTACC ATGTTGAAGGTGACAA在此以粗线字体显示IV2内含子，以斜体字显示nagB序列，加底线的部分表示MET70。

引物3(B508)34′MER

TTGTCACCTTCAAC ATGGTAAGTTTCTGCTTCTA在此以粗线字体显示IV2内含子，以斜体字显示nagB序列，加底线的部分表示MET70。

引物4(B509)34′MER

AGACCGAC ATATTCGTCCTCCACATCAACAAATT在此以粗线字体显示IV2内含子，以斜体字显示nagB序列，加底线的部分表示TYR73 GLU72 ASP71。

引物5(B510)34′MER

AATTTGTTGATGTGCAG GACGAATATGTCGGTCT在此以粗线字体显示IV2内含子，以斜体字显示nagB序列，加底线的部分表示ASP71 GLU72 TYR73。

引物6(B511)27′MER

CATGCCTCGAGCAGGGATAACAA TTAC在此以斜体字显示nagB3′非翻译区，终止密码子加底线表示，以粗线字体显示XhoI位点。

应用“三苯甲基-ON”法合成了所有上述的寡核苷酸引物，并在“C.O.P”柱上纯化(见前面)。

通过PCR合成了如下三个待剪接的区段。区段1

通过扩增nagB的编码区NT1-234产生，在5′末端附加了整套上游区和BglII位点，在3′末端附加了IV2内含子的NT1-17的重叠部分(反应1)。区段2

通过扩增IV2内含子(189BP)产生，在5′末端附加了nagB的编码区NT218-234的重叠部分，在3′末端附加了nagB编码区的NT 235-251的另一个重叠部分(反应2)。区段3

通过扩增nagB的编码区和终止密码子的NT235-801产生，在5′末端附加了与IV2的NT 172-189的重叠部分，在3′末端附加了Xho I位点(反应3)。反应1：

73/69/65μl水

4/8/12μl MgCl₂ 25mM

0.5μl pPS48 nagB

5μl引物1(B507)4 pmole/μl

5μl引物2(B506)4 pmole/μl

2μl dNTP混合物(各2.5mM)

0.5μl Amplitaq反应2：

73/69/65μl水

4/812μl MgCl₁ 25mM

0.5μl pUC.GUS.内含子

5μl引物3(B508)

5μl引物4(B509)

2μl dNTP混合物(各2.5mM)

0.5μl Amplitaq反应3：

73/69/65μl水

4/8/12μl MgCl₂ 25nM

0.5μl pPS48 nagB

5μl(B510)引物5

5μl引物6(B511)

2μl dNTP混合物(各2.5nM)

0.5μl Amplitaq温度程序

循环	反应1和3	反应2
循环	反应1和3	反应2	1	94℃-5mins	94℃-5mins
2-29	94℃-1.5mins	94℃-1.5mins	1	94℃-5mins	94℃-5mins
	94℃-1.5mins	94℃-1.5mins	58℃-1mins	50℃-1mins
	72℃-2mins	72℃-2mins	58℃-1mins	50℃-1mins
	72℃-2mins	72℃-2mins	30	94℃-1.5mins	94℃-1.5mins
58℃-1mins	50℃-1mins			94℃-1.5mins	94℃-1.5mins
58℃-1mins	50℃-1mins	72℃-10mins		72℃-10mins
31	4℃-至收集	72℃-10mins		72℃-10mins	4℃-至收集

上面的反应都进行过夜。

通过如下方法对PCR反应物进行分析，将每种反应混合物2μl加到8μl水中，并加入2μl凝胶加样缓冲液(0.25％溴酚兰/0.25％二甲苯基胺FF/30％甘油·水溶液)，使整个样品混合液电泳通过在TAE缓冲液中的2％w/v琼脂糖凝胶，35V电泳约2小时。样品与BoehringerDNA分子量标记物VI平行电泳。结果显示在图13中。图14显示相同样品的制备性电泳凝胶，也指示切割电泳带的位置。

各种产物在凝胶中的迁移同预计的分子大小非常相符合(反应1：251bp，反应2：223bp，反应3：628bp)。

将在2mM MgCl₂下进行的每种反应的样品50μl，加到10μl凝胶加样缓冲液中，通过在2％w/v琼脂糖凝胶中电泳进行分析，在TAE缓冲液中，35V电泳约2小时。

切取各电泳带，通过如下步骤提取DNA：将此凝胶切片置于Eppendorf小试管中，在液氮中冷冻，再在37℃融化5分钟，然后置于Millipore Ultrafree MC过滤小管中，13000g离心5分钟，从凝胶中离心出缓冲液。然后，用1/10体积的乙酸盐和2体积的冰冷的乙醇(96％)，从滤出液中沉淀出DNA，随之以13000g离心5分钟。用冰冷的70％v/v乙醇洗沉淀的DNA，干燥后再重悬于10μl TE中。

为了核实PCR后所观察到的电泳带不是人工假象，进行了一组单一引物对照反应。

通过如下步骤将这些单一引物对照反应与引物对反应进行比较：各取2μl样品，将它们加到8μl水和2μl缓冲液中，全量样品液电泳通过在TAE缓冲液中的2％w/v琼脂糖凝胶，35V电泳约2小时。

此项研究的结果显示在图15中。

如图15中所示，在单一引物对照中，未呈现出任何人工假象电泳带。

应用如下PCR反应混合物实现了将片断1和片断2拼接在一起：

51μl水

8μl MgCl₂ 25mM

10μl不含Mg的Amplitaq 10×缓冲液

1μl片断1

8μl片断2

5μl引物1(B507)4pmoles/μl

5μl引物4(B509)4pmoles/μl

2μl dNTP混合物(各2.5mM)

0.5μl Amplitaq缓冲液(Perkin Elmer)应用如下温度程序使拼接反应进行过夜。

循环	剪接反应(片断1和2)
循环	剪接反应(片断1和2)	1	94℃-5mins
2-29	94℃-1.5mins	1	94℃-5mins
	94℃-1.5mins	54℃-1mins
	72℃-2mins	54℃-1mins
	72℃-2mins	30	94℃-1.5mins
54℃-1mins			94℃-1.5mins
54℃-1mins	72℃-10mins
31	72℃-10mins		4℃-直至收集

为了提供较多的产物供将来使用，反复平行进行了反应2。

将每个PCR反应的6μl样品加到24μl水和6μl凝胶加样缓冲液(Amplitaq缓冲液，由Perkin Elmer供应)中，将全量的每种混合物对在TAE缓冲液中的2％v/v琼脂糖凝胶加样，在35V下电泳约2小时。结果显示在图16中。

拼接产物的迁移率同预计的大小440bp非常符合。将片断1和2拼接产物的2×50μl样品进行电泳，以同前述相同的方式从产物电泳带中提取了DNA。结果显示在图17中。

应用如下的PCR反应混合物，实现了使融合的片断1和2同片断3拼接：

67μl水

10μl无Mg的Amplitaq 10×缓冲液，

8μl MgCl₂ 25mM

1μl融合的片断1和2

2μl片断3

5μl引物1(B507)4pmoles/μl

5μl引物6(B511)4pmoles/μl

2μl dNTP混合物(各2.5mM)

0.5μl Amplitaq缓冲液

应用如下的温度程序使拼接反应进行过夜。

循环	较低的退火温度	较高的退火温度
循环	较低的退火温度	较高的退火温度	1	94℃-5mins	94℃-5mins
2-29	94℃-1.5mins	94℃-1.5mins	1	94℃-5mins	94℃-5mins
	94℃-1.5mins	94℃-1.5mins	56℃-1mins	60℃-1mins
	72℃-2mins	72℃-2mins	56℃-1mins	60℃-1mins
	72℃-2mins	72℃-2mins	30	94℃-1.5mins	94℃-1.5mins
56℃-1mins	60℃-1mins			94℃-1.5mins	94℃-1.5mins
56℃-1mins	60℃-1mins	72℃-10mins		72℃-10mins
31	4℃-直至收集	72℃-10mins		72℃-10mins	4℃-直至收集

还在较低退火温度下进行了仅有引物1或仅有引物6的单一引物对照反应。

以同上述相同的方式，通过电泳对PCR反应进行了分析。结果显示在图18中。

此拼接反应在凝胶上产生了显著的电泳带，它相当好地符合于预计的分子大小1034bp。引物6的单一引物对照反应也产生一个产物，但是比此产物稍大，而引物5的单一引物对照反应产生了小得多的产物。有趣的是，60℃的较高退火温度没有减少电泳背景带，相反增加了。

以前述用于纯化区段1、2和3的相同方式，通过电泳分离了融合的片断1和2与片断3的拼接产物。从凝胶上切取电泳带，用基因纯化剂II(gene cleanII)进行纯化。

并作了进一步的电泳分离，结果显示在图19中。克隆和测序

将从nagB扩增的PCR产物，以及其中已拼接了IV2内含子的nagB，克隆进入已附着了T-突出物(T-overhangs)的pT7Blue(Novagen)的EcorRV位点。在已涂布有50μl X-gal(20mg/ml二甲基亚砜)，并使之在无菌层流台上干燥了的含有50mg/ml氨苄青霉素的LB平板上，进行了重组体的兰/白选择。通过以EcoRV/XbaI和PstI消化的双消化产物，对白色菌落的小量制备物进行了检测。然后应用Ouiagen(Quiagen)制备重组质粒的大批量制备物，并将此DNA用于测序。热测序

用如下引物(Pharmacia)进行了热测序。

5′荧光素-d〔CAG CGT TGT AAA ACG ACG GCC AGT〕-3′

5′荧光素-d〔CAG GAA ACA GCT ATG AC〕-3′所用的试剂除了热稳定聚合酶，热测序酶(Amershem LifeScience)之外，其余都来自Autoread 1000测序试剂盒(Pharmacia)。

吸取0.5-1μg质粒DNA置于21μl水中。按如下配制反应混合物：

荧光标记物(1-2pmol) 1μl

质粒DNA 5μl

A，C，G或T试剂 2μl

先将样品加热至95℃，然后立即按如下温度程序进行25个循环：

95℃ 30s

60℃ 30s用Autoread 100测序试剂盒(Pharmacia)测序

为了应用Autoread 100测序试剂盒(Pharmacia)测序，合成了如下与nagB核苷酸序列互补的引物。

206-222 GCTTTAAGCACGTTGTC

225-209(rev) GGTGACAACGTGCTTAA

719-703(rev) TTTGCGACGCGAGTGTC

431-415(rev) TATTCGTCCTGCACATC

将质粒模板的浓度调整至大约20μg/μl。在如下反应混合物中进行引物退火。

模板DNA 10μl

质粒(1-2pmol) 2μl

退火缓冲液 2μl

无菌水 1μl

将此退火混合物涡旋混合，粗略地离心，并在65℃温育10分钟。使此反应物冷却至室温，放置45分钟以上，然后粗略地离心。

每个退火温度加入2μl荧光-dATP标记试剂。各加入2μl稀释的T7 DNA聚合酶(4U/μl)，并将此反应物在37℃温育10分钟。在此引物标记反应之后，使混合物保持在37℃，同时加入1μl延伸缓冲液和3.5μl二甲基亚砜。将5.4μl每种引物标记反应混合物立即加到3μl每种核苷酸混合物(A，C，G和T)中，37℃再温育5分钟。加入5μl终止液使反应停止。电泳

应用Pharmacia ALF自动测序仪对二种类型的测序反应物进行电泳。先将样品加热至90℃维持2分钟，然后以8μl小份量对测序凝胶加样。将nagB构建物连接进入植物表达盒，并克隆进入植物转化载体

通过测序证实pT7Blue中nagB的克隆，以及含有IV2内含子的nagB具有正确的核苷酸序列。它们作为BglII/XhoI片断从pT7Blue中被切取，并被直接克隆进入Bam HI/SalI酶切的pPS48的CaMV 35S表达盒(见图8)。以同样的方式，将已拼接了IV2内含子至其中的magB构建物也克隆于pDB22的rubisco小亚单位启动子和胭脂碱合成酶终止子之间(见图9)。从pPS48和pDB22中作为HindIII片段切取以此方式连接进入表达盒的nagB构建物，连带相邻的启动子和终止子，并连接进入pVictor IV GNG的唯一HindIII位点。

含有nagB编码区的质粒，此编码区已拼接了IV2内含子，并且此编码区被连接进入CaMV 35S表达盒，这种质粒被定名称为pVictor IVGNG E35S nagB IV2(见图10)。

含有nagB编码区的质粒，此编码区内已拼接了IV2内含子，并且此编码区被连接进入rubisco小亚单位启动子/胭脂碱合成酶表达盒内，这种质粒被称为pVictor IV GNG rbc magB IV2(见图11)。

所形成的质粒含有在CaMV 35S表达盒内的未修饰的nagB编码区，此质粒被称为pVictor IV GNG E35S nagB(见图12)。毒性研究

剂量-反应曲线

为了确定葡糖胺对瓜尔豆外植体的毒性，用非转基因瓜尔豆子叶作外植体，制作了0-5.0g/l范围内随葡糖胺浓度改变的剂量-反应曲线。用对外植体上幼苗形成的影响测定葡糖胺的毒性(图20)。

按如下获得瓜尔豆外植体。在每100ml溶液加入了二滴Tween 80的2.5％次氯酸钠溶液中，在pH7.0对瓜尔豆种子作无菌处理。在此溶液中搅拌种子25分钟，然后以无菌水洗5次。将种子接种在发芽培养基上(4.43g/l MSMO(Sigma M6899)，20g/l蔗糖，8.0g/l琼脂，用KOH校准pH至5.8)，以12小时白天和12小时黑夜的方式置于25℃11-13天。

从籽苗切取包括约2mm下胚轴的子叶，用作此实验的外植体，以及用于转化实验。将此子叶置于含有不同浓度葡糖胺的选择培养基上。选择培养基：

3.2g/l Gamborg B5(Sigma G5893)

20g/l蔗糖

1.0mg/l苄氨基嘌呤

0.05mg/l赤霉酸(GA3)

1.0μM硫代硫酸银

1.0mg/l NiCl₂·6H₂O

0.5mg/l2-(对-氯苯氧基)-2-甲基丙酸

30mg/l头孢氨噻

30mg/l青霉烷砜(Betamaze)

0-5g/l D-葡糖胺·HCl(根据不同实验)

pH5.7

三周之后，测定在不同葡糖胺含量的培养基上外植体形成幼苗的百分数，结果显示在图20中。

影响葡糖胺毒性的因素

为了能找到合适的选择条件，对影响葡糖胺毒性的某些因素进行了研究。

首先对选择培养基中不同浓度(5-40g/l)的蔗糖进行了测定。显示在图21中的结果表明，较高浓度的蔗糖可降低葡糖胺对被研究植物细胞的毒性作用。预计其它糖类如葡萄糖、果糖、麦芽糖、甘露糖等也可能影响葡糖胺的作用。

其次，在有葡糖胺存在时(3.0g/l)，测定了选择培养基中GemborgB5盐浓度的作用。我们研究了这种盐用于降低培养基中碳素含量的用途。结果如下：

选择培养基中Gamborg B5盐浓度(g/l)	瓜尔豆外植体上幼苗形成(％)
选择培养基中Gamborg B5盐浓度(g/l)	瓜尔豆外植体上幼苗形成(％)	3.2	17.4
2.4	9.1	3.2	17.4
2.4	9.1	1.6	6.2

可以注意到，选择培养基中Gamborg B5盐减少50％，在没有葡糖胺存在时对幼苗形成没有显著的影响。

因此，可能改变选择培养基将影响葡糖胺的作用并因此影响应用葡糖胺选择的转化实验结果。转化研究

如下实施例证明，可用大肠杆菌nagB基因作为对转化细胞如转基因瓜尔豆(Cyamopsis teragonoloba)幼苗，在含有葡糖胺作为选择剂的培养基中提供选择的手段。

转基因瓜尔豆植株：

按照Joersbo and Okkels(PCT/DK95/00221)的方法，用包含有图10中所示质粒的根瘤土壤杆菌LBA 4404，实施了对瓜尔豆子叶外植体的转化。

用上述含有不同浓度葡糖胺，蔗糖和Gamborg B5盐的选择培养基完成了转基因幼苗的选择。四周之后，收获这些幼苗，将所有的外植体转移至新鲜的选择培养基中(相同成分)，经过另外四周选择之后，收获最后的幼苗。

收获之后，用组织化学测定法(Jefferson et al.1987，EMBO J6：3901-3907)分析这些幼苗的β-葡糖醛酸酶(GUS)活性。下表中给出了GUS-阳性幼苗的数目。

蔗糖(g/l)	葡糖胺(g/l)	B5-盐(g/l)	GUS-阳性幼苗的数目
蔗糖(g/l)	葡糖胺(g/l)	B5-盐(g/l)	GUS-阳性幼苗的数目	10	2.5	3.2	2
20	2.5	2.4	1	10	2.5	3.2	2
20	2.5	2.4	1	20	3.0	2.4	1

这样，在具有不同含量葡糖胺，蔗糖和Gamborg B5盐的选择培养基上，获得了转基因幼苗，表明该选择培养基可以有显著的改变，而仍然对选择转基因幼苗有效。

转基因马铃薯植株：

在我们的共同未决专利申请PCT/EP96/03053，PCT/EP96/03052和PCT/EP94/01082(每个专利的内容在此匀被引入作为参考)中，可找到关于马铃薯转化的一般技术。

对于本项研究，采用了如下方案。

质粒构建物：

在含有100mg/l利福平和500mg/l硫酸链霉素的YMB琼脂(K₂HPO₄·3H₂O 660mg/l，MgSO₄ 200mg/l，NaCl 100mg/l，甘露醇10g/l，酵母膏400mg/l，0.8％w/v琼脂，pH7.0)上，培养包含有辅助病毒质粒pRAL 4404(Hoekma et al，1983自然303pp179-180)的解除了防御的根瘤土壤杆菌LBA 4404株。应用Holter etal(1978分子基因遗传学163：181-187)的冻-融法，实现了以pVICTOR IV GNG E35S nagB IV2或pVICTOR IV GNG rbcnagB IV2或pVICTOR IV GNG E35S nagB的转化作用，并在含有100mg/l利福平和500mg/l链霉素和50mg/l硫酸庆大霉素的YMB琼脂上对转化体进行了选择。按同样方式实施了以缺少nagB基因的对照构建物的转化作用。

对植株的转化：

将马铃薯(Solamm tuberosum cv Saturna)的幼苗培养物保存在LS琼脂上，此LS琼脂含有Murashige Skoog碱性盐(SigmaM6899)(Murashige and Skoog，1965，植物生理学15，473-497)，并含有硫代硫酸银以及Linsmaier and Skoog(1965植物生理学18，100-127)所述的营养物和维生素。将培养物保持在25℃，每日给予16小时光照。大约40天之后进行继代培养，在此期间将幼苗切成了约8mm长的单节分割小段。

将成熟大约40天的幼苗培养物(高5-6cm)切割成8mm节间分割小段，并且/或者切取叶片，通过在小叶片上作2-4个小切口形成创伤。然后将这些幼苗材料置于内含根瘤土壤杆菌的液体LS-培养基中，此土壤杆菌已用pVICTOR IV GNG E35S nagB IV₂或pVICTOR IV GNG rbc nagB IV2或pVICTOR IV GNGE35S nagB转化了(A₆₆₀＝0.5，光径长度1cm)。在室温下培育30分钟后，将这些分割段在无菌滤纸上吸干，然后转移至含有2mg/l 2，4-D和500mg/l反式-玉米素的LS琼脂(0.8％w/v)中。以用LS培养基浸湿的滤纸覆盖这些外植体，并在25℃以布覆盖3天。这样处理之后，可用含有800mg/l羧苄青霉素的液体LS培养基洗这些分割小段，然后转移到含有1mg/l反式-玉米素，100mg/l赤霉酸(GA3)，以及蔗糖(例如7.5g/l)的LS琼脂(0.8％w/v)上。此琼脂还可任选地含有葡糖胺(例如2.5g/l)。将这些分割小段在新鲜基质内每3-4周传代。在3-4周内分割小段发育成幼苗，使新幼苗形成持续3-4个月。

使再生的幼苗保持生长在由LS-基质，0.002mM STS(Silthiosulfet)和琼脂(8g/l)组成的基质上。如果需要可加入羧苄青霉素(800mg/l)。

按照Hodal.L.et al(Pl.Sci.(1992)，87：115-122)的方法，通过对共导入的β-葡糖醛酸酶基因进行GUS测定，可对此转基因植物进行鉴定。

另一种选择是，按照Wang et al(1993，NAR21，pp4153-4154)的方法，通过进行NPT II测定(Radke，S.E.et al，理论和实用遗传学(1988)，75：685-694)或者通过进行根据Wang et al(1993，NAR 21，pp4153-4154)的PCR分析，可鉴定此再生幼苗的转基因基因型。

将此幼苗(高度约2-3cm)从生根基质移植至土壤中，置于生长培养室内(21℃，16小时光照200-400uE/m²/sec)。当植株良好地形成后，将它们移到温室内，在此使它们生长直至块茎已形成，植株上部正开始衰老。收获

约3-6个月之后收获马铃薯，然后进行分析。

通过对其基质加入葡糖胺可以区分转化的幼苗和未转化的幼苗。收获幼苗之后，可通过对幼苗培养基加入高浓度葡糖胺来选择转化的幼苗。转化的幼苗具有利用葡糖胺的能力而能存活。对转化体的分析

为了证实nagB的整合作用，可按照Dellaporta et al(1983植物分子生物学报导1，19-21)的方法分离基因组DNA，然后将此DNA样品用EcoRI消化，在0.8％w/v琼脂糖凝胶中经受电泳，然后通过DNA印迹法(Southern，1975，分子生物学杂志98，503-517)转移至Hybond N+膜(Amershem)。依照Feinberg和Vogelsteim(1983分析生物化学137：266-267)的方法，可将nagB编码区的探针用作随机引发的³²p-标记探针合成的模板，并可在高严格条件(65℃，0.1×SSC)下同DNA印迹杂交。

使用含有7.5g/l蔗糖的培养基的结果被显示在下面的表中。

葡糖胺(g/l)	NH₄/NO₃(g/l)	每个外植体转化的面积数	转基因幼苗数	转化率(％)(转基因幼苗数/起始外植体数)
葡糖胺(g/l)	NH₄/NO₃(g/l)	每个外植体转化的面积数	转基因幼苗数	转化率(％)(转基因幼苗数/起始外植体数)	2	1650	0	0	0
2	1298	0.025	0	0	2	1650	0	0	0
2	1298	0.025	0	0	2.5	1650	0	0	0
2.5	1189	0	0	0	2.5	1650	0	0	0
2.5	1189	0	0	0	3	1650	0	0	0
3	1093	0	0	0	3	1650	0	0	0
3	1093	0	0	0	0	1650	1.08	3	7.5
0	1298	2.73	6	15	0	1650	1.08	3	7.5
0	1298	2.73	6	15	0	1189	2.50	12	30
0	1093	1.40	12	30	0	1189	2.50	12	30

葡糖胺(g/l)	每个外植体转化的面积数	转基因幼苗数	转化率(转基因幼苗数/起始外植体数)
葡糖胺(g/l)	每个外植体转化的面积数	转基因幼苗数	转化率(转基因幼苗数/起始外植体数)	0	5.4	12	24
1	3.8	1	2	0	5.4	12	24
1	3.8	1	2	2.5	0	0	0
5	0	0	0	2.5	0	0	0
5	0	0	0	7.5	0	0	0
10	0	0	0	7.5	0	0	0

结果表明，nagB基因为转化的马铃薯细胞提供了一个选择系统。

此外，随后的研究还表明，可将转化的马铃薯暴露于含有葡糖胺的培养基，以便确保对它的选择。

结果还表明，在某些情况下，降低NH₄NO₃的含量可使葡糖胺减少毒性。但是，当降低NH₄NO₃的浓度时，对于转化过程插入基因的效率增加了。转基因玉米植株

引言

自从1983年首次公布转基因植物产生以来(Leemans，1993，生物技术学11.s22)，已经有许多转基因植物产生的报导，特别是包括双子叶农作物。

直到最近都只有非常少量关于成功地产生转基因单子叶农作物的报导。在单子叶植物中的这种相对缓慢的发展是由于二种原因。首先直到80年代初，都已证明从培养的单子叶植物细胞和组织有效地再生植株是非常困难的。最后通过从未成熟的和胚发生组织培养外值体解决了这个问题，这种外植体在含有植物生长调节剂的营养培养基上可保持它们的形态发生潜能，第二，单子叶植物不是根瘤土壤杆菌的天然宿主，这意味着在双子叶植物中用它们的天然载体根瘤土壤杆菌成功发展的技术，对于单子叶植物多年来都不成功。

尽管如此，应用如下方法现在已可能成功地转化和产生可育的转基因玉米植株，如(1)碳化硅搅拌器(Silico Carbide Whiskers)，(2)微粒轰击，(3)通过PEG处理的原生质体摄取DNA，或(4)DNA摄入电穿孔的组织。这些方法的每一种都可能用于产生特别是根据本发明的转基因玉米，Thompson详述了这些方法(1995，Euphtytica 85，pp75-80)。

特别是微粒枪法已成功地用于转化单子叶植物。但是，EP-A-0604662报导了另一种转化单子叶植物的方法。这种方法包括，在去分化过程中或者去分化之后用含有超级双载体的土壤杆菌转化培养的单子叶植物组织，并用潮霉素-抗性基因作为选择手段。通过潮霉素选择产生转基因愈伤组织和植株已得到证实。这种方法可用于产生特别是根据本发明的转基因玉米。

在EP-A-0604662的方法之后，EP-A-0672752报导了关于非去分化的未成熟胚胎法。在此潮霉素-抗性和PPT-抗性均被用作选择手段，其中PPT可导致10％或更多独立的转化植物。此方法可用于产生特别是根据本发明的转基因玉米。

现在，转基因玉米植株似乎可以从容易培养的变异体-如近交系A188成功地产生。关于这方面，可参阅Ishida et al(1996天然的生物技术学14，pp745-750)论述。这些研究者公布的方法也可用于产生特别是根据本发明的转基因玉米。

Vasil(1996，天然的生物技术学14，pp702-703)提供了有关玉米转化的另一篇述评论文。

虽然通过应用例如微粒枪中介的转化作用可能产生转化的玉米，但是对于本研究采用了如下的方案。

质粒构建物：

在含有100mg/l利福平和500mg/l硫酸链霉素的YMB琼脂(K₂HPO₄·3H₂O 660mg/l，MgSO₄ 200mg/l，NaCl 100mg/l，甘露醇10g/l，酵母膏400mg/l，0.8％w/v琼脂，pH7.0)上，培养包含有辅助病毒质粒pRAL 4404(Hoekema et al，1983，自然303，pp179-180)的解除了防御的根瘤土壤杆菌LBA 4404株。应用Holterset al(1978分子基因遗传学163：181-187)的冻-融法，实现了以pVICTOR IV GNG E35S nagB IV2或pVICTOR IV GNGrbc nagB IV2或pVICTOR IV GNG E35S nagB的转化作用，并在含有100mg/l利福平和500mg/l链霉素和50mg/l硫酸庆大霉素的YMB琼脂上对转化体进行了选择。按同样的方式实施了以缺少nagB基因的对照构建物的转化作用。

分离和共培养外植体

分离出例如大小1.5-2.5mm的A188系玉米的未成熟胚胎，并在N6-AS中，25℃光照下同根瘤土壤杆菌LBA 4404株共培养2-3天。然后，用含有250mg/l头孢氨噻的无菌水洗此胚胎，并转移至含有250mg/l头孢氨噻和浓度达100mg/l葡糖胺的LS培养基中(此后这种培养基被称为LSS1)。

选择转基因植株的条件

外植体在LSS1培养基上培养3周，然后转移至含有葡糖胺和头孢氨噻的LS培养基上。在此培养基3周之后，分离出绿色的幼苗，并测定GUS活性。

使GUS阳性的幼苗生根

将GUS阳性的幼苗转移至含有2mg/l的MS培养基上生根。在此培养基上四周之后，将小植株转移至有无菌土壤的花盆中进行驯化。讨论

在这些研究中，已将编码葡糖胺-6-磷酸脱氨基酶的基因编码区克隆并插入一个植物表达盒中。此基因提供了一种用于植物转化的有效选择手段，其中此选择手段使之能够从未转化的细胞中选择转化的细胞。对于这点，植物中这种酶的表达，通过外源性供给葡糖胺可解除对代谢的抑制作用，此葡糖胺对于转化的细胞可有益地作为碳水化合物和氮素的来源。葡糖胺甚至可用来补充组织培养基中蔗糖和铵盐水平的降低。现在认为，此选择系统具有自我调节的附加优点。除了作为已糖激酶的底物之外，葡糖胺还可迅速地饱和导致糖蛋白合成的途径，随之必然地产生N-乙酰葡糖胺6-磷酸，这又可激活葡糖胺-6-磷酸脱氨基酶，当失去葡糖胺的外源性供应时，这种酶的活性将会下降。

因此，相对目前可利用的方法，葡糖胺6-磷酸脱氨基酶提供了另一种有用的选择手段，特别是因为它可以作为氮素来源而被供给，与单独的碳素相比较，氮素更多地限制植物生长。

此外，葡糖胺6-磷酸脱氨基酶相对目前可利用的方法进一步提供了另一种选择手段，因为它能被供给作为氮和碳的来源。

另一方面，我们已发现，对于某些植物细胞中存在蔗糖和葡糖胺水平之间的相互作用。关于这点，我们的初步发现表明，对于某些植物细胞，当蔗糖浓度降低时，葡糖胺甚至变得对未转化的细胞更有毒性。这将意味着，有可能选择培养基的成分，以便对转化的细胞和植物提供甚至更有利的选择条件。概述

因此本发明关系到一种用于从细胞群中选择一种或几种选择性遗传转化细胞的选择方法，以及用于这种方法的构建物、载体、质粒、细胞和生物体，此外还关系到用这种方法制备的构建物、载体、质粒、细胞和生物体。在此方法中，细胞群包括选择性遗传转化细胞和可能未-转化的细胞。每种选择性遗传转化细胞包含一个第一可表达性核苷酸序列和任选一个第二可表达性核苷酸序列。在此方法中，一种成分或其代谢衍生物，当以低浓度存在于培养基中时，对于选择性遗传转化细胞和未转化的细胞都是营养物。在此方法中，该成分或其代谢衍生物，当以高浓度存在于培养基中时，对未转化的细胞是有毒的，但对选择性遗传转化细胞没有毒性。该第一核苷酸序列编码一种基因产物，它能将以高浓度存在于培养基中的该成分或其代谢衍生物转变成选择性遗传转化细胞的营养物。该方法包括将此细胞群导入含有高浓度该成分或其代谢衍生物的培养基的步骤。在此方法中，该成分或其代谢衍生物对于选择性遗传转化细胞既是碳水化合物又是氮素的来源。另一方面，在此方法中如果该成分的一部分起代谢底物的作用，并被代谢转变成衍生化底物，那么此衍生化底物对该基因产物能够引起别构效应。

本发明的其它一些改变形式对于本领域的技术人员将是显而易见的。

Claims

1.一种用于从一个细胞群中选择一种或几种选择性遗传转化细胞的选择方法，

其中该细胞群包括选择性遗传转化细胞和可能未转化的细胞；

其中每种选择性遗传转化细胞都包含一个第一可表达性核苷酸序列和任选地一个第二可表达性核苷酸序列；

其中的一种成分或其代谢衍生物，当以低浓度存在于培养基中时，对于选择性遗传转化细胞和未转化的细胞都是营养物；

其中该成分或其代谢衍生物，当以高浓度存在于培养基中时，对未转化的细胞是有毒的；

其中的第一核苷酸序列编码一种基因产物，它能够将以高浓度存在于培养基中的该成分或其代谢衍生物转变成选择性遗传转化细胞的营养物；

该方法包括将此细胞群导入一种培养基的步骤，其中此培养基任选包含高浓度的该成分或其代谢衍生物；以及

或者其中该成分或其代谢衍生物，对于选择性遗传转化细胞既是碳水化合物又是氮素的来源；

或者其中如果该成分的一部分起代谢底物的作用，并被代谢转变成衍生化底物，那么此衍生化底物对该基因产物能够引起别构效应。

2.一种组合物和一种培养基，此组合物包含含有选择性遗传转化细胞和可能未转化细胞的细胞群；

其中的一种成分或其代谢衍生物，当以低浓度存在于培养基中时，对于选择性遗传转化细胞和未转化细胞都是营养物；

此培养基任选地含有高浓度的该成分或其代谢衍生物；以及

3.一个包含选择性遗传转化细胞和可能未转化细胞的细胞群；

其中每种选择性遗传转化细胞都包含一个第一可表达性核苷酸序列和任选的一个第二可表达性核苷酸序列；

其中该成分或其代谢衍生物，当以高浓度存在于培养基中时，对于未转化的细胞是有毒的；

其中的第一核苷酸序列编码一种基因产物，它能够将以高浓度存在于培养基中的该成分或其代谢衍生物转变成选择性遗传转化细胞的营养物；以及

或者其中该成分或其代谢衍生物对于选择性遗传转化细胞既是碳水化合物又是氮素的来源；

4.一种选择性遗传转化的细胞，它包含一个第一可表达性核苷酸序列和任选地一个第二可表达性核苷酸序列；

其中该成分或其代谢衍生物当以高浓度存在于培养基中时，对未转化的细胞是有毒的；

或者其中如果该成分的一部分起代谢底物的作用，并被代谢转变成衍生化底物，那么此衍生化底物对该基因产物能引起别构效应。

5.一种用于遗传转化未转化的细胞而产生选择性遗传转化细胞的构建物；

此构建物包含一个第一可表达性核苷酸序列和任选地一个第二可表达性核苷酸序列；

其中的一种成分或其代谢衍生物，当以低浓度存在于培养基中时，对于选择性遗传转化细胞和未转化的细胞是营养物；

6.一种载体，包含有一个用于遗传转化未转化的细胞而产生选择性遗传转化细胞的构建物；

其中的一种成分或其代谢衍生物当以低浓度存在于培养基中时，对于选择性遗传转化细胞和未转化的细胞是营养物；

7.一种质粒，包含有一个用于遗传转化未转化的细胞而产生选择性遗传转化细胞的构建物；

此构建物包含一个第一可表达性核苷酸序列和任选一个第二可表达性核苷酸序列；

或者其中该成分或其代谢衍生物对于选择性遗传转化细胞，既是碳水化合物又是氮素的来源；

8.一种含有选择性遗传转化细胞的生物体；

其中的选择性遗传转化细胞含有一个第一可表达性核苷酸序列和任选地一个第二可表达性核苷酸序列；

9.一种试剂盒，包括一个用于遗传转化未转化的细胞而产生选择性遗传转化细胞的构建物(如当包含在其中或者在载体上或质粒中时)和一种培养基；

此构建物包含有一个第一可表达性核苷酸序列和任选地一个第二可表达性核苷酸序列；

此培养基任选地含有高浓度的该成分或其代谢衍生物；以及

10.上述权利要求任何之一的发明，其中该成分或其代谢衍生物对于选择性遗传转化细胞既是碳水化合物又是氮素的来源；以及其中如果该成分的一部分起代谢底物的作用，并被代谢转变成衍生化底物，那么该衍生化底物对该基因产物能够引起别构效应。

11.上述权利要求任何之一的发明，其中该成分能够对选择性遗传转化细胞既供给碳水化合物又供给氮素的来源。

12.上述权利要求任何之一的发明，其中该成分含有胺基团，优选地其中该成分为葡糖胺。

13.上述权利要求任何之一的发明，其中对未转化细胞有毒性的该成分的代谢衍生物包含胺基团和/或磷酸基团，优选地其中该代谢衍生物是葡糖胺-6-磷酸。

14.上述权利要求任何之一的发明，其中该衍生化底物包含胺基团和/或磷酸基团，优选地其中该衍生化底物是N-乙酰-葡糖胺-6-磷酸。

15.上述权利要求任何之一的发明，其中的第一核苷酸序列含有一个内含子。

16.上述权利要求任何之一的发明，其中该基因产物是一种酶。

17.上述权利要求任何之一的发明，其中的酶能够修饰糖蛋白前体物，优选地其中该酶能够使糖蛋白前体物脱氨基，优选地其中该酶是葡糖胺-6-磷酸脱氨基酶。

18.上述权利要求任何之一的发明，其中的酶是从一种微生物得到的葡糖胺-6-磷酸脱氨基酶，优选地是从细菌得到的，优选地其中该酶是从大肠杆菌得到的葡糖胺-6-磷酸脱氨基酶。

19.上述权利要求任何之一的发明，其中的葡糖胺-6-磷酸脱氨基酶具有如SEQ ID NO：3所显示的氨基酸序列，或是其变异体，同系物或片断。

20.上述权利要求任何之一的发明，其中的葡糖胺-6-磷酸脱氨基酶，是由SEQ ID NO：1显示的核苷酸序列，或者其变异体，同系物或片断，或者是与其互补的序列所编码的，或者是由SEQ ID NO：2显示的核苷酸序列，或其变异体，同系物或片断，或者是与其互补的序列所编码的。

21.上述权利要求任何之一的发明，其中的葡糖胺-6-磷酸脱氨基酶，或者编码此酶的基因，是从NCIMB 40852或NCIMB 40853或NCIMB 40854获得。

22.上述权利要求任何之一的发明，其中的选择性遗传转化细胞是在体外培养物中。

23.上述权利要求任何之一的发明，其中的选择性遗传转化细胞是在体内生物体中。

24.上述权利要求任何之一的发明，其中的选择性遗传转化细胞是选择性遗传转化的植物细胞。

25.上述权利要求任何之一的发明，其中存在第二核苷酸序列，并且其中该第二核苷酸序列编码一个所需的核苷酸序列。

26.一种根据上述权利要求任何之一的发明产生的，或者包含该发明的植物，优选其中该植物能够为人类或动物提供食品。

27.权利要求26的植物，其中该植物是瓜尔豆，马铃薯或玉米中的任何一种。

28.一种含有异源性酶的植物，其中该异源性酶是葡糖胺-6-磷酸脱氨基酶。

29.权利要求28的植物，其中的酶是从细菌获得的葡糖胺-6-磷酸脱氨基酶，优选地其中该酶是从大肠杆菌获得的葡糖胺-6-磷酸脱氨基酶。

30.权利要求28或29的植物，其中的葡糖胺-6-磷酸脱氨基酶具有如SEQ ID NO：3显示的氨基酸序列，或者是它的变异体，同系物或片段。

31.权利要求28-30中任何之一的植物，其中的葡糖胺-6-磷酸脱氨基酸酶，是由SEQ ID NO：1显示的核苷酸序列，或者其变异体，同系物或片段，或者是与其互补的序列所编码的，或者是由SEQ IDNO：2显示的核苷酸序列，或其变异体，同系物或片断，或者是与其互补的序列所编码的。

32.权利要求28-31中任何之一的植物，其中的葡糖胺-6-磷酸脱氨基酶或编码此酶的基因，是从NCIMB 40852或NCIMB 40853或NCIMB 40854获得。

33.一种根据上述权利要求任何之一的发明产生的，或者包含该发明的食品或食物。

34.葡糖胺-6-磷酸脱氨基酶作为一种选择手段的用途，用于从未转化的细胞中选择遗传转化的细胞。

35.编码葡糖胺-6-磷酸脱氨基酶的基因的用途，用于提供从未转化的细胞中选择遗传转化细胞的选择手段。

36.一种基因，可用于提供从未转化的细胞中选择遗传转化细胞的选择手段；其中该基因是从NCIMB 40852或NCIMB 40853或NCIMB40854获得。

37.从NCIMB 40852或NCIMB 40853或NCIMB 40854获得的基因的用途，用于提供从未转化的细胞中选择遗传转化细胞的选择手段。

38.一种使基因或基因产物失活的方法，这种基因或基因产物当存在于原核生物中时对此原核生物可能是有害的，通过将至少一个内含子插入此基因，从而可使此原核生物中这种基因或基因产物失活。

39.权利要求38的方法，其中至少将一个内含子插入该基因的保守区。

40.一种原核生物，它包含有当存在于此原核生物中时，可能对其有害的基因，但是其中该基因含有至少一个使原核生物中这种基因或其产物失活的内含子。

41.权利要求40的原核生物，其中的至少一个内含子是插入在该基因的保守区内。

42.NCIMB 40852或NCIMB 40853或NCIMB 40854。

43.一个如SEQ ID NO：2所显示的核苷酸序列，或者它的变异体，同系物或片断，或者与其互补的序列。

44.一种构建物，包含或表达权利要求43的核苷酸序列。

45.一种载体，包含或表达权利要求43或44的发明。

46.一种质粒，包含或表达权利要求43-45中任何之一的发明。

47.一种转基因生物体(或者它的器官、组织或细胞)，包含或表达权利要求43-46中任何之一的发明。

48.权利要求47的转基因生物体，其中该生物体是植物。

49.一种基本上如在此所述的选择方法，或序列，或转基因生物体(或者它的一部分)。