CN1172416A

CN1172416A - 在基因工程植物的贮藏器官中增加类胡萝卜素的积累

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Publication number: CN1172416A
Application number: CN95197153.0A
Authority: CN
Inventors: R·豪普曼; W·H·埃申费尔德; J·英格利希; F·L·布林克豪斯
Original assignee: BP Corp North America Inc
Current assignee: BP Corp North America Inc
Priority date: 1994-10-28
Filing date: 1995-10-27
Publication date: 1998-02-04
Anticipated expiration: 2015-10-27
Also published as: JP3881012B2; PL319788A1; JPH10509309A; NO326137B1; MX9703081A; AU3970195A; CN1183256C; AU697358B2; NO971945D0; EP0792352A1; EP0792352B1; PL182161B1; EP0792352A4; NZ296012A; DE69534082D1; DE69534082T2; NO971945L; US5618988A; ATE291079T1; WO1996013149A1

Abstract

本发明公开了含有转基因的转基因高等植物和种子,以及用于提高类胡萝卜素积累的方法。这种转基因高等植物具有编码嵌合多肽连接物的基因组结构基因,并且,相对于在同类型非转基因植物中的积累,它能在预选的贮藏器官中提高有色天然类胡萝卜素的积累。对嵌合多肽的表达,是由有效地连接于该结构基因的,能使贮藏器官增强表达的启动子所驱动的。此嵌合多肽具有N末端质体转运肽部分,它的C末端又被连接于非高等植物八氢番茄红素合成酶的N末端。

Description

在基因工程植物的贮藏器官中增加类胡萝卜素的积累

技术领域

本发明涉及类胡萝卜素的生物合成。更具体地说，本发明涉及编码八氢番茄红素(phytoene)合成酶的非高等植物基因的表达，这种酶可在预先选择的植物贮藏器官，如根、种子、果实或块茎中，催化无色的类胡萝卜素-八氢番茄红素-的形成，使得在该植物的贮藏器官中，一种或多种天然产生的有色类胡萝卜素的积累增加。

技术背景

类胡萝卜素是含40个碳原子(C₄₀)的萜类化合物，通常由8个异戊二烯(C₅)单元连接在一起组成。在分子的中心，这些单元的连接是反向的。在此发明公开中，将使用一些俗名和缩写，在首次提到一个俗名时，通常在其后的括弧内给出由IUPAC推荐的半系统命名。

类胡萝卜素是具有多种用途的色素。类胡萝卜素烃被称为胡萝卜素，而其氧化衍生物被称为叶黄素。

类胡萝卜素，特别是α-和β-胡萝卜素，β-阿朴-8′-胡萝卜醛(carotenal)(脱辅基胡萝卜醛)，和4，4′-二酮-β-胡萝卜素(角黄素)，被广泛地用作食品着色剂，并且许多类胡萝卜素都显示有维生素原A的活性。参阅，作为着色剂和维生素A前体的类胡萝卜素，J.C.Bauernfeind编，第二章“作为食品染料的类胡萝卜素”，H.Klaui和J.C.Bauernfeind，Academic Press，New York(1981)pp.48-317。

八氢番茄红素(7、8、11、12、7′、8′、11′、12′-ψ八氢-ψ，ψ-胡萝卜素)是类胡萝卜素生物合成途径中的第一类胡萝卜素，它是由20碳原子的前体-香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)-通过二聚作用而产生的。八氢番茄红素可用于治疗皮肤疾病(美国专利No.4,642，318)。八氢番茄红素本身是无色的，但是，它是有色类胡萝卜素的前体。

在某些生物体中，红色的类胡萝卜素-番茄红素(ψ，ψ-胡萝卜素)-是该途径中产生的另一个类胡萝卜素。番茄红素使成熟的番茄具有特征性红色。番茄红素可用作食品着色剂，并且在某些细菌、真菌和绿色植物中，番茄红素是其它类胡萝卜素生物合成的中间体。

可用于从普遍存在的前体物焦磷酸法尼酯合成番茄红素的类胡萝卜素特异性基因，包括GGPP合成酶的基因，八氢番茄红素合成酶的基因，以及八氢番茄红素脱氢酶(去饱和酶)的基因，在生成番茄红素的过程中，八氢番茄红素脱氢酶能够从八氢番茄红素中总共去掉4摩尔氢。

有趣的是，不同的生物体以不同的方式使八氢番茄红素脱氢。例如球形红色杆菌(Rhodobacter Spheeroides)的某些菌株含有一种酶，它能在一步反应中脱去3摩尔氢，形成四氢番茄红素，然后再从它脱去另1摩尔氢，形成番茄红素。在草生欧文氏杆菌(Erwinia herbicola)中是由单独一个酶脱去全部4摩尔氢，将八氢番茄红素转化成番茄红素。在高等植物中，该脱氢反应似乎一般需要单独的四个步骤，各步骤生成三个可分离的中间体。由此，八氢番茄红素形成六氢番茄红素，再形成ζ-胡萝卜素，再形成四氢番茄红素，再形成番茄红素。

在类胡萝卜素的生物合成途径中，β-胡萝卜素(β，β-胡萝卜素)是通过在两个末端的环化作用，从番茄红素产生的。它也能被一些细菌、真菌和绿色植物合成。β-胡萝卜素可用作人造黄油和黄油的着色剂，也是合成维生素A和体内产生维生素A的原料，并且最近又发现它对某几种癌症具有预防作用。

例如，预测性和回溯性流行病研究已表明，血清或血浆中β-胡萝卜素含量低与后来肺癌的发生有关系。因为视黄醇(维生素A)与肺癌危险性没有类似的相关性，所以看来β-胡萝卜素是在未转化成维生素A时才有保护作用。Ziegler，Amer.Instit.Nutr.，publication 022/3166/89，116(1989)。

β-胡萝卜素是由不饱和的类胡萝卜素通过环化作用而产生的，对其过程迄今尚未完全了解。参阅Bramley等，Current Topics inCellular Regulation，29：291，297(1988)。因为只发现积累番茄红素，而不是γ-胡萝卜素(另一种可能的前体)的突变体，所以据信，对于植物和微生物，都有单一的环化酶负责将番茄红素转化成β-胡萝卜素。已发现与这种环化作用相关的酶，它通常是完整的膜蛋白。

目前商业化生产β-胡萝卜素的方法包括从胡萝卜分离、化学合成〔Isler等，美国专利2,917,539(1959)〕和通过三孢子笄霉菌(Choanephore trispora)进行微生物生产〔Zajic，美国专利Nos.2,959,521(1960)和3，128，236(1964)〕。

在某些植物和细菌中，β-胡萝卜素被双重羟基化而形成了玉米黄质(β，β-胡萝卜素-3，3′-二醇)，这是一种在养禽业中被用作着色剂的黄色色素。虽然生产玉米黄质的化学合成法是已知的，但是它是低效率的，不能与现有的生物量来源进行商业竞争。生物量来源包括玉米粒、玉米谷蛋白粉和万寿菊花瓣。玉米粒中玉米黄质的含量平均大约为0.001％(干重)，在玉米谷蛋白粉中大约为0.01％(干重)。这些生物量来源的特点是产量低而且产量不稳定。

玉米黄质二糖苷是另一种食品着色剂，它是从玉米黄质生物合成产生的。这种物质也具有类似玉米黄质的黄色。

在许多植物中，番茄红素是类胡萝卜素生物合成的分支点。因此，某些植物的番茄红素被转化成β-胡萝卜素和玉米黄质，有时是玉米黄质二糖苷，而番茄红素的剩余部分被转化成α-胡萝卜素和另一个羟基化的化合物-叶黄素(3，3′-二羟基-α-胡萝卜素)。

Chamovitz等，J.Biol Chem.268(23)：17348-17353(1993)曾报导，在兰细菌胡萝卜素生成过程中，番茄红素的形成是其速度限制性步骤。根据兰细菌和植物在胡萝卜素生成途径之间的相似性，以及进一步的实验资料，这些研究者推测，在高等植物中，八氢番茄红素去饱和形成番茄红素也是限速性步骤。

在高等植物，即被子植物中，发现类胡萝卜素存在于质体，即叶绿体和有色体中。质体是细胞内贮藏体，它不同于液泡，是由双层膜而不是由单层膜包裹的。质体，如叶绿体也含有它们自己的DNA和核糖体，能够独立地复制和合成某些它们自身的蛋白质。.因此，质体具有线粒体的某些特征。

在叶片中，类胡萝卜素通常存在于叶绿体的基粒中，在此，它们提供光防护功能。β-胡萝卜素和叶黄素是占优势的类胡萝卜素，紫黄质和新黄质仅少量存在。类胡萝卜素在发育中的花瓣有色体中积累，通常伴有叶绿素消失。象在花瓣中那样，类胡萝卜素是当有色体从叶绿体发百时才出现在果实的有色体中。类胡萝卜素也存在于胡萝卜根和马铃薯块茎的有色体中。β-胡萝卜素是在市售的胡萝卜和甘薯中存在主要色素，而叶黄素通常只小量存在。参阅T.W.Goodwin，“类胡萝卜素”，植物生理百科全书，New Series，Vol.8，Pirson等编，次级植物产品，Chapter 5.3，Bell等编，Springer-Verlag，New York(1980)pages257-287。

目前，仅有少量植物被广泛地用于生产市售的有色类胡萝卜素产品。但是，在这些植物的大多数中，有色类胡萝卜素合成的效率都相当低，导致类胡萝卜素生产的成本很高。

提高生物合成生产能力的一个途径是应用重组DNA技术。例如，为人所需的是通过重组DNA技术广泛地生产有色类胡萝卜素，特异性地生产β-胡萝卜素。这种类型的生产过程使人们能够对最适合、最有效的生产者生物体控制其质量、数量和选择性。后者对于商品是否经济，是否为消费者接受，是特别重要的。

能够合成类胡萝卜素，并能作为这种生物合成目的的可能基因来源的生物体是草生欧文氏杆菌。草生欧文氏杆菌是肠杆菌科革兰氏阴性菌属的一个成员，是兼性厌氧菌。

欧文氏杆菌属通常可分为三类。这三类中的草生菌类包括能典型地形成黄色色素的菌种(例如草生欧文氏杆菌)，已经证明这种色素是类胡萝卜素。这些细菌作为腐生菌存在于植物表面，还可能作为继发性细菌存在于由许多植物病原体引起的损伤中。发现它们也存在于土壤、水中，也可以是动物，包括人的偶发性病原菌。

专利申请WO91/13078(1991年9月5日公开)讲授了来自草生欧文氏杆菌的基因，在几种单细胞和多细胞生物体中制备几种类胡萝卜素分子的应用。此外，欧洲专利申请0393690Al(1990年10月24公开)报告了应用来自另一种欧文氏杆菌属；噬夏孢欧文氏杆菌(Erwiniauredovora)20D3(ATCC 19321)的DNA，在制备类胡萝卜素的应用。

正如此后将要详细论述的，本发明最优选地应用来自草生欧文氏杆菌EHO-10菌(ATCC 39368)的编码八氢番茄红素合成酶的DNA，该合成酶在高等植物的贮藏器官内制备类胡萝卜素分子。在此使用的草生欧文氏杆菌EHO-10菌也被称为创伤埃希氏菌(EscherichiaVulneris)。

专利申请WO91/13078讲授了通过包含组成性花椰菜花叶病病毒CaMV35S启动子和根癌土壤杆菌(Agrobaeterium tumefaciens)介导的转移DNA的载体，增加高等植物八氢番茄红素产量的方法。还报导了把基因转移作为将八氢番茄红素合成酶转运到植物类胡萝卜素的通常合成部位-叶绿体-的一种方法，其中转移基因是编码在其N末端与烟草核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶(RUBISCO或RBCS)转运(信号)肽相连接的八氢番茄红素合成酶的基因。此专利申请还讲述了应用根癌土壤杆菌，将含有上述转运肽基因的基因和将番茄红素转化成β-胡萝卜素的番茄红素环化酶的基因，转移到植物中，从而提高叶绿体中β-胡萝卜素的含量。

虽然上述技术对于提高整株植物和植物的叶绿体类胡萝卜素含量方面已证明是成功的，但是，这样产生的再生植物本身就常常是黄色或橙色的，显示出形态异常，并且它们的生长出乎预料地迟缓。因此，希望有一个更好的方法，用于提高植物中类胡萝卜素，特别是α-和β-胡萝卜素，玉米黄质和叶黄素的产量。如下的公开内容将阐明用于实现该期望目的的两种相关技术。

发明概述

本发明涉及被转化而含有异源基因组DNA的高等植物，该DNA编码与质体转运肽相连接的非高等植物八氢番茄红素合成酶，并且是在提供贮藏器官增强表达的启动子控制之下。催化无色类胡萝卜素八氢番茄红素合成的酶的器官增强表达的结果，是器官增强有色类胡萝卜素的积累，此积累过程处于该具体植物合成途径的下游。

本发明一方面提供一种方法，该方法用于在转基因高等植物中预选的贮藏器官内，获得提高的有色天然类胡萝卜素的积累，其中提高的积累是与同类型非转化植物贮藏器官中有色天然类胡萝卜素的积累相比较，并且这二种植物是在同样的条件下生长的。此方法包括使转化植物生长到预选的贮藏器官成熟的各个步骤。该转基因植物的基因组含有(i)编码嵌合多肽连接物的DNA区段，(ii)与此DNA区段有效连接的启动子DNA区段，该启动子能驱动嵌合多肽连接物的贮藏器官增强表达。该嵌合多肽连接物具有N末端质体转运肽部分，该部分的C末端以肽键与非高等植物八氢番茄红素合成酶的N末端相连接。

本发明的另一方面是一种类似的方法，该方法补充了这样一个附加的步骤，即把转基因组织再生成转基因植株，生长该植株使预选的贮藏器官成熟。

本发明的更进一步的实施方案，是试图通过以重组DNA分子，对一种在其预选的贮藏器官中积累有色天然类胡萝卜素的植物组织进行基因组转化，而形成转基因植物组织的另一种方法，其中重组DNA分子包含一个整合载体，该区段有效地结合了(i)编码嵌合多肽连接物的DNA区段，以及(ii)启动子DNA区段，它能在从该植物组织再生的植物预选贮藏器官中，驱动嵌合多肽连接物的贮藏器官增强表达。然后使该转化的植物组织再生成预选的贮藏器官已生长成熟的转基因植物。此后，就可以从成熟的贮藏器官中，回收有色的天然类胡萝卜素。

上述任何一种方法中的贮藏器官，优选的是根、种子、块茎或果实。在上述方法中被转化的非转基因植物，优选的是下列植物：马铃薯、番茄、胡萝卜、甜瓜、南瓜、红番石榴、西番莲果、芒果、红番木瓜、鳄梨、樱桃、红桔、柑桔、棕榈、黄瓜、杏、桃和玉米。

优选的质体转运肽是烟草RUBISCO，矮牵牛EPSP合成酶，和胡椒PSY基因转运肽中的一种。优选的启动子可以是根或块茎增强启动子，而优选的预选贮藏器官可以分别是根或块茎。优选的八氢番茄红素合成酶是被草生欧文氏杆菌的crt B基因编码的酶。

还试图得到转基因植物。这种植物(a)具有编码嵌合多肽连接物的基因组结构基因，以及(b)由于存在引起贮藏器官增强表达该多肽连接物的启动子，能在预选的贮藏器官内过度积累有色的天然类胡萝卜素，这种过度积累是相对于同类型非转基因植物该贮藏器官中有色天然类胡萝卜素的积累而言的。该嵌合多肽连接物具有N末端质体转运肽部分，该部分的C末端连接于非高等植物八氢番茄红素合成酶的N末端。还试图得到同样具有编码嵌合多肽的结构基因的转基因植物杂交体。

以前曾提到过示范性转基因植物。转基因胡萝卜是特别试图得到的转基因植物。这种胡萝卜(a)具有编码嵌合多肽连接物的结构基因，以及(b)相对于同类型非转基因胡萝卜，能在根内过度积累有色的C₄₀胡萝卜素或叶黄素。该嵌合多肽连接物具有N末端的RUBISCO转运肽部分，它的C末端是连接于草生欧文氏杆菌八氢番茄红素合成酶的N末端。

还试图得到前面讨论的转基因植物的种子，该种子能萌发形成转基因植物，相对于同样品系的非转基因植物和由此产生的杂交体，它能够积累有色天然类胡萝卜素。该种子含有编码嵌合多肽连接物的基因组基因，此多肽连接物具有N末端转运肽，其C末端又与非高等植物八氢番茄红素合成酶的N末端相连接。

附图简述

图1是归纳的高等植物合成类胡萝卜素方案的流程图。无色化合物GGPP，八氢番茄红素，和六氢番茄红素是以空心字母显示，而有色的类胡萝卜素以黑体字母显示，酶以黑斜体字显示。

图2用示意图显示质粒pARC376，它含有从法呢基焦磷酸合成类胡萝卜素所需要的全套草生欧文氏杆菌菌的酶基因，图中以大写字母表示。除β-胡萝卜素羟化酶(crtZ)之外，其它所有酶结构基因的转录方向(箭头所示)都是一致的，crtZ是以相反的方向转录。重要的限制性酶切位点也以括弧内的位置编号表示出。八氢番茄红素的合成是由GGPP合成酶(crtE)和八氢番茄红素合成酶(crtB)催化的。以crtX、crtY、crtI和crtZ表示的基因，分别编码玉米黄质糖基化酶，番茄红素环化酶，八氢番茄红素脱氢酶-4H和β-胡萝卜素羟化酶。

图3用示意图显示质粒pATC915，它含有编码RUBISCO(RBCS)/八氢番茄红素合成酶嵌合多肽的基因，以及氨苄青霉素抗性基因AP^r和几个重要的限制性酶切位点及它们的位置编号。

图4用示意图显示质粒pATC920，它是由图3中显示的质粒pATC915制成的。

图5用示意图显示质粒pmas4Z，它含有mas启动子(AmasPmas)，并如图3中所示。

图6用示意图显示质粒pATC909，它含有CaMV 35S启动子和nos终止子，该启动子有效地连接于八氢番茄红素脱氢酶4-H(PDH)的基因，并如图3中所示。

图7用示意图显示质粒pATC911，其中以图5的mas启动子代替了图6的CaMV 35S启动子，并如图3中所示。

图8用示意图显示质粒pATC921，其中以图4的RUBISCO/八氢番茄红素合成酶基因替代了图6的PDH基因，并如图3中所示。

图9用示意图显示质粒pATC923，它含有图8的mas-RUBISCO/八氢番茄红素合成酶-nos终止子构建体，并转移进入到载体pKYLX71，位于该载体中原先被CaMV 35S启动子所占据的位点，并如图3中所示。

图10用示意图显示质粒pATC703，它含有被克隆进入商品质粒pBI101.2的上述构建体，并如图3中所示。

图11用示意图显示质粒pPPR001，它含有马铃薯马铃薯糖蛋白启动子，并如图3中所示。

图12用示意图显示质粒pATC954，它含有在图11的马铃薯糖蛋白启动子控制下的RUBISCO/八氢番茄红素合成酶偶联多肽的基因和nos终止子，并如图3中所示。

图13用示意图显示质粒pATC956，它含有被克隆进入商品质粒pBI101.2的图12中的马铃薯糖蛋白启动子-RUBISCO/八氢番茄红素合成酶偶联肽基因和nos终止子，并如图3中所示。发明详述

A、术语说明

氨基酸：在此列举的所有氨基酸残基都是天然L-构型的。与标准多肽命名法一致，见J.Biol.Chem.243：3557-59(1969)，氨基酸残基的缩写列举在下面的对应表中：

对应表

符号氨基酸单字母三字母

Y Tyr L-酪氨酸

G Gly 甘氨酸

F Phe L-苯丙氨酸

M Met L-甲硫氨酸

A Ala L-丙氨酸

S Ser L-丝氨酸

I Ile L-异亮氨酸

L Leu L-亮氨酸

T Thr L-苏氨酸

V Val L-缬氨酸

P Pro L-脯氨酸

K Lys L-赖氨酸

H His L-组氨酸

Q Gln L-谷氨酰胺

E Glu L-谷氨酸

W Trp L-色氨酸

R Arp L-精氨酸

D Asp L-天冬氨酸

N Asn L-天冬酰胺

C Cys L-半胱氨酸应该说明的是，所有的氨基酸残基序列，在此都是以分子式表示，其以左到右的取向是常规的从氨基端到羧基端的方向。

表达：细胞内过程的组合，包括结构基因为了产生多肽而进行的转录和翻译。

表达载体：构成控制元件的DNA序列，当它与载体内的结构基因有效地连接时，能调节结构基因的表达。

被整合：异源DNA序列被掺入到宿主染色体即被整合。

有效地连接或插入：载体DNA序列与结构基因DNA序列有效地连接指的是，如果二者在正确的阅读框架内如此地共价结合并定位，以致启动子DNA序列将影响结构基因DNA序列的转录或翻译。

启动子：是在DNA序列或DNA序列组合上的一个识别位点，它对基因提供表达控制作用，并且，RNA聚合酶特异性地与其结合，而启动该基因的RNA合成(转录)。

重组DNA分子：杂交的DNA序列，含有至少两个实际上在正常情况下不同时存在的核苷酸序列。

结构基因：表达多肽即氨基酸残基序列的DNA序列。

载体：细胞内能复制的DNA分子，和/或另一DNA片段能够与其有效地连接，而导致该附加片段复制的DNA分子。质粒是典型的载体。

B、引言

将要构建的最广泛分布的一组色素，类胡萝卜素，基本上存在于所有的光合作用生物体内，在此它们是光合作用器官的主要功能产物。所有萜类化合物的第一个特异性前体物，甲瓦龙酸(mevaloniv acid)，是从乙酰辅酶A经由HMG-辅酶A(3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A)形成，它本身又转化成异戊烯基焦磷酸(IPP)-通用的异戊二烯单元。借助异戊烯转移酶的催化作用，在IPP异构化成二甲丙烯基焦磷酸，以及一系列加IPP缩合反应之后，通过香叶基香叶基焦磷酸合成酶(GGPP合成酶)的作用，形成了香叶基香叶基焦磷酸。这是生成类胡萝卜素的第一步，培养进行GGPP的尾对尾二聚作用，通过八氢番茄红素合成酶的催化，形成八氢番茄红素-第一个C₄₀类胡萝卜素。

八氢番茄红素之后以六氢番茄红素开始形成的每个碳氢化合物类胡萝卜素，是有色的。高等植物类胡萝卜素生物合成的归纳的途径如图1所示。

番茄红素是通过一个或多个八氢番茄红素脱氢酶(去饱和酶)的催化作用，由八氢番茄红素制成。如图1所示，番茄红素是高等植物类胡萝卜素合成的分支点。

在一条途径中，番茄红素通过环化作用形成β-胡萝卜素。图1的另一条途径中番茄红素环化形成α-胡萝卜素。在此二条途径中，α-胡萝卜素和β-胡萝卜素同样地被环化，分别形成叶黄素和玉米黄质。在某些植物中，番茄红素仅有一个末端环化形成δ-胡萝卜素或γ-胡萝卜素。γ-胡萝卜素的对称环化作用形成α-胡萝卜素。类似地，δ-胡萝卜素的对称环化作用形成ε-胡萝卜素，而不对称环化作用形成α-胡萝卜素。

类胡萝卜素一旦形成，就可作为生物合成途径中下一个要生成的类胡萝卜的前体物。因此，如果类胡萝卜素与转化此类胡萝卜素成为该合成途径中下一种分子的适当的酶一道存在，那么，该转化过程通常会发生。

作为前体相关物的前面的产物，将引起在生物合成反应途径中，以后形成的一种或多种类胡萝卜素在植物中积累，这种积累是相对于先形成的前体物类胡萝卜素仅有少量积累或没有积累而言。这种前体物类胡萝卜素积累的相对缺乏，在下述情况特别明显，其中任何α-胡萝卜素或β-胡萝卜素，叶黄素或玉米黄质都是最终产生的类胡萝卜素，其中通常几乎没有发现番茄红素，而有可测定量的八氢番茄红素，是成熟的植物部分(如果实)中后形成的有色类胡萝卜素含量的大约1/5-1/10。

例如，一个关于红钟辣椒(Capsicum annum)的研究曾报导，在所得到的类胡萝卜素中，八氢番茄红素占大约1.7％，与之相比较，辣椒红占约34.7％，β-胡萝卜素占约11.6％。〔作为着色剂和维生素A前体物的类胡萝卜素，同上p69，表5〕。类似地，在该论文的第135页的表29还报导，意大利洋李的类胡萝卜素成分之中，八氢番茄红素占约1.3％，β-胡萝卜素约占18.7％，叶黄素约占15.5％，以及紫黄质约占35.0％，而对番茄红素没有报导。在上述论文中的检测资料显示，在讨论各种来源的类胡萝卜素分析资料时，甚至很少提到八氢番茄红素的浓度。

众所周知，生物产生物质的相对含量取决于几个可变因素，在此包括前体物类胡萝卜素的浓度，酶催化转化生成下一个类胡萝卜素的速率，以及可能的产物反馈抑制作用，借助于这种抑制作用，产生的类胡萝卜素将抑制它本身的进一步反应。某些植物还可能产生非功能性的或功能低的转化酶，这样，看上去在后面能产生的类胡萝卜素则不能被产生，或者仅产生相当小的量。对后面的，而不是对前面的转化酶发生作用的人工抑制剂，也可能在类胡萝卜素的积累中起作用。

每种高等植物贮藏器官中的质体，都产生特征性的有色类胡萝卜素，当这种植物在特定条件下生长时，这种有色类胡萝卜素的积累比其它类胡萝卜素的积累能达到更高的程度。这些特征性的贮藏器官有色类胡萝卜素，在此被称为“有色的天然类胡萝卜素”。

本发明试图构建一种转基因植物，并建立应用这种植物的方法。该转基因植物的基因组包含(i)编码嵌合多肽连接物的DNA区段，(ii)与此DNA区段有效连接的启动子DNA区段，它能驱动非光合作用的贮藏器官增强表达该多肽连接物。该嵌合多肽连接物具有N末端质体转运肽部分，它的C末端(以肽键结合)与非高等植物八氢番茄红素合成酶的N末端连接。

用该方法可在此转基因植物预选的(预定的)贮藏器官内，获得提高的有色天然类胡萝卜素积累，这种提高的积累是相对于同类型的非转化植物贮藏器官中有色天然类胡萝卜素的积累而言，并且这二种植物是在同样的条件下生长。一方面，使转基因植物生长到预选的贮藏器官成熟，其中表达了提高含量的有色天然类胡萝卜素。另一方面，转基因组织是以此后将要叙述的载体转化的植物组织。使之再生形成转基因植物，则当该转基因植物生长到其贮藏器官成熟时，其中类胡萝卜素的表达被增强了。再一方面是首先形成转基因植物组织，然后使之再生形成转基因植物，并进一步生长到其贮藏器官成熟。

因而已发现，通过提高植物贮藏器官中单独一种无色C₄₀类胡萝卜素的产量，就可提高在该贮藏器官中正常产生的有色类胡萝卜素，即有色的天然类胡萝卜素的产量。例如，通过无色的C₄₀类胡萝卜素，八氢番茄红素，可提高橙色α-胡萝卜素和β-胡萝卜素，以及黄色叶黄素和玉米黄质的产量。因此，正如Chamovitz等在J.Biol.Chem.268(12)：17348-17353(1993)所提议的，不是番茄红素的产生，而是八氢番茄红素的产生，是高等植物胡萝卜素生成中的速度限制性步骤。

通过构建转基因植物可达到提高八氢番茄红素产量的目的，此转基因植物具有基因组整合的，异源非高等植物的八氢番茄红素合成酶基因。该异源八氢番茄红素合成酶基因在以此基因转化的高等植物中，预选的(预定的)贮藏器官中表达。应该理解到，这种表达是被设计在某些贮藏器官中进行，这些贮藏器官是在植物有性再生循环过程中产生的，例如在种子和果肉中，然而，在另一些植物，贮藏器官是根，如胡萝卜，或者是块茎，如马铃薯和薯蓣，在这些植物中，表达在其整个生长过程中进行。在此二种情况下，使植物生长到其贮藏器官成熟，则有增加量的天然有色类胡萝卜素在其中被表达。还注意到，有色天然类胡萝卜素产量的提高，并非组成性地在所有植物贮藏器官中提高，而是在特定的预定非光合作用贮藏器官中提高，如下文将要论述的。

应用异源非高等植物基因的原因，是因为存在所谓的共抑制现象，即加入同源基因会引起天然基因和转移基因都不能被表达。参阅例如，Fray等，Plant Mol.Biol.22：589-692(1993)，或Finnegan等，Bio/Technology，12：883-888(Sept.1994)。因此，来源于高等植物的八氢番茄红素合成酶基因，例如番茄的pTOM5，或胡椒的PSY，在此都不能被应用。

但是，异源八氢番茄红素合成酶基因，在预选贮藏器官中的细胞质表达，不足以提高植物贮藏器官中所希望的有色C₄₀类胡萝卜素的产量，因为在其中表达的蛋白质大部分不能透过质体的双层膜，而那些有色类胡萝卜素正是在质体中被制造出的。这样，为了提高植物贮藏器官质体中C₄₀有色天然类胡萝卜素的产量，被表达的酶也应具有与其N末端残基融合的(连接的，肽键结合的)质体转运肽，以便使表达的八氢番茄红素合成酶能够进入质体，形成更多八氢番茄红素，用作增加有色天然类胡萝卜素合成的起始物。含有整合的异源八氢番茄红素合成酶基因的DNA因此能编码嵌合多肽连接物，包括与非高等植物八氢番茄红素合成酶连接的转运肽。

试图在预选的植物贮藏器官中提高八氢番茄红素的产量，同时提高天然有色C₄₀类胡萝卜素的产量，也需要在该植物贮藏器官中对嵌合多肽连接物只进行相对于组成性表达的实质性表达。因而，对嵌合偶联多肽的表达，是被含有贮藏器官增强启动子的DNA区段所驱动。这种构建体使贮藏器官能增强表达具有生物活性的八氢番茄红素合成酶，用于催化在贮藏器官内的质体中产生八氢番茄红素，同时在植物的其它部位稍微增加八氢番茄红素合成。

因而，在此应用了分别编码启动子和嵌合多肽连接物的DNA区段，二者在用于植物的整合表达载体中有效地连接在一起，下文将进一步论述。

试图构建的编码八氢番茄红素合成酶的基因或分离纯化的DNA区段，可以是质粒中特定位置的若干碱基对，或者是以两个限制性内切酶位点为界的限制片段，或者是以两个限制性内切酶位点为界的，并含有若干碱基对的限制片段。如此设计作为基因的DNA，还可以规定包括已命名的SEQ ID NO加这些基因(下文所述)的等位基因，变异体和类似物的序列，这些DNA序列非随机地(特异性地)与在SEQ ID NO中所示的基因杂交，或者与如下文所述的，在严谨条件下被鉴定为限制性片段的的八氢番茄红素合成酶基因的序列杂交。每个被设计的基因都包含所列举的非随机(特异性地)杂交的等位基因、变异体或类似物DNA序列，当适当地被整合进合适的宿主基因组，并在其中表达时，它们编码八氢番茄红素合成酶，并且还产生所编码酶的具有生物活性的分子。

多核苷酸杂交作用，在其它各种可变因素中，特别易受如下因素的影响：序列的同一性(同源性)，序列G+C含量，缓冲液的浓度，序列的长度，以及双链解链温度(T_m)。参阅Maniatis等，MolecularCloning，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.(1982)，p38。

以类似的序列长度、缓冲液浓度和解链温度，通过杂交技术，将为评价序列的同一性(同源性)提供有用的参数。例如，当存在至少90％同源性的情况下，杂交可在68℃下，在缓冲液如由20×SSC稀释的6×SSC中进行〔Maniatis等，同上，p447〕，两个序列形成一个杂交的双链(杂交)。用于最后DNA印迹清洗的缓冲液可以是低浓度的缓冲液，如0.1×SSC，并可在相当高的温度，如68℃下进行。把上述应用于杂交和清洗的条件同其被定义为高严谨条件。

当两个序列具有至少大约80％同源性时，杂交可应用中等高严谨条件。在此，可使用6×SSC，在大约50-55℃的温度下进行杂交。最后清洗可用大约1-3×SSC的盐浓度，在大约60-68℃的温度下进行。这些杂交和清洗条件被定义为中等高严谨条件。

当两个序列具有至少30％同源性，以及更优选的具有至少大约40％同源性时，可应用低严谨条件进行杂交。此时，可在大约40-50℃的温度下，用6×SSC进行杂交，最后在大约40-60℃的温度下，用大约6×SSC缓冲液浓度清洗而完成非任意杂交作用。这些杂交和清洗条件被定义为低严谨条件。

在活的生物体中，蛋白质或多肽的氨基酸残基顺序，是通过遗传密码，与编码该蛋白质的结构基因脱氧核糖核酸(DNA)序列直接相关联的。结构基因可以根据它所编码的氨基酸残基序列，即蛋白质或多肽来限定。

因此，根据众所周知的遗传密码冗余性，可以制备编码相同氨基酸残基序列的其他DNA序列和相应的RNA序列，但是这些序列与上述的基因序列有明显的差异，这两个序列在高严谨条件下不能杂交，但在中等高严谨条件下能够杂交。这样，例如在下文阐述的体外诱变可用于改变DNA序列，以至使被表达酶的相同残基，可通过一个或多个不同的密码子来表达。此外，在希望插入或删除特异性限制性内切酶位点的情况下，同样的技术也可用于将一个氨基酸残基改变成另一个氨基酸残基。该技术还将在下面实施例1d中阐述，在此，突变作用删除了一个限制性位点，但保留了氨基酸序列不变。此外，在其它生物体中也可能存在某一结构基因的等位基因变异体，它们也是有用的，但是，只有在中等高严谨条件下才能形成杂交的双链分子。

在此被定义为DNA变异体序列的DNA或RNA序列具有如下特征：(1)能编码基本上表现出与八氢番茄红素合成酶分子同样生物活性的非高等植物酶分子，此合成酶分子是被SEQ ID NO：1 DNA序列，被在此所述的编码八氢番茄红素合成酶的基因、限制性片段、或者是被含DNA的质粒所表达的，(2)能够在至少中等高严谨条件下，与该SEQ ID NO的DNA序列、基因、限制性片段或质粒杂交，并且(3)与该SEQ ID NO DNA序列、基因、限制性片段或质粒DNA，具有至少80％的同源性，更优选的是至少90％。

因此，DNA变异体或变异体DNA被限定为包括RNA序列。

构建编码上述酶蛋白的类似物或同功物DNA和RNA序列，也被试图作为本发明的一部分。还计划构建具有如下特征的非高等植物DNA和RNA序列：(1)能编码基本上表现出与八氢番茄红素合成酶分子同样生物活性的非高等植物酶分子，此合成酶分子是被SEQ ID NO：1DNA序列、被在此所述的编码八氢番茄红素合成酶的基因，限制性片段，或者被含DNA的质粒所表达的，(2)能编码氨基酸残基序列，它至少有30％，更优选地至少40％，与SEQ ID NO：1与被构建的基因，限制性片段或者与质粒编码的草生欧文氏杆菌八氢番茄红素合成酶的氨基酸残基序列同源，并且(3)能够在低严谨杂交条件下，但不能在中等高严谨条件下，与SEQ ID NO：1的，与基因、限制性片段的、或者与质粒的结构基因杂交，并且在此将这种非高等植物DNA和RNA序列称为在图中所示DNA或RNA序列的“类似物”或“同功物”。因此，DNA类似物或同功物的DNA序列，也被限定为包括RNA序列。

C、编码八氢番茄红素合成酶的生物合成所需酶的基因

下文将要论述，并以实例说明一种非高等植物的基因，它能编码具有生物活性的八氢番茄红素合成酶分子，与高等植物宿主的内源性基因不同，它是一种被用于本发明的非高等植物异源八氢番茄红素合成酶基因。来自草生欧文氏杆菌菌的，被所谓的crtB(Eh-crtB)基因编码的八氢番茄红素合成酶基因，被特别优选地在此作为例示应用，论述如下：

1.分离类胡萝卜素基因群(cluster)

质粒pARC376含有由Perry等，J.Becteriol，168：607(1986)从细菌草生欧文氏杆菌EHO-10(创伤埃希氏菌，ATCC39368)分离的大约13kb的染色体DNA片段，当此质粒被转移进入大肠杆菌(Ecoli)时，会导致E.coli细胞产生黄色色素。这些研究者将质粒pARC376称为质粒pPL376。显示质粒pARC376适当的限制性位点的限制性酶切图谱如图2所示。

此质粒中负责色素产生的结构基因位于一个大约7500碱基对(bp)的DNA片段上，以图2中所示的限制性位点PstI(位于约位置4936)和BglII(位于约位置12433)为界。在此大约7500bp区域内，共有六个有关的基因，它们能使E.coli细胞产生类胡萝卜素玉米黄质二糖苷，这是包含在本文定义的质粒pARC376中的类胡萝卜素途径中被鉴定的最终产物。

虽然要求所有六个基因都存在于其本身不产生类胡萝卜素的生物体中，并且这六个基因能够被加入到产生类胡萝卜素的生物体如高等植物中，但是令人惊奇地发现，只要加入一个编码八氢番茄红素合成酶的基因，就能够在高等植物的贮藏器官如根、种子、块茎、果实等等中，增加有色天然类胡萝卜素如胡萝卜素和叶黄素的产量。高等植物在其贮藏器官内，产生制造八氢番茄红素所需要的法尼基焦磷酸和GGPP。

2.八氢番茄红素合成酶(crtB)基因

草生欧文氏杆菌的crtB基因含有至少大约888个碱基对(bp)，优选地至少含有942个bp。该基因位于质粒pARC376的大约6395和5353之间的位置(图2)。除pARC376之外，含有草生欧文氏杆菌crtB基因(Eh-crtB)的有用的DNA区段，还可以从其它一些构建质粒中得到，如在已公开的专利WO91/13078(PCT/US 91/01458)中所述。

例如，质粒pARC285(ATCC40756)，在其一个大约1112bp的NcoI-EcoI片段中，或者大约1040bp的NcoI-BamHI片段中，含有上述的较短基因。质粒pARC140N(ATCC40759)，在如下片段中包含Eh-crtB基因：大约1176bp的HpaI-EcoRI片段，大约1238bp的PvuII-EcoRI片段，以及在该质粒多接头区更大的片段中，它的长度随所用的内切核酸酶位点不同而改变。另一种类型的这种基因，在质粒pARC145G(ATCC40753)中存在于大约1158bp的BglII-EcoRI片段中。

最优选地，所使用的Eh-crtB基因是位于质粒pARC1614的SphI-SalI片段(大约1083bp)上的基因，它是由质粒pARC376(从图2的大约位置6900到位置5353)的BglII-BamHI部分消化片段(大约1547bp)构建的，将在下文进一步论述。该Eh-crtB基因构建体具有由丝氨酸(Ser)改变为精氨酸(Arg)残基的第二氨基酸残基。在此所使用的Eh-crtB基因，在位置11有甲硫氨酸(Met)，而不是上述已公开专利WO91/13078中的苏氨酸(Thr)，这看来是自发地产生的，因为，在专利WO91/13078的序列与其它研究者保藏的Genbank序列是一致的，并且本发明者对该区域反复测序都得到了相同的结果。因此，这两个基因是预期的变异体，此种基因具有与天然基因一样的功能，编码与天然基因相比较有99％以上同源性的蛋白质(在309个残基中，有1个或2个残基被改变)。SphI内切核酸酶的切割位点包括基因的ATG起始密码子。此基因构建物的DNA序列显示在SEQ ID NO：1中。

Eh-crtB基因的序列被Armstrong等于1992年保藏于Genbank中，给予的保藏号为M87280。

来源于噬夏孢欧文氏杆菌的crtB基因序列被Misawa等保藏于Genbank中，给予的保藏号为D90087。这个序列与Misawa等在欧洲专利申请0 393 690中公开的序列相同。

通过比较草生欧文氏杆菌和噬夏孢欧文氏杆菌的DNA序列，公开的欧洲专利申请0 393 690曾报导，应用高严谨杂交条件，来自噬夏孢欧文氏杆菌的DNA不能与来自草生欧文氏杆菌的DNA杂交。本研究表明，在已公开的欧洲专利申请(图5)的DNA和氨基酸残基序列之间，即现在被称为crtB基因和八氢番茄红素合成酶序列的SEQ ID NOs：1和2之间的序列的同源性大约是64％。尽管存在大约36％错配的碱基对，并且据报导草生欧文氏杆菌和噬夏孢欧文氏杆菌的DNA，在高严谨条件下不能杂交，但是，所报导的噬夏孢欧文氏杆菌的crtB(Eu-crtB)DNA序列，在此还是可被利用。在此所应用的Eu-crtB基因和草生欧文氏杆菌(Eh-crtB)八氢番茄红素合成酶DNA互为DNA类似物，在此使用术语“类似物”

欧洲专利申请0 393 690把其图5中的噬夏孢欧文氏杆菌基因错误地鉴定为形成中的前八氢番茄红素焦磷酸(PPPP)，而不是八氢番茄红素。但是最近，该专利的一位署名的发明者报导，其图5的基因确实能把GGPP转化成八氢番茄红素。见Sandmann等，FEMS Microbiol，Lett，90：253-258(1992)。

Armstrong等，Mol.Gen.Genet.216：254-268(1989)中报导了应用来自荚膜红色杆菌(Rhodobacter capsulatus)产生类胡萝卜素的基因群，该菌是兼性原养型，革兰氏阴性紫色非硫磺菌。R.capsulatns菌能制造GGPP和八氢番茄红素，但不能制造番茄红素或环状类胡萝卜素。

Armstrong等在Mol.Gen.Genet.216：254-268(1989)中报导了包括crtB基因在内的荚膜红色杆菌crt基因群八个成员的基因序列。对八个基因产物中的五个提出了其功能假设，对crtB，crtE和crtJ基因的功能没有提出。Armstrong等.在J.Biol.Chem.265(4)：8329-8338(1990)中曾提出，荚膜红色杆菌的crtB基因能转化GGPP成为PPPP，而crtE基因能转化PPPP成为八氢番茄红素，虽然都需要crtJ基因，但是它没有明确的作用。这些假设的根据是，在crtE突变株中有PPPP积累，在crtB突变株中有GGPP积累。

Armstrong等，Proc Natl.Acad.Sci.USA87：9975-9979(1990)曾报导了草生欧文氏杆菌crtB、crtE和crtI基因的DNA序列，并将被其编码的蛋白质与被来自荚膜红色杆菌类似名称基因编码的蛋白质相比较，以及与被番茄PTOMS基因产物编码的蛋白质相比较。报导了在荚膜红色杆菌crtB(Rc-crtB)基因产物和Eh-crtB基因产物之间，编码的蛋白质具有33.7％的同源性。Schnurr等，FEMS Microbiol，Lett.78：157-162(1991)报导了草生欧文氏杆菌crtB基因DNA与来自荚膜红色杆菌的探针，在低严谨条件下的杂交。表明荚膜红色杆菌和草生欧文氏杆菌的基因，是如前面所定义的类似物。

Armstrong等已将荚膜红色杆菌基因的序列资料保藏于Genbank，保藏号为X52291。

Bartley等，J.Biol.Chem.267(8)：5036-5039(1992)最近的工作报导，荚膜红色杆菌的crt E基因编码GGPP合成酶，而不是八氢番茄红素合成酶。这些研究者还得出结论，荚膜红色杆菌的crtB基因是编码八氢番茄红素合成酶的基因。更近些时候，Romer等在Biochem，Biophys.Res.Commun.196(3)：1414-1421(1993)中也得出结论，荚膜红色杆菌的crtB基因编码八氢番茄红素合成酶。

在Chamovits等，FEBS Lett，296(3)：305-310(1992)报导的新近研究工作中，提供了来自聚球藻属兰细菌PCC7942的，命名为PYS的八氢番茄红素合成酶基因序列。该PYS基因(Syc-crtB)编码一个计算分子量大约为35.8kD的蛋白质。Chamovits已将该序列资料保藏于Genbank，保藏号为X63873。

随着显示编码GGPP合成酶的基因和携带着除crtB基因外的噬夏孢欧文氏杆菌类胡萝卜素生物合成基因的质粒在E.coli内的共同表达，产生了玉米黄质和八氢番茄红素，并且证实，PYS基因能编码在此有用的八氢番茄红素合成酶。通过将Syc-crtB基因的产物分别与Eu-crtB和Re-crtB的产物相比较，报告存在33％和30％的同源性。

Botella等已将来自Myxococcus Xanthus(黄色粘球菌)的另一个有用的crtB基因序列保藏于Genbank，保藏号为Z21955。通过Clustal法，将M.Xanthus菌crtB基因(Mx-crtB)序列与草生欧文氏杆菌的crtB基因序列相比较，发现二者存在36.5％的相似性。

Hoshino等在Appl.Environ.Microbiol，59：3150-3153(1993)中公开了嗜热性耐热菌(Thermns thermophilus)的八氢番茄红素合成酶crtB基因序列，并已保藏于Genbank(保藏号D14604)。将此嗜热性耐热菌的crtB(Tt-crtB)基因序列通过Clustal法与Eh-crtB基因序列相比较，得到32.1％的相似性。

Viogue已将聚球藻属菌的八氢番茄红素合成酶基因(Syy-crtB)的序列资料，以保藏号X69172保藏于Genbank。用Clustal法对Syy-crtB基因的Eh-crtB基因进行比较，显示有26.6％的相似性。

另一个有用的基因是来源于粗糙链孢霉菌(Neurospora crassa)的真菌八氢番茄红素合成酶基因(Nc-crtB)，是最近由Schmidhauser等，J.Biol.Chem.269：12060-12066(1994)报导的，并对以前以保藏号L27652保藏于Genbank的基因序列，提出了一个修正的序列。用Clustal法将此基因与Eh-crtB进行比较，得到26.8％的相似性。

利用Apple Macmtosh计算机DNASTAR程序的Megalign应用系统(DNASTAR，Inc，Madison，WI)，通过上述的Clustal法进行了多重校准。

综合上述的公开内容可见，Eh-crtB，Eu-CrtB，Rc-crtB，Syc-crtB，Syy-crtB，Mx-crtB，Tt-crtB或Nc-crtB基因中的任何一个都可以用作编码八氢番茄红素合成酶的高等植物基因。Eh-crtB基因是优选的，并在此作例示性的应用。这些基因的每一个都被认为是其它基因的类似物，而具有以精氨酸取代丝氨酸的Eh-crtB基因，以及Genbank表中的该基因都是变异体，由于该基因具有精氨酸/丝氨酸的改变，并有甲硫氨酸对苏氨酸的取代，因此是Genbank序列中的Eh-crtB基因的等位变异体。

应用在此所述的杂交法和功能性选择标准，以及据上面引证的文献，还可以从其它非高等植物生物体，得到另一些编码八氢番茄红素合成酶的类似的DNA分子。例如，那些已经知道，或者已显示能产生八氢番茄红素或后面的类胡萝卜素如β-胡萝卜素的细菌、真菌或藻类，都可以用作DNA的来源。应用在Maniatis等，Molecular cloning，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y. (1982)，p270-294中论述的方案，或者应用Baieley等，J.Biol.Chem.267(8)：5036-5039(1992)用于得到PsyI基因的方案，可从被选择的生物体中得到整个DNA，并在λ噬菌体如λgtll中构建基因组资料库。

然后用标准方案和在上面所述的低严谨杂交条件下，对此噬菌体资料库进行筛选，筛选中应用了放射标记的切口平移DNA探针，此探针具有SEQ ID NO：1的草生欧文氏杆菌DNA序列，它是一个来自保藏载体的前述限制性酶切片段，或者是另一个有用的crtB基因。一旦通过杂交研究定位了适当的结构基因，就可得该结构基因的DNA区段，为进行应用，必要时可对它进行测序，设计在适当的重组体分子中进行表达，并显示其产生具有生物活性的八氢番茄红素合成酶的能力，对此将另有叙述。

上述技术和方案，对于分子生物学领域的技术人员是熟知的，不需要作更多的叙述。但是应该指出，上述操作过程也可以用于得到编码八氢番茄红素合成酶的变异体DNA分子，因为在低严谨条件下杂交的DNA分子，也包括那些在高和中等高严谨条件下杂交的DNA分子。

为了确定某一等位基因、变异体或类似物的DNA序列能否编码具有“生物活性”的酶，或具有基本相同生物活性的酶，可根据该等位基因、变异体或类似物DNA序列能否将GGPP转化成八氢番茄红素，即能否发挥八氢番茄红素合成酶的作用来判断。例如，可以把这样一种等位基因、类似物或变异体DNA序列定义为有生物活性，并因此具有同参照酶一样的生物活性，此DNA序列能表达含有八氢番茄红素合成酶的连接物分子，此连接物又能把所提供的GGPP转化成八氢番茄红素。因此，把表达的多肽连接物看作是八氢番茄红素合成酶，表明该多肽具有生物活性。可通过八氢番茄红素的产量来测定。从变异体、等位基因或类似物的DNA序列对有生物活性的八氢番茄红素合成酶的表达，如在上述母专利申请中所述，或者类似地如在Chamovitz等，FEBS Lett，296(3)：305-310(1992)中所表明的。

D、贮藏器官转运肽

贮藏器官质体转运肽基本上可以是任何来源的，而典型的应含有大约30-80个氨基酸残基。在Von Heijne等，Eur J.Biochem.180：535-545(1989)，和Clark，等J.Biol.Chem.264(29)：17544-17550(1989)中公开了几个可用作示例性的肽。在della-Cioppa等，PlantPhysiol.84：965-968(1987)中更广泛地论述了另一些质体特异性的(叶绿体)转运肽。

示例性的转运肽包括菠菜亚铁氧化还原蛋白还原酶转运肽，Rieske铁-硫蛋白，硅烯亚铁氧化还原蛋白，豌豆热休克蛋白转运肽，谷氨酰胺(Gln)合成酶，以及白菜酰基载体蛋白转运肽。在Von Heijne等的上述论文中，提供了这些转运肽和其它一些转运肽的氨基酸残基序列。Weisbeek等在同上刊物中公开了另一些硅烯转运肽的DNA和氨基酸残基序列。

如Romer等，Biochem.Biophys.Res.Commun.196(3)：1414-1424(1993)报导的，与PSY基因相邻的胡椒植物转运肽基因也可以用于与上述的一种八氢番茄红素合成酶基因融合或有效地连接，从而产生一个构建的与该转化植物异源的多肽连接物。Shah等，Science，233：478-481(1986)公开的编码EPSP合成酶的72个密码子(216bp)转运肽的碧冬茄(MP4-G)转运肽基因也可以应用。

一种特别优选的质体转运肽，是Mazwr等Nucl.Acids Res.13：2343-2386(1985)报导的修饰形式的烟草(Nicotiane tabacum)双磷酸核酮糖羧化酶-加氧酶(RUBISCO，RBSC)信号(转换)肽。在此采用的基因修饰，是在5′端引入了一个NcoI位点，并在碱基73和74之间断开并引入一个NarI位点。这二种修饰都不改变氨基酸残基的序列。对此质体转运肽基因的构建，下文将进一步论述。

产生的质体转运肽基因含有177bp。该基因被优选地用作177bpSalI-SphI片段，它能与前述的含有Eh-crtB基因的SphI-SalI片段连接。这种连接产生了一个SalI-SalI基因(约1260bp)，此基因编码一个具有N-端转运肽的异质性(嵌合的)多肽，它的C-端与一个显示有八氢番茄红素合成酶活性的多肽N-端相连接。已保藏的质粒pATC1616(ATCC40806)中含有这种特别优选的SalI-SphI177bp DNA。

E、贮藏器官增强启动子

如较早时所指出的，以前在植物中通过组成性启动子如CaMV35S和nos启动子，产生增强有色类胡萝卜素表达的成功，已导致转化的植物中形成了黄色和橙色的叶子以及其它一些形态学生长异带。因此已意识到，为了在其它方面显示正常生长的植物中，得到有色天然类胡萝卜素理想的增强表达，需要使表达有更强的特异性。得到这种理想结果的一种方法是，利用能在一个或多个预选的或预定的非光合作用植物器官中，表达其所控制基因的启动子。

在此把在一个或多个预选的贮藏器官中的表达，而在其它器官如根相对于叶或茎中只有很少表达或没有表达的表达，称为增强表达或优先表达。一个典型的启动子，在一种或多种预选的器官中定向表达，与另一器官相比较，比率至少达到5∶1时，在此被定义为器官增强启动子。基本上只在一种贮藏器官中表达，在其它贮藏器官中基本上不表达时，被称为器官特异性表达，即在一种贮藏器官中相对于另一种器官表达产物的比率达到大约100∶1或更大时，表明具有器官特异性。因此，贮藏器官特异性启动子，是贮藏器官增强启动子种类的一类成员。

成熟时能产生其自身类胡萝卜素的植物贮藏器官，是用作预选的器官增强表达的特别好的选择。这些器官内含有质体，如有色体和叶绿体，在这种器官的自然成熟过程中，它们的叶绿素会部分或全部丧失。这种含质体的植物贮藏器官的典型例子是胡萝卜的根、马铃薯块茎，和如下果实的果肉：红番石榴、西番莲果、芒果、红番木瓜、番茄、鳄梨、樱桃、红桔、柑桔、棕榈、罗马甜瓜和西瓜，还有其它一些肉质果如南瓜、黄瓜、芒果、杏、桃子，以及玉米种子。

CaMV 35S启动子通常被认为是一个组成性启动子。但是，最近的研究表明，CaMV 35S启动子的21bp区，当被有效地连接于另一个异源的，通常的绿色组织启动子rbcs-3A启动子时，可使所形成的嵌合启动子变成根增强启动子。在美国专利No.5,023,179中公开了此21bp序列，它的公开内容将被引入作为参考。这个含有美国专利No.5,023,179的21bp插入片段的启动子，在此是有用的根增强启动子。

一个包含有上述21bp片段的类似的根增强启动子，是CaMV 35S启动子本身的-90-+8区段。其公开内容被引入作为参考的美国专利No.5,110,732揭示，该被切短的CaMV 35S启动子可在根部和注定将合成为根的种子基部提供增强的表达。该启动子在此也是有用的。

另一个有用的根增强启动子是在PCT/GB92/00416(WO91/13922，1991年9月19公开)中公开的油菜(Brassica napus L.)基因的-1616- -1启动子。锚定质粒pRlambdas4的E.coli DH5α和含有该启动子的细菌噬菌体λβ，它已被保藏在国家工业和海洋细菌收集中心(National Collection of Industrial and Marine Bacteria)Aberdeen，GB，1990年3月8日，保藏号分别为NCIMB40265和NCIMB40266。通过用Hae III切割该质粒，可以得到作为1.0kb片段的此启动子的有用部分。

最优选的根增强启动子是存在于质粒pKan2中的甘露品(mannopine)合成酶(mas)启动子，已由DiRitat和Gelvin在Mol.Gen.Genet.207：233-241(1987)中描述，并在此被应用，它的用途下文将详细论述。该启动子可以从它的质粒pKen2中，以XbaI-XbaI片段的形式取出。

优选的甘露品合成酶根增强启动子是由直到位置-138的核心甘露品合成酶(mas)启动子区和从-318到-213位置的甘露品合成酶激活子组成，合起来被称为AmasPmas。已发现该启动子在烟草根中，与叶的表达水平相比较，增加产量大约是10至100倍。组成性CaMV 35S启动子在烟草中显示出只有AmasPmas大约一半的表达，并且在叶组织中也有良好的表达。

一种优选的根特异性启动子，是带有富羟脯氨酸糖蛋白基因HRGPnt3的大约500bp的5′侧序列，它在侧生根起始的过程中表达，是由Keller等在Genes Dev，3：1639-1646(1989)报导的。另一种优选的根特异性启动子，是由Yamamoto等在Plant Cell，3：371-381(1991)报导的，它存在于烟草根特异性基因TORBF大约-635至-1的5′侧支区中。这些研究者把调节表达的cis-作用因子更特异性地定位于从转录起始位点开始的大约位置-636到大约位置-299 5′的区域。Yamamoto等报导了根中来自TORBF基因的，稳定状态的mRNA产量，但在叶、枝条分生组织或茎中未见这种情况。

还有另一种有用的贮藏器官特异性启动子，是番茄(Lycopersiconesculentum)果实成熟基因E8的5′和3′侧支区。在Deikman等，EMBOJ.7(11)：3315-3320(1988)和Plant Physiol，100：2013-2017(1992)中，对这些区段和它们的cDNA序列进行了阐述。

在该基因5′侧支序列的2181bp中，定位了三个区段，并且看来522bp序列的3′到附加聚(A)位点能控制E8基因的表达。在未成熟的果实中，通过乙烯对E8基因转录的激活，需要从-2181到-1088的区段，该区段对成熟过程中的转录也有作用。另两个区段，-1088到-863和-409到-263，在未成熟的果实中不能使乙烯发挥作用，但是，在成熟过程中对E8基因的表达是足够的。

玉米中的玉米蔗糖合成酶-1(Sh)启动子，在胚乳中能高水平地表达它所控制的酶，在根中其表达水平则大大降低了，在绿色组织或花粉中则不能表达，已有报导表明，该启动子在烟草的韧皮部细胞中能表达一个嵌合的报告基因，特异性地产生在茎和根中丰富的β-葡萄糖苷酸酶(GUS)。参阅Yang等，Proc.Natl.Acai Sci.USA87：4144-4148(1990)。因此该启动子对于植物的器官如象甜瓜类的肉质果实，如罗马甜瓜，或者对于含有胚乳的种子，以及对于含有高水平韧皮部细胞的根都是有用的。

另一种典型的组织特异性启动子是外源性凝集素启动子，它是对种子组织特异性的。大豆种子中的外源性凝集素蛋白是单个基因(Lel)编码的，仅在种子成熟的过程中表达，大约占种子总mRNA的2-5％。对外源性凝集素基因和种子特异性启动子已作了充分的鉴定，并在转基因烟草类植物中，用于直接种子特异性表达。参阅如Vodkin等，Cell，34：1023(1983)和Lindstrom等，Developmental Genetics，11：160(1990)。

特别优选的块茎特异性表达启动子，是马铃薯的马铃薯糖蛋白(patatin)基因的5′侧支区段。Twell等在Plant Mol.Biol.9：365-375(1987)中描述了该启动子的用途。该启动子存在于细菌噬菌体LPOTI的大约406bp的片段中。LPOTI启动子具有与其它4个马铃薯糖蛋白启动子有超过90％同源性的区段，以及在全部400个碱基中，与马铃薯糖蛋白启动子PGT5大约有95％的同源性。这些启动子的每个在此都是有用的。也可参阅Wenzler等，Plant Mol.Biol，12：41-50(1989)。

在Benfey等，Science，244：174-181(1988)中公开了其他的器官增强和器官特异性的启动子。

被使用的每个启动子序列基本上不受细胞中类胡萝卜素(八氢番茄红素或有色产物)含量的影响。在此应用的术语“基本上不受影响”意味着该启动子对在被转化的细胞中或转基因植物中积累的类胡萝卜素或八氢番茄红素合成酶的直接的反馈控制(抑制作用)没有响应。

F、DNA的大小

以前描述的DNA片段经常是注明其最小长度，以及总的全部长度。最小长度的定义为编码一种特异性蛋白质酶、转运肽或启动子的，具有一定顺序的DNA片段的长度。因为对于许多设计构建的八氢番茄红素合成酶基因和转运肽的编码序列是已知的，所以通过体外诱变，就可以制备其分离的DNA片段、等位基因、变异体和类似物，如在实施例中所述，它是以酶基因的起始ATG密码子开始，到每个基因末端或终止密码子或者正好在其下游结束。因此，可以在八氢番茄红素合成酶基因的起始密码子或者其上游，以及在终止密码子或者其下游，设计一个理想的限制性位点，这样可以制备出比上述许多基因更短的八氢番茄红素合成酶基因，并可将它切取和分离。

如专业人员所熟知，只要存在所需要的DNA序列(包括启动子，起始和终止信号)，附加的碱基对通常可在片段的两端加入，特别是在3′端，该片段仍然可被用于表达蛋白质。当然，这是假定在该片段中不存在抑制表达的，有效连接的DNA片段，而通过消耗所需要的反应产物，表达由该期待的蛋白质所产生的产物，否则将干扰该DNA片段的结构基因。

因此，只要启动子、转运肽和含八氢番茄红素合成酶DNA的片段中不含这种干扰性DNA序列，那么在本发明中有用的DNA片段，其长度可以是2000-15000个碱基对。只要当需要时，为复制和表达所需要的所有最小DNA序列都存在。一个重组DNA分子，特别是表达载体的最大尺寸，主要取决于使用方便，并且该载体的大小能够被宿主细胞接纳。已清楚地知道最小载体的大小。这种长度的DNA片段不是优选的，但可以应用。

G、质粒构建

1.DNA片段

编码前述酶蛋白，转运肽和启动子的DNA片段，可以通过化学方法合成。例如Matteucci等，J.Am.Chem.Soc，103：3185(1981)报导的磷酸三酯法。当然，用化学法来合成编码序列，可以简单地通过以适当的碱基替换编码天然氨基酸残基序列的碱基，来进行任何所需要的修饰。但是，包含前述序列的DNA片段是优选的。

而且，含有编码蛋白质结构基因的DNA片段，可以从包含这些基因的重组DNA分子(质粒载体)得到。例如，质粒型重组DNA分子pARC285和pARC140N，都含有编码八氢番茄红素合成酶蛋白的DNA序列，质粒pARC145G含有编码GGPP合成酶和八氢番茄红素合成酶的DNA区段。此外，质粒型重组DNA分子pARC146D和pARC1616都含有编码具生物活性八氢番茄红素脱氢酶蛋白的DNA序列，并且质粒pATC1616还含有RUBISCO质体转运肽基因。

可通过从所保存的质粒或本文前述的质粒，用熟知的方法删除和有效地连接适当的限制性片段，来制备具有如下结构的DNA片段：该DNA片段含有编码器官增强启动子的DNA序列，该启动子是有效地与编码质体转运肽的DNA连接的，它的DNA又与编码八氢番茄红素合成酶的DNA片段5′端连接。在此所用的以这种方式产生的DNA分子具有典型的粘性末端，即伸展在该分子双链部分之外的“突出的”单链部分。虽然也试图构建具有平末端的分子，但在本发明的DNA分子上存在粘性末端是优选的。

上述的每个质粒载体都已按照布达佩斯协议保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，12301 Parklawn Drive，Rockville，MD20852。

关于保藏物的资料如下所示：质粒 ATCC号保藏日期pARC285 40756 1990.2.26pARC140N 40759 1990.2.26pARC145G 40753 1990.2.26pARC146D 40801 1990.5.11pATC1616 40806 1990.5.15pATC703 1994.10.27pATC923 1994.10.27

上述保藏物是按照布达佩斯协议的要求保藏的，该要求是：保藏的持续期限应该是从保藏日开始起的30年，或者是最后一次要求在保藏处保藏后的5年，或美国专利从其申请到可实施操作的期限期满后5年，看哪个时间更长。并且如果该质粒在保藏处变得不能复制，应该给予补充。

还试图构建了上述DNA片段的核糖核酸(RNA)等价物。

2.重组DNA分子

通过将载体有效地与本发明的分离DNA片段连接，构成如本文所述的和保藏的质粒，可产生在此可用的重组DNA分子。特别优选的重组DNA分子此后将在实施例中详细论述。在此把能够引导基因表达的载体称为表达载体。

上述的表达载体含有包括启动子在内的表达控制成分。编码嵌合多肽的基因有效地与表达载体连接，使启动子序列能引导RNA聚合酶结合和表达编码所需要的多肽的基因。如Poszkowski等.EMBO J.3：2719(1989)和Odell等，Nature，313：810(1985)所描述的可诱导的、病毒的、合成的、组成性启动子，以及如Chns等，Science 244：174-181(1989)提出的时间调控、空间调控和时空调控的启动子，可用于表达编码多肽的基因。

选择哪种表达载体，以及编码多肽的基因最后与哪种预选的器官增强启动子有效地连接，直接由所需要的功能特性来决定，例如蛋白质表达的位置和时机，以及将被转化的细胞。这些都是熟知的构建重组DNA分子技术中的固有局限性。但是，在将实施本发明有用的载体整合进入宿主高等植物的基因组之后，它能够引导复制，并且也能引导表达包含在该DNA序列中，并与之有效连接的，编码嵌合多肽的基因。已清楚地知道，表达载体不能整个整合进入宿主植物的基因组，而只是整合了一部分。尽管如此，还是认为载体整合有利于表达。

在一个优选的实施方案中，载体中包含有原核复制子，即在以此转化的原核宿主细胞中，具有引导在染色体外自主复制和维持重组DNA分子能力的DNA序列。本专业的人员都熟知这种复制子。

那些包含原核复制子的载体，也可以包含有能够在宿主细胞中，如在以此转化的E.coli中，引导表达八氢番茄红素合成酶偶联的基因的原核启动子区。在含有一个或多个能方便地插入本发明DNA片段的限制性位点的质粒载体中，提供了可与细菌宿主相容的独特的启动子序列。这种载体质粒的典型代表有可从Gibco BRL，Gaithersburg，MD得到的pUC18、pUC19和pBR322，以及可从Pharmacia，Piscataway，N.J.得到的pPL和pKK233-3。这些载体可用于合成存在于整合表达载体中的DNA区段。

本专业的人员都熟知对高等植物中基因表达有用的典型载体，它们包括Rogers等，Meth.in Enzymol.153：253-277(1987)所述的，来自根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)Ti质粒的载体。这些载体是植物整合载体，在其中，通过转化作用，该载体将一部分载体DNA整合进了宿主植物的基因组。对于基于Ti质粒的整合载体，被整合进入宿主植物染色体的区段，是Ti质粒左、右边缘之间的区段。

在此应用的示例性根癌土壤杆菌载体，是由Schardl等，Gene 61：1-11(1987)中和Berger等在Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：8402-8406(1989)中报导的质粒pKYLX6和pKYLX7。质粒pKYLX6被被设计用作中间构建体的E.coli载体，而质粒pKYLX7是被设计用于整合克隆基因的根癌土壤杆菌载体。修饰载体pKYLX61和pKYLX71含有代替了原来的HindIII-SstI片段多克隆位点区的HindIII，XhoI，BamHI，PstI和SstI位点。另一个在此有用的载体是质粒pBI101.2，它可从Clontech Laboratories，Inc.Palo Alto，CA得到。质粒pKYLX7，pKYLX71和pB7101.2是与具有病毒基因的另一个载体一起被用于根癌土壤杆菌的双组分载体。

另一个植物转化系统是建立在发根土壤杆菌(Agrobacteriumrhzogenes)上的系统，这种菌在转化中诱导产生发状根，而不是产生瘤。专利申请PCT/US87/02512(WO88/02405，1988年4月7日公开)叙述了用发根土壤杆菌A4菌株和它的Ri质粒，同根癌土壤杆菌载体pARC8或pARC16一道转化黄瓜(Cucnmis Sativas L.，CV，StraightEight)，并形成再生植物黄瓜。

Dong等，Bio/Technology，9：858-863(1991)报导了对于Curcurbitacrae黄瓜科的另一成员，香瓜(Cucumis melo.L)，基于土壤杆菌的转化系统。那些研究工作者使用了一个双组分载体，此载体利用了在此无用的组成性CaMV35S启动子，并发现了基本上是所有的待测组织都通过报告基因转化的证据。此工作同样展示了甜瓜对通过根癌土壤杆菌转化的适应性。

还试图用逆转录病毒表达载体构建本发明的重组DNA。在此所用的术语“逆转录病毒表达载体”指的是含有来自逆转录病毒基因组长末端重复(LTR)区启动子序列的DNA分子。

因为某些类胡萝卜素产物可能与食品的产量和颜色有关，所以逆转录表达载体最好不宜在真核细胞中复制。Verma在PCT PublicationNo.WO87/00551和Cocking等，Science，236：1259-62(1987)中，已描述了逆转录病毒载体的构建和用途。

在优选的实施方案中，用于表达编码多肽基因的载体包含在植物细胞中有效的选择标记物，优选的是药物抗性选择标记物。一个优选的药物抗性标记物是其表达将导致卡那霉素抗性的基因，即含有胭脂碱(nopaline)合成酶启动子的嵌合基因，Tn5新霉素磷酸转移酶II和胭脂碱合成酶3′非翻译区，如Rogers等在植物分子生物学方法，AWeissbach和H.Weissbach编，Academic Press Inc.，San.Diego，CA(1988)中所述。另一个优选的标记物是来自转座子Tn9的，可测定的氯霉素乙酰基转移酶(CAT)基因。

已经建立了多种方法用于通过互补的粘性末端或平末端将DNA有效地与载体连接。例如，可以把互补的同聚物片段加到将要被插入的DNA片段和载体DNA中。然后此载体和DNA片段通过氢键在互补的同聚物尾端之间结合，形成重组DNA分子。

另一种方法是，同含有一个或多个限制性内切酶位点的合成接头，可将DNA片段与整合表达载体结合。在存在能催化平末端DNA分子连接的酶，如细菌噬菌体T4DNA连接酶的条件下，通过将平末端DNA片段与过量合成接头分子共温育，可使合成接头与平末端DNA片段连接。这样的反应产物是在其末端带有合成接头的DNA片段。然后用适当的限制性内切酶将这些DNA片段切开，并连接到整合表达载体中，该载体也已用酶切开而产生了能与那些合成接头匹配的末端。包含有各种限制性内切酶位点的合成接头，可从多种来源买到，包括New EnglandBiolabs，Beverly，MA。

本发明还试图构建上述重组DNA分子的RNA等价物。

3.将基因导入高等植物

用于将编码多肽的基因导入高等多细胞开花植物的方法包括：土壤杆菌介导的植株和细胞转化、原生质体转化、将基因转移进花粉、注射进再生的器官、以及注射进未成熟的胚中。这些方法各有明显的优缺点。因此，一种将基因导入某种特定植物的特殊方法，可能对另一种植物不一定最有效，但是，已经知道哪种方法可用于某种特定的植物。

土壤杆菌介导的转移是将基因导入植物细胞的可广泛应用的系统，因为DNA能被引导进入整个植物组织中，因此没有必要从原生质体再生形成完整的植物。本领域专业人员都熟知用土壤杆菌介导的表达载体将DNA导入植物细胞的方法。参阅如Fraley等，Biotechnology 3：629(1985)和Rogers等，Methods in Enzymology，153：253-277(1987)所述的方法。另外，Ti-DNA的整合是引起某些重排的比较精确的方法。将要被转移的DNA范围是由边缘序列确定的，而间插的DNA通常被插入植物与基因组，如Spielmann等，Mol.Gen，Gent，205：34(1986)和Jorgensen等，Mol.Gen.Gent，207：471(1987)所述。

新的土壤杆菌转化载体，如前面叙述的那些，能够在E.coli以及土壤杆菌中复制，使之有可能方便地操作，如Klee等在Plant DNAInfectionus Agents，T.Hohn和J.Schell编，Springer-Verlag，NewYork(1985)pp.179-203中所述。

而且，最近有关用于土壤杆菌介导基因转移载体的技术进步，已改进了载体中基因和限制性位点的排列，有助于构建能够表达编码各种多肽基因的载体。Rogers等，Methods in Enzymology，153：253(1987)所述的载体，具有被启动子侧面相连的方便的多接头区，和引导表达编码插入多肽基因的多聚腺苷酸化位点，适合于本发明的目的。

在那些土壤杆菌介导的转化是有效的植物中，由于其基因转移具有容易做到和明确的特性，这正是可选择方法。但是，看来几乎没有单子叶植物是土壤杆菌属菌的天然宿主，尽管如Bytebier等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：5345(1987)所述，用土壤杆菌载体，已在天门冬属植物产生了转基因植物。因此，对于重要的商品谷类如水稻、玉米和小麦，必须用另外的方法转化。

土壤杆菌介导的叶盘和其它组织如愈伤组织的转化，看来只限制在土壤杆菌自然感染的植物种类之中。因此，对于双子叶植物，土壤杆菌介导的转化是最有效的。但是，如上所述，用土壤杆菌转化天门冬属植物也能获得成功。

应用基于磷酸钙沉淀作用、聚乙二醇处理、电穿孔、以及这些方法的组合处理，对植物原生质体的转化可获得成功。参阅例如，Potrykus等，Mol.Gen.Genet.199：183(1985)，Lorz等，Mol.Gen.Genet.199：178(1985)，Fromm等，Nature 319：791(1986)，Uchimiya等.MolGen.Genet.204：204(1986)，Callis等，Genes and Development1：1183(1987)，Marcotte等，Nature，335：454(1988)，Wang等，Bio/Technology，10：691-696(1992)，以及Fennell等，Plant CellReports 11：567-570(1992)。

这些系统对不同种植物的应用，取决于从原生质体再生成此具体植物的能力。在如下文献中论述了从原生质体再生谷类植物的例证性方法：Fujimura等，Plant Tissue Culture Letters，2：74(1985)，Toriyama等，Theor Appl.Gent.73：16(1986)，Yamade等，PlantCell Rep.4：85(1986)，Abdullah等，Biotechnology，4：1087(1986)。

为了转化不能成功地从原生质体再生的植物，可以用其它的方法将DNA导入完整的细胞或组织。例如，如Vasil在Biotechnology 6：397(1988)的所述，从未成熟的胚和外植体可实现谷类植物的再生。此外，还可以应用微粒枪或高速微弹技术。应用这种技术，可在金属微粒表面将DNA携带通过细胞壁，进入细胞质，如Klein等，Nature，327：70(1987)，Klein等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：8502(1988)，McCabe等，Biotechnology，6：923(1988)和Vasil等，Bio/Technology 9：667-674(1992)所述。这种金属微粒可透过几层细胞，因此可以在组织外植体内转化细胞。

金属微粒已成功地用于转化玉米细胞，并且用于产生可育的、稳定转化的烟草和大豆植物。组织外植体转化不必通过原生质阶段，因此加速了转基因植物的产生。

还可通过引导DNA转移进入花粉来使DNA导入植物，如Zhou等，Method in Enzymology，101：433(1983)，D.Hess，Intern Rev.Cytol，107：367(1987)，Luo等，Plant Mol.Bio.Reporter.6：165(1988)所述。通过将DNA注射进入植物的再生器官内，可以得到对编码多肽基因的表达，如Pena等在Nature，325：274(1987)中所述。也可以将DNA直接注射进入未成熟胚细胞和再水化的干燥的胚中，如Neuhaus等，Theor.Apl.Genet，75：30(1987)和Benbrook等，Proceedings Bio.Expo.1986，Butterworth，Stoneham，MA.pp.27-54所述。

本领域技术人员都熟知从单一植物的原生质体或各种外植体再生植物的方法。参阅例如，Methods for Plant Molecular Biology，A.Weissbach和H Weissbach编，Academic Press.Inc.San.Diego.CA(1988)。这种再生和培育的方法包括如下步骤：挑选转化的细胞和幼苗，使转化的苗生根，以及在土壤中培育小植物苗。

如Horsch等，Science.227：1229-1231(1985)所述，可以得到含有通过土壤杆菌从叶外植体导入的外来基因的再生植物。在此过程中，转化体是在含有选择剂的培养基中培育，此培养基诱导被转化植物的苗再生，如Fraley等，Proc.Natl.Acad.Sci.U S.A.80：4803(1983)所述。通过这个过程，通常可在2-4周内产生幼苗，然后将这些转化体幼苗转移到适当的诱导生根的培养基中，这种培养基中含有选择剂和阻止细菌生长的抗生素。

为形成转化的植物幼苗，愈伤组织的转化是优选的。下文将要论述这种转化作用的具体实施例。

然后将在存在选择剂的条件下生根，形成小植物的转化体幼苗，转移到土壤中或其它生根培养基中。这些过程非常依赖于所使用的具体植物品种，本专业人员都熟知这样的变种。

4.类胡萝卜素的回收

用本专业技术人员熟知的，适合于特殊转化高等植物的方法，培植本发明的含有整合启动子的植物，该启动子能驱动基因编码转运肽-八氢番茄红素合成酶嵌合多肽。本发明的任何转基因植物都能被培植，从而分离出它们包含的所需要的类胡萝卜素产物。

在培植之后，从该转基因植物能够收获回收类胡萝卜素产物。这种收获步骤可以是收获整个植物，或仅仅收获该植物产生含有有色类胡萝卜素的贮藏器官如果实、块茎或根。这种收获步骤或者会毁了整株植物，或者如果被收获的仅仅是该转基因植物的非主要部分如果实，则可保留植物继续生长。

在优选的实施方案中，这种收获过程另外还包括如下步骤：

(i)至少将转基因植物含有有色类胡萝卜素的部分作匀浆，生产植物匀浆，并且直接利用该含有类胡萝卜素的匀浆以干燥的颗粒或小片作为动物(包括人)的食物，或者

(ii)从此植物匀浆中提取有色类胡萝卜素，优选的是在干燥片提取，用适当的溶剂如有机溶剂，或者借助于超临界萃取法〔Favati等，J.Fool Sci.53：1532(1988)和其中引用的文献〕产生含有类胡萝卜素的液体溶液或悬液，以及

(iii)从该溶液或悬液中分离出有色类胡萝卜素。

在上述步骤(iii)中分离出的有色类胡萝卜素通常至少是α-或β-胡萝卜素，虽然产生的其它有色类胡萝卜素也能被分离和分开，如在下文所述。

含有提高含量的有色天然类胡萝卜素的贮藏器官，如胡萝卜的根，本身将被吃掉，则只需要通常的收获过程。存在提高含量的有色天然类胡萝卜素，将对食品提供更诱人的颜色，并且还可以通过类胡萝卜素抗氧化剂的特征，提供更长的贮藏期。

当有色类胡萝卜素需要以纯的或较浓缩的形式获得，则可用本专业技术人员熟知的方法，将转基因植物的至少某一适当的部分作匀浆，产生植物匀浆。这种匀浆化过程可以手工进行，也可以用机器，或者只要将该转基因植物各部分打碎成小片，则可用化学方法作匀浆，产生植物匀浆。这种植物匀浆是由希望得到的有色天然类胡萝卜素混合物，残存量的前体物，细胞颗粒和胞液内含物组成。这种肉浆可以被干燥并压缩成颗粒或小片，或被吃掉而得到好处，或者，可以对这种匀浆进行提取。

可以从上述产生的植物匀浆中提取有色的天然类胡萝卜素如β-胡萝卜素，得到含有β-胡萝卜素的溶液或悬液。这种提取方法是普通的，是本专业技术人员所熟知的。例如，提取步骤可以包括在适合的溶剂中浸泡或浸透植物匀浆。这种适合的溶剂能够溶解或悬浮存在于植物匀浆中的β-胡萝卜素，生成含有β-胡萝卜素的溶液或悬液。对这种提取方法有用的溶剂都是本专业技术人员熟知的，包括水，几种有机溶剂和它们的组合物，例如甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、乙腈、四氢呋喃(THF)、己烷，和三氯甲烷。植物油如花生油、玉米油、大豆油和其它类似的油也可以用于这种提取。当表达是设计在含油的果实如棕榈中进行的时候，收获它本身的油就可以得到类胡萝卜素。

用本专业的技术人员熟知的分离类胡萝卜素的方法，可从上述产生的溶液或悬液中分离出β-胡萝卜素。这些方法包括但不局限于，基于它在各种液体介质中溶解度的纯化技术，层析技术如柱层析，以及其它方法。分离叶黄素通常需要进一步水解叶黄素酯产物，为此可用氢氧化钠的醇溶液。

5.遗传学

用土壤杆菌转化法形成的转基因植物，在一条染色体上典型地含有单基因。可以把这种转基因植物看作是以加入的基因杂合化的。但是，由于使用了名词“杂合化的”通常意味着在染色体对的第二条染色体上的相同基因座存在一个互补的基因，而这里在含有一个附加基因的植物中不存在这样一个基因，可以认为，对这样一种植物更准确的名称应该是独立的分离子，因为在有丝分裂和减数分裂过程中，这种加入的外源性非高等植物基因会自由分离。含有器官增强启动子的转基因植物，即独立的分离子是优选的转基因植物，其中启动子能驱动编码具有八氢番茄红素合成酶活性的嵌合多肽和其转运肽的单结构基因。

更优选的是以加入的结构基因杂合化的转基因植物，即转基因植物含有两个加入的基因，一个基因是位于染色体对与每条染色体上的相同的基因座。可以通过使含有单加入基因的独立分离子转基因植物有性结合(自花受精)来得到杂合性的转基因植物，使产生的一些种子萌发，对所产生的植物分析其提高的八氢番茄红素合成酶活性，提高的有色类胡萝卜素的积累，或同时分析二者，并与对照植物(天然的非转基因植物)或独立分离子转基因植物进行比较。当与天然的非转基因植物和独立分离子转基因植物相比较时，杂合性转基因植物显示出提高的八氢番茄红素合成酶活性和提高的有色类胡萝卜素积累。

应该理解，两株不同的转基因植物也可以使之交配产生含有两个独立分离的附加的外源(异源)基因的后代。以适当的子代自花受精可以产生对两个加入的外源基因都是纯合的植物，此基因能编码具有八氢番茄红素合成酶活性的嵌合多肽。还试图进行对母本植物回交和与非转基因植物以进行异型杂交。

因此，本发明的转基因植物具有异源结构基因，此基因能编码含有嵌合质体转运肽的，具有八氢番茄红素合成酶活性的多肽。优选的转基因植物是加入的异源八氢番茄红素合成酶结构基因和转运肽基因的独立分离子，并且能够将这些基因和它们的活性传递给它的子代，更优选的转基因植物对那些异源基因是纯合的，并以通过有性结合将那些基因传递给它的所有后代。

试图得到的转基因植物与同类型或同品系的非转化植物相比较，与此二种植物在同样的条件下培植时，能积累更大量的有色天然类胡萝卜素。与非转化植物相比较，积累的提高可以大约是1.5-20倍，通常是大约2-10倍。形成的类胡萝卜素是前述的天然类胡萝卜素，并同时形成了八氢番茄红素，与其它天然类胡萝卜素相比，存在量通常都较小。

在此所用的术语“同类型”或“同品系”，指的是与未转化植物相同的杂交植物，或者是未转化植物的无性繁殖系。如象广泛的近亲交配植物那样，杂交的姐妹株中等位变异很小，则比较可以在姐妹株之间进行，或者同用几个姐妹株得到的平均值作比较。否则，用无性繁殖系作对照是优选的。

6.培育商品杂交种子

将来自转基因植物的种子在野外的温室中或在窗台等地方培育，并将产生的性成熟转基因植物作自花授粉，产生真正的繁殖植物。从这些植物产生的子代可成为用于评价有色天然类胡萝卜素积累的真正的繁殖系，优选地应在野外，在一定的环境条件下培育。

如果可出售许多不同的杂交组合，则能提高具有增加了有色天然类胡萝卜素积累的转基因植物的商业价值。用户可以根据如成熟期、稳定性或其它农艺学特征的差异，代表性地培植几个杂种。此外，由于这样一些特征如成熟度，对疾病和除草剂抗性的差异，适应于某一国家一部分地区的杂种，不一定适应于另一地区。由于这个原因，优选地是在大量的亲本品系中培育有色天然类胡萝卜素的积累，这样可产生很多杂种组合。

通过本专业人员熟知的多种技术，可以实现把提高有色天然类胡萝卜素积累的特性加到一个农艺学优秀的品系中。例如，可以将具有如下特征的亲本转基因植物，同具有其它一些理想特征如对除草剂抗性的品系杂交，产生杂种，该亲本转基因植物或者是纯合的，或者含有能编码具有八氢番茄红素合成酶活性的嵌合多肽的单个独立可分离基因，而因此可用于在希望的器官中提高有色类胡萝卜素的积累。优选的是，将提高了有色类胡萝卜素积累的纯合转基因植物用于产生杂种。

例如，可将提高了有色天然类胡萝卜素积累的纯合的转基因植物，同具有其他理想特性的亲本植物杂交。将此杂合的，或者其提高的有色类胡萝卜素的积累是自由可分的子代，同各种亲本回交，得到具有提高有色天然类胡萝卜素积累和其它理想特性的转基因植物。子代同亲本的回交可能必须重复一次以上，以使得到具有全部理想特性的转基因植物。实施例1：在高等植物中八氢番茄红素合成酶的产生

a.构建质粒

为了对下面的聚合酶链反应(PCR)提供适合的模板，首先构建了质粒pARC283。构建质粒pARC283用了质粒pARC376大约1547bp的BglII至BamHI部分消化分段(从图2的大约位置6900到大约位置5353)。使含有多个独特限制性位点的多接头片段，与这种BglII-BamHI片段的末端连接。将产生的片段用EcoRI消化，并克隆进入质粒pBR322的EcoRI位点。这样产生的质粒被定名为pARC283。

对此质粒的八氢番茄红素合成酶结构基因进行修饰，在基因3′末端的甲硫氨酸起始密码子和SalI限制性位点，导入限制性位点SphI。为了实现这些修饰，可先从质粒pARC283切取EcoRI-EcoRI片段，再将这种片段借助琼脂糖凝胶电泳分离。并用作PCR的模板。如下的寡核苷酸探针可用于在八氢番茄红素合成酶基因的ATG起始密码子产生SphI位点：5′TCG CAT GCG CCA ACG CCG CIG CTT GAC CAC GC 3′

Sph I (SEQ ID NO：3)其中粗体字母表明是改变了的核苷酸。这种修饰使显示在SEQ ID NO：1中的第二个残基从丝氨酸变为精氨酸，借此产生了编码各种草生欧文氏杆菌八氢番茄红素合成酶的基因。

通过类似的PCR技术，在八氢番茄红素合成酶基因的3′末端导入SalI位点，改变了DNA序列，如下面所示：原来的序列：5′GAC GTA GAG CCG CTT CAG GTA GCC CCG GCG 3′

(SEQ ID NO：4)新序列：

SalI5′GAC GTA GAG CCG CTC CGT AGC CGT CGG GTC GAC

(SEQ ID NO：5)新序列中的粗体字母指明是改变了的碱基。

尽管PCR探针只有15个核苷酸与原来的3′序列精确地杂交，但是这种进行PCR的杂交条件，使此杂交量足以让PCR适当地发挥功能，导入在序列中标明的改变。

将探针再悬浮于一定体积的无菌水中，使每种探针的最后浓度为10pmol/μl。如下所述进行PCR反应。

用GeneAmp DNA扩增试剂盒(Perkin Elmer Cetus)进行此反应。根据厂商说明书规定的用量和顺序，将下列成分混合。

成分加入顺序体积最后浓度

无菌水 1 43.5μl

10XRxn.缓冲液 2 10μl 1X1.25mMdNTP混合 3 16μl 各200μM

物引物1(10pmole/μl) 4 10μl 1μM引物2(10pmole/μl) 5 10μl 1μM

模板DNA 6 10μl 100ng

Taq聚合酶 7 0.5μl 2.5单位

将矿物油(100μl)加在反应混合物的表面，用Perkin Elmer CetusDNA热循环器(扩增仪)(Perkin Elmer，Prairie Clond，MN)进行反应。该方法由25个扩增循环组成。每个循环包括如下过程：(1)在92℃变性1分钟，(2)在37℃模板退火2分钟，(3)在72℃聚合3分钟，

在25个循环的末尾，再在72℃进行最后一次7分钟的聚合。

反应完成后，除去表面的矿物油，用乙醚萃取反应混合物二次，再用乙醇沉淀DNA。

b.克隆PCR产生的DNA片段

用SphI和SalI消化PCR反应产生的DNA。以琼脂糖凝胶分离和回收产生的这种SphI-SalI PCR片段(大约1083bp)。同样用SphI和SalI消化质粒pUC18(Pharmacia)将此SphI-SalI PCR片段克隆进入质粒pUC18的SphI-SalI位点。形成的质粒定名为pATC1611。

c.对基因工程八氢番茄红素合成酶基因的功能验证

可通过将PCR修饰的基因克隆进入E.coli表达载体，对质粒pATC1611的八氢番茄红素合成酶基因的特有功能进行检验。具体做法是，首先用HindIII和Eco-RI消化质粒pATC1611。以琼脂糖凝胶分离和回收产生的HindIII-Eco-RI片段，再用DNA聚合酶I的Klenow片段和4个脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)处理，补平其末端形成平末端。

然后将此平末端片段克隆进入质粒pDR540(Pharmacia)，这是一个E.coli中的含有TAC启动子活性的质粒。这样，可用BamHI切割质粒pDR540，并同上用Klenow片段和4个dNTPs补平其末端。使现在为平末端的原来含有八氢番茄红素合成酶基因的HindIII-EcoRI片段与BamHI处理的pDR540平末端连接。用HindIII切割这种质粒结构，可得到含有八氢番茄红素合成酶和TAC启动子的HindIII-HindIII片段。然后将此HindIII-HindIII片段连接于质粒pARC139的HindIII位点。

质粒pARC139在其八氢番茄红素合成酶基因内具有缺失。将八氢番茄红素合成酶基因的功能性拷贝加入到质粒pARC139中，可恢复以这样一种结构转化的E.coli细胞产生有色类胡萝卜素的能力。PCR修饰的八氢番茄红素合成酶基因可导致在以质粒pARC139转化的E.coli中产生有色类胡萝卜素，这表明，通过PCR法导入基因的修饰作用，不会影响从被修饰的基因产生八氢番茄红素合成酶。

d.构建质粒pATC1614

用SphI和HincII消化质粒pATC1611。将生成的SphI-HincII片段克隆进入质粒pATC212的SphI和HincII位点，产生质粒pATC1614。质粒pATC212含有RUBISCO转运肽，可按如下构建。

(i)RUBISCO转运肽

在此所用的示例性转运肽DNA序列，基本是Mezur等，Nucl.AcidsRes.13：2343-2386(1985)报导的烟草(Nicotiana tabacum)核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶信号肽DNA序列。对此公开的177bp的序列作了二处改变。

第一处改变是在5′端加入胞嘧啶核苷酸，产生一个NcoI限制性位点。第二处改变是在碱基位置73和74之间断开，插入一个NarI位点。这种改变是在位置69以G取代T，在位置72以G取代A，这二种改变都保持了编码的氨基酸残基序列未改变。删去3′末端的最后两个残基可得到通常的SphI限制性位点粘性末端。

因此合成的编码转运肽的DNA也含有177个bp。显示5′NcoI和3′SphI粘性末端的单链编码序列。在下文SEQ ID NO：6中说明。

(ii)质粒pARC480

编码转运肽的DNA可由八个片段人工合成，将这些片段通过在90℃加热5分钟后在一起退火成对，然后缓慢地冷却至室温。每个片段用50pmol。此操作方法在已公开的专利WO91/13078(PCT/US91/01458)第138-140中作了描述，在此不必叙述。

将生成的177个碱基对片段克隆进入质粒pARC466中。质粒pARC466是一种与M13mp19相同的质粒，不同的只是以NcoI位点取代了天然的HindIII位点。此质粒含有包括SmaI位点的多接头区，此SmaI位点位于SphI位点的下游。

质粒pARC466中的NcoI位点，可用前述的体外诱变法，通过取代原有的HindIII位点来产生。所用的引物是：

NcoI5′CCT GCA GGC ATC CAA CCA TGG CGT AAT CAT GGT CAT 3′

(SEQ ID NO：7)其中粗体字母标明序列中的改变。

用NcoI和SphI消化质粒pARC466。为了能克隆进入这些位点，对此177bp的转运肽DNA片段的末端进行了设计。此177碱基对片段结合进入质粒pARC466，形成了质粒pARC480。通过M13方案对质粒pARC480进行测序，检查设计的肽序列，看哪个序列正确。

(iii)质粒pATC212

将此转运肽DNA片段移入含有植物启动子和终止序列的质粒中。pCaMVCN是一种由Pharmacia供应的质粒，它含有花椰菜花叶病毒35S启动子和nos多聚腺苷酸化序列。按如下方法将此转运肽DNA片段克隆在紧邻CaMV35启动子之后：

(a)用限制酶ShalI消化质粒pCaMVCN。用SalI消化来源于New England Biolabs d(TCGACCCGGG)的接头#1104，然后与消化的pCaMVCN连接，产生质粒pATC209。

(b)用Sma I消化质粒pATC209。用NcoI和SmaI消化质粒pARC480，取出转运肽DNA片段。用E.coli DNA聚合酶的Klenow片段和4个dNTPs处理该转运肽DNA的NcoI位点，产生了一个使该片段能与质粒pATC209的SmaI位点匹配的平末端。将此双平末端片段克隆进入SmaI消化的质粒pATC209，产生质粒pATC212。

e.构建质粒pATC920

按照厂商的说明书，用限制性酶SphI和SalI(Bethesda ResearchLaboratories[BRL]，Gaithersburg，MD)消化质粒pARC1614。将载体pGEM4Z(Promega Corp，Madison，WI)也用SphI和SalI消化，并与来自pARC1614的SalI-SphI片段(约1083bp)连接。(随后发现在上述两个反应中，SphI酶无活性，因此确实的结果似乎是DNA样品仅被SalI消化了，即来自pARC1614的1240bp的SalI-SalI片段结合进了SalI消化的pGEM4Z)。这个新构建物被称为质粒pATC915。

用dsDNA循环测序系统(BRL)，以来源于Promega的T7和Sp6启动子-引物，对插入的DNA部分序列进行测定。从插入片段的每个末端开始，大约测定了序列的230bp。这证实了作为草生欧文氏杆菌八氢番茄红素合成酶变异体的克隆与来自在紧靠上游插入的烟草核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亚单位(RUBISCO)的转运肽具有同一性，图3中显示了pATC915质粒图。

通过在载体多接头区中加入的限制性酶位点，可以简化对来自质粒pATC915的八氢番茄红素合成酶插入物的随后处理。但是，原来的载体(pGEM4Z)在紧邻HindIII位点的位置56，含有SphI位点。因为对SphI的识别序列含有“GCATG”，所以在RUBISCO转运肽真“ATG”的上游加入了一个附加的“假”起始密码子。最好的情况是，这将增加对需要产物的表达水平，而最坏的情况是，可能完全抑制表达。为了消除这个问题，构建了一个修饰的克隆载体，其中用XhoI位点代替了SphI位点，在其识别序列中不含有“ATG”。将载体pGEM4Z用BamHI和HindIII消化，并通过琼脂糖凝胶电泳纯化，除去多接头的小片段。然后将其大片段与下面SEQ ID NO：8和9的一对合成的寡核苷酸序列连接，再生了仅以XhoI位点代替了SphI位点的多接头区。形成的载体被称为pGEM4ZX。

(SEQ ID NO：8)5′-GATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGCTCGAGA-3′

3′-GAGATCTCAGCTGGACGTCGAGCTCTTCGA-5′

(SEQ ID NO：9)

将pARC1614的大约1260SalI-SalI片段(含有RUBISCO转运肽和八氢番茄红素合成酶基因)，连入SalI消化的pGEM4ZX中。使新载体被称为质粒pATC920。图4显示了pATC920质粒图。实施例2：根增强启动子

从Purdue大学的Dr.S.Gelvin〔DiRita and Gelvin，Mol.Gen.Genet，207：233-241(1987)〕得到了甘露品(mannopine)合成酶基因启动子。该论文的载体(pKan2)含有-318 AmasPmas(mas)激活物-启动子结构，它能够作为XhoI-XbaI片段被取出。将此片段结合到已用SalI和XbaI消化的pGEM4Z(Promega corp.)中。形成的结构被称为质粒pmas4Z。用dsDNA循环测序系统(BRL)，以来自Promega的T7的Sp6启动子-引物，对插入物的序列进行测定。在图5中显示了pmas4Z质粒图。

通过用XbaI和HindIII消化，从pmas4Z中取出mas启动子(MASPROM)，并通过用XbaI和HindIII消化，从pATC909(图6)中取出35S启动子，将二者连接在一起，产生了质粒pATC911(图7)。这个载体含有来自草生欧文氏杆菌的八氢番茄红素脱氢酶基因，它是在带有nos终止子的mas启动子的控制之下。

通过用SalI消化质粒pARC526，从其中取出草生欧文氏杆菌的八氢番茄红素脱氢酶(PDH)基因，并将得到的1508bp的片段结合进入载体pNIU21的XhoI位点，这样构建了质粒pATC909。在Fennell和Hauptmann，Plant Cell Reports，11：567-570(1992)中描述了构建pNIU21的方法。质粒pARC1526含有驱动PDH基因的PGK启动子，PGK终止紧随其后，为另一目的制备了这种质粒。在保藏的质粒载体pARC146D(ATCC40801)中存在相同的PDH 1508bp SalI-SalI片段，在此步骤也可以使用。结果是得到了一个含有在CaMV35S启动子和nos终止子控制下的PDH基因的载体(pATC909)。已注意到，将SalI片段结合进入XhoI位点后没有导致这两个位点再产生。实施例3：根增强启动子/八氢番茄红素合成酶的构成物质粒pATC921

通过二步操作，可从质粒pATC920(图4)中取出连接的多肽转运肽/八氢番茄红素合成酶基因。用HindIII消化该质粒，用DNA聚合酶的Klenow片段和4个dNTPs补平其伸出的末端产生平末端。然后用SacI(promega)消化该质粒，并借助于琼脂糖凝胶电泳分离出1.3kb的基因片段。用XbaI消化载体pATC911(图7)，并以DNA聚合酶Klenow片段和4个dNTPs制成平末端。然后再用SacI消化该质粒，取出八氢番茄红素脱氢酶基因。通过琼脂糖凝胶电泳将形成的载体纯化处理。将质粒pATC920的转运肽(RUBISCO)/八氢番茄红素合成酶基因和已消化分离的载体(pATC911)、连接在一起，产生了含有编码RUBISCO转运肽和八氢番茄红素合成酶基因的质粒，该基因受带有nos终止子的mas启动子(AmasPmas)的控制。这个载体被称为质粒pATC921(图8)。已注意到，在连接了之后，来源于质粒pATC911的XbaI位点被再产生了，但来源于质粒pATC920插入物的HindIII位点没有被再产生。因此，在质粒pATC921的位置2235，HindIII位点是唯一的，使整个基因结构可通过用HindIII和EcoRI消化而被取出的位点。实施例4：双组分质粒(binary plasmid)的构建

1.质粒pATC923

用EcoRI和HindIII消化双组分载体pKYLX71，取出35S启动子。用同样的这个酶消化，从pATC921中取出mas-RUBISCO/八氢番茄红素合成酶-nos终止子结构。将它们结合在一起，产生载体pATC923(图9)。这是一个双组分载体，含有在mas启动子和nos终止子控制下的偶联多肽RUBISCO转运肽-八氢番茄红素合成酶基因，并携带有卡那霉素和四环素二种抗性基因。这种载体适合用于转化根癌土壤杆菌，然后用于转化植物材料。

2.质粒pATC703

按照构建pATC923类似的方法构建双组分载体pATC703。通过用HindIII和EcoRI消化，从pATC921中取出nos-RUBISCO/八氢番茄红素合成酶-nos终止子结构，并将它们结合进入已用此相同的两个酶消化的，可购得的双组分载体pBI101.2中(Clontech Laboratories Inc.Palo Alto，CA)。结果是得到了一个含有在mas启动子控制下的，偶联多肽RUBISCO转运肽和八氢番茄红素合成酶基因的双组分载体。此载体被称为pATC703(图10)，并且它携带有卡那霉素抗性基因。实施例5：转化胡萝卜组织

在单独的研究中分别用质粒pATC923和pATC703通过根癌土壤杆菌转化了Danver Half Long(DHL)胡萝卜的愈伤组织。二种载体的初期结果相类似。下面论述的特异性结果，都是用pATC923转化的愈伤组织得到的，除非另有说明。

a.方法

通常如Scott等，Plant Mol.Biol.8：265-274(1987)所述制备和转化胡萝卜组织，方法稍有改进，简述如下。

在UM培养基(见下面)中制备叶柄、根、或愈伤组织的悬浮培养物。对培养物作二周间隔的传代培养，使培养物在每个培养期的末尾含有大约1.3×10⁶胡萝卜细胞，铺平板单位/ml。用12-16周龄的培养物进行转化，与Scott等所用的8-10周龄的培养物相比较。

用10-14天龄的胡萝卜细胞制备投料培养物(feeder culture)(来自最近的传代物)，通过在以UM或MSD培养基(见下文)配制的0.8％熔化琼脂中，每升琼脂混合大约70ml饲养细胞来制备投料板(feederplate)。使形成的混合物彻底混匀，倒入8.5cm直径的Petri皿中。凝固后，在每块板的上面加上一片8.5cm直径的无菌Whatmann#1滤纸片，随后在上面再加一片5cm直径无菌“转移片(transfer disc)”。将这种制备的投料板在持续光照下，在环境室温下培育3天。

然后以最近一次传代后大约2周的悬浮培养物约0.1-0.2ml，接种转移片。当所用的培养物生长成簇，首先通过60-80目的滤网过滤。然后将此投料板再培育5-7天。

将接种1-2天的根癌土壤杆菌培养物稀释至大约10⁴个细胞/ml，并接种到上述已接种的转移片上。将这些转移片培养大约5-7天，或者直到首次见到根癌土壤杆菌生长物出现为止。将转移片置于选择培养基UMKC或MSDKC(见下述)中，培育2-4周。将在培养末期仍然继续生长的菌落转移至新鲜的选择培养基中。

然后将成胚的愈伤组织转移至无激素的MSKC培养基中进行选择再生长。胚体细胞再培育2-3周以上。当小植物达到大约5-7cm长时，被转移培植在无菌的土壤中，并覆盖保持湿度。

b.培养基

在此所用的培养基是基于Muroshige和Skoog(MS)的基础盐混合物(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO；分类号No.M5524)。

培养基MSD成分如下：

按说明书稀释的MS盐；

3％蔗糖；

1ml/L Gamburgs维生素B5(Sigma G1019)；

2，4-二氯苯氧基乙酸(2.4-D)@2mg/L；

8g/L Difco琼脂；

pH＝5.8。

UM培养基含有所有的MSD成分加下列成分：

激动素@0.25mg/L；

酪蛋白水解物(酶催化)@2g/L；

甘氨酸@2mg/L。

KC培养基是上面两个培养基加上最后浓度为100mg/L的卡那霉素(K)和最后浓度为250mg/L的头孢噻肟(C)。如果出现根癌土壤杆菌过度生长的问题，则该选择培养基中还要加入羧苄青霉素，最后浓度为400-500mg/L。

C.结果

通过卡那霉素抗性对转化组织进行选择。分离的愈伤组织颜色范围从深橙色到显现出接近对照的颜色。根据颜色的均一性，对愈伤组织作进一步选择和传代。异基因的愈伤组织常常具有被浅色愈伤组织环绕的鲜艳橙色。这种不同的颜色反映出植物转化中通常见到的称为“位置效应”的现象，这种效应导致在具有不同转录活性的染色体区域内插入基因。区域越活跃，转基因过程也越活跃。结果，每个独立的转化体，以不同的水平表达一个基因。

在从深黄色转化体再生的植物中，小植物的颜色是黄色，表明八氢番茄红素合成酶基因，在叶组织中正在以干扰光合作用的水平进行表达。在从浅黄色转化体再生的植物中，小植物的茎和根中，具有绿色带鲜艳橙色的尖端。当植物开始成熟，不同的基因开始表达，植物开始具有正常的外观，根中类胡萝卜素的产量提高了。实施例6：在窗台上培育再生体

将来自如上愈伤组织研究的再生转基因胡萝卜(DHL-PS)，再生的对照(天然)胡萝卜(DHL)和从Wisconsin高β-胡萝卜素变种再生的胡萝卜HCM，在窗台上进行培植，就生长习性和叶片的外观而言，它们都具有相似的表观。在此HCM是一个普遍可得到的变种，是通过USDA育种程序得到的。某些转化的DHL植株表现出明显的黄色和斑纹。对根的重量也作了比较，DHL对照植株产生38.6g的根，DHL-PS植株产生37.5g的根，HCM植株产生30.75g的根，数据是基于新鲜根组织的重量。所有这些再生体都显示出普遍可见的根形状不正常，是由于损伤了由组织培养再生而得到的分支根分生组织。在由再生体种子产生的胡萝卜植株中，这些根形状异常消失了。

将来自所有这些植株的根，在其中部作横切。对照DHL的根具有浅绿色的中心区，而转化的DHL-PS，整个切面都是紫色/橙色。HCM变种根以整个颜色比DHL-PS的根更深。

对照DHL和转化DHL-PS根之间的颜色差异表明，根增强八氢番茄红素的产生，导致了增强有色类胡萝卜素的产生。转基因胡萝卜根更均匀的颜色，也给喜欢均匀颜色胡萝卜根的商品生产者提供了利益。

下面表1显示来自窗台培植胡萝卜根的类胡萝卜素的产量。数据是以干重的百分数表示，其中“增加倍数”是由测定的类胡萝卜素总量相对于天然DHL根而确定的。

表1

在窗台上培植再生的转基因和非转

基因胡萝卜根中，产生的类胡萝卜素

α-胡 β-胡八氢番玉米黄质增加植株萝卜素萝卜素茄红素或叶黄素总重倍数DHL 0.0203 0.0283 0.0025 0.0093 0.0604 1(对照)DHL-PS 0.0638 0.0638 0.0133 0.0115 0.1569 2.6(转基因的)HCM 0.1510 0.1273 0.0123 0.0065 0.2971 4.9(对照)

从上述结果可见，通过增强八氢番茄红素合成酶的表达，并因此增强了对八氢番茄红素的表达，使所有的类胡萝卜素都增加了。转基因植物(DHL-PS)中的有色类胡萝卜素，比天然的非转化植物(DHL)，增加了大约24倍。实施例7：在温室中培育的再生体

在上面的研究中，产生了200多株转基因DHL-PS胡萝卜素植株。将许多这种植株，转移到温室中同再生的DHL植株一起培植。下面的表2表明，从4株再生的对照DHL植株和6株单独的转化体DHL-PS植株的根得到的类胡萝卜素相对于干重的平均百分数(±SD)。最后一项“增加倍数”，是测定的总类胡萝卜素的含量相对于对照DHL根中含量的倍数。以“703号”标明的转基因胡萝卜根，是用质粒pATC703转化的，以“923号”标明的转基因胡萝卜根，是以质粒pATC923转化的。

表 2

在转化和非转化的胡萝卜根中，

类胡萝卜素产量的百分数

α-胡 β-胡八氢番玉米黄质增加植株萝卜素萝卜素茄红素或叶黄素总重倍数对照 0.0076 0.0137 0.0017 0.0024 0.0254 1

(0.0035) (0.0027) (0.0009) (0.0015) (0.0077)转基因的703-2 0.0506 0.0674 0.0145 0.0020 0.1345 5.3703-3 0.0287 0.0450 0.0086 0.0052 0.0875 3.4703-4 0.0170 0.0245 0.0034 0.0030 0.0478 1.9703-5 0.0132 0.0219 0.0039 0.0048 0.0437 1.7923-1 0.0281 0.0338 0.0049 0.0041 0.0710 2.8923-2 0.0496 0.0678 0.0114 0.0060 0.1347 5.3

上面的结果再次表明，通过以具有器官增强启动子/AmasPmas的整合载体转化，从胡萝卜根得到了提高产量的有色类胡萝卜素，该器官增强启动子已有效地与编码嵌合多肽连接物的基因连接，此连接物具有一个N末端质体转运肽RUBISCO，它的C端是与Eh-crtB基因的产物，显示有八氢番茄红素合成酶活性的多肽N端连接。在这些研究中也观察到表达的位置效应。有色类胡萝卜素的增加倍数，比所显示的总类胡萝卜素的增加倍数稍微小点。实施例8：在马铃薯块茎中提高有色类胡萝卜素积累

原先来自Peruvian Andes(88K 3.58)的橙色肉质的马铃薯，在它们的块茎贮藏器官内能产生有色类胡萝卜素如玉米黄质。USDA Dr.CR Brown赠送的马铃薯88K 3.58能产生其重量(干重)的0.0064％玉米黄质，以及少量的叶黄素和其它类胡萝卜素。见Brown等，J.Amer.Soc.Hort.Sci，118(1)：145-150(1993)。

1.质粒pPPR001

质粒pPPR001含有马铃薯糖蛋白启动子，是由加拿大Albany西部研究中心农业研究所，USDA的Dr.W.Belknap构建，并从其得到这种质粒。简单地说，马铃薯糖蛋白启动子是通过聚合酶链反应(PCR)，在相应于Genbank序列STPATG1(保藏号：X03956)位置1271至2309的序列区域上合成的。所用的PCR引物把HindIII位点加到分子的5′端和3′端的SmaI位点。将得到的约1.05kb PCR片段结合进入已预先用HindIII和SmaI消化的质粒pUC19中，形成新质粒pPPR001，它被图解显示在图11中。

2.质粒pATC954

将前述的质粒pATC921用XhoI消化，以Klenow片段和四个dNTP补平，然后再用EcoRI消化，结果可取出一个大约1.56kb的DNA片段，它含有RUBISCO转运肽和八氢番茄红素合成酶基因和胭脂碱合成酶(nos)聚腺苷酸化信号(终止子)。将此片段结合进入已预先用EcoRI和SmaI消化的质粒pPPR001中，形成的质粒被定名为pATC954，被图解显示在图12中。这些程序再生了原来存在于pATC921中的XhoI位点，而没有再生质粒pPPR001的SmaI位点。

3.质粒pATC956

用EcoRI和HindIII消化质粒pATC954，得到一个大约2.6kb的DNA片段，它含有马铃薯糖蛋白启动子，嵌合RUBISCO/八氢番茄红素合成酶多肽连接物的基因，和nos终止子。将此2.6kb片段结合进入用于制备质粒pATC703的，并已用EcoRI和HindIII酶切的双组分质粒pBI101.2中。形成的载体被称为质粒pATC956，被图解显示在图13中。质粒载体pATC956可用于转染进入根癌土壤杆菌，随后可用于转染在其块茎中能产生有色类胡萝卜素的马铃薯植株如88K3.58。

用88K3.58马铃薯愈伤组织进行这种转化作用，并如Twell等所述再生植株，得到了在生长特性和形态学都看来正常的植株，并能产生块茎。这样产生的转化体块茎，相对于在同样条件下生长的未转化植株，显示出有色类胡萝卜素的积累提高。

上面的说明和实施例是例示性的，而不是作为限制。在本发明的精神和范围内，还可能存在其它变化的形式，它们对于本领域的专业人员是显而易见的。

序列表

(1)一般资料：

(i)申请人：Amoco 公司

(ii)发明题目：在基因工程植物贮藏器官中增加类胡萝卜素的积累

(iii)序列数：9个

(iv)通讯地址：

(A)地址：Amoco Corporation，Law Dept

(B)街名：200 East Randolph Drive

(C)城市：Chicago

(D)州：IL

(E)国家：USA

(F)zip：60680-0703

(v)计算机可读形式：

(A)媒体类型：软盘

(B)计算机：IBM PC兼容机

(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：Patent In Release#1.24

(vi)现有的申请数据：

(A)申请号：

(B)申请日期：

(C)分类号：

(viii)律师/代理人资料：

(A)姓名：Galloway，Norval B

(ix)电讯资料：

(A)Tel：7082717400

(B)FAX：7082717428

(2)SEQ ID NO：1的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：1083个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链数：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组DNA)

(xi)序列描述；SEQ ID NO：1：GCATGAGCCA ACCGCCGCTG CTTGACCACG CCACGCAGAC CATGGCCAAC GGCTCGAAAA60GTTTTGCCAC CGCTGCGAAG CTGTTCGACC CGGCCACCCG CCGTAGCGTG CTGATGCTCT120ACACCTGGTG CCGCCACTGC GATGACGTCA TTGACGACCA GACCCACGGC TTCGCCAGCG180AGGCCGCGGC GGAGGAGGAG GCCACCCAGC GCCTGGCCCG GCTGCGCACG CTGACCCTGG240CGGCGTTTGA AGGGGCCGAG ATGCAGGATC CGGCCTTCGC TGCCTTTCAG GAGGTGGCGC300TGACCCACGG TATTACGCCC CGCATGGCGC TCGATCACCT CGACGGCTTT GCGATGGACG360TGGCTCAGAC CCGCTATGTC ACCTTTGAGG ATACGCTGCG CTACTGCTAT CACGTGGCGG420GCGTGGTGGG TCTGATGATG GCCAGGGTGA TGGGCGTGCG GGATGAGCGG GTGCTGGATC480GCGCCTGCGA TCTGGGGCTG GCCTTCCAGC TGACGAATAT CGCCCGGGAT ATTATTGACG540ATGCGGCTAT TGACCGCTGC TATCTGCCCG CCGAGTGGCT GCAGGATGCC GGGCTGACCC600CGGAGAACTA TGCCGCGCGG GAGAATCGGG CCGCGCTGGC GCGGGTGGCG GAGCGGCTTA660TTGATGCCGC AGAGCCGTAC TACATCTCCT CCCAGGCCGG GCTACACGAT CTGCCGCCGC720GCTGCGCCTG GGCGATCGCC ACCGCCCGCA GCGTCTACCG GGAGATCGGT ATTAAGGTAA780AAGCGGCGGG AGGCAGCGCC TGGGATCGCC GCCAGCACAC CAGCAAAGGT GAAAAAATTG840CCATGCTGAT GGCGGCACCG GGGCAGGTTA TTCGGGCGAA GACGACGAGG GTGACGCCGC900GTCCGGCCGG TCTTTGGCAG CGTCCCGTTT AGGCGGGCGG CCATGACGTT CACGCAGGAT960CGCCTGTAGG TCGGCAGGCT TGCGGGCGTA AATAAAACCG AAGGAGACGC AGCCCTCCCG1020GCCGCGCACC GCGTGGTGCA GGCGGTGGGC GACGTAGAGC CGCTCCGTAG CCGTCGGGTC1080GAC1083

(2)SEQ ID NO：2的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：309氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：

Met Arg Gln Pro Pro Leu Leu Asp His Ala Met Gln Thr Met AlaAsn

1 5 10 15

Gly Ser Lys Ser Phe Ala Thr Ala Ala Lys Leu Phe Asp Pro AlaThr

20 25 30

Arg Arg Ser Val Leu Met Leu Tyr Thr Trp Cys Arg His Cys AspAsp 35 40 45

Val Ile Asp Asp Gln Thr His Gly Phe Ala Ser Glu Ala Ala AlaGlu

50 55 60

Glu Glu Ala Thr Gln Arg Leu Ala Arg Leu Arg Thr Leu Thr LeuAla

65 70 75 80

Ala Phe Glu Gly Ala Glu Met Gln Asp Pro Ala Phe Ala Ala PheGln

85 90 95

Glu Val Ala Leu Thr His Gly Ile Thr Pro Arg Met Ala Leu AspHis

100 105 110

Leu Asp Gly Phe Ala Met Asp Val Ala Gln Thr Arg Tyr Val ThrPhe

115 120 125

Glu Asp Thr Leu Arg Tyr Cys Tyr His Val Ala Gly Val Val GlyLeu 130 135 140

Met Met Ala Arg Val Met Gly Val Arg Asp Glu Arg Val Leu AspArg

145 150 155160

Ala Cys Asp Leu Gly Leu Ala Phe Gln Leu Thr Asn Ile Ala ArgAsp

165 170 175

Ile Ile Asp Asp Ala Ala Ile Asp Arg Cys Tyr Leu Pro Ala GluTrp

180 185 190

Leu Gln Asp Ala Gly Leu Thr Pro Glu Asn Tyr Ala Ala Arg GluAsn

195 200 205

Arg Ala Ala Leu Ala Arg Val Ala Glu Arg Leu Ile Asp Ala AlaGlu

210 215 220

Pro Tyr Tyr Ile Ser Ser Gln Ala Gly Leu His Asp Leu Pro ProArg

225 230 235240

Cys Ala Trp Ala Ile Ala Thr Ala Arg Ser Val Tyr Arg Glu IleGly

245 250 255

Ile Lys Val Lys Ala Ala Gly Gly Ser Ala Trp Asp Arg Arg GlnHis

260 265 270

Thr Ser Lys Gly Glu Lys Ile Ala Met Leu Met Ala Ala Pro GlyGln

275 280 285

Val Ile Arg Ala Lys Thr Thr Arg Val Thr Pro Arg Pro Ala GlyLeu

290 295 300

Trp Gln Arg Pro Val

305

(2)SEQ ID NO：3的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：32个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链数：单股

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组DNA)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：

TCGCATGCGC CAACGCCGCT GCTTGACCAC GC 32

(2)SEQ ID NO：4的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：30个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链数：单股

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组DNA)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：

GACGTAGAGC CGCTTCAGGT AGCCCCGGCG 30

(2)SEQ ID NO：5的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：30个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链数：单股

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组DNA)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：

GACGTAGAGC CGCTCCGTAG CCGTCGGGTC GAC 33

(2)SEQ ID NO：6的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：177个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链数：单股

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组DNA)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：

ATGGCTTCCT CAGTTCTTTC CTCTGCAGCA GTTGCCACCC GCAGCAATGT TGCTCAAGCT

60

AACATGGTGG CGCCTTTCAC TGGCCTTAAG TCAGCTGCCT CATTCCCTGT TTCAAGGAAG

120

CAAAACCTTG ACATCACTTC CATTGCCAGC AACGGCGGAA GAGTGCAATG CATGCAG

177

(2)SEQ ID NO：7的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：36个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链数：单股

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组DNA)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：

CCTGCAGGCA TCCAACCATG GCGTAATCAT GGTCAT 36

(2)SEQ ID NO：8的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：30个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链数：单股

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型： DNA(基因组DNA)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：

GATCCTCTAG AGTCGACCTG CAGCCTCGAGA 30

(2)SEQ ID NO：9的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：30个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链数：单股

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组DNA)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：

AGCTTCTCGA GCTGCAGGTC GACTCTAGAG 30

Claims

1.一种在转基因高等植物的预选的贮藏器官中提高有色天然类胡萝卜素积累的方法，其中提高的积累是与同类型非转化植物的该贮藏器官中这种有色天然类胡萝卜素的积累相比较而言的，并且这两种植物是在同样的条件下生长的，此方法包括生长转化植物使所述预选的贮藏器官成熟的步骤，所述转基因植物的基因组含有(i)编码嵌合多肽连接物的DNA区段，(ii)与此DNA区段有效连接的启动子DNA区段，它能在转基因植物的预选的贮藏器官内驱动贮藏器官增强该嵌合多肽连接物的表达，此嵌合多肽连接物具有N末端质体转运肽部分，该部分的C末端以肽键与非高等植物八氢番茄红素合成酶的N末端相连接。

2.权利要求1的方法，其中预选的贮藏器官选自：根、种子、块茎和果实。

3.权利要求1的方法，其中植物选自：马铃薯、番茄、胡萝卜、甜瓜、南瓜、红番石榴、西番莲果、芒果、红番木瓜、鳄梨、樱桃、红桔、柑桔、棕榈、黄瓜、杏、桃和玉米。

4.权利要求1的方法，其中质体转运肽部分选自：烟草RUBISCO、矮牵牛EPSP合成酶和胡椒PSY_基因转运肽。

5.权利要求1的方法，其中启动子是根或块茎增强启动子，所述预选的贮藏器官分别是根或块茎。

6.权利要求5的方法，其中根增强启动子选自：mas、油菜伸展蛋白、玉米金属硫蛋白样蛋白、含ASF-2结合位点的rbcs-3A和CAMV35S启动子的碱基对-90到+8。

7.权利要求5的方法，其中块茎增强启动子是马铃薯糖蛋白启动子。

8.权利要求1的方法，其中嵌合多肽连接物包含由草生欧文氏杆菌的crt B基因编码的八氢番茄红素合成酶。

9.一种在转基因植物的预选的贮藏器官中，提高有色天然类胡萝卜素的积累的方法，此提高的积累是相对于同类型非转化植物的该器官中有色天然类胡萝卜素的积累而言的，并且这两种植物是在同样的条件下生长的，此方法包括如下步骤：

(a)使转基因植物组织再生成转基因植物，该转基因植物组织是以重组DNA分子转化的植物组织，此重组DNA分子包括一个基因组整合表达载体，它已有效地连接了(i)编码嵌合多肽连接物的DNA区段，和(ii)驱动贮藏器官增强该嵌合多肽连接物表达的启动子DNA区段，这种表达是在由转基因植物组织再生的转基因植物的预选的实心贮藏器官中进行的，其中嵌合多肽连接物具有N末端质体转运肽部分，它的C末端连接于非高等植物八氢番茄红素合成酶的N末端；以及

(b)生长转基因植物使该贮藏器官成熟。

10.权利要求9的方法，其中贮藏器官选自：根、种子、块茎和果实。

11.权利要求9的方法，其中植物选自：马铃薯、番茄、胡萝卜、甜瓜、南瓜、红番石榴、西番莲果、芒果、红番木瓜、鳄梨、樱桃、红桔、柑桔、棕榈、黄瓜、杏、桃和玉米。

12.权利要求9的方法，其中质体转运肽部分选自：烟草RUBISCO、矮牵牛EPSP合成酶和胡椒PSY基因转运肽。

13.权利要求9的方法，其中启动子是根或块茎增强启动子，所述预选贮藏器官分别是根或块茎。

14.权利要求13的方法，其中根增强启动子选自：mas、油菜伸展蛋白、玉米金属硫蛋白样蛋白、含ASF-2结合位点的rbcs-3A和CAMV35S启动子的碱基对-90到+8。

15.权利要求13的方法，其中块茎增强启动子是马铃薯糖蛋白启动子。

16.权利要求9的方法，其中嵌合多肽连接物包含由草生欧文氏杆菌的crt B基因编码的八氢番茄红素合成酶。

17.一种在转基因植物的预选的贮藏器官中，提高有色天然类胡萝卜素的积累的方法，其中提高的积累是与同类型非转化植物的该贮藏器官中这种有色天然类胡萝卜素的积累相比较而言的，并且这两种植物是在同样的条件下生长的，此方法包括如下步骤：

(a)通过以重组DNA分子对在预选的贮藏器官中积累有色类胡萝卜素的植物组织进行基因组转化，来形成转基因植物组织，该重组DNA分子包含整合载体，该载体已有效地连接了(i)编码嵌合多肽连接物的DNA区段，和(ii)驱动贮藏器官增强该嵌合多肽连接物表达的启动子DNA区段，这种表达是在由转基因植物组织再生的转基因植物的预选的贮藏器官中进行的，其中嵌合多肽连接物具有N末端质体转运肽部分，该部分的C末端连接于非高等植物八氢番茄红素合成酶的N末端；

(b)使该转基因植物组织再生成为具有贮藏器官的转基因植物；

(c)生长该转基因植物使预选的贮藏器官成熟。

18.权利要求17的方法，其中贮藏器官选自：根、种子、块茎和果实。

19.权利要求17的方法，其中有色类胡萝卜素是胡萝卜素或叶黄素。

20.权利要求17的方法，其中植物组织是从选自下列种类的植物中得到的：马铃薯、番茄、胡萝卜、甜瓜、南瓜、红番石榴、西番莲果、芒果、红番木瓜、鳄梨、樱桃、红桔、柑桔、棕榈、黄瓜、杏、桃和玉米。

21.权利要求17的方法，其中质体转运肽部分选自：烟草RUBISCO、矮牵牛EPSP合成酶和胡椒PSY基因转运肽。

22.权利要求17的方法，其中启动子是根或块茎增强启动子，所述预选的贮藏器官分别是根或块茎。

23.权利要求22的方法，其中根增强启动子选自：mas、油菜伸展蛋白、玉米金属硫蛋白样蛋白、含ASF-2结合位点的rbcs-3A和CAMV35S启动子的碱基对-90到+8。

24.权利要求22的方法，其中块茎增强启动子是马铃薯糖蛋白启动子。

25.权利要求17的方法，其中嵌合多肽连接物包含由草生欧文氏杆菌的crt B基因编码的八氢番茄红素合成酶。

26.一种在转化的胡萝卜的根中提高胡萝卜素和叶黄素积累的方法，所述胡萝卜当其为非转化植物时，就能在根中积累胡萝卜素或叶黄素，该方法包括如下步骤：

(a)通过以重组DNA分子对在根中积累胡萝卜素或叶黄素的胡萝卜组织进行基因组转化，来培育转基因胡萝卜组织，此重组DNA分子包含一个整合载体，它有效地连接了(i)编码嵌合多肽连接物的DNA区段，和(ii)驱动根增强该嵌合多肽连接物表达的mas启动子DNA区段，这种表达是在由转基因胡萝卜组织再生的转基因胡萝卜植株的根中进行的，其中嵌合多肽连接物具有N末端RUBISCO转运肽部分，该部分的C末端连接于草生欧文氏杆菌八氢番茄红素合成酶的N末端；

(b)使该转基因胡萝卜组织再生成为有根的转基因胡萝卜植株；知

(c)生长该转基因胡萝卜植株使根成熟。

27.一种转基因植物，它(a)具有编码嵌合多肽连接物的基因组结构基因，(b)并能在预选的贮藏器官中提高有色天然类胡萝卜素的积累，此提高的积累是相对于同类型非转基因植物的该器官中有色天然类胡萝卜素的积累而言的，其中嵌合多肽连接物具有N末端质体转运肽部分，该部分的C末端连接于非高等植物八氢番茄红素合成酶的N末端。

28.权利要求27的转基因植物，其中贮藏器官选自：根、种子、块茎和果实。

29.权利要求28的转基因植物，它是胡萝卜。

30.一种转基因植物，它(a)具有编码嵌合多肽连接物的基因组结构基因，(b)并能在选自根、种子、块茎和果实的预选贮藏器官中提高有色天然类胡萝卜素的积累，此提高的积累是相对于同类型非转基因植物的该器官中的积累而言的，其中嵌合多肽连接物具有N末端质体转运肽部分，该部分的C末端连接于非高等植物八氢番茄红素合成酶的N末端。

31.权利要求30的转基因植物，其中质体转运肽部分是RUBISCO转运肽。

32.权利要求30的转基因植物，其中非高等植物显示的八氢番茄红素合成酶是由草生欧文氏杆菌的crt B基因编码的。

33.权利要求30的转基因植物，其中非转基因植物选自：马铃薯、番茄、胡萝卜、甜瓜、南瓜、红番石榴、西番莲果、芒果、红番木瓜、鳄梨、樱桃、红桔、柑桔、棕榈、黄瓜、杏、桃和玉米。

34.权利要求30的转基因植物，其中有色类胡萝卜素选自胡萝卜素和叶黄素。

35.一种转基因胡萝卜，它(a)具有编码嵌合多肽连接物的基因组结构基因，(b)并能在根中提高胡萝卜素或叶黄素的积累，此提高的积累是相对于同类型非转基因胡萝卜的积累而言的，所述嵌合多肽连接物具有N末端RUBISCO转运肽部分，该部分的C末端连接于草生欧文氏杆菌八氢番茄红素合成酶的N末端。

36.一种转基因植物的种子，它能够萌发形成提高有色天然类胡萝卜素的积累的转基因植物，这种提高的积累是相对于同类型植物和由它们产生的杂种的非转基因植物而言的，该种子含有编码嵌合多肽连接物的基因组基因，此基因已有效地连接于能在由种子培植的植物的预选贮藏器官中驱动贮藏器官增强嵌合多肽连接物表达的启动子，其中嵌合多肽连接物具有N末端质体转运肽部分，该部分的C末端连接于非高等植物八氢番茄红素合成酶的N末端。

37.权利要求34(？)的转基因植物的种子，其中有色天然类胡萝卜素选自胡萝卜素和叶黄素。

38.一种转基因植物的种子，它能萌发形成提高β-胡萝卜素的积累的转基因植物，这种提高的积累是相对于同类型植物和由它们产生的杂种的非转基因植物而言的。

39.权利要求38的转基因植物的种子，它是胡萝卜种子。