JP2001505409A

JP2001505409A - 植物種子中のカロチノイド化合物と特殊油の製造方法

Info

Publication number: JP2001505409A
Application number: JP50991198A
Authority: JP
Inventors: シューメーカー，クリスティン，ケー．
Original assignee: カルジーンエルエルシー
Priority date: 1996-08-09
Filing date: 1997-08-08
Publication date: 2001-04-24
Also published as: EP0925366A1; CA2261577A1; AU4058497A; BR9713462A; CN1227609A; WO1998006862A1

Abstract

(57)【要約】改変されたカロチノイド、脂肪酸およびトコフェロール組成を有する植物および種子を産生する方法が提供される。この方法は、脂肪種子植物中のカロチノイドレベルの増加、および好ましい高オレイン酸種子油の提供に、特に使用される。

Description

【発明の詳細な説明】植物種子中のカロチノイド化合物と特殊油の製造方法発明の分野本発明は、植物、植物細胞および種子の遺伝子的改質、特にカロチノイド生合成および脂肪酸組成の改変に関する。発明の背景カロチノイドは、多様な用途を有する色素である。これは、緑色植物、ある種のカビ、酵母および細菌中に存在する、黄色−橙色−赤色の脂質である。カロチノイド炭化水素は、カロチンと呼ばれ、酸化誘導体は、キサントフィルと呼ばれる。カロチノイドは、カロチノイド以外にクロロフィルやビタミンＥ活性物質であるトコフェロールのような化合物を産生する大きなイソプレノイド生合成経路の一部である。植物のカロチノイド経路は、α−カロチンやβ−カロチンのようなカロチン、およびリコペン、およびルテインのようなキサントフィルを産生する。カロチノイドの生合成では、Ｃ₂₀前駆体のゲラニルＰＰ_iの２つの分子が縮合して最初のＣ₄₀炭化水素フィトエンを生成する。一連の連続的脱飽和により、フィトエンはリコペンを生成する。リコペンは、環状カロチンであるβ−カロチンやα−カロチンの前駆体である。キサントフィルであるゼアキサンチンやルテインは、それぞれβ−カロチンやα−カロチンの水酸化により生成する。その色が黄色から橙色の範囲のスペクトル内にあるカロチンであるβ−カロチンは、ニンジンの根や植物の緑色の葉の中に大量に存在する。β−カロチンは、着色物質としておよび哺乳動物のビタミンＡの前駆体としても有用である。β− カロチンの現在の商業的製造法には、ニンジンからの単離、化学合成、および微生物による製造がある。多くの作物植物や単一の脂肪種子作物は、実質的なレベルのカロチノイドを有することが知られており、このような天然のカロチノイド源の消費は、健康に有益な多くの作用を与えることが示されている。以下の表は、多くの植物種について報告されているカロチノイドのレベルを示す。種々の作物のカロチノイド含量（μｇ／ｇ）カロチノイドの生合成経路は多くの生物で研究されており、細菌から高等植物までの生物で生合成経路が解明されている。例えば、T.W.Goodwin（編），Plant pigments ，1988，Academic Press，Inc．(London)，Ltd.，London中のBritton ．G．(1988)Biosynthesis of carotenoids，p．133-182を参照されたい。カロチノイド生合成遺伝子も、エルウィニア・ウレドボラ（Erwinia uredovora）（Mis awaら、（1980）J．Bacteriol．172:6704-6712:エルウィニア・ハービコラ（Erw inia herbicola）（出願WO91/13078，Armstrongら、（1990）Proc．Natl．Acad ．Sci．USA 87:9975-9979）；アール・カプスラタス（R．capsulatus）（Armstr ongら、（1989）Mol．Gen．Genet．216:254-268，Romerら、（1993）Biochem．B iophys．Res．Commun．196:1414-1421）；サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）（Hoshlnoら、（1993）Appl．Envlron．Microbiol．59:3150-315 3）；青緑色細菌シネココッカススピーシーズ（Synechococcus sp.）（ジーンバンク（GenBank）受け入れ番号X63873）を含む種々の生物からクローニングされてきた。また、出願WO96/13149およびその中に引用された文献を参照されたい。これらの遺伝子は解明されているが、植物における遺伝子の使用についてはほとんどわかっていない。トランスジェニック植物中の植物フィトエンシンターゼ（Ｐｓｙ１）遺伝子の過剰発現または発現の阻害は、フルーツ中のカロチノイドレベルを改変できることが、証明されている。例えばBirdら、（1991）Biotechn ology 9:635-639;Bramleyら、（1992）Plant J．2:343-349；およびFrayとGrier son（1993）Plant Mol．Biol．22:589-602を参照されたい。さらにFrayら、（19 95）The Plant Journal 8:693-701により報告されているように、トランスジェニックトマトにおけるフルーツのフィトエンシンターゼ遺伝子の構成的発現は、ジベレリン経路から代謝物を別の方向に向かわせることにより、短小性を引き起こす。出願WO96/13149は、遺伝子操作した植物の塊茎や根のような貯蔵器官におけるカロチノイド蓄積の増強について報告している。この出願は、特異的な所定の非光合成貯蔵器官中の本来の有色カロチノイド産生の増強に関する。この出願の実施例は、形質転換したニンジンの根やオレンジフレッシュポテトの塊茎中の有色カロチノイドの増加に関する。これらの組織の両方とも、栄養組織であり、種子ではなく、本来高レベルのカロチノイドを有する。カロチノイドは、多くの用途に有用である。一般的に、カロチノイドは、補助剤（特にビタミン補助剤）として、植物油ベースの食品および食品成分として、動物の飼料の飼料添加物として、および着色剤として有用である。特に、フィトエンは、皮膚疾患の治療に使用される。例えば、米国特許第4,642,318号を参照されたい。リコペン、α−カロチンおよびβ−カロチンは、食品着色剤として使用される。β−カロチンとリコペンの摂取はまた、ある種の癌に対して予防効果を有するとされている。さらに、ルテイン摂取は、目の黄斑変性の予防に関連しているとされている。植物油は、多くの工業的および食用的応用に有用である。新規の植物油組成物および／または生合成によりまたは天然の植物源から油組成物を得るための改良された手段が必要である。油の使用目的に依存して、種々の異なる脂肪酸組成物が必要である。特定の脂肪酸組成を有する改質油（特にオレイン酸量の高い油）に対する需要は大きい。Haumann，B.F.（1996）INFORM 7:320-334を参照されたい。Haumannにより報告されたように、理想的な揚げ油は、飽和度の低い、オレイン酸量の高い、かつリノレン酸量の低い油であろう。さらに最近の研究により、食用成分としてのモノ不飽和脂肪酸の価値が確立された。特定の油の脂肪酸プロフィールを改良するための試みが、多年にわたって行われてきた。例えば、植物油の酸化的安定性は、脂肪酸中の二重結合の数に関係がある。すなわち、数個の二重結合を有する分子は、より不安定であることが認識されている。このように科学者たちは、特に加熱下で保存寿命と酸化安定性を改良するために、α−リノレン酸の含量を低下させることを試みてきた。作物植物、特に植物種子において、高レベルのカロチノイド化合物を生産する方法が必要であることは明らかである。植物や種子の脂肪酸含量を改変することはさらに有用であろう。このような改変種子産物は、栄養的に有用且つより安定な油を生産するための供給源を提供するであろう。植物種子中で産生されるカロチノイドのレベルおよび組成を実質的に改変（特に、カロチノイドの産生レベルを上げること）するための方法の報告はない。従って、植物（特に種子）中のカロチノイドレベルを改変し、改質されたカロチノイド組成および／または含量を有する油を生産するための有用な方法が必要である。発明の要約改変されたカロチノイドレベルおよび／または改質された脂肪酸組成を有する形質転換植物、植物細胞および種子が提供される。植物、植物細胞および種子は、少なくとも１つのカロチノイド生合成遺伝子を用いて形質転換される。本発明の形質転換組成物を作成し使用する方法もまた提供される。これらの方法は、植物、特に種子中のカロチノイドレベルの改変、ならびに分子農業（molecular fa rming）のために特定の化合物の増加（例えば、特定のカロチノイドおよびトコフェロールの生産）に使用される。同時に、形質転換組成物（特に、種子）は、改質油の供給源を提供し、これらの油は、種々のカロチノイドおよびカロチノイド混合物の天然資源を含む油製品を提供するために、種子から抽出される。本発明の特定の態様において、形質転換種子は、特定のカロチノイド化合物のための、および／または改変カロチノイドまたはトコフェロール組成および／または改変脂肪酸組成（特に、オレイン酸のレベルが増加し、リノール酸およびリノレン酸のレベルが低下した）を有する改質された特殊油のための供給源を提供することができる。図面の簡単な説明図１は、ＳＳＵ／crtＢ融合配列のヌクレオチド配列を示す。図２は、植物種子におけるカロチノイド生合成遺伝子の発現のための構築物を示す。図２Ａは、ＳＳＵ／crtＢ配列に作動可能に結合されたナピン(napin)プロモーターを含有するプラスミドｐＣＧＮ３３９０を示す。図２Ｂは、ＳＳＵ／cr tＥ配列に作動可能に結合されたナピンプロモーターを含有するプラスミドｐＣＧＮ３３９２を示す。図２Ｃは、ＳＳＵ／crtＩ配列に作動可能に結合されたナピンプロモーターを含有するプラスミドｐＣＧＮ９０１０を示す。図２Ｄは、ＳＳＵ／crtＢ配列に作動可能に結合されたナピンプロモーターとＳＳＵ／crtＩ配列に作動可能に結合されたナピンプロモーターとを含有するプラスミドｐＣＧＮ９００９を示す。図２Ｅは、ＳＳＵ／crtＢ配列に作動可能に結合されたナピンプロモーターとアンチセンスεシクラーゼ配列に作動可能に結合されたナピンプロモーターとを含有するプラスミドｐＣＧＮ９００２を示す。図２Ｆは、ＳＳＵ／crtB配列に作動可能に結合されたナピンプロモーターと、アンチセンスβシクラーゼ配列に作動可能に結合されたナピンプロモーターとを含有するプラスミドｐＣＧＮ９０１７を示す。図３は、対照種子のケン化試料の分析結果を示す。図４は、ｐＣＧＮ３３９０形質転換種子のケン化試料の分析結果を示す。図５は、ｐＣＧＮ３３９０形質転換種子中の脂肪酸分析のグラフを示し、１８：１脂肪酸の増加は１８：２および１８：３の減少と相関することを示す。図６は、ｐＣＧＮ３３９０形質転換種子中の脂肪酸分析のグラフを示し、１８：１の増加は１８：０および２０：０の増加と相関するが、１６：０ではほとんど影響がないことを示す。図７は、ｐＣＧＮ３３９０形質転換種子中の脂肪酸分析のグラフを示し、１８：０の増加は２０：０の増加と良く相関することを証明する。図８は、カロチノイド生合成経路を示す。図９は、ビー・ナプス（B．napus）εシクラーゼｃＤＮＡクローン９−４の配列を提供する。図１０は、ビー・ナプス（B．napus）εシクラーゼｃＤＮＡクローン７−６の配列を提供する。図１１は、ビー・ナプス（B．napus）βシクラーゼｃＤＮＡクローンの配列を提供する。図１２は、３３９０形質転換ブラシカ・ナプス（Brassica napus）植物のＴ２種子分析を提供する。図１３は、３３９０形質転換ブラシカ・ナプス（Brassica napus）植物のＴ３種子分析を提供する。発明の詳細な説明本発明に従って、植物、特に植物種子中のカロチノイド化合物の産生量を増大する方法ならびに脂肪酸組成を改変する方法が提供される。この方法は、植物細胞を少なくとも１つのカロチノイド生合成遺伝子で形質転換することを含む。これは、カロチノイド生合成を改変する作用、特に下流の生成物の産生を増加させる効果、ならびに好ましい脂肪酸組成を有する新規の種子油を提供する効果がある。次に第２の遺伝子を使用して、代謝活性を特定のカロチノイド化合物の産生に向けるか、または脂肪酸組成をさらに改変することができる。驚くべきことに、植物を初期カロチノイド生合成遺伝子で形質転換すると、カロチノイド経路を介するフラックス（flux）が大幅に増加し、特定のカロチノイドが増加することがわかった。すなわち、特定のカロチノイドの産生のためにさらに操作することができる代謝活性の増加がある。さらに、形質転換された種子は、例えばフィトエンシンターゼ遺伝子で形質転換した植物由来の本明細書に記載の種子で見られるように、カロチノイド遺伝子発現の結果として改変された脂肪酸組成を示す。すなわち、本発明の方法を使用して、高レベルの特定のカロチノイドを産生する、および／または所望の脂肪酸組成を有する特殊油を産生する、種子が提供される。例えば脂肪種子アブラナ属（Brassica）では、初期カロチノイド生合成遺伝子による形質転換により、α−カロチン、β−カロチンおよびルテインの産生が大幅に増加した種子が得られる。さらにアブラナ属種子は、改変された脂肪酸組成を示し、オレイン酸含量が増加しリノール酸およびリノレン酸含量が低下している植物油を与える。すなわち、形質転換された種子は、カロチノイド生成物ならびに改質種子油の供給源を提供することができる。こうして、改質された特殊油を産生することができ、抽出および精製のためのカロチノイドの新しい供給源が提供される。本発明の油はまた、他の２つの主要なカロチノイドの植物供給源であるマリーゴールド花弁と赤パーム油（中果皮）と比較して、安定性の実質的な改良も提供する。４週間の保存後に総カロチノイドの約２０〜３０％が失われることにより証明されるように、空気中で室温で保存した種子では不安定性が観察されるが、１〜２週間後の喪失はわずかに１０％である。これに対してパーム中果皮は、カロチノイドの大きな喪失を避けるために、収穫後１日または２日以内に処理しなければならない。さらに、本発明の種子におけるカロチノイドの分解は、種子を窒素中で保存することにより大幅に低下し得る。カロチノイド生合成が増加した種子の産生のためには、初期カロチノイド生合成遺伝子で植物を形質転換すれば充分である。初期カロチノイド生合成遺伝子とは、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ、フィトエンシンターゼ、フィトエンデサチュラーゼ（desaturase）、およびイソペンテニルジホスフェート（IPP ）イソメラーゼを意味する。初期カロチノイド生合成遺伝子のために種々の供給源が利用可能であり、ほとんどの場合任意の供給源由来の遺伝子が利用可能である。しかし、同時抑制のために、標的宿主植物本来の植物遺伝子の利用は、特定の酵素の発現の増加が必要な場合は、好ましくないことがある。多くの初期カロチノイド生合成遺伝子が単離されており、本発明の方法に使用できる。例えば：ＩＰＰイソメラーゼは、アール・カプスラツス（R．Capsulatus）（Hahnら、（1996）J．Bacteriol．178:619-624およびそこに引用されている文献）（ジーンバンク（GenBank）受け入れ番号U48963とX82627）、クラルキア・キサンチアナ（Clarkia xantiana））（ジーンバンク受け入れ番号U48962）、アラビドプシス・タリアナ（Arabidopsis thaliana）（ジーンバンク受け入れ番号U48961)、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharmoyces pombe）（ジーンバンク受け入れ番号U21154）、ヒト（ジーンバンク受け入れ番号X17025）、クルイベロミセス・ラクチス(Kluyveromyces lactis)(ジーンバンク受け入れ番号X14230)、から単離されている；ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼは、イー・ウレドボラ（E．Uredovora ）（Misawaら、(1990)J．Bacteriol．172:6704-6712、および出願WO91/13078）；およびホワイトルピン（white lupin）（Aitkenら、(1995)Plant Phys．108:8 37-838）、ベルペパー（bell pepper）（Badilloら、(1995)Plant Mol．Biol．2 7:425-428）、およびアラビドプシス（Arabidopsis）（Scolnik and Bartely（1 994）Plant Physiol．104:1469-1470；Zhuら、（1997）Plant Cell Physiol．38 :357-361）を含む植物から単離されている；フィトエンシンターゼは、イー・ウレドボラ（E．uredovora）、ロードバクター・カプスラツス（Rhodobacter capsulatus）、および植物（Misawaら、（1980 ）J．Bacteriol．172:6704-6712（ジーンバンク受け入れ番号D90087）、出願ＷＯ91/13078、Armstrongら、(1989)Mol．Gen．Genet．216:254-268、Armstrong， G.A.「カロチノイド生合成の遺伝的解析と制御」、R.C．Blankenship，M.T．Mad igan，and C.E．Bauer（編）、Anoxygenic photosynthetic bacteria：advances in photosynthesis。Kluwer Academic Publishers，Dordrecht，The Netherlan ds、Armstrongら、(1990)Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87:9975-9979、Armstron gら、(1993)Methods Enzymol．214:297-311,、Bartley and Scolnik（1993）J． Biol．Chem．268:27518-27521，Bartleyら、(1992)J．Biol．Chem．267:5036-50 39、Bramleyら、(1992)Plant J．2:291-343、Rayら、(1992)Plant Mol．Biol．1 9:401-404、Rayら、(1987)Nucleic Acids Res．15:10587、Romerら、(1994)Bioc hem．Biophys．Res．Commun．196:1414-1421、Karvouniら、（1995）Plant Mole cular Biology 27:1153-1162（ジーンバンク受け入れ番号U32636、Z37543、L374 05、X95596、D58420、U32636、Z37543、X78814、X82458、S71770、L27652、L234 24、X68017、L25812、M87280、M38424、X69172、X63873およびX60441）、Armstr ong，G.A.（1994）J．Bacteriol．176:4795-4802、およびそこに引用されている文献）を含む多くの供給源から単離されている；並びに、フィトエンデサチユラーゼは、イー・ウレドボラ（E．uredovora）（Misawaら、(1990)J．Bacteriol．172:6704-6712、および出願WO91/13078（ジーンバンク受け入れ番号L37405、X95596、D58420、X82458、S71770、およびM8728 0））を含む、細菌から；およびトウモロコシ（Liら、(1996)Plant Mol．Biol． 30:269-279）、トマト（Peckerら、（1992）Proc．Natl．Acad．Sci．89:4962-4 966およびAracriら、（1994）Plant Physiol．106:789）、およびカピスム・アヌウム（Capisum annuum）（ベルベツパース（bell beppers））（Hugueneyら、 (1992)L．Biochem．209:399-407（ジーンバンク受け入れ番号U37285、X59948、X 78271、およびX68058））を含む植物から単離されている。一般的には、Misawaら、（1990）J．of Bacteriology 172:6704-6712、E.P.O. 393690 B1、米国特許第5、429、939号、Bartleyら、（1992）J．Biol．Chem．26 7:5036-5039、Birdら、（1991）Blotechnology 9:635-639、および米国特許第5, 304,478号（これらは参考として本明細書中に組み込まれる）を参照されたい。初期カロチノイド遺伝子（１次遺伝子とも呼ばれる）による形質転換は、カロチノイド経路の生合成活性を増加させ、例えばα−カロチンおよびβ−カロチンのような特定のカロチノイドの産生を増加させる。以下の実施例でより詳細に記載されるように、１次遺伝子としてフィトエンシンターゼを発現することにより、形質転換した植物の種子中で、一般的にはカロチノイド含量および特にα−カロチンおよびβ−カロチンレベルの大幅な増加が得られる。こうして産生されるカロチノイドを含む油は種子から抽出されて、α−カロチンおよびβ−カロチンの貴重な供給源となり得る。このような油は、例えばマーガリンを着色するための食品着色剤として、または食用油として使用できる。高いα−カロチンおよび β−カロチンレベルを有する食用油は、夜盲症を引き起こすビタミンＡ欠乏症を防ぐのに関係がある。従って、有用な食用油を提供するための形質転換された植物の生産およびα−カロチンおよびβ−カロチン含量の高い油の抽出は、夜盲症がはびこっている地域（例えば、インドやアジア）では、特に望ましい。本明細書で例示される油では、α−カロチンおよびβ−カロチンレベルが高いのに加え、他のカロチノイドレベルも増加している。例えばルテインレベルは、フィトエンシンターゼ遺伝子で形質転換した植物由来の種子、ならびにＧＧＰＰシンターゼ遺伝子で形質転換した植物由来の種子で増加している。さらに、カロチノイド経路を介するより大きいフラックス（flux）を与えるように追加の１次遺伝子が発現されてもよい。例えば、本明細書に記載のフィトエンシンターゼ遺伝子を含有する脂肪種子アブラナ属種子において、フィトエンのレベルの増加が観察される。すなわち、フィトエンデサチユラーゼならびにフィトエンシンターゼの発現の増加は、カロチノイド（例えば、α−カロチンやβ−カロチン、およびルテイン）のレベルのさらなる増加を引き起こし得る。さらにフィトエンシンターゼおよびＧＧＰＰシンターゼ遺伝子の両方を発現する植物が望ましく、本明細書に記載のこれらの遺伝子を含む３３９０および３３９２植物を交配することにより産生することができる。本明細書に記載のカロチノイドの産生に加え、１次カロチノイド生合成遺伝子（単数又は複数）の発現により生合成活性がいったん増加すると、経路を特異的化合物の産生について迂回させることができる。この迂回には、目的の少なくとも１つの第２の目的遺伝子（２次遺伝子）の作用が関与する。２次遺伝子は、特定の化合物の産生を強制する酵素をコードするか、あるいは特定の化合物の蓄積のために経路を停止させる遺伝子をコードすることができる。特定の化合物の産生を強制するために、所望のカロチノイド化合物の経路中のカロチノイド生合成遺伝子の発現が使用される。例えば高等植物以外の供給源（例えばエルウィニア（Erwinia）およびロードバクター（Rhodobacter）種を含む細菌）由来のカロチノイド生合成遺伝子を含む、標的植物宿主に本来のまたは外来の遺伝子を、使用することができる。特定のカロチノイド化合物を蓄積させるために経路を停止するために、２次遺伝子は、標的宿主植物本来の遺伝子の転写を阻害し、ここで阻害される遺伝子によりコードされる酵素は、所望のカロチノイド化合物を改質することができる。阻害は、遺伝子のセンス（同時抑制）またはアンチセンス配向のいずれかで阻害される本来の遺伝子の転写により達成される。例えば、より高レベルのβ−カロチン由来のカロチノイド（例えば、ゼアキサンチン（zeaxanthin）、ゼアキサンチンジグルコシド（zeaxanthin diglucoside ）、カンタキサンチン（canthaxanthin）、およびアスタキサンチン（astaxanth in））の蓄積のためにカロチノイド組成を改変するために、リコペンεシクラーゼの阻害が、α−カロチンおよびその誘導体カロチノイド（例えば、ルテイン）の蓄積を防止するために好ましい。リコペンεシクラーゼの阻害とともに、２次遺伝子の発現の増加が、特定のβ−カロチン由来カロチノイドの蓄積の増加のために好ましい。例えば、β−カロチンヒドロキシラーゼ発現の増加はゼアキサンチンの産生に有用であり、β−カロチンヒドロキシラーゼおよびケト導入性酵素の発現の増加は、アスタキサンチンの産生にとって有用である。あるいはリコペンの蓄積のために、α−カロチンおよびβ−カロチンへのリコペンの変換を低下させるために、リコペンβシクラーゼ、またはリコペンεシクラーゼとリコペンβシクラーゼの阻害が好ましい。本願の目的の２次遺伝子は、以下のものを含むがこれらに限定されない：ゼアキサンチンの産生のための、β−カロチンヒドロキシラーゼまたはcrtＺ（Hundleら、（1993）FEBS Lett．315:329-334、ジーンバンク受け入れ番号M872 80）；カンタキサンチン（canthaxanthin）の産生のための、ascrtＷ（Misawaら、(1 995)J．Bacteriol 177:6575-6584、WO95/18220、WO96/06172）またはβ−Ｃ−４ −オキシゲナーゼ（crtＯ：Harker and Hirschberg（1997）FEBS Lett．404:129 -134）のようなケト導入性酵素；アスタキサンチンの産生のための、crtＺおよびcrtＷまたはcrtＯ；ルテインの産生のための、ε−シクラーゼおよびε−ヒドロキシラーゼ；ルテインとゼアキサンチンの産生のための、ε−ヒドロキシラーゼおよびcrt Ｚ； β−カロチンの産生増加のための、アンチセンスリコペンε−シクラーゼ（ジーンバンク受け入れ番号U50738）：リコペンの産生のための、アンチセンスリコペンε−シクラーゼおよびリコペンβ−シクラーゼ(Hugueneyら、(1995)Plant J．8:417-424、Cunningham FX Jr （1996）Plant Cell 8:1613-1626、Scolnik and Bartley（1995）Plant Physiol ．108:1343、ジーンバンク受け入れ番号X86452、L40176、X81787、U50739、およびX74599）；フィトエンの産生のための、アンチセンス植物フィトエンデサチユラーゼ；など。こうして、任意の特定の目的カロチノイド化合物の産生を高めるために、経路を改変することができる。そのような化合物には、α−クリプトキサンチン、β −クリプトキサンチン、ζ−カロチン、フィトフルエン（phytofluene）、ニューロスポラン（neurosporane）などがあるが、これらに限定されない。本発明の方法を使用して、カロチノイド経路の任意の目的化合物を、種子中で高レベルに産生することができる。また、前駆体化合物が、制御される特定のカロチノイドに変換されることを防ぐアンチセンスＤＮＡ配列の形質転換により、特定のカロチノイドのレベルを低下させるように経路を操作することができる。２次遺伝子はまた、特殊油の産生のために植物の脂肪酸含量を改変するのに選択することができる。例えば、特定の長さの脂肪酸鎖に特異的なアシル−ACPチオエステラーゼ遺伝子を使用することができる。例えば、USPN 5,304,481、USPN 5,455,167、WO95/13390、WO94/1O288、WO92/20236、WO91/16421、WO971/2047、およびWO96/36719を参照されたい。他の目的の脂肪酸生合成遺伝子には、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ（USPN 5,510,255）、脂肪酸アシルＣｏＡシンターゼ（USPN 5,455,947）、脂肪酸アシル還元酵素（USPN 5,370,996）、およびステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ（WO91/13972）があるが、これらに限定されない。特に興味深いのは、脂肪酸含量の改質のための２次遺伝子としてのマンゴスチンアシル−ＡＣＰチオエステラーゼの使用である。WO96/36719およびWO97/12047 に記載のように、マンゴスチンアシル−ＡＣＰチオエステラーゼの発現により種子中で高いステアリン酸含量が得られる。本明細書に記載の３３９０植物の高オレイン酸形質とWO97/12047に記載の５２６６高ステアリン酸植物を組合せるために、３３９０−１と５２６６−５の間および３３９０−１と５２６６−５の間で交配を行なった。これらの交配から得られる種子は、高レベルのステアリン酸、低レベルのリノレン酸、低レベルのリノレン酸及び高レベルのカロチノイド表現型を有する油を含有した。１次遺伝子又は１次遺伝子と２次遺伝子の両方を含む植物を産生するための任意の手段が、本発明に包含される。例えば目的の２次遺伝子は、１次遺伝子と同時に植物を形質転換（同時形質転換）するために使用することができ、２次遺伝子は、１次遺伝子ですでに形質転換した植物中に導入することができ、または形質転換した植物（１次遺伝子を発現するものと２次遺伝子を発現するもの）を、同じ植物中に遺伝子を取り込むために交配することができる。遺伝子と組織特異的プロモーターとを組合せることにより、カロチノイドレベルを植物の特定の組織中で改変することができる。すなわち、胚と胚乳を含む種子中のカロチノイドレベルは、種子特異的転写開始領域の使用により改変することができる。このような領域は、例えば米国特許第5,420,034号（これは、参考として本明細書中に組み込まれる）に開示されている。こうして、形質転換種子は、改質油の産生のための工場を提供する。改質油を使用しても、あるいは油中の化合物を単離してもよい。すなわち本発明は、特定の目的化合物ならびに特殊油の産生を可能にする。目的の酵素をコードする１次遺伝子または２次遺伝子は、形質転換植物組織中での発現のために、発現カセット中で使用することができる。目的の植物中のカロチノイドまたは脂肪酸レベルを改変するために、植物を、目的の遺伝子に結合した転写開始領域を含む少なくとも１つの発現カセットで形質転換する。このような発現カセットには、制御領域の転写制御下に目的の遺伝子を挿入するための複数の制限部位が提供される。転写開始は、宿主本来のものであるかもしくはこれと類似であるか、または宿主に対して外来もしくは異種でもよい。外来とは、転写開始領域が、その転写開始領域が導入される野生型宿主中に見られないことを意味する。特に興味深いことは、保存タンパク質（例えば、ナピン、クルシフェリン（cr uciferin）、β−コングリシニン、ファセオリンなど）および脂肪酸生合成に関与するタンパク質（例えば、アシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ））に関連する転写開始領域である。米国特許第5,420,034号を参照されたい（参考として本明細書中に組み込まれる）。転写カセットは、転写の５’−３’方向に、植物中で機能する転写および翻訳開始領域、目的のＤＮＡ配列、および転写及び翻訳停止領域を含むであろう。停止領域は、転写開始領域と起源が同じであっても、目的のＤＮＡ配列と起源が同じであっても、または別の供給源から得られてもよい。便利な停止領域は、エー・ツメファシエンス（A．tumefaciens）のＴｉ−プラスミドから得られ、例えばオクトピンシンターゼおよびノパリンシンターゼ停止領域がある。また、Guerinea uら、(1991)，Mol．Gen．Genet.，262:141-144，Proudfoot，(1991)，Cell，64: 671-674；Sanfaconら、(1991)，Genes Dev.，5:141-149；Mogenら、(1990)，Pla nt Cell，2:1261-1272；Munroeら、(1990)，Gene，91:151-158；Ballasら、(198 9)，Nucleic Acids Res.，17:7891-7903；Joshiら、(1987)，Nucleic Acid Res. ，15:9627-9639も参照されたい。一般に本発明の目的遺伝子は、発現のためにプラスチド（plastid）（例えば、葉緑体）にターゲッティングされるであろう。こうして、目的遺伝子がプラスチドに直接挿入されない場合、発現カセットは、目的遺伝子をプラスチドに向けるための運搬ペプチド（transit peptide）をコードする遺伝子をさらに含有するであろう。このような運搬ペプチドは当該分野で公知である。例えば、Von He ijneら、（1991）Plant Mol．Biol．Rep．9:104-126；Clarkら、（1989）J．Bio l．Chem．264:17544-17550：della-Cioppaら、（1987）Plant Physiol．84:965- 968；Romerら、（1993）Biochem．Biophys．Res．Commun．196:1414-1421；およびShahら、（1986）Science 233:478-481を参照されたい。本発明において有用な植物カロチノイド遺伝子は、本来のまたは異種運搬ペプチドを利用してもよい。目的の遺伝子またはＤＮＡ配列がアンチセンスＤＮＡの場合、プラスチドへのターゲティングは必要ないことに注意されたい。この構築物はまた、目的のヌクレオチド配列に作動可能に結合された、例えば植物翻訳コンセンサス配列（Joshi，C.P.,（1987）Nucleic Acids Research，15 :6643-6653）、イントロン（Luehrsen and Walbot，(1991)，Mol．Gen．Genet., 225:81-93）などの任意の他の必要なレギュレーターを含有してもよい。発現カセット構築物中に５’リーダー配列を含むことが有効なこともある。このようなリーダー配列は、翻訳を増強するのに作用することができる。翻訳リーダーは当該分野で公知であり、ピコルナウイルス、例えばＥＭＣＶリーダー（脳心筋炎５’非コード領域）（Elroy-Stein，O.，Fuerst，T.R.，and Moss，B．（ 1989)PNAS USA 86:6126-6130）；ポチウイルス（potyvirus）リーダー、例えばＴＥＶリーダー（タバコエッチウイルス（Tobacco Etch Virus）（Allisonら、( 1986)；ＭＤＭＶリーダー（メイズドワーフモザイクウイルス（Malze Dwarf Mo saic Virus）；Virology，154:9-20））、およびヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（ＢｉＰ）（Macejak，D.G．and Sarnow，P.，(1991)，Nature，353:90 -94；アルファルファモザイクウイルスのコートタンパク質ｍＲＮＡ由来の非翻訳リーダー（ＡＭＶＲＮＡ４）（Jobling，S.A.，and Gehrke，L.，(1987)，N ature，325:622-625；タバコモザイクウイルスリーダー（ＴＭＶ）（Gallie，D. R.ら、(1989)，Molecular Biology of RNA，237-256頁；およびトウモロコシ白化斑点ウイルス（maize chlorotic mottle）リーダー（ＭＣＭＶ）（Lommel，S. A.ら、(1991)，Virology，81:382-385）がある。またDella-Cioppaら、(1987)， Plant Physiology，84:965-968を参照されたい。目的のＤＮＡ配列が発現される場所に依存して、植物の好適なコドンを有するかあるいは葉緑体の好適なコドンを有する配列を合成することが好ましいこともある。植物の好適なコドンは、特定の目的植物種中で最大の量で発現されるタンパク質中の最も頻度の高いコドンから決定され得る。EPA 0359472；EPA 0385962 ；WO91/16432；Perlakら、（1991）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88:3324-3328 ；およびMurrayら、（1989）Nucleic Aclds Research 17:477-498を参照されたい。こうして、ヌクレオチド配列の発現は、任意の植物中で最適化される。この遺伝子配列のすべてまたは一部は最適化されても合成でもよいことを理解されたい。すなわち、合成または部分的に最適化された配列を使用することもできる。葉緑体の好適な遺伝子の作成については、USPN 5,545,817を参照されたい。転写カセットの調製において、適正な配向でありかつ適宜適正な読みとり枠内にあるＤＮＡ配列を提供するように、種々のＤＮＡ断片を操作することができる。このために、アダプターまたはリンカーを使用してＤＮＡ断片を結合したり、または他の操作を用いて、便利な制限部位、余分なＤＮＡの除去、制限部位の除去などを提供することができる。この目的のために、インビトロの突然変異誘発、プライマー修復、制限、アニーリング、切除、結合などを使用することができ、挿入、欠失または置換（例えば、塩基転移や塩基転換）を使用することができる。本発明の組換えＤＮＡ分子は、当該分野で公知の多くの方法により植物細胞中に導入することができる。方法の選択は、形質転換のためにターゲティングされる植物のタイプ（すなわち双子葉または単子葉）に依存することを、当業者は理解できるであろう。植物細胞の形質転換のための適切な方法には、微量注入法（ Crosswayら、（1986）BioTechniques 4:320-334）、電気穿孔法（Riggsら、（19 86）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 83:5602-5606）、アグロバクテリウム（Agrob acterium）媒介性形質転換（Hincheeら、（1988）Biotechnology 6:915-921）および衝撃粒子加速法（例えば、Sanfordら、米国特許第4,945,050号；およびMcCa beら、（1988）Biotechnology 6:923-926）がある。またWeissingerら、（1988 ）Annual Rev．Genet．22:421-477；Sanfordら、（1987）Particulate Science and Technology 5:27-37（タマネギ）；Christouら、（1988）Plant Physiol．8 7:671-674（大豆）；McCabeら、（1988）Bio/Technology 6:923-926（大豆）；D attaら、（1990）Biotechnology 8:736-740（イネ）；Kleinら、（1988）Proc． Natl．Acad．Sci．USA 85:4305-4309（トウモロコシ）；Kleinら、（1988）Biot echnology 6:559-563（トウモロコシ）；Klelnら、（1988）Plant Physlol．91: 440-444（トウモロコシ）；Frommら、（1990）Biotechnology 8:833-839；およびGordon-Kammら、（1990）Plant Cell 2:603-618（トウモロコシ）も参照されたい。あるいは、植物プラスチドを直接形質転換することができる。葉緑体の安定な形質転換は、高等植物で報告されており、例えば、SVABら、（1990）Proc．Nat' l.Acad．Sci．USA 87:8526-8530；SVAB ＆ Maliga（1993）Proc．Nat'l．Acad.S ci．USA 90:913-917;Staub ＆ Maliga（1993）Embo J．12:601-606を参照されたい。この方法は、選択マーカーを含有するＤＮＡの粒子銃送達（particlegun de livery）と、相同的組換えを介するプラスチドゲノムへのＤＮＡのターゲティングに依存する。このような方法において、プラスチド遺伝子発現は、プラスチド遺伝子プロモーターの使用、またはＴ７ＲＮＡポリメラーゼに認識されるような選択的プロモーター配列から発現されるように配置されるサイレントプラスチド由来の導入遺伝子のトランス活性化により達成することができる。サイレントプラスチド遺伝子は、核発現構築物由来の特異的ＲＮＡポリメラーゼの発現、および運搬ペプチドの使用によるプラスチドへのポリメラーゼのターゲティングにより活性化される。組織特異的発現は、適切な植物組織特異的プロモーターから発現される、核にコードされプラスチド指向性の特異的ＲＮＡポリメラーゼの使用によるような方法で得られる。そのようなシステムは、McBrideら、（1994 ）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 91:7301-7305に報告されている。形質転換された細胞は、通常の方法に従って植物中に増殖され得る。例えば、 McCormickら、Plant Cell Reports(1986)，5:81-84を参照されたい。次にこれらの植物を増殖させ、同じ形質転換株または異なる株で授粉し、所望の表現型の特徴を有する得られたハイブリッドを同定する。２つまたはそれ以上の世代を増殖させ、対象の表現型の特徴を安定に維持かつ遺伝していることを確認し、次に種子を採取して所望の表現型または他の性質が達成されていることを確認する。宿主細胞として、任意の植物品種を使用することができる。特に興味深いものは、目的の種子を提供する植物種である。一般に種子が多量に産生され、目的の種子特異的生成物が関与するか、または種子もしくは種子の一部分が食用である、植物が選択されるであろう。目的の種子には、脂肪種子（例えば脂肪種子であるアブラナ属（Brassica）種子、綿花種子、大豆、ベニバナ、ヒマワリ、ココナツ、パームなど）；穀物種子（例えば、コムギ、オオムギ、オートムギ、アマランサス（amaranth）、アマ、ライムギ、ライコムギ、イネ、コーンなど）；他の食用種子または食用部分を有する種子（カボチャ、カボチャ属（squash）、ゴマ、ケシ、ブドウ、ヤエナリ、ピーナツ、エンドウ、インゲンマメ、ダイコン、アルファルファ、ココア、コーヒー、木のナッツ（例えば、クルミ、アーモンド、ペカン、ヒヨコマメなど））がある。本発明の１つの実施態様において、種子転写開始領域は、少なくとも１つのカロチノイド生合成遺伝子とともに使用される。これは、カロチノイド経路の活性を増加させ、形質転換種子中のカロチノイドレベルを改変する。こうして、目的の化合物の生成を促進するために特定の遺伝子を選択することができる。選択された遺伝子が初期カロチノイド生合成遺伝子である場合、形質転換種子は、経路を介するフラックスの増加の結果として、カロチノイド生合成が大きく増加する。初期カロチノイド生合成遺伝子で形質転換したアブラナ属種子については、種子油中のα−カロチン、β−カロチンの産生の大幅の増加、およびルテインのこれより少ない増加、ならびに改変された油脂肪酸組成が得られる。初期カロチノイド生合成遺伝子がフィトエンシンターゼの場合、α−カロチンおよびβ−カロチンレベルに見られる増加のように、１０〜５０倍の増加、好ましくは少なくとも５０〜１００倍、より好ましくは少なくとも５０〜２００倍の増加の範囲の、特定のカロチノイドの大幅な増加がある。この場合ルテインレベルも増加するが、１．５〜２倍の低い増加である。同時に総カロチノイドレベルは、少なくとも１０〜２５倍、好ましくは２５〜６０倍、およびより好ましくは２５〜１００倍増加し得る。すなわち、フィトエンシンターゼ遺伝子で形質転換した本発明の種子は、α−カロチンおよびβ−カロチンおよび総カロチノイドのレベルの実質的な増加、ならびにルテインと他のカロチノイドのこれより少ない増加がある。ある場合には、形質転換していないものからの種子中のレベルが低すぎて検出できないため、所与のカロチノイド化合物で増加倍数を定量することが不可能である。例えばブラシカ・ナプス（Brassica napus）では、α−クリプトキサンチン、リコペン、フィトエン、およびフィトフルエンはすべて、crtＢ遺伝子で形質転換した種子中で種々のレベルで検出されるが、形質転換していないブラシカ・ナプス（Brassica napus）植物由来の種子では検出できない。初期カロチノイド生合成遺伝子がＧＧＰＰシンターゼである場合、ルテインと β−カロチンの１．５〜２倍の増加が得られる。crtＥ（ＧＧＰＰシンターゼ）遺伝子で形質転換したブラシカ・ナプス（Brassica napus）植物由来の種子中では、リコペンも検出される。この場合総カロチノイドもまた、約２倍増加する。従って、カロチノイドの供給源としても興味深いものは、増加レベルのフィトエンシンターゼとＧＧＰＰシンターゼを発現するように操作した植物である。初期カロチノイド遺伝子を用いる形質転換により影響を受けるこの代謝エネルギーを、第２の遺伝子による形質転換により、選択した代謝性化合物に集めることができる。上述のように、第２の遺伝子は、目的のカロチノイドの生成を促進することにより、または化合物の蓄積を可能にするために経路を停止することにより、特定のカロチノイドの合成を促進するように設計される。従って、本発明の形質転換種子中で、多量の目的のカロチノイドを産生することができる。１次初期カロチノイド生合成遺伝子で形質転換した本発明の種子はまた、新規の油組成物の供給源を提供する。例えば１次遺伝子としてのフィトエンシンターゼの使用は、種子油中のオレイン酸含量を実質的に増加させる。実質的な増加とは、約５％〜約４０％、具体的には約２０％〜約４０％、より具体的には約３０％〜約４０％の増加を意味する。すなわち１次初期カロチノイド生合成遺伝子で形質転換した本発明の種子は、オレイン酸含量の高い改質油の供給源を提供する。すなわち、カロチノイド生合成遺伝子、特に初期カロチノイド生合成遺伝子は、少なくとも７０％のオレイン酸（重量％ベース）を有する種子を産生するのに使用することができる。任意の種子中のオレイン酸含量（天然で高オレイン酸含量を有する種子でさえも）は、本発明の方法により改変することができる。本発明の方法による天然で高オレイン酸含量を有する種子の改変により、総オレイン酸含量は８０％にもなる。重要なことは、リノール酸とリノレン酸含量の低下もあることである。リノール脂肪酸含量の低下とは、約１０％〜約２５％の低下、好ましくは約２５％〜約４０％の低下、より好ましくは約３５％〜約６０％の低下を意味する。リノレン脂肪酸含量の低下とは、約１０％〜約３０％の低下、好ましくは約３０％〜約６０％の低下、より好ましくは約５０％〜約７５％の低下を意味する。すなわち、本発明の方法は、天然に存在する油より酸化的により安定な油を与える。本発明の改質油は、低飽和性で、オレイン酸が多くおよびリノレン酸が少ない。さらに、本発明は、食品成分として重要なモノ不飽和脂肪酸の多い油を提供する。本明細書中に記載した方法に基づき、高オレイン酸含量ならびに高レベルの目的カロチノイドを有する油を作成するように、種子油を改質することができる。オレイン酸並びにα−およびβ−カロチン含量は両方とも安定性を与えるため、高オレイン酸並びに高α−およびβ−カロチン油はより長い保存寿命を有する。このような油は、高レベルの飽和脂肪酸を含有する天然の赤パーム油よりカロチノイドの供給源として好ましい。こうして本発明の形質転換種子は、カロチノイド生成物ならびに改質脂肪酸の供給源を提供する。目的の特定のカロチノイド化合物を産生することを意図する場合、カロチノイド化合物の精製法は当該分野で利用可能である。同様に、カロチノイドの精製油を生成するために当業界で入手可能な方法を使用することができる。一般的には、WO91/13149、およびFavatiら、（1988）J．Food Sci．53:15 32、およびそこに引用された文献を参照されたい。種子中のカロチノイドレベルの改変以外に、トコフェロールレベルを改変、好ましくは増加させることができる。α−トコフェロールはビタミンＥ群の最も重要な型であるため、トコフェロール（特に、α−トコフェロール）のレベルが増加した種子が好ましい。ビタミンＥは、ヒトおよび他の動物の栄養に必須である。ビタミンＥは、赤血球の完全性の維持のために体内で機能し、細胞の呼吸に必須であり、ＤＮＡの生合成に関与し、そして発癌物質から細胞を保護することが示唆されている抗酸化剤として作用する、という証拠がある。従つて、トコフェロールレベルの増加した種子および油が好ましい。α−トコフェロールレベルが５０％近く増加した油が本明細書において提供され、さらに大きな増加レベル（２〜５倍まで）を有する種子油が、本発明の方法を使用して想定される。形質転換種子および胚は、さらにスクリーニング可能なマーカーとして使用される。すなわち形質転換された種子および胚は、カロチノイド含量が増加しているため、視覚的に決定し、色に基づいて選択することができる。形質転換種子または胚は、カロチノイドレベルが増加した結果、黄色から橙色そして赤色の範囲の色を示す。従って植物形質転換法に胚段階が関与する場合（例えば、綿花または大豆の形質転換）、カロチノイド遺伝子は、形質転換体の視覚的選択を可能にするマーカー遺伝子として植物形質転換実験で使用することができる。同様に、形質が分離した種子（segregating seed）は、以下の実施例に更に記載するように容易に同定することができる。以下の実施例は、例示のためのみであって、決して本発明を限定するものではない。実験実施例１発現構築物および植物形質転換Ａ．イー・ウレドボラ（E．uredovora）カロチノイド生合成遺伝子へのＳＳＵの融合（１）フィトエンシンターゼＳＳＵリーダーとcrtＢ遺伝子配列をＰＣＲにより結合させた。ＳＳＵ／crtＢ融合体の配列を図１に示す。ヌクレオチド５０５７〜５３６３（番号付けは、Mi sawaら、（1990）上記、に従う）由来のcrtＢ遺伝子を、以下のようにＳＳＵリーダーに結合させた。クローニングを容易にするために、ＳＳＵリーダー開始部位の上流にＢｇｌII部位を加えた。crtＢの５０５７位のチミジンヌクレオチドをアデノシンに変化させて、ＳＳＵリーダー／crtＢジャンクションの最初のアミノ酸をメチオニンにし、スプライス部位をｃｙｓ−ｍｅｔ−ａｓｎにした。ＳＳＵの本来のスプライス部位はｃｙｓ−ｍｅｔ−ｇｌｎである。Misawaら（(1990)前述）は、crtＢのコード領域の開始部位はヌクレオチド５０９６であることを示していることに注意されたい。すなわち、crtＢのコード領域の公表された開始部位の上流かつcrtＢ／ＳＳＵ融合体のＳＳＵスプライス部位の後ろに、１３個のアミノ酸がある。これらのアミノ酸のうち１２個は、エルウィニア（Erwinia ）crtＢ上流配列から翻訳され、１つは追加されたメチオニンである。次に５３６３（ＥｃｏＲＶ）〜６００９（ＥｃｏＲＩ）のcrtＢを、ＳＳＵ−crtＢ融合体に結合させて、ｐＣＧＮ３３７３と呼ばれる完全なＳＳＵ−crtＢ融合構築物を得た（図１）。（２）フィトエンデサチュラーゼエンドウ豆ルビスコ（Rubisco）の小サブユニットの運搬ペプチド配列に融合したイー・ウレドボラ（E．uredovora）crtＩ遺伝子を含むプラスミドが、Misaw aら（The plant Journal（1993）4:833-840）により記載されている。ＳＳＵ−c rtＩ融合体とｎｏｓ３’停止領域を含有するこのプラスミドの約２．１kbのＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩ断片を、ナピン５’プロモーターから発現させるための位置にクローン化した。（３）ＧＧＰＰシンターゼイー・ウレドボラ（E．uredovora）crtＥ遺伝子に融合したＳＳＵ運搬体（tra nsit）を含有する同様の構築物を得た。ＳＳＵ−crtＥ融合体は、ｐＣＧＮ３３６０中の約１．２kbのＢｇｌII/ＢａｍＨＩ断片上に存在する。Ｂ．植物形質転換のための発現構築物（１）フィトエンシンターゼ完全なＳＳＵ／crtＢ融合体を有するｐＣＧＮ３３７３を、ＢｇｌIIとＢａｍＨＩで切断して、ＳＳＵ／crtＢ融合体を切り出した。得られる断片を、ＢａｍＨＩ部位で、ｐＣＧＮ３２２３中のナピン発現カセット中に連結した（ナピン発現カセットについてはWO94/10288を参照されたい）。次に、得られる構築物ｐＣＧＮ３３８９をＨｉｎｄIIIで消化して、ナピン５’−ＳＳＵ／crtＢ−ナピン３’ 断片を切り出し、これを次に、ＨｉｎｄIIIで切断したｐＣＧＮ１５５９ＰＡＳＳ中にクローン化してｐＣＧＮ３３９０を得た。ｐＣＧＮ１５５９ＰＡＳＳは、 McBrideらが記載したもの（Plant Mol．Biol．（1990）14:269-276）のようなアグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換のためのバイナリーベクターであり、ｐＣＧＮ１５５９から、以下の制限消化部位：Ａｓｐ７１８／ＡｓｃＩ／ＰａｃＩ／ＸｂａＩ／ＢａｍＨＩ／Ｓｗａｌ／Ｓｓｅ８３８７（ＰｓｔＩ）／ＨｉｎｄIIIを含有するリンカー領域によって、ｐＣＧＮ１５５９リンカー領域を置換することにより調製される。ｐＣＧＮ３３９０の地図を、図２Ａに示す。（２）フィトエンデサチユラーゼ上記のナピン５’／ＳＳＵ−crtＩ融合体／ｎｏｓ３’構築物を含む断片を、植物形質転換のためのバイナリーベクター中にクローン化して、ｐＣＧＮ９０１０を得た。ｐＣＧＮ９０１０の地図を図２Ｃに示す。（３）ＧＧＰＰシンターゼ完全なＳＳＵ／crtＥ融合体を有するｐＣＧＮ３３６０をＢｇｌIIとＢａｍＨＩで切断して、ＳＳＵ／crtＥ融合体を切り出した。得られる１．２kbの断片を、ＢａｍＨＩ部位で、ｐＣＧＮ３２２３中のナピン発現カセットに連結した。得られる構築物ｐＣＧＮ３３９１をＨｉｎｄIIIで消化して、ナピンプロモーター −ＳＳＵ／crtＥナピン３’断片を切り出し、これを次に、ＨｉｎｄIIIで切断したｐＣＧＮ１５５９ＰＡＳＳ中にクローン化してｐＣＧＮ３３９２を得た。ｐＣＧＮ３３９２の地図を図２Ｂに示す。（４）フィトエンシンターゼ＋フィトエンデサチュラーゼｐＣＧＮ３３８９由来のナピン５’−ＳＳＵ／crtＢ−ナピン３’断片とｐＣＧＮ９０１０中に存在するナピン５’／ＳＳＵ−crtＩ融合体／ｎｏｓ３’を、バイナリーベクターに挿入して、ｐＣＧＮ９００９を得た（図２Ｄに示す）。（５）アンチセンスεシクラーゼ＋フィトエンシンターゼブラシカ・ナプス（Brassica napus）εシクラーゼ遺伝子を、アラビドプシス（Arabidopsis）εシクラーゼ遺伝子（Cunningham FX Jr（1996）Plant Cell 8: 1613-1626）から設計したプライマーを使用して、ＰＣＲにより単離した。ビー・ナプス（B．napus）εシクラーゼ遺伝子の配列を図９（クローン９−４）と図１０（クローン７−６）に示す。アンチセンス構築物は、ｃＤＮＡクローン９ −４のＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩ断片を、ＸｈｏＩとＢｇｌIIで消化したナピン発現カセット（ｐＣＧＮ３２２３）中にクローン化することにより調製される。ナピン５’−アンチセンスεシクラーゼナピン３’断片は、ナピン５’−ＳＳＵ／cr tＢ−ナピン３’断片とともに、植物形質転換のためのバイナリーベクターにクローン化され、ｐＣＧＮ９００２が得られる（図２Ｅ）。（６）アンチセンスβシクラーゼ＋フィトエンシンターゼブラシカ・ナプス（Brassica napus）βシクラーゼ遺伝子は、アラビドプシス（Arabidopsis）βシクラーゼ遺伝子（Cunningham FX Jr（1996）Plant Cell 8: 1613-1626）から設計されるプライマーを使用して、ＰＣＲにより単離される。ビー・ナプス（B．napus）βシクラーゼｃＤＮＡ（３２〜３）の配列を図１１に示す。アンチセンス構築物は、βシクラーゼｃＤＮＡクローンのＸｈｏＩ断片を、ＸｈｏＩで消化したナピン発現カセット（ｐＣＧＮ３２２３）中にクローン化することにより調製される。アンチセンス配向でβシクラーゼを含有するクローンが選択される。ナピン５’−アンチセンスβシクラーゼナピン３’断片は、ナピン５’−ＳＳＵ／crtＢ−ナピン３’断片とともに、植物形質転換のためのバイナリーベクターにクローン化され、ｐＣＧＮ９０１７が得られる（図２Ｆ）。Ｃ．植物形質転換上記構築物を含有する形質転換ブラシカ・ナプス（Brassica napus）植物は、 Radkeら（Theor．Appl．Genet．（1988）75:685-694およびPlant Cell Reports （1992）11:499-505）に記載のように得られる。実施例２．トランスジェニック植物の解析Ａ．視覚的観察と分離比２１２／８６のナピン−ＳＳＵリーダー／crtＢ植物を、開花後２１日、２８日および３５日目に標識した。最初の植物３３９０−１を２８日目に採取した時、種子の一部は明らかに橙色であった。３５ｄｐａに、橙色は、分離比（segreg ation ratio）を得るのに充分明白であった。この橙色の種子の傾向が続き、得られた採取した１７株のそれぞれで見られる。分離比の表を、下記表１に示す。Ｂ．発達している種子のカロチノイド分析開花後約３５日目に採取した種子から、以下のようにカロチノイドを抽出した。トランスジェニック植物３３９０−１由来の８つの橙色の種子試料と２１２／８６変種ナタネ対照植物の８つの種子試料を、２００μｌの７０％アセトン／３０％メタノール中ですりつぶした。すりつぶした種子混合物を次に、微量遠心分離機中で約５分間遠心分離し、上清を除去した。ペレットにした種子物質を用いて、７０％アセトン／３０％メタノール抽出をさらに２回行い、すべての３つの上清をプールし、Ａ／Ｍ抽出物とラベルした。抽出のこの時点で、対照種子ペレットは白色であり、トランスジェニック種子由来の種子ペレットは黄色である。次にペレットをエーテルで２回抽出し、得られた上清をプールし、Ｅ抽出物とラベルする。Ａ／Ｍ抽出物を次に、以下のようにエーテルに移した。４５０μｌのエーテルと６００μｌの水を抽出物に加え、次にエーテル層を除去した。Ａ／Ｍ抽出物を次に、４００μｌのエーテルでさらに２回洗浄し、３つのＡ／Ｍ洗浄物由来のエーテル画分をプールした。上記のＥ抽出物を４００μｌの水で１回洗浄し、Ａ／Ｍエーテル画分とともにプールした。プールしたエーテル画分を、窒素ガスを吹き付けて約３００μｌの容量にし、シリンジミクロフィルターを使用してろ過した。試料バイアルを約１００μｌのエーテルで洗浄し、洗浄液を同様にろ過し、最初のろ液とともにプールして、総量約１５０μｌを得た。５０μｌのアリコートをさらに分析するまで−２０℃で保存し、残りの１００μｌの試料を以下のようにケン化した。１０％水酸化カリウム（ＫＯＨ）メタノール液１００μｌを、各１００μｌの試料に加え、混合物を暗所で室温で約２時間保存した。次に試料に４００μｌの水を加え、エーテル層を除去した。さらに層を分離するために、飽和ＮａＣｌで水を置換してもよい。次に水溶液を１００μｌのエーテルでさらに２回抽出し、エーテル試料をプールし、水で洗浄した。ケン化した試料を次に、RaininミクロソルブＣ１８カラム（長さ２５cm、外径４．６mm）で流速１．５ml／分でＨＰＬＣ分析により分析した。溶出に使用した勾配は以下の通りである：Ａ＝アセトニトリルＢ＝ヘキサン／塩化メチレン（１：１）Ｃ＝メタノール最初の溶液は、７０：２０：１０（Ａ：Ｂ：Ｃ）であった。２．５分に、溶液に５分間勾配をかけて６５：２５：１０（Ａ：Ｂ：Ｃ）にし、このまま１２．５分間維持した。次に溶液を２分間勾配をかけて７０：２０：１０（Ａ：Ｂ：Ｃ）にし、次に３分遅れて次の試料を注入した。溶出する試料の吸光度を４５０nmと２８０nmで連続的に追跡し、既知の化学的および生物学的標準物質を使用して、種々の吸光度ピークを同定した。図３と図４において、ケン化試料の分析結果をそれぞれ対照とｐＣＧＮ３３９０形質転換種子について示す。トランスジェニック植物種子中のα−カロチンと β−カロチンおよびフィトエンレベルの明らかな増加が観察され、これより少ないが、水酸化カロチノイドであるルテインレベルの増加も見られた。Ｃ．crtＢトランスジェニック植物由来の成熟種子のカロチノイドおよびトコフェロール分析成熟３３９０Ｔ２種子を、当該分野で公知の標準的ＨＰＬＣ法を用いて定量分析するために、分析ラボラトリーに送った。これらの分析結果を下記表２に示す。化合物レベルは、μｇ／ｇで示す。「えび茶色」と記載した種子は、種子の色に基づいて選択した。橙色の胚を有する種子は成熟すると、この栽培品種の野生型植物の種子のこげ茶色の外観ではなくえび茶色になる。「ランダム」と示された種子は、色について選択しなかった。３３９０−１は、Ｋａｎについて３対１に分離するように、「ランダム」集団は、無効なものの比率を含有する。えび茶色の集団は、トランスジェニック体のみを含む。この集団由来の無効なものを除去する試みのために、ホモ接合体を含めることが好ましい。非トランスジェニック試料では、「その他」には大体、非常に極性の化合物（例えば、ネオキサンチン、ビオラキサンチンなど）を含む。トランスジェニック試料では、「その他」には、これらの化合物と追加の化合物（例えば、ゼータ− カロチン、ニューロスポレン、およびモノ環状カロチノイド）を含む。ビー・ナプス（B．napus）変種Quantum（ＳＰ３００２１）の形質転換植物由来の３３９０Ｔ２種子のカロチノイド分析の結果を図１２に示す。ビー・ナプス（B．napus）変種２１２／８６（ＳＰ００１）の形質転換植物由来の３３９０Ｔ３種子のカロチノイド分析の結果を図１３に示す。上記結果は、成熟種子中ではcrtＢ遺伝子の発現の結果としてα−カロチンおよびβ−カロチンレベルが大きく増加していることを証明している。一般に、カロチノイドの全体的増加は非常に大きく、５０倍近くの着色カロチノイドおよびフィトエンとフィトフルエンが含まれる場合は最大６０倍までの増加がある。イソプレノイド経路を介するフラックスは、劇的に増加していることは明らかである。さらにα−トコフェロール（ビタミンＥ）レベルもまた５０％近く増加している。Ｄ．発芽試験３３９０−１の１０個の成熟種子と２１２／８６対照の１０個の種子を土壌に植え、立って出入りできる大きさの栽培室中で成長させた。トランスジェニック体は対照より１〜２日遅く出芽したが、１０個のすべての種子が発芽した。トランスジェニック体は、最初に出芽した時黄色っぽいピンク色であったが、１〜２日で緑色になった。最初の真の葉が出芽した時、色の差は認められなかった。トランスジェニックおよび対照種子から発芽した植物は両方とも、正常に成長した。Ｅ．脂肪酸分析成熟種子の脂肪酸組成を、トランスジェニック植物３３９０−１と３３９０− ８から採取した単一のＴ２種子のＧＣ分析により測定した。ランダム（Ｒ）およびえび茶色（Ｍ）集団（前記で定義された）の両方からの単一の種子を分析し、２１２／８６対照（ＳＰ００１−１）由来の種子と比較した。これらの分析の結果を、重量％総脂肪酸として、下記表３に示す。上記データは、各トランスジェニック株由来の種子中のオレイン酸（１８：１）の実質的な増加を示す。オレイン酸の増加は、リノール酸とリノレン酸を犠牲にしており、この２つはトランスジェニック株においては低下した。１８：０及び２０：０脂肪酸の増加もまた観察された。これらのデータに基づき、ランダム集団中に存在する無効な種子（null seeds）が同定でき、表３に星印（＊）で示してある。各トランスジェニック株由来のえび茶色集団中のすべての種子は、改変された胆肪酸組成が観察され、改変された脂肪酸組成がcrtＢ遺伝子の発現の結果であることを確認している。１８：１レベルの観察された増加に伴う脂肪酸組成の変化の、陽性および陰性の相関を示すトランスジェニック種子中の脂肪酸組成データの傾向は、図５〜７に示す。１８：１の増加は、１８：２および１８：３の減少と相関する（図５）。１８：１の増加はまた、１８：０および２０：０の増加と相関するが、１６：０に対してはほとんど影響は見られなかった（図６）。１８：０の増加はまた、２０：０の増加と相関した（図７）。Ｆ．crtＥトランスジェニック植物由来の成熟種子のカロチノイド分析イー・ウレドボラ（E．uredovora）crtＥ遺伝子を発現するように形質転換した３３９２ビー・ナプス（B．napus）植物の成熟Ｔ２種子で、カロチノイドを分析した。植物３３９２−ＳＰ３００２１−１６の種子中で、ルテインとβ−カロチンレベルの約２倍の増加が観察された。これらの種子ではリコペンも検出され、非形質転換対照植物の種子では検出できなかった。７つの追加の３３９２形質転換体由来の種子の分析では、カロチノイドレベルの大きな増加は認められなかった。実施例３ crtＢ植物の交配Ａ．トランスジェニック油特性ナピン−crtＢトランスジェニック植物の高オレイン酸特性を他の油特性の発現とともに評価するために、３３９０−１−６−８とマンゴスチンチオエステラーゼ（５２６６）とナツメグチオエステラーゼ（３８５４；WO96/23892を参照）との交配を作成した。２つの低リノレン酸（ＬＰ００４とＬＰ３０１０８）変種についても交配を作成した。カロチノイドと脂肪酸組成の半種子分析（half see d analysis）を、分離種子について行い、半種子価（half seed value）の平均を下記表４と５に示す。上記結果が証明するように、植物種子組織中で優先的に発現されるプロモーターの制御下での、初期カロチノイド生合成遺伝子の発現のための植物の形質転換により、α−カロチンおよびβ−カロチンの劇的な増加（１００〜２００倍）ならびに総カロチノイドの６０倍の増加を得ることができる。このフラックスの増加は、前記のように特殊生成物の産生のための経路をプライムし、またα−トコフェロール（ビタミンＥ）の産生の増加を引き起こす。さらに、トランスジェニック植物種子中で脂肪酸組成も改変することができることは明らかである。こうして種子は、新規生成物を産生するために、特定のカロチノイドの産生したり、高オレイン酸油を提供したりするために、使用することができる。本明細書中のすべての刊行物および特許出願は、本発明が関係する当業者の技術レベルを示す。本明細書中のすべての刊行物および特許出願は、各々が具体的にかつ個々に参考として本明細書に組み込まれると指示されたものとして、参考として本明細書に組み込まれる。前記本発明をより明確に理解できるように、例示および実施例を使用してある程度詳細に記載したが、本発明の請求の範囲内でいくつかの変更や変形が可能であることは明らかであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｐ 23/00 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ

Claims

【特許請求の範囲】１．宿主植物由来の種子中のカロチノイドレベルを改変する方法であって、作動可能に結合された成分として、植物種子中で優先的に発現される遺伝子由来の転写開始領域と、プラスチド運搬ペプチドと、少なくとも１つのカロチノイド生合成遺伝子のＤＮＡコード配列と、転写停止領域とを含む構築物によって、該宿主植物を形質転換することを含む、上記方法。２．カロチノイドレベルが増加される、請求項１記載の方法。３．前記カロチノイド生合成遺伝子が、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ、フィトエンシンターゼ、フィトエンデサチュラーゼ、イソペンテニルジホスフェートイソメラーゼ、β−カロチンヒドロキシラーゼ、ε−ヒドロキシラーゼ、リコペンε−シクラーゼ、リコペンβ−シクラーゼ、およびcrtＷによりコードされるアスタキサンチン生合成酵素よりなる群から選択される酵素をコードする、請求項１記載の方法。４．ＤＮＡコード配列が、アンチセンスまたは同時抑制により、前記宿主植物本来のカロチノイド生合成遺伝子の発現を低下させる、請求項１記載の方法。５．前記カロチノイド生合成遺伝子が、リコペンε−シクラーゼ、リコペンβ− シクラーゼ、ε−ヒドロキシラーゼ、β−ヒドロキシラーゼ、およびフィトエンデサチュラーゼよりなる群から選択される、請求項４記載の方法。６．前記カロチノイド生合成遺伝子が前記宿主植物本来のものではない、請求項２記載の方法。７．前記カロチノイド生合成遺伝子が原核生物由来である、請求項２記載の方法。８．前記宿主植物が脂肪種子アブラナ属（Brassica）植物である、請求項１記載の方法。９．前記転写開始領域が、アブラナ属（Brassica）種子組織中で優先的に発現される遺伝子由来である、請求項１記載の方法。１０．前記転写開始領域がナピン遺伝子由来である、請求項９記載の方法。１１．宿主植物由来の種子中のカロチノイド生合成フラックスを増加させる方法であって、作動可能に結合された成分として、植物種子中で優先的に発現される遺伝子由来の転写開始領域と、１次遺伝子のＤＮＡコード配列と、転写停止領域とを含む構築物によって該宿主植物を形質転換することを含む、ここで該１次遺伝子は初期カロチノイド生合成遺伝子である、上記方法。１２．初期カロチノイド生合成遺伝子が、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ、フィトエンシンターゼ、フィトエンデサチュラーゼおよびイソペンテニルジホスフェートイソメラーゼよりなる群から選択される酵素をコードする、請求項１１記載の方法。１３．前記初期カロチノイド生合成遺伝子がフィトエンシンターゼをコードする、請求項１２記載の方法。１４．前記遺伝子が原核生物由来である、請求項１１記載の方法。１５．前記遺伝子がcrtＢである、請求項１３記載の方法。１６．前記宿主植物が２次初期カロチノイド生合成遺伝子によって形質転換される、請求項１１記載の方法。１７．前記１次遺伝子がフィトエンシンターゼをコードし、前記２次初期カロチノイド生合成遺伝子がフィトエンデサチュラーゼをコードする、請求項１６記載の方法。１８．前記転写開始領域が、アブラナ属（Brassica）種子組織中で優先的に発現される遺伝子由来である、請求項１７記載の方法。１９．前記転写開始領域がナピン遺伝子由来である、請求項１７記載の方法。２０．宿主植物由来の種子中のα−カロチンおよびβ−カロチンを増加させる方法であって、作動可能に結合された成分として、植物種子中で優先的に発現される遺伝子由来の転写開始領域と、プラスチド運搬ペプチドと、１次遺伝子のＤＮＡコード配列と、転写停止領域とを含む発現カセットによって該宿主植物を形質転換することを含む、ここで該１次遺伝子がゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ、フィトエンシンターゼ、フィトエンデサチュラーゼ、およびイソペンテニルジホスフェートイソメラーゼよりなる群から選択される初期カロチノイド生合成遺伝子である、上記方法。２１．前記種子中のルテインレベルが増加される、請求項２０記載の方法。２２．前記初期カロチノイド生合成遺伝子がフィトエンシンターゼをコードする、請求項２０または２１記載の方法。２３．前記遺伝子が非高等植物源由来である、請求項２０または２１記載の方法。２４．前記遺伝子がcrtＢである、請求項２２記載の方法。２５．前記宿主植物が脂肪種子アブラナ属（Brassica）植物である、請求項２０記載の方法。２６．前記転写開始領域が、アブラナ属（Brassica）種子組織中で優先的に発現される遺伝子由来である、請求項２０記載の方法。２７．前記転写開始領域がナピン遺伝子由来である、請求項２６記載の方法。２８．種子中に目的のカロチノイド化合物を産生させる方法であって、該種子を産生する形質転換植物を得ることを包含し、該植物はそのゲノム中に、プラスチド運搬ペプチドと、植物種子中で優先的に発現される遺伝子由来の転写開始領域とに作動可能に結合された初期カロチノイド生合成遺伝子である１次遺伝子と；植物種子中で優先的に発現される遺伝子由来の転写開始領域に作動可能に結合された少なくとも１つの２次遺伝子であって、プラスチド運搬ペプチドに作動可能に結合された該カロチノイド化合物の経路中のカロチノイド生合成遺伝子をコードするか、またはＤＮＡ配列の転写を引き起こし、これは該カロチノイド化合物を改質することができる酵素の発現の阻害により該カロチノイド化合物を蓄積させる、但し該阻害は該酵素のアンチセンスまたは同時抑制により得られる、該２次遺伝子と、を有し発現することを特徴とする上記方法。２９．前記初期カロチノイド生合成遺伝子が、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ、フィトエンシンターゼ、フィトエンデサチュラーゼ、およびイソペンテニルジホスフェートイソメラーゼよりなる群から選択される酵素をコードする、請求項２８記載の方法。３０．前記初期カロチノイド生合成遺伝子がフィトエンシンターゼをコードする、請求項２９記載の方法。３１．前記２次遺伝子が、β−カロチンヒドロキシラーゼ、crtＷによりコードされるアスタキサンチン生合成酵素、およびε−ヒドロキシラーゼよりなる群から選択される酵素をコードするか、または前記２次遺伝子が、リコペンε−シクラーゼ、リコペンβ−シクラーゼまたはフィトエンデサチュラーゼをコードする内因性植物遺伝子の転写を阻害することを特徴とする、請求項２８記載の方法。３２．前記２次遺伝子がβ−カロチンヒドロキシラーゼをコードする、請求項３１記載の方法。３３．前記２次遺伝子が、crtＷによりコードされるアスタキサンチン生合成酵素をコードする、請求項３１記載の方法。３４．前記植物が２つの２次遺伝子を発現する、請求項３１記載の方法。３５．前記２次遺伝子がcrtＺとcrtＷである、請求項３４記載の方法。３６．前記２次遺伝子がリコペンε−シクラーゼの転写の阻害に導く、請求項３１記載の方法。３７．前記２次遺伝子が、リコペンε−シクラーゼとリコペンβ−シクラーゼの転写の阻害に導く、請求項３４記載の方法。３８．前記２次遺伝子がε−ヒドロキシラーゼをコードする、請求項３１記載の方法。３９．前記２次遺伝子がε−ヒドロキシラーゼとcrtZである、請求項３４記載の方法。４０．前記２次遺伝子がフィトエンデサチュラーゼをコードする、請求項３１記載の方法。４１．前記種子がアブラナ属（Brassica）である、請求項２８記載の方法。４２．前記転写開始領域が、アブラナ属（Brassica）種子組織中で優先的に発現される遺伝子由来である、請求項２７記載の方法。４３．前記転写開始領域がナピン遺伝子由来である、請求項４２記載の方法。４４．目的の植物由来の種子中の脂肪酸レベルを改変する方法であって、作動可能に結合された成分として、植物種子中で優先的に発現される遺伝子由来の転写開始領域と、プラスチド運搬ペプチドと、１次遺伝子のＤＮＡコード配列と、転写停止領域とを含む発現カセットによって該目的の植物を形質転換すること含む、ここで１次遺伝子が初期カロチノイド生合成遺伝子である、上記方法。４５．前記初期カロチノイド生合成遺伝子が、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ、フィトエンシンターゼ、フィトエンデサチュラーゼ、およびイソペンテニルジホスフェートイソメラーゼよりなる群から選択される酵素をコードする、請求項４４記載の方法。４６．前記初期カロチノイド生合成遺伝子がフィトエンシンターゼをコードする、請求項４５記載の方法。４７．前記目的植物が、脂肪種子アブラナ属（Brassica）、綿花、大豆、ベニバナ、ヒマワリ、パーム、ココナツ、およびコーンよりなる群から選択される脂肪種子作物である、請求項４４記載の方法。４８．前記植物が脂肪種子アブラナ属植物である、請求項４７記載の方法。４９．前記遺伝子がcrtＢである、請求項４６記載の方法。５０．前記転写開始領域が、アブラナ属（Brassica）種子中で優先的に発現される遺伝子由来である、請求項４４記載の方法。５１．前記転写開始領域がナピン遺伝子由来である、請求項５０記載の方法。５２．前記種子がオレイン酸の増加を含む、請求項４４記載の方法。５３．前記種子が更にリノレン酸および／またはリノール酸脂肪酸の低下を含む、請求項５２記載の方法。５４．形質転換種子または形質転換胚のスクリーニング法であって、作動可能に結合された成分として、植物種子中で優先的に発現される遺伝子由来の転写開始領域と、運搬ペプチドと、少なくとも１つのカロチノイド生合成遺伝子のＤＮＡコード配列と、転写停止領域とを含む発現カセットによって植物を形質転換する工程であって、ここで該初期カロチノイド生合成遺伝子は、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ、フィトエンシンターゼ、フィトエンデサチュラーゼおよびイソペンテニルジホスフェートイソメラーゼよりなる群から選択される酵素をコードする、上記工程と、黄色、橙色または赤色を示す該形質転換種子または形質転換胚を選択する工程と、を含む、上記方法。５５．前記初期カロチノイド生合成遺伝子がフィトエンシンターゼである、請求項５４記載の方法。５６．前記植物が、脂肪種子アブラナ属（Brassica）植物であり、前記形質転換胚が橙色を示す、請求項５５記載の方法。５７．植物形質転換におけるマーカー遺伝子としてカロチノイド生合成遺伝子を使用する方法であって、目的遺伝子とカロチノイド生合成遺伝子で植物を形質転換する工程であって、ここで、該カロチノイド生合成遺伝子は、運搬ペプチドと植物種子中で優先的に発現される遺伝子由来の転写開始領域とに作動可能に結合している、上記工程と、黄色、橙色または赤色を示す胚をスクリーニングするか、または黄色、橙色から赤色を有する種子について該形質転換植物から種子をスクリーニングすることにより、該形質転換植物を選択する工程と、を含む、上記方法。５８．前記カロチノイド生合成遺伝子が、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ、フィトエンシンターゼ、フィトエンデサチュラーゼおよびイソペンテニルジホスフェートイソメラーゼよりなる群から選択される、請求項５７記載の方法。５９．前記初期カロチノイド生合成遺伝子がフィトエンシンターゼである、請求項５８記載の方法。６０．改変したカロチノイドレベルを有する種子を産生するトランスジェニック植物。６１．前記種子が、増加したレベルの少なくとも１つの目的カロチノイド化合物を産生し、該目的化合物が、α−カロチン、β−カロチン、リコペン、ルテイン、ゼアキサンチン、カンタキサンチン、フィトエン、α−クリプトキサンチン、 β−クリプトキサンチン、ζ−カロチン、フィトフルエン、ニューロスポランおよびアスタキサンチンよりなる群から選択されることを特徴とする、請求項６０記載の植物。６２．前記種子が、増加したレベルのα−カロチン、β−カロチン、およびルテインを産生する、請求項６１記載の植物。６３．前記種子が改変脂肪酸レベルも有する、請求項６２記載の植物。６４．前記種子が、増加したレベルのオレイン酸と、低下したレベルのリノール酸および／またはリノレン酸を有する、請求項６３記載の植物。６５．改変カロチノイドレベルを有する、形質転換種子。６６．前記種子が、増加したレベルの少なくとも１つの目的のカロチノイド化合物を産生し、該目的化合物が、α−カロチン、β−カロチン、リコペン、ルテイン、ゼアキサンチン、カンタキサンチン、α−クリプトキサンチン、β−クリプトキサンチン、ζ−カロチン、フィトフルエン、ニューロスポランおよびアスタキサンチンよりなる群から選択されることを特徴とする、請求項６５記載の形質転換種子。６７．前記種子が、増加したレベルのα−カロチン、β−カロチン、およびルテインを産生する、請求項６６記載の形質転換種子。６８．前記種子が改変した脂肪酸レベルを有する、請求項６５記載の形質転換種子。６９．前記種子が、増加したレベルのオレイン酸と、低下したレベルのリノール酸および／またはリノレン酸を有する、請求項６８記載の形質転換種子。７０．宿主植物由来の種子中でトコフェロールレベルを増加させる方法であって、作動可能に結合された成分として、植物種子中で優先的に発現される遺伝子由来の転写開始領域と、プラスチド運搬ペプチドと、１次遺伝子のＤＮＡコード配列と、転写停止領域とを含む発現カセットによって該宿主植物を形質転換することを含む、ここで該１次遺伝子が、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ、フィトエンシンターゼ、フィトエンデサチュラーゼ、およびイソペンテニルジホスフエートイソメラーゼよりなる群から選択される初期カロチノイド生合成遺伝子である、上記方法。７１．前記初期カロチノイド生合成遺伝子がフィトエンシンターゼをコードする、請求項７０記載の方法。７２．前記種子中のα−トコフェロールレベルが少なくとも５０％増加している、請求項７１記載の方法。７３．前記遺伝子が非高等植物源由来である、請求項７１記載の方法。７４．前記遺伝子がcrtＢである、請求項７３記載の方法。７５．前記宿主植物が油種子アブラナ属植物である、請求項７０記載の方法。７６．請求項１、１１、２０、２８、４４、および７０のいずれか１項に記載の方法により産生される種子。７７．請求項１、１１、２０、２８、４４、５４、５７、および７０のいずれか１項に記載の方法により産生される植物。７８．請求項１、１１、２０、２８、４４、および７０のいずれか１項に記載の方法により産生される種子から抽出される油。７９．請求項１、１１、２０、２８、および７０のいずれか１項に記載の方法により産生される種子から抽出されるミール。８０．前記種子が、脂肪種子アブラナ属（Brassica）、綿花、大豆、ベニバナ、ヒマワリ、ココナツ、パーム、コムギ、オオムギ、イネ、コーン、オートムギ、アマランサス（amaranth）、カボチャ、カボチャ属、ゴマ、ケシ、ブドウ、ヤエナリ、ピーナツ、エンドウ、インゲンマメ、ダイコン、アルファルファ、ココア、コーヒー、木のナッツよりなる群から選択される植物由来である、請求項１、１１、２０、２８、および７０のいずれか１項に記載の方法。８１．前記種子が、脂肪種子アブラナ属（Brassica）、綿花、大豆、ベニバナ、ヒマワリ、パーム、ココナツ、およびコーンよりなる群から選択される脂肪種子作物植物由来である、請求項８０記載の方法。