JP2002525034A - １−デオキシ−ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼをコードするｄｎａ配列および植物におけるその過剰産生 - Google Patents
１−デオキシ−ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼをコードするｄｎａ配列および植物におけるその過剰産生Info
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Abstract
(57)【要約】
アラビドプシス(Arabidopsis)または大腸菌に由来する1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸シンターゼ遺伝子の植物における過剰産生による、ビタミンE生合成活性が増強された植物の生産方法。
Description
【０００１】 本発明は、トコフェロール、ビタミンK、クロロフィルおよび／またはカロテ
ノイドの含量が増加した植物の生産のための、1-デオキシ-D-キシルロース-5-リ
ン酸シンターゼ(DOXS)をコードするDNA配列の使用に関し、具体的には、トコフ
ェロール、ビタミンK、クロロフィルおよび／またはカロテノイドの含量が増加
した植物の生産のための、配列番号１もしくは配列番号３のDNA配列または配列
番号３のDNA配列にハイブリダイズするDNA配列の使用、配列番号１もしくは配列
番号３のDNA配列および配列番号５もしくは後者のDNA配列にハイブリダイズし、
かつ1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸シンターゼ(DOXS)およびp-ジヒドロキ
シフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ(HPPD)をコードするDNA配列の使用、ト
コフェロール、ビタミンK、クロロフィルおよび／またはカロテノイドの含量が
増加した植物の生産のための、配列番号１もしくは配列番号３のDNA配列および
配列番号７のDNA配列もしくは後者のDNA配列にハイブリダイズし、かつ1-デオキ
シ-D-キシルロース-5-リン酸シンターゼ(DOXS)およびゲラニルゲラニル-ピロリ
ン酸オキシドレダクターゼ(GGPPOR)をコードするDNA配列の使用、トコフェロー
ル、ビタミンK、クロロフィルおよび／またはカロテノイドの含量が増加した植
物の生産のための、配列番号１もしくは配列番号３のDNA配列、配列番号５のDNA
配列および配列番号７のDNA配列または後者のDNA配列にハイブリダイズし、かつ
1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸シンターゼ(DOXS)、ヒドロキシフェニルピ
ルビン酸ジオキシゲナーゼ(HPPD)およびゲラニルゲラニル-ピロリン酸オキシド
レダクターゼ(GGPPOR)をコードするDNA配列の使用、配列番号１もしくは配列番
号３のDNA配列、配列番号１もしくは配列番号３および配列番号５のDNA配列、配
列番号１もしくは配列番号３および配列番号７のDNA配列、または配列番号１も
しくは配列番号３および配列番号５および配列番号７のDNA配列を含む、トコフ
ェロール、ビタミンK、クロロフィルおよび／またはカロテノイドの含量が増加
した植物の生産方法、この方法で生産された植物そのもの、ならびにDOXS阻害剤
を同定するための試験系を製造するための配列番号１もしくは配列番号３の使用
、に関する。
ノイドの含量が増加した植物の生産のための、1-デオキシ-D-キシルロース-5-リ
ン酸シンターゼ(DOXS)をコードするDNA配列の使用に関し、具体的には、トコフ
ェロール、ビタミンK、クロロフィルおよび／またはカロテノイドの含量が増加
した植物の生産のための、配列番号１もしくは配列番号３のDNA配列または配列
番号３のDNA配列にハイブリダイズするDNA配列の使用、配列番号１もしくは配列
番号３のDNA配列および配列番号５もしくは後者のDNA配列にハイブリダイズし、
かつ1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸シンターゼ(DOXS)およびp-ジヒドロキ
シフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ(HPPD)をコードするDNA配列の使用、ト
コフェロール、ビタミンK、クロロフィルおよび／またはカロテノイドの含量が
増加した植物の生産のための、配列番号１もしくは配列番号３のDNA配列および
配列番号７のDNA配列もしくは後者のDNA配列にハイブリダイズし、かつ1-デオキ
シ-D-キシルロース-5-リン酸シンターゼ(DOXS)およびゲラニルゲラニル-ピロリ
ン酸オキシドレダクターゼ(GGPPOR)をコードするDNA配列の使用、トコフェロー
ル、ビタミンK、クロロフィルおよび／またはカロテノイドの含量が増加した植
物の生産のための、配列番号１もしくは配列番号３のDNA配列、配列番号５のDNA
配列および配列番号７のDNA配列または後者のDNA配列にハイブリダイズし、かつ
1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸シンターゼ(DOXS)、ヒドロキシフェニルピ
ルビン酸ジオキシゲナーゼ(HPPD)およびゲラニルゲラニル-ピロリン酸オキシド
レダクターゼ(GGPPOR)をコードするDNA配列の使用、配列番号１もしくは配列番
号３のDNA配列、配列番号１もしくは配列番号３および配列番号５のDNA配列、配
列番号１もしくは配列番号３および配列番号７のDNA配列、または配列番号１も
しくは配列番号３および配列番号５および配列番号７のDNA配列を含む、トコフ
ェロール、ビタミンK、クロロフィルおよび／またはカロテノイドの含量が増加
した植物の生産方法、この方法で生産された植物そのもの、ならびにDOXS阻害剤
を同定するための試験系を製造するための配列番号１もしくは配列番号３の使用
、に関する。
【０００２】 現在まで、植物に関する分子遺伝学的研究の重要な目的は、糖、酵素およびア
ミノ酸の含量が増加した植物の作製であった。しかし、ビタミンの含量、例えば
トコフェロールの含量が増加した植物の開発にも市場的な興味がある。
ミノ酸の含量が増加した植物の作製であった。しかし、ビタミンの含量、例えば
トコフェロールの含量が増加した植物の開発にも市場的な興味がある。
【０００３】 天然に存在するビタミンE活性を有する８種の化合物は、6-クロマノールの誘
導体である(Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A 27 (19
96), VCH Verlagsgesellschaft, Chapter 4, 478-488, Vitamin E)。第１のグル
ープ(1a〜d)は、トコフェロールから誘導されるものであるが、第２のグループ
はトコトリエノールの誘導体(2a〜d)からなる： 1a、α-トコフェロール：R1=R2=R3=CH3 1b、β-トコフェロール [148-03-8]：R1=R3=CH3、R2=H 1c、γ-トコフェロール [54-28-4]：R1=H、R2=R3=CH3 1d、δ-トコフェロール [119-13-1]：R1=R2=H、R3=CH3 2a、α-トコトリエノール[1721-51-3]：R1=R2=R3=CH3 2b、β-トコトリエノール[490-23-3]：R1=R3=CH3、R2=H 2c、γ-トコトリエノール[14101-61-2]：R1=H、R2=R3=CH3 2d、δ-トコトリエノール[25612-59-3]：R1=R2=H、R3=CH3
導体である(Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A 27 (19
96), VCH Verlagsgesellschaft, Chapter 4, 478-488, Vitamin E)。第１のグル
ープ(1a〜d)は、トコフェロールから誘導されるものであるが、第２のグループ
はトコトリエノールの誘導体(2a〜d)からなる： 1a、α-トコフェロール：R1=R2=R3=CH3 1b、β-トコフェロール [148-03-8]：R1=R3=CH3、R2=H 1c、γ-トコフェロール [54-28-4]：R1=H、R2=R3=CH3 1d、δ-トコフェロール [119-13-1]：R1=R2=H、R3=CH3 2a、α-トコトリエノール[1721-51-3]：R1=R2=R3=CH3 2b、β-トコトリエノール[490-23-3]：R1=R3=CH3、R2=H 2c、γ-トコトリエノール[14101-61-2]：R1=H、R2=R3=CH3 2d、δ-トコトリエノール[25612-59-3]：R1=R2=H、R3=CH3
【０００４】 大きな市場的重要性を有する化合物は、α-トコフェロールである。
【０００５】 組織培養または種子の突然変異誘発および自然選択によるトコフェロール含量
の増加した農産用植物の開発には限界がある。例えば、一方では、トコフェロー
ル含量は組織培養においてさえ測定可能である必要があり、他方では、組織培養
技術によって操作し得る植物のみが、細胞培養から全植物にまで再生し得る植物
である。さらに、農産用植物は、突然変異誘発及び選択の後、場合によっては数
回の戻し交配によって再度消失させる必要のある望ましくない性質を示すことが
ある。さらに、交配によってトコフェロール含量を増加させることができるのは
、同一種の植物に限られる。
の増加した農産用植物の開発には限界がある。例えば、一方では、トコフェロー
ル含量は組織培養においてさえ測定可能である必要があり、他方では、組織培養
技術によって操作し得る植物のみが、細胞培養から全植物にまで再生し得る植物
である。さらに、農産用植物は、突然変異誘発及び選択の後、場合によっては数
回の戻し交配によって再度消失させる必要のある望ましくない性質を示すことが
ある。さらに、交配によってトコフェロール含量を増加させることができるのは
、同一種の植物に限られる。
【０００６】 これらの理由から、トコフェロール合成活性をコードする必須生合成遺伝子を
単離し、標的の農産用植物中に導入する遺伝子工学的方法は、古典的な育種法よ
りも優れている。この方法の前提条件は、生合成およびその調節が公知であり、
生合成活性に影響する遺伝子が同定されていることである。
単離し、標的の農産用植物中に導入する遺伝子工学的方法は、古典的な育種法よ
りも優れている。この方法の前提条件は、生合成およびその調節が公知であり、
生合成活性に影響する遺伝子が同定されていることである。
【０００７】 イソプレノイドまたはテルペノイドは、様々なクラスの脂溶性分子からなり、
部分的に、もしくは完全にC5−イソプレン単位から形成される。純粋なプレニル
脂質(例えばカロテノイド)は、専らイソプレン単位から誘導されるC骨格からな
るのに対して、混合プレニル脂質(例えばクロロフィル)は、芳香族核に結合した
イソプレノイド側鎖を有する。
部分的に、もしくは完全にC5−イソプレン単位から形成される。純粋なプレニル
脂質(例えばカロテノイド)は、専らイソプレン単位から誘導されるC骨格からな
るのに対して、混合プレニル脂質(例えばクロロフィル)は、芳香族核に結合した
イソプレノイド側鎖を有する。
【０００８】 プレニル脂質の生合成は、3個のアセチル-CoA単位から始まる。3個のアセチル
-CoA単位は、β-ヒドロキシメチルグルタリル-CoA(HMG-CoA)およびメバロン酸を
介して最初のイソプレン単位(C5)であるイソペンテニルピロリン酸(IPP)に変換
される。最近、メバロン酸非依存的経路が種々の真正細菌類、緑藻類および植物
クロロプラストに存在し、IPPを産生することが、C13を用いたin vivoの栄養試
験により示された：
-CoA単位は、β-ヒドロキシメチルグルタリル-CoA(HMG-CoA)およびメバロン酸を
介して最初のイソプレン単位(C5)であるイソペンテニルピロリン酸(IPP)に変換
される。最近、メバロン酸非依存的経路が種々の真正細菌類、緑藻類および植物
クロロプラストに存在し、IPPを産生することが、C13を用いたin vivoの栄養試
験により示された：
【０００９】 これは、ピルビン酸の脱炭酸反応により生成するヒドロキシエチルチアミンを
必要とし、グリセルアルデヒド3-リン酸(3-GAP)が、1-デオキシ-D-キシルロース
-5-リン酸シンターゼにより媒介される「トランスケトラーゼ」反応において、
最初に1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸に変換される(Schwenderら、FEBS L
ett. 414(1), 129-134(1997); Arigoniら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94(2),
10600-10605(1997); Langeら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(5), 2100-2104
(1998); Lichtenthalerら、FEBS Lett. 400(3), 271-274(1997))。後者は次いで
分子内転位によりIPPに変換される(Arigoniら、1997)。生化学的データは、メバ
ロン酸経路が細胞質ゾル中で働き、フィトステロールの生成をもたらすことを示
している。メバロン酸生成の特異的阻害剤である抗生物質メビノリンは、細胞質
におけるステロール生合成の阻害のみをもたらし、色素体におけるプレニル脂質
生成は影響されない(BachおよびLichtenthaler、Physiol. Plant 59(1983), 50-
60)。対照的に、メバロン酸非依存的経路は、色素体に局在し、主にカロテノイ
ドおよび色素体性プレニル脂質の生成をもたらす(Schwenderら、1997；Arigoni
ら、1997)。
必要とし、グリセルアルデヒド3-リン酸(3-GAP)が、1-デオキシ-D-キシルロース
-5-リン酸シンターゼにより媒介される「トランスケトラーゼ」反応において、
最初に1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸に変換される(Schwenderら、FEBS L
ett. 414(1), 129-134(1997); Arigoniら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94(2),
10600-10605(1997); Langeら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(5), 2100-2104
(1998); Lichtenthalerら、FEBS Lett. 400(3), 271-274(1997))。後者は次いで
分子内転位によりIPPに変換される(Arigoniら、1997)。生化学的データは、メバ
ロン酸経路が細胞質ゾル中で働き、フィトステロールの生成をもたらすことを示
している。メバロン酸生成の特異的阻害剤である抗生物質メビノリンは、細胞質
におけるステロール生合成の阻害のみをもたらし、色素体におけるプレニル脂質
生成は影響されない(BachおよびLichtenthaler、Physiol. Plant 59(1983), 50-
60)。対照的に、メバロン酸非依存的経路は、色素体に局在し、主にカロテノイ
ドおよび色素体性プレニル脂質の生成をもたらす(Schwenderら、1997；Arigoni
ら、1997)。
【００１０】 IPPは、その異性体であるジメチルアリルピロリン酸(DMAPP)と平衡状態にある
。頭−尾付加におけるIPPとDMAPPとの縮合により、モノテルペン(C10)のゲラニ
ルピロリン酸(GPP)が生じる。さらなるIPP単位の付加により、セスキテルペン(C 15 )のファルネシル(farnesy)ピロリン酸(FPP)およびジテルペン(C20)のゲラニル
‐ゲラニルピロリン酸(GGPP)が生じる。２個のGGPP分子の連結により、カロテノ
イドのC40前駆体が生成する。GGPPは、プレニル鎖ヒドロゲナーゼにより、フィ
チルピロリン酸(PPP)、すなわちトコフェロールのさらなる生成のための出発物
質に変換される。
。頭−尾付加におけるIPPとDMAPPとの縮合により、モノテルペン(C10)のゲラニ
ルピロリン酸(GPP)が生じる。さらなるIPP単位の付加により、セスキテルペン(C 15 )のファルネシル(farnesy)ピロリン酸(FPP)およびジテルペン(C20)のゲラニル
‐ゲラニルピロリン酸(GGPP)が生じる。２個のGGPP分子の連結により、カロテノ
イドのC40前駆体が生成する。GGPPは、プレニル鎖ヒドロゲナーゼにより、フィ
チルピロリン酸(PPP)、すなわちトコフェロールのさらなる生成のための出発物
質に変換される。
【００１１】 ビタミンEおよびKの産生をもたらす混合プレニル脂質の環構造はキノンを含み
、その初期の代謝物はシキミ酸経路から誘導される。芳香族アミノ酸であるフェ
ニルアラニンおよびチロシンは、ヒドロキシフェニルピルビン酸に変換され、こ
れは二原子酸素添加反応によりホモゲンチジン酸に変換される。後者は、PPPに
結合して、α-トコフェロールおよびα-トコキノンの前駆体である2-メチル-6-
フィチルキノールを生成する。メチル基供与体としてS-アデノシルメチオニンを
用いるメチル化ステップにより、最初に2,3-ジメチル-6-フィチルキノールが、
次いで、環化によりγ-トコフェロールが、再度メチル化によりα-トコフェロー
ルが生成する(Richter, Biochemie der Pflanzen, Georg Thieme Verlag Stuttg
art, 1996)。
、その初期の代謝物はシキミ酸経路から誘導される。芳香族アミノ酸であるフェ
ニルアラニンおよびチロシンは、ヒドロキシフェニルピルビン酸に変換され、こ
れは二原子酸素添加反応によりホモゲンチジン酸に変換される。後者は、PPPに
結合して、α-トコフェロールおよびα-トコキノンの前駆体である2-メチル-6-
フィチルキノールを生成する。メチル基供与体としてS-アデノシルメチオニンを
用いるメチル化ステップにより、最初に2,3-ジメチル-6-フィチルキノールが、
次いで、環化によりγ-トコフェロールが、再度メチル化によりα-トコフェロー
ルが生成する(Richter, Biochemie der Pflanzen, Georg Thieme Verlag Stuttg
art, 1996)。
【００１２】 酵素の操作が代謝物の流れの方向に影響し得ることを示す例を文献中に見出す
ことができる。２個のGGPP分子を互いに結合して15-シス-フィトエンを与えるフ
ィトエンシンターゼの改変された発現を利用した実験において、これらのトラン
スジェニックトマト植物におけるカロテノイドの量に対する直接的な効果を測定
することが可能であった(FrayおよびGrierson、Plant Mol. Biol. 22(4), 589-6
02(1993); Frayら、Plant J., 8, 693-701(1995))。期待されたように、フェニ
ルアラニン-アンモニウムリアーゼの量が減少したトランスジェニックタバコ植
物では、フェニルプロパノイドの量が減少することが示された。この酵素、フェ
ニルアラニン-アンモニウムリアーゼは、フェニルアラニンの分解を触媒し、従
ってフェニルプロパノイド生合成からフェニルアラニンを除去する(Bateら、Pro
c. Natl. Acad. Sci USA 91 (16):7608-7612(1994); Howlesら、Plant Physiol.
112. 1617-1624 (1996))。
ことができる。２個のGGPP分子を互いに結合して15-シス-フィトエンを与えるフ
ィトエンシンターゼの改変された発現を利用した実験において、これらのトラン
スジェニックトマト植物におけるカロテノイドの量に対する直接的な効果を測定
することが可能であった(FrayおよびGrierson、Plant Mol. Biol. 22(4), 589-6
02(1993); Frayら、Plant J., 8, 693-701(1995))。期待されたように、フェニ
ルアラニン-アンモニウムリアーゼの量が減少したトランスジェニックタバコ植
物では、フェニルプロパノイドの量が減少することが示された。この酵素、フェ
ニルアラニン-アンモニウムリアーゼは、フェニルアラニンの分解を触媒し、従
ってフェニルプロパノイド生合成からフェニルアラニンを除去する(Bateら、Pro
c. Natl. Acad. Sci USA 91 (16):7608-7612(1994); Howlesら、Plant Physiol.
112. 1617-1624 (1996))。
【００１３】 現在まで、個々の生合成遺伝子の過剰発現によって植物のトコフェロール含量
を増加させるために代謝物のフラックスを増加させるということに関してはほと
んど開示されていない。酵素p-ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ
(HPPD)の発現の増加またはダウンレギュレーションによって、トコフェロール含
量を改変するというWO 97/27285号にわずかに記載されているのみである。
を増加させるために代謝物のフラックスを増加させるということに関してはほと
んど開示されていない。酵素p-ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ
(HPPD)の発現の増加またはダウンレギュレーションによって、トコフェロール含
量を改変するというWO 97/27285号にわずかに記載されているのみである。
【００１４】 本発明の目的は、トコフェロール、ビタミンK、クロロフィルおよびカロテノ
イドの含量が増加したトランスジェニック植物を開発することである。
イドの含量が増加したトランスジェニック植物を開発することである。
【００１５】 本発明者らは、この目的が植物において1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸
シンターゼ(DOXS)遺伝子の過剰発現によって達成されることを見出した。
シンターゼ(DOXS)遺伝子の過剰発現によって達成されることを見出した。
【００１６】 一次代謝からイソプレノイド代謝への代謝物のフラックスを増加させるために
、あらゆる色素体性イソプレノイドのための一般的な出発物質としてのIPPの生
成を増加させた。この目的のために、植物におけるDOXS活性を、相同遺伝子(同
一の種の生物に由来する遺伝子)の過剰発現によって増加させた。このことは、
異種遺伝子(種として離れた生物に由来する遺伝子)を発現させることによっても
達成することができる。シロイヌナズナDOXS(登録番号U 27099)、コメDOXS(登録
番号AF024512)およびペパーミントDOXS(登録番号AF019383)に由来するヌクレオ
チド配列が記載されている。
、あらゆる色素体性イソプレノイドのための一般的な出発物質としてのIPPの生
成を増加させた。この目的のために、植物におけるDOXS活性を、相同遺伝子(同
一の種の生物に由来する遺伝子)の過剰発現によって増加させた。このことは、
異種遺伝子(種として離れた生物に由来する遺伝子)を発現させることによっても
達成することができる。シロイヌナズナDOXS(登録番号U 27099)、コメDOXS(登録
番号AF024512)およびペパーミントDOXS(登録番号AF019383)に由来するヌクレオ
チド配列が記載されている。
【００１７】 実施例１においては、トランスジェニック植物におけるシロイヌナズナに由来
するDOXS遺伝子(配列番号１；Mandelら、Plant J. 9、649-658(1996)；登録番号
U 27099)の発現が増強された。色素体における局在は、該遺伝子配列中に存在す
る輸送シグナル配列によって確認される。配列番号１とハイブリダイズし、かつ
例えば大腸菌(配列番号３)などの他の生物、または好ましくは他の植物から誘導
されたDOXS遺伝子をコードするDNA配列もまた好適な発現カセットである。
するDOXS遺伝子(配列番号１；Mandelら、Plant J. 9、649-658(1996)；登録番号
U 27099)の発現が増強された。色素体における局在は、該遺伝子配列中に存在す
る輸送シグナル配列によって確認される。配列番号１とハイブリダイズし、かつ
例えば大腸菌(配列番号３)などの他の生物、または好ましくは他の植物から誘導
されたDOXS遺伝子をコードするDNA配列もまた好適な発現カセットである。
【００１８】 利用可能となった量の増加したGGPPは、トコフェロールおよびカロテノイドの
方向にさらに変換される。
方向にさらに変換される。
【００１９】 カロテノイドの効率的な生成は光合成にとって必須である。光合成において、
カロテノイドは光子エネルギーのより良い利用のための「光集積複合体」として
クロロフィルと共に働く(Heldt, Pflanzenbiochemie. Spektrum Akademischer V
erlag Heidelberg Berlin Oxford, 1996)。さらに、カロテノイドは、一重項酸
素などの酸素フリーラジカルから保護するという重要な機能を担っており、それ
らを基底状態に戻すことができる(Asada, 1994; Demming-AdamsおよびAdams, Tr
ends in Plant Sciences 1; 21-26(1996))。「アルビノ表現型」を示す1-デオキ
シ-D-キシルロース-5-リン酸シンターゼ欠損シロイヌナズナ変異体が単離された
(Mandelら、1996)。このことから、色素体におけるカロテノイド量の減少は植物
に有害な作用を及ぼすことが推測される。
カロテノイドは光子エネルギーのより良い利用のための「光集積複合体」として
クロロフィルと共に働く(Heldt, Pflanzenbiochemie. Spektrum Akademischer V
erlag Heidelberg Berlin Oxford, 1996)。さらに、カロテノイドは、一重項酸
素などの酸素フリーラジカルから保護するという重要な機能を担っており、それ
らを基底状態に戻すことができる(Asada, 1994; Demming-AdamsおよびAdams, Tr
ends in Plant Sciences 1; 21-26(1996))。「アルビノ表現型」を示す1-デオキ
シ-D-キシルロース-5-リン酸シンターゼ欠損シロイヌナズナ変異体が単離された
(Mandelら、1996)。このことから、色素体におけるカロテノイド量の減少は植物
に有害な作用を及ぼすことが推測される。
【００２０】 本発明者らは、本発明の目的が、植物における1-デオキシ-D-キシルロース-5-
リン酸シンターゼ(DOXS)遺伝子およびp-ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシ
ゲナーゼ(HPPD)遺伝子の過剰発現によっても達成されることを見出した。図１を
参照されたい。
リン酸シンターゼ(DOXS)遺伝子およびp-ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシ
ゲナーゼ(HPPD)遺伝子の過剰発現によっても達成されることを見出した。図１を
参照されたい。
【００２１】 一次代謝からイソプレノイド代謝への代謝物のフラックスを増加させるために
、あらゆる色素体性イソプレノイドのための一般的な出発物質としてのIPPの生
成を増加させた。この目的のために、トランスジェニックタバコおよびアブラナ
植物におけるDOXS活性を、大腸菌に由来するDOXSの過剰発現によって増加させた
。このことは、相同な遺伝子または他の異種遺伝子を発現させることによって達
成することができる。
、あらゆる色素体性イソプレノイドのための一般的な出発物質としてのIPPの生
成を増加させた。この目的のために、トランスジェニックタバコおよびアブラナ
植物におけるDOXS活性を、大腸菌に由来するDOXSの過剰発現によって増加させた
。このことは、相同な遺伝子または他の異種遺伝子を発現させることによって達
成することができる。
【００２２】 利用可能となった量の増加したD-1-デオキシ-キシルロース5-リン酸は、トコ
フェロールおよびカロテノイドの方向にさらに変換される。
フェロールおよびカロテノイドの方向にさらに変換される。
【００２３】 さらに、ホモゲンチジン酸の生成は、フィチルキノン、従ってトコフェロール
の方向に代謝物フラックスをさらに増加させる。図１を参照されたい。ホモゲン
チジン酸は、酵素p-ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ(HPPD)によ
って、p-ヒドロキシフェニルピルビン酸から生成される。種々の生物、例えば微
生物、植物、およびヒトに由来するこの酵素をコードするcDNAが記載されている
。
の方向に代謝物フラックスをさらに増加させる。図１を参照されたい。ホモゲン
チジン酸は、酵素p-ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ(HPPD)によ
って、p-ヒドロキシフェニルピルビン酸から生成される。種々の生物、例えば微
生物、植物、およびヒトに由来するこの酵素をコードするcDNAが記載されている
。
【００２４】 実施例１１では、植物および植物色素体において、ストレプトミセス・アベル
ミチリス(Streptomyces avermitilis)に由来するHPPD遺伝子(Denoyaら、J. Bact
eriol. 176(1994), 5312-5319; 配列番号５)と共に大腸菌に由来するDOXS遺伝子
(配列番号３)を初めて過剰発現させた。
ミチリス(Streptomyces avermitilis)に由来するHPPD遺伝子(Denoyaら、J. Bact
eriol. 176(1994), 5312-5319; 配列番号５)と共に大腸菌に由来するDOXS遺伝子
(配列番号３)を初めて過剰発現させた。
【００２５】 色素体のIPP生成が増加すると、色素体イソプレノイドすべての生成増強が起
こる。ホモゲンチジン酸の供給を増加することにより、色素体におけるトコフェ
ロールの生成に、十分な基質が使用可能になることが確実になる。この時点で、
使用可能となった量の増加したホモゲンチジン酸を、DOXSの過剰発現のためにフ
ィチル二リン酸（PPP）の量が増加することで、今度はトランスジェニック植物
において変換することができる。ここで、PPPは、一方で、クロロフィルおよび
フィロキノンの出発基質として、また、他方で、トコフェロールの出発基質とし
て働くことから、重要な位置を占める。
こる。ホモゲンチジン酸の供給を増加することにより、色素体におけるトコフェ
ロールの生成に、十分な基質が使用可能になることが確実になる。この時点で、
使用可能となった量の増加したホモゲンチジン酸を、DOXSの過剰発現のためにフ
ィチル二リン酸（PPP）の量が増加することで、今度はトランスジェニック植物
において変換することができる。ここで、PPPは、一方で、クロロフィルおよび
フィロキノンの出発基質として、また、他方で、トコフェロールの出発基質とし
て働くことから、重要な位置を占める。
【００２６】 トランスジェニック植物は、DOXSおよびHPPD遺伝子を含む構築物を用いた、植
物の形質転換により生成される。タバコやアブラナを、トコフェロール、ビタミ
ンＫ、クロロフィルおよびカロテノイドの生成用のモデル植物として使用した。
物の形質転換により生成される。タバコやアブラナを、トコフェロール、ビタミ
ンＫ、クロロフィルおよびカロテノイドの生成用のモデル植物として使用した。
【００２７】 本発明はまた、トコフェロール、ビタミンＫ、クロロフィルおよび／またはカ
ロテノイドの含量が増加した植物生成のための、DOXSもしくはHPPDまたはそれら
の機能上の同等物をコードする、配列番号１または配列番号３および配列番号５
のDNA配列の使用に関する。核酸配列は、これらの場合、例えば、DNAまたはcDNA
配列でよい。発現カセットへの挿入に適したコード配列は、例えば、DOXSまたは
HPPDをコードし、宿主に、トコフェロールを過剰生産する能力を与えるものであ
る。
ロテノイドの含量が増加した植物生成のための、DOXSもしくはHPPDまたはそれら
の機能上の同等物をコードする、配列番号１または配列番号３および配列番号５
のDNA配列の使用に関する。核酸配列は、これらの場合、例えば、DNAまたはcDNA
配列でよい。発現カセットへの挿入に適したコード配列は、例えば、DOXSまたは
HPPDをコードし、宿主に、トコフェロールを過剰生産する能力を与えるものであ
る。
【００２８】 発現カセットは、さらに、宿主細胞におけるコード配列の発現を制御する調節
核酸配列を含む。好ましい実施形態では、発現カセットは、上流、すなわちコー
ド配列の5'末端にプロモーターを、また、下流、すなわち3'末端にポリアデニル
化シグナルを含み、必要に応じて、さらに、両末端の間に位置するDOXSおよびHP
PD遺伝子のコード配列に機能的に連結した調節エレメントを含む。
核酸配列を含む。好ましい実施形態では、発現カセットは、上流、すなわちコー
ド配列の5'末端にプロモーターを、また、下流、すなわち3'末端にポリアデニル
化シグナルを含み、必要に応じて、さらに、両末端の間に位置するDOXSおよびHP
PD遺伝子のコード配列に機能的に連結した調節エレメントを含む。
【００２９】 発現カセットは、適切なプロモーターを、適切なDOXSまたはHPPD DNA配列、好
ましくは、プロモーターとDOXSまたはHPPD DNA配列との間に挿入され、葉緑体特
異的トランジットペプチドをコードするDNA、ならびにポリアデニル化シグナル
に融合することにより生成される。この融合は、例えば、T. Maniatis、E.F. Fr
itschおよびJ. Sambrook、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、Cold Spr
ing Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、NY（1989）、ならびに、T.J. Si
lhavy、M.L. BermanおよびL.W. Enquist、Experiments with Gene Fusions、Col
d Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、NY（1984）、ならびに、Au
subel、F.M.ら、Current Protocols in Molecular Biology、Greene Publishing
Assoc.およびWiley-Interscience（1987）に記載のような伝統的組み換え及び
クローニング方法により達成される。
ましくは、プロモーターとDOXSまたはHPPD DNA配列との間に挿入され、葉緑体特
異的トランジットペプチドをコードするDNA、ならびにポリアデニル化シグナル
に融合することにより生成される。この融合は、例えば、T. Maniatis、E.F. Fr
itschおよびJ. Sambrook、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、Cold Spr
ing Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、NY（1989）、ならびに、T.J. Si
lhavy、M.L. BermanおよびL.W. Enquist、Experiments with Gene Fusions、Col
d Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、NY（1984）、ならびに、Au
subel、F.M.ら、Current Protocols in Molecular Biology、Greene Publishing
Assoc.およびWiley-Interscience（1987）に記載のような伝統的組み換え及び
クローニング方法により達成される。
【００３０】 また、DOXSまたはHPPD融合タンパク質をコードするDNA配列を有する発現カセ
ットを用いることも可能である。その際、該融合タンパク質の一部は、ポリペプ
チドの転位を制御するトランジットペプチドである。葉緑体に対して特異的で、
しかも、葉緑体へのDOXSまたはHPPD遺伝子の転位後に、該DOXSまたはHPPD部分か
ら酵素により除去されるトランジットペプチドが好ましい。特に好ましいトラン
ジットペプチドは、色素体のトランスケトラーゼ（TK）もしくはこのトランジッ
トペプチドの機能上の同等物（例えば、ルビスコ（rubisco）またはフェレドキ
シン-NADPオキシドレダクターゼの小サブユニットのトランジットペプチド）に
由来する。
ットを用いることも可能である。その際、該融合タンパク質の一部は、ポリペプ
チドの転位を制御するトランジットペプチドである。葉緑体に対して特異的で、
しかも、葉緑体へのDOXSまたはHPPD遺伝子の転位後に、該DOXSまたはHPPD部分か
ら酵素により除去されるトランジットペプチドが好ましい。特に好ましいトラン
ジットペプチドは、色素体のトランスケトラーゼ（TK）もしくはこのトランジッ
トペプチドの機能上の同等物（例えば、ルビスコ（rubisco）またはフェレドキ
シン-NADPオキシドレダクターゼの小サブユニットのトランジットペプチド）に
由来する。
【００３１】 DOXS遺伝子およびHPPD遺伝子をコードする融合発現カセットは、好ましくは、
ベクター、例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンスの形質転換に適した
pBin19にクローン化する。
ベクター、例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンスの形質転換に適した
pBin19にクローン化する。
【００３２】 本発明はさらに、植物、または、植物の細胞、組織もしくは部分の形質転換の
ための、配列番号１もしくは配列番号３および配列番号５のDNA配列、または後
者とハイブリダイズするDNA配列の使用に関する。この使用の好ましい目的は、
植物のトコフェロール、ビタミンＫ、クロロフィルおよびカロテノイド含量を増
加することである。
ための、配列番号１もしくは配列番号３および配列番号５のDNA配列、または後
者とハイブリダイズするDNA配列の使用に関する。この使用の好ましい目的は、
植物のトコフェロール、ビタミンＫ、クロロフィルおよびカロテノイド含量を増
加することである。
【００３３】 さらに、プロモーターの選択に応じて、植物の葉、種子もしくはその他の部分
に、特異的に発現を起こすことも可能である。本発明はさらに、トランスジェニ
ック植物、その増殖物質、ならびにこれら植物の細胞、組織または部分に関する
。
に、特異的に発現を起こすことも可能である。本発明はさらに、トランスジェニ
ック植物、その増殖物質、ならびにこれら植物の細胞、組織または部分に関する
。
【００３４】 本発明はまた、配列番号１もしくは配列番号３および配列番号５の配列、また
は後者とハイブリダイズするDNA配列を含む発現カセットで形質転換したトラン
スジェニック植物、このような植物のトランスジェニック細胞、組織、部分およ
び増殖物質に関する。特に、ここでは、好ましいものとして、例えば、オオムギ
、コムギ、ライムギ、トウモロコシ、オートムギ、ダイズ、コメ、ワタ、サトウ
キビ、カノラ、ヒマワリ、アマ、アサ、ジャガイモ、タバコ、トマト、アブラナ
、アルファルファ、レタス、ならびに、各種樹木、堅果およびブドウ種等のトラ
ンスジェニッ農作物植物が挙げられる。
は後者とハイブリダイズするDNA配列を含む発現カセットで形質転換したトラン
スジェニック植物、このような植物のトランスジェニック細胞、組織、部分およ
び増殖物質に関する。特に、ここでは、好ましいものとして、例えば、オオムギ
、コムギ、ライムギ、トウモロコシ、オートムギ、ダイズ、コメ、ワタ、サトウ
キビ、カノラ、ヒマワリ、アマ、アサ、ジャガイモ、タバコ、トマト、アブラナ
、アルファルファ、レタス、ならびに、各種樹木、堅果およびブドウ種等のトラ
ンスジェニッ農作物植物が挙げられる。
【００３５】 本発明は、さらに、次のものに関する： −配列番号１もしくは配列番号３のDNA配列および配列番号５のDNA配列または後
者とハイブリダイズするDNA配列を含む発現カセットを、植物細胞、カルス組織
、全植物または植物のプロトプラストに導入することを含む、植物の形質転換方
法、 −植物におけるDOXSおよびHPPD DNA配列の発現により、トコフェロール、ビタミ
ンＫ、クロロフィルおよび／またはカロテノイド含量が増加した植物の生成を目
的とする、配列番号１もしくは配列番号３および配列番号５のDNA配列または後
者とハイブリダイズするDNA配列の使用。
者とハイブリダイズするDNA配列を含む発現カセットを、植物細胞、カルス組織
、全植物または植物のプロトプラストに導入することを含む、植物の形質転換方
法、 −植物におけるDOXSおよびHPPD DNA配列の発現により、トコフェロール、ビタミ
ンＫ、クロロフィルおよび／またはカロテノイド含量が増加した植物の生成を目
的とする、配列番号１もしくは配列番号３および配列番号５のDNA配列または後
者とハイブリダイズするDNA配列の使用。
【００３６】 この目的は、植物における、1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸シンターゼ
（DOXS）遺伝子およびゲラニルゲラニル-ピロリン酸オキシドレダクターゼ（GGP
POR）遺伝子の過剰発現によっても達成された（図1を参照のこと）。
（DOXS）遺伝子およびゲラニルゲラニル-ピロリン酸オキシドレダクターゼ（GGP
POR）遺伝子の過剰発現によっても達成された（図1を参照のこと）。
【００３７】 イソプレノイド代謝への一次代謝からの代謝産物フラックスを増加するために
、すべての色素体イソプレノイドの全体的出発基質として、IPPの生成を増加さ
せた。このために、トランスジェニックタバコおよびアブラナのDOXS活性を、大
腸菌由来のDOXSの過剰発現により、増加させた。これは、相同遺伝子もしくはそ
の他の異種遺伝子の発現により達成することができる。
、すべての色素体イソプレノイドの全体的出発基質として、IPPの生成を増加さ
せた。このために、トランスジェニックタバコおよびアブラナのDOXS活性を、大
腸菌由来のDOXSの過剰発現により、増加させた。これは、相同遺伝子もしくはそ
の他の異種遺伝子の発現により達成することができる。
【００３８】 この時点で、使用可能な量が増加したGGPPを、本発明に必須な更なる段階でト
コフェロールおよびカロテノイドへと変換するために、酵素：ゲラニルゲラニル
-ピロリン酸オキシドレダクターゼの活性を、対応する遺伝子の過剰発現により
増加させる。この手段により、ゲラニルゲラニルピロリン酸からフィチルピロリ
ン酸への変換が増加することにより、フィチルピロリン酸の生成増加が達成され
る。
コフェロールおよびカロテノイドへと変換するために、酵素：ゲラニルゲラニル
-ピロリン酸オキシドレダクターゼの活性を、対応する遺伝子の過剰発現により
増加させる。この手段により、ゲラニルゲラニルピロリン酸からフィチルピロリ
ン酸への変換が増加することにより、フィチルピロリン酸の生成増加が達成され
る。
【００３９】 これは、例えば、トランスジェニック植物におけるシロイヌナズナ由来のGGPP
OR遺伝子（配列番号７）の増強された発現により達成される。色素体の局在化を
確実にするために、トランジットシグナル配列をナズナGGPPORの前に置く。発現
カセットとして、配列番号７とハイブリダイズし、しかも、他の生物または他の
植物に由来するGGPPOR遺伝子をコードするDNA配列も適している。
OR遺伝子（配列番号７）の増強された発現により達成される。色素体の局在化を
確実にするために、トランジットシグナル配列をナズナGGPPORの前に置く。発現
カセットとして、配列番号７とハイブリダイズし、しかも、他の生物または他の
植物に由来するGGPPOR遺伝子をコードするDNA配列も適している。
【００４０】 実施例15では、シロイヌナズナ由来のGGPPOR遺伝子のクローニングについて説
明する。
明する。
【００４１】 色素体1-デオキシ-D-キシルロース5-リン酸およびフィチルピロリン酸生成を
増加することにより、すべての色素体イソプレノイドの増加が起こり、その結果
、トコフェロール、クロロフィル、ビタミンＫおよびフィロキノンの生成に十分
な基質が、色素体において使用可能となる。
増加することにより、すべての色素体イソプレノイドの増加が起こり、その結果
、トコフェロール、クロロフィル、ビタミンＫおよびフィロキノンの生成に十分
な基質が、色素体において使用可能となる。
【００４２】 このトランスジェニック植物は、DOXSおよびGGPPOR遺伝子を含む構築物で、植
物を形質転換することにより作成される。トコフェロール、ビタミンＫ、クロロ
フィルおよびカロテノイドの生成用のモデル植物として、タバコとセイヨウアブ
ラナを用いた。
物を形質転換することにより作成される。トコフェロール、ビタミンＫ、クロロ
フィルおよびカロテノイドの生成用のモデル植物として、タバコとセイヨウアブ
ラナを用いた。
【００４３】 本発明はまた、トコフェロール、ビタミンＫ、クロロフィルおよび／またはカ
ロテノイド含量が増加した植物の作成を目的とする、DOXSもしくはGGPPOR、また
はそれらの機能上の同等物をコードする、配列番号１または配列番号３および配
列番号７のDNA配列の使用に関する。核酸配列は、これらの場合、例えば、DNAま
たはcDNA配列である。発現カセットへの挿入に適したコード配列は、例えば、DO
XSまたはGGPPORをコードすると共に、トコフェロールを過剰生成する能力を宿主
に賦与する配列である。
ロテノイド含量が増加した植物の作成を目的とする、DOXSもしくはGGPPOR、また
はそれらの機能上の同等物をコードする、配列番号１または配列番号３および配
列番号７のDNA配列の使用に関する。核酸配列は、これらの場合、例えば、DNAま
たはcDNA配列である。発現カセットへの挿入に適したコード配列は、例えば、DO
XSまたはGGPPORをコードすると共に、トコフェロールを過剰生成する能力を宿主
に賦与する配列である。
【００４４】 上記発現カセットは、さらに、宿主細胞におけるコード配列の発現を制御する
調節核酸配列を含む。好ましい実施形態では、この発現カセットは、上流、すな
わち、コード配列の5'末端にプロモーターを、また下流、すなわち、3'末端にポ
リアデニル化シグナルを、さらに、必要な場合には、両者の間に位置するDOXSま
たはGGPPOR遺伝子のコード配列に機能可能に連結された調節エレメントを含む。
機能可能な連結とは、調節エレメントの各々が、コード配列の発現にその機能を
適正に果たすことができるような、プロモーター、コード配列、ターミネーター
、ならびに、必要な場合には、さらなる調節エレメントの連続的配置を意味する
。機能可能な連結に好ましい配列として、限定するものではないが、アポプラス
ト、液胞、色素体、ミトコンドリア、小胞体（ER）、細胞核、エライオプラスト
もしくはその他のコンパートメントにおける細胞下局在化を確実にするためのタ
ーゲッティング配列、ならびに、タバコモザイクウイルスに由来する5'リーダー
配列（Gallieら、Nucl. Acids Res. 15（1987）、8693〜8711）等の翻訳エンハ
ンサーが挙げられる。
調節核酸配列を含む。好ましい実施形態では、この発現カセットは、上流、すな
わち、コード配列の5'末端にプロモーターを、また下流、すなわち、3'末端にポ
リアデニル化シグナルを、さらに、必要な場合には、両者の間に位置するDOXSま
たはGGPPOR遺伝子のコード配列に機能可能に連結された調節エレメントを含む。
機能可能な連結とは、調節エレメントの各々が、コード配列の発現にその機能を
適正に果たすことができるような、プロモーター、コード配列、ターミネーター
、ならびに、必要な場合には、さらなる調節エレメントの連続的配置を意味する
。機能可能な連結に好ましい配列として、限定するものではないが、アポプラス
ト、液胞、色素体、ミトコンドリア、小胞体（ER）、細胞核、エライオプラスト
もしくはその他のコンパートメントにおける細胞下局在化を確実にするためのタ
ーゲッティング配列、ならびに、タバコモザイクウイルスに由来する5'リーダー
配列（Gallieら、Nucl. Acids Res. 15（1987）、8693〜8711）等の翻訳エンハ
ンサーが挙げられる。
【００４５】 例えば、植物発現カセットは、タバコ形質転換ベクターpBinAR-Hygに組み込む
ことができる。図1は、35Sプロモーター(A)を有するタバコ形質転換ベクターpBi
nAR-Hygと、種子特異的プロモーターファゼオリン（phaseolin）796(B)を有する
pBinAR-Hygを示す。
ことができる。図1は、35Sプロモーター(A)を有するタバコ形質転換ベクターpBi
nAR-Hygと、種子特異的プロモーターファゼオリン（phaseolin）796(B)を有する
pBinAR-Hygを示す。
【００４６】 −HPT：ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ −OCS：オクトピンシンターゼターミネーター −PNOS：ノパリンシンターゼプロモーター −また、該ベクターを一度だけ切断する制限切断部位も含まれる。
【００４７】 発現カセットに適したプロモーターは、原理的には、植物における外来遺伝子
の発現を制御することができるあらゆるプロモーターである。好ましくは、特に
、植物プロモーターまたは植物ウイルス由来のプロモーターが用いられる。カリ
フラワーモザイクウイルス由来のCaMV 35Sプロモーター（Frankら、Cell 21（19
80）、285〜294）が特に好ましい。このプロモーターは、公知のように、全体で
、挿入された遺伝子の永久的かつ構成的発現を可能にする転写エフェクター用の
様々な認識配列を含む（Benfeyら、EMBO J. 8（1989）、2195〜2202）。
の発現を制御することができるあらゆるプロモーターである。好ましくは、特に
、植物プロモーターまたは植物ウイルス由来のプロモーターが用いられる。カリ
フラワーモザイクウイルス由来のCaMV 35Sプロモーター（Frankら、Cell 21（19
80）、285〜294）が特に好ましい。このプロモーターは、公知のように、全体で
、挿入された遺伝子の永久的かつ構成的発現を可能にする転写エフェクター用の
様々な認識配列を含む（Benfeyら、EMBO J. 8（1989）、2195〜2202）。
【００４８】 この発現カセットはまた、植物における外因性DOXSまたはGGPPOR遺伝子の発現
を特定の時期に制御することができる、化学的に誘導可能なプロモーターを含ん
でもよい。この種のプロモーターとして、中でも、PRP1プロモーター（Wardら、
Plant. Mol. Biol. 22（1993）、361〜366）、サリチル酸により誘導可能なプロ
モーター（WO 95/19443号）、ベンゼンスルホンアミド誘導性プロモーター（欧
州特許出願第388186号）、テトラサイクリン誘導性プロモーター（Gatzら、（19
92）Plant J. 2、397〜404）、アブシジン酸誘導性プロモーター（欧州特許出願
第335528号）、ならびにエタノールまたはシクロヘキサノン誘導性プロモーター
（WO 93/21334号）等を使用することができる。
を特定の時期に制御することができる、化学的に誘導可能なプロモーターを含ん
でもよい。この種のプロモーターとして、中でも、PRP1プロモーター（Wardら、
Plant. Mol. Biol. 22（1993）、361〜366）、サリチル酸により誘導可能なプロ
モーター（WO 95/19443号）、ベンゼンスルホンアミド誘導性プロモーター（欧
州特許出願第388186号）、テトラサイクリン誘導性プロモーター（Gatzら、（19
92）Plant J. 2、397〜404）、アブシジン酸誘導性プロモーター（欧州特許出願
第335528号）、ならびにエタノールまたはシクロヘキサノン誘導性プロモーター
（WO 93/21334号）等を使用することができる。
【００４９】 さらに、特に好ましいプロモーターは、トコフェロールまたはその前駆体の生
合成が起こる植物の組織または部分で発現を確実にするプロモーターである。特
に、葉特異的発現を確実にするプロモーターが挙げられる。また、ジャガイモ由
来の細胞質ゾルFBPaseのプロモーター、あるいは、ジャガイモ由来のST-LSIプロ
モーター（Stockhausら、EMBO J. 8（1989）2445〜245）が挙げられる。
合成が起こる植物の組織または部分で発現を確実にするプロモーターである。特
に、葉特異的発現を確実にするプロモーターが挙げられる。また、ジャガイモ由
来の細胞質ゾルFBPaseのプロモーター、あるいは、ジャガイモ由来のST-LSIプロ
モーター（Stockhausら、EMBO J. 8（1989）2445〜245）が挙げられる。
【００５０】 発現カセットは、適したプロモーターを、適したDOXSまたはGGPPOR DNA配列、
好ましくは、プロモーターと、DOXSまたはGGPPOR DNA配列との間に挿入され、葉
緑体特異的トランジットペプチドをコードするDNA、ならびにポリアデニル化シ
グナルに融合することにより作成される。この融合は、従来の組換えおよびクロ
ーン化方法により達成され、例えば、T. Maniatis、E.F. FritschおよびJ. Samb
rook、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laborat
ory、Cold Spring Harbor、NY（1989）； T.J. Silhavy、M.L. BermanおよびL.W
. Enquist、Experiments with Gene Fusions、Cold Spring Harbor Laboratory
、Cold Spring Harbor、NY（1984）；ならびに、Ausbel、F.M.ら、Current Prot
ocols in Molecular Biology、Greene Publishing Assoc.およびWiley-Intersci
ence（1987）に記載されている。
好ましくは、プロモーターと、DOXSまたはGGPPOR DNA配列との間に挿入され、葉
緑体特異的トランジットペプチドをコードするDNA、ならびにポリアデニル化シ
グナルに融合することにより作成される。この融合は、従来の組換えおよびクロ
ーン化方法により達成され、例えば、T. Maniatis、E.F. FritschおよびJ. Samb
rook、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laborat
ory、Cold Spring Harbor、NY（1989）； T.J. Silhavy、M.L. BermanおよびL.W
. Enquist、Experiments with Gene Fusions、Cold Spring Harbor Laboratory
、Cold Spring Harbor、NY（1984）；ならびに、Ausbel、F.M.ら、Current Prot
ocols in Molecular Biology、Greene Publishing Assoc.およびWiley-Intersci
ence（1987）に記載されている。
【００５１】 また、DOXSまたはGGPPOR融合タンパク質をコードするDNA配列を有する発現カ
セットを使用することも可能であり、その際、該融合タンパク質の一部は、ポリ
ペプチドの転位を制御するトランジットペプチドである。葉緑体に特異的なトラ
ンジットペプチドが特に好ましいが、これらのペプチドは、DOXSまたはGGPPOR遺
伝子の葉緑体への転位の後、DOXSまたはGGPPOR部分から酵素により排除される。
特に好ましいトランジットペプチドは、色素体トラスケトラーゼ（TK）に由来す
るものか、あるいは、このトランジットペプチドの機能上の同等物（例えば、ル
ビスコまたはフェレドキシン-NADPオキシドレダクターゼの小サブユニットのト
ランジットペプチド）である。
セットを使用することも可能であり、その際、該融合タンパク質の一部は、ポリ
ペプチドの転位を制御するトランジットペプチドである。葉緑体に特異的なトラ
ンジットペプチドが特に好ましいが、これらのペプチドは、DOXSまたはGGPPOR遺
伝子の葉緑体への転位の後、DOXSまたはGGPPOR部分から酵素により排除される。
特に好ましいトランジットペプチドは、色素体トラスケトラーゼ（TK）に由来す
るものか、あるいは、このトランジットペプチドの機能上の同等物（例えば、ル
ビスコまたはフェレドキシン-NADPオキシドレダクターゼの小サブユニットのト
ランジットペプチド）である。
【００５２】 DOXS遺伝子またはGGPPOR遺伝子をコードする融合発現カセットは、好ましくは
、例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンスを形質転換するのに適したpB
in19等のベクターにクローン化される。
、例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンスを形質転換するのに適したpB
in19等のベクターにクローン化される。
【００５３】 さらに、本発明は、植物または細胞の形質転換、植物の組織または部分の形質
転換のための、配列番号１もしくは配列番号３および配列番号７のDNA配列、ま
たは後者とハイブリダイズするDNA配列を含む発現カセットの使用に関する。こ
の使用の好ましい目的は、植物のトコフェロール、ビタミンＫ、クロロフィルお
よびカロテノイドを増加させることである。
転換のための、配列番号１もしくは配列番号３および配列番号７のDNA配列、ま
たは後者とハイブリダイズするDNA配列を含む発現カセットの使用に関する。こ
の使用の好ましい目的は、植物のトコフェロール、ビタミンＫ、クロロフィルお
よびカロテノイドを増加させることである。
【００５４】 さらに、プロモーターの選択に応じて、発現が、植物の葉、種子もしくはその
他の部分に特異的に起こるようにすることも可能である。本発明は、さらにまた
、このようなトランスジェニック植物、その増殖物質、ならびに、これら植物の
細胞、組織または部分に関する。
他の部分に特異的に起こるようにすることも可能である。本発明は、さらにまた
、このようなトランスジェニック植物、その増殖物質、ならびに、これら植物の
細胞、組織または部分に関する。
【００５５】 本発明はまた、配列番号１もしくは配列番号３および配列番号７の配列、また
は後者とハイブリダイズするDNA配列を含む発現カセットで形質転換されたトラ
ンスジェニック植物、ならびに、このような植物のトランスジェニック細胞、組
織、部分および増殖物質に関する。これに関し、特に好ましいものとして、オオ
ムギ、コムギ、ライムギ、トウモロコシ、オートムギ、ダイズ、コメ、ワタ、サ
トウキビ、カノラ、ヒマワリ、アマ、アサ、ジャガイモ、タバコ、トマト、セイ
ヨウアブラナ、アルファルファ、レタス等のトランスジェニック農作物、ならび
に、各種樹木、木の実および蔓植物種が挙げられる。
は後者とハイブリダイズするDNA配列を含む発現カセットで形質転換されたトラ
ンスジェニック植物、ならびに、このような植物のトランスジェニック細胞、組
織、部分および増殖物質に関する。これに関し、特に好ましいものとして、オオ
ムギ、コムギ、ライムギ、トウモロコシ、オートムギ、ダイズ、コメ、ワタ、サ
トウキビ、カノラ、ヒマワリ、アマ、アサ、ジャガイモ、タバコ、トマト、セイ
ヨウアブラナ、アルファルファ、レタス等のトランスジェニック農作物、ならび
に、各種樹木、木の実および蔓植物種が挙げられる。
【００５６】 さらに、本発明は、次のものに関する： −配列番号１もしくは配列番号３および配列番号７のDNA配列、または、後者と
ハイブリダイズするDNA配列を含む発現カセットを、植物細胞、カルス組織、全
植物または植物の原形質体に、導入することを含む、植物の形質転換方法、 −植物におけるDOXSおよびGGPPOR DNA配列の発現により、トコフェロール、ビタ
ミンＫ、クロロフィルおよび／またはカロテノイド含量が増加した植物の作成を
目的とする、配列番号１もしくは配列番号３および配列番号７のDNA配列、また
は、後者とハイブリダイズするDNA配列の使用。
ハイブリダイズするDNA配列を含む発現カセットを、植物細胞、カルス組織、全
植物または植物の原形質体に、導入することを含む、植物の形質転換方法、 −植物におけるDOXSおよびGGPPOR DNA配列の発現により、トコフェロール、ビタ
ミンＫ、クロロフィルおよび／またはカロテノイド含量が増加した植物の作成を
目的とする、配列番号１もしくは配列番号３および配列番号７のDNA配列、また
は、後者とハイブリダイズするDNA配列の使用。
【００５７】 この目的は、植物における、1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸シンターゼ
（DOXS）遺伝子、p-ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（HPPD）お
よびゲラニルゲラニル-ピロリン酸オキシドレダクターゼ（GGPPOR）遺伝子の過
剰発現によっても達成されている（図1を参照のこと）。
（DOXS）遺伝子、p-ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（HPPD）お
よびゲラニルゲラニル-ピロリン酸オキシドレダクターゼ（GGPPOR）遺伝子の過
剰発現によっても達成されている（図1を参照のこと）。
【００５８】 イソプレノイド代謝への一次代謝からの代謝産物フラックスを増加させるため
に、すべての色素体イソプレノイドの全体的出発基質として、IPPの生成を増加
させた。このために、トランスジェニックタバコおよびセイヨウアブラナ植物に
おけるDOXS活性を、大腸菌由来のDOXSの過剰発現により、増加させた。これは、
相同DOXS遺伝子もしくはその他の異種DOXS遺伝子、例えば、配列番号１のDNA配
列等の発現により達成することもできる。
に、すべての色素体イソプレノイドの全体的出発基質として、IPPの生成を増加
させた。このために、トランスジェニックタバコおよびセイヨウアブラナ植物に
おけるDOXS活性を、大腸菌由来のDOXSの過剰発現により、増加させた。これは、
相同DOXS遺伝子もしくはその他の異種DOXS遺伝子、例えば、配列番号１のDNA配
列等の発現により達成することもできる。
【００５９】 この時点で、量が増加した利用可能なD-1-デオキシ-キシルロース-5-リン酸を
、ゲラニルゲラニル-ピロリン酸へと、さらに変換する。
、ゲラニルゲラニル-ピロリン酸へと、さらに変換する。
【００６０】 この時点で、量が増加した利用可能なGGPPをトコフェロールおよびカロテノイ
ドへと変換するためには、本発明に不可欠なさらに別の段階で、酵素：ゲラニル
ゲラニルピロリン酸オキシドレダクターゼの活性を、対応する相同または異種遺
伝子の過剰発現により増加させる。この手段により、ゲラニルゲラニルピロリン
酸からフィチルピロリン酸への変換が増加したことにより、フィチルピロリン酸
の生産増加が達成される。
ドへと変換するためには、本発明に不可欠なさらに別の段階で、酵素：ゲラニル
ゲラニルピロリン酸オキシドレダクターゼの活性を、対応する相同または異種遺
伝子の過剰発現により増加させる。この手段により、ゲラニルゲラニルピロリン
酸からフィチルピロリン酸への変換が増加したことにより、フィチルピロリン酸
の生産増加が達成される。
【００６１】 これは、トランスジェニック植物における、例えば、シロイヌナズナ（Aarabi
dopsis thaliana）由来のGGPPOR遺伝子（配列番号７）の増強された発現により
達成される。色素体の局在化を確実にするために、トランジットシグナル配列を
シロイヌナズナGGPPORの前に置く。発現カセットとして、配列番号７とハイブリ
ダイズするGGPPOR遺伝子をコードし、他の生物または他の植物に由来するDNA配
列もまた適している。
dopsis thaliana）由来のGGPPOR遺伝子（配列番号７）の増強された発現により
達成される。色素体の局在化を確実にするために、トランジットシグナル配列を
シロイヌナズナGGPPORの前に置く。発現カセットとして、配列番号７とハイブリ
ダイズするGGPPOR遺伝子をコードし、他の生物または他の植物に由来するDNA配
列もまた適している。
【００６２】 実施例15では、シロイヌナズナ由来のGGPPOR遺伝子のクローン化について説明
する。
する。
【００６３】 この時点で、量が増加した利用可能なPPPをトコフェロールおよびカロテノイ
ドに変換するためには、本発明に不可欠のさらに別の段階で、酵素：p-ヒドロキ
シフェニルプルビン酸ジオキシゲナーゼ（HPPD）の活性を、対応する相同または
異種遺伝子の過剰発現により増加させる。この手段により、ヒドロキシフェニル
プルビン酸からホモゲンチジン酸への変換が増加したことにより、ホモゲンチジ
ン酸の生産増加が達成される。
ドに変換するためには、本発明に不可欠のさらに別の段階で、酵素：p-ヒドロキ
シフェニルプルビン酸ジオキシゲナーゼ（HPPD）の活性を、対応する相同または
異種遺伝子の過剰発現により増加させる。この手段により、ヒドロキシフェニル
プルビン酸からホモゲンチジン酸への変換が増加したことにより、ホモゲンチジ
ン酸の生産増加が達成される。
【００６４】 この酵素をコードするcDNAは、例えば、微生物、植物およびヒト等の様々な生
物由来のものが記載されている。
物由来のものが記載されている。
【００６５】 実施例10には、ストレプトミセス・アベルミチリスに由来するHPPD遺伝子（De
noyaら、J. Bacteriol. 176（1994）、5312〜5319；配列番号５）のクローン化
が記載されている。色素体の局在化を確実にするために、トランジットシグナル
配列をストレプトミセスHPPDの前に置く。発現カセットとして、配列番号５とハ
イブリダイズするHPPD遺伝子をコードし、他の生物または他の植物に由来するDN
Aもまた適している。
noyaら、J. Bacteriol. 176（1994）、5312〜5319；配列番号５）のクローン化
が記載されている。色素体の局在化を確実にするために、トランジットシグナル
配列をストレプトミセスHPPDの前に置く。発現カセットとして、配列番号５とハ
イブリダイズするHPPD遺伝子をコードし、他の生物または他の植物に由来するDN
Aもまた適している。
【００６６】 色素体のD-1-デオキシ-キシルロース5-リン酸、フィチルピロリン酸およびホ
モゲンチジン酸の生成が増加すると、すべての色素体イドプレノイドの産生増加
が起こる。これら前駆体の供給を増加することにより、色素体におけるトコフェ
ロール、クロロフィル、ビタミンＫおよびフィロキノンの生成に十分な基質が確
実に使用可能となる。
モゲンチジン酸の生成が増加すると、すべての色素体イドプレノイドの産生増加
が起こる。これら前駆体の供給を増加することにより、色素体におけるトコフェ
ロール、クロロフィル、ビタミンＫおよびフィロキノンの生成に十分な基質が確
実に使用可能となる。
【００６７】 本発明に従うトランスジェニック植物は、DOXS、HPPD遺伝子およびGGPPOR遺伝
子を含む構築物で、植物を形質転換することにより生成される（図17）。トコフ
ェロール、ビタミンＫ、クロロフィルおよびカロテノイドの生成用のモデル植物
として、タバコとセイヨウアブラナを用いた。
子を含む構築物で、植物を形質転換することにより生成される（図17）。トコフ
ェロール、ビタミンＫ、クロロフィルおよびカロテノイドの生成用のモデル植物
として、タバコとセイヨウアブラナを用いた。
【００６８】 本発明はまた、トコフェロール、ビタミンＫ、クロロフィルおよび／またはカ
ロテノイド含量が増加した植物の作成を目的とする、DOXS、HPPDおよびGGPPOR、
もしくはそれらの機能上の同等物をコードする、配列番号１または配列番号３、
配列番号５および配列番号７のDNA配列の使用に関する。この核酸配列は、これ
らの場合、例えば、DNAまたはcDNA配列である。発現カセットへの挿入に適した
コード配列は、例えば、DOXS、HPPDおよびGGPPORをコードすると共に、トコフェ
ロールを過剰生成する能力を宿主に賦与する配列である。
ロテノイド含量が増加した植物の作成を目的とする、DOXS、HPPDおよびGGPPOR、
もしくはそれらの機能上の同等物をコードする、配列番号１または配列番号３、
配列番号５および配列番号７のDNA配列の使用に関する。この核酸配列は、これ
らの場合、例えば、DNAまたはcDNA配列である。発現カセットへの挿入に適した
コード配列は、例えば、DOXS、HPPDおよびGGPPORをコードすると共に、トコフェ
ロールを過剰生成する能力を宿主に賦与する配列である。
【００６９】 上記発現カセットは、さらに、宿主細胞における該コード配列の発現を制御す
る調節核酸配列を含む。好ましい実施形態では、発現カセットは、上流、すなわ
ち、コード配列の5'末端にプロモーターを、また下流、すなわち、3'末端にポリ
アデニル化シグナルを、さらに、必要な場合には、両者の間に位置するDOXS、HP
PDまたはGGPPOR遺伝子のコード配列に機能可能に連結された調節エレメントを含
む。機能可能な連結とは、調節エレメントの各々が、コード配列の発現において
その機能を適正に果たすことができるような、プロモーター、コード配列、ター
ミネーター、ならびに、必要な場合には、さらなる調節エレメントの連続的配置
を意味する。機能可能な連結に好ましい配列として、限定するものではないが、
アポプラスト、液胞、色素体、ミトコンドリア、小胞体（ER）、細胞核、エライ
オプラストもしくはその他のコンパートメントにおける細胞下局在化を確実にす
るターゲッティング配列、ならびに、タバコモザイクウイルスに由来する5'リー
ダー配列（Gallieら、Nucl. Acids Res. 15（1987）、8693〜8711）等の翻訳エ
ンハンサーが挙げられる。
る調節核酸配列を含む。好ましい実施形態では、発現カセットは、上流、すなわ
ち、コード配列の5'末端にプロモーターを、また下流、すなわち、3'末端にポリ
アデニル化シグナルを、さらに、必要な場合には、両者の間に位置するDOXS、HP
PDまたはGGPPOR遺伝子のコード配列に機能可能に連結された調節エレメントを含
む。機能可能な連結とは、調節エレメントの各々が、コード配列の発現において
その機能を適正に果たすことができるような、プロモーター、コード配列、ター
ミネーター、ならびに、必要な場合には、さらなる調節エレメントの連続的配置
を意味する。機能可能な連結に好ましい配列として、限定するものではないが、
アポプラスト、液胞、色素体、ミトコンドリア、小胞体（ER）、細胞核、エライ
オプラストもしくはその他のコンパートメントにおける細胞下局在化を確実にす
るターゲッティング配列、ならびに、タバコモザイクウイルスに由来する5'リー
ダー配列（Gallieら、Nucl. Acids Res. 15（1987）、8693〜8711）等の翻訳エ
ンハンサーが挙げられる。
【００７０】 例えば、該植物発現カセットは、タバコ形質転換ベクターpBinAR-Hygに組み込
むことができる。図２は、35Sプロモーター(A)を有するタバコ形質転換ベクター
pBinAR-Hygと、種子特異的プロモーター、ファゼオリン（phaseolin）796(B)を
有するpBinAR-Hygを示す： −HPT：ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ −OCS：オクトピンシンターゼターミネーター −PNOS：ノパリンシンターゼプロモーター −また、該ベクターを一度だけ切断する制限切断部位も含まれる。
むことができる。図２は、35Sプロモーター(A)を有するタバコ形質転換ベクター
pBinAR-Hygと、種子特異的プロモーター、ファゼオリン（phaseolin）796(B)を
有するpBinAR-Hygを示す： −HPT：ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ −OCS：オクトピンシンターゼターミネーター −PNOS：ノパリンシンターゼプロモーター −また、該ベクターを一度だけ切断する制限切断部位も含まれる。
【００７１】 発現カセットに適したプロモーターは、原理的には、植物における外来遺伝子
の発現を制御することができるあらゆるプロモーターである。好ましくは、特に
、植物プロモーターまたは植物ウイルス由来のプロモーターが用いられる。カリ
フラワーモザイクウイルス由来のCaMV 35Sプロモーター（Frankら、Cell 21（19
80）、285〜294）が特に好ましい。このプロモーターは、公知のように、全体で
、挿入された遺伝子の永久的かつ構成的発現を実現する転写エフェクター用の異
なる認識配列を含む（Benfeyら、EMBO J. 8（1989）、2195〜2202）。
の発現を制御することができるあらゆるプロモーターである。好ましくは、特に
、植物プロモーターまたは植物ウイルス由来のプロモーターが用いられる。カリ
フラワーモザイクウイルス由来のCaMV 35Sプロモーター（Frankら、Cell 21（19
80）、285〜294）が特に好ましい。このプロモーターは、公知のように、全体で
、挿入された遺伝子の永久的かつ構成的発現を実現する転写エフェクター用の異
なる認識配列を含む（Benfeyら、EMBO J. 8（1989）、2195〜2202）。
【００７２】 この発現カセットはまた、植物における外因性DOXS、HPPDおよびGGPPOR遺伝子
の発現を特定の時期に制御することができる、化学的に誘導可能なプロモーター
を含んでもよい。この種のプロモーターとして、中でも、PRP1プロモーター（Wa
rdら、Plant. Mol. Biol. 22（1993）、361〜366）、サリチル酸により誘導可能
なプロモーター（WO 95/19443号）、ベンゼンスルホンアミド誘導性プロモータ
ー（欧州特許出願第388186号）、テトラサイクリン誘導性プロモーター（Gatzら
、（1992）Plant J. 2、397〜404）、アブシジン酸誘導性プロモーター（欧州特
許出願第335528号）、ならびにエタノールまたはシクロヘキサノン誘導性プロモ
ーター（WO 93/21334号）等を使用することができる。
の発現を特定の時期に制御することができる、化学的に誘導可能なプロモーター
を含んでもよい。この種のプロモーターとして、中でも、PRP1プロモーター（Wa
rdら、Plant. Mol. Biol. 22（1993）、361〜366）、サリチル酸により誘導可能
なプロモーター（WO 95/19443号）、ベンゼンスルホンアミド誘導性プロモータ
ー（欧州特許出願第388186号）、テトラサイクリン誘導性プロモーター（Gatzら
、（1992）Plant J. 2、397〜404）、アブシジン酸誘導性プロモーター（欧州特
許出願第335528号）、ならびにエタノールまたはシクロヘキサノン誘導性プロモ
ーター（WO 93/21334号）等を使用することができる。
【００７３】 さらに、特に好ましいプロモーターは、トコフェロールまたはその前駆体の生
合成が起こる植物の組織または部分で発現を確実にするプロモーターである。特
に、葉特異的発現を確実にするプロモーターが挙げられる。また、ジャガイモ由
来の細胞質ゾルFBPaseのプロモーター、あるいは、ジャガイモ由来のST-LSIプロ
モーター（Stockhausら、EMBO J. 8（1989）2445〜245）が挙げられる。
合成が起こる植物の組織または部分で発現を確実にするプロモーターである。特
に、葉特異的発現を確実にするプロモーターが挙げられる。また、ジャガイモ由
来の細胞質ゾルFBPaseのプロモーター、あるいは、ジャガイモ由来のST-LSIプロ
モーター（Stockhausら、EMBO J. 8（1989）2445〜245）が挙げられる。
【００７４】 発現カセットは、適したプロモーターを、適したDOXS、HPPDおよびGGPPOR DNA
配列、好ましくは、プロモーターと、DOXS、HPPDおよびGGPOR DNA配列との間に
挿入され、かつ、葉緑体特異的トランジットペプチドをコードするDNA、ならび
に、ポリアデニル化シグナルに融合することにより作成される。尚、この融合は
、従来の組換えおよびクローン化方法により達成され、例えば、T. Maniatis、E
.F. FritschおよびJ. Sambrook、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、Co
ld Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、NY（1989）； T.J. Silha
vy、M.L. BermanおよびL.W. Enquist、Experiments with Gene Fusions、Cold S
pring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、NY（1984）；ならびに、Ausbe
l、F.M.ら、Current Protocols in Molecular Biology、Greene Publishing Ass
oc.およびWiley-Interscience（1987）に記載されている。
配列、好ましくは、プロモーターと、DOXS、HPPDおよびGGPOR DNA配列との間に
挿入され、かつ、葉緑体特異的トランジットペプチドをコードするDNA、ならび
に、ポリアデニル化シグナルに融合することにより作成される。尚、この融合は
、従来の組換えおよびクローン化方法により達成され、例えば、T. Maniatis、E
.F. FritschおよびJ. Sambrook、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、Co
ld Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、NY（1989）； T.J. Silha
vy、M.L. BermanおよびL.W. Enquist、Experiments with Gene Fusions、Cold S
pring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、NY（1984）；ならびに、Ausbe
l、F.M.ら、Current Protocols in Molecular Biology、Greene Publishing Ass
oc.およびWiley-Interscience（1987）に記載されている。
【００７５】 また、DOXS、HPPDおよびGGPOR融合タンパク質をコードするDNA配列を有する発
現カセットを使用することも可能であり、その際、該融合タンパク質の一部は、
ポリペプチドの転位を制御するトランジットペプチドである。葉緑体に特異的な
トランジットペプチドが特に好ましいが、これらのペプチドは、DOXS、HPPDおよ
びGGPOR遺伝子の葉緑体への転位の後、DOXS、HPPDおよびGGPPOR部分から酵素に
より排除される。特に好ましいトランジットペプチドは、色素体トラスケトラー
ゼ（TK）に由来するものか、あるいは、このトランジットペプチドの機能上の同
等物（例えば、ルビスコまたはフェレドキシン-NADPオキシドレダクターゼの小
サブユニットのトランジットペプチド）である。
現カセットを使用することも可能であり、その際、該融合タンパク質の一部は、
ポリペプチドの転位を制御するトランジットペプチドである。葉緑体に特異的な
トランジットペプチドが特に好ましいが、これらのペプチドは、DOXS、HPPDおよ
びGGPOR遺伝子の葉緑体への転位の後、DOXS、HPPDおよびGGPPOR部分から酵素に
より排除される。特に好ましいトランジットペプチドは、色素体トラスケトラー
ゼ（TK）に由来するものか、あるいは、このトランジットペプチドの機能上の同
等物（例えば、ルビスコまたはフェレドキシン-NADPオキシドレダクターゼの小
サブユニットのトランジットペプチド）である。
【００７６】 DOXS遺伝子、HPPD遺伝子またはGGPPOR遺伝子をコードする融合発現カセットは
、好ましくは、例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンスを形質転換する
のに適したpBin19等のベクターにクローン化される。
、好ましくは、例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンスを形質転換する
のに適したpBin19等のベクターにクローン化される。
【００７７】 さらに、本発明は、植物または細胞の形質転換、植物の組織または部分の形質
転換のための、配列番号１もしくは配列番号３、配列番号５および配列番号７の
DNA配列、または後者とハイブリダイズするDNA配列を含む発現カセットの使用に
関する。この使用の好ましい目的は、植物のトコフェロール、ビタミンＫ、クロ
ロフィルおよびカロテノイド含量を増加することである。
転換のための、配列番号１もしくは配列番号３、配列番号５および配列番号７の
DNA配列、または後者とハイブリダイズするDNA配列を含む発現カセットの使用に
関する。この使用の好ましい目的は、植物のトコフェロール、ビタミンＫ、クロ
ロフィルおよびカロテノイド含量を増加することである。
【００７８】 さらに、プロモーターの選択に応じて、発現が、植物の葉、種子もしくはその
他の部分に特異的に起こるようにすることも可能である。本発明は、さらにまた
、このようなトランスジェニック植物、その増殖物質、ならびに、これら植物の
細胞、組織または部分に関する。
他の部分に特異的に起こるようにすることも可能である。本発明は、さらにまた
、このようなトランスジェニック植物、その増殖物質、ならびに、これら植物の
細胞、組織または部分に関する。
【００７９】 本発明はまた、配列番号１もしくは配列番号３、配列番号５および配列番号７
の配列、または後者とハイブリダイズするDNA配列を含む発現カセットで形質転
換されたトランスジェニック植物、ならびに、このような植物のトランスジェニ
ック細胞、組織、部分および増殖物質に関する。これに関し、特に好ましいもの
として、オオムギ、コムギ、ライムギ、トウモロコシ、オートムギ、ダイズ、コ
メ、ワタ、サトウキビ、カノラ、ヒマワリ、アマ、アサ、ジャガイモ、タバコ、
トマト、セイヨウアブラナ、アルファルファ、レタス等のトランスジェニック農
作物、ならびに、各種樹木、木の実および蔓植物種が挙げられる。
の配列、または後者とハイブリダイズするDNA配列を含む発現カセットで形質転
換されたトランスジェニック植物、ならびに、このような植物のトランスジェニ
ック細胞、組織、部分および増殖物質に関する。これに関し、特に好ましいもの
として、オオムギ、コムギ、ライムギ、トウモロコシ、オートムギ、ダイズ、コ
メ、ワタ、サトウキビ、カノラ、ヒマワリ、アマ、アサ、ジャガイモ、タバコ、
トマト、セイヨウアブラナ、アルファルファ、レタス等のトランスジェニック農
作物、ならびに、各種樹木、木の実および蔓植物種が挙げられる。
【００８０】 さらに、本発明は、次のものに関する： −配列番号１もしくは配列番号３、配列番号５および配列番号７のDNA配列、ま
たは、後者とハイブリダイズするDNA配列を含む発現カセットを、植物細胞、カ
ルス組織、全植物または植物の原形質体に、導入することを含む、植物の形質転
換方法、 −植物におけるDOXS、HPPDおよびGGPPOR DNA配列の発現により、トコフェロール
、ビタミンＫ、クロロフィルおよび／またはカロテノイド含量が増加した植物の
作成を目的とする、配列番号１もしくは配列番号３、配列番号５および配列番号
７のDNA配列、または、後者とハイブリダイズするDNA配列の使用。
たは、後者とハイブリダイズするDNA配列を含む発現カセットを、植物細胞、カ
ルス組織、全植物または植物の原形質体に、導入することを含む、植物の形質転
換方法、 −植物におけるDOXS、HPPDおよびGGPPOR DNA配列の発現により、トコフェロール
、ビタミンＫ、クロロフィルおよび／またはカロテノイド含量が増加した植物の
作成を目的とする、配列番号１もしくは配列番号３、配列番号５および配列番号
７のDNA配列、または、後者とハイブリダイズするDNA配列の使用。
【００８１】 従って、本発明の別の目的は、DOXS阻害剤を同定するための試験システムを開
発することである。
発することである。
【００８２】 この目的は、シロイヌナズナまたは大腸菌由来のDOXS遺伝子、もしくはこれと
ハイブリダイズするDNA配列を発現させた後、DOXS酵素活性の阻害について化学
物質を試験することにより、達成されている。
ハイブリダイズするDNA配列を発現させた後、DOXS酵素活性の阻害について化学
物質を試験することにより、達成されている。
【００８３】 このトランスジェニック植物は、DOXS遺伝子を含む構築物で、植物を形質転換
することにより作成される。トコフェロール、ビタミンＫ、クロロフィルおよび
カロテノイドの生成用のモデル植物として、シロイヌナズナとセイヨウアブラナ
を用いた。
することにより作成される。トコフェロール、ビタミンＫ、クロロフィルおよび
カロテノイドの生成用のモデル植物として、シロイヌナズナとセイヨウアブラナ
を用いた。
【００８４】 シロイヌナズナ由来の完全DOXS遺伝子のクローン化は、DOXS遺伝子に特異的な
cDNA（配列番号１）を単離することにより起こる。
cDNA（配列番号１）を単離することにより起こる。
【００８５】 本発明はまた、トコフェロール、ビタミンＫ、クロロフィルおよび／またはカ
ロテノイド含量が増加した植物の作成を目的とする、DOXSまたはその機能上の同
等物をコードする、配列番号１または配列番号３のDNA配列の使用に関する。さ
らに、該核酸配列は、例えば、DNAまたはcDNA配列でよい。発現カセットへの挿
入に適したコード配列は、例えば、DOXSをコードし、トコフェロールを過剰生成
する能力を宿主に賦与する配列である。
ロテノイド含量が増加した植物の作成を目的とする、DOXSまたはその機能上の同
等物をコードする、配列番号１または配列番号３のDNA配列の使用に関する。さ
らに、該核酸配列は、例えば、DNAまたはcDNA配列でよい。発現カセットへの挿
入に適したコード配列は、例えば、DOXSをコードし、トコフェロールを過剰生成
する能力を宿主に賦与する配列である。
【００８６】 上記発現カセットは、さらに、宿主細胞におけるコード配列の発現を制御する
調節核酸配列を含む。好ましい実施形態では、発現カセットは、上流、すなわち
、コード配列の5'末端にプロモーターを、また下流、すなわち、3'末端にポリア
デニル化シグナルを、さらに、必要な場合には、両者の間に位置するDOXS遺伝子
のコード配列に機能可能に連結された調節エレメントを含む。機能可能な連結と
は、調節エレメントの各々が、コード配列の発現においてその機能を適正に果た
すことができるような、プロモーター、コード配列、ターミネーター、ならびに
、必要な場合には、さらなる調節エレメントの連続的配置を意味する。機能可能
な連結に好ましい配列として、限定するものではないが、アポプラスト、液胞、
色素体、ミトコンドリア、小胞体（ER）、細胞核、エライオプラストもしくはそ
の他のコンパートメントにおける細胞下局在化を確実にするターゲッティング配
列、ならびに、タバコモザイクウイルスに由来する5'リーダー配列（Gallieら、
Nucl. Acids Res. 15（1987）、8693〜8711）等の翻訳エンハンサーが挙げられ
る。
調節核酸配列を含む。好ましい実施形態では、発現カセットは、上流、すなわち
、コード配列の5'末端にプロモーターを、また下流、すなわち、3'末端にポリア
デニル化シグナルを、さらに、必要な場合には、両者の間に位置するDOXS遺伝子
のコード配列に機能可能に連結された調節エレメントを含む。機能可能な連結と
は、調節エレメントの各々が、コード配列の発現においてその機能を適正に果た
すことができるような、プロモーター、コード配列、ターミネーター、ならびに
、必要な場合には、さらなる調節エレメントの連続的配置を意味する。機能可能
な連結に好ましい配列として、限定するものではないが、アポプラスト、液胞、
色素体、ミトコンドリア、小胞体（ER）、細胞核、エライオプラストもしくはそ
の他のコンパートメントにおける細胞下局在化を確実にするターゲッティング配
列、ならびに、タバコモザイクウイルスに由来する5'リーダー配列（Gallieら、
Nucl. Acids Res. 15（1987）、8693〜8711）等の翻訳エンハンサーが挙げられ
る。
【００８７】 例えば、該植物発現カセットは、タバコ形質転換ベクターpBinAR-Hygに組み込
むことができる。図［欠落］は、35Sプロモーター(A)を有するタバコ形質転換ベ
クターpBinAR-Hygと、種子特異的プロモーター、ファゼオリン（phaseolin）796
(B)を有するpBinAR-Hygを示す。
むことができる。図［欠落］は、35Sプロモーター(A)を有するタバコ形質転換ベ
クターpBinAR-Hygと、種子特異的プロモーター、ファゼオリン（phaseolin）796
(B)を有するpBinAR-Hygを示す。
【００８８】 −HPT：ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ −OCS：オクトピンシンターゼターミネーター −PNOS：ノパリンシンターゼプロモーター −また、該ベクターを一度だけ切断する制限切断部位も含まれる。
【００８９】 該発現カセットに適したプロモーターは、原理的には、植物における外来遺伝
子の発現を制御することができるあらゆるプロモーターである。好ましくは、特
に、植物プロモーターまたは植物ウイルス由来のプロモーターが用いられる。カ
リフラワーモザイクウイルス由来のCaMV 35Sプロモーター（Franckら、Cell 21
（1980）、285〜294）が特に好ましい。このプロモーターは、公知のように、全
体で、挿入された遺伝子の永久的かつ構成的発現を実現する転写エフェクター用
の様々な認識配列を含む（Benfeyら、EMBO J. 8（1989）、2195〜2202）。
子の発現を制御することができるあらゆるプロモーターである。好ましくは、特
に、植物プロモーターまたは植物ウイルス由来のプロモーターが用いられる。カ
リフラワーモザイクウイルス由来のCaMV 35Sプロモーター（Franckら、Cell 21
（1980）、285〜294）が特に好ましい。このプロモーターは、公知のように、全
体で、挿入された遺伝子の永久的かつ構成的発現を実現する転写エフェクター用
の様々な認識配列を含む（Benfeyら、EMBO J. 8（1989）、2195〜2202）。
【００９０】 この発現カセットはまた、植物における外因性DOXS遺伝子の発現を特定の時期
に制御することができる、化学的に誘導可能なプロモーターを含んでもよい。こ
の種のプロモーターとして、中でも、PRP1プロモーター（Wardら、Plant. Mol.
Biol. 22（1993）、361〜366）、サリチル酸により誘導可能なプロモーター（WO
95/19443号）、ベンゼンスルホンアミド誘導性プロモーター（欧州特許出願第3
88186号）、テトラサイクリン誘導性プロモーター（Gatzら、（1992）Plant J.
2、397〜404）、アブシジン酸誘導性プロモーター（欧州特許出願第335528号）
、ならびにエタノールまたはシクロヘキサノン誘導性プロモーター（WO 93/2133
4号）等を使用することができる。
に制御することができる、化学的に誘導可能なプロモーターを含んでもよい。こ
の種のプロモーターとして、中でも、PRP1プロモーター（Wardら、Plant. Mol.
Biol. 22（1993）、361〜366）、サリチル酸により誘導可能なプロモーター（WO
95/19443号）、ベンゼンスルホンアミド誘導性プロモーター（欧州特許出願第3
88186号）、テトラサイクリン誘導性プロモーター（Gatzら、（1992）Plant J.
2、397〜404）、アブシジン酸誘導性プロモーター（欧州特許出願第335528号）
、ならびにエタノールまたはシクロヘキサノン誘導性プロモーター（WO 93/2133
4号）等を使用することができる。
【００９１】 さらに、特に好ましいプロモーターは、トコフェロールまたはその前駆体の生
合成が起こる植物の組織または部分で発現を確実にするプロモーターである。特
に、葉特異的発現を確実にするプロモーターが挙げられる。また、ジャガイモ由
来の細胞質ゾルFBPaseのプロモーター、あるいは、ジャガイモ由来のST-LSIプロ
モーター（Stockhausら、EMBO J. 8（1989）2445〜245）が挙げられる。
合成が起こる植物の組織または部分で発現を確実にするプロモーターである。特
に、葉特異的発現を確実にするプロモーターが挙げられる。また、ジャガイモ由
来の細胞質ゾルFBPaseのプロモーター、あるいは、ジャガイモ由来のST-LSIプロ
モーター（Stockhausら、EMBO J. 8（1989）2445〜245）が挙げられる。
【００９２】 種子特異的プロモーターを用いて、トランスジェニックタバコ植物の種子にお
いて、全可溶性種子タンパク質の0.67％の含量まで、安定して外来タンパク質を
発現させることができる（FiedlerおよびConrad、Bio/Technology 10（1995）、
1090〜1094）。従って、該発現カセットは、例えば、種子特異的プロモーター（
好ましくは、ファゼオリンプロモーター（US 5504200号）、USP（Baumlein、H.
ら、Mol. Gen. Genet. (1991) 225 (3)、459〜467）またはLEB4プロモーター（F
iedlerおよびConrad、1995））、LEB4シグナルペプチド、発現しようとする遺伝
子、ならびにER保持シグナルを含有することができる。この種のカセットの構築
は、図2に例として概略的に示す。
いて、全可溶性種子タンパク質の0.67％の含量まで、安定して外来タンパク質を
発現させることができる（FiedlerおよびConrad、Bio/Technology 10（1995）、
1090〜1094）。従って、該発現カセットは、例えば、種子特異的プロモーター（
好ましくは、ファゼオリンプロモーター（US 5504200号）、USP（Baumlein、H.
ら、Mol. Gen. Genet. (1991) 225 (3)、459〜467）またはLEB4プロモーター（F
iedlerおよびConrad、1995））、LEB4シグナルペプチド、発現しようとする遺伝
子、ならびにER保持シグナルを含有することができる。この種のカセットの構築
は、図2に例として概略的に示す。
【００９３】 発現カセットは、適したプロモーターを、適したDOXS DNA配列、好ましくは
、プロモーターと、DOXS DNA配列との間に挿入され、葉緑体特異的トランジット
ペプチドをコードするDNA、ならびに、ポリアデニル化シグナルに融合すること
により作成される。尚、この融合は、従来の組換えおよびクローン化方法により
達成され、例えば、T. Maniatis、E.F. FritschおよびJ. Sambrook、Molecular
Cloning：A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring
Harbor、NY（1989）； T.J. Silhavy、M.L. BermanおよびL.W. Enquist、Exper
iments with Gene Fusions、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Har
bor、NY（1984）；ならびに、Ausbel、F.M.ら、Current Protocols in Molecula
r Biology、Greene Publishing Assoc.およびWiley-Interscience（1987）に記
載されている。
、プロモーターと、DOXS DNA配列との間に挿入され、葉緑体特異的トランジット
ペプチドをコードするDNA、ならびに、ポリアデニル化シグナルに融合すること
により作成される。尚、この融合は、従来の組換えおよびクローン化方法により
達成され、例えば、T. Maniatis、E.F. FritschおよびJ. Sambrook、Molecular
Cloning：A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring
Harbor、NY（1989）； T.J. Silhavy、M.L. BermanおよびL.W. Enquist、Exper
iments with Gene Fusions、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Har
bor、NY（1984）；ならびに、Ausbel、F.M.ら、Current Protocols in Molecula
r Biology、Greene Publishing Assoc.およびWiley-Interscience（1987）に記
載されている。
【００９４】 特に好ましい配列には、アポプラスト、色素体、液胞、ミトコンドリア、小胞
体（ER）におけるターゲッティングを確実にする、あるいは、適切な機能性配列
が不在であるために、生産コンパートメント、細胞質ゾルにおける保持を確実に
する配列がある（Kermode、Crit. Rev. Plant Sci. 15、4（1996）、285〜423）
。ERでの局在化は、トランスジェニック植物に蓄積したタンパク質の量が有利で
あることを証明している（Schoutenら、Plant Mol. Biol. 30（1996）、781 〜7
92）。
体（ER）におけるターゲッティングを確実にする、あるいは、適切な機能性配列
が不在であるために、生産コンパートメント、細胞質ゾルにおける保持を確実に
する配列がある（Kermode、Crit. Rev. Plant Sci. 15、4（1996）、285〜423）
。ERでの局在化は、トランスジェニック植物に蓄積したタンパク質の量が有利で
あることを証明している（Schoutenら、Plant Mol. Biol. 30（1996）、781 〜7
92）。
【００９５】 また、DOXS融合タンパク質をコードするDNA配列を有する発現カセットを使用
することも可能であり、その際、該融合タンパク質の一部は、ポリペプチドの転
位を制御するトランジットペプチドである。葉緑体に特異的なトランジットペプ
チドが特に好ましいが、これらのペプチドは、DOXS遺伝子の葉緑体への転位の後
、DOXS部分から酵素により排除される。特に好ましいトランジットペプチドは、
色素体トラスケトラーゼ（TK）に由来するものか、あるいは、このトランジット
ペプチドの機能上の同等物（例えば、ルビスコまたはフェレドキシン-NADPオキ
シドレダクターゼの小サブユニットのトランジットペプチド）である。
することも可能であり、その際、該融合タンパク質の一部は、ポリペプチドの転
位を制御するトランジットペプチドである。葉緑体に特異的なトランジットペプ
チドが特に好ましいが、これらのペプチドは、DOXS遺伝子の葉緑体への転位の後
、DOXS部分から酵素により排除される。特に好ましいトランジットペプチドは、
色素体トラスケトラーゼ（TK）に由来するものか、あるいは、このトランジット
ペプチドの機能上の同等物（例えば、ルビスコまたはフェレドキシン-NADPオキ
シドレダクターゼの小サブユニットのトランジットペプチド）である。
【００９６】 DOXSをコードする挿入ヌクレオチド配列は、合成により調製することもできる
し、天然から取得することもできる。あるいは、該ヌクレオチドは、合成および
天然DNA成分の混合物を含んでもよいし、また、異なる生物由来の異なる異種DOX
S遺伝子セクションから構成されていてもよい。一般に、合成ヌクレオチド配列
は、植物が優先するコドンを用いて生成される。植物が優先するこれらのコドン
は、ほとんどの目的の植物種で発現される、タンパク質頻度（protein frequenc
y）の最も高いコドンから同定することができる。発現カセットを調製するため
に、様々なDNA断片を操作することにより、正しい方向で有利に読み取れると同
時に、正しいリーディングフレームを備えるヌクレオチド配列を取得することも
可能である。アダプターまたはリンカーを該断片に結合することにより、DNA断
片を互いに連結することもできる。
し、天然から取得することもできる。あるいは、該ヌクレオチドは、合成および
天然DNA成分の混合物を含んでもよいし、また、異なる生物由来の異なる異種DOX
S遺伝子セクションから構成されていてもよい。一般に、合成ヌクレオチド配列
は、植物が優先するコドンを用いて生成される。植物が優先するこれらのコドン
は、ほとんどの目的の植物種で発現される、タンパク質頻度（protein frequenc
y）の最も高いコドンから同定することができる。発現カセットを調製するため
に、様々なDNA断片を操作することにより、正しい方向で有利に読み取れると同
時に、正しいリーディングフレームを備えるヌクレオチド配列を取得することも
可能である。アダプターまたはリンカーを該断片に結合することにより、DNA断
片を互いに連結することもできる。
【００９７】 プロモーターおよびターミネーター領域に、この配列を挿入するための1つ以
上の制限部位を含むリンカーまたはポリリンカーを、転写方向に備えることが可
能であり、また有利である。原則として、リンカーは、１〜10個、通常、１〜８
個、好ましくは２〜６個の制限部位を有する。リンカーのサイズは、調節領域内
部で、100bp未満、多くの場合、60bpより小さいが、少なくとも５bpである。プ
ロモーターは、宿主植物に対して、天然もしくは相同性および外来性または異種
性のいずれでもよい。発現カセットは、転写の5'から3'の方向に、プロモーター
、DOXS遺伝子をコードするDNA、ならびに、転写の終結のための領域を含む。様
々な終結領域が所望に応じて交換可能である。
上の制限部位を含むリンカーまたはポリリンカーを、転写方向に備えることが可
能であり、また有利である。原則として、リンカーは、１〜10個、通常、１〜８
個、好ましくは２〜６個の制限部位を有する。リンカーのサイズは、調節領域内
部で、100bp未満、多くの場合、60bpより小さいが、少なくとも５bpである。プ
ロモーターは、宿主植物に対して、天然もしくは相同性および外来性または異種
性のいずれでもよい。発現カセットは、転写の5'から3'の方向に、プロモーター
、DOXS遺伝子をコードするDNA、ならびに、転写の終結のための領域を含む。様
々な終結領域が所望に応じて交換可能である。
【００９８】 さらに、適切な制限切断部位を提供する、または、重複DNAもしくは制限切断
部位を欠失させる操作を使用してもよい。挿入、欠失または置換、例えば、トラ
ンジションおよびトランスバージョンに関して、in vitro突然変異誘発、プライ
マー修復、制限または連結を用いることが可能である。適切な操作、例えば、平
滑末端のための突出部の制限、破砕（chewing back）または充填を用いて、連結
用の断片の相補的末端をもたらすことができる。
部位を欠失させる操作を使用してもよい。挿入、欠失または置換、例えば、トラ
ンジションおよびトランスバージョンに関して、in vitro突然変異誘発、プライ
マー修復、制限または連結を用いることが可能である。適切な操作、例えば、平
滑末端のための突出部の制限、破砕（chewing back）または充填を用いて、連結
用の断片の相補的末端をもたらすことができる。
【００９９】 本発明を成功させる上で重要なのは、中でも、特定のER保持シグナルSEKDEL（
Schouten, A.ら、Plant Mol. Biol. 30（1996）、781〜792）を結合し、これに
よって、発現の平均レベルを3倍または４倍にすることであろう。また、カセッ
ト構築用のER内に局在化された植物および動物タンパク質に自然に発生する他の
保持シグナルを使用することも可能である。
Schouten, A.ら、Plant Mol. Biol. 30（1996）、781〜792）を結合し、これに
よって、発現の平均レベルを3倍または４倍にすることであろう。また、カセッ
ト構築用のER内に局在化された植物および動物タンパク質に自然に発生する他の
保持シグナルを使用することも可能である。
【０１００】 好ましいポリアデニル化シグナルは、植物ポリアデニル化シグナルであり、好
ましくは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス由来の、特に、Tiプラスミド
pTiACH5（Gielenら、EMBO J. 3（1984）835 ff）、またはその機能上の同等物の
T-DNA（オクトピンシンターゼ）の遺伝子３のT-DNAポリアデニル化シグナルに本
質的に対応するものである。
ましくは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス由来の、特に、Tiプラスミド
pTiACH5（Gielenら、EMBO J. 3（1984）835 ff）、またはその機能上の同等物の
T-DNA（オクトピンシンターゼ）の遺伝子３のT-DNAポリアデニル化シグナルに本
質的に対応するものである。
【０１０１】 発現カセットは、例えば、構成プロモーター（好ましくは、CaMV 35 Sプロモ
ーター）、LeB4シグナルペプチド、発現させようとする遺伝子、ならびに、ER保
持シグナルを含有することができる。好ましく使用されるER保持シグナルは、ア
ミノ酸配列KDEL（リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ロイシン）である。
ーター）、LeB4シグナルペプチド、発現させようとする遺伝子、ならびに、ER保
持シグナルを含有することができる。好ましく使用されるER保持シグナルは、ア
ミノ酸配列KDEL（リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ロイシン）である。
【０１０２】 DOXS遺伝子をコードする融合発現カセットは、好ましくは、アグロバクテリウ
ム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens)を形質転換するのに適した
、ベクター、例えば、pBin19にクローン化される。このようなベクターで形質転
換されたアグロバクテリウムを公知の方法で用いて、例えば、アグロバクテリウ
ムの溶液に、傷つけた葉または葉の切片を浸した後、適切な培地中で培養するこ
とにより、植物、特に、農作物、例えば、タバコ植物を形質転換することができ
る。アグロバクテリウムによる植物の形質転換は、特に、F.F. White、Vectors
for Gene Transfer in Higher Plants；Transgenic Plants、Vol. 1、Engineeri
ng and Utilization、S.D. KungおよびR. Wu編、Academic Press、1993、pp.15
〜38により開示されている。DOXS遺伝子の発現用の、発現カセットに組み込まれ
た遺伝子を含有するトランスジェニック植物は、傷つけた葉または葉の切片の形
質転換された細胞から、公知の方法で再生することができる。
ム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens)を形質転換するのに適した
、ベクター、例えば、pBin19にクローン化される。このようなベクターで形質転
換されたアグロバクテリウムを公知の方法で用いて、例えば、アグロバクテリウ
ムの溶液に、傷つけた葉または葉の切片を浸した後、適切な培地中で培養するこ
とにより、植物、特に、農作物、例えば、タバコ植物を形質転換することができ
る。アグロバクテリウムによる植物の形質転換は、特に、F.F. White、Vectors
for Gene Transfer in Higher Plants；Transgenic Plants、Vol. 1、Engineeri
ng and Utilization、S.D. KungおよびR. Wu編、Academic Press、1993、pp.15
〜38により開示されている。DOXS遺伝子の発現用の、発現カセットに組み込まれ
た遺伝子を含有するトランスジェニック植物は、傷つけた葉または葉の切片の形
質転換された細胞から、公知の方法で再生することができる。
【０１０３】 DOXSをコードするDNAを用いた宿主植物の形質転換のために、発現カセットを
挿入断片として、組換えベクターに組み込む。尚、このベクターDNAは、さらに
、機能性調節シグナル、例えば、複製または組込み用の配列を含む。適したベク
ターは、特に、"Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology"（CR
C Press）、Chap. 6/7、pp. 71〜119（1993）に記載されている。
挿入断片として、組換えベクターに組み込む。尚、このベクターDNAは、さらに
、機能性調節シグナル、例えば、複製または組込み用の配列を含む。適したベク
ターは、特に、"Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology"（CR
C Press）、Chap. 6/7、pp. 71〜119（1993）に記載されている。
【０１０４】 前述の組換えおよびクローン化方法を用いて、発現カセットを、例えば、大腸
菌において、それらの複製を可能にする適切なベクター中にクローン化すること
が可能である。適したクローニングベクターは、特に、pBR332、pUC系列、M13mp
系列およびpACYC184である。大腸菌およびアグロバクテリアの両方で複製が可能
なバイナリーベクターが特に適している。
菌において、それらの複製を可能にする適切なベクター中にクローン化すること
が可能である。適したクローニングベクターは、特に、pBR332、pUC系列、M13mp
系列およびpACYC184である。大腸菌およびアグロバクテリアの両方で複製が可能
なバイナリーベクターが特に適している。
【０１０５】 さらに、本発明は、植物の形質転換、植物の細胞、組織または一部の形質転換
のための、配列番号１または配列番号３；配列番号１または配列番号３および配
列番号５；配列番号１または配列番号３および配列番号７、あるいは、配列番号
１または配列番号３および配列番号５および配列番号７のDNA配列、あるいは後
者とハイブリダイズするDNA配列を含む発現カセットの使用に関する。この使用
の好ましい目的は、植物のトコフェロール、ビタミンＫ、クロロフィルおよびカ
ロテノイド含量を増加することである。
のための、配列番号１または配列番号３；配列番号１または配列番号３および配
列番号５；配列番号１または配列番号３および配列番号７、あるいは、配列番号
１または配列番号３および配列番号５および配列番号７のDNA配列、あるいは後
者とハイブリダイズするDNA配列を含む発現カセットの使用に関する。この使用
の好ましい目的は、植物のトコフェロール、ビタミンＫ、クロロフィルおよびカ
ロテノイド含量を増加することである。
【０１０６】 さらに、プロモーターの選択に応じて、発現が、植物の葉、種子もしくはその
他の部分に特異的に起こるようにすることも可能である。本発明は、さらにまた
、このようなトランスジェニック植物、その増殖物質、ならびに、これら植物の
細胞、組織または一部に関する。
他の部分に特異的に起こるようにすることも可能である。本発明は、さらにまた
、このようなトランスジェニック植物、その増殖物質、ならびに、これら植物の
細胞、組織または一部に関する。
【０１０７】 さらに、トコフェロール、ビタミンＫ、クロロフィルおよび／またはカロテノ
イド産生を増加することを目的として、発現カセットを用いて、細菌、ラン藻類
、酵母、糸状菌および藻類を形質転換することができる。
イド産生を増加することを目的として、発現カセットを用いて、細菌、ラン藻類
、酵母、糸状菌および藻類を形質転換することができる。
【０１０８】 植物のゲノムへの外来遺伝子の転移を形質転換と呼ぶ。これに関して、植物組
織または植物細胞から植物を形質転換および再生することについて記載された方
法を用いて、一過性または安定した形質転換を実施する。適した方法は、ポリエ
チレングリコール誘導DNA取込みによるプロトプラスト形質転換、パーティクル
ボンバードメント法と呼ばれる遺伝子ガンを用いた生物分解性方法、エレクトロ
ポレーション、DNA含有溶液中での乾燥胚のインキュベーション、マイクロイン
ジェクション、ならびに、アグロバクテリウムが媒介する遺伝子トランスファー
である。上記の方法は、例えば、B. Jenesら、Techniques for Gene Transfer、
Transgenic Plants、Vol.１、Engineering and Utilization、S.D. KungおよびR
. Wu編、Academic Press（1993）128〜143ならびにPotrykus Annu. Rev. Plant
Physiol. Plant Molec. Biol. 42（1991）205〜225）に記載されている。発現す
べき構築物は、好ましくは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobact
erium tumefaciens)を形質転換するのに適したベクター、例えば、pBin19（Beva
nら、Nucl. Acids Res. 12（1984）8711）中にクローン化する。
織または植物細胞から植物を形質転換および再生することについて記載された方
法を用いて、一過性または安定した形質転換を実施する。適した方法は、ポリエ
チレングリコール誘導DNA取込みによるプロトプラスト形質転換、パーティクル
ボンバードメント法と呼ばれる遺伝子ガンを用いた生物分解性方法、エレクトロ
ポレーション、DNA含有溶液中での乾燥胚のインキュベーション、マイクロイン
ジェクション、ならびに、アグロバクテリウムが媒介する遺伝子トランスファー
である。上記の方法は、例えば、B. Jenesら、Techniques for Gene Transfer、
Transgenic Plants、Vol.１、Engineering and Utilization、S.D. KungおよびR
. Wu編、Academic Press（1993）128〜143ならびにPotrykus Annu. Rev. Plant
Physiol. Plant Molec. Biol. 42（1991）205〜225）に記載されている。発現す
べき構築物は、好ましくは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobact
erium tumefaciens)を形質転換するのに適したベクター、例えば、pBin19（Beva
nら、Nucl. Acids Res. 12（1984）8711）中にクローン化する。
【０１０９】 同様に、発現カセットを用いて形質転換したアグロバクテリウムを公知公知方
法で用いて、例えば、傷つけた葉または葉の切片をアグロバクテリウムの溶液に
浸けた後、適した培地で培養することにより、植物、特に、穀物、トウモロコシ
、オートムギ、ダイズ、コメ、ワタ、サトウキビ、カノラ、ヒマワリ、アマ、ア
サ、ジャガイモ、タバコ、トマト、セイヨウアブラナ、アルファルファ、レタス
等の農作物、ならびに、各種樹木、木の実およびブドウ種を形質転換することが
できる。
法で用いて、例えば、傷つけた葉または葉の切片をアグロバクテリウムの溶液に
浸けた後、適した培地で培養することにより、植物、特に、穀物、トウモロコシ
、オートムギ、ダイズ、コメ、ワタ、サトウキビ、カノラ、ヒマワリ、アマ、ア
サ、ジャガイモ、タバコ、トマト、セイヨウアブラナ、アルファルファ、レタス
等の農作物、ならびに、各種樹木、木の実およびブドウ種を形質転換することが
できる。
【０１１０】 DOXS遺伝子をコードする機能上の同等配列は、ヌクレオチド配列は異なるが、
必要な機能を備える配列である。機能上の同等物は、従って、本明細書に記載す
る配列の自然に発生した変異体、ならびに、例えば、化学合成により取得し、植
物のコドン使用法に適合させた人工ヌクレオチド配列を含む。
必要な機能を備える配列である。機能上の同等物は、従って、本明細書に記載す
る配列の自然に発生した変異体、ならびに、例えば、化学合成により取得し、植
物のコドン使用法に適合させた人工ヌクレオチド配列を含む。
【０１１１】 機能上の同等物はまた、DOXSをコードするが、依然として必要な機能を示す、
最初に単離された配列の自然または人工突然変異も意味する。突然変異は、１つ
以上のヌクレオチド残基の置換、付加、欠失、転位または挿入を含む。従って、
本発明はまた、例えば、DOXSヌクレオチド配列を修飾することにより得られたヌ
クレオチド配列も含む。このような修飾の目的は、例えば、存在するコード配列
をさらに局在化すること、あるいは、例えば、さらに制限酵素切断部位を挿入す
ることである。
最初に単離された配列の自然または人工突然変異も意味する。突然変異は、１つ
以上のヌクレオチド残基の置換、付加、欠失、転位または挿入を含む。従って、
本発明はまた、例えば、DOXSヌクレオチド配列を修飾することにより得られたヌ
クレオチド配列も含む。このような修飾の目的は、例えば、存在するコード配列
をさらに局在化すること、あるいは、例えば、さらに制限酵素切断部位を挿入す
ることである。
【０１１２】 また、機能上の同等物は、元の遺伝子または遺伝子断片と比較して、減衰もし
くは増強した機能を有する変異体である。
くは増強した機能を有する変異体である。
【０１１３】 また、人工DNA配列は、前述のように、必要な特性、例えば、農作物においてD
OXS遺伝子を過剰発現させることにより、該植物中にトコフェロール含量を増加
させる特性を賦与するものであれば、適している。このような人工DNA配列は、
例えば、分子モデル化により構築され、かつ、DOXS活性を有するタンパク質の戻
り翻訳（back-translation）により、あるいは、in vitro選択により同定するこ
とができる。特に適したコードDNA配列は、宿主植物に特異的なコドン使用法に
従うポリペプチド配列の戻り翻訳により得られたものである。特異的コドン使用
法は、植物遺伝子工学の当業者により、形質転換しようとする植物における他の
公知遺伝子のコンピューター分析を通じて確立することができる。
OXS遺伝子を過剰発現させることにより、該植物中にトコフェロール含量を増加
させる特性を賦与するものであれば、適している。このような人工DNA配列は、
例えば、分子モデル化により構築され、かつ、DOXS活性を有するタンパク質の戻
り翻訳（back-translation）により、あるいは、in vitro選択により同定するこ
とができる。特に適したコードDNA配列は、宿主植物に特異的なコドン使用法に
従うポリペプチド配列の戻り翻訳により得られたものである。特異的コドン使用
法は、植物遺伝子工学の当業者により、形質転換しようとする植物における他の
公知遺伝子のコンピューター分析を通じて確立することができる。
【０１１４】 さらに、適した同等の核酸配列として、融合タンパク質をコードする配列が挙
げられ、この場合、植物DOXSポリペプチドまたはその機能上同等部分は、該融合
タンパク質の構成要素である。該融合タンパク質の第2の部分は、例えば、酵素
活性を有する別のポリペプチド、もしくはDOXS発現（例えば、mycタグまたはhis
タグ）を検出するために使用することができる抗原ポリペプチド配列であってよ
い。しかし、好ましくは、これは、調節タンパク質配列、例えば、DOXSタンパク
質を必要な作用部位に導くシグナルペプチドまたはトランジットペプチドである
。
げられ、この場合、植物DOXSポリペプチドまたはその機能上同等部分は、該融合
タンパク質の構成要素である。該融合タンパク質の第2の部分は、例えば、酵素
活性を有する別のポリペプチド、もしくはDOXS発現（例えば、mycタグまたはhis
タグ）を検出するために使用することができる抗原ポリペプチド配列であってよ
い。しかし、好ましくは、これは、調節タンパク質配列、例えば、DOXSタンパク
質を必要な作用部位に導くシグナルペプチドまたはトランジットペプチドである
。
【０１１５】 本発明はまた、本発明に従って生成された発現産物、ならびに、トランジット
ペプチドと、DOXS活性を有するポリペプチドとから構成される融合タンパク質に
関する。
ペプチドと、DOXS活性を有するポリペプチドとから構成される融合タンパク質に
関する。
【０１１６】 トコフェロール、ビタミンＫ、クロロフィルおよび／またはカロテノイド含量
の増加は、本発明の目的に関して、少なくとも１つの植物世代の間に、遺伝的に
改変されなかった植物と比較して、植物におけるDOXS遺伝子の機能的過剰発現に
より、上記化合物の生合成における活性増加の能力が人工的に獲得されたことを
意味する。
の増加は、本発明の目的に関して、少なくとも１つの植物世代の間に、遺伝的に
改変されなかった植物と比較して、植物におけるDOXS遺伝子の機能的過剰発現に
より、上記化合物の生合成における活性増加の能力が人工的に獲得されたことを
意味する。
【０１１７】 トコフェロール生合成部位は、一般に、DOXS遺伝子の葉特異的発現が顕著にな
るように、葉組織である。しかし、トコフェロール生合成は、葉組織に限定する
必要はなく、植物の他のあらゆる部分、例えば、油脂含有種子において、組織特
異的に起こり得ることは明らかである。
るように、葉組織である。しかし、トコフェロール生合成は、葉組織に限定する
必要はなく、植物の他のあらゆる部分、例えば、油脂含有種子において、組織特
異的に起こり得ることは明らかである。
【０１１８】 外因性DOXS遺伝子の構成発現は、さらに別の利点である。しかし、反対に誘導
可能な発現もまた好ましいと思われる。
可能な発現もまた好ましいと思われる。
【０１１９】 トランスジェニックにより発現させたDOXS遺伝子の発現の有効性は、例えば、
茎頂分裂組織増殖によりin vitroで決定することができる。さらに、DOXS遺伝子
の発現の性質およびレベル、ならびに、トコフェロール生合成活性に及ぼすその
影響の変化は、試験植物に関する温室実験で試験することができる。
茎頂分裂組織増殖によりin vitroで決定することができる。さらに、DOXS遺伝子
の発現の性質およびレベル、ならびに、トコフェロール生合成活性に及ぼすその
影響の変化は、試験植物に関する温室実験で試験することができる。
【０１２０】 本発明はさらに、配列番号１または配列番号３；配列番号１または配列番号３
および配列番号５；、配列番号１または配列番号３および配列番号７の配列、あ
るいは、配列番号１または配列番号３および配列番号5および配列番号７のDNA配
列、あるいは後者とハイブリダイズするDNA配列を含む発現カセットを用いて形
質転換されたトランスジェニック植物、ならびに、このような植物のトランスジ
ェニック細胞、組織、部分および増殖物質に関する。これに関し、特に好ましい
ものとして、オオムギ、コムギ、ライムギ、トウモロコシ、オートムギ、ダイズ
、コメ、ワタ、サトウキビ、カノラ、ヒマワリ、アマ、アサ、ジャガイモ、タバ
コ、トマト、セイヨウアブラナ、アルファルファ、レタス等のトランスジェニッ
ク農作物、ならびに、各種樹木、木の実およびブドウ種が挙げられる。
および配列番号５；、配列番号１または配列番号３および配列番号７の配列、あ
るいは、配列番号１または配列番号３および配列番号5および配列番号７のDNA配
列、あるいは後者とハイブリダイズするDNA配列を含む発現カセットを用いて形
質転換されたトランスジェニック植物、ならびに、このような植物のトランスジ
ェニック細胞、組織、部分および増殖物質に関する。これに関し、特に好ましい
ものとして、オオムギ、コムギ、ライムギ、トウモロコシ、オートムギ、ダイズ
、コメ、ワタ、サトウキビ、カノラ、ヒマワリ、アマ、アサ、ジャガイモ、タバ
コ、トマト、セイヨウアブラナ、アルファルファ、レタス等のトランスジェニッ
ク農作物、ならびに、各種樹木、木の実およびブドウ種が挙げられる。
【０１２１】 本発明の目的のための植物は、単子葉および双子葉植物または藻類である。
【０１２２】 効率的なDOXS阻害剤を見いだすためには、阻害剤／酵素結合実験の実施を可能
にする適切な試験系を提供する必要がある。この目的のために、シロイヌナズナ
（Arabidopsis）由来のDOXSの完全cDNA配列を発現ベクター（pQE、Qiagen）にク
ローン化し、大腸菌中で過剰発現させる。
にする適切な試験系を提供する必要がある。この目的のために、シロイヌナズナ
（Arabidopsis）由来のDOXSの完全cDNA配列を発現ベクター（pQE、Qiagen）にク
ローン化し、大腸菌中で過剰発現させる。
【０１２３】 上記発現カセットを用いて発現させたDOXSタンパク質は、DOXSに特異的な阻害
剤を見いだすために特に適している。
剤を見いだすために特に適している。
【０１２４】 この目的のために、DOXSを、例えば、酵素アッセイで用いることができる。こ
こで、試験対象である活性物質の存在および不在下で、DOXSの活性を測定する。
２つの活性測定値を比較することにより、試験対象の活性物質の阻害挙動につい
て、性質および量に関する情報を得ることができる。DOXS活性測定方法について
は、記載されている（Putraら、Tetrahedron Letters 39（1998）、23〜26；Spr
engerら、PNAS 94（1997）、12857〜12862）。
こで、試験対象である活性物質の存在および不在下で、DOXSの活性を測定する。
２つの活性測定値を比較することにより、試験対象の活性物質の阻害挙動につい
て、性質および量に関する情報を得ることができる。DOXS活性測定方法について
は、記載されている（Putraら、Tetrahedron Letters 39（1998）、23〜26；Spr
engerら、PNAS 94（1997）、12857〜12862）。
【０１２５】 本発明の試験系を用いることにより、阻害特性について、多数の化学化合物を
迅速かつ簡単に検定することができる。この方法は、多数の物質、特に、高い活
性を有する物質からの再生可能な選択を可能にし、これによって、後に、これら
の物質を用いて、当業者に公知のさらに集中的な試験を実施することができる。
迅速かつ簡単に検定することができる。この方法は、多数の物質、特に、高い活
性を有する物質からの再生可能な選択を可能にし、これによって、後に、これら
の物質を用いて、当業者に公知のさらに集中的な試験を実施することができる。
【０１２６】 原理として、植物において、DOXSをコードする配列番号１または配列番号３の
遺伝子配列を過剰発現させることにより、DOXS阻害剤に対する耐性を高めること
が可能である。同様に、本発明は、このようにして作製されたトランスジェニッ
ク植物に関する。
遺伝子配列を過剰発現させることにより、DOXS阻害剤に対する耐性を高めること
が可能である。同様に、本発明は、このようにして作製されたトランスジェニッ
ク植物に関する。
【０１２７】 本発明は、さらに、下記の事項に関する： −配列番号１もしくは配列番号３のDNA配列、または、後者とハイブリダイズす
るDNA配列を含む発現カセットを、植物細胞、カルス組織、植物全体または植物
のプロトプラストに導入することを含む、植物の形質転換方法、 −植物DOXSを製造するための植物の使用、 −配列番号１もしくは配列番号３のDNA配列、または、後者とハイブリダイズす
るDNA配列の増強した発現により、DOXS阻害剤に対する耐性が高められた植物を
製造するための、配列番号１もしくは配列番号３のDNA配列、または、後者とハ
イブリダイズするDNA配列を含む発現カセットの使用。 −植物におけるDOXS DNA配列の発現により、トコフェロール、ビタミンＫ、クロ
ロフィルおよび／またはカロテノイド含量が増加した植物を製造するための、配
列番号１もしくは配列番号３のDNA配列、または、後者とハイブリダイズするDNA
配列の使用。 −DOXS阻害剤を同定する試験系を製造するための、配列番号１もしくは配列番号
３のDNA配列、または、後者とハイブリダイズするDNA配列を含む発現カセットの
使用。
るDNA配列を含む発現カセットを、植物細胞、カルス組織、植物全体または植物
のプロトプラストに導入することを含む、植物の形質転換方法、 −植物DOXSを製造するための植物の使用、 −配列番号１もしくは配列番号３のDNA配列、または、後者とハイブリダイズす
るDNA配列の増強した発現により、DOXS阻害剤に対する耐性が高められた植物を
製造するための、配列番号１もしくは配列番号３のDNA配列、または、後者とハ
イブリダイズするDNA配列を含む発現カセットの使用。 −植物におけるDOXS DNA配列の発現により、トコフェロール、ビタミンＫ、クロ
ロフィルおよび／またはカロテノイド含量が増加した植物を製造するための、配
列番号１もしくは配列番号３のDNA配列、または、後者とハイブリダイズするDNA
配列の使用。 −DOXS阻害剤を同定する試験系を製造するための、配列番号１もしくは配列番号
３のDNA配列、または、後者とハイブリダイズするDNA配列を含む発現カセットの
使用。
【０１２８】 以下に記載する実施例により、本発明を説明するが、本発明がこれらに限定さ
れるわけではない。
れるわけではない。
【０１２９】一般的クローニング方法 制限切断、アガロースゲル電気泳動、DNA断片の精製、ニトロセルロースおよ
びナイロン膜への核酸のトランスファー、DNA断片の連結、大腸菌細胞の形質転
換、細菌の培養、ファージの複製、ならびに、組換えDNA配列解析等、本発明の
目的のために実施されるクローニングステップは、Sambrookらが記載する通りに
実施した（Sambrookら、（1989）Cold Spring Harbor Laboratory Press；ISBN
0-87969-309-6）。
びナイロン膜への核酸のトランスファー、DNA断片の連結、大腸菌細胞の形質転
換、細菌の培養、ファージの複製、ならびに、組換えDNA配列解析等、本発明の
目的のために実施されるクローニングステップは、Sambrookらが記載する通りに
実施した（Sambrookら、（1989）Cold Spring Harbor Laboratory Press；ISBN
0-87969-309-6）。
【０１３０】 以下で用いた細菌株（大腸菌、XL-I Blue）は、Stratageneから購入した。植
物の形質転換に用いたアグロバクテリウム株（アグロバクテリウム・ツメファシ
エンス、プラスミドpGV2260またはpGV3850 kannを含むC58C1）は、Deblaereら（
Nucl. Acids Res. 13（1985） 4777）により記載されている。これ以外に、アグ
ロバクテリウム株LBA4404（Clontech）もしくはその他の菌株を使用する可能性
もある。クローン化に使用することのできるベクターは、pUC19（Yanish-Perron
、Gene 33（1985）、103〜119）、pBluescript SK-（Stratagenen）、pGEM-T（P
romega）、ｐZer0（Invitrogen）、pBin19（Bevanら、Nucl. Acids Res. 12（19
84）、8711〜8720）およびpBinAR（HofgenおよびWillmitzer、Plant Science 66
（1990）、221〜230）である。
物の形質転換に用いたアグロバクテリウム株（アグロバクテリウム・ツメファシ
エンス、プラスミドpGV2260またはpGV3850 kannを含むC58C1）は、Deblaereら（
Nucl. Acids Res. 13（1985） 4777）により記載されている。これ以外に、アグ
ロバクテリウム株LBA4404（Clontech）もしくはその他の菌株を使用する可能性
もある。クローン化に使用することのできるベクターは、pUC19（Yanish-Perron
、Gene 33（1985）、103〜119）、pBluescript SK-（Stratagenen）、pGEM-T（P
romega）、ｐZer0（Invitrogen）、pBin19（Bevanら、Nucl. Acids Res. 12（19
84）、8711〜8720）およびpBinAR（HofgenおよびWillmitzer、Plant Science 66
（1990）、221〜230）である。
【０１３１】組換えDNA配列解析 Licorレーザー蛍光DNAシークエンサー（MWG Biotech、Ebersbachにより市販）お
よびサンガー法（Sangerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74（1977）、5463〜5
467）を用いて、組換えDNA分子を配列決定した。
よびサンガー法（Sangerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74（1977）、5463〜5
467）を用いて、組換えDNA分子を配列決定した。
【０１３２】実施例１ シロイヌナズナDOXS形質転換構築物の製造 Mandelら（1996）の記載通りに、シロイヌナズナDOXS遺伝子を完全cDNAとして
、ベクターpBluescript KS-（Stratagene）にクローン化した。
、ベクターpBluescript KS-（Stratagene）にクローン化した。
【０１３３】 過剰発現構築物を生成するため、pBluescript KS- Hincll（平滑末端）および
Sac1切断部位によって、2.3 kb断片（F-23-Cと称する）を単離した。この配列は
、ATG開始コドンから、終止コドンの下流80 bpに位置するEcoRlI切断部位までの
完全DOXS cDNAを含む。この断片を、Smal（平滑末端）と、Sacl切断部位によっ
て、pBIN19ベクター（図3）（Bevanら、（1980））にクローン化した。尚、この
ベクターは、配列内に3回配置されるカリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモ
ーター（Frankら、Cell 21(1)、285〜294（1980））を含む。
Sac1切断部位によって、2.3 kb断片（F-23-Cと称する）を単離した。この配列は
、ATG開始コドンから、終止コドンの下流80 bpに位置するEcoRlI切断部位までの
完全DOXS cDNAを含む。この断片を、Smal（平滑末端）と、Sacl切断部位によっ
て、pBIN19ベクター（図3）（Bevanら、（1980））にクローン化した。尚、この
ベクターは、配列内に3回配置されるカリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモ
ーター（Frankら、Cell 21(1)、285〜294（1980））を含む。
【０１３４】 アンチセンス構築物を生成するために、cDNAの3'末端の領域（F-23-Cアンチセ
ンスと呼ばれる）を前述のpBIN19-3X35Sベクターにクローン化した。pBluescrip
t KS-中のDOXS cDNAの5'領域をHincllおよびDOXS内部BglII切断部位を介して消
化し、得られた断片を除去した（図4）。BglII切断部位をクレノウ充填反応（ク
レノウポリメラーゼ；Roche；業者のプロトコルに従う反応の後）により充填し
、これによって、平滑末端が形成された。適合性となった末端（BglII平滑末端
およびHinclII）を連結した。DOXS cDNAの3'領域を、アンチセンス配向のKpnIお
よびXbal（両切断部位は、pBluescript KS-5'とDOXS cDNAの3'のポリリンカー内
に位置する）を介して、アンチセンス配向に前記pBIN19ベクターにクローン化し
た。
ンスと呼ばれる）を前述のpBIN19-3X35Sベクターにクローン化した。pBluescrip
t KS-中のDOXS cDNAの5'領域をHincllおよびDOXS内部BglII切断部位を介して消
化し、得られた断片を除去した（図4）。BglII切断部位をクレノウ充填反応（ク
レノウポリメラーゼ；Roche；業者のプロトコルに従う反応の後）により充填し
、これによって、平滑末端が形成された。適合性となった末端（BglII平滑末端
およびHinclII）を連結した。DOXS cDNAの3'領域を、アンチセンス配向のKpnIお
よびXbal（両切断部位は、pBluescript KS-5'とDOXS cDNAの3'のポリリンカー内
に位置する）を介して、アンチセンス配向に前記pBIN19ベクターにクローン化し
た。
【０１３５】 アグロバクテリウム・ツメファシエンスを用いた、前記構築物によるシロイヌ
ナズナ植物の形質転換は、真空浸透法（Bentら、Science 265（1994）、1856〜8
60）により実施した。各構築物について、複数の独立した形質転換細胞を単離し
た。各文字（表1）は、独立した形質転換系統を示す。そこから得られたT1世代
由来の植物を同型または異型接合性について判定した。各系統由来の複数の植物
を交配して、分離分析を実施した。表１に示す数字は、さらなる分析のために選
択された個別植物に対応する。同型および異型接合系統の両方が得られた。得ら
れた系統の分離分析を以下の表１に示す。
ナズナ植物の形質転換は、真空浸透法（Bentら、Science 265（1994）、1856〜8
60）により実施した。各構築物について、複数の独立した形質転換細胞を単離し
た。各文字（表1）は、独立した形質転換系統を示す。そこから得られたT1世代
由来の植物を同型または異型接合性について判定した。各系統由来の複数の植物
を交配して、分離分析を実施した。表１に示す数字は、さらなる分析のために選
択された個別植物に対応する。同型および異型接合系統の両方が得られた。得ら
れた系統の分離分析を以下の表１に示す。
【０１３６】
【表１】
【０１３７】実施例２ 大腸菌XL1 Blueの細菌ゲノムDNAの単離 大腸菌XL1 Blueの培養物を300 mlのルリア肉汁培地中で、37℃にて、12時間増
殖させた。Sorvall RC50 fugeにおいて5,000回転で、この培養物を１回ペレット
化することにより、細菌のゲノムDNAを単離した。次に、このペレットを、最初
の培養の溶菌バッファー（25 mM EDTA、0.5％SDS；50 mM Tris HCl、pH 8.0）の
１／30の容量中に再懸濁した。同じ容量のフェノール／クロロホルム／イソアミ
ルアルコール（25：24：１）を添加した後、70℃で10分間インキュベートした。
この水相をHaraeusフロア遠心分離機において3,500回転で15分間、フェノール類
から分離した。水性の上澄みを2.5容量のエタノールおよび１／10容量の8 M塩化
リチウムと混合し、核酸を室温で10分間かけて沈殿させた。次に、該ペレットを
400 μlのTE/RNAseに溶解させ、37℃で10分間インキュベートした。この溶液を
１容量のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（25：24：１）を用
いて再び振盪し、2.5容量のエタノールと、１／10容量の8 M塩化リチウムとを用
いて、上澄みを沈殿させた。次に、ペレットを80％エタノールで洗浄し、400 μ
lのTE/RNAseに溶解させた。
殖させた。Sorvall RC50 fugeにおいて5,000回転で、この培養物を１回ペレット
化することにより、細菌のゲノムDNAを単離した。次に、このペレットを、最初
の培養の溶菌バッファー（25 mM EDTA、0.5％SDS；50 mM Tris HCl、pH 8.0）の
１／30の容量中に再懸濁した。同じ容量のフェノール／クロロホルム／イソアミ
ルアルコール（25：24：１）を添加した後、70℃で10分間インキュベートした。
この水相をHaraeusフロア遠心分離機において3,500回転で15分間、フェノール類
から分離した。水性の上澄みを2.5容量のエタノールおよび１／10容量の8 M塩化
リチウムと混合し、核酸を室温で10分間かけて沈殿させた。次に、該ペレットを
400 μlのTE/RNAseに溶解させ、37℃で10分間インキュベートした。この溶液を
１容量のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（25：24：１）を用
いて再び振盪し、2.5容量のエタノールと、１／10容量の8 M塩化リチウムとを用
いて、上澄みを沈殿させた。次に、ペレットを80％エタノールで洗浄し、400 μ
lのTE/RNAseに溶解させた。
【０１３８】実施例３ 大腸菌からのDOXSの単離 PCR用のオリゴヌクレオチドは、DOXS DNA配列（登録番号AF035440）から誘導
し、これらに、BamHI制限切断部位を5'末端に結合し、また、XbaIまたは別のBam
HI制限切断部位を3'末端に結合した。5'末端のオリゴヌクレオチドは、遺伝子の
ATG開始コドンで始まる配列5'-ATGGATCCATGAGTTTT-GATATTGCCAAATAC-3'（DNA配
列のヌクレオチド１〜24；下線）を含み、また3'末端のオリゴヌクレオチドは、
遺伝子の終止コドンで始まる配列5'-ATTCTAGATTATGCCAGCCAGGCCTTG-3'または5'-
ATGGATCCTTATGCCAGCCAGGCCTTG-3'（逆転相補性DNA配列のヌクレオチド1845〜186
3；下線）を含む。２つのBamHI含有オリゴヌクレオチドを用いたPCR反応は、業
者の指示に従って、Pfuポリメラーゼ（Stratagenen GmbH、Heidelberg）を用い
て実施した。大腸菌由来の500ngのゲノムDNAを鋳型として使用した。PCRプログ
ラムは、次の通りである： ５サイクル：４秒94℃、30秒52℃、２分72℃； ５サイクル：４秒94℃、30秒48℃、２分72℃； 25サイクル：４秒94℃、30秒44℃、２分72℃。
し、これらに、BamHI制限切断部位を5'末端に結合し、また、XbaIまたは別のBam
HI制限切断部位を3'末端に結合した。5'末端のオリゴヌクレオチドは、遺伝子の
ATG開始コドンで始まる配列5'-ATGGATCCATGAGTTTT-GATATTGCCAAATAC-3'（DNA配
列のヌクレオチド１〜24；下線）を含み、また3'末端のオリゴヌクレオチドは、
遺伝子の終止コドンで始まる配列5'-ATTCTAGATTATGCCAGCCAGGCCTTG-3'または5'-
ATGGATCCTTATGCCAGCCAGGCCTTG-3'（逆転相補性DNA配列のヌクレオチド1845〜186
3；下線）を含む。２つのBamHI含有オリゴヌクレオチドを用いたPCR反応は、業
者の指示に従って、Pfuポリメラーゼ（Stratagenen GmbH、Heidelberg）を用い
て実施した。大腸菌由来の500ngのゲノムDNAを鋳型として使用した。PCRプログ
ラムは、次の通りである： ５サイクル：４秒94℃、30秒52℃、２分72℃； ５サイクル：４秒94℃、30秒48℃、２分72℃； 25サイクル：４秒94℃、30秒44℃、２分72℃。
【０１３９】 遺伝子クリーンキット（Dianova GmbH、Hilden）を用いて、断片を精製し、製
造者の指示に従って、ベクターPCR-Script（Stratagene GmbH、Heidelberg）に
クローン化した。配列の正確さは、配列決定により確認した。該断片は、PCR-Sc
riptベクターから単離したBamHIであり、これを、対応して切断したBin19ベクタ
ーに連結した。尚、このベクターは、プロモーターとして、CaMV 35Sの下流にジ
ャガイモトランスケタラーゼのトランジットペプチドをさらに含んでいる。この
トランジットペプチドが、色素体の局在化を確実にする。構築物を図５および６
に示すが、これらの断片は次の有意性を有する。
造者の指示に従って、ベクターPCR-Script（Stratagene GmbH、Heidelberg）に
クローン化した。配列の正確さは、配列決定により確認した。該断片は、PCR-Sc
riptベクターから単離したBamHIであり、これを、対応して切断したBin19ベクタ
ーに連結した。尚、このベクターは、プロモーターとして、CaMV 35Sの下流にジ
ャガイモトランスケタラーゼのトランジットペプチドをさらに含んでいる。この
トランジットペプチドが、色素体の局在化を確実にする。構築物を図５および６
に示すが、これらの断片は次の有意性を有する。
【０１４０】 断片A（529bp）は、カリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーター（カリ
フラワーモザイクウイルスのヌクレオチド6909〜7437）を含む。断片B（259bp）
は、トランスケトラーゼのトランジットペプチドを含む。断片Eは、DOXS遺伝子
を含む。断片D（192 bp）は、転写を終結させる、TiプラスミドpTIACH5（Gielen
ら、1984）のT DNAの遺伝子３のポリアデニル化シグナルを含む。
フラワーモザイクウイルスのヌクレオチド6909〜7437）を含む。断片B（259bp）
は、トランスケトラーゼのトランジットペプチドを含む。断片Eは、DOXS遺伝子
を含む。断片D（192 bp）は、転写を終結させる、TiプラスミドpTIACH5（Gielen
ら、1984）のT DNAの遺伝子３のポリアデニル化シグナルを含む。
【０１４１】 5'-BamHIおよび3'-XbaI含有オリゴヌクレオチドを用いたPCR反応は、製造者の
指示に従い、Taqポリメラーゼ（Takara,Sosei Co., Ltd.）を用いて実施した。
鋳型として、500ngの大腸菌由来ゲノムDNAを使用した。PCRプログラムは次の通
りである： ５サイクル：４秒94℃、４秒50℃、２分30℃； ５サイクル：４秒94℃、30秒46℃、２分68℃； 25サイクル：４秒94℃、30秒42℃、２分68℃。
指示に従い、Taqポリメラーゼ（Takara,Sosei Co., Ltd.）を用いて実施した。
鋳型として、500ngの大腸菌由来ゲノムDNAを使用した。PCRプログラムは次の通
りである： ５サイクル：４秒94℃、４秒50℃、２分30℃； ５サイクル：４秒94℃、30秒46℃、２分68℃； 25サイクル：４秒94℃、30秒42℃、２分68℃。
【０１４２】 遺伝子クリーンキットを用いて、断片を精製し、ベクターpGemT（Promega Gmb
H、Mannheim）に連結した。これをBamHI/XbaI断片同様に、対応して切断したpBi
n19ARベクターのCaMV 35Sプロモーターの下流にクローン化した。配列決定によ
り配列を確認した（配列番号３）。これにより、公表された配列と比較して、バ
リンへのアミノ酸152（アスパラギン）の変化およびトリプロファンへのアミノ
酸330（システイン）の変化を引き起こす２つの非保存的塩基交換が明らかにさ
れた。
H、Mannheim）に連結した。これをBamHI/XbaI断片同様に、対応して切断したpBi
n19ARベクターのCaMV 35Sプロモーターの下流にクローン化した。配列決定によ
り配列を確認した（配列番号３）。これにより、公表された配列と比較して、バ
リンへのアミノ酸152（アスパラギン）の変化およびトリプロファンへのアミノ
酸330（システイン）の変化を引き起こす２つの非保存的塩基交換が明らかにさ
れた。
【０１４３】実施例４ トランスジェニック植物におけるDOXS RNAの増加量の検出 DOXS過剰発現構築物を有する様々なトランスジェニック系統の発芽後15日目の
幼植物からの全RNAをLogemanら（Anal. Biochem. 163、16〜20（1987））の方法
により抽出し、1.2％アガロースゲル中で分画し、フィルターにトランスファー
後、プローブとしての長さ2.1 kbのDOXS断片とハイブリダイズした（図7）。
幼植物からの全RNAをLogemanら（Anal. Biochem. 163、16〜20（1987））の方法
により抽出し、1.2％アガロースゲル中で分画し、フィルターにトランスファー
後、プローブとしての長さ2.1 kbのDOXS断片とハイブリダイズした（図7）。
【０１４４】実施例５ トランスジェニック植物におけるDOXSタンパク質の増加量の検出 DOXS過剰発現構築物を有する様々なトランスジェニック植物それぞれの発芽後
15日目の幼植物からの全タンパク質（図8）を単離し、ポリクローナル抗DOXS抗
体（IgG）を用いたウエスタン分析で検出した（図9）。
15日目の幼植物からの全タンパク質（図8）を単離し、ポリクローナル抗DOXS抗
体（IgG）を用いたウエスタン分析で検出した（図9）。
【０１４５】実施例６ カロテノイドおよびクロロフィル含量の測定 LichtenthalerおよびWellburn（1983）により記載のように、100％アセトン抽
出物を用いて、カロテノイドおよびクロロフィルの合計量を測定した。DOXS過剰
発現構築物を有するトランスジェニック系統それぞれの測定結果を以下の表２に
示す。
出物を用いて、カロテノイドおよびクロロフィルの合計量を測定した。DOXS過剰
発現構築物を有するトランスジェニック系統それぞれの測定結果を以下の表２に
示す。
【０１４６】
【表２】
【０１４７】実施例７ セイヨウアブラナの形質転換 トランスジェニックセイヨウアブラナ植物の製造は、Bade, JBおよびDamm, B
（Gene, Transfer to Plants, Potrykus, I. およびSpangenberg, G.編、Spring
er Lab Manual, Springer Verlag、1995、30〜38）のプロトコルに基づいて行っ
た。使用する培地の組成についても記載されている。形質転換は、アグロバクテ
リウム株LBA4404（Clontech）を用いて実施した。使用したバイナリベクターは
、前述した完全DOXS cDNAを含むpBIN19構築物であった。これらpBINベクターに
おけるNOSターミネーター配列をOCRターミネーター配列で置換した。セイヨウア
ブラナ（Brassica napus）の種子を70％（v/v）エタノールで表面殺菌し、H2O中
で55℃にて10分間洗浄し、１％強度の次亜塩素酸塩溶液（25％ v/v Teepol、0.1
％ v/v Twenn 20）中で20分間インキュベートした後、滅菌H2Oで20分づつ、６回
洗浄した。種子をろ紙上で3日間乾燥させ、10〜15個の種子を、15mlの発芽媒質
を含むガラス製フラスコ中で発芽するよう誘導した。数本の幼植物（長さ約10cm
）から根と頂端を除去し、残った胚軸を長さ約６cmの切片に切断した。このよう
にして得られた約600個の外植片を50mlの基礎培地で30分間洗浄した後、300mlの
フラスコに移した。100mlのカルス誘導培地を添加した後、培養物を100rpmで24
時間インキュベートした。
（Gene, Transfer to Plants, Potrykus, I. およびSpangenberg, G.編、Spring
er Lab Manual, Springer Verlag、1995、30〜38）のプロトコルに基づいて行っ
た。使用する培地の組成についても記載されている。形質転換は、アグロバクテ
リウム株LBA4404（Clontech）を用いて実施した。使用したバイナリベクターは
、前述した完全DOXS cDNAを含むpBIN19構築物であった。これらpBINベクターに
おけるNOSターミネーター配列をOCRターミネーター配列で置換した。セイヨウア
ブラナ（Brassica napus）の種子を70％（v/v）エタノールで表面殺菌し、H2O中
で55℃にて10分間洗浄し、１％強度の次亜塩素酸塩溶液（25％ v/v Teepol、0.1
％ v/v Twenn 20）中で20分間インキュベートした後、滅菌H2Oで20分づつ、６回
洗浄した。種子をろ紙上で3日間乾燥させ、10〜15個の種子を、15mlの発芽媒質
を含むガラス製フラスコ中で発芽するよう誘導した。数本の幼植物（長さ約10cm
）から根と頂端を除去し、残った胚軸を長さ約６cmの切片に切断した。このよう
にして得られた約600個の外植片を50mlの基礎培地で30分間洗浄した後、300mlの
フラスコに移した。100mlのカルス誘導培地を添加した後、培養物を100rpmで24
時間インキュベートした。
【０１４８】 アグロバクテリウム株の一晩培養物をカナマイシン（20mg/l）を含むLB中で29
℃にて準備し、この２mlをカナマイシンを含まない50mlのLBにおいて29℃でOD60 0 が0.4〜0.5になるまで4時間インキュベートした。この培養物を2,000 rpmで25
分間ペレット化した後、細胞ペレットを25mlの基礎培地中に再懸濁した。基礎培
地をさらに添加することにより、溶液中の細菌の濃度をOD600が0.3となるように
調節した。
℃にて準備し、この２mlをカナマイシンを含まない50mlのLBにおいて29℃でOD60 0 が0.4〜0.5になるまで4時間インキュベートした。この培養物を2,000 rpmで25
分間ペレット化した後、細胞ペレットを25mlの基礎培地中に再懸濁した。基礎培
地をさらに添加することにより、溶液中の細菌の濃度をOD600が0.3となるように
調節した。
【０１４９】 滅菌ピペットを用いて、カルス誘導培地をセイヨウアブラナ外植片から除去し
、50mlのアグロバクテリウム溶液を添加し、注意深く混合した後、20分間インキ
ュベートした。アグロバクテリウム懸濁液を除去し、セイヨウアブラナ外植片を
、50mlのカルス誘導培地で１分間洗浄した後、100mlのカルス誘導培地を添加し
た。回転振盪機で、共培養を100rpmにて24時間実施した。カルス誘導培地を除去
することにより、共培養を停止させ、外植片を100rpmにて25mlの洗浄培地で１分
ずつ２回、100mlの洗浄培地で60分ずつ２回洗浄した。外植片を含む洗浄培地を1
5cmのペトリ皿に移し、滅菌ピペットを用いて洗浄培地を除去した。再生のため
に、各場合において、20〜30個の外植片を90mmのペトリ皿に移した。尚、このペ
トリ皿は、25mlのカナマイシン含有シュート誘導培地を含む。２層のロイコポア
（Leukopor）でペトリ皿を密閉し、16/8 H光周期の2000ルクスで、25℃にてイン
キュベートした。12日置きに、成長したカルスを、新鮮なシュート誘導培地を含
むペトリ皿に移した。完全な植物を再生するのにさらに必要なすべてのステップ
をBade, J.B.およびDamm, B.の記載（Gene Transfer to Plants, Potrykus, I.
および Spangenberg, G.編、Springer Lab Manual、Springer Verlag、1995、30
〜38）による記載の通りに、実施した。
、50mlのアグロバクテリウム溶液を添加し、注意深く混合した後、20分間インキ
ュベートした。アグロバクテリウム懸濁液を除去し、セイヨウアブラナ外植片を
、50mlのカルス誘導培地で１分間洗浄した後、100mlのカルス誘導培地を添加し
た。回転振盪機で、共培養を100rpmにて24時間実施した。カルス誘導培地を除去
することにより、共培養を停止させ、外植片を100rpmにて25mlの洗浄培地で１分
ずつ２回、100mlの洗浄培地で60分ずつ２回洗浄した。外植片を含む洗浄培地を1
5cmのペトリ皿に移し、滅菌ピペットを用いて洗浄培地を除去した。再生のため
に、各場合において、20〜30個の外植片を90mmのペトリ皿に移した。尚、このペ
トリ皿は、25mlのカナマイシン含有シュート誘導培地を含む。２層のロイコポア
（Leukopor）でペトリ皿を密閉し、16/8 H光周期の2000ルクスで、25℃にてイン
キュベートした。12日置きに、成長したカルスを、新鮮なシュート誘導培地を含
むペトリ皿に移した。完全な植物を再生するのにさらに必要なすべてのステップ
をBade, J.B.およびDamm, B.の記載（Gene Transfer to Plants, Potrykus, I.
および Spangenberg, G.編、Springer Lab Manual、Springer Verlag、1995、30
〜38）による記載の通りに、実施した。
【０１５０】実施例８ セイヨウアブラナにおけるトコフェロール生合成の増加 DOXS cDNA（配列番号１）に、CaMV 35Sプロモーターを提供し、35Sプロモータ
ーを用いて、セイヨウアブラナで過剰発現させた。これと並行して、ファゼオリ
ン遺伝子の種子特異的プロモーターを用いて、セイヨウアブラナの種子中のトコ
フェロール含量を特異的に高めた。対応する構築物を用いて形質転換されたセイ
ヨウアブラナ植物を温室で生育した。次に、植物全体および該植物の種子のαト
コフェロール含量を測定した。すべての事例で、非形質転換植物と比較して、α
トコフェロール濃度が増加した。
ーを用いて、セイヨウアブラナで過剰発現させた。これと並行して、ファゼオリ
ン遺伝子の種子特異的プロモーターを用いて、セイヨウアブラナの種子中のトコ
フェロール含量を特異的に高めた。対応する構築物を用いて形質転換されたセイ
ヨウアブラナ植物を温室で生育した。次に、植物全体および該植物の種子のαト
コフェロール含量を測定した。すべての事例で、非形質転換植物と比較して、α
トコフェロール濃度が増加した。
【０１５１】実施例９ トランスジェニックタバコにおける大腸菌由来DOXS発現の検出 直径0.9mmのリーフディスクをpBinAR HPPD-DOXS構築物を含む植物の完全に広
がった葉から切り取り、液体窒素で凍結した。葉材料をプロテイナーゼ阻害剤を
含むHEPES-KOHバッファーでホモゲナイズし、製造者の指示に従い、Bio-Radタン
パク質アッセイを用いて、抽出物からタンパク質濃度を測定した。各抽出物から
の45μgのタンパク質を1容量のローディングバッファー（Laemmli、1970）と混
合し、95℃で5分インキュベートした。このタンパク質を12.5％SDS-PAGEゲルで
分画した。次に、半乾燥電気ブロットを用いて、タンパク質をPorablot膜に転写
した（Machery und Nagel）。大腸菌DOXSに対するウサギ抗体を用いて、DOXSタ
ンパク質の検出を実施した。呈色反応は、二次抗体とアルカリ性ホスファターゼ
との結合に基づくものであり、このホスファターゼが、NBT/BCIPを染料に変換す
る。二次抗体とアルカリ性ホスファターゼは、Pierceから入手し、手順は製造者
の指示に従った。
がった葉から切り取り、液体窒素で凍結した。葉材料をプロテイナーゼ阻害剤を
含むHEPES-KOHバッファーでホモゲナイズし、製造者の指示に従い、Bio-Radタン
パク質アッセイを用いて、抽出物からタンパク質濃度を測定した。各抽出物から
の45μgのタンパク質を1容量のローディングバッファー（Laemmli、1970）と混
合し、95℃で5分インキュベートした。このタンパク質を12.5％SDS-PAGEゲルで
分画した。次に、半乾燥電気ブロットを用いて、タンパク質をPorablot膜に転写
した（Machery und Nagel）。大腸菌DOXSに対するウサギ抗体を用いて、DOXSタ
ンパク質の検出を実施した。呈色反応は、二次抗体とアルカリ性ホスファターゼ
との結合に基づくものであり、このホスファターゼが、NBT/BCIPを染料に変換す
る。二次抗体とアルカリ性ホスファターゼは、Pierceから入手し、手順は製造者
の指示に従った。
【０１５２】 図10は、トランスジェニック植物の葉におけるDOXSタンパク質の検出を示す。
１：マーカー；２：植物10；3：62；4：63；5：69；７：71；８：112；９：113
；10：116；11：WT1；12：WT2；13：100ngの組換えタンパク質；14：50ngの組換
えタンパク質；15：10ngの組換えタンパク質。
１：マーカー；２：植物10；3：62；4：63；5：69；７：71；８：112；９：113
；10：116；11：WT1；12：WT2；13：100ngの組換えタンパク質；14：50ngの組換
えタンパク質；15：10ngの組換えタンパク質。
【０１５３】実施例10 ストレプトミセス・アベルミチリス U11864由来のHPPD遺伝子のクローン化 細菌ストレプトミセス・アベルミチリス U11864のゲノムDNAの単離 ストレプトミセス・アベルミチリス U11864の培養物を300mlのYEME培地（５g
の麦芽抽出物、２gの酵母抽出物、２gのグルコース）において、28℃で96時間増
殖させた。細菌のゲノムDNAを、Sorvall RC5C遠心機において初め5,000回転でペ
レット化することにより、この培養物から単離した。次に、ペレットを１／30容
量の溶菌バッファー（25mM EDTA、0.5％ SDS、50mM Tris-HCl、pH 8.0）に再懸
濁した。同量のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（25：24：１
）を添加して、70℃で10分インキュベートした。次に、Heraeusフロア遠心分離
機において、3,500回転で15分間、上記フェノール類から水相を分離した。１／1
0容量の８Ｍ塩化リチウム中で、水性上澄みを2.5容量のエタノールと混合し、核
酸を室温で10分沈殿させた。ペレットを400μlのTE/Rnase中に取り上げ、37℃で
10分インキュベートした。この溶液を、１容量のフェノール／クロロホルム／イ
ソアミルアルコール（25：24：１）と共に再び振盪させた。2.5容量のエタノー
ルおよび１／10容量の８Ｍ塩化リチウムを用いて、上澄みを沈殿させた。ペレッ
トを80％エタノールで洗浄し、400μlのTE/Rnase中に取り上げた。
の麦芽抽出物、２gの酵母抽出物、２gのグルコース）において、28℃で96時間増
殖させた。細菌のゲノムDNAを、Sorvall RC5C遠心機において初め5,000回転でペ
レット化することにより、この培養物から単離した。次に、ペレットを１／30容
量の溶菌バッファー（25mM EDTA、0.5％ SDS、50mM Tris-HCl、pH 8.0）に再懸
濁した。同量のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（25：24：１
）を添加して、70℃で10分インキュベートした。次に、Heraeusフロア遠心分離
機において、3,500回転で15分間、上記フェノール類から水相を分離した。１／1
0容量の８Ｍ塩化リチウム中で、水性上澄みを2.5容量のエタノールと混合し、核
酸を室温で10分沈殿させた。ペレットを400μlのTE/Rnase中に取り上げ、37℃で
10分インキュベートした。この溶液を、１容量のフェノール／クロロホルム／イ
ソアミルアルコール（25：24：１）と共に再び振盪させた。2.5容量のエタノー
ルおよび１／10容量の８Ｍ塩化リチウムを用いて、上澄みを沈殿させた。ペレッ
トを80％エタノールで洗浄し、400μlのTE/Rnase中に取り上げた。
【０１５４】 PCR用のオリゴヌクレオチドをストレプトミセス・アベルミチリス （Denoyaら
、1994、；Acc. Number U1864）由来のHPPDのDNA配列に基づいて作製し、BamHI
制限切断部位をこれらの5'末端に、またXbaI制限切断部位をそれらの3'末端にそ
れぞれ連結した。5'末端のオリゴヌクレオチドは、配列：5'-GGATCCAGCGGACAAGC CAAC -3'（5'方向でATGから37〜55塩基遠位；下線）を含み、ならびに、3'末端で
のオリゴヌクレオチドは、配列：5'-TCTAGATTATGCCAGCCAGGCCTTG-3'（逆方向相
補DNA配列のヌクレオチド1845〜1863；下線）を含む。
、1994、；Acc. Number U1864）由来のHPPDのDNA配列に基づいて作製し、BamHI
制限切断部位をこれらの5'末端に、またXbaI制限切断部位をそれらの3'末端にそ
れぞれ連結した。5'末端のオリゴヌクレオチドは、配列：5'-GGATCCAGCGGACAAGC CAAC -3'（5'方向でATGから37〜55塩基遠位；下線）を含み、ならびに、3'末端で
のオリゴヌクレオチドは、配列：5'-TCTAGATTATGCCAGCCAGGCCTTG-3'（逆方向相
補DNA配列のヌクレオチド1845〜1863；下線）を含む。
【０１５５】 製造者の指示に従い、Pfuポリメラーゼ（Stratagene GmbH、Heidelberg）を用
いてPCR反応を実施した。400ngのゲノムDNAをパターンとして使用した。PCRプロ
グラムは次の通りである： ５サイクル：４秒94℃、30秒54℃、２分72℃； ５サイクル：４秒94℃、30秒52℃、２分72℃； 25サイクル：４秒94℃、30秒50℃、２分72℃。
いてPCR反応を実施した。400ngのゲノムDNAをパターンとして使用した。PCRプロ
グラムは次の通りである： ５サイクル：４秒94℃、30秒54℃、２分72℃； ５サイクル：４秒94℃、30秒52℃、２分72℃； 25サイクル：４秒94℃、30秒50℃、２分72℃。
【０１５６】 Gene-Cleanキット（Dianova GmbH、Hilden）を用いて断片を精製し、製造者の
指示に従って、ベクターPCR-Script（Stratagene GmbH、Heidelberg）にクロー
ン化した。配列の正確さを配列決定により確認した。これにより、単離された遺
伝子が、さらに別のアミノ酸をコードすることがわかった。これは、前記配列に
おいて、ヌクレオチドN429の前に、３つの塩基TAC（チロシンをコードする）を
含む（Denoyaら、1994）。
指示に従って、ベクターPCR-Script（Stratagene GmbH、Heidelberg）にクロー
ン化した。配列の正確さを配列決定により確認した。これにより、単離された遺
伝子が、さらに別のアミノ酸をコードすることがわかった。これは、前記配列に
おいて、ヌクレオチドN429の前に、３つの塩基TAC（チロシンをコードする）を
含む（Denoyaら、1994）。
【０１５７】 BamHIおよびXbaIにより、断片をベクターから単離し、サイトゾルにおける遺
伝子発現用のCaMV 35Sプロモーターの下流で、対応して切断されたBin19ARベク
ターに連結した。同じPCR-Scriptベクターから、BamHI断片として遺伝子を単離
し、対応して切断されたpBin19ベクターに連結した。尚このベクターは、CaMV 3
5Sの下流にジャガイモ色素体トランスケトラーゼのトランジットペプチドをさら
に含む。該トランジットペプチドは、色素体局在化を確実にする。
伝子発現用のCaMV 35Sプロモーターの下流で、対応して切断されたBin19ARベク
ターに連結した。同じPCR-Scriptベクターから、BamHI断片として遺伝子を単離
し、対応して切断されたpBin19ベクターに連結した。尚このベクターは、CaMV 3
5Sの下流にジャガイモ色素体トランスケトラーゼのトランジットペプチドをさら
に含む。該トランジットペプチドは、色素体局在化を確実にする。
【０１５８】 構築物は図11および12に示したが、上記断片は次のような有意性を有する： 断片A（529bp）は、カリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーター（カリ
フラワーモザイクウイルスのヌクレオチド6909〜7437）を含む。断片B（259bp）
は、トランスケトラーゼのトランジットペプチドを含む。断片Cは、HPPD遺伝子
を含む。断片D（192 bp）は、転写を終結するTiプラスミドｐTIACH5（Gielen, J
.ら、EMBO J. 3（1984）、835〜846）のT DNAの遺伝子３のポリアデニル化シグ
ナルを含む。
フラワーモザイクウイルスのヌクレオチド6909〜7437）を含む。断片B（259bp）
は、トランスケトラーゼのトランジットペプチドを含む。断片Cは、HPPD遺伝子
を含む。断片D（192 bp）は、転写を終結するTiプラスミドｐTIACH5（Gielen, J
.ら、EMBO J. 3（1984）、835〜846）のT DNAの遺伝子３のポリアデニル化シグ
ナルを含む。
【０１５９】実施例11 DOXSおよびHPPD DNA配列で植物を形質転換するための構築物の作製 DOXSおよびHPPDについてのトランスジェニック体である植物を産生するために
、双方の遺伝子配列を含むバイナリーベクターを作製した（図13）。DOXSおよび
HPPD遺伝子配列をそれぞれBamHI断片として、実施例3および10に記載のようにク
ローン化した。該ベクターpBinAR-Hygは、カリフラワーモザイクウイルスの35S
プロモーターおよび転写終結のためのTiプラスミドpTIACH5（Gielenら、1984)
のT DNAの遺伝子3のポリアデニル化シグナルを含む。該pBinAR-Hygベクターは、
植物に抗生物質ハイグロマイシンに対する耐性を与え、そのためカナマイシン耐
性を有する植物への重複感染に適している。
、双方の遺伝子配列を含むバイナリーベクターを作製した（図13）。DOXSおよび
HPPD遺伝子配列をそれぞれBamHI断片として、実施例3および10に記載のようにク
ローン化した。該ベクターpBinAR-Hygは、カリフラワーモザイクウイルスの35S
プロモーターおよび転写終結のためのTiプラスミドpTIACH5（Gielenら、1984)
のT DNAの遺伝子3のポリアデニル化シグナルを含む。該pBinAR-Hygベクターは、
植物に抗生物質ハイグロマイシンに対する耐性を与え、そのためカナマイシン耐
性を有する植物への重複感染に適している。
【０１６０】 さらに別のcDNAを含むベクター内にHPPDをクローン化するために、PCR用のオ
リゴヌクレオチドを誘導し、BamHI制限酵素切断部位を5'末端および3'末端に結
合した。該オリゴヌクレオチドは5'末端に、配列5'-GGATCCTCCAGCGGACAAGCCAAC-
3'(ATGから5'方向に37〜55ヌクレオチド離れている；下線）を含み、該オリゴヌ
クレオチドは3'末端に、配列5'-ATGGATCCCGCGCCGCCTACAGGTTG-3'（コード配列の
塩基対1140で終了し、TAG終止コドンから3'方向の8塩基対で始まる；下線)を含
む。PCR反応は、Tliポリメラーゼ（Promega GmbH, Mannheim)を製造元の説明に
従って用いることにより実施した。10 ngのプラスミドpBinAR-HPPDを鋳型として
用いた。PCRプログラムは以下の通りとした： 5サイクル：94℃ 4秒、68℃ 30秒、72℃ 2分 5サイクル：94℃ 4秒、64℃ 30秒、72℃ 2分 25サイクル：94℃ 4秒、60℃ 30秒、72℃ 2分。
リゴヌクレオチドを誘導し、BamHI制限酵素切断部位を5'末端および3'末端に結
合した。該オリゴヌクレオチドは5'末端に、配列5'-GGATCCTCCAGCGGACAAGCCAAC-
3'(ATGから5'方向に37〜55ヌクレオチド離れている；下線）を含み、該オリゴヌ
クレオチドは3'末端に、配列5'-ATGGATCCCGCGCCGCCTACAGGTTG-3'（コード配列の
塩基対1140で終了し、TAG終止コドンから3'方向の8塩基対で始まる；下線)を含
む。PCR反応は、Tliポリメラーゼ（Promega GmbH, Mannheim)を製造元の説明に
従って用いることにより実施した。10 ngのプラスミドpBinAR-HPPDを鋳型として
用いた。PCRプログラムは以下の通りとした： 5サイクル：94℃ 4秒、68℃ 30秒、72℃ 2分 5サイクル：94℃ 4秒、64℃ 30秒、72℃ 2分 25サイクル：94℃ 4秒、60℃ 30秒、72℃ 2分。
【０１６１】 該断片をGene-Cleanキット（Dianova GmbH, Hilden）を用いて精製し、製造元
の説明に従ってベクター PCR-Script（Stratagene GmbH, Heidelberg）中にクロ
ーン化した。該配列の正確さは、配列決定によって確認した。該配列はBamHI断
片としてベクター PCR-Scriptから切り出し、対応するように切断されたpBinAR
ベクターに連結した。pBinARベクターはさらに、遺伝子産物を色素体に導入する
ためのトランスケトラーゼのトランジットペプチドを含む。結果として、プラス
ミドpBinAR-TP-HPPD（図12）が得られた。
の説明に従ってベクター PCR-Script（Stratagene GmbH, Heidelberg）中にクロ
ーン化した。該配列の正確さは、配列決定によって確認した。該配列はBamHI断
片としてベクター PCR-Scriptから切り出し、対応するように切断されたpBinAR
ベクターに連結した。pBinARベクターはさらに、遺伝子産物を色素体に導入する
ためのトランスケトラーゼのトランジットペプチドを含む。結果として、プラス
ミドpBinAR-TP-HPPD（図12）が得られた。
【０１６２】 クローニングのために、35Sプロモーター、トランスケトラーゼトランジット
ペプチド、HPPD遺伝子および転写終結のためのTiプラスミドpTIACH5（Gielenら
、1984) のT DNAの遺伝子3のポリアデニル化シグナルを、プラスミドpBinAR-TP-
HPPDからPCRによって単離した。HindIII切断部位を、各場合において、プロモー
ターおよびターミネーターに対するオリゴヌクレオチドに結合した。プロモータ
ー（下線）の5'領域上にアニーリングするオリゴヌクレオチドの配列は、5'-ATA
AGCTTCATGGAGTCAAA-GATTCAAATAGA-3'であり、ターミネーター配列（下線）にア
ニーリングするオリゴヌクレオチドの配列は、5'-ATAAGCTT GGACAATCAGTAAATTGA ACGGAG -3'である。得られた断片をGene-Cleanキット（Dianova GmbH, Hilden)を
用いて精製し、製造元の説明に従ってベクター PCR-Script(Stratagene GmbH, H
eidelberg)中にクローン化した。配列の正確さは、配列決定により確認した。該
配列は、このPCR-ScriptベクターからのHindIII断片として、対応するように切
断されたベクターpBin19に導入した（Bevan, 1984, Nucleic Acids Res. 12, 87
11-8721）。
ペプチド、HPPD遺伝子および転写終結のためのTiプラスミドpTIACH5（Gielenら
、1984) のT DNAの遺伝子3のポリアデニル化シグナルを、プラスミドpBinAR-TP-
HPPDからPCRによって単離した。HindIII切断部位を、各場合において、プロモー
ターおよびターミネーターに対するオリゴヌクレオチドに結合した。プロモータ
ー（下線）の5'領域上にアニーリングするオリゴヌクレオチドの配列は、5'-ATA
AGCTTCATGGAGTCAAA-GATTCAAATAGA-3'であり、ターミネーター配列（下線）にア
ニーリングするオリゴヌクレオチドの配列は、5'-ATAAGCTT GGACAATCAGTAAATTGA ACGGAG -3'である。得られた断片をGene-Cleanキット（Dianova GmbH, Hilden)を
用いて精製し、製造元の説明に従ってベクター PCR-Script(Stratagene GmbH, H
eidelberg)中にクローン化した。配列の正確さは、配列決定により確認した。該
配列は、このPCR-ScriptベクターからのHindIII断片として、対応するように切
断されたベクターpBin19に導入した（Bevan, 1984, Nucleic Acids Res. 12, 87
11-8721）。
【０１６３】 35S プロモーター、トランスケトラーゼトランジットペプチド、DOXS遺伝子お
よび転写終結のためのTiプラスミドpTIACH5（Gielenら、1984） のT DNAの遺伝
子3のポリアデニル化シグナルを、PCRによってプラスミドpBinAR-TP-DOXSから単
離した。EcoRI切断部位を、各場合において、プロモーターおよびターミネータ
ー配列に対する各オリゴヌクレオチドに結合した。プロモーター（下線)にアニ
ーリングするオリゴヌクレオチドの配列は、5'-ATGAATTCCATGGAGTCAAAGATTCAAAT AGA -3'であり、ターミネーター配列（下線）にアニーリングするオリゴヌクレオ
チドの配列は、5'-ATGAATTCGGACAATCAGTAAATTGAA-CGGAG-3'である。得られた断
片をGene-Cleanキット（Dianova GmbH, Hilden)を用いて精製し、製造元の説明
に従ってベクター PCR-Script(Stratagene GmbH, Heidelberg)中にクローン化し
た。配列の正確さは、配列決定により確認した(配列番号３）。該配列は、このP
CR-ScriptベクターからのEcoRI断片として、対応するように切断されたベクター
pBin19に導入した（Bevan, 1984)。
よび転写終結のためのTiプラスミドpTIACH5（Gielenら、1984） のT DNAの遺伝
子3のポリアデニル化シグナルを、PCRによってプラスミドpBinAR-TP-DOXSから単
離した。EcoRI切断部位を、各場合において、プロモーターおよびターミネータ
ー配列に対する各オリゴヌクレオチドに結合した。プロモーター（下線)にアニ
ーリングするオリゴヌクレオチドの配列は、5'-ATGAATTCCATGGAGTCAAAGATTCAAAT AGA -3'であり、ターミネーター配列（下線）にアニーリングするオリゴヌクレオ
チドの配列は、5'-ATGAATTCGGACAATCAGTAAATTGAA-CGGAG-3'である。得られた断
片をGene-Cleanキット（Dianova GmbH, Hilden)を用いて精製し、製造元の説明
に従ってベクター PCR-Script(Stratagene GmbH, Heidelberg)中にクローン化し
た。配列の正確さは、配列決定により確認した(配列番号３）。該配列は、このP
CR-ScriptベクターからのEcoRI断片として、対応するように切断されたベクター
pBin19に導入した（Bevan, 1984)。
【０１６４】 該配列は、このPCR-ScriptベクターからのXbaI断片として、上記のように既に
HPPD配列を含み対応するように切断されたベクターに導入した。結果として、構
築物pBinAR-HPPD-DOXS（図13）が得られ、その断片は以下に示す重要性を有する
： 断片A(529bp)は、カリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーター（ヌクレ
オチド6909〜7437）を含む。断片Bは、色素体トランスケトラーゼのトランジッ
トペプチドを含む。断片Cは、HPPD遺伝子を含む。断片Dは、転写終結のためのTi
プラスミドpTIACH5（Gielenら、1984) のT DNAの遺伝子3のポリアデニル化シグ
ナルを含む。断片Eは、DOXS遺伝子を含む。
HPPD配列を含み対応するように切断されたベクターに導入した。結果として、構
築物pBinAR-HPPD-DOXS（図13）が得られ、その断片は以下に示す重要性を有する
： 断片A(529bp)は、カリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーター（ヌクレ
オチド6909〜7437）を含む。断片Bは、色素体トランスケトラーゼのトランジッ
トペプチドを含む。断片Cは、HPPD遺伝子を含む。断片Dは、転写終結のためのTi
プラスミドpTIACH5（Gielenら、1984) のT DNAの遺伝子3のポリアデニル化シグ
ナルを含む。断片Eは、DOXS遺伝子を含む。
【０１６５】実施例12 トランスジェニックタバコ植物の産生 (Nicotiana tabacum L. cv. Samsun NN) プレニル脂質含有量が変化したトランスジェニックタバコ植物は、タバコのリ
ーフディスク(leaf disk)をDOXSおよびHPPD配列で形質転換することにより作製
した。タバコ植物を形質転換するために、選択条件下で増殖させた10mlのアグロ
バクテリウム・ツメファシエンスの一晩の培養物を遠心にかけ、上清を廃棄し、
該細菌を同容量の抗生物質を含まない培地に再懸濁した。滅菌植物から得たリー
フディスク（直径約1cm）を、滅菌ペトリ皿中のこの細菌懸濁液に浸した。次に
リーフディスクを、ペトリ皿中の、2% スクロースおよび0.8% Bacto寒天を含むM
S培地上（Murashige and Skoog, Physiol. Plant(1962) 15, 473）にプレートし
た。暗所で25℃にて2日間インキュベートした後、これを100mg/lカナマイシン、
500mg/l Claforan、1mg/l ベンジルアミノプリン(BAP)、0.2mg/l ナフチル酢酸
（NAA)、1.6% グルコースおよび0.8% Bacto寒天を含むMS培地に移し、培養を続
けた（明所で16時間/暗所で8時間）。成長するシュートを、2%スクロース、250m
g/l Claforanおよび0.8% Bacto寒天を含み、ホルモンを含まないMS培地に移した
。
ーフディスク(leaf disk)をDOXSおよびHPPD配列で形質転換することにより作製
した。タバコ植物を形質転換するために、選択条件下で増殖させた10mlのアグロ
バクテリウム・ツメファシエンスの一晩の培養物を遠心にかけ、上清を廃棄し、
該細菌を同容量の抗生物質を含まない培地に再懸濁した。滅菌植物から得たリー
フディスク（直径約1cm）を、滅菌ペトリ皿中のこの細菌懸濁液に浸した。次に
リーフディスクを、ペトリ皿中の、2% スクロースおよび0.8% Bacto寒天を含むM
S培地上（Murashige and Skoog, Physiol. Plant(1962) 15, 473）にプレートし
た。暗所で25℃にて2日間インキュベートした後、これを100mg/lカナマイシン、
500mg/l Claforan、1mg/l ベンジルアミノプリン(BAP)、0.2mg/l ナフチル酢酸
（NAA)、1.6% グルコースおよび0.8% Bacto寒天を含むMS培地に移し、培養を続
けた（明所で16時間/暗所で8時間）。成長するシュートを、2%スクロース、250m
g/l Claforanおよび0.8% Bacto寒天を含み、ホルモンを含まないMS培地に移した
。
【０１６６】実施例13 トランスジェニックアブラナ植物（Oilseed rape plant)の産生 プレニル脂質含有量が変化したトランスジェニックアブラナ植物の産生は、Ba
de, J.B. and Damm, B.(Gene Transfer to Plants, Potrykus, I. and Spangenb
erg, G., eds, Springer Lab Manual, Springer Verlag, 1995, 30-38)のプロ
トコールに基づいて行った。ここには、使用する培地およびバッファーの組成も
示されている。
de, J.B. and Damm, B.(Gene Transfer to Plants, Potrykus, I. and Spangenb
erg, G., eds, Springer Lab Manual, Springer Verlag, 1995, 30-38)のプロ
トコールに基づいて行った。ここには、使用する培地およびバッファーの組成も
示されている。
【０１６７】 形質転換は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス株LBA4404（Clontech Gm
bH、 Heidelberg)を用いて実施した。用いたバイナリーベクターは、既に記載し
たように、DOXSおよびHPPDの全cDNAを含むバイナリーな構築物であった。本発明
で用いたすべてのバイナリーベクター中では、NOSターミネーター配列を、転写
終結のためのTiプラスミドpTIACH5（Gielenら、1984) のT DNAの遺伝子3のポリ
アデニル化シグナルと置換した。Brassica napus種子を70%(v/v)エタノールを用
いて表面滅菌し、55℃にて10分間水で洗浄し、1%強度の次亜塩素酸溶液（25% v/
v Teepol, 0.1% v/v Tween 20)中で20分間インキュベートし、滅菌水で6回、毎
回20分間ずつ洗浄した。該種子を濾紙上で、3日間乾燥させ、10〜15個の種子に
ついて、15mlの発芽培地を含むガラスフラスコ中で発芽を誘起した。根と茎頂を
いくつかの幼植物から取り除き（大きさ約10cm)、残った下子葉部を長さ約6mmの
片に切断した。この方法によって得られたおよそ600の外植片を、50mlの基本培
地で30分間洗浄し、300mlフラスコに移した。100mlのカルス誘起培地を添加した
後、培養物を100 rpmで24時間インキュベートした。
bH、 Heidelberg)を用いて実施した。用いたバイナリーベクターは、既に記載し
たように、DOXSおよびHPPDの全cDNAを含むバイナリーな構築物であった。本発明
で用いたすべてのバイナリーベクター中では、NOSターミネーター配列を、転写
終結のためのTiプラスミドpTIACH5（Gielenら、1984) のT DNAの遺伝子3のポリ
アデニル化シグナルと置換した。Brassica napus種子を70%(v/v)エタノールを用
いて表面滅菌し、55℃にて10分間水で洗浄し、1%強度の次亜塩素酸溶液（25% v/
v Teepol, 0.1% v/v Tween 20)中で20分間インキュベートし、滅菌水で6回、毎
回20分間ずつ洗浄した。該種子を濾紙上で、3日間乾燥させ、10〜15個の種子に
ついて、15mlの発芽培地を含むガラスフラスコ中で発芽を誘起した。根と茎頂を
いくつかの幼植物から取り除き（大きさ約10cm)、残った下子葉部を長さ約6mmの
片に切断した。この方法によって得られたおよそ600の外植片を、50mlの基本培
地で30分間洗浄し、300mlフラスコに移した。100mlのカルス誘起培地を添加した
後、培養物を100 rpmで24時間インキュベートした。
【０１６８】 アグロバクテリウム株の一晩経った培養物を、29℃のカナマイシン(20mg/l)を
含むLuria Broth 培地中に準備し、この2mlを、カナマイシンを含まないLuria B
roth培地 50ml中で、29℃にて4時間、OD600が0.4〜0.5になるまでインキュベー
トした。この培養物を、2000rpmで25分間かけてペレット化し、細胞ペレットを2
5mlの基本培地に再懸濁した。溶液中における細菌濃度は、さらに基本培地を加
えることによりOD600が0.3となるように調節した。
含むLuria Broth 培地中に準備し、この2mlを、カナマイシンを含まないLuria B
roth培地 50ml中で、29℃にて4時間、OD600が0.4〜0.5になるまでインキュベー
トした。この培養物を、2000rpmで25分間かけてペレット化し、細胞ペレットを2
5mlの基本培地に再懸濁した。溶液中における細菌濃度は、さらに基本培地を加
えることによりOD600が0.3となるように調節した。
【０１６９】 カルス誘起培地を、滅菌ピペットを用いてアブラナ外植片から取り除き、50ml
のアグロバクテリウム溶液を添加し、そして注意深く混合した後、20分間インキ
ュベートした。アグロバクテリア懸濁液を除去し、アブラナ外植片を50mlのカル
ス誘起培地で1分間洗浄し、続いて、100mlのカルス誘起培地を添加した。共培養
は、ロータリーシェーカー上にて、100rpmで24時間にわたって実施した。共培養
は、カルス誘起培地を除去することによって停止し、洗浄培地25mlを用いる1分
間の洗浄を2回、100mlを用いる60分間の洗浄を2回、100rpmで行った。外植片を
含む洗浄培地を15cmのペトリ皿に移し、該培地を滅菌ピペットを用いて除去した
。
のアグロバクテリウム溶液を添加し、そして注意深く混合した後、20分間インキ
ュベートした。アグロバクテリア懸濁液を除去し、アブラナ外植片を50mlのカル
ス誘起培地で1分間洗浄し、続いて、100mlのカルス誘起培地を添加した。共培養
は、ロータリーシェーカー上にて、100rpmで24時間にわたって実施した。共培養
は、カルス誘起培地を除去することによって停止し、洗浄培地25mlを用いる1分
間の洗浄を2回、100mlを用いる60分間の洗浄を2回、100rpmで行った。外植片を
含む洗浄培地を15cmのペトリ皿に移し、該培地を滅菌ピペットを用いて除去した
。
【０１７０】 再生するために、各場合ごとに20〜30の外植片を、カナマイシンを含有する25
mlのシュート誘起培地を含む90mmペトリ皿に移した。該ペトリ皿を2層のLeukopo
rで密封し、25℃にて、2000 luxの光線を用い、明所16時間/暗所8時間の光周期
でインキュベートした。発生したカルスを12日ごとにシュート誘起培地を含む新
たなペトリ皿に移した。植物全体を再生するためのさらなるステップはすべて、
Bade, J.B. and Damm, B.(Gene Transfer to Plants, Potrykus, I. and Spange
nberg, G., eds, Springer Lab Manual, Springer Verlag, 1995, 30-38)に記
載されているように実施した。
mlのシュート誘起培地を含む90mmペトリ皿に移した。該ペトリ皿を2層のLeukopo
rで密封し、25℃にて、2000 luxの光線を用い、明所16時間/暗所8時間の光周期
でインキュベートした。発生したカルスを12日ごとにシュート誘起培地を含む新
たなペトリ皿に移した。植物全体を再生するためのさらなるステップはすべて、
Bade, J.B. and Damm, B.(Gene Transfer to Plants, Potrykus, I. and Spange
nberg, G., eds, Springer Lab Manual, Springer Verlag, 1995, 30-38)に記
載されているように実施した。
【０１７１】実施例14 アブラナにおけるトコフェロール生合成の増大 DOXSのcDNA（配列番号3)およびHPPDのcDNA（配列番号5)は、CaMV35Sプロモー
ターとともに提供され、35Sプロモーターを用いてアブラナにおいて過剰発現さ
せた。これに平行して、ファゼオリン遺伝子の種子に特異的なプロモーターを用
いて、アブラナ種子中のトコフェロール含有量を特異的に増加させた。対応する
構築物で形質転換したアブラナ植物を、温室で成長させた。そして、該植物全体
および該植物の種子におけるα-トコフェロール含有量を測定した。すべての場
合において、α-トコフェロール濃度は、形質転換されていない植物と比較して
増加していた。
ターとともに提供され、35Sプロモーターを用いてアブラナにおいて過剰発現さ
せた。これに平行して、ファゼオリン遺伝子の種子に特異的なプロモーターを用
いて、アブラナ種子中のトコフェロール含有量を特異的に増加させた。対応する
構築物で形質転換したアブラナ植物を、温室で成長させた。そして、該植物全体
および該植物の種子におけるα-トコフェロール含有量を測定した。すべての場
合において、α-トコフェロール濃度は、形質転換されていない植物と比較して
増加していた。
【０１７２】実施例15 シロイヌナズナ由来のGGPPOR遺伝子のクローニング シロイヌナズナの完全に広がった葉からの全RNAの単離 シロイヌナズナの完全に広がった葉を摘み取り、液体窒素中で凍結させた。次
に該材料を乳鉢中で粉末にし、z6バッファー（8M塩酸グアニジン、20mM MES、20
mM EDTA pH 7.0）中に取り上げた。該懸濁液を反応ベッセル中に移し、1容量の
フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール (25:24:1)とともに振り混ぜた
。15000 rpmで10分間遠心した後、上清を新たな反応ベッセルに移し、1/20容量
の1N酢酸および0.7容量のエタノール（無水）を用いて、RNAを沈殿させた。再び
遠心にかけた後、ペレットを最初に3M酢酸ナトリウム溶液で洗浄し、さらに遠心
にかけた後、70%エタノール中で洗浄した。続いてペレットをDEPC水に溶解し、R
NA濃度を分光光度法で測定した。
に該材料を乳鉢中で粉末にし、z6バッファー（8M塩酸グアニジン、20mM MES、20
mM EDTA pH 7.0）中に取り上げた。該懸濁液を反応ベッセル中に移し、1容量の
フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール (25:24:1)とともに振り混ぜた
。15000 rpmで10分間遠心した後、上清を新たな反応ベッセルに移し、1/20容量
の1N酢酸および0.7容量のエタノール（無水）を用いて、RNAを沈殿させた。再び
遠心にかけた後、ペレットを最初に3M酢酸ナトリウム溶液で洗浄し、さらに遠心
にかけた後、70%エタノール中で洗浄した。続いてペレットをDEPC水に溶解し、R
NA濃度を分光光度法で測定した。
【０１７３】シロイヌナズナの完全に広がった葉に由来する全RNAからのcDNAの産生 20μgの全RNAを最初に3.3μlの3M酢酸ナトリウム溶液および2μlの1M 硫酸マ
グネシウム溶液と混合し、DEPC水を用いて最終容量を100μlにした。1μlのRnas
e非含有DNase（Boehringer Mannheim)をこれに添加し、37℃で45分間インキュベ
ートした。フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコールとともに振り混ぜる
ことによって該酵素を除去した後、RNAをエタノールで沈殿させ、ペレットを100
μlのDEPC水に取った。この溶液から得られた2.5μgのRNAを、cDNAキット(Gibco
, Life Technologies)を用いてcDNAに転写した。
グネシウム溶液と混合し、DEPC水を用いて最終容量を100μlにした。1μlのRnas
e非含有DNase（Boehringer Mannheim)をこれに添加し、37℃で45分間インキュベ
ートした。フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコールとともに振り混ぜる
ことによって該酵素を除去した後、RNAをエタノールで沈殿させ、ペレットを100
μlのDEPC水に取った。この溶液から得られた2.5μgのRNAを、cDNAキット(Gibco
, Life Technologies)を用いてcDNAに転写した。
【０１７４】 オリゴヌクレオチドを、PCRのために ゲラニルゲラニルピロリン酸オキシドレ
ダクターゼDNA配列（Kellerら、Eur. J. Biochem. （1998）251(1-2), 413-417
；登録番号 Y14044）に基づいて作製し、BamHI制限酵素切断部位をこれらの5'末
端に結合し、SalI制限酵素切断部位を3'末端に結合した。該オリゴヌクレオチド
は5'末端に、該cDNAの第１コドン(下線)から始まる配列5'-ATGGATCC ATGGCGACGA CGGTTACACTC -3'を含み、該オリゴヌクレオチドは3'-末端に、該cDNA配列の塩基
対1494(下線)から始まる配列3'-ATGTCGACGTGATGATAGATTACTAACAGAC-3'を含む。
ダクターゼDNA配列（Kellerら、Eur. J. Biochem. （1998）251(1-2), 413-417
；登録番号 Y14044）に基づいて作製し、BamHI制限酵素切断部位をこれらの5'末
端に結合し、SalI制限酵素切断部位を3'末端に結合した。該オリゴヌクレオチド
は5'末端に、該cDNAの第１コドン(下線)から始まる配列5'-ATGGATCC ATGGCGACGA CGGTTACACTC -3'を含み、該オリゴヌクレオチドは3'-末端に、該cDNA配列の塩基
対1494(下線)から始まる配列3'-ATGTCGACGTGATGATAGATTACTAACAGAC-3'を含む。
【０１７５】 PCR反応をPfuポリメラーゼ（Stratagene GmbH, Heidelberg)を製造元の説明に
従って用いることにより実施した。cDNAの容量の1/8（0.3μgのRNAに相当）を鋳
型として使用した。PCRプログラムは以下のようなものとした： 5サイクル：94℃ 4秒、48℃ 30秒、72℃ 2分 5サイクル：94℃ 4秒、46℃ 30秒、72℃ 2分 25サイクル：94℃ 4秒、44℃ 30秒、72℃ 2分。
従って用いることにより実施した。cDNAの容量の1/8（0.3μgのRNAに相当）を鋳
型として使用した。PCRプログラムは以下のようなものとした： 5サイクル：94℃ 4秒、48℃ 30秒、72℃ 2分 5サイクル：94℃ 4秒、46℃ 30秒、72℃ 2分 25サイクル：94℃ 4秒、44℃ 30秒、72℃ 2分。
【０１７６】 該断片をGene-Cleanキット（Dianova GmbH, Hilden）を用いて精製し、製造元
の説明に従ってベクター PCR-Script（Stratagene GmbH, Heidelberg）中にクロ
ーン化した。該断片の正確さは、配列決定によって確認した（配列番号７）。該
遺伝子は、BamHI/SalI断片として、プライマーによって該配列に連結された制限
酵素切断部位を介して、対応するように切断されたベクターBinAR-Hygにクロー
ン化した。後者はカリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーターと、転写終
結のためのTiプラスミドpTIACH5(Gielenら、EMBO J. 3 (1984), 835-846)のT DNA
の遺伝子3のポリアデニル化シグナルとを含む。該プラスミドは、植物に抗生物
質ハイグロマイシンに対する耐性を与え、そのためカナマイシン耐性を有する植
物への重複感染に適している。GGPPORの色素体トランジットペプチドもまたクロ
ーン化したので、トランスジェニック植物において該タンパク質はおそらく色素
体中に輸送されるはずである。該構築物を図14に示す。該断片は以下の重要性を
有する： 断片A(529bp)は、カリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーター（カリフ
ラワーモザイクウイルスのヌクレオチド6909〜7437）を含む。断片Dは、転写終
結のためのTiプラスミドpTIACH5（Gielenら、1984） のT DNAの遺伝子3のポリア
デニル化シグナルを含む。断片Fは、固有の色素体トランジット配列を含むGGPPO
Rの遺伝子を含む。
の説明に従ってベクター PCR-Script（Stratagene GmbH, Heidelberg）中にクロ
ーン化した。該断片の正確さは、配列決定によって確認した（配列番号７）。該
遺伝子は、BamHI/SalI断片として、プライマーによって該配列に連結された制限
酵素切断部位を介して、対応するように切断されたベクターBinAR-Hygにクロー
ン化した。後者はカリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーターと、転写終
結のためのTiプラスミドpTIACH5(Gielenら、EMBO J. 3 (1984), 835-846)のT DNA
の遺伝子3のポリアデニル化シグナルとを含む。該プラスミドは、植物に抗生物
質ハイグロマイシンに対する耐性を与え、そのためカナマイシン耐性を有する植
物への重複感染に適している。GGPPORの色素体トランジットペプチドもまたクロ
ーン化したので、トランスジェニック植物において該タンパク質はおそらく色素
体中に輸送されるはずである。該構築物を図14に示す。該断片は以下の重要性を
有する： 断片A(529bp)は、カリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーター（カリフ
ラワーモザイクウイルスのヌクレオチド6909〜7437）を含む。断片Dは、転写終
結のためのTiプラスミドpTIACH5（Gielenら、1984） のT DNAの遺伝子3のポリア
デニル化シグナルを含む。断片Fは、固有の色素体トランジット配列を含むGGPPO
Rの遺伝子を含む。
【０１７７】実施例16 DOXSおよびGGPPOR配列で植物を形質転換するための構築物の作製 DOXSおよびGGPPORについてのトランスジェニック体である植物を作製するため
に、双方の遺伝子配列を含むバイナリーベクターを作製した（図15）。固有の色
素体局在化配列を有するGGPPOR遺伝子を（実施例15に記載）、BamHI/SalI断片と
して、対応するように切断されたベクターpBinAR-Hygにクローン化した。DOXS遺
伝子を、BamHI断片として実施例３に記載のようにクローン化した。ベクターpBi
nAR-Hygは、カリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーターと、転写終結のた
めのTiプラスミドpTIACH5(Gielenら、1984)のT DNAの遺伝子3のポリアデニル化シ
グナルとを含む。該プラスミドは、植物に抗生物質ハイグロマイシンに対する耐
性を与え、そのためカナマイシン耐性を有する植物への重複感染に適している。
に、双方の遺伝子配列を含むバイナリーベクターを作製した（図15）。固有の色
素体局在化配列を有するGGPPOR遺伝子を（実施例15に記載）、BamHI/SalI断片と
して、対応するように切断されたベクターpBinAR-Hygにクローン化した。DOXS遺
伝子を、BamHI断片として実施例３に記載のようにクローン化した。ベクターpBi
nAR-Hygは、カリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーターと、転写終結のた
めのTiプラスミドpTIACH5(Gielenら、1984)のT DNAの遺伝子3のポリアデニル化シ
グナルとを含む。該プラスミドは、植物に抗生物質ハイグロマイシンに対する耐
性を与え、そのためカナマイシン耐性を有する植物への重複感染に適している。
【０１７８】 35S プロモーター、トランスケトラーゼトランジットペプチド、DOXS遺伝子お
よび転写終結のためのTiプラスミドpTIACH5（Gielenら、1984) のT DNAの遺伝子
3のポリアデニル化シグナルを、プラスミドpBinAR-TP-DOXSからPCRによって単離
した。EcoRI切断部位を、各場合において、プロモーターおよびターミネーター
配列に対するオリゴヌクレオチドに結合した。プロモーター（下線)にアニーリ
ングするオリゴヌクレオチドの配列は、5'-ATGAATTC CATGGAGTCAAAGATTCAAATAGA -3'であり、ターミネーター配列（下線）にアニーリングするオリゴヌクレオチ
ドの配列は、5'-ATGAATTCGGACAATCAGTAAATTGAACGGAG-3'である。該断片をGene-C
leanキット（Dianova GmbH, Hilden)を用いて精製し、製造元の説明に従ってベ
クター PCR-Script(Stratagene GmbH, Heidelberg)中にクローン化した。配列の
正確さは、配列決定により確認した。該配列は、このPCR-ScriptベクターからEc
oRI断片として、対応するように切断されたベクターpBin19に移された（Bevan,
Nucleic Acids Res. 12（1984) 8711-8721)。
よび転写終結のためのTiプラスミドpTIACH5（Gielenら、1984) のT DNAの遺伝子
3のポリアデニル化シグナルを、プラスミドpBinAR-TP-DOXSからPCRによって単離
した。EcoRI切断部位を、各場合において、プロモーターおよびターミネーター
配列に対するオリゴヌクレオチドに結合した。プロモーター（下線)にアニーリ
ングするオリゴヌクレオチドの配列は、5'-ATGAATTC CATGGAGTCAAAGATTCAAATAGA -3'であり、ターミネーター配列（下線）にアニーリングするオリゴヌクレオチ
ドの配列は、5'-ATGAATTCGGACAATCAGTAAATTGAACGGAG-3'である。該断片をGene-C
leanキット（Dianova GmbH, Hilden)を用いて精製し、製造元の説明に従ってベ
クター PCR-Script(Stratagene GmbH, Heidelberg)中にクローン化した。配列の
正確さは、配列決定により確認した。該配列は、このPCR-ScriptベクターからEc
oRI断片として、対応するように切断されたベクターpBin19に移された（Bevan,
Nucleic Acids Res. 12（1984) 8711-8721)。
【０１７９】 35S プロモーター、GGPPOR遺伝子および転写終結のためのTiプラスミドpTIACH
5（Gielenら、1984) のT DNAの遺伝子3のポリアデニル化シグナルを、プラスミ
ドpBinARHyg-GGPPORからPCRによって単離した。XbaI切断部位を、各場合におい
て、プロモーターおよびターミネーターに対するオリゴヌクレオチドに結合した
。プロモーター（下線)にアニーリングするオリゴヌクレオチドの配列は、5'-AT
TCTAGACATGGAGTCAAA-GATTCAAATAGA-3'であり、ターミネーター配列（下線）にア
ニーリングするオリゴヌクレオチドの配列は、5'-ATTCTAGAGGACAA-TCAGTAAATTGA ACGGAG -3'である。該断片をGene-Cleanキット（Dianova GmbH, Hilden)を用いて
精製し、製造元の説明に従ってベクター PCR-Script(Stratagene GmbH, Heidelb
erg)中にクローン化した。配列の正確さは、配列決定により確認した。該配列は
、このPCR-ScriptベクターからXbaI断片として、上記のように既にDOXS配列を含
み対応するように切断されたベクターに導入した。結果として、構築物pBinAR-D
OXS-GGPPOR（図15）が得られ、その断片は以下に示す重要性を有する： 断片A(529bp)は、カリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーター（カリフ
ラワーモザイクウイルスのヌクレオチド6909〜7437）を含む。断片Bは、色素体
トランスケトラーゼのトランジットペプチドを含む。断片Dは、転写終結のため
のTiプラスミドpTIACH5（Gielenら、1984） のT DNAの遺伝子3のポリアデニル化
シグナルを含む。断片Eは、DOXS遺伝子を含む。断片Fは、固有の色素体トランジ
ット配列を含むGGPPOR遺伝子を含む。
5（Gielenら、1984) のT DNAの遺伝子3のポリアデニル化シグナルを、プラスミ
ドpBinARHyg-GGPPORからPCRによって単離した。XbaI切断部位を、各場合におい
て、プロモーターおよびターミネーターに対するオリゴヌクレオチドに結合した
。プロモーター（下線)にアニーリングするオリゴヌクレオチドの配列は、5'-AT
TCTAGACATGGAGTCAAA-GATTCAAATAGA-3'であり、ターミネーター配列（下線）にア
ニーリングするオリゴヌクレオチドの配列は、5'-ATTCTAGAGGACAA-TCAGTAAATTGA ACGGAG -3'である。該断片をGene-Cleanキット（Dianova GmbH, Hilden)を用いて
精製し、製造元の説明に従ってベクター PCR-Script(Stratagene GmbH, Heidelb
erg)中にクローン化した。配列の正確さは、配列決定により確認した。該配列は
、このPCR-ScriptベクターからXbaI断片として、上記のように既にDOXS配列を含
み対応するように切断されたベクターに導入した。結果として、構築物pBinAR-D
OXS-GGPPOR（図15）が得られ、その断片は以下に示す重要性を有する： 断片A(529bp)は、カリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーター（カリフ
ラワーモザイクウイルスのヌクレオチド6909〜7437）を含む。断片Bは、色素体
トランスケトラーゼのトランジットペプチドを含む。断片Dは、転写終結のため
のTiプラスミドpTIACH5（Gielenら、1984） のT DNAの遺伝子3のポリアデニル化
シグナルを含む。断片Eは、DOXS遺伝子を含む。断片Fは、固有の色素体トランジ
ット配列を含むGGPPOR遺伝子を含む。
【０１８０】実施例17 DOXS、GGPPORおよびHPPD DNA配列で植物を形質転換するための構築物の作製 DOXS、GGPPORおよびHPPDについてのトランスジェニック体である植物を作製す
るために、3つの遺伝子配列のすべてを含むバイナリーベクターを作製した（図1
6）。GGPPOR遺伝子を固有の色素体局在化配列とともに提供する（実施例15に記
載）。用いたpBinAR-Hygベクターは、植物に抗生物質ハイグロマイシンに対する
耐性を与え、そのためカナマイシン耐性を有する植物への重複感染に適している
。
るために、3つの遺伝子配列のすべてを含むバイナリーベクターを作製した（図1
6）。GGPPOR遺伝子を固有の色素体局在化配列とともに提供する（実施例15に記
載）。用いたpBinAR-Hygベクターは、植物に抗生物質ハイグロマイシンに対する
耐性を与え、そのためカナマイシン耐性を有する植物への重複感染に適している
。
【０１８１】 さらに別のcDNAを含むベクター中にHPPDをクローン化するために、PCR用のオ
リゴヌクレオチドを誘導し、BamHI制限酵素切断部位を5'末端および3'末端に結
合させる。該オリゴヌクレオチドは5'末端に、配列5'-GGA TCCTCCAGCGGACAAGCCA AC -3'(ATGから5'方向に37〜55ヌクレオチド離れている；下線）を含み、該オリ
ゴヌクレオチドは3'末端に、配列5'-ATGGATC CCGCGCCGCCTACAGGTTG-3'（コード
配列の塩基対1140で終了し、TAG終止コドンの3'の8塩基対で始まる；下線)を含
む。PCR反応をTliポリメラーゼ（Promega GmbH, Mannheim)を製造元の説明に従
って用いることにより実施した。10 ngのプラスミドpBinAR-HPPDを鋳型として用
いた。PCRプログラムは以下の通りとした： 5サイクル：94℃ 4秒、68℃ 30秒、72℃ 2分 5サイクル：94℃ 4秒、64℃ 30秒、72℃ 2分 25サイクル：94℃ 4秒、60℃ 30秒、72℃ 2分。
リゴヌクレオチドを誘導し、BamHI制限酵素切断部位を5'末端および3'末端に結
合させる。該オリゴヌクレオチドは5'末端に、配列5'-GGA TCCTCCAGCGGACAAGCCA AC -3'(ATGから5'方向に37〜55ヌクレオチド離れている；下線）を含み、該オリ
ゴヌクレオチドは3'末端に、配列5'-ATGGATC CCGCGCCGCCTACAGGTTG-3'（コード
配列の塩基対1140で終了し、TAG終止コドンの3'の8塩基対で始まる；下線)を含
む。PCR反応をTliポリメラーゼ（Promega GmbH, Mannheim)を製造元の説明に従
って用いることにより実施した。10 ngのプラスミドpBinAR-HPPDを鋳型として用
いた。PCRプログラムは以下の通りとした： 5サイクル：94℃ 4秒、68℃ 30秒、72℃ 2分 5サイクル：94℃ 4秒、64℃ 30秒、72℃ 2分 25サイクル：94℃ 4秒、60℃ 30秒、72℃ 2分。
【０１８２】 該断片をGene-Cleanキット（Dianova GmbH, Hilden)を用いて精製し、製造元
の説明に従ってベクター PCR-Script（Stratagene GmbH, Heidelberg)中にクロ
ーン化した。該配列の正確さは、配列決定によって確認した。該配列はBamHI断
片としてベクター PCR-Scriptから切り出し、対応するように切断されたpBinAR
ベクターに連結した。pBinARベクターはさらに、遺伝子産物を色素体に導入する
ためのトランスケトラーゼのトランジットペプチドを含む。結果として、プラス
ミドpBinAR-TP-p-HPPDが得られた。
の説明に従ってベクター PCR-Script（Stratagene GmbH, Heidelberg)中にクロ
ーン化した。該配列の正確さは、配列決定によって確認した。該配列はBamHI断
片としてベクター PCR-Scriptから切り出し、対応するように切断されたpBinAR
ベクターに連結した。pBinARベクターはさらに、遺伝子産物を色素体に導入する
ためのトランスケトラーゼのトランジットペプチドを含む。結果として、プラス
ミドpBinAR-TP-p-HPPDが得られた。
【０１８３】 クローニングのために、35S プロモーター、トランスケトラーゼトランジット
ペプチド、p-HPPD遺伝子および転写終結のためのTiプラスミドpTIACH5（Gielen
ら、1984) のT DNAの遺伝子3のポリアデニル化シグナルを、プラスミドpBinAR-T
P-p-HPPDから、PCRによって単離した。HindIII切断部位を、各場合において、プ
ロモーターおよびターミネーターに対するオリゴヌクレオチドに結合した。プロ
モーターの5'領域（下線)にアニーリングするオリゴヌクレオチドの配列は、5'-
ATAAGCTTCATGGAGTCAAA-GATTCAAATAGA-3'であり、ターミネーター配列（下線）に
アニーリングするオリゴヌクレオチドの配列は、5'-ATAAGCTTGGAC-AATCAGTAAATT GAACGGAG -3'である。得られた断片をGene-Cleanキット（Dianova GmbH, Hilden)
を用いて精製し、製造元の説明に従ってベクター PCR-Script(Stratagene GmbH,
Heidelberg)中にクローン化した。配列の正確さは、配列決定により確認した。
該配列は、このPCR-ScriptベクターからのHindIII断片として、対応するように
切断されたベクターpBin19に導入した（Bevan, 1984, Nucleic Acids Res. 12,
8711-8721)。
ペプチド、p-HPPD遺伝子および転写終結のためのTiプラスミドpTIACH5（Gielen
ら、1984) のT DNAの遺伝子3のポリアデニル化シグナルを、プラスミドpBinAR-T
P-p-HPPDから、PCRによって単離した。HindIII切断部位を、各場合において、プ
ロモーターおよびターミネーターに対するオリゴヌクレオチドに結合した。プロ
モーターの5'領域（下線)にアニーリングするオリゴヌクレオチドの配列は、5'-
ATAAGCTTCATGGAGTCAAA-GATTCAAATAGA-3'であり、ターミネーター配列（下線）に
アニーリングするオリゴヌクレオチドの配列は、5'-ATAAGCTTGGAC-AATCAGTAAATT GAACGGAG -3'である。得られた断片をGene-Cleanキット（Dianova GmbH, Hilden)
を用いて精製し、製造元の説明に従ってベクター PCR-Script(Stratagene GmbH,
Heidelberg)中にクローン化した。配列の正確さは、配列決定により確認した。
該配列は、このPCR-ScriptベクターからのHindIII断片として、対応するように
切断されたベクターpBin19に導入した（Bevan, 1984, Nucleic Acids Res. 12,
8711-8721)。
【０１８４】 35S プロモーター、トランスケトラーゼトランジットペプチド、DOXS遺伝子お
よび転写終結のためのTiプラスミドpTIACH5（Gielenら、1984) のT DNAの遺伝子
3のポリアデニル化シグナルを、PCRによってプラスミドpBinAR-TP-DOXSから単離
した。EcoRI切断部位を、各場合において、プロモーターおよびターミネーター
配列に対するオリゴヌクレオチドに結合した。プロモーター（下線)にアニーリ
ングするオリゴヌクレオチドの配列は、5'-ATGAATTC CATGGAGTCAAAGATTCAAATAGA -3'であり、ターミネーター配列（下線）にアニーリングするオリゴヌクレオチ
ドの配列は、5'-ATGAATTCGGACAATCAGTAAATTGAACGGAG-3'である。該断片をGene-C
leanキット（Dianova GmbH, Hilden)を用いて精製し、製造元の説明に従ってベ
クター PCR-Script(Stratagene GmbH, Heidelberg)中にクローン化した。配列の
正確さは、配列決定により確認した。該配列は、このPCR-ScriptベクターからEc
oRI断片として、上記のように既にHPPD配列を含み対応するように切断されたベ
クターに導入した。
よび転写終結のためのTiプラスミドpTIACH5（Gielenら、1984) のT DNAの遺伝子
3のポリアデニル化シグナルを、PCRによってプラスミドpBinAR-TP-DOXSから単離
した。EcoRI切断部位を、各場合において、プロモーターおよびターミネーター
配列に対するオリゴヌクレオチドに結合した。プロモーター（下線)にアニーリ
ングするオリゴヌクレオチドの配列は、5'-ATGAATTC CATGGAGTCAAAGATTCAAATAGA -3'であり、ターミネーター配列（下線）にアニーリングするオリゴヌクレオチ
ドの配列は、5'-ATGAATTCGGACAATCAGTAAATTGAACGGAG-3'である。該断片をGene-C
leanキット（Dianova GmbH, Hilden)を用いて精製し、製造元の説明に従ってベ
クター PCR-Script(Stratagene GmbH, Heidelberg)中にクローン化した。配列の
正確さは、配列決定により確認した。該配列は、このPCR-ScriptベクターからEc
oRI断片として、上記のように既にHPPD配列を含み対応するように切断されたベ
クターに導入した。
【０１８５】 35S プロモーター、GGPPOR遺伝子および転写終結のためのTiプラスミドpTIACH
5（Gielenら、1984) のT DNAの遺伝子3のポリアデニル化シグナルを、プラスミ
ドpBinARHyg-GGPPORからPCRによって単離した。XbaI切断部位を、各場合におい
て、プロモーターおよびターミネーターに対するオリゴヌクレオチドに結合した
。プロモーター（下線)にアニーリングするオリゴヌクレオチドの配列は、5'-AT
TCTAGACATGGAGTCAAA-GATTCAAATAGA-3'であり、ターミネーター配列（下線）にア
ニーリングするオリゴヌクレオチドの配列は、5'-ATTCTAGAGGACAA-TCAGTAAATTGA ACGGAG -3'である。該断片をGene-Cleanキット（Dianova GmbH, Hilden)を用いて
精製し、製造元の説明に従ってベクター PCR-Script(Stratagene GmbH, Heidelb
erg)中にクローン化した。配列の正確さは、配列決定により確認した。該配列は
、このPCR-ScriptベクターからXbaI断片として、上記のように既にHPPDおよびDO
XS配列を含み対応するように切断されたベクターに導入した。結果として、構築
物pBinAR-DOXS-GGPPOR-HPPD（図16）が得られ、その断片は以下に示す重要性を
有する： 断片A(529bp)は、カリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーター（カリフ
ラワーモザイクウイルスのヌクレオチド6909〜7437）を含む。断片Bは、色素体
トランスケトラーゼのトランジットペプチドを含む。断片Cは、HPPD遺伝子を含
む。断片Dは、転写終結のためのTiプラスミドpTIACH5（Gielenら、1984） のT D
NAの遺伝子3のポリアデニル化シグナルを含む。断片Eは、DOXS遺伝子を含む。断
片Fは、固有の色素体トランジット配列を含むGGPPOR遺伝子を含む。
5（Gielenら、1984) のT DNAの遺伝子3のポリアデニル化シグナルを、プラスミ
ドpBinARHyg-GGPPORからPCRによって単離した。XbaI切断部位を、各場合におい
て、プロモーターおよびターミネーターに対するオリゴヌクレオチドに結合した
。プロモーター（下線)にアニーリングするオリゴヌクレオチドの配列は、5'-AT
TCTAGACATGGAGTCAAA-GATTCAAATAGA-3'であり、ターミネーター配列（下線）にア
ニーリングするオリゴヌクレオチドの配列は、5'-ATTCTAGAGGACAA-TCAGTAAATTGA ACGGAG -3'である。該断片をGene-Cleanキット（Dianova GmbH, Hilden)を用いて
精製し、製造元の説明に従ってベクター PCR-Script(Stratagene GmbH, Heidelb
erg)中にクローン化した。配列の正確さは、配列決定により確認した。該配列は
、このPCR-ScriptベクターからXbaI断片として、上記のように既にHPPDおよびDO
XS配列を含み対応するように切断されたベクターに導入した。結果として、構築
物pBinAR-DOXS-GGPPOR-HPPD（図16）が得られ、その断片は以下に示す重要性を
有する： 断片A(529bp)は、カリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーター（カリフ
ラワーモザイクウイルスのヌクレオチド6909〜7437）を含む。断片Bは、色素体
トランスケトラーゼのトランジットペプチドを含む。断片Cは、HPPD遺伝子を含
む。断片Dは、転写終結のためのTiプラスミドpTIACH5（Gielenら、1984） のT D
NAの遺伝子3のポリアデニル化シグナルを含む。断片Eは、DOXS遺伝子を含む。断
片Fは、固有の色素体トランジット配列を含むGGPPOR遺伝子を含む。
【０１８６】実施例18 アブラナにおけるトコフェロール生合成の増大 DOXSのcDNA（配列番号3)およびGGPPORのcDNA（配列番号7)は、CaMV35Sプロモ
ーターとともに提供され、35Sプロモーターを用いてアブラナにおいて過剰発現
させた。これに平行して、ファゼオリン遺伝子の種子特異的プロモーターを用い
て、アブラナ種子中のトコフェロール含有量を特異的に増加させた。対応する構
築物で形質転換したアブラナ植物を、温室で成長させた。そして、該植物全体お
よび該植物の種子におけるα-トコフェロール含有量を測定した。すべての場合
において、α-トコフェロール濃度は形質転換されていない植物と比較して増加
していた。
ーターとともに提供され、35Sプロモーターを用いてアブラナにおいて過剰発現
させた。これに平行して、ファゼオリン遺伝子の種子特異的プロモーターを用い
て、アブラナ種子中のトコフェロール含有量を特異的に増加させた。対応する構
築物で形質転換したアブラナ植物を、温室で成長させた。そして、該植物全体お
よび該植物の種子におけるα-トコフェロール含有量を測定した。すべての場合
において、α-トコフェロール濃度は形質転換されていない植物と比較して増加
していた。
【０１８７】実施例19 アブラナにおけるトコフェロール生合成の増大 DOXSのcDNA（配列番号3)、HPPDのcDNA（配列番号5)およびGGPPORのcDNA（配列
番号7)は、CaMV35Sプロモーターとともに提供され、35Sプロモーターを用いてア
ブラナにおいて過剰発現させた。これに平行して、ファゼオリン遺伝子の種子に
特異的なプロモーターを用いて、アブラナ種子中のトコフェロール含有量を特異
的に増加させた。対応する構築物で形質転換したアブラナ植物を、温室で成長さ
せた。そして、該植物全体および該植物の種子におけるα-トコフェロール含有
量を測定した。すべての場合において、α-トコフェロール濃度は形質転換され
ていない植物と比較して増加していた。
番号7)は、CaMV35Sプロモーターとともに提供され、35Sプロモーターを用いてア
ブラナにおいて過剰発現させた。これに平行して、ファゼオリン遺伝子の種子に
特異的なプロモーターを用いて、アブラナ種子中のトコフェロール含有量を特異
的に増加させた。対応する構築物で形質転換したアブラナ植物を、温室で成長さ
せた。そして、該植物全体および該植物の種子におけるα-トコフェロール含有
量を測定した。すべての場合において、α-トコフェロール濃度は形質転換され
ていない植物と比較して増加していた。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 １９８ ４５ ２３１．４ (32)優先日 平成10年10月１日(1998．10．1) (33)優先権主張国 ドイツ（ＤＥ） (31)優先権主張番号 １９８ ４５ ２２４．１ (32)優先日 平成10年10月１日(1998．10．1) (33)優先権主張国 ドイツ（ＤＥ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＵ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＧＥ， ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＪＰ，ＫＲ，ＫＺ，Ｌ Ｔ，ＬＶ，ＭＫ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＵＡ，ＵＳ，ＺＡ (72)発明者 メジア、パトリシア レオン メキシコ国 62250 モレロス、クエルナ ヴァカ、ガンザロ デ サンドヴァル 226 (72)発明者 パルマス、ホアン マヌエル エステヴェ ス メキシコ国 ロマ ボニタ テカマック エスタド、エントラーダ ア オジョ デ アグア コル． (72)発明者 グラシア、マリア アラセリ カンター メキシコ国 62210 モレロス、ロマ ボ ニタ クエルナヴァカ 22、２ディーエー パリヴァド ロス ピノス 22 (72)発明者 エブネス、マーカス ドイツ連邦共和国 ディー−06486 クエ ドリンブルグ、ビックリンゲルヴェグ 16 (72)発明者 ヘルベルス、カリン ドイツ連邦共和国 ディー−06486 クエ ドリンブルグ、アン ハンゲ ６ Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD08 CA17 CA19 CB02 CD03 CD07 CD09 CD13 CD17 4B024 AA08 BA07 BA08 CA04 DA01 DA05 EA04 EA10 GA00 HA01 4B063 QA01 QQ04 QQ44 QR32 QR62 QS25 QS34
Claims (22)
- 【請求項１】 トコフェロール、ビタミンK、クロロフィルおよび／または
カロテノイドの含量が増加した植物の生産のための、1-デオキシ-D-キシルロー
ス-5-リン酸シンターゼ(DOXS)をコードするDNA配列の使用。 - 【請求項２】 トコフェロール、ビタミンK、クロロフィルおよび／または
カロテノイドの含量が増加した植物の生産のための、配列番号１もしくは配列番
号３のDNA配列、または配列番号３のDNA配列にハイブリダイズし、かつ1-デオキ
シ-D-キシルロース-5-リン酸シンターゼ(DOXS)をコードするDNA配列の使用。 - 【請求項３】 トコフェロール、ビタミンK、クロロフィルおよび／または
カロテノイドの含量が増加した植物の生産のための、1-デオキシ-D-キシルロー
ス-5-リン酸シンターゼ(DOXS)をコードするDNA配列およびp-ヒドロキシフェニル
ピルビン酸ジオキシゲナーゼ(HPPD)をコードするDNA配列の使用。 - 【請求項４】 トコフェロール、ビタミンK、クロロフィルおよび／または
カロテノイドの含量が増加した植物の生産のための、配列番号１もしくは配列番
号３のDNA配列、ならびに配列番号５のDNA配列もしくは後者のDNA配列にハイブ
リダイズし、かつ1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸シンターゼ(DOXS)および
p-ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ(HPPD)をコードするDNA配列
の使用。 - 【請求項５】 トコフェロール、ビタミンK、クロロフィルおよび／または
カロテノイドの含量が増加した植物の生産のための、1-デオキシ-D-キシルロー
ス-5-リン酸シンターゼ(DOXS)をコードするDNA配列およびゲラニルゲラニルピロ
リン酸オキシドレダクターゼ(GGPPOR)をコードするDNA配列の使用。 - 【請求項６】 トコフェロール、ビタミンK、クロロフィルおよび／または
カロテノイドの含量が増加した植物の生産のための、配列番号１もしくは配列番
号３のDNA配列、ならびに配列番号７のDNA配列もしくは後者のDNA配列にハイブ
リダイズし、かつ1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸シンターゼ(DOXS)および
ゲラニルゲラニルピロリン酸オキシドレダクターゼ(GGPPOR)をコードするDNA配
列の使用。 - 【請求項７】 トコフェロール、ビタミンK、クロロフィルおよび／または
カロテノイドの含量が増加した植物の生産のための、1-デオキシ-D-キシルロー
ス-5-リン酸シンターゼ(DOXS)をコードするDNA配列およびヒドロキシフェニルピ
ルビン酸ジオキシゲナーゼ(HPPD)をコードするDNA配列およびゲラニルゲラニル
ピロリン酸オキシドレダクターゼ(GGPPOR)をコードするDNA配列の使用。 - 【請求項８】 トコフェロール、ビタミンK、クロロフィルおよび／または
カロテノイドの含量が増加した植物の生産のための、配列番号１もしくは配列番
号３のDNA配列、ならびに配列番号５のDNA配列および配列番号７のDNA配列もし
くは後者のDNA配列にハイブリダイズし、かつ1-デオキシ-D-キシルロース-5-リ
ン酸シンターゼ(DOXS)、ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ(HPPD)
およびゲラニルゲラニルピロリン酸オキシドレダクターゼ(GGPPOR)をコードする
DNA配列の使用。 - 【請求項９】 配列番号１もしくは配列番号３のDNA配列、または後者のDNA
配列にハイブリダイズするDNA配列を植物において発現させることを含む、トコ
フェロール、ビタミンK、クロロフィルおよび／またはカロテノイドの含量が増
加した植物の生産方法。 - 【請求項１０】 配列番号１もしくは配列番号３のDNA配列、および配列番
号５のDNA配列もしくは後者のDNA配列にハイブリダイズするDNA配列を植物にお
いて発現させることを含む、トコフェロール、ビタミンK、クロロフィルおよび
／またはカロテノイドの含量が増加した植物の生産方法。 - 【請求項１１】 配列番号１もしくは配列番号３のDNA配列、および配列番
号７のDNA配列もしくは後者のDNA配列にハイブリダイズするDNA配列を植物にお
いて発現させることを含む、トコフェロール、ビタミンK、クロロフィルおよび
／またはカロテノイドの含量が増加した植物の生産方法。 - 【請求項１２】 配列番号１もしくは配列番号３、配列番号５および配列番
号７のDNA配列、または後者のDNA配列にハイブリダイズするDNA配列を植物にお
いて発現させることを含む、トコフェロール、ビタミンK、クロロフィルおよび
／またはカロテノイドの含量が増加した植物の生産方法。 - 【請求項１３】 プロモーターおよび配列番号１もしくは配列番号３のDNA
配列を含む発現カセットを、植物細胞、カルス組織、全植物または植物細胞のプ
ロトプラスト中に導入することを含む、植物の形質転換方法。 - 【請求項１４】 プロモーターならびに配列番号１もしくは配列番号３およ
び配列番号５のDNA配列を含む発現カセットを、植物細胞、カルス組織、全植物
または植物細胞のプロトプラスト中に導入することを含む、植物の形質転換方法
。 - 【請求項１５】 プロモーターならびに配列番号１もしくは配列番号３およ
び配列番号７のDNA配列を含む発現カセットを、植物細胞、カルス組織、全植物
または植物細胞のプロトプラスト中に導入することを含む、植物の形質転換方法
。 - 【請求項１６】 プロモーターならびに配列番号１もしくは配列番号３、配
列番号５および配列番号７のDNA配列を含む発現カセットを、植物細胞、カルス
組織、全植物または植物細胞のプロトプラスト中に導入することを含む、植物の
形質転換方法。 - 【請求項１７】 前記形質転換を、アグロバクテリウム・ツメファシエンス
(Agrobacterium tumefaciens)株、エレクトロポレーションまたは粒子ボンバー
ドメント法によって行うことを特徴とする、請求項１３〜１６のいずれか１項に
記載の植物の形質転換方法。 - 【請求項１８】 請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の発現カセットを
含む、トコフェロール、ビタミンK、クロロフィルおよび／またはカロテノイド
の含量が増加した植物。 - 【請求項１９】 大豆、カノラ、大麦、オート麦、小麦、アブラナ、トウモ
ロコシまたはヒマワリからなる群より選択される、請求項１８に記載の植物。 - 【請求項２０】 DOXS阻害剤を同定するための試験系を製造するための、配
列番号１または配列番号３の使用。 - 【請求項２１】 請求項１３に記載の発現カセットの発現に基づく、DOXS阻
害剤を同定するための試験系。 - 【請求項２２】 植物および細菌のDOXSを製造するための、配列番号１もし
くは配列番号３のDNA配列または配列番号３のDNA配列にハイブリダイズするDNA
配列を含む植物の使用。
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