DE19752700A1 - 1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat Synthase, Verfahren zur Identifizierung von Effektoren der 1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat Synthase und Effektoren der 1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat Synthase - Google Patents

1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat Synthase, Verfahren zur Identifizierung von Effektoren der 1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat Synthase und Effektoren der 1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat Synthase

Info

Publication number
DE19752700A1
DE19752700A1 DE19752700A DE19752700A DE19752700A1 DE 19752700 A1 DE19752700 A1 DE 19752700A1 DE 19752700 A DE19752700 A DE 19752700A DE 19752700 A DE19752700 A DE 19752700A DE 19752700 A1 DE19752700 A1 DE 19752700A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
dxs
host cell
protein
function
pyruvate
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
DE19752700A
Other languages
English (en)
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bayer CropScience AG
Original Assignee
Hoechst Schering Agrevo GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoechst Schering Agrevo GmbH filed Critical Hoechst Schering Agrevo GmbH
Priority to DE19752700A priority Critical patent/DE19752700A1/de
Priority to CA002219271A priority patent/CA2219271A1/en
Priority to JP10039499A priority patent/JPH11169186A/ja
Priority to DE29800547U priority patent/DE29800547U1/de
Priority to CA 2228170 priority patent/CA2228170A1/en
Publication of DE19752700A1 publication Critical patent/DE19752700A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/66—Phosphorus compounds
    • A61K31/662—Phosphorus acids or esters thereof having P—C bonds, e.g. foscarnet, trichlorfon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N57/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic phosphorus compounds
    • A01N57/18—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic phosphorus compounds having phosphorus-to-carbon bonds
    • A01N57/20—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic phosphorus compounds having phosphorus-to-carbon bonds containing acyclic or cycloaliphatic radicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N61/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing substances of unknown or undetermined composition, e.g. substances characterised only by the mode of action
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1022—Transferases (2.) transferring aldehyde or ketonic groups (2.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/527—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving lyase

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die 1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat Synthase (DXS), Verfahren zur Herstellung der DXS, die Verwendung der DXS, Verfahren zur Identifizierung von Effektoren der DXS sowie Effektoren der DXS.
Isoprenoide stellen eine sehr umfangreiche Klasse von Naturstoffen dar und umfassen eine Vielzahl essentieller Verbindungen wie beispielsweise Carotinoide, Steroide, Prenylchinonseitenketten oder Phytolreste in Chlorophyllen (Coolbear & Threlfall, (1989) in Biosynthesis of terpenoid lipids, ed. Ratledge & Wilkinson, (Academic Press), pp. 115-254, Bach, T. J. (1995) Lipids 30, 191-202).
Es wird postuliert, daß die Biosynthese des Isopentenyldiphosphats (IPP), dem C-5-Grundkörper aller Isoprenoide, über den Acetat-Mevalonat-Weg erfolgt (Banthorpe et al., (1972) Chem. Rev. 72, 115-155; Beyia & Porter, (1976) Annu. Rev. Biochem. 45, 113-142).
Vor kurzem wurde durch 13C-Markierungsversuche an Bakterien, Algen and Pflanzen die Existenz eines zum Acetat-Mevalonat-Weg alternativen Stoffwechselweges zum IPP nachgewiesen (Rohmer et al., (1993) Biochem. J 295, 517-524; Rohmer et al., (1996) J. Am. Chem. Soc. 118, 2564-2566).
Als erstes Zwischenprodukt dieses alternativen Isoprenoidbiosyntheseweges wurde 1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat (DXP) postuliert, das in einer Thiamindiphosphat­ abhängigen Reaktion aus Pyruvat und Glycerinaldehyd-3-phosphat (GA3P) synthetisiert wird.
Die DXS katalysiert den ersten Reaktionsschritt des alternativen, nicht Mevalonat-abhängigen Isoprenoidbiosyntheseweges, d. h. die Synthese von 1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat (DXP) aus Pyruvat und Glycerinalde­ hyd-3-phosphat (GA3P).
DXP bzw. 1-Desoxy-D-xylulose (DOX) sind außerdem an der Biosynthese von Thiamin (Vitamin B1) und Pyridoxol (Vitamin B6) beteiligt (Hill et al., (1996) J. Biol. Chem. 271, 30426-30435; Himmeldirk et al., (1996) Chem. Commun., 1187-1188).
Darüber hinaus wurde über die Klonierung und Charakterisierung des dxs-Gens aus E. coli sowie die Überexpression des dxs-Genprodukts in E. coli berichtet (Lois et al., (1997) Abstracts 3rd Terpnet Meeting on Plant Isoprenoids, p. 16, Universite de Poitiers, Frankreich). Die Bildung von DXP wurde mittels zellfreien Extrakten nachgewiesen.
Für das Enzym DXS aus E. coli wurde eine Thiamindiphosphat-Bindungsstelle postuliert, wie sie z. B. aus anderen Enzymen, wie Pyruvat-Decarboxylasen, Acetolactat-Synthasen oder Transketolasen bekannt ist.
Ein Sequenzvergleich mit Sequenzinformationen auf Aminosäure-Ebene zeigte Homologien zu Genprodukten bisher unbekannter Funktion, so daß den folgenden offenen Leserahmen (ORF) die Funktion einer DXS zugeordnet werden kann:
E. coli (EMBL Acc. No. U 82664, Bp 17765 bis 19627), Haemophilus influenzae (SwissProt Acc. No. P 45205), Bacillus subtilis (SwissProt Acc. No. P 54523); Rhodobacter capsulatus (SwissProt Acc. No. P 26242), Synechocystis sp PCC6803 (Gen Bank Acc. No. D 90903), Mycobacterium leprae (Acc. No. P 46708), Mycobacterium tuberculosis (Acc. No. Z 96072), Helicobacter pylori (Acc. No. AE 000552), Methanococcus jannaschii (Acc. No. G 64384) und dem CLA 1 (oder Def) Gen aus Arabidopsis thaliana (Gen Bank Acc. No. U 27099; Mandel et al. (1996) The Plant Journal 9, 649-658).
Weitere Recherchen in Sequenzdatenbanken ergaben für die DXS-Proteine Homologien zu Transketolase-ähnlichen Enzymen (z. B. EC 2.2.1.1) und den E1-Proteinen aus dem Pyruvatdehydrogenase-Komplex (PDH, EC 1.2.4.1) aus verschiedenen Organismen. Die DXS-Proteine sind jedoch in der Regel kleiner als bakterielle Transketolasen.
Die Nukleinsäure-Sequenzen bzw. Nukleinsäuremolküle kodierend für ein Protein mit der Funktion einer 1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat Synthase werden als "dxs" und die Aminosäuresequenzen bzw. Proteine mit der Funktion einer 1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat Synthase als "DXS" bezeichnet.
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß Enzyme mit der Funktion einer DXS einen neuen, hochspezifischen Angriffspunkt für die Entwicklung pestizider, insbesondere herbizider oder antibiotisch wirksamer Verbindungen darstellen.
Erfindungsgegenstand ist daher ein isoliertes Protein mit der Funktion einer DXS, oder ein aktives Fragment daraus, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus DXS aus E. coli, Haemophilus influenzae, Bacillus subtilis, Rhodobacter capsulatus, Synechocystis sp. PCC6803, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Helicobacter pylori, Methanococcus jannaschii und Arabidopsis thaliana.
Erfindungsgegenstand ist auch die o. g. DXS zur Verwendung als Wirkort für Herbizide oder Antibiotika.
Ein weiterer Erfindungsgegenstand ist ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins mit der Funktion einer DXS oder eines aktiven Fragments daraus in einer rekombinanten Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Nukleinsäuremolekül kodierend für ein Protein mit der Funktion einer DXS oder eines aktiven Fragments daraus in eine für eine Wirtszelle geeignete Expressionskassette inseriert; die so erhaltene Expressionskassette in geeigneter Weise in einen für eine Wirtszelle geeigneten Vektor inseriert; eine geeignete Wirtszelle mit dem so erhaltenen Vektor transformiert; die so transformierte Wirtszelle in einem geeigneten Medium kultiviert; und das von besagter Wirtszelle produzierte Protein mit der Funktion einer DXS oder das aktive Fragment daraus in geeigneter Weise aus dem Kulturmedium und/oder der Wirtszelle isoliert.
Die vorliegende Erfindung betrifft insofern die Herstellung gereinigter DXS auf gentechnischem Wege. Z. B. können zur Herstellung von rekombinanter DXS in einem Wirtsorganismus DXS-codierende DNA-Sequenzen in eine Expressionskassette kloniert werden, welche zur heterologen Expression des Strukturgens in dem ausgewählten Wirtsorganismus geeignet sind.
Hierfür sind beispielsweise folgende DXS-kodierenden DNA-Sequenzen geeignet:
mikrobielle oder pflanzliche dxs-cDNA, mit gängigen Methoden in ihrer Sequenz veränderte pflanzliche dxs-cDNA-Moleküle, aber auch synthetische DNA-Se­ quenzen, abgeleitet aus mikrobieller oder pflanzlicher dxs-cDNA, die die Expression einer aktiven DXS oder deren aktiver Fragmente ermöglichen, insbesondere die oben genannten DXS-codierenden Sequenzen aus E. coli, Haemophilus influenzae, Bacillus subtilis, Rhodobacter capsulatus, Synechocystis sp. PCC6803, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Helicobacter pylori, Methanococcus jannaschii und Arabidopsis thaliana.
DXS-kodierende DNA-Sequenzen sind auch verwendbar als Selektionsmarker, wie z. B. als Herbizidresistenzmarker.
Die Einführung spezifischer regulatorischer Sequenzen in die Expressionskassette kann außerdem erwünscht sein, beispielsweise von Promotoren, Operatorsequenzen, Enhancern, Terminatoren, Signalsequenzen, 5'- und 3'-un­ translatierter Sequenzen, oder Sequenzen kodierend für geeignete Fusionsproteine. Die Verwendung solcher regulatorischer Sequenzen ist allgemein übliche Technik, die je nach Expressionsstrategie breit variieren kann.
Die resultierende dxs-Expressionskassette, versehen mit den notwendigen regulatorischen Elementen im passenden Leserahmen des dxs-Strukturgens, kann in einen Expressionsvektor, mit welchem der ausgewählte Wirtsorganismus transformiert werden kann, inseriert werden. Geeignete Expressionsstrategien zur Herstellung rekombinanter Proteine und entsprechende Expressionsvektoren sind allgemein bekannt für Wirtsorganismen wie beispielsweise E. coli, Hefen und Insektenzellen. Der durch stabile oder transiente Transformation mit der dxs-Expressionskassette erhaltene rekombinante Organismus kann zur Gewinnung von rekombinanter DXS in gereinigter oder partiell gereinigter Form oder von Zellfraktionen, enthaltend DXS dienen. Der rekombinante Organismus kann gegebenenfalls auch direkter Bestandteil, d. h. zellulärer Bestandteil eines analytischen Testsystems sein.
Unter dem Begriff "rekombinanter Organismus" ist insofern die Zelle eines durch in vitro veränderter oder integrierter DNA modifizierten Organismus zu verstehen, beispielsweise von rekombinanten Hefe-, Bakterien-, Algen, Insekten- oder Pflanzenzellen.
Ein bevorzugtes Expressionssystem ist z. B. die Verwendung von E. coli als Wirtsorganismus. Als Vektoren können alle Vektoren dienen, die über die geeigneten Expressionssignale, wie z. B. Promotoren und geeignete Selektionsmarker, wie z. B. Resistenzgene oder Gene, die eine Auxotrophie komplementieren, verfügen.
Gentechnisch hergestellte DXS kann mittels verschiedener Methoden gereinigt werden. Die Eignung einer Methode hängt jeweils vom verwendeten Wirtsorganismus, der Expressionsstategie und anderen Faktoren ab, die einem in der Expression und Reinigung rekombinanter Proteine erfahrenen Fachmann bekannt sind. Zum Zweck der Reinigung kann das rekombinante Protein auch durch entsprechende Veränderung seiner Gen-Sequenz in der Expressionskassette mit Peptidsequenzen fusioniert werden. Bevorzugt sind als Fusionspartner Peptide oder Proteine zu verwenden, die als C- oder N-terminale Fusionen der rekombinanten DXS eine Affinität zu bestimmten Säulenmaterialien verleihen. Solche Fusionen dürfen die Funktion der DXS nicht beeinflussen oder müssen z. B. durch Einbau geeigneter Proteaseschnittstellen unter Rekonstitution der Funktion abspaltbar sein. Als Beispiele für Fusionspartner seien Oligohistidin- Tails, das Strep-Tag™ (Biometra GmbH, Göttingen, BRD), die Glutathion-S-Trans­ ferase (GST) oder das Maltose-bindende Protein (MalE) genannt, ohne daß diese Anwendung auf die beispielhaft angegebenen Fusionspartner oder deren Fragmente beschränkt ist.
Die rekombinante oder gentechnische Herstellung und Reinigung der DXS ermöglicht z. B. die Verwendung von DXS in biochemischen Testsystemen zur Bestimmung der Enzymfunktion der DXS in Gegenwart von auszuprüfenden Testsubstanzen, insbesondere durch automatisiertes Prüfen (z. B. High Throughput Screening) von Testsubstanzen.
Die erfindungsgemäßen Proteine weisen bestimmte gemeinsame Charakteristika von DXS-Proteinen auf. Dazu können z. B. Enzymaktivität, Molekulargewicht, immunologische Reaktivität, chromatographisches Verhalten, Konformation, Stabilität, pH-Optimum, Temperatur-Optimum etc. gehören, sowie auch physikalische Eigenschaften wie z. B. das elektrophoretische Laufverhalten, Ladung, Sedimentationskoeffizienten, Löslichkeit, spektroskopische Eigenschaften etc.
Ein wichtiges Charakteristikum einer DXS ist z. B. ihre Fähigkeit zur Synthese von DXP unter Umsetzung von Pyruvat und GA3P. Diese Aktivität kann z. B. wie in Beispiel Nr. 4 beschrieben bestimmt werden.
Erfindungsgegenstand ist daher auch ein Verfahren zur Identifizierung von Effektoren der DXS, dadurch gekennzeichnet, daß die enzymatische Aktivität der DXS zu einem direkt oder indirekt, qualitativ oder quantitativ meßbaren Signal führt, vorzugsweise indem man eine DXS mit geeigneten Substraten inkubiert und die enzymatische Aktivität der DXS in An- und Abwesenheit einer zu untersuchenden Testsubstanz bestimmt und vergleicht.
Erfindungsgegenstand ist daher auch ein Verfahren zur Identifizierung von Effektoren der DXS, worin man die enzymatische Aktivität der DXS in Abwesenheit einer Testsubstanz bestimmt; die enzymatische Aktivität der DXS in Anwesenheit besagter Testsubstanz bestimmt; und die ermittelten enzymatischen Aktivitäten miteinander vergleicht.
Erfindungsgegenstand ist daher auch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Verfahrens zur Identifizierung von Effektoren der DXS, vorzugsweise in einem automatisierten Testsystem, z. B. durch sog. "High-Throughput-Screening", z. B. unter Verwendung von Pipettierrobotern und/oder computergestützten Steuer- und Analysesystemen.
Das Verfahren ist geeignet, spezifische Inhibitoren oder Aktivatoren, d. h. Effektoren der DXS aufzufinden, so daß u. a. Stoffe identifiziert werden können, welche eine potentielle herbizide bzw. wachstumshemmende aber auch wachstumsfördernde Wirkung besitzen. Die zu untersuchende chemische Verbindung wird dabei bevorzugt in Konzentrationen zwischen 10-9 M und 10-3 M, und besonders bevorzugt in Konzentrationen zwischen 10-7 M und 10-4 M eingesetzt.
Für die Bestimmung der enzymatischen Aktivität der DXS stehen eine Reihe von geeigneten Verfahren zur Verfügung, bei denen man die DXS in einem geeigneten Reaktionspuffer unter geeigneten Reaktionsbedingungen bezüglich Reaktionstemperatur und dem pH-Wert der Reaktion in Anwesenheit von Thiamindiphosphat mit geeigneten Substraten, wie z. B. Pyruvat und GA3P, inkubiert.
Als bevorzugte Reaktionsbedingungen der DXS seien geeignete Reaktionspuffer mit einem pH-Wert zwischen pH 3 und pH 11, sowie Reaktionstemperaturen zwischen 2°C und 60°C genannt.
Die Quantifizierung der Enzyminhibition oder Enzymaktivierung (d. h. der effektorischen Wirkung) kann durch einen einfachen Vergleich der katalytischen Aktivität der DXS in Abwesenheit und in Anwesenheit der zu untersuchenden Testsubstanz unter ansonsten identischen Testbedingungen geschehen. Zur Bestimmung der Aktivität der DXS können verschiedene biochemische Meß-Me­ thoden eingesetzt werden, durch die entweder die Entstehung der Reaktionsprodukte der von der DXS katalysierten Reaktion, z. B. DXP, oder aber eine Abnahme der Konzentration der Enzymsubstrate der DXS, z. B. Pyruvat oder GA3P, gemessen werden, z. B. durch eine Endpunktbestimmung des DXP nach enzymatischer Umsetzung der Substrate Pyruvat und GA3P, die gegebenenfalls radioaktiv markiert oder mit anderen gängigen Markern versehen waren oder durch nachgeschaltete Reaktionen nachgewiesen werden können, z. B. durch gekoppelte enzymatische Reaktionen.
Dem in der Durchführung von Enzymtests erfahrenen Fachmann stehen viele Standardmethoden zur Bestimmung von Enzymaktivitäten zur Verfügung (s. z. B. Bergmeyer, H. U., Methoden der enzymatischen Analyse, Band 1 und 2, Verlag Chemie, Weinheim (1974), Suelter, C. H., Experimentelle Enzymologie: Grundlagen für die Laborpraxis, Fischer Stuttgart (1990)).
Die Bestimmung der enzymatischen Aktivität der DXS kann z. B. erfolgen, indem man die DXS mit [2-14C]-Pyruvat und GA3P inkubiert und nach Ablauf einer geeigneten Inkubatiohszeit die Menge des gebildeten [2-14C]-1-Desoxy-D-xylulo­ se-5-phosphat nach Abtrennung von noch nicht umgesetzten [2-14C]-Pyruvat und GA3P qualitativ oder quantitativ bestimmt. Die Trennung des 1-Desoxy-D-xylulo­ se-5-phosphat von Pyruvat und GA3P kann z. B. an einer geeigneten stationären Phase unter Verwendung eines geeigneten Laufmittelgemischs z. B. durch Dünnschichtchromatographie oder durch HPLC erfolgen. Zur Verbesserung der Trennung von DXP, Pyruvat und GA3P können die im Reaktionsansatz enthaltenen Phosphorsäureester vor der chromatographischen Trennung z. B. durch Behandlung mit saurer oder alkalischer Phosphatase in die korrespondierenden Alkohole überführt werden. Bei der Aktivitätsbestimmung einer DXS können aber auch andere, radioaktiv markierte Substrate, wie z. B. [U-14C]-Pyruvat, 14C-markiertes GA3P, 3H-markiertes Pyruvat oder 3H-markiertes GA3P an Stelle von [2-14C]-Py­ ruvat und GA3P verwendet werden.
Es ist weiterhin vorstellbar, radioaktiv markierte DXP-Derivate (z. B. 13C-, 14C- oder 32P markiert u. a.), ausgehend von aufgereinigter DXS, herzustellen, um diese in Testsystemen einzusetzen. Radioaktiv markiertes DXP kann als spezifischer Metabolit zur Untersuchung von Folgeenzymen des 1-Desoxyxylulose-P-Weges eingesetzt werden und damit auch wiederum die Untersuchung von Effektoren ermöglichen. So könnte z. B. Die Bildung von 14C-IPP oder anderen 14C-Ver­ bindungen nachgewiesen werden; jeglicher Effektor, der demnach die Umwandlung von 14C-DXP in IPP in vivo oder in vitro absenkt, kann wiederum als mögliches Herbizid/Antibiotikum des gesamten Weges angesehen werden.
Die Aktivität der DXS kann auch bestimmt werden, indem man z. B. die DXS mit [1-14C]-Pyruvat und GA3P inkubiert und nach Ablauf einer geeigneten Inkubationszeit die Menge des bei der Reaktion freigesetzten 14CO2 bestimmt.
Die Aktivität der DXS kann auch bestimmt werden, indem man z. B. die DXS mit Pyruvat und GA3P inkubiert und nach Ablauf einer geeigneten Inkubationszeit die Menge des bei der Reaktion noch nicht umgesetzten Pyruvats mit Hilfe des Enzyms Lactat Dehydrogenase zu Lactat umsetzt und die Abnahme der Konzentration des bei der Reaktion der Lactat Dehydrogenase als Cosubstrat benötigten reduzierten Nikotinamid-Dinukleotid (NADH) mit einem geeigneten Verfahren, z. B. photometrisch, bestimmt.
Die Aktivität der DXS kann auch bestimmt werden, indem man z. B. die DXS mit Pyruvat und GA3P inkubiert und nach Ablauf einer geeigneten Inkubationszeit die Menge des bei der Reaktion noch nicht umgesetzten GA3P mit Hilfe des Enzyms Glycerinaldehyd-3-phosphat Dehydrogenase zu 1,3-Bisphosphoglycerat umsetzt und die Zunahme der Konzentration der reduzierten Form des bei der Reaktion der Glycerinaldehyd-3-phosphat Dehydrogenase als Cosubstrat benötigten Nikotina­ mid-Dinukleotids mit einem geeigneten Verfahren direkt, z. B. photometrisch, oder nach Kopplung mit der Reduktion von Tetrazoliumverbindungen, bestimmt.
Die Aktivität der DXS kann auch bestimmt werden, indem man z. B. die DXS mit Pyruvat und GA3P inkubiert und entweder nach Ablauf einer geeigneten Inkubationszeit oder in einem gekoppelten enzymatischen Testsystem kontinuierlich die Menge das bei der Reaktion freiwerdende CO2 mit Hilfe des Enzyms Phosphoenolpyruvat Carboxylase zu Oxalacetat umsetzt und die Menge des so gebildeten Oxalacetats mit Hilfe des Enzyms Malat Dehydrogenase zu Malat umsetzt und die Abnahme der Konzentration des bei der Reaktion der Malat Dehydrogenase als Cosubstrat benötigten reduzierten Nikotinamid-Dinukleotid (NADH) mit einem geeigneten Verfahren, z. B. photometrisch, bestimmt.
Die Aktivität der DXS kann auch bestimmt werden, indem man z. B. die DXS mit Pyruvat und GA3P inkubiert und die Teilreaktion der Dekarboxylierung von Pyruvat an die Reduktion von 2,6-Dichlorphenolindophenol koppelt.
Die erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung der effektorischen Wirkung von Testsubstanzen können mit gereinigter DXS durchgeführt werden, aber auch mit ganzen Zellen eines rekombinanten Organismus, welcher die DXS rekombinant exprimiert, mit DXS-haltigen Extrakten aus diesem Organismus oder angereicherten DXS-haltigen Fraktionen aus diesem Organismus. Als bevorzugter rekombinanter Wirtsorganismus seien Bakterien-, Insekten- und Hefezellen genannt. Alternativ kann auch eine aus Pflanzengewebe oder Pflanzenzellkulturen isolierte DXS verwendet werden. Es ist bekannt, daß DXP zu DMAPP/IPP über eine Reihe von Zwischenschritten umgesetzt wird. Die Einzelheiten, also die entstehenden Folgeenzyme sind noch nicht analysiert worden. Es ist jedoch bekannt, daß die Umsetzung über Kinasen, Oxidoreduktasen, Isomerasen und Mutasen erfolgt. Insofern ist zu erwarten, daß die Folgeenzyme ebenfalls Wirkorte für Herbizide und Antibiotika darstellen und ebenfalls als Effektoren fungieren.
Für verschiedene Anwendungen wie z. B. die Herstellung eines o.g. biochemischen Testsystems zur Bestimmung einer Proteinfunktion ist eine wesentliche Voraussetzung, daß das zu untersuchende Protein in funktionsfähigem Zustand und möglichst rein, d. h. frei von störenden Aktivitäten, gewonnen werden kann. Wie bei allen Zellproteinen kann dies im Falle der DXS dadurch geschehen, daß das Enzym mit Hilfe gängiger Verfahren der Proteinreinigung aus den Organismen oder Geweben isoliert wird. In der vorliegenden Erfindung ist dargelegt, daß eine funktionell intakte DXS isoliert werden kann, deren Sequenz beispielhaft für E. coli mit SEQ ID Nr. 1 angegeben ist und mit der Sequenz aus der EMBL Datenbank Acc. No. U 82664 übereinstimmt.
Erfindungsgegenstand ist desweiteren die Verwendung eines Proteins mit der Funktion einer DXS oder ein aktives Fragment daraus zur Identifizierung von Effektoren der DXS.
Die Verwendung der DXS basiert im wesentlichen auf ihrer enzymatischen Aktivität. Die Bereitstellung funktionell intakter DXS ermöglicht sowohl in vitro (z. B. zellfreies Testsystem der DXS) als auch in vivo die Durchführung von biochemischen Reaktionen, beispielsweise in ein- oder mehrzelligen rekombinanten Organsimen oder Zellkulturen, insbesondere Hefen, Bakterien, Algen, Insektenzellen oder Pflanzen.
Diese Reaktionen können einerseits zur Herstellung von 1-Desoxy-D-xylulo­ se-5-phosphat (DXP) oder Folgeprodukten wie z. B. Thiamin, Pyridoxin und Isoprenoide (u. a. Carotinoide, Chlorophylle, Phytole, Lutein, Sterole, Ubichinone/Menachinone/Plastochinone, Dolichol, Naturkautschuk, Paclitaxe/Docetaxel (Handelsnamen Taxol/Taxotere) genutzt werden, andererseits können diese biochemischen Reaktionen dazu verwendet werden, um in einem Testsystem die Wirkung von chemischen Verbindungen oder heterogenen Stoffgemischen in bezug auf die Funktion der DXS zu bestimmen.
Desweiteren kann die gentechnisch hergestellte DXS beispielsweise auch verwendet werden, um die Raumstruktur des Enzyms aufzuklären. Zur Aufklärung der Raumstruktur können allgemein bekannte Verfahren, wie z. B. die Röntgenstrukturanalyse von Proteinkristallen oder NMR-Spektroskopie verwendet werden. Die Strukturinformationen über die DXS, können beispielsweise verwendet werden, um ein rationales Design von neuen Inhibitoren der DXS - und somit potentiellen Herbiziden - durchzuführen.
Erfindungsgegenstand sind auch Effektoren der DXS, identifizierbar durch ein erfindungsgemäßes Verfahren, Effektoren der DXS, die ein Strukturanaloges des Pyruvat, des GA3P oder des DXP sind, insbesondere antibiotisch, pestizid oder herbizid wirksame Effektoren der DXS sowie deren Verwendung als Pestizide, Herbizide oder Antibiotika.
In den nachfolgenden Beispielen, die der näheren Erläuterung der Erfindung dienen und die in keiner Weise eine Einschränkung bedeuten sollen, wurden die folgenden Materialien und Methoden verwendet:
Bakterienstämme und Plasmide
Escherichia coli K 12, W3110 Wildtyp-Stamm (erhältlich von Genetic Stock Center der Yale Universität, U.S.A.) wurde als Ausgangsmaterial für die Gewinnung von chromosomaler DNA verwendet.
Zur Klonierung und Expression von dxs in E. coli DH5 (supE44 ΔlacUI69 (Φ80lacZ ΔM15) hsdRl7 recAl endA1 gyrA96 thi-l relA1) (Hanahan (1983) J. Mol. Biol. 166, 557-580) und E. coli JM 109 (recAll supE44 endAll hsdR17 gyrA96 relA1 thi Δ(lac­ proAB) F' [traD36 proAB+ Iaclq lacZΔM15]) (Yanisch-Perron et al. (1985) Gene 33, 103-119) wurde der Plasmid pUCBM20 (Boehringer Mannheim, BRD) eingesetzt.
Klonierungstechniken
Zur Klonierung (Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Lab. Press. Cold Spring Harbor, NY), PCR-Amplifizierung (Mullis und Faloona, (1987) Meth. Enzymol. 155, 335-350) und Transformation von DNA (Hanahan (1983) J. Mol. Biol. 166, 557-580) wurden im allgemeinen die in den Literaturstellen beschriebenen Standardtechniken verwendet.
Es ist zu erwarten, daß eine veränderte DXS-Aktivität, insbesondere eine Aktivitätserhöhung, zu einer verstärkten Bildung von DXP-Derivaten (z. B. Thiamin oder Pyridoxin) und isoprenoiden Substanzen führt. Hierzu zählen Carotinoide. DXS ist sowohl von Interesse als Wirkort zur Hemmung der IPP-Synthese (Herbizide, Antibiotika). Erfindungsgegenstand ist aber auch eine Erhöhung der DXS-Aktivität und die verstärkte Bildung von DXP-Derivaten wie Thiamin oder Pyridoxin (Vitamine B1 und B6), und vor allem von isoprenoiden Substanzen. Dazu sollen, in möglichst breitem Maße, namentlich aber nicht ausschließlich, beansprucht werden:
Carotinoide, Chlorophylle, Phvtole, Lutein, Sterole, Ubichionine/Menachinone/Plastochinone, Dolichol, Naturkautschuk, Paclitaxel/Docetaxel (Handelnamen Taxol/Taxotère), u. a. kommerziell interessante Verbindungen.
Beispiel 1 Isolierung und Klonierung des dxs-Gens aus E. coli
Das dxs-Gen wurde aus E. coli K12 Wildtyp-Stamm W 3110 mittels Polymerase- Ketten-Reaktion (PCR) unter Verwendung der bekannten E. coli Genomsequenz U 82664 und dem folgenden Primer amplifiziert:
Die PCR-Primern DXSEC05 und DXSEC03 enthalten Restriktionsschnittstellen für die Enzyme EcoRl bzw. Sphl.
Zur Durchführung der PCR wurden jeweils 100 pmol der Primer mit 1,6 ng chromosomaler DNA aus E. coli K-12 Wildtyp Stamm LJ 110 (W31 10) eingesetzt. Nach Denaturieren des DNA-Doppelstranges bei 95°C für 30 Sekunden, folgten 30 Zyklen von jeweils: annealing bei 60°C, Polymerisation bei 72°C und nachfolgender Denaturierung bei 95°C (1 min).
Die Sequenz des PCR-Produkts (SEQ ID Nr. 2) wurde mittels eines A.L.F. Systems (Pharmacia, Freiburg, BRD) bestimmt:
Beispiel 2 Expression des dxs-Gens in E. coli JM 109
Das resultierende 1,9 kb PCR-Fragment mit einer 7 bp strangaufwärts gelegenen Ribosomen-Bindungsstelle (AGG) wurde isoliert und über die EcoRl- und Sphl-Schnittstellen in den Plasmid pUCBM20 (Boehringer Mannheim, BRD) subkloniert. Nach Transformation in E. coli JM109, wurde die Integrität der Plasmide durch Restriktionsanalyse überprüft. Die Expression erfolgte durch den auf dem Plasmid gelegenen lac-Promoter.
Beispiel 3 Reinigung des Enzyms DXS aus rekombinanten E. coli JM 109 Zellen
E. coli JM109 Zellen, die das Plasmid pUCBM20 mit dem inserierten dxs-Gen enthielten, wurden in LB-Medium (insgesamt 9,6 Liter) mit Ampicillin (100 mg/l) bis zu einer optischen Dichte von 0,8 kultiviert und 4 h lang mit Isopropyl-beta-D-thi­ ogalaktosid (IPTG) (0,4 mM) induziert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet, mit 50 mM Tris/HCl, 1 mM Dithiothreitol, 0,5 mM Thiamindiphosphat, 5 mM MgCl2, pH 7,5 (Puffer A) gewaschen, in Puffer A resuspendiert (2,5 ml/g Zellfeuchtgewicht), und durch 3 Passagen in einer French Press aufgeschlossen. Nach Zentrifugation wurde die Zelldebris verworfen und dem Überstand (173 ml) zur Fällung der Proteine 225 g/l NH4SO4 bei 0°C zugesetzt. Das Präzipitat wurde in Puffer A resuspendiert und ultrafiltriert.
Die Probe (63 ml) wurde anschließend auf eine Q-Sepharose HP-Säule (Pharmacia Biotech, Schweden) aufgetragen, mit Puffer A gewaschen, und mittels eines ansteigenden Salzgradienten (0-1 M NaCl in Puffer A) im Bereich zwischen 0,2 und 0,3 M NaCl eluiert.
Die Rohextrakte und (partiell) gereinigtes Enzym wurden mittels des unten beschriebenen Testverfahrens auf ihre enzymatischen Eigenschaften hin untersucht, aus Pyruvat und GA3P DXP zu bilden. Bezogen auf die rekombinanten Zellen, konnte eine ca. 17-fache Anreicherung erzielt werden (Tabelle 1).
Tabelle 1
Im Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidelektrophoresegel (SDS-PAGE) besitzt das gereinigte DXS-Protein ein apparentes Molekulargewicht von ca. 66 kDa (Fig. 3). Die Molmasse von 66 kD stimmt mit der aus der DNA-Sequenz erwarteten Molmasse von 67,6 kD überein.
SDS-PAGE Beispiel 4 Enzymtest der 1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat Synthase
Der Test der enzymatischen Aktivität der 1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat Synthase wurde in Gegenwart von 200 mM Natriumcitrat-Puffer, pH 6,0, 10 mM Pyruvat, 30 mM D,L-Glycerinaldehyd-3-phosphat, 20 mM MgCl2, 1,5 mM Thiamindiphosphat (THDP), 1 mM Dithiothreitol (DTT), 0,4 mM Ethylendiamintetraacetat (EDTA), 1 µCi [2-14C]-Pyruvat und der zu untersuchenden Probe in einem Gesamtvolumen von 50 µl durchgeführt.
Nach einer Inkubationszeit von 1 bis 4 Stunden (h) bei 30°C wurde die Reaktion durch Zugabe von 20%iger Perchlorsäure (5 µl) gestoppt. Der Überstand wurde mit 5 molarer K2CO3 (8 µl) neutralisiert.
Zu einem Aliquot von 5 µl des DXS-Reaktionsüberstandes wurden 15 U alkalische Phosphatase aus Kälberdarm (1,5 µl, Boehringer Mannheim, Nr. 108138) hinzugefügt und 30 min lang bei 30°C inkubiert. Das Reaktionsprodukt, DXP, wurde nach Dephosphorylierung durch Behandlung mit alkalischer Phosphatase als 1-Desoxy-D-xylulose auf einer Aminex HPX-87H (300 × 7.8 cm) HPLC-Säule (Bio- Rad Laboratories GmbH, München, BRD) nachgewiesen, indem die Lösung anschließend auf eine Aminex HPX-87H HPLC-Säule aufgetragen und mit 6 mM H2SO4 bei einer Temperatur von 65°C nach Herstellerangaben eluiert wurde.
Der Nachweis des DXP und der 1-Desoxy-D-xylulose erfolgte durch einen in Reihe geschlossenen UV-Monitor (185 nm) und einen Radiomonitor (Berthold LB506C). 1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat eluierte im Ausschlußvolumen der Säule. Die Konzentration und Signalpositionen wurden mittels chemisch synthetisierter Standards der jeweiligen 1-Desoxy-Xylulose-Derivate (von T. Begley, Cornell University, New York, USA) bestimmt.
1 Unit (U) der enzymatischen Aktivität der DXS wurde als die Bildung von 1 µmol/min DXP bei einer Temperatur von 30°C definiert.
Durch Dialyse gegen einen Puffer ohne Thiamindiphosphat (THDP) verlor das Enzym seine Aktivität. Die Aktivität konnte jedoch zu mehr als 50% rekonstituiert werden, wenn THDP hinzugefügt wurde. Das Enzym zeigte insofern eine reversible, Thiamindiphosphat-abhängige Aktivität.
Beispiel 5 Identifizierung des Reaktionsprodukts DXP
Pyruvat und GA3P wurden in Gegenwart von gereinigter DXS unter den in Beispiel 4 genannten Reaktionsbedingungen umgesetzt. Ein hochauflösendes 1H-NMR-Spek­ trum bei 400,13 MHz bzw. ein 31P-NMR-Spektrum bei 161.97 MHz wurden an einem AMX-400 WB Spektrometer (Bruker, Karlsruhe, BRD) aufgenommen und ergab für DXP: 5,47 (d, 1,9 Hz, 1H); 4,38 (td, 6,5 Hz, 1,9 Hz, 1H); 3,90 (dd, 6,5 Hz,7,3 Hz, 2H); 2,34 (s, 3H).
Diese Ergebnisse stimmten mit den NMR-Daten von chemisch synthetisiertem 1-Des­ oxy-D-xylulose-5-phosphat (DXP) überein.
Beispiel 6 Inhibition der 1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat Synthase
Die gemäß Beispiel 3 gereinigte DXS (von T. Begley, Cornell University, New York, USA) wurde auf seine in vitro Aktivität wie in Beispiel 4 beschrieben getestet. Die gemessene relative Aktivität des Ansatzes in Abwesenheit von Testsubstanzen wurde in Gegenwart von 1, 2 und 10 mM Pyruvat mit 100% festgelegt. Nach Zusatz des Pyruvatanalogen (jeweils 10 mM) wurde die verbliebene Aktivität der DXS in Gegenwart des Kompetitors ermittelt (Tabelle 2).
Tabelle 2
Inhibition der DXS durch Strukturanaloge des Pyruvat
SEQUENZPROTOKOLL

Claims (13)

1. Isoliertes Protein, gekennzeichnet durch die Funktion einer DXS oder ein aktives Fragment daraus.
2. Verfahren zur Herstellung eines Proteins mit der Funktion einer DXS oder eines aktiven Fragments daraus in einer rekombinanten Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, daß man
  • a) ein Nukleinsäuremolekül kodierend für ein Protein mit der Funktion einer DXS oder eines aktiven Fragments daraus in eine für eine Wirtszelle geeignete Expressionskassette inseriert;
  • b) die so erhaltene Expressionskassette in geeigneter Weise in einen für die Wirtszelle geeigneten Vektor inseriert;
  • c) eine geeignete Wirtszelle mit dem so erhaltenen Vektor transformiert;
  • d) die so transformierte Wirtszelle in einem geeigneten Medium kultiviert; und
  • e) das von besagter Wirtszelle produzierte Protein mit der Funktion einer DXS oder das aktive Fragment daraus in geeigneter Weise aus dem Kulturmedium oder der Wirtszelle isoliert.
3. Isoliertes Protein mit der Funktion einer DXS oder ein aktives Fragment daraus, herstellbar nach einem Verfahren gemäß Anspruch 2.
4. Verfahren zur Identifizierung von Effektoren der DXS, worin man
  • a) die enzymatische Aktivität der DXS in Abwesenheit einer Testsubstanz bestimmt;
  • b) die enzymatische Aktivität der DXS in Anwesenheit besagter Testsubstanz bestimmt; und
  • c) die unter a) und b) ermittelten enzymatischen Aktivitäten miteinander vergleicht.
5. Verwendung eines Proteins mit der Funktion einer DXS oder eines aktives Fragments daraus zur Identifizierung von Effektoren der DXS.
6. Verwendung eines Verfahrens gemäß Anspruch 4 zur Identifizierung von Effektoren der DXS.
7. Verwendung gemäß Anspruch 6 in einem automatisierten Testsystem.
8. Effektor der DXS, identifizierbar durch ein Verfahren gemäß Anspruch 4.
9. Effektor der DXS, der ein Strukturanloges des Pyruvats, des GA3P oder des DXP ist.
10. Pestizid wirksamer Effektor gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 8 und 9.
11. Antibakteriell wirksamer Effektor gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 8 und 9.
12. Herbizid wirksamer Effektor gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 8 und 9.
13. Verwendung eines Effektors gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 8 bis 12 als Pestizid, Herbizid oder Antibiotikum.
DE19752700A 1997-11-28 1997-11-28 1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat Synthase, Verfahren zur Identifizierung von Effektoren der 1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat Synthase und Effektoren der 1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat Synthase Withdrawn DE19752700A1 (de)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19752700A DE19752700A1 (de) 1997-11-28 1997-11-28 1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat Synthase, Verfahren zur Identifizierung von Effektoren der 1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat Synthase und Effektoren der 1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat Synthase
CA002219271A CA2219271A1 (en) 1997-11-28 1997-12-23 1-deoxy-d-xylulose 5-phosphate synthase, a process for identifying effectors of 1-deoxy-d-xylulose 5-phosphate synthase and effectors of 1-deoxy-d-xylulose 5-phosphate synthase
JP10039499A JPH11169186A (ja) 1997-11-28 1998-01-16 １−デオキシ−ｄ−キシルロース５−ホスフェートシンターゼ、１−デオキシ−ｄ−キシルロース５−ホスフェートシンターゼのエフェクターの同定方法及び１−デオキシ−ｄ−キシルロース５−ホスフェートシンターゼのエフェクター
DE29800547U DE29800547U1 (de) 1997-11-28 1998-01-16 1-Desoxy-D-xylose-5-phosphat Synthase und Effektoren der 1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat Synthase
CA 2228170 CA2228170A1 (en) 1997-11-28 1998-01-29 1-deoxy-d-xylulose 5-phosphate synthase, a process for identifying effectors of 1-deoxy-d-xylulose 5-phosphate synthase and effectors of 1-deoxy-d-xylulose 5-phosphate synthase

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19752700A DE19752700A1 (de) 1997-11-28 1997-11-28 1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat Synthase, Verfahren zur Identifizierung von Effektoren der 1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat Synthase und Effektoren der 1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat Synthase

Publications (1)

Publication Number Publication Date
DE19752700A1 true DE19752700A1 (de) 1999-06-02

Family

ID=7850045

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE19752700A Withdrawn DE19752700A1 (de) 1997-11-28 1997-11-28 1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat Synthase, Verfahren zur Identifizierung von Effektoren der 1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat Synthase und Effektoren der 1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat Synthase
DE29800547U Expired - Lifetime DE29800547U1 (de) 1997-11-28 1998-01-16 1-Desoxy-D-xylose-5-phosphat Synthase und Effektoren der 1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat Synthase

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE29800547U Expired - Lifetime DE29800547U1 (de) 1997-11-28 1998-01-16 1-Desoxy-D-xylose-5-phosphat Synthase und Effektoren der 1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat Synthase

Country Status (3)

Country Link
JP (1) JPH11169186A (de)
CA (1) CA2219271A1 (de)
DE (2) DE19752700A1 (de)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999052938A2 (de) * 1998-04-14 1999-10-21 Jomaa Hassan Identifizierung chemischer wirkstoffe zur hemmung des 1-desoxy-d-xylulose-5-phosphat-biosynthesewegs in parasiten
WO2000008169A1 (de) * 1998-08-05 2000-02-17 Sungene Gmbh & Co.Kgaa Dna-sequenz kodierend für eine 1-deoxy-d-xylulose-5-phosphat synthase und deren überproduktion in pflanzen
WO2000017233A2 (de) * 1998-09-22 2000-03-30 Jomaa Pharmaka Gmbh Gene des 1-desoxy-d-xylulose-biosynthesewegs
WO2000036138A1 (en) * 1998-12-14 2000-06-22 Adelbert Bacher Screening for inhibitors of terpenoids biosynthesis
WO2000072022A1 (de) * 1999-05-21 2000-11-30 Jomaa Pharmaka Gmbh Verwendung von genen des desoxy-d-xylulose-phosphatbiosynthesewegs zur veränderung der isoprenoidkonzentration
GB2430200A (en) * 2005-09-16 2007-03-21 Bridgestone Corp A gene cluster involved in biosynthesis of isopentenyl diphosphate by the non-mevalonate pathway of Hevea brasiliensis
EP2175025A1 (de) * 1998-04-14 2010-04-14 Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. Verfahren zur Herstellung von Isoprenoidverbindungen durch Mikroorganismen

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9901902D0 (en) * 1999-01-28 1999-03-17 New Royal Holloway & Bedford Manipulating isoprenoid expression
WO2001009341A2 (en) * 1999-07-30 2001-02-08 Bayer Aktiengesellschaft Method of determining the activity of 1-deoxy-d-xylulose-5-phosphate reductoisomerase and 1-deoxy-d-xylulose-5-phosphate synthase
AU6280300A (en) 1999-08-04 2001-03-05 Adelbert Bacher Isoprenoid biosynthesis
DE10027821A1 (de) 2000-06-05 2001-12-06 Adelbert Bacher Der Mevalonat-unabhängige Isoprenoidbiosyntheseweg
DE10201458A1 (de) 2001-04-11 2002-10-17 Adelbert Bacher Intermediate und Enzyme des Mevalonat-unabhängigen Isoprenoidbiosyntheseweg

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999052938A2 (de) * 1998-04-14 1999-10-21 Jomaa Hassan Identifizierung chemischer wirkstoffe zur hemmung des 1-desoxy-d-xylulose-5-phosphat-biosynthesewegs in parasiten
WO1999052938A3 (de) * 1998-04-14 1999-12-09 Hassan Jomaa Identifizierung chemischer wirkstoffe zur hemmung des 1-desoxy-d-xylulose-5-phosphat-biosynthesewegs in parasiten
EP2175025A1 (de) * 1998-04-14 2010-04-14 Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. Verfahren zur Herstellung von Isoprenoidverbindungen durch Mikroorganismen
WO2000008169A1 (de) * 1998-08-05 2000-02-17 Sungene Gmbh & Co.Kgaa Dna-sequenz kodierend für eine 1-deoxy-d-xylulose-5-phosphat synthase und deren überproduktion in pflanzen
WO2000017233A2 (de) * 1998-09-22 2000-03-30 Jomaa Pharmaka Gmbh Gene des 1-desoxy-d-xylulose-biosynthesewegs
WO2000017233A3 (de) * 1998-09-22 2000-05-25 Hassan Jomaa Gene des 1-desoxy-d-xylulose-biosynthesewegs
WO2000036138A1 (en) * 1998-12-14 2000-06-22 Adelbert Bacher Screening for inhibitors of terpenoids biosynthesis
WO2000072022A1 (de) * 1999-05-21 2000-11-30 Jomaa Pharmaka Gmbh Verwendung von genen des desoxy-d-xylulose-phosphatbiosynthesewegs zur veränderung der isoprenoidkonzentration
GB2430200A (en) * 2005-09-16 2007-03-21 Bridgestone Corp A gene cluster involved in biosynthesis of isopentenyl diphosphate by the non-mevalonate pathway of Hevea brasiliensis
US7803985B2 (en) 2005-09-16 2010-09-28 Bridgestone Corporation Gene cluster involved in biosynthesis of isopentenyl diphosphate in the non-mevalonate pathway of Hevea brasiliensis
US8921654B2 (en) 2005-09-16 2014-12-30 Bridgestone Corporation Gene cluster involved in biosynthesis of isopentenyl diphosphate in the non-mevalonate pathway of Hevea brasiliensis

Also Published As

Publication number Publication date
DE29800547U1 (de) 1999-04-08
JPH11169186A (ja) 1999-06-29
CA2219271A1 (en) 1999-05-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2245152B1 (de) Stabilisierung von dehydrogenasen mit stabilen coenzymen
Martins et al. In situ analysis of methylglyoxal metabolism in Saccharomyces cerevisiae
DE19752700A1 (de) 1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat Synthase, Verfahren zur Identifizierung von Effektoren der 1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat Synthase und Effektoren der 1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat Synthase
EP0796914A2 (de) Alkohol-Dehydrogenase und deren Verwendung zur enzymatischen Herstellung chiraler Hydroxy-verbindungen
EP1285962B1 (de) NADH-Oxidase aus Lactobacillus
DE19960106A1 (de) Enzyme und Gene für die Herstellung von Vanillin
DE112012002557B4 (de) Verfahren zur Herstellung von 2-Keto-L-Gulonsäure
DE19935967A1 (de) Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von 1-Desoxy-D-Xylulose-5-Phosphat-Reduktionsomerase und 1-Desoxy-D-Xylulose-5-Phosphat-Synthase
EP1570066A2 (de) Feedback-resistente homoserin-transsuccinylasen mit modifiziertem c-terminus
DE69332146T2 (de) Morphinone reduktase zur herstellung von hydromorphone und hydrocodone
DE69125541T2 (de) Verfahren zur enzymatischen Herstellung von 7-Aminocephalosporinsäure
DE19717656A1 (de) DNA-Sequenzen kodierend für die Untereinheit CHLD pflanzlicher Magnesium-Chelatasen, sowie Verfahren zur Aktivitätsbestimmung pflanzlicher Magnesium-Chelatasen
DE10247437A1 (de) Feedback-resistente Homoserin-Transsuccinylasen
EP1767644A1 (de) Mikrobielle Stämme zur Produktion von Sphingosin
EP0372332B1 (de) Mikrobiologisch hergestellte Diacetyl-Reduktase, Verfahren zu ihrer Gewinnung und ihre Verwendung
EP1612276A1 (de) Verfahren zum Identifizieren von fungizid wirksamen Verbindungen basierend auf Thymidylat-Kinasen
WO2002048321A2 (de) Verwendung von acetyl-coa carboxylase zum identifizieren von insektizid wirksamen verbindungen
Kumar et al. An LC-MS/MS assay for enzymatic characterization of methylthioalkylmalate synthase (MAMS) involved in glucosinolate biosynthesis
DE10114999A1 (de) D-Carbamoylase aus Arthrobacter crystallopoietes DSM 20117
DE60309830T2 (de) Verfahren zur herstellung von chiralen aromatischen alpha-hydroxy-ketonen unter verwendung einer 2-hydroxy-3-oxosäure-synthase
EP1319715B1 (de) IMP Dehydrogenase und deren Verwendung zum Identifizieren von fungizid wirksamen Verbindungen
CA2228170A1 (en) 1-deoxy-d-xylulose 5-phosphate synthase, a process for identifying effectors of 1-deoxy-d-xylulose 5-phosphate synthase and effectors of 1-deoxy-d-xylulose 5-phosphate synthase
DE10242940A1 (de) Verfahren zum Identifizieren von fungizid wirksamen Verbindungen
DE602004003489T2 (de) Hybrid topoisomerasen und ihre verwendung
EP0474116B1 (de) Stabile 6-Phosphogluconolactonase, Verfahren zu deren Gewinnung sowie Verwendung des Enzyms

Legal Events

Date Code Title Description
8130 Withdrawal