JPH11169186A - １−デオキシ−ｄ−キシルロース５−ホスフェートシンターゼ、１−デオキシ−ｄ−キシルロース５−ホスフェートシンターゼのエフェクターの同定方法及び１−デオキシ−ｄ−キシルロース５−ホスフェートシンターゼのエフェクター - Google Patents
１−デオキシ−ｄ−キシルロース５−ホスフェートシンターゼ、１−デオキシ−ｄ−キシルロース５−ホスフェートシンターゼのエフェクターの同定方法及び１−デオキシ−ｄ−キシルロース５−ホスフェートシンターゼのエフェクターInfo
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 １−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−ホスフ
ェートとその製造方法及びＤＸＳの使用によるＤＸＳエ
フェクターを確認する方法の確立。 【解決手段】 ＤＸＳの機能を有するタンパク質又はそ
の活性断片をコード化する核酸分子を宿主細胞にとって
適当な発現カセット中に挿入し、得られる発現カセット
を適当な方法で宿主細胞にとって適当なベクターに挿入
し、得られるベクターで適当な宿主細胞を変換し、この
ように変換された宿主細胞を適当な培地で培養し、そし
て前記宿主細胞によって生産されるＤＸＳの機能を有す
るタンパク質又はその活性断片を培養培地又は宿主細胞
から適当な方法で単離することからなる組換え体宿主細
胞におけるＤＸＳの機能を有するタンパク質又はその活
性断片の製造方法。試験物質の不在下でＤＸＳの酵素活
性を測定し、前記試験物質の存在下でＤＸＳの酵素活性
を測定し、そして確認された酵素活性を比較することか
らなるＤＸＳエフェクターを確認する方法。
ェートとその製造方法及びＤＸＳの使用によるＤＸＳエ
フェクターを確認する方法の確立。 【解決手段】 ＤＸＳの機能を有するタンパク質又はそ
の活性断片をコード化する核酸分子を宿主細胞にとって
適当な発現カセット中に挿入し、得られる発現カセット
を適当な方法で宿主細胞にとって適当なベクターに挿入
し、得られるベクターで適当な宿主細胞を変換し、この
ように変換された宿主細胞を適当な培地で培養し、そし
て前記宿主細胞によって生産されるＤＸＳの機能を有す
るタンパク質又はその活性断片を培養培地又は宿主細胞
から適当な方法で単離することからなる組換え体宿主細
胞におけるＤＸＳの機能を有するタンパク質又はその活
性断片の製造方法。試験物質の不在下でＤＸＳの酵素活
性を測定し、前記試験物質の存在下でＤＸＳの酵素活性
を測定し、そして確認された酵素活性を比較することか
らなるＤＸＳエフェクターを確認する方法。
Description
【０００１】本発明は１−デオキシ−Ｄ−キシルロース
５−ホスフェートシンターゼ（ＤＸＳ）、ＤＸＳの製造
方法、ＤＸＳの使用、ＤＸＳエフェクターの同定方法及
びＤＸＳエフェクターに関する。
５−ホスフェートシンターゼ（ＤＸＳ）、ＤＸＳの製造
方法、ＤＸＳの使用、ＤＸＳエフェクターの同定方法及
びＤＸＳエフェクターに関する。
【０００２】イソプレノイドは天然物質の極めて広範な
種類を代表し、そして多数の必須の化合物例えばカロテ
ノイド、ステロイド、プレニルキノン側鎖又はクロロフ
ィルのフィトール残基（Coolbear & Threlfall, (1989
年) (Biosynthesis of terpenoid lipids, Ratledge &
Wilkinson編, (Academic Press), 115-254ページに所
載）；Bach, T.J. (1995年), Lipids, 30巻, 191-202ペ
ージを包含する。
種類を代表し、そして多数の必須の化合物例えばカロテ
ノイド、ステロイド、プレニルキノン側鎖又はクロロフ
ィルのフィトール残基（Coolbear & Threlfall, (1989
年) (Biosynthesis of terpenoid lipids, Ratledge &
Wilkinson編, (Academic Press), 115-254ページに所
載）；Bach, T.J. (1995年), Lipids, 30巻, 191-202ペ
ージを包含する。
【０００３】すべてのイソプレノイドのＣ５親物質であ
るイソペンテニルジホスフェート（ＩＰＰ）の生合成は
アセテート／メバロネート経路（asetate/mevalonate p
athway）を経て行われると仮定されている（Banthorpe
等，（1972年），Chem. Rev.,72巻，115-155ページ；Be
yia & Porter, (1976年), Annu. Rev. Biochem., 45巻,
113-142ページ）。
るイソペンテニルジホスフェート（ＩＰＰ）の生合成は
アセテート／メバロネート経路（asetate/mevalonate p
athway）を経て行われると仮定されている（Banthorpe
等，（1972年），Chem. Rev.,72巻，115-155ページ；Be
yia & Porter, (1976年), Annu. Rev. Biochem., 45巻,
113-142ページ）。
【０００４】最近、アセテート／メバロネート経路の代
替経路であるＩＰＰ合成の代謝経路の存在が細菌、藻類
及び植物で行った13Ｃ標識実験により証明された（Rohm
er等, (1993年), Biochem. J., 295巻, 517-524ペー
ジ；Rohmer等, (1996年), J. Am. Chem. Soc., 118巻,
2564-2566ページ）。チアミンジホスフェート依存性反
応においてピルベート及びグリセルアルデヒド３−ホス
フェート（ＧＡ３Ｐ）から合成される１−デオキシ−Ｄ
−キシルロース５−ホスフェート（ＤＸＰ）はイソプレ
ノイド生合成のこの代替経路における最初の中間物質と
仮定されている。
替経路であるＩＰＰ合成の代謝経路の存在が細菌、藻類
及び植物で行った13Ｃ標識実験により証明された（Rohm
er等, (1993年), Biochem. J., 295巻, 517-524ペー
ジ；Rohmer等, (1996年), J. Am. Chem. Soc., 118巻,
2564-2566ページ）。チアミンジホスフェート依存性反
応においてピルベート及びグリセルアルデヒド３−ホス
フェート（ＧＡ３Ｐ）から合成される１−デオキシ−Ｄ
−キシルロース５−ホスフェート（ＤＸＰ）はイソプレ
ノイド生合成のこの代替経路における最初の中間物質と
仮定されている。
【０００５】ＤＸＳはこの代替経路の、非メバロネート
依存イソプレノイド生合成経路、すなわちピルベート及
びグリセルアルデヒド３−ホスフェート（ＧＡ３Ｐ）か
らの１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−ホスフェート
（ＤＸＰ）の合成の最初の反応段階を触媒する。ＤＸＰ
及び１−デオキシ−Ｄ−キシルロース（ＤＯＸ）はチア
ミン（ビタミンＢ1）及びピリドキソール（ビタミン
Ｂ6）の生合成にも関与する（Hill等, (1996年), J. Bi
ol. Chem., 271巻, 30426-30435ページ；Himmeldirk等,
(1996年),Chem.Commun., 1187-1188ページ）。
依存イソプレノイド生合成経路、すなわちピルベート及
びグリセルアルデヒド３−ホスフェート（ＧＡ３Ｐ）か
らの１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−ホスフェート
（ＤＸＰ）の合成の最初の反応段階を触媒する。ＤＸＰ
及び１−デオキシ−Ｄ−キシルロース（ＤＯＸ）はチア
ミン（ビタミンＢ1）及びピリドキソール（ビタミン
Ｂ6）の生合成にも関与する（Hill等, (1996年), J. Bi
ol. Chem., 271巻, 30426-30435ページ；Himmeldirk等,
(1996年),Chem.Commun., 1187-1188ページ）。
【０００６】これに加えて、大腸菌のｄｘｓ遺伝子のク
ローニング及び特徴づけ（学術用語より）並びに大腸菌
におけるｄｘｓ遺伝子生産物の過剰生産に関する報告が
なされている（Lois等, (1997年), Abstracts 3rd Terp
net Meeting on Plant Isoprenoids, 16ページ, Univer
site de Poitiers,France）。ＤＸＰの形成は無細胞抽
出液を使用して証明された。
ローニング及び特徴づけ（学術用語より）並びに大腸菌
におけるｄｘｓ遺伝子生産物の過剰生産に関する報告が
なされている（Lois等, (1997年), Abstracts 3rd Terp
net Meeting on Plant Isoprenoids, 16ページ, Univer
site de Poitiers,France）。ＤＸＰの形成は無細胞抽
出液を使用して証明された。
【０００７】大腸菌ＤＸＳ酵素は、例えばピルベート脱
炭酸酵素、アセトラクテートシンターゼ又はトランスケ
トラーゼのような他の酵素で知られているようにチアミ
ンジホスフェート結合部位を有すると仮定されている。
炭酸酵素、アセトラクテートシンターゼ又はトランスケ
トラーゼのような他の酵素で知られているようにチアミ
ンジホスフェート結合部位を有すると仮定されている。
【０００８】アミノ酸レベルで実行された配列比較によ
り、従来知られていなかった機能の遺伝子生産物との相
同性はＤＸＳ機能が下記のオープンリーディングフレー
ム（ＯＲＦ）に帰することができるとする程度まで証明
された：大腸菌（EMBL Acc.No.U82664，Bp17765〜1962
7）、インフルエンザ菌（SwissProt Acc. No. P4520
5）、枯草菌（SwissProt Acc．No．P54523）、ロドバク
ターカプスラツス（SwissProt Acc．No．P26242）、シ
ネコシスチス・sp．PCC6803（GenBank Acc．No．D9090
3）、癩菌（Acc．No．P46708）、結核菌（Acc．No．Z96
072）、ヘリコバクターピロリ（Acc．No．AE000552），
メタノコッカスジャンナシイ（Acc．No．G64384）及び
アラビドプシスタリアナからのCLA1（又はDef）遺伝子
（GenBank Acc．No．U27099；Mandel等, (1996年), The
Plant Journal, 9巻, 649-658ページ）。
り、従来知られていなかった機能の遺伝子生産物との相
同性はＤＸＳ機能が下記のオープンリーディングフレー
ム（ＯＲＦ）に帰することができるとする程度まで証明
された：大腸菌（EMBL Acc.No.U82664，Bp17765〜1962
7）、インフルエンザ菌（SwissProt Acc. No. P4520
5）、枯草菌（SwissProt Acc．No．P54523）、ロドバク
ターカプスラツス（SwissProt Acc．No．P26242）、シ
ネコシスチス・sp．PCC6803（GenBank Acc．No．D9090
3）、癩菌（Acc．No．P46708）、結核菌（Acc．No．Z96
072）、ヘリコバクターピロリ（Acc．No．AE000552），
メタノコッカスジャンナシイ（Acc．No．G64384）及び
アラビドプシスタリアナからのCLA1（又はDef）遺伝子
（GenBank Acc．No．U27099；Mandel等, (1996年), The
Plant Journal, 9巻, 649-658ページ）。
【０００９】配列データベースについてさらに研究した
結果、種々の生物からのＤＸＳタンパク質及びトランス
ケトラーゼ類似酵素（例えばＥＣ２.２.１.１）及びピ
ルベート脱水素酵素複合体のＥ１タンパク質（ＰＤＨ，
ＥＣ１.２.４.１）の間に相同性の存在することが示さ
れた。しかしながら、ＤＸＳタンパク質は通常細菌トラ
ンスケトラーゼより小さい。
結果、種々の生物からのＤＸＳタンパク質及びトランス
ケトラーゼ類似酵素（例えばＥＣ２.２.１.１）及びピ
ルベート脱水素酵素複合体のＥ１タンパク質（ＰＤＨ，
ＥＣ１.２.４.１）の間に相同性の存在することが示さ
れた。しかしながら、ＤＸＳタンパク質は通常細菌トラ
ンスケトラーゼより小さい。
【００１０】１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−ホス
フェートシンターゼの機能を有するタンパク質をコード
化する核酸配列又は核酸分子は「ｄｘｓ」で表し、そし
て１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−ホスフェートシ
ンターゼの機能を有するアミノ酸配列又はタンパク質は
「ＤＸＳ」で表す。驚くべきことに、今回ＤＸＳの機能
を有する酵素は農薬、特に除草性化合物又は抗生物質作
用を有する化合物を開発するための新規で極めて特別な
目標を有することが見出された。
フェートシンターゼの機能を有するタンパク質をコード
化する核酸配列又は核酸分子は「ｄｘｓ」で表し、そし
て１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−ホスフェートシ
ンターゼの機能を有するアミノ酸配列又はタンパク質は
「ＤＸＳ」で表す。驚くべきことに、今回ＤＸＳの機能
を有する酵素は農薬、特に除草性化合物又は抗生物質作
用を有する化合物を開発するための新規で極めて特別な
目標を有することが見出された。
【００１１】従って、本発明は大腸菌、インフルエンザ
菌、枯草菌、ロドバクターカプスラツス、シネコシスチ
ス・sp．PCC6803、癩菌、結核菌、ヘリコバクターピロ
リ、メタノコッカスジャンナシイ及びアラビドプシスタ
リアナからのＤＸＳからなる群より好ましくは選ばれる
ＤＸＳの機能を有する単離されたタンパク質又はその活
性断片に関する。本発明は除草剤又は抗生物質のための
作用部位として使用する上述のＤＸＳにも関する。
菌、枯草菌、ロドバクターカプスラツス、シネコシスチ
ス・sp．PCC6803、癩菌、結核菌、ヘリコバクターピロ
リ、メタノコッカスジャンナシイ及びアラビドプシスタ
リアナからのＤＸＳからなる群より好ましくは選ばれる
ＤＸＳの機能を有する単離されたタンパク質又はその活
性断片に関する。本発明は除草剤又は抗生物質のための
作用部位として使用する上述のＤＸＳにも関する。
【００１２】本発明はさらに組換え体宿主細胞中におけ
るＤＸＳの機能を有するタンパク質又はその活性断片の
製造方法に関し、この方法はＤＸＳの機能を有するタン
パク質又はその活性断片をコード化する核酸分子を宿主
細胞にとって適当な発現カセット中に挿入し、得られる
発現カセットを適当な方法で宿主細胞にとって適当なベ
クターに挿入し、得られるベクターで適当な宿主細胞を
変換し、このように変換された宿主細胞を適当な培地で
培養し、そして前記宿主細胞によって生産されるＤＸＳ
の機能を有するタンパク質又はその活性断片を培養培地
及び／又は宿主細胞から適当な方法で単離することから
なる。
るＤＸＳの機能を有するタンパク質又はその活性断片の
製造方法に関し、この方法はＤＸＳの機能を有するタン
パク質又はその活性断片をコード化する核酸分子を宿主
細胞にとって適当な発現カセット中に挿入し、得られる
発現カセットを適当な方法で宿主細胞にとって適当なベ
クターに挿入し、得られるベクターで適当な宿主細胞を
変換し、このように変換された宿主細胞を適当な培地で
培養し、そして前記宿主細胞によって生産されるＤＸＳ
の機能を有するタンパク質又はその活性断片を培養培地
及び／又は宿主細胞から適当な方法で単離することから
なる。
【００１３】この点で、本発明は組換え体経路による精
製されたＤＸＳの製造方法に関する。例えば宿主生物中
で組換えＤＸＳを生産するため、ＤＸＳコード化ＤＮＡ
配列を選択された宿主生物において構造遺伝子の異種発
現に適当な発現カセット中にクローニングすることがで
きる。
製されたＤＸＳの製造方法に関する。例えば宿主生物中
で組換えＤＸＳを生産するため、ＤＸＳコード化ＤＮＡ
配列を選択された宿主生物において構造遺伝子の異種発
現に適当な発現カセット中にクローニングすることがで
きる。
【００１４】次のＤＸＳコード化ＤＮＡ配列が例えばこ
の目的に適しており、すなわち微生物又は植物のｄｘｓ
ｃＤＮＡ、配列が最近の方法で変更された植物のｄｘ
ｓｃＤＮＡ、及び微生物又は植物のｄｘｓ ｃＤＮＡか
ら誘導され、活性ＤＸＳ又はその活性断片を発現するこ
とが可能な合成ＤＮＡ配列、特に上述の大腸菌、インフ
ルエンザ菌、枯草菌、ロドバクターカプスラツス、シネ
コシスチス・ｓｐ．ＰＣＣ６８０３、癩菌、結核菌、ヘ
リコバクターピロリ、メタノコッカスジャンナシイ及び
アラビドプシスタリアナからのＤＸＳコード化配列であ
る。ＤＸＳコード化ＤＮＡ配列は選択マーカーとして、
例えば除草剤耐性マーカーとして使用することができ
る。
の目的に適しており、すなわち微生物又は植物のｄｘｓ
ｃＤＮＡ、配列が最近の方法で変更された植物のｄｘ
ｓｃＤＮＡ、及び微生物又は植物のｄｘｓ ｃＤＮＡか
ら誘導され、活性ＤＸＳ又はその活性断片を発現するこ
とが可能な合成ＤＮＡ配列、特に上述の大腸菌、インフ
ルエンザ菌、枯草菌、ロドバクターカプスラツス、シネ
コシスチス・ｓｐ．ＰＣＣ６８０３、癩菌、結核菌、ヘ
リコバクターピロリ、メタノコッカスジャンナシイ及び
アラビドプシスタリアナからのＤＸＳコード化配列であ
る。ＤＸＳコード化ＤＮＡ配列は選択マーカーとして、
例えば除草剤耐性マーカーとして使用することができ
る。
【００１５】特定の調節配列、例えばプロモーター、オ
ペレーター配列、エンハンサー、ターミネーター、シグ
ナル配列、５′−未翻訳及び３′−未翻訳配列、又は適
当な融合タンパク質をコード化する配列を発現カセット
に導入することも望ましいことがあり得る。そのような
調節配列を使用することは一般に是認されている技法で
あり、この技法は発現戦略によって広範に変更すること
が可能である。
ペレーター配列、エンハンサー、ターミネーター、シグ
ナル配列、５′−未翻訳及び３′−未翻訳配列、又は適
当な融合タンパク質をコード化する配列を発現カセット
に導入することも望ましいことがあり得る。そのような
調節配列を使用することは一般に是認されている技法で
あり、この技法は発現戦略によって広範に変更すること
が可能である。
【００１６】ｄｘｓ構造遺伝子の適当なリーディングフ
レームの中の必要な調節要素を備えた得られるｄｘｓ発
現カセットは発現ベクターに挿入され、そこでこのベク
ターは選択した宿主生物を変換するために使用すること
ができる。組換えタンパク質を作るための適当な発現戦
略及び対応する発現ベクターは大腸菌、酵母及び昆虫細
胞のような宿主生物の場合、一般に既知である。ｄｘｓ
発現カセットによる安定な又は一時的な変換により得ら
れる組換え体生物は組換えＤＸＳを精製した又は部分的
に精製した形で得るため又はＤＸＳを含有する細胞画分
を得るために使用することができる。適当な場合、組換
え体生物が分析試験系の直接の成分、すなわち細胞成分
であってもよい。
レームの中の必要な調節要素を備えた得られるｄｘｓ発
現カセットは発現ベクターに挿入され、そこでこのベク
ターは選択した宿主生物を変換するために使用すること
ができる。組換えタンパク質を作るための適当な発現戦
略及び対応する発現ベクターは大腸菌、酵母及び昆虫細
胞のような宿主生物の場合、一般に既知である。ｄｘｓ
発現カセットによる安定な又は一時的な変換により得ら
れる組換え体生物は組換えＤＸＳを精製した又は部分的
に精製した形で得るため又はＤＸＳを含有する細胞画分
を得るために使用することができる。適当な場合、組換
え体生物が分析試験系の直接の成分、すなわち細胞成分
であってもよい。
【００１７】この場合、用語「組換え体生物」はインビ
トロで変更され又は組み込まれたＤＮＡにより変化させ
た生物の細胞、例えば組換え体酵母、細菌、藻類、昆虫
又は植物の細胞と理解すべきである。
トロで変更され又は組み込まれたＤＮＡにより変化させ
た生物の細胞、例えば組換え体酵母、細菌、藻類、昆虫
又は植物の細胞と理解すべきである。
【００１８】好ましい発現系の例は大腸菌を宿主生物と
して使用する系である。プロモーターのような適当な発
現シグナル、及び耐性遺伝子又は栄養素要求性を補う遺
伝子のような適当な選択マーカーを担持するすべてのベ
クターをベクターとして使用することができる。
して使用する系である。プロモーターのような適当な発
現シグナル、及び耐性遺伝子又は栄養素要求性を補う遺
伝子のような適当な選択マーカーを担持するすべてのベ
クターをベクターとして使用することができる。
【００１９】組換え体により作られたＤＸＳは種々の方
法を使用して精製することができる。方法の適性は各々
の場合使用する宿主生物、発現戦略及びその他の要因次
第であり、これは組換えタンパク質の発現及び精製の経
験を積んだ熟練した技術者には既知のことである。その
精製のため、組換えタンパク質は発現カセット中のその
遺伝子配列を適当に変更することによりペプチド配列と
融合させることができる。Ｃ末端又はＮ末端融合として
組換えＤＸＳに特定のカラム物質に対する親和性を付与
するペプチド又はタンパク質が融合パートナーとして使
用するのが好ましい。これらの融合はＤＸＳの機能に影
響してはならず、又は例えば適当なプロテアーゼ解裂部
位を組み込むことにより除去され、その後に機能が再構
成されなければならない。挙げられる融合パートナーの
例はオリゴヒスチジン尾部、Strep-TagTM（Biometra Gm
bH, Goettingen, FRG)、グルタチオンＳ−トランスフェ
ラーゼ（ＧＳＴ）又はマルトース結合タンパク質（Ｍａ
ｌＥ）であるが、この使用は融合パートナー又はそれら
の断片に限定されるものではなく、それらは例として示
すものである。
法を使用して精製することができる。方法の適性は各々
の場合使用する宿主生物、発現戦略及びその他の要因次
第であり、これは組換えタンパク質の発現及び精製の経
験を積んだ熟練した技術者には既知のことである。その
精製のため、組換えタンパク質は発現カセット中のその
遺伝子配列を適当に変更することによりペプチド配列と
融合させることができる。Ｃ末端又はＮ末端融合として
組換えＤＸＳに特定のカラム物質に対する親和性を付与
するペプチド又はタンパク質が融合パートナーとして使
用するのが好ましい。これらの融合はＤＸＳの機能に影
響してはならず、又は例えば適当なプロテアーゼ解裂部
位を組み込むことにより除去され、その後に機能が再構
成されなければならない。挙げられる融合パートナーの
例はオリゴヒスチジン尾部、Strep-TagTM（Biometra Gm
bH, Goettingen, FRG)、グルタチオンＳ−トランスフェ
ラーゼ（ＧＳＴ）又はマルトース結合タンパク質（Ｍａ
ｌＥ）であるが、この使用は融合パートナー又はそれら
の断片に限定されるものではなく、それらは例として示
すものである。
【００２０】ＤＸＳの組換え体による製造及び精製は、
例えばＤＸＳの酵素機能を定量すべき試験物質の存在下
で、特に試験物質を自動的に定量する（例えば高処理量
選別）ことにより測定するための生化学的試験系にＤＸ
Ｓを使用することを可能にする。
例えばＤＸＳの酵素機能を定量すべき試験物質の存在下
で、特に試験物質を自動的に定量する（例えば高処理量
選別）ことにより測定するための生化学的試験系にＤＸ
Ｓを使用することを可能にする。
【００２１】本発明によるタンパク質はＤＸＳタンパク
質が共通して具有する特性を示す。これらの特性は、例
えば酵素活性、分子量、免疫学的反応性、クロマトグラ
フ上の行動、立体配座、安定性、最適ｐＨ、最適温度な
ど、そして物理的特性例えば電気泳動易動度、電荷、沈
降定数、溶解度、分光特性なども包含することができ
る。
質が共通して具有する特性を示す。これらの特性は、例
えば酵素活性、分子量、免疫学的反応性、クロマトグラ
フ上の行動、立体配座、安定性、最適ｐＨ、最適温度な
ど、そして物理的特性例えば電気泳動易動度、電荷、沈
降定数、溶解度、分光特性なども包含することができ
る。
【００２２】ＤＸＳの重要な特性の例はピルベート及び
ＧＡ３ＰからＤＸＰを合成するその能力である。この活
性は例えば実施例４に記述のように測定することができ
る。従って、本発明はその結果として直接又は間接に、
定性的または定量的に測定することができるシグナルを
生じるＤＸＳの酵素活性からＤＸＳエフェクターを確認
する方法にも関し、この方法では好ましくはＤＸＳを適
当な基質と共にインキュベートし、そして研究する試験
物質の存在及び不在下でＤＸＳの酵素活性を測定しそし
て比較する。
ＧＡ３ＰからＤＸＰを合成するその能力である。この活
性は例えば実施例４に記述のように測定することができ
る。従って、本発明はその結果として直接又は間接に、
定性的または定量的に測定することができるシグナルを
生じるＤＸＳの酵素活性からＤＸＳエフェクターを確認
する方法にも関し、この方法では好ましくはＤＸＳを適
当な基質と共にインキュベートし、そして研究する試験
物質の存在及び不在下でＤＸＳの酵素活性を測定しそし
て比較する。
【００２３】従って、本発明は試験物質の不在下でＤＸ
Ｓの酵素活性を測定し、前記試験物質の存在下でＤＸＳ
の酵素活性を測定し、そして確認した酵素活性を比較す
ることからなるＤＸＳエフェクターを確認する方法にも
関する。従って、本発明はＤＸＳエフェクターを、好ま
しくは自動化された試験系、例えばいわゆる高処理量選
別による、例えばピペッティングロボット及び／又はコ
ンピュータを用いる制御及び分析系を使用して確認する
ための本発明による方法の使用にも関する。
Ｓの酵素活性を測定し、前記試験物質の存在下でＤＸＳ
の酵素活性を測定し、そして確認した酵素活性を比較す
ることからなるＤＸＳエフェクターを確認する方法にも
関する。従って、本発明はＤＸＳエフェクターを、好ま
しくは自動化された試験系、例えばいわゆる高処理量選
別による、例えばピペッティングロボット及び／又はコ
ンピュータを用いる制御及び分析系を使用して確認する
ための本発明による方法の使用にも関する。
【００２４】この方法はＤＸＳの特異的阻害物質又は活
性化物質、すなわちエフェクターを確認するために適し
ており、従って、中でも潜在的な除草又は成長阻害作
用、あるいは成長促進作用を有する物質を確認すること
ができる。この場合、研究する化学物質は好ましくは１
０-9Ｍ〜１０-3Ｍの濃度で、特に好ましくは１０-7Ｍ〜
１０-4Ｍの濃度で使用される。
性化物質、すなわちエフェクターを確認するために適し
ており、従って、中でも潜在的な除草又は成長阻害作
用、あるいは成長促進作用を有する物質を確認すること
ができる。この場合、研究する化学物質は好ましくは１
０-9Ｍ〜１０-3Ｍの濃度で、特に好ましくは１０-7Ｍ〜
１０-4Ｍの濃度で使用される。
【００２５】適当な反応緩衝液中で、反応温度及び反応
のｐＨに関して適当である反応条件下で、チアミンジホ
スフェートを適当な基質例えばピルベート及びＧＡ３Ｐ
と一緒に存在させてＤＸＳをインキュベートする多くの
適当な方法を、ＤＸＳの酵素活性を測定するために使用
することができる。ｐＨ３〜１１の適当な反応緩衝液、
及び２℃〜６０℃の反応温度がＤＸＳにとって好ましい
反応条件として挙げられる。
のｐＨに関して適当である反応条件下で、チアミンジホ
スフェートを適当な基質例えばピルベート及びＧＡ３Ｐ
と一緒に存在させてＤＸＳをインキュベートする多くの
適当な方法を、ＤＸＳの酵素活性を測定するために使用
することができる。ｐＨ３〜１１の適当な反応緩衝液、
及び２℃〜６０℃の反応温度がＤＸＳにとって好ましい
反応条件として挙げられる。
【００２６】酵素阻害又は酵素活性化（すなわちエフェ
クターにより起こる作用）は研究する試験物質の不在下
及び存在下において、その他の試験条件は同一にしてＤ
ＸＳの触媒活性を単純に比較することにより定量するこ
とができる。種々の生化学的測定方法をＤＸＳの活性を
測定するために使用することができ、これらの方法はＤ
ＸＳ触媒反応の反応生成物例えばＤＸＰの形成を測定す
るか、又はＤＸＳの酵素基質例えばピルベート又はＧＡ
３Ｐの濃度の低下を、適切には放射能標識された又はそ
の他の通常の標識付けがなされた基質であるピルベート
及びＧＡ３Ｐの酵素変換後ＤＸＰの終点測定により測定
するいずれかに使用され、もしくは後続する反応により
例えば連結した酵素反応により検出することができる。
クターにより起こる作用）は研究する試験物質の不在下
及び存在下において、その他の試験条件は同一にしてＤ
ＸＳの触媒活性を単純に比較することにより定量するこ
とができる。種々の生化学的測定方法をＤＸＳの活性を
測定するために使用することができ、これらの方法はＤ
ＸＳ触媒反応の反応生成物例えばＤＸＰの形成を測定す
るか、又はＤＸＳの酵素基質例えばピルベート又はＧＡ
３Ｐの濃度の低下を、適切には放射能標識された又はそ
の他の通常の標識付けがなされた基質であるピルベート
及びＧＡ３Ｐの酵素変換後ＤＸＰの終点測定により測定
するいずれかに使用され、もしくは後続する反応により
例えば連結した酵素反応により検出することができる。
【００２７】酵素活性を測定するための多くの標準方法
が酵素試験の実施の経験を積んだ熟練者によって利用可
能である。例えば、Bergmeyer, H.U.,「酵素分析方法
（Methoden der enzymatischen Analyse)」, １巻及び
２巻, Verlag Chemie, Weinheim(1974年)；Suelter, C.
H.,「実験酵素学、研究室作業の基本原理（Experimente
lle Enzymologie:Grundlagen fuer die Laborpraxi
s)」, Fischer Stuttgart（1990年)が参照される。
が酵素試験の実施の経験を積んだ熟練者によって利用可
能である。例えば、Bergmeyer, H.U.,「酵素分析方法
（Methoden der enzymatischen Analyse)」, １巻及び
２巻, Verlag Chemie, Weinheim(1974年)；Suelter, C.
H.,「実験酵素学、研究室作業の基本原理（Experimente
lle Enzymologie:Grundlagen fuer die Laborpraxi
s)」, Fischer Stuttgart（1990年)が参照される。
【００２８】ＤＸＳの酵素活性は、例えばＤＸＳを［２
−14Ｃ］−ピルベート及びＧＡ３Ｐと一緒にインキュベ
ートし、適当なインキュベーション時間の後未反応の
［２− 14Ｃ］−ピルベート及びＧＡ３Ｐを分離した後得
られた［２−14Ｃ］−１−デオキシ−Ｄ−キシルロース
５−ホスフェートの量を定性的又は定量的に測定するこ
とにより求めることができる。１−デオキシ−Ｄ−キシ
ルロース５−ホスフェートはピルベートおよびＧＡ３Ｐ
から適当な固定相上で適当な移動相混合物を使用して例
えば薄層クロマトグラフィー又はＨＰＬＣにより分離す
ることができる。ＤＸＰ、ピルベート及びＧＡ３Ｐの分
離をよくするため、反応混合物中に存在するリン酸エス
テルはクロマトグラフィーによる分離を行なう前に例え
ばそれらを酸又はアルカリホスファターゼで処理するこ
とにより対応するアルコールに変換することができる。
ＤＸＳの活性を測定する場合、他の放射能標識した基質
例えば［Ｕ−14Ｃ］−ピルベート、14Ｃ標識ＧＡ３Ｐ、
3Ｈ標識ピルベート又は3Ｈ標識ＧＡ３Ｐを［２−14Ｃ］
−ピルベート及びＧＡ３Ｐの代わりに使用することもで
きる。
−14Ｃ］−ピルベート及びＧＡ３Ｐと一緒にインキュベ
ートし、適当なインキュベーション時間の後未反応の
［２− 14Ｃ］−ピルベート及びＧＡ３Ｐを分離した後得
られた［２−14Ｃ］−１−デオキシ−Ｄ−キシルロース
５−ホスフェートの量を定性的又は定量的に測定するこ
とにより求めることができる。１−デオキシ−Ｄ−キシ
ルロース５−ホスフェートはピルベートおよびＧＡ３Ｐ
から適当な固定相上で適当な移動相混合物を使用して例
えば薄層クロマトグラフィー又はＨＰＬＣにより分離す
ることができる。ＤＸＰ、ピルベート及びＧＡ３Ｐの分
離をよくするため、反応混合物中に存在するリン酸エス
テルはクロマトグラフィーによる分離を行なう前に例え
ばそれらを酸又はアルカリホスファターゼで処理するこ
とにより対応するアルコールに変換することができる。
ＤＸＳの活性を測定する場合、他の放射能標識した基質
例えば［Ｕ−14Ｃ］−ピルベート、14Ｃ標識ＧＡ３Ｐ、
3Ｈ標識ピルベート又は3Ｈ標識ＧＡ３Ｐを［２−14Ｃ］
−ピルベート及びＧＡ３Ｐの代わりに使用することもで
きる。
【００２９】さらに放射能標識したＤＸＰ誘導体（例え
ば、とりわけ13Ｃ標識、14Ｃ標識または32Ｐ標識誘導
体）を調製するためのベースとして精製ＤＸＳを使用す
ることは、これらの誘導体をその後に試験系に使用する
観点から考え得ることである。放射能標識したＤＸＰは
１−デオキシキシルロース−Ｐ経路における後続する酵
素を研究するための特異的代謝産物として使用すること
ができ、そしてそれによりエフェクターを再び研究する
ことが可能にもなる。かくして、例えば14Ｃ−ＩＰＰ又
はその他の14Ｃ化合物の形成を検出することが可能にな
るであろうし、インビボ又はインビトロにおける14Ｃ−
ＤＸＰのＩＰＰへの転化を減少させるエフェクターはい
ずれも全経路にとって除草剤／抗生物質となり得るもの
とみなすことができる。
ば、とりわけ13Ｃ標識、14Ｃ標識または32Ｐ標識誘導
体）を調製するためのベースとして精製ＤＸＳを使用す
ることは、これらの誘導体をその後に試験系に使用する
観点から考え得ることである。放射能標識したＤＸＰは
１−デオキシキシルロース−Ｐ経路における後続する酵
素を研究するための特異的代謝産物として使用すること
ができ、そしてそれによりエフェクターを再び研究する
ことが可能にもなる。かくして、例えば14Ｃ−ＩＰＰ又
はその他の14Ｃ化合物の形成を検出することが可能にな
るであろうし、インビボ又はインビトロにおける14Ｃ−
ＤＸＰのＩＰＰへの転化を減少させるエフェクターはい
ずれも全経路にとって除草剤／抗生物質となり得るもの
とみなすことができる。
【００３０】ＤＸＳの活性は、例えばＤＸＳを［１−14
Ｃ］−ピルベート及びＧＡ３Ｐと一緒にインキュベート
し、そして適当なインキュベーション時間の後反応から
放出される14ＣＯ2の量を測定することによって求める
こともできる。ＤＸＳの活性は、例えばＤＸＳをピルベ
ート及びＧＡ３Ｐと一緒にインキュベートし、そして適
当なインキュベーション時間の後反応中に残存する未転
化のピルベートを乳酸脱水素酵素を使用してラクテート
に転化し、そして乳酸脱水素酵素反応において補助基質
として要求される還元ニコチンアミドジヌクレオチド
（ＮＡＤＨ）の濃度の減少を適当な方法例えば測光法に
より測定することによって求めることもできる。
Ｃ］−ピルベート及びＧＡ３Ｐと一緒にインキュベート
し、そして適当なインキュベーション時間の後反応から
放出される14ＣＯ2の量を測定することによって求める
こともできる。ＤＸＳの活性は、例えばＤＸＳをピルベ
ート及びＧＡ３Ｐと一緒にインキュベートし、そして適
当なインキュベーション時間の後反応中に残存する未転
化のピルベートを乳酸脱水素酵素を使用してラクテート
に転化し、そして乳酸脱水素酵素反応において補助基質
として要求される還元ニコチンアミドジヌクレオチド
（ＮＡＤＨ）の濃度の減少を適当な方法例えば測光法に
より測定することによって求めることもできる。
【００３１】ＤＸＳの活性は、例えばＤＸＳをピルベー
ト及びＧＡ３Ｐと一緒にインキュベートし、そして適当
なインキュベーション時間の後反応中に残存する未転化
のＧＡ３Ｐをグリセルアルデヒド３−ホスフェート脱水
素酵素を使用して１,３−ビホスホグリセレートに転化
し、そしてグリセルアルデヒド３−ホスフェート脱水素
酵素反応において補助基質として要求されるニコチンア
ミドジヌクレオチドの還元形態の濃度の増加を適当な方
法例えば測光法により直接、又はテトラゾリウム化合物
への還元に連結後測定することによって求めることもで
きる。
ト及びＧＡ３Ｐと一緒にインキュベートし、そして適当
なインキュベーション時間の後反応中に残存する未転化
のＧＡ３Ｐをグリセルアルデヒド３−ホスフェート脱水
素酵素を使用して１,３−ビホスホグリセレートに転化
し、そしてグリセルアルデヒド３−ホスフェート脱水素
酵素反応において補助基質として要求されるニコチンア
ミドジヌクレオチドの還元形態の濃度の増加を適当な方
法例えば測光法により直接、又はテトラゾリウム化合物
への還元に連結後測定することによって求めることもで
きる。
【００３２】ＤＸＳの活性は、例えばＤＸＳをピルベー
ト及びＧＡ３Ｐと一緒にインキュベートし、そして適当
なインキュベーション時間の後又は連結した酵素試験系
のいずれかにおいて、連続的に反応中に放出される量の
ＣＯ2をホスホエノールピルベートカルボキシラーゼを
使用してオキサロアセテートに転化しそしてこのように
形成されたオキサロアセテートをマレイン酸脱水素酵素
を使用してマレートに転化し、そしてマレイン酸脱水素
酵素反応において補助基質として要求されるニコチンア
ミドジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）の濃度の増加を適当な
方法例えば測光法により測定することによって求めるこ
ともできる。ＤＸＳの活性は、例えばＤＸＳをピルベー
ト及びＧＡ３Ｐと一緒にインキュベートし、そしてピル
ベートの脱炭酸の部分的反応を２,６−ジクロロフェノ
ールインドフェノールの還元に連結することによっても
測定することができる。
ト及びＧＡ３Ｐと一緒にインキュベートし、そして適当
なインキュベーション時間の後又は連結した酵素試験系
のいずれかにおいて、連続的に反応中に放出される量の
ＣＯ2をホスホエノールピルベートカルボキシラーゼを
使用してオキサロアセテートに転化しそしてこのように
形成されたオキサロアセテートをマレイン酸脱水素酵素
を使用してマレートに転化し、そしてマレイン酸脱水素
酵素反応において補助基質として要求されるニコチンア
ミドジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）の濃度の増加を適当な
方法例えば測光法により測定することによって求めるこ
ともできる。ＤＸＳの活性は、例えばＤＸＳをピルベー
ト及びＧＡ３Ｐと一緒にインキュベートし、そしてピル
ベートの脱炭酸の部分的反応を２,６−ジクロロフェノ
ールインドフェノールの還元に連結することによっても
測定することができる。
【００３３】試験物質の作用をエフェクターとして測定
する本発明の方法は精製ＤＸＳを使用して実行すること
ができるが、一方この方法はＤＸＳを組換えＤＮＡによ
り発現する組換え体生物の完全細胞を使用して、これら
の生物からのＤＸＳ含有抽出液を使用して、又はこの生
物からの富化されたＤＸＳ含有画分を使用することによ
り実行することもできる。好ましい組換え体宿主生物と
して挙げられるのは細菌、昆虫及び酵母細胞である。又
は、植物組織又は植物細胞培養から分離したＤＸＳを使
用することもできる。ＤＸＰが多段の中間段階を経てＤ
ＭＡＰＰ／ＩＰＰに転化されることは既知である。この
経路の詳細、すなわちその後に出現する酵素はなお解明
されていない。しかしながら、この転化がキナーゼ、オ
キシドレダクターゼ、イソメラーゼ及びムターゼの関与
により起こることが知られている。この点で、後続する
酵素も同様に除草剤及び抗生物質の作用のための部位を
構成しそして同様にエフェクターとして機能するであろ
うことが期待される。
する本発明の方法は精製ＤＸＳを使用して実行すること
ができるが、一方この方法はＤＸＳを組換えＤＮＡによ
り発現する組換え体生物の完全細胞を使用して、これら
の生物からのＤＸＳ含有抽出液を使用して、又はこの生
物からの富化されたＤＸＳ含有画分を使用することによ
り実行することもできる。好ましい組換え体宿主生物と
して挙げられるのは細菌、昆虫及び酵母細胞である。又
は、植物組織又は植物細胞培養から分離したＤＸＳを使
用することもできる。ＤＸＰが多段の中間段階を経てＤ
ＭＡＰＰ／ＩＰＰに転化されることは既知である。この
経路の詳細、すなわちその後に出現する酵素はなお解明
されていない。しかしながら、この転化がキナーゼ、オ
キシドレダクターゼ、イソメラーゼ及びムターゼの関与
により起こることが知られている。この点で、後続する
酵素も同様に除草剤及び抗生物質の作用のための部位を
構成しそして同様にエフェクターとして機能するであろ
うことが期待される。
【００３４】タンパク質機能を測定するための上述の生
化学的試験系の確立、研究されるタンパク質を機能的状
態でそして可及的純粋に、すなわち干渉する活性のない
形で単離することができるといった種々の適用にとって
の重要な前提条件がある。すべての細胞タンパク質と同
じように、これはＤＸＳの場合においても生物又は組織
からの酵素の分離のための通常のタンパク質精製の方法
を使用することにより達成することができる。本発明に
おいて、その配列が大腸菌を例に取るとＳＥＱＩＤ Ｎ
ｏ.１で示され、そしてＥＭＢＬデータベースにおいて
Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｕ８２６６４と表示される配列に相当す
る機能的に完全なＤＸＳを単離することが可能であるこ
とが示されている。
化学的試験系の確立、研究されるタンパク質を機能的状
態でそして可及的純粋に、すなわち干渉する活性のない
形で単離することができるといった種々の適用にとって
の重要な前提条件がある。すべての細胞タンパク質と同
じように、これはＤＸＳの場合においても生物又は組織
からの酵素の分離のための通常のタンパク質精製の方法
を使用することにより達成することができる。本発明に
おいて、その配列が大腸菌を例に取るとＳＥＱＩＤ Ｎ
ｏ.１で示され、そしてＥＭＢＬデータベースにおいて
Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｕ８２６６４と表示される配列に相当す
る機能的に完全なＤＸＳを単離することが可能であるこ
とが示されている。
【００３５】
【化１】
【００３６】本発明はさらにＤＸＳの機能を有するタン
パク質又はその活性断片のＤＸＳフェクターを確認する
ための使用に関する。ＤＸＳの使用は本質的にその酵素
活性に基づく。機能的に完全なＤＸＳの供給がインビト
ロ（例えば無細胞ＤＸＳ試験系）及びインビボ、例えば
単一細胞又は多細胞の組換え体生物又は細胞培養、特に
酵母、細菌、藻類、昆虫細胞又は植物のそれによる生化
学反応を実行することを可能にする。
パク質又はその活性断片のＤＸＳフェクターを確認する
ための使用に関する。ＤＸＳの使用は本質的にその酵素
活性に基づく。機能的に完全なＤＸＳの供給がインビト
ロ（例えば無細胞ＤＸＳ試験系）及びインビボ、例えば
単一細胞又は多細胞の組換え体生物又は細胞培養、特に
酵母、細菌、藻類、昆虫細胞又は植物のそれによる生化
学反応を実行することを可能にする。
【００３７】一方、これらの反応は１−デキオシ−Ｄ−
キシルロース５−ホスフェート（ＤＸＰ）又はその結果
として生じる生成物例えばチアミン、ピリドキシン及び
イソプレノイド（カロテノイド、クロロフィル、フィト
ール、ルテイン、ステロール、ユビキノン／メナキノン
／プラストキノン、ドリコール、天然ゴム、パクリタキ
セル／ドセタキセル（商品名Taxol/Taxotere）を包含す
る）を製造するために使用することができ、そして一
方、これらの生化学反応は試験系におけるＤＸＳの機能
に対する化学的化合物又は異種物質混合物の作用を測定
するために使用することができる。
キシルロース５−ホスフェート（ＤＸＰ）又はその結果
として生じる生成物例えばチアミン、ピリドキシン及び
イソプレノイド（カロテノイド、クロロフィル、フィト
ール、ルテイン、ステロール、ユビキノン／メナキノン
／プラストキノン、ドリコール、天然ゴム、パクリタキ
セル／ドセタキセル（商品名Taxol/Taxotere）を包含す
る）を製造するために使用することができ、そして一
方、これらの生化学反応は試験系におけるＤＸＳの機能
に対する化学的化合物又は異種物質混合物の作用を測定
するために使用することができる。
【００３８】さらに、組換え体により作られたＤＸＳは
例えば酵素の空間構造を解明するために使用することが
できる。一般的に知られている方法、例えばタンパク質
結晶のＸ線構造解析又はＮＭＲ分光分析法が空間構造を
解明するために使用することができる。ＤＸＳの構造に
関して得られる情報は、例えば新規なＤＸＳ阻害剤、及
びその結果としての強力な除草剤の設計に合理的に使用
することができる。
例えば酵素の空間構造を解明するために使用することが
できる。一般的に知られている方法、例えばタンパク質
結晶のＸ線構造解析又はＮＭＲ分光分析法が空間構造を
解明するために使用することができる。ＤＸＳの構造に
関して得られる情報は、例えば新規なＤＸＳ阻害剤、及
びその結果としての強力な除草剤の設計に合理的に使用
することができる。
【００３９】本発明は、本発明の方法により確認するこ
とができるＤＸＳエフェクター及びピルベートＧＡ３Ｐ
又はＤＸＰの構造類似体であるＤＸＳエフェクター、特
に抗生物質、農薬又は除草作用を有するＤＸＳエフェク
ター、及びそれらの農薬、除草剤又は抗生物質としての
使用にも関する。
とができるＤＸＳエフェクター及びピルベートＧＡ３Ｐ
又はＤＸＰの構造類似体であるＤＸＳエフェクター、特
に抗生物質、農薬又は除草作用を有するＤＸＳエフェク
ター、及びそれらの農薬、除草剤又は抗生物質としての
使用にも関する。
【００４０】次の物質及び方法は下に示す実施例に使用
しており、この実施例は本発明を明らかにするためであ
り、決してなんらかの制限を加えることを意図するもの
ではない。 細菌株及びプラスミド 大腸菌Ｋ１２，Ｗ３１１０野生型株（Yale University
Genetic Stock Center,USAから入手）を染色体ＤＮＡを
分離するための出発材料として使用した。プラスミドｐ
ＵＣＢＭ２０（Boehringer Mannheim, FRG）を大腸菌Ｄ
Ｈ５α株（supE44 ΔlacUI69（φ80lacZ ΔM15）hsdRI7
recAl endA1 gyrA96 thi-l relA1）（Hanahan, (1983
年), J. Mol. Biol., 166巻, 557-580ページ）、及び大
腸菌ＪＭ１０９株（recAlI supE44 endAlI hsdR17 gyrA
96 relAl thi Δ(lac-proAB)F′[traD36 proAB+ laclq
lacZ ΔM15]）（Yanisch-Perron等,（1985年), Gene, 3
3巻, 103-119ページ）でｄｘｓをクローニングし、発現
させるために使用した。
しており、この実施例は本発明を明らかにするためであ
り、決してなんらかの制限を加えることを意図するもの
ではない。 細菌株及びプラスミド 大腸菌Ｋ１２，Ｗ３１１０野生型株（Yale University
Genetic Stock Center,USAから入手）を染色体ＤＮＡを
分離するための出発材料として使用した。プラスミドｐ
ＵＣＢＭ２０（Boehringer Mannheim, FRG）を大腸菌Ｄ
Ｈ５α株（supE44 ΔlacUI69（φ80lacZ ΔM15）hsdRI7
recAl endA1 gyrA96 thi-l relA1）（Hanahan, (1983
年), J. Mol. Biol., 166巻, 557-580ページ）、及び大
腸菌ＪＭ１０９株（recAlI supE44 endAlI hsdR17 gyrA
96 relAl thi Δ(lac-proAB)F′[traD36 proAB+ laclq
lacZ ΔM15]）（Yanisch-Perron等,（1985年), Gene, 3
3巻, 103-119ページ）でｄｘｓをクローニングし、発現
させるために使用した。
【００４１】クローニング方法 一般に文献に記載されている標準の方法をクローニング
（Sambrook等, (1989年), Molecular cloning; a labor
atory manual, 第２版, Cold Spring HarborLab. Pres
s, Cold Spring Harbor, NY）、ＰＣＲ増幅（Mullis及
びFaloona, (1987年), Meth Enzymol., 155巻, 335-350
ページ)、及びＤＮＡ変換（Hanahan, (1983年), J. Mo
l. Biol., 166巻, 557-580ページ）に使用した。ＤＸＳ
の活性における変化、特に活性の増加はＤＸＰ誘導体
（例えばチアミン又はピリドキシン）及びイソプレイド
物質形成の増加につながるであろうことが期待される。
後者にはカロテノイドが含まれる。ＤＸＳはＩＰＰ合成
を阻害する作用部位（除草剤及び抗生物質）として関心
がもたれるが、本発明はＤＸＳの活性の増加及びチアミ
ン又はピリドキシン（ビタミンＢ１及びＢ６）のような
ＤＸＰ誘導体、特にイソプレノイド物質の形成の増加に
も関連する。これに関連して、カロテノイド、クロロフ
ィル、フィトール、ルテイン、ステロール、ユビキノン
／メナキノン／プラストキノン、ドリコール、天然ゴ
ム、パクリタキセル／ドセタキセル（商品名Taxol/Taxo
tere）を商業的に興味のある化合物の中でも特に可能な
限り広い範囲で特許請求するが、これのみに限定される
ものではない。
（Sambrook等, (1989年), Molecular cloning; a labor
atory manual, 第２版, Cold Spring HarborLab. Pres
s, Cold Spring Harbor, NY）、ＰＣＲ増幅（Mullis及
びFaloona, (1987年), Meth Enzymol., 155巻, 335-350
ページ)、及びＤＮＡ変換（Hanahan, (1983年), J. Mo
l. Biol., 166巻, 557-580ページ）に使用した。ＤＸＳ
の活性における変化、特に活性の増加はＤＸＰ誘導体
（例えばチアミン又はピリドキシン）及びイソプレイド
物質形成の増加につながるであろうことが期待される。
後者にはカロテノイドが含まれる。ＤＸＳはＩＰＰ合成
を阻害する作用部位（除草剤及び抗生物質）として関心
がもたれるが、本発明はＤＸＳの活性の増加及びチアミ
ン又はピリドキシン（ビタミンＢ１及びＢ６）のような
ＤＸＰ誘導体、特にイソプレノイド物質の形成の増加に
も関連する。これに関連して、カロテノイド、クロロフ
ィル、フィトール、ルテイン、ステロール、ユビキノン
／メナキノン／プラストキノン、ドリコール、天然ゴ
ム、パクリタキセル／ドセタキセル（商品名Taxol/Taxo
tere）を商業的に興味のある化合物の中でも特に可能な
限り広い範囲で特許請求するが、これのみに限定される
ものではない。
【００４２】
【実施例】実施例１：大腸菌ｄｘｓ遺伝子の単離及びク
ローニング ｄｘｓ遺伝子を大腸菌Ｋ１２野生型株Ｗ３１１０から、
既知の大腸菌ゲノム配列Ｕ８２６６４及び下記のプライ
マーを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により
増幅した。
ローニング ｄｘｓ遺伝子を大腸菌Ｋ１２野生型株Ｗ３１１０から、
既知の大腸菌ゲノム配列Ｕ８２６６４及び下記のプライ
マーを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により
増幅した。
【化２】
【００４３】ＰＣＲプライマーのＤＸＳＥＣ０５及びＤ
ＸＳＥＣ０３はそれぞれ酵素ＥｃｏＲＩ及びＳｐｈＩの
制限解裂部位を含む。ＰＣＲを実行するため、各々のプ
ライマーの１００pmolを大腸菌Ｋ１２野生型株ＬＪ１１
０（Ｗ３１１０）からの染色体ＤＮＡの１.６ngと一緒
に使用した。二本鎖ＤＮＡを９５℃で３０秒間変性させ
た後、引き続いて各々６０℃でアニーリング、７２℃で
重合及び９５℃で後続の変性（１分）からなる処理サイ
クルを３０回行った。ＰＣＲ生成物（SEQ ID No.2）の
配列をA.L.F. System（Pharmacia, Freiburg,FRG）を使
用して測定した。
ＸＳＥＣ０３はそれぞれ酵素ＥｃｏＲＩ及びＳｐｈＩの
制限解裂部位を含む。ＰＣＲを実行するため、各々のプ
ライマーの１００pmolを大腸菌Ｋ１２野生型株ＬＪ１１
０（Ｗ３１１０）からの染色体ＤＮＡの１.６ngと一緒
に使用した。二本鎖ＤＮＡを９５℃で３０秒間変性させ
た後、引き続いて各々６０℃でアニーリング、７２℃で
重合及び９５℃で後続の変性（１分）からなる処理サイ
クルを３０回行った。ＰＣＲ生成物（SEQ ID No.2）の
配列をA.L.F. System（Pharmacia, Freiburg,FRG）を使
用して測定した。
【００４４】
【化３】
【００４５】実施例２：大腸菌ＪＭ１０９株におけるｄ
ｘｓ遺伝子の発現 得られる１.９ｋｂのＰＣＲ断片は７ｂｐだけ上流にリ
ボソーム結合部位（ＡＧＧ）をもつが、ＥｃｏＲＩ及び
ＳｐｈＩ解裂部位によりこれを単離し、そしてプラスミ
ドｐＵＣＢＭ２０（Boehringer Mannheim, FRG）中にサ
ブクローニングした。それらを大腸菌ＪＭ１０９株に変
換した後、プラスミドの完全性を制限分析により調査し
た。発現はプラスミド上にあるｌａｃプロモーターによ
り果たされた。
ｘｓ遺伝子の発現 得られる１.９ｋｂのＰＣＲ断片は７ｂｐだけ上流にリ
ボソーム結合部位（ＡＧＧ）をもつが、ＥｃｏＲＩ及び
ＳｐｈＩ解裂部位によりこれを単離し、そしてプラスミ
ドｐＵＣＢＭ２０（Boehringer Mannheim, FRG）中にサ
ブクローニングした。それらを大腸菌ＪＭ１０９株に変
換した後、プラスミドの完全性を制限分析により調査し
た。発現はプラスミド上にあるｌａｃプロモーターによ
り果たされた。
【００４６】実施例３：組換え体大腸菌ＪＭ１０９細胞
からのＤＸＳ酵素の精製 方法Ａ 挿入したｄｘｓ遺伝子を含有するプラスミドｐＵＣＢＭ
２０が存在する大腸菌ＪＭ１０９細胞をアンピシリン
（１００mg／Ｌ）含有ＬＢ培地（全部で９.６リット
ル）で光学密度０.８になるまで培養し、その後イソプ
ロピル−ベータ−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）
（０.４mM）を使用して４時間誘導した。細胞を遠心分
離して集め、５０mMのTris／ＨＣｌ、１mMのジチオトレ
イトール、０.５mMのチアミンジホスフェート、５mMの
ＭｇＣｌ2、ｐＨ７.５（緩衝液Ａ）で洗浄し、緩衝液Ａ
（細胞湿潤重量ｇ当たり２.５ml）に再懸濁し、そして
フレンチプレス中を３回通過させて細胞破壊した。遠心
分離した後細胞砕片を捨て、そして（ＮＨ4)2ＳＯ4を上
澄液（１７３ml）に０℃で２２５ｇ／Ｌの割合で添加し
てタンパク質を沈澱させた。沈澱物を緩衝液Ａに再懸濁
し、限外濾過にかけた。次いで試料（６３ml）をＱ−セ
ファロースＨＰカラム（Pharmacia Biotech, Sweden）
にかけ、緩衝液Ａで洗浄し、次いで０.２〜０.３Ｍ Ｎ
ａＣｌの範囲の上昇塩勾配（緩衝液Ａ中０〜１Ｍ Ｎａ
Ｃｌ）を使用して溶離した。
からのＤＸＳ酵素の精製 方法Ａ 挿入したｄｘｓ遺伝子を含有するプラスミドｐＵＣＢＭ
２０が存在する大腸菌ＪＭ１０９細胞をアンピシリン
（１００mg／Ｌ）含有ＬＢ培地（全部で９.６リット
ル）で光学密度０.８になるまで培養し、その後イソプ
ロピル−ベータ−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）
（０.４mM）を使用して４時間誘導した。細胞を遠心分
離して集め、５０mMのTris／ＨＣｌ、１mMのジチオトレ
イトール、０.５mMのチアミンジホスフェート、５mMの
ＭｇＣｌ2、ｐＨ７.５（緩衝液Ａ）で洗浄し、緩衝液Ａ
（細胞湿潤重量ｇ当たり２.５ml）に再懸濁し、そして
フレンチプレス中を３回通過させて細胞破壊した。遠心
分離した後細胞砕片を捨て、そして（ＮＨ4)2ＳＯ4を上
澄液（１７３ml）に０℃で２２５ｇ／Ｌの割合で添加し
てタンパク質を沈澱させた。沈澱物を緩衝液Ａに再懸濁
し、限外濾過にかけた。次いで試料（６３ml）をＱ−セ
ファロースＨＰカラム（Pharmacia Biotech, Sweden）
にかけ、緩衝液Ａで洗浄し、次いで０.２〜０.３Ｍ Ｎ
ａＣｌの範囲の上昇塩勾配（緩衝液Ａ中０〜１Ｍ Ｎａ
Ｃｌ）を使用して溶離した。
【００４７】方法Ｂ プラスミドｐＵＣＢＭ２０ｄｘｓを持っている大腸菌Ｊ
Ｍ１０９細胞を３７℃で６００nmでの光学密度０.８に
なるまで培養し、イソプロピル−ベータ−Ｄ−チオガラ
クトシド（ＩＰＴＧ）（０.４mM）を使用して少なくと
も４時間誘導した。細胞を遠心分離して集め、緩衝液Ａ
１５０nMのTris／ＨＣｌ／１mMのジチオトレイトール／
０.５mMのチアミンジホスフェート／５mMのＭｇＣｌ2、
ｐＨ７.５）で洗浄し、同じ緩衝液Ａ（細胞湿潤重量ｇ
当たり２.５ml）に再懸濁し、そしてエタノール／氷浴
中で冷却しながらBranson Sonifier（４０Ｗ出力で１０
３０秒パルス、衝撃係数５０％）で超音波処理した。遠
心分離（３８.００×ｇで１時間）した後、上澄液を無
細胞抽出液として用いた。４℃で硫酸アンモニウム（２
２.５ｇ／１００ml、４０％飽和）を加えた。沈澱物を
緩衝液Ａに再懸濁し、限外濾過をくりかえして硫酸アン
モニウムを除去し、そして得られた溶液を遠心分離した
（３０分、３８.００×ｇ）。次いで、試料を１００ml
床容量のＱ−セファロースＨＰ陰イオン交換カラム（Ph
armacia Biotech）にかけ、緩衝液Ａで洗浄し、そして
増加塩勾配（緩衝液Ａ中０〜１Ｍ ＮａＣｌ）を用いて
溶離した。ＤＸＰシンターゼは、０.１〜０.２Ｍ Ｎａ
Ｃｌで溶離された。第二の陰イオン交換クロマトグラフ
ィーでは、ＤＥＡＥ−６５０Ｓテンタクル（tentacle）
カラム（Merck Darmstadt, Germany）を同じ緩衝液およ
び塩体系で使用した。下記に示す試験方法は粗抽出液及
び（部分的）精製酵素のピルベート及びＧＡＰ３Ｐから
酵素的にＤＸＰを形成する能力を研究するために使用し
た。組換え体細胞に対して約１７倍の富化が達成された
（表１）。
Ｍ１０９細胞を３７℃で６００nmでの光学密度０.８に
なるまで培養し、イソプロピル−ベータ−Ｄ−チオガラ
クトシド（ＩＰＴＧ）（０.４mM）を使用して少なくと
も４時間誘導した。細胞を遠心分離して集め、緩衝液Ａ
１５０nMのTris／ＨＣｌ／１mMのジチオトレイトール／
０.５mMのチアミンジホスフェート／５mMのＭｇＣｌ2、
ｐＨ７.５）で洗浄し、同じ緩衝液Ａ（細胞湿潤重量ｇ
当たり２.５ml）に再懸濁し、そしてエタノール／氷浴
中で冷却しながらBranson Sonifier（４０Ｗ出力で１０
３０秒パルス、衝撃係数５０％）で超音波処理した。遠
心分離（３８.００×ｇで１時間）した後、上澄液を無
細胞抽出液として用いた。４℃で硫酸アンモニウム（２
２.５ｇ／１００ml、４０％飽和）を加えた。沈澱物を
緩衝液Ａに再懸濁し、限外濾過をくりかえして硫酸アン
モニウムを除去し、そして得られた溶液を遠心分離した
（３０分、３８.００×ｇ）。次いで、試料を１００ml
床容量のＱ−セファロースＨＰ陰イオン交換カラム（Ph
armacia Biotech）にかけ、緩衝液Ａで洗浄し、そして
増加塩勾配（緩衝液Ａ中０〜１Ｍ ＮａＣｌ）を用いて
溶離した。ＤＸＰシンターゼは、０.１〜０.２Ｍ Ｎａ
Ｃｌで溶離された。第二の陰イオン交換クロマトグラフ
ィーでは、ＤＥＡＥ−６５０Ｓテンタクル（tentacle）
カラム（Merck Darmstadt, Germany）を同じ緩衝液およ
び塩体系で使用した。下記に示す試験方法は粗抽出液及
び（部分的）精製酵素のピルベート及びＧＡＰ３Ｐから
酵素的にＤＸＰを形成する能力を研究するために使用し
た。組換え体細胞に対して約１７倍の富化が達成された
（表１）。
【００４８】
【表１】 精製したＤＸＳタンパク質はドデシル硫酸ナトリウム−
ポリアクリルアミド電気泳動ゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
において約６６ｋＤａ（図３）の見掛けの分子量を有す
る。６６ｋＤａの分子量はＤＮＡ配列から予測される６
７.６ｋＤａの分子量と一致する。
ポリアクリルアミド電気泳動ゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
において約６６ｋＤａ（図３）の見掛けの分子量を有す
る。６６ｋＤａの分子量はＤＮＡ配列から予測される６
７.６ｋＤａの分子量と一致する。
【００４９】実施例４：１−デオキシ−Ｄ−キシルロー
ス５−ホスフェートシンターゼの酵素試験 １−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−ホスフェートシン
ターゼの酵素活性の試験を全量５０μl中２００mMのク
エン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ３.０、１０mMのピルベ
ート、３０mMのＤ,Ｌ−グリセルアルデヒド３−ホスフ
ェート、２０mMのＭｇＣｌ2、１.５mMのチアミンジホス
フェート（ＴＨＤＰ）、１mMのジチオトレイトール（Ｄ
ＴＴ）、０.４mMのエチレンジアミンテトラアセテート
（ＥＤＴＡ）、１μＣｉの［２−14Ｃ］−ピルベート及
び研究する試料の存在の下で実行した。３０℃で１〜４
時間のインキュベーションの後、２０％過塩素酸（５μ
ｌ）を添加して反応を止めた。上澄液を５モルのＫ2Ｃ
０3（８μｌ）で中和した。１５Ｕの子牛腸アルカリホ
スファターゼ（１.５μl, Boehringer Mannheim, No. 1
08138）をＤＸＳ反応上澄液の５μｌ分に添加し、混合
物を３０℃で３時間インキュベートした。アルカリホス
ファターゼ処理によりそれが脱リン酸された後、溶液を
Aminex HPX-87H（３００×７.８cm）ＨＰＬＣカラム（B
io-Rad Laboratories GmbH, Munich, FRG）にかけ、製
造者の指示に従って６mM Ｈ2ＳＯ4を使用して６５℃の
温度で溶離して、Aminex HPX-87H ＨＰＬＣカラム上で
反応生成物のＤＸＰを１−デオキシ−Ｄ−キシルロース
として検出した。
ス５−ホスフェートシンターゼの酵素試験 １−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−ホスフェートシン
ターゼの酵素活性の試験を全量５０μl中２００mMのク
エン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ３.０、１０mMのピルベ
ート、３０mMのＤ,Ｌ−グリセルアルデヒド３−ホスフ
ェート、２０mMのＭｇＣｌ2、１.５mMのチアミンジホス
フェート（ＴＨＤＰ）、１mMのジチオトレイトール（Ｄ
ＴＴ）、０.４mMのエチレンジアミンテトラアセテート
（ＥＤＴＡ）、１μＣｉの［２−14Ｃ］−ピルベート及
び研究する試料の存在の下で実行した。３０℃で１〜４
時間のインキュベーションの後、２０％過塩素酸（５μ
ｌ）を添加して反応を止めた。上澄液を５モルのＫ2Ｃ
０3（８μｌ）で中和した。１５Ｕの子牛腸アルカリホ
スファターゼ（１.５μl, Boehringer Mannheim, No. 1
08138）をＤＸＳ反応上澄液の５μｌ分に添加し、混合
物を３０℃で３時間インキュベートした。アルカリホス
ファターゼ処理によりそれが脱リン酸された後、溶液を
Aminex HPX-87H（３００×７.８cm）ＨＰＬＣカラム（B
io-Rad Laboratories GmbH, Munich, FRG）にかけ、製
造者の指示に従って６mM Ｈ2ＳＯ4を使用して６５℃の
温度で溶離して、Aminex HPX-87H ＨＰＬＣカラム上で
反応生成物のＤＸＰを１−デオキシ−Ｄ−キシルロース
として検出した。
【００５０】ＤＸＰ及び１−デオキシ−Ｄ−キシルロー
スを直列に接続したＵＶモニター（１８５nm）及びラジ
オモニター（Berthold LB506C）を使用して検出した。
１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−ホスフェートはカ
ラムの排出液の中に溶離した。濃度及びシグナルの位置
はそれぞれの１−デオキシキシルロース誘導体の化学的
に合成した標準物質（T. Begley, Cornell University,
New YOrk, U.S.A. から入手した）を使用して決定し
た。ＤＸＳ酵素活性の１単位（Ｕ）は温度３０℃で１分
当たり１μmolのＤＸＰを形成するものと定義した。酵
素はチアミンジフォスフェート（ＴＨＤＰ）を含まない
緩衝液に対して透析するとその活性を失う。しかしなが
ら、ＴＨＤＰを添加すると５０％より上の活性が再構成
されることが可能であった。この点から、酵素は可逆的
なチアミンジホスフェート依存性活性を示す。
スを直列に接続したＵＶモニター（１８５nm）及びラジ
オモニター（Berthold LB506C）を使用して検出した。
１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−ホスフェートはカ
ラムの排出液の中に溶離した。濃度及びシグナルの位置
はそれぞれの１−デオキシキシルロース誘導体の化学的
に合成した標準物質（T. Begley, Cornell University,
New YOrk, U.S.A. から入手した）を使用して決定し
た。ＤＸＳ酵素活性の１単位（Ｕ）は温度３０℃で１分
当たり１μmolのＤＸＰを形成するものと定義した。酵
素はチアミンジフォスフェート（ＴＨＤＰ）を含まない
緩衝液に対して透析するとその活性を失う。しかしなが
ら、ＴＨＤＰを添加すると５０％より上の活性が再構成
されることが可能であった。この点から、酵素は可逆的
なチアミンジホスフェート依存性活性を示す。
【００５１】実施例５：反応生成物ＤＸＰの同定 ピルベート及びＧＡ３Ｐを、精製したＤＸＳの存在下で
実施例４に詳述した反応条件下で反応させた。４００.
１３Mhzにおける高分解能1ＨＮＭＲスペクトル及び１６
１.９７Mhzにおける31ＰＮＭＲスペクトルをＡＭＸ−４
００ＷＢ分光計（Bruker, Karlsruhe, FRG）上でプロッ
トして次のＤＸＰのデータを得た：５．４７（ｄ，１.
９Hz，１Ｈ）；４.３８（ｔｄ，６.５Hz，１.９Hz，1
Ｈ）；３.９０（ｄｄ，６.５Hz，７.３Hz，２Ｈ）；２.
３４（ｓ，３Ｈ）。これらの結果は化学的に合成した１
−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−ホスフェート（ＤＸ
Ｐ）で得られたＮＭＲデータと一致した。
実施例４に詳述した反応条件下で反応させた。４００.
１３Mhzにおける高分解能1ＨＮＭＲスペクトル及び１６
１.９７Mhzにおける31ＰＮＭＲスペクトルをＡＭＸ−４
００ＷＢ分光計（Bruker, Karlsruhe, FRG）上でプロッ
トして次のＤＸＰのデータを得た：５．４７（ｄ，１.
９Hz，１Ｈ）；４.３８（ｔｄ，６.５Hz，１.９Hz，1
Ｈ）；３.９０（ｄｄ，６.５Hz，７.３Hz，２Ｈ）；２.
３４（ｓ，３Ｈ）。これらの結果は化学的に合成した１
−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−ホスフェート（ＤＸ
Ｐ）で得られたＮＭＲデータと一致した。
【００５２】実施例６:１−デオキシ−Ｄ−キシルロー
ス５−ホスフェートシンターゼの阻害 実施例３に記述したように精製したＤＸＳ（T. Begley,
Cornell University,New York, U.S.A. から入手し
た）につき、実施例４に記述したようにそのインビトロ
活性を試験した。試験物質の不在下でそして１.２及び
１０mMのピルベートの存在下で測定した混合物の相対活
性をそれぞれ１００％と定義した。競合物質の存在下で
残存するＤＸＳ活性を、次いでピルベート類似体（各々
の場合１０mM）を添加した後確認した（表２）。
ス５−ホスフェートシンターゼの阻害 実施例３に記述したように精製したＤＸＳ（T. Begley,
Cornell University,New York, U.S.A. から入手し
た）につき、実施例４に記述したようにそのインビトロ
活性を試験した。試験物質の不在下でそして１.２及び
１０mMのピルベートの存在下で測定した混合物の相対活
性をそれぞれ１００％と定義した。競合物質の存在下で
残存するＤＸＳ活性を、次いでピルベート類似体（各々
の場合１０mM）を添加した後確認した（表２）。
【００５３】
【表２】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 シユテフアーニエ・ブリンガー−マイアー ドイツ連邦共和国52428ユーリヒ ヨーゼ フーラヒーア−シユトラーセ13 (72)発明者 ゲオルク・アー・シユプレンガー ドイツ連邦共和国52428ユーリヒ シユロ スシユトラーセ４ (72)発明者 ヘルマン・ザーム ドイツ連邦共和国52428ユーリヒ．ヴエン デリヌスシユトラーセ71 (72)発明者 ウルリヒ・シエルケン ドイツ連邦共和国52428ユーリヒ．ヴイー ゼンシユトラーセ６ゲー．アパートメント 181 (72)発明者 ジーグリト・グロレ ドイツ連邦共和国52428ユーリヒ．ヴイー ゼンシユトラーセ６ゲー．アパートメント 181 (72)発明者 アルノー・シユルツ ドイツ連邦共和国65817エプシユタイン. インデンアムトマンスヴイーゼン５ (72)発明者 ベルント・ラバー ドイツ連邦共和国65812バートゾーデン. タールシユトラーセ４ (54)【発明の名称】 １−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−ホスフェートシンターゼ、１−デオキシ−Ｄ−キシルロー ス５−ホスフェートシンターゼのエフェクターの同定方法及び１−デオキシ−Ｄ−キシルロース ５−ホスフェートシンターゼのエフェクター
Claims (13)
- 【請求項１】 ＤＸＳの機能を有する単離されたタンパ
ク質又はその活性断片。 - 【請求項２】 ａ) ＤＸＳの機能を有するタンパク質又
はその活性断片をコード化する核酸分子を宿主細胞にと
って適当な発現カセット中に挿入し、 ｂ) 得られる発現カセットを適当な方法で宿主細胞にと
って適当なベクターに挿入し、 ｃ) 得られるベクターで適当な宿主細胞を変換し、 ｄ) このように変換された宿主細胞を適当な培地で培養
し、そして ｅ) 前記宿主細胞によって生産されるＤＸＳの機能を有
するタンパク質又はその活性断片を培養培地又は宿主細
胞から適当な方法で単離することからなる組換え体宿主
細胞におけるＤＸＳの機能を有するタンパク質又はその
活性断片の製造方法。 - 【請求項３】 請求項２に記載の方法により製造するこ
とができるＤＸＳの機能を有する単離されたタンパク質
又はその活性断片。 - 【請求項４】 ａ) 試験物質の不在下でＤＸＳの酵素活
性を測定し、 ｂ) 前記試験物質の存在下でＤＸＳの酵素活性を測定
し、そして ｃ) ａ）及びｂ）で確認された酵素活性を比較すること
からなるＤＸＳエフェクターを確認する方法。 - 【請求項５】 ＤＸＳの機能を有するタンパク質又はそ
の活性断片の、ＤＸＳエフェクターを確認するための使
用。 - 【請求項６】 ＤＸＳエフェクターを確認するための請
求項４に記載の方法の使用。 - 【請求項７】 自動化された試験系における請求項６に
記載の使用。 - 【請求項８】 請求項４に記載の方法により確認するこ
とができるＤＸＳエフェクター。 - 【請求項９】 ピルベートの、ＧＡ３Ｐの又はＤＸＰの
構造類似体であるＤＸＳエフェクター。 - 【請求項１０】 農薬作用を有する請求項８及び９のい
ずれか一項に記載のエフェクター。 - 【請求項１１】 抗菌作用を有する請求項８及び９のい
ずれか一項に記載のエフェクター。 - 【請求項１２】 除草作用を有する請求項８及び９のい
ずれか一項に記載のエフェクター。 - 【請求項１３】 農薬として、除草剤として又は抗生物
質としての請求項８〜１２のいずれか一項に記載のエフ
ェクターの使用。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19752700A DE19752700A1 (de) | 1997-11-28 | 1997-11-28 | 1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat Synthase, Verfahren zur Identifizierung von Effektoren der 1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat Synthase und Effektoren der 1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat Synthase |
| DE19752700:0 | 1997-11-28 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11169186A true JPH11169186A (ja) | 1999-06-29 |
Family
ID=7850045
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10039499A Pending JPH11169186A (ja) | 1997-11-28 | 1998-01-16 | １−デオキシ−ｄ−キシルロース５−ホスフェートシンターゼ、１−デオキシ−ｄ−キシルロース５−ホスフェートシンターゼのエフェクターの同定方法及び１−デオキシ−ｄ−キシルロース５−ホスフェートシンターゼのエフェクター |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH11169186A (ja) |
| CA (1) | CA2219271A1 (ja) |
| DE (2) | DE19752700A1 (ja) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2175025A1 (en) | 1998-04-14 | 2010-04-14 | Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. | Process for producing isoprenoid compounds by using microorganisms |
| EP1071959A2 (de) * | 1998-04-14 | 2001-01-31 | Jomaa Hassan | Identifizierung chemischer wirkstoffe zur hemmung des 1-desoxy-d-xylulose-5-phosphat-biosynthesewegs in parasiten |
| AU757440B2 (en) * | 1998-08-05 | 2003-02-20 | Sungene Gmbh And Co. Kgaa | DNA sequence coding for a 1-deoxy-d-xylulose-5-phosphate synthase and the overproduction thereof in plants |
| IL141888A0 (en) * | 1998-09-22 | 2002-03-10 | Jomaa Pharmaka Gmbh | Genes of the 1-deoxy-d-xylulose biosynthetic pathway |
| JP2002532101A (ja) * | 1998-12-14 | 2002-10-02 | バッハー，アーデルバート | テルペノイド類生合成阻害剤のためのスクリーニング |
| GB9901902D0 (en) * | 1999-01-28 | 1999-03-17 | New Royal Holloway & Bedford | Manipulating isoprenoid expression |
| CN1351715A (zh) * | 1999-05-21 | 2002-05-29 | 朱马制药有限公司 | 脱氧－d－木酮糖磷酸生物合成途径的基因在改变类异戊二烯浓度中的应用 |
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