JP5035872B2 - パラゴムノキの非メバロン酸経路でのイソペンテニル二リン酸生合成に関与する遺伝子群 - Google Patents
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Description
本発明は、パラゴムノキの非メバロン酸経路でのイソペンテニル二リン酸生合成に関与する遺伝子群に関する。
各種ステロイド、テルペノイド、カロチノイド、各種ビタミンなどは炭素数5個のイソプレンがいくつか共有結合してできたものである。その基本となるイソプレン構造はイソプレン単位と呼ばれ、イソプレン単位をもつ化合物はイソプレノイドと総称される。炭素数５の化合物であるイソペンテニル二リン酸 (isopentenyl diphosphate、IPP)は、イソプレノイド化合物が生成するときの縮合反応の単位となる。IPPの生合成経路としては、メバロン酸経路と非メバロン酸経路の２つが存在することが知られている。植物においては、細胞質ではメバロン酸経路、色素体では非メバロン酸経路が働いているといわれている。大腸菌において非メバロン酸経路遺伝子について各遺伝子が単離され、機能が確認されている。しかしパラゴムノキにおいては、当該遺伝子群の配列は未報告である。なおIPP生合成の非メバロン酸経路を図１に示す。この経路によるイソプレノイドの生合成の詳細については、例えばW.Eisenreich et al., Cell.Mol.Life Sci.61(2004)1401-1426の総説などに記載されている。
非メバロン酸経路においては、まず、グリセルアルデヒド-3-リン酸とピルビン酸が1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸シンターゼ（DXS）の触媒によって脱炭酸反応を伴って縮合し、1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸（DXP）を産生する。DXSはトランスケトラーゼやピルビン酸デカルボキシラーゼと似た反応機構により、チアミン二リン酸をコファクターとして２炭酸移動を触媒する。
DXPは1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸リダクトイソメラーゼ（DXR）の触媒により、転移反応を受けたあとに還元され、2-C-メチル-D-エリスリトール-4-リン酸（MEP）を生じる。MEPはMEPシチジルトランスフェラーゼ（MCT）によりCDPと連結し、4-（シチジン-5’-ジホスホ）-2-C-メチル-D-エリスリトール（MEPPC）を生じる。MEPPCは4-（シチジン-5’-ジホスホ）-2-C-メチル-D-エリスリトールキナーゼ（CMK）により３位の水酸基がリン酸化され、4-（シチジン-5’-ジホスホ）-2-C-メチル-D-エリスリトール2-リン酸（MEPPCP）に変換される。
MEPPCPは2-C-メチルエリスリトール2,4-シクロジリン酸シンターゼ（MECPS）の触媒により、2-C-メチルエリスリトール2,4-シクロジリン酸（MECPP）を生じる。次にMECPPは還元的に1-ヒドロキシ-2-メチル-2-(E)-ブテニル4-リン酸（HMBPP）に変換される。そして更にHMBPPからIPPおよびDMAPPが生合成される。
W.Eisenreich et al., Cell.Mol.Life Sci.61(2004)1401-1426
W.Eisenreich et al., Cell.Mol.Life Sci.61(2004)1401-1426
そこで、パラゴムノキにおいて非メバロン酸経路でのIPPの生合成に関与している遺伝子群を単離し、当該遺伝子群を構成する各遺伝子の塩基配列を解析することが、本発明の課題である。
パラゴムノキのEST（Expression Sequence Tags）解析により得た遺伝子断片情報と既知遺伝子データベースとの統合解析により，非メバロン酸系IPP生合成遺伝子群と思われる配列を特定し，全長cDNAクローニングにより、非メバロン酸経路に関与する遺伝子ホモログを取得した。そして取得した各遺伝子についてその塩基配列を決定した。
非メバロン酸経路によるIPP生合成に関与する本発明の遺伝子群は、ビタミンEやカロテノイドの生合成に関与している。よって本発明で得られた遺伝子群で植物を形質転換することにより、ビタミンEやカロテノイドの含量が高い実用植物を作製可能である。より具体的には、本発明の遺伝子を導入して得られた形質転換したパラゴムノキは、耐老化性が向上した高品質のゴムを産生することが期待できる。特にビタミンE含量の向上により、ゴムを加工する際に添加する合成老化防止剤の量を削減することも可能となるなど、多くの効果が期待できる。
上記課題を達成するために本発明者らは、EST解析およびcDNAクローニングによる遺伝子塩基配列決定を行った。パラゴムノキ標準木の乳液（Latex）および当年枝の木部組織（Xylem）について、total RNAを抽出し、cDNAライブラリを作製した。これらについて網羅的なワンパスシークエンス解析を行った。乳液、木部組織由来のcDNAライブラリについて、それぞれ16407、16035の精度の高いEST配列が得られた（合計 32442）。得られた部分配列について、配列の類似性に基づいたクラスタリング解析と、既知遺伝子との比較に基づいたアノテーション解析を行い、パラゴムノキESTデータベースを構築した。
得られたESTデータベースにおいて、非メバロン酸経路の諸酵素、より具体的には、1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸シンターゼ、1-デオキシ-D-キシルロ−ス-5-リン酸リダクトイソメラーゼ、2-C-メチル-D-エリスリトール-4-リン酸シチジルトランスフェラーゼ、4-(シチジン-5’-ジホスホ)-2-C-メチル-D-エリスリトールキナーゼ、2-C-メチル-D-エリスリトール-2,4-シクロ二リン酸シンターゼ、1-ヒドロキシ-2-メチル-2-(E)-ブテニル-4-二リン酸シンターゼ、1-ヒドロキシ-2-メチル-ブテニル-4-二リン酸リダクターゼをコードすると推定されるEST配列を見出した。そしてこれらの配列について、3'-RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）により3’末端側の配列を決定し、完全長のcDNAを取得した。
1-デオキシ-D -キシルロース-5-リン酸シンターゼをコードする遺伝子を、配列表の配列番号1の塩基番号１から２５９１に示す。配列表の配列番号１の塩基配列において塩基番号２３５から２３９４に対応する部分が読み枠である。そしてその読み枠の塩基配列から得た1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸シンターゼの推定アミノ酸配列を、配列表の配列番号２のアミノ酸番号１から７２０に示す。なお、1-デオキシ-D -キシルロース-5-リン酸シンターゼは、ピルビン酸とグリセロアルデヒド3リン酸を基質として1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸を生合成する反応を触媒する酵素である。
1-デオキシ-D-キシルロ−ス-5-リン酸リダクトイソメラーゼをコードする遺伝子を、配列表の配列番号３の塩基番号１から１９２９に示す。なおこの配列にはベクターの配列が含まれており、そのベクター部分を除去した配列は、配列表の配列番号３の塩基番号１から１８８４に相当する。配列表の配列番号３の塩基配列において塩基番号３０１から１７１３に対応する部分が読み枠である。なおこの部分にはベクターの配列が含まれており、そのベクター部分を除去した読み枠は、配列表の配列番号３の塩基番号２５６から１６７１に相当する。そしてその読み枠の塩基配列から得た1-デオキシ-D-キシルロ−ス-5-リン酸リダクトイソメラーゼの推定アミノ酸配列を、配列表の配列番号４のアミノ酸番号１から４７１に示す。なお1-デオキシ-D-キシルロ−ス-5-リン酸リダクトイソメラーゼは、１-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸を基質として2-C-メチル-D-エリスリトール-4-リン酸を生合成する反応を触媒する酵素である。
2-C-メチル-D-エリスリトール-4-リン酸シチジルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を、配列表の配列番号５の塩基番号１から１３３５に示す。なおこの配列にはベクターの配列が含まれており、そのベクター部分を除去した配列は、配列表の配列番号５の塩基番号１から１３０１に相当する。配列表の配列番号５の塩基配列において塩基番号２１４から１１４６に対応する部分が読み枠である。なおこの部分にはベクターの配列が含まれており、そのベクター部分を除去した読み枠は、配列表の配列番号５の塩基番号１８０から１１１５に相当する。そしてその読み枠の塩基配列から得た2-C-メチル-D-エリスリトール-4-リン酸シチジルトランスフェラーゼの推定アミノ酸配列を、配列表の配列番号６のアミノ酸番号１から３１１に示す。なおに2-C-メチル-D-エリスリトール-4-リン酸シチジルトランスフェラーゼは、2-C-メチル-D-エリスリトール-4-リン酸を基質として4-(シチジン-5’-ジホスホ)-2-C-メチル-D-エリスリトールを生合成する反応を触媒する酵素である。
他のクローンから得られた2-C-メチル-D-エリスリトール-4-リン酸シチジルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を、配列表の配列番号７の塩基番号１から２０６９に示す。なおこの配列にはベクターの配列が含まれており、そのベクター部分を除去した配列は、配列表の配列番号７の塩基番号１から１２５４に相当する。配列表の配列番号７の塩基配列において塩基番号１８５から１１１７に対応する部分が読み枠である。なおこの部分にはベクターの配列が含まれており、そのベクター部分を除去した読み枠は、配列表の配列番号７の塩基番号１５０から１０８５に相当する。そしてその読み枠の塩基配列から得た2-C-メチル-D-エリスリトール-4-リン酸シチジルトランスフェラーゼの推定アミノ酸配列を、配列表の配列番号８のアミノ酸番号１から３１１に示す。なお2-C-メチル-D-エリスリトール-4-リン酸シチジルトランスフェラーゼは、2-C-メチル-D-エリスリトール-4-リン酸を基質として4-(シチジン-5’-ジホスホ)-2-C-メチル-D-エリスリトールを生合成する反応を触媒する酵素である。
4-(シチジン-5’-ジホスホ)-2-C-メチル-D-エリスリトールキナーゼをコードする遺伝子を、配列表の配列番号９の塩基番号１から１５１２に示す。配列表の配列番号９の塩基配列において塩基番号１１０から１２７６に対応する部分が読み枠である。そしてその読み枠の塩基配列から得た4-(シチジン-5’-ジホスホ)-2-C-メチル-D-エリスリトールキナーゼの推定アミノ酸配列を、配列表の配列番号１０のアミノ酸番号１から３８８に示す。なお、4-(シチジン-5’-ジホスホ)-2-C-メチル-D-エリスリトールキナーゼは、4-(シチジン-5’-ジホスホ)-2-C-メチル-D-エリスリトールを基質として4-(シチジン-5’-ジホスホ)-2-C-メチル-D-エリスリトール二リン酸を生合成する反応を触媒する酵素である。
2-C-メチル-D-エリスリトール-2,4-シクロ二リン酸シンターゼをコードする遺伝子を、配列表の配列番号１１の塩基番号１から１０３６に示す。配列表の配列番号１１の塩基配列において塩基番号１から７１４に対応する部分が読み枠である。そしてその読み枠の塩基配列から得た2-C-メチル-D-エリスリトール-2,4-シクロ二リン酸シンターゼの推定アミノ酸配列を、配列表の配列番号１２のアミノ酸番号１から２３７に示す。なお、2-C-メチル-D-エリスリトール-2,4-シクロ二リン酸シンターゼは、4-(シチジン-5’-ジホスホ)-2-C-メチル-D-エリスリトール二リン酸を基質として2-C-メチル-D-エリスリトール-2,4-シクロ二リン酸を生合成する反応を触媒する酵素である。
他のクローンから得られた2-C-メチル-D-エリスリトール-2,4-シクロ二リン酸シンターゼをコードする遺伝子を、配列表の配列番号１３の塩基番号１から９８９に示す。配列表の配列番号１３の塩基配列において塩基番号４９から７７４に対応する部分が読み枠である。そしてその読み枠の塩基配列から得た2-C-メチル-D-エリスリトール-2,4-シクロ二リン酸シンターゼの推定アミノ酸配列を、配列表の配列番号１４のアミノ酸番号１から２４１に示す。なお、2-C-メチル-D-エリスリトール-2,4-シクロ二リン酸シンターゼは、4-(シチジン-5’-ジホスホ)-2-C-メチル-D-エリスリトール二リン酸を基質として2-C-メチル-D-エリスリトール-2,4-シクロ二リン酸を生合成する反応を触媒する酵素である。
1-ヒドロキシ-2-メチル-2-(E)-ブテニル-4-二リン酸シンターゼをコードする遺伝子を、配列表の配列番号１５の塩基番号１から２７４５に示す。なおこの配列にはベクターの配列が含まれており、そのベクター部分を除去した配列は、配列表の配列番号１５の塩基番号１から２７１３に相当する。配列表の配列番号１５の塩基配列において塩基番号１８４から２４０３に対応する部分が読み枠である。なおこの部分にはベクターの配列が含まれており、そのベクター部分を除去した読み枠は、配列表の配列番号１５の塩基番号１５２から２３７４に相当する。そしてその読み枠の塩基配列から得た1-ヒドロキシ-2-メチル-2-(E)-ブテニル-4-二リン酸シンターゼの推定アミノ酸配列を、配列表の配列番号１６のアミノ酸番号１から７４０に示す。なお1-ヒドロキシ-2-メチル-2-(E)-ブテニル-4-二リン酸シンターゼは、2-C-メチル-D-エリスリトール-2,4-シクロ二リン酸を基質として1-ヒドロキシ-2-メチル-2-(E)-ブテニル4-二リン酸を生合成する反応を触媒する酵素である。
1-ヒドロキシ-2-メチル-ブテニル-4-二リン酸リダクターゼをコードする遺伝子を、配列表の配列番号１７の塩基番号１から１６８２に示す。なおこの配列にはベクターの配列が含まれており、そのベクター部分を除去した配列は、配列表の配列番号１７の塩基番号１から１６３２に相当する。配列表の配列番号１７の塩基配列において塩基番号１０７から１４９２に対応する部分が読み枠である。なおこの部分にはベクターの配列が含まれており、そのベクター部分を除去した読み枠は、配列表の配列番号１７の塩基番号５７から１４４５に相当する。そしてその読み枠の塩基配列から得た1-ヒドロキシ-2-メチル-ブテニル-4-二リン酸リダクターゼの推定アミノ酸配列を、配列表の配列番号１８のアミノ酸番号１から４６２に示す。なお1-ヒドロキシ-2-メチル-ブテニル-4-二リン酸リダクターゼは、1-ヒドロキシ-2-メチル-2-(E)-ブテニル4-二リン酸を基質としてイソペンテニル二リン酸とジメチルアリル二リン酸を生合成する反応を触媒する酵素である。
遺伝子組み換え技術によれば、基本となるDNA の特定の部位に、当該DNA の基本的な特性を変化させることなく、あるいはその特性を改善する様に、人為的に変異を起こすことができる。本発明により提供される天然の塩基配列を有する遺伝子、あるいは天然のものとは異なる塩基配列を有する遺伝子に関しても、同様に人為的に挿入、欠失、置換を行う事により、天然の遺伝子と同等のあるいは改善された特性を有するものとすることが可能であり、本発明はそのような変異遺伝子を含むものである。
即ち、配列表の配列番号１に示す遺伝子の一部が欠失、置換若しくは付加された遺伝子とは、配列番号１に示す塩基配列において、20個以下、好ましくは10個以下、更に好ましくは５個以下の塩基が置換された遺伝子である。また、その様な遺伝子と配列番号１に示す塩基配列とは、95％以上、好ましくは97％以上、更に好ましくは99％以上の相同性を有する。その様な遺伝子も、ピルビン酸とグリセロアルデヒド3リン酸を基質として1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸を生合成する1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸シンターゼとしての機能を有する蛋白質をコードする限り本発明の範囲内である。また、その様な遺伝子はストリンジェントな条件下で配列表の配列番号１に示す遺伝子とハイブリッドを形成する。
同様に、配列表の配列番号３に示す遺伝子の一部が欠失、置換若しくは付加された遺伝子とは、配列番号３に示す塩基配列において、20個以下、好ましくは10個以下、更に好ましくは５個以下の塩基が置換された遺伝子である。また、その様な遺伝子と配列番号３に示す塩基配列とは、95％以上、好ましくは97％以上、更に好ましくは99％以上の相同性を有する。その様な遺伝子も、１-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸を基質として2-C-メチル-D-エリスリトール-4-リン酸を生合成する1-デオキシ-D-キシルロ−ス-5-リン酸リダクトイソメラーゼとしての機能を有する蛋白質をコードする限り本発明の範囲内である。また、その様な遺伝子はストリンジェントな条件下で配列表の配列番号３に示す遺伝子とハイブリッドを形成する。
同様に、配列表の配列番号５に示す遺伝子の一部が欠失、置換若しくは付加された遺伝子とは、配列番号５に示す塩基配列において、20個以下、好ましくは10個以下、更に好ましくは５個以下の塩基が置換された遺伝子である。また、その様な遺伝子と配列番号５に示す塩基配列とは、95％以上、好ましくは97％以上、更に好ましくは99％以上の相同性を有する。その様な遺伝子も、2-C-メチル-D-エリスリトール-4-リン酸を基質として4-(シチジン-5’-ジホスホ)-2-C-メチル-D-エリスリトールを生合成する2-C-メチル-D-エリスリトール-4-リン酸シチジルトランスフェラーゼとしての機能を有する蛋白質をコードする限り本発明の範囲内である。また、その様な遺伝子はストリンジェントな条件下で配列表の配列番号５に示す遺伝子とハイブリッドを形成する。
同様に、配列表の配列番号７に示す遺伝子の一部が欠失、置換若しくは付加された遺伝子とは、配列番号７に示す塩基配列において、20個以下、好ましくは10個以下、更に好ましくは５個以下の塩基が置換された遺伝子である。また、その様な遺伝子と配列番号７に示す塩基配列とは、95％以上、好ましくは97％以上、更に好ましくは99％以上の相同性を有する。その様な遺伝子も、2-C-メチル-D-エリスリトール-4-リン酸を基質として4-(シチジン-5’-ジホスホ)-2-C-メチル-D-エリスリトールを生合成する2-C-メチル-D-エリスリトール-4-リン酸シチジルトランスフェラーゼとしての機能を有する蛋白質をコードする限り本発明の範囲内である。また、その様な遺伝子はストリンジェントな条件下で配列表の配列番号７に示す遺伝子とハイブリッドを形成する。
同様に、配列表の配列番号９に示す遺伝子の一部が欠失、置換若しくは付加された遺伝子とは、配列番号９に示す塩基配列において、20個以下、好ましくは10個以下、更に好ましくは５個以下の塩基が置換された遺伝子である。また、その様な遺伝子と配列番号９に示す塩基配列とは、95％以上、好ましくは97％以上、更に好ましくは99％以上の相同性を有する。その様な遺伝子も、4-(シチジン-5’-ジホスホ)-2-C-メチル-D-エリスリトールを基質として4-(シチジン-5’-ジホスホ)-2-C-メチル-D-エリスリトール二リン酸を生合成する4-(シチジン-5’-ジホスホ)-2-C-メチル-D-エリスリトールキナーゼとしての機能を有する蛋白質をコードする限り本発明の範囲内である。また、その様な遺伝子はストリンジェントな条件下で配列表の配列番号９に示す遺伝子とハイブリッドを形成する。
同様に、配列表の配列番号１１に示す遺伝子の一部が欠失、置換若しくは付加された遺伝子とは、配列番号１１に示す塩基配列において、20個以下、好ましくは10個以下、更に好ましくは５個以下の塩基が置換された遺伝子である。また、その様な遺伝子と配列番号１１に示す塩基配列とは、95％以上、好ましくは97％以上、更に好ましくは99％以上の相同性を有する。その様な遺伝子も、4-(シチジン-5’-ジホスホ)-2-C-メチル-D-エリスリトール二リン酸を基質として2-C-メチル-D-エリスリトール-2,4-シクロ二リン酸を生合成する2-C-メチル-D-エリスリトール-2,4-シクロ二リン酸シンターゼとしての機能を有する蛋白質をコードする限り本発明の範囲内である。また、その様な遺伝子はストリンジェントな条件下で配列表の配列番号１１に示す遺伝子とハイブリッドを形成する。
同様に、配列表の配列番号１３に示す遺伝子の一部が欠失、置換若しくは付加された遺伝子とは、配列番号１３に示す塩基配列において、20個以下、好ましくは10個以下、更に好ましくは５個以下の塩基が置換された遺伝子である。また、その様な遺伝子と配列番号１３に示す塩基配列とは、95％以上、好ましくは97％以上、更に好ましくは99％以上の相同性を有する。その様な遺伝子も、4-(シチジン-5’-ジホスホ)-2-C-メチル-D-エリスリトール二リン酸を基質として2-C-メチル-D-エリスリトール-2,4-シクロ二リン酸を生合成する2-C-メチル-D-エリスリトール-2,4-シクロ二リン酸シンターゼとしての機能を有する蛋白質をコードする限り本発明の範囲内である。また、その様な遺伝子はストリンジェントな条件下で配列表の配列番号１３に示す遺伝子とハイブリッドを形成する。
同様に、配列表の配列番号１５に示す遺伝子の一部が欠失、置換若しくは付加された遺伝子とは、配列番号１５に示す塩基配列において、20個以下、好ましくは10個以下、更に好ましくは５個以下の塩基が置換された遺伝子である。また、その様な遺伝子と配列番号１５に示す塩基配列とは、95％以上、好ましくは97％以上、更に好ましくは99％以上の相同性を有する。その様な遺伝子も、2-C-メチル-D-エリスリトール-2,4-シクロ二リン酸を基質として1-ヒドロキシ-2-メチル-2-(E)-ブテニル4-二リン酸を生合成する1-ヒドロキシ-2-メチル-2-(E)-ブテニル-4-二リン酸シンターゼとしての機能を有する蛋白質をコードする限り本発明の範囲内である。また、その様な遺伝子はストリンジェントな条件下で配列表の配列番号１５に示す遺伝子とハイブリッドを形成する。
同様に、配列表の配列番号１７に示す遺伝子の一部が欠失、置換若しくは付加された遺伝子とは、配列番号１７に示す塩基配列において、20個以下、好ましくは10個以下、更に好ましくは５個以下の塩基が置換された遺伝子である。また、その様な遺伝子と配列番号１７に示す塩基配列とは、95％以上、好ましくは97％以上、更に好ましくは99％以上の相同性を有する。その様な遺伝子も、1-ヒドロキシ-2-メチル-2-(E)-ブテニル4-二リン酸を基質としてイソペンテニル二リン酸とジメチルアリル二リン酸を生合成する1-ヒドロキシ-2-メチル-ブテニル-4-二リン酸リダクターゼとしての機能を有する蛋白質をコードする限り本発明の範囲内である。また、その様な遺伝子はストリンジェントな条件下で配列表の配列番号１７に示す遺伝子とハイブリッドを形成する。
ハイブリダイゼーションの条件については当業者が適宜選択をすることができるが、具体的には以下の操作によってハイブリダイゼーションを行うことができる。試験すべきDNA またはRNA 分子を転写した膜と標識したプローブを、適用なハイブリダイゼーションバッファー中でハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションバッファーの組成は、例えば、5 ×SSC 、 0.1重量% N-ラウロイルサルコシン、0.02重量% のSDS 、 2重量% の核酸ハイブルダイゼーション用ブロッキング試薬及び50% フォルムアミドから成る。核酸ハイブルダイゼーション用ブロッキング試薬としては、一例として、0.1Mマレイン酸と0.15M 塩化ナトリウムからなる緩衝液(pH7.5) に市販の核酸ハイブリダイゼーション用ブロッキング試薬を10% になるように溶解したものを使用することができる。20×SSC は、３Ｍ塩化ナトリウム、0.3 Ｍクエン酸溶液であり、SSC は、より好ましくは、３〜６×SSC 、更に好ましくは４〜５×SSC の濃度で使用する。
ハイブリダイゼーションの温度は、40〜80℃、より好ましくは50〜70℃、更に好ましくは55〜65℃の範囲であり、数時間から一晩のインキュベーションを行った後、洗浄バッファーで洗浄する。洗浄の温度は、好ましくは室温、より好ましくはハイブリダイゼーション時の温度である。洗浄バッファーの組成は６×SSC ＋０．１重量％SDS 溶液、より好ましくは４×SSC ＋０．１重量％SDS 溶液、更に好ましくは２×SSC ＋０．１重量％SDS 溶液、更に好ましくは１×SSC ＋０．１重量％SDS 溶液、最も好ましくは０．１×SSC ＋０．１重量％SDS 溶液である。このような洗浄バッファーで膜を洗浄し、プローブがハイブリダイズしたDNA 分子またはRNA 分子をプローブに用いた標識を利用して識別することができる。
更に本願明細書において、配列番号２に示すアミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加された蛋白質とは、配列番号２に示すアミノ酸配列において、20個以下、好ましくは10個以下、更に好ましくは５個以下のアミノ酸が置換された蛋白質である。また、その様な蛋白質と配列番号２に示すアミノ酸配列とは、95％以上、好ましくは97％以上、更に好ましくは99％以上の相同性を有する。その様な蛋白質も、ピルビン酸とグリセロアルデヒド3リン酸を基質として1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸を生合成する1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸シンターゼとしての機能を有する限り、本発明の範囲内である。
更に本願明細書において、配列番号４に示すアミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加された蛋白質とは、配列番号４に示すアミノ酸配列において、20個以下、好ましくは10個以下、更に好ましくは５個以下のアミノ酸が置換された蛋白質である。また、その様な蛋白質と配列番号４に示すアミノ酸配列とは、95％以上、好ましくは97％以上、更に好ましくは99％以上の相同性を有する。その様な蛋白質も、１-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸を基質として2-C-メチル-D-エリスリトール-4-リン酸を生合成する1-デオキシ-D-キシルロ−ス-5-リン酸リダクトイソメラーゼとしての機能を有する限り、本発明の範囲内である。
同様に、配列表の配列番号６に示すアミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加された蛋白質とは、配列番号６に示すアミノ酸配列において、20個以下、好ましくは10個以下、更に好ましくは５個以下のアミノ酸が置換された蛋白質である。また、その様な蛋白質と遺伝子と配列番号６に示すアミノ酸配列とは、95％以上、好ましくは97％以上、更に好ましくは99％以上の相同性を有する。その様な蛋白質も、2-C-メチル-D-エリスリトール-4-リン酸を基質として4-(シチジン-5’-ジホスホ)-2-C-メチル-D-エリスリトールを生合成する2-C-メチル-D-エリスリトール-4-リン酸シチジルトランスフェラーゼとしての機能を有する限り本発明の範囲内である。
同様に、配列表の配列番号８に示すアミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加された蛋白質とは、配列番号８に示すアミノ酸配列において、20個以下、好ましくは10個以下、更に好ましくは５個以下のアミノ酸が置換された蛋白質である。また、その様な蛋白質と遺伝子と配列番号８に示すアミノ酸配列とは、95％以上、好ましくは97％以上、更に好ましくは99％以上の相同性を有する。その様な蛋白質も、2-C-メチル-D-エリスリトール-4-リン酸を基質として4-(シチジン-5’-ジホスホ)-2-C-メチル-D-エリスリトールを生合成する2-C-メチル-D-エリスリトール-4-リン酸シチジルトランスフェラーゼとしての機能を有する限り本発明の範囲内である。
同様に、配列表の配列番号１０に示すアミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加された蛋白質とは、配列番号１０に示すアミノ酸配列において、20個以下、好ましくは10個以下、更に好ましくは５個以下のアミノ酸が置換された蛋白質である。また、その様な蛋白質と遺伝子と配列番号１０に示すアミノ酸配列とは、95％以上、好ましくは97％以上、更に好ましくは99％以上の相同性を有する。その様な蛋白質も、4-(シチジン-5’-ジホスホ)-2-C-メチル-D-エリスリトールを基質として4-(シチジン-5’-ジホスホ)-2-C-メチル-D-エリスリトール二リン酸を生合成する4-(シチジン-5’-ジホスホ)-2-C-メチル-D-エリスリトールキナーゼとしての機能を有する限り本発明の範囲内である。
同様に、配列表の配列番号１２に示すアミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加された蛋白質とは、配列番号１２に示すアミノ酸配列において、20個以下、好ましくは10個以下、更に好ましくは５個以下のアミノ酸が置換された蛋白質である。また、その様な蛋白質と遺伝子と配列番号１２に示すアミノ酸配列とは、95％以上、好ましくは97％以上、更に好ましくは99％以上の相同性を有する。その様な蛋白質も、4-(シチジン-5’-ジホスホ)-2-C-メチル-D-エリスリトール二リン酸を基質として2-C-メチル-D-エリスリトール-2,4-シクロ二リン酸を生合成する2-C-メチル-D-エリスリトール-2,4-シクロ二リン酸シンターゼとしての機能を有する限り本発明の範囲内である。
同様に、配列表の配列番号１４に示すアミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加された蛋白質とは、配列番号１４に示すアミノ酸配列において、20個以下、好ましくは10個以下、更に好ましくは５個以下のアミノ酸が置換された蛋白質である。また、その様な蛋白質と遺伝子と配列番号１４に示すアミノ酸配列とは、95％以上、好ましくは97％以上、更に好ましくは99％以上の相同性を有する。その様な蛋白質も、4-(シチジン-5’-ジホスホ)-2-C-メチル-D-エリスリトール二リン酸を基質として2-C-メチル-D-エリスリトール-2,4-シクロ二リン酸を生合成する2-C-メチル-D-エリスリトール-2,4-シクロ二リン酸シンターゼとしての機能を有する限り本発明の範囲内である。
同様に、配列表の配列番号１６に示すアミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加された蛋白質とは、配列番号１６に示すアミノ酸配列において、20個以下、好ましくは10個以下、更に好ましくは５個以下のアミノ酸が置換された蛋白質である。また、その様な蛋白質と遺伝子と配列番号１６に示すアミノ酸配列とは、95％以上、好ましくは97％以上、更に好ましくは99％以上の相同性を有する。その様な蛋白質も、2-C-メチル-D-エリスリトール-2,4-シクロ二リン酸を基質として1-ヒドロキシ-2-メチル-2-(E)-ブテニル4-二リン酸を生合成する1-ヒドロキシ-2-メチル-2-(E)-ブテニル-4-二リン酸シンターゼとしての機能を有する限り本発明の範囲内である。
同様に、配列表の配列番号１８に示すアミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加された蛋白質とは、配列番号１８に示すアミノ酸配列において、20個以下、好ましくは10個以下、更に好ましくは５個以下のアミノ酸が置換された蛋白質である。また、その様な蛋白質と遺伝子と配列番号１８に示すアミノ酸配列とは、95％以上、好ましくは97％以上、更に好ましくは99％以上の相同性を有する。その様な蛋白質も、1-ヒドロキシ-2-メチル-2-(E)-ブテニル4-二リン酸を基質としてイソペンテニル二リン酸とジメチルアリル二リン酸を生合成する1-ヒドロキシ-2-メチル-ブテニル-4-二リン酸リダクターゼとしての機能を有する限り本発明の範囲内である。
非メバロン酸経路のイソペンテニル二リン酸生合成に関与している本発明の遺伝子群を、ゴムノキなどの植物に遺伝子導入してその発現を増強することにより、非メバロン酸経路の遺伝子の産物を該植物において増加させることができる。非メバロン酸経路ではラテックスの主成分であるポリイソプレン（ゴム成分）以外の多くの非ゴム成分が合成される。特にビタミンEの１種であるトコトリエノールやカロテノイドは、ラテックスを加工した天然ゴム中で老化防止効果を示すことが知られており、この成分を増やせば、ゴム材料の耐老化性が向上することを期待することができる。なお本願明細書において「ゴムの性質を改良」とは、ビタミンEやカロテノイドなどの含量が天然ゴムの中で増加し、よって得られたゴムの耐老化性が増すという好ましい効果を奏することをいう。
なお本発明の遺伝子を導入する植物の例としては、パラゴムノキの他、グアユール、キャッサバ、ヒマワリ、レタス、インドゴムノキなどを挙げることができるが、形質転換を行う対象の植物はそれらの植物に限定されるものではなく、種々の植物において本発明の遺伝子を導入した形質転換体を作成することができる。中でもパラゴムノキなどのゴム産出植物を用いて形質転換を行い、該ゴム産出植物から得られるゴムの品質を向上させることは、本発明において好適な態様である。なおゴム産出植物は、キク科、クワ科、トウダイグサ科、ガガイモ科、キョウチクトウ科など多種の科に渡ることが知られている。
形質転換体の作製方法としては、本技術分野において知られている通常の方法を用いる事ができる。導入された遺伝子を活性化するために有用なプロモーターとして、例えば、本技術分野で汎用されているカリフラワーモザイクウイルス35S プロモーターを用いて、形質導入するべき本発明の遺伝子の上流に配置することができる。導入された外来遺伝子を十分に発現させるためには、多くの場合には何らかのプロモーターが必要とされるが、好適なプロモーターはカリフラワーモザイクウイルス35S プロモーターに限定されるものではなく、本技術分野において汎用されている種々のプロモーターを用いることも可能である。
また、本発明において使用可能なベクターとして、例えば、pIG121-Hm、pBI12、pBI221、pBIN19、pCC22、pGA482、pPCV001、pCGN1547、pJJ1881、pPZP111、pGreen0029、pBI101、pBI121、pYLTAC7などを挙げることができる。しかし使用できるベクターはそれらに限定されるものではない。そのようなベクターを、例えばアグロバクテリウム菌に導入して、カルス又は幼植物に感染させることにより、形質転換植物を作製する事が可能であり、更に、そのような形質転換植物に由来する種子を得る事が可能である。また、本発明の植物遺伝子を植物に導入する形質転換法は、アグロバクテリウム法に限定されるものではなく、パーティクルガン法、電気穿孔法等の、本技術分野において公知の種々の方法を用いる事も可能である。なおゴムノキにおいて外来遺伝子を導入して形質転換を行った例が、特開平８−１１６９７７号公報において開示されている。よって本技術分野の当業者は、例えば特開平８−１１６９７７号公報の記載を参考にして適宜工夫をして、本発明の遺伝子を導入した形質転換植物を作製することができる。
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの例に限定されるものではない。
（材料）
植物体試料として、Indonesia Cikaｍpekで栽培されているパラゴムノキ（Hevea brasiliensis）RRIM600標準木より採取した乳液および、当年枝の木部組織を用いた。乳液は採取後、直ちに等量の2×サンプリングバッファー（0.1M Tris-HCl, 0.3M LiCl, 0.01M EDTA, 10% SDS）に懸濁した。大腸菌変異株は、東京大学生物生産工学研究センターの葛山智久助教授から分与していただいたものを用いた。
植物体試料として、Indonesia Cikaｍpekで栽培されているパラゴムノキ（Hevea brasiliensis）RRIM600標準木より採取した乳液および、当年枝の木部組織を用いた。乳液は採取後、直ちに等量の2×サンプリングバッファー（0.1M Tris-HCl, 0.3M LiCl, 0.01M EDTA, 10% SDS）に懸濁した。大腸菌変異株は、東京大学生物生産工学研究センターの葛山智久助教授から分与していただいたものを用いた。
（パラゴムノキからの RNA 抽出）
乳液および木部組織からそれぞれ下記の手順でRNAを抽出した。
採取後、直ちに等量の2×サンプリングバッファー（0.1M Tris-HCl, 0.3M LiCl, 0.01M EDTA, 10% SDS）に懸濁したサンプル（乳液25 ml相当）を遠心分離し、上層のゴム層を取り除いた。さらに1.5倍量の2×CTAB 溶液 (2% ヘキサデシルトリメチルアンモニウム・ブロマイド(CTAB)、1% 2-メルカプトエタノール、0.1 M Tris-HCl (pH9.5)、1.4 M NaCl、 20 mM EDTA )を加え、65℃で10分間 インキュベートした後、クロロホルム/イソアミルアルコール 処理を行った (2 回くり返す) 。回収した水層に 1/4 量の10 M LiCl を加え混合し −20℃で 2 時間インキュベートした (RNA の選択的沈殿)。これを遠心分離し、沈殿を適量の TE に溶解、遠心し上清を回収した (多糖類を排除)。これについて フェノール処理、 フェノール/クロロホルム処理、クロロホルム/イソアミルアルコール 処理を行なった後、再度LiCl によるRNA の選択的沈殿を行った。沈殿を 70% エタノールで洗浄、減圧乾燥後 DEPC 処理水に溶解し、乳液由来total RNAを得た。
乳液および木部組織からそれぞれ下記の手順でRNAを抽出した。
採取後、直ちに等量の2×サンプリングバッファー（0.1M Tris-HCl, 0.3M LiCl, 0.01M EDTA, 10% SDS）に懸濁したサンプル（乳液25 ml相当）を遠心分離し、上層のゴム層を取り除いた。さらに1.5倍量の2×CTAB 溶液 (2% ヘキサデシルトリメチルアンモニウム・ブロマイド(CTAB)、1% 2-メルカプトエタノール、0.1 M Tris-HCl (pH9.5)、1.4 M NaCl、 20 mM EDTA )を加え、65℃で10分間 インキュベートした後、クロロホルム/イソアミルアルコール 処理を行った (2 回くり返す) 。回収した水層に 1/4 量の10 M LiCl を加え混合し −20℃で 2 時間インキュベートした (RNA の選択的沈殿)。これを遠心分離し、沈殿を適量の TE に溶解、遠心し上清を回収した (多糖類を排除)。これについて フェノール処理、 フェノール/クロロホルム処理、クロロホルム/イソアミルアルコール 処理を行なった後、再度LiCl によるRNA の選択的沈殿を行った。沈殿を 70% エタノールで洗浄、減圧乾燥後 DEPC 処理水に溶解し、乳液由来total RNAを得た。
また、当年枝からメスを用いて師部組織を剥離して得られた木部組織約1gを液体窒素で冷却しつつ乳鉢・乳棒で破砕し、RNeasy Plant Mini Kit（登録商標、QIAGEN社）を使用して、木部組織由来total RNAを得た。
得られた RNA 溶液について吸光度測定による定量と電気泳動による確認を行った。乳液 25mlから450μg、木部組織1gから110μgのRNAが得られた。
（パラゴムノキcDNAライブラリの作製）
パラゴムノキ乳液および木部組織由来 RNA 試料について、日立計測器サービス (株) にてG-キャッピング法により cDNA ライブラリを作製した。G-キャッピング法は cDNA 完全長率の高い手法である。
パラゴムノキ乳液および木部組織由来 RNA 試料について、日立計測器サービス (株) にてG-キャッピング法により cDNA ライブラリを作製した。G-キャッピング法は cDNA 完全長率の高い手法である。
乳液由来のcDNAライブラリのライブラリサイズは、1.7×105、インサート率は71% (24 サンプル/アガロースゲル電気泳動)、完全長率はインサートのあるクローンに対して82% であった。木部組織由来のcDNAライブラリのライブラリサイズは、2.9×105、インサート率は80% (24 サンプル/アガロースゲル電気泳動)、完全長率はインサートのあるクローンに対して87% であった。
（EST配列のシークエンス解析とクラスタリング解析およびアノテーション解析）
北里大学北里生命科学研究所ゲノム情報学研究室にて、パラゴムノキ乳液および木部組織由来 cDNA ライブラリそれぞれ約2万クローンについて網羅的なワンパスシークエンス解析を行った。シークエンス解析により得られた配列情報からインサートを保持しないクローン、シークエンスが読めていないものを除去し、精度の高い配列情報を得た。乳液、木部組織のライブラリについてそれぞれ16407、16035の精度の高い EST 配列が得られた（合計 32442）。
北里大学北里生命科学研究所ゲノム情報学研究室にて、パラゴムノキ乳液および木部組織由来 cDNA ライブラリそれぞれ約2万クローンについて網羅的なワンパスシークエンス解析を行った。シークエンス解析により得られた配列情報からインサートを保持しないクローン、シークエンスが読めていないものを除去し、精度の高い配列情報を得た。乳液、木部組織のライブラリについてそれぞれ16407、16035の精度の高い EST 配列が得られた（合計 32442）。
得られた部分配列について、配列の類似性に基づいたクラスタリング解析と、既知遺伝子との比較に基づいたアノテーション解析を行い、パラゴムノキESTデータベースを構築した。クラスタリング解析には、NTT ソフトウェア の VISUALBIO clustering を使用した。アノテーション解析は、NCBI BLAST を使用した相同性検索により行った。検索の際に使用したデータベースは nr (All non-redundant GenBank CDS translations + PDB + SwissProt + PIR (Peptide Sequence Database)) である。
得られたESTデータベースにおいて、非メバロン酸経路の諸酵素、すなわち、1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸シンターゼ、1-デオキシ-D-キシルロ−ス-5-リン酸リダクトイソメラーゼ、2-C-メチル-D-エリスリトール-4-リン酸シチジルトランスフェラーゼ、4-(シチジン-5’-ジホスホ)-2-C-メチル-D-エリスリトールキナーゼ、2-C-メチル-D-エリスリトール-2,4-シクロ二リン酸シンターゼ、1-ヒドロキシ-2-メチル-2-(E)-ブテニル-4-二リン酸シンターゼ、1-ヒドロキシ-2-メチル-ブテニル-4-二リン酸リダクターゼをコードすると推定されるEST配列を見出した。
（3'-RACE による 3'末端側の配列決定）
上記の解析により得られた各配列について3'-RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends, RACE) により 3' 末端側の配列を決定し、完全長の cDNA を取得した。3'-RACE には 3’-Full RACE Core Set （タカラバイオ (株)）を使用した。逆転写反応には oligo-dT primer を使用した。PCR による増幅にはoligo-dT primer と 既知配列の一部と同じ配列のsense primer を使用した。逆転写反応、PCR により得られた増幅断片を pT7Blue vector に TA クローニングした後シークエンス解析を行った。
上記の解析により得られた各配列について3'-RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends, RACE) により 3' 末端側の配列を決定し、完全長の cDNA を取得した。3'-RACE には 3’-Full RACE Core Set （タカラバイオ (株)）を使用した。逆転写反応には oligo-dT primer を使用した。PCR による増幅にはoligo-dT primer と 既知配列の一部と同じ配列のsense primer を使用した。逆転写反応、PCR により得られた増幅断片を pT7Blue vector に TA クローニングした後シークエンス解析を行った。
そのようにして得られた配列が、(1)1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸シンターゼの塩基配列（配列表の配列番号１）、(2)1-デオキシ-D-キシルロ−ス-5-リン酸リダクトイソメラーゼの遺伝子の塩基配列（配列表の配列番号３）、(3)2-C-メチル-D-エリスリトール-4-リン酸シチジルトランスフェラーゼの遺伝子の塩基配列（配列表の配列番号５）、(4)他のクローンに由来する2-C-メチル-D-エリスリトール-4-リン酸シチジルトランスフェラーゼの遺伝子の塩基配列（配列表の配列番号７）、(5)4-(シチジン-5’-ジホスホ)-2-C-メチル-D-エリスリトールキナーゼの遺伝子の塩基配列（配列表の配列番号９）、(6)2-C-メチル-D-エリスリトール-2,4-シクロ二リン酸シンターゼの遺伝子の塩基配列（配列表の配列番号１１）、(7)他のクローンに由来する2-C-メチル-D-エリスリトール-2,4-シクロ二リン酸シンターゼの遺伝子の塩基配列（配列表の配列番号１３）、(8)1-ヒドロキシ-2-メチル-2-(E)-ブテニル-4-二リン酸シンターゼの遺伝子の塩基配列（配列表の配列番号１５）、(9)1-ヒドロキシ-2-メチル-ブテニル-4-二リン酸リダクターゼの遺伝子の塩基配列（配列表の配列番号１７）である。
そしてそれらの塩基配列の読み枠から得られた蛋白質の推定アミノ酸配列が、(1)1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸シンターゼのアミノ酸配列（配列表の配列番号２）、(2)1-デオキシ-D-キシルロ−ス-5-リン酸リダクトイソメラーゼのアミノ酸配列（配列表の配列番号４）、(3)2-C-メチル-D-エリスリトール-4-リン酸シチジルトランスフェラーゼのアミノ酸配列（配列表の配列番号６）、(4)他のクローンに由来する2-C-メチル-D-エリスリトール-4-リン酸シチジルトランスフェラーゼのアミノ酸配列（配列表の配列番号８）、(5)4-(シチジン-5’-ジホスホ)-2-C-メチル-D-エリスリトールキナーゼのアミノ酸配列（配列表の配列番号１０）、(6)2-C-メチル-D-エリスリトール-2,4-シクロ二リン酸シンターゼのアミノ酸配列（配列表の配列番号１２）、(7)他のクローンに由来する2-C-メチル-D-エリスリトール-2,4-シクロ二リン酸シンターゼのアミノ酸配列（配列表の配列番号１４）、(8)1-ヒドロキシ-2-メチル-2-(E)-ブテニル-4-二リン酸シンターゼのアミノ酸配列（配列表の配列番号１６）、(9)1-ヒドロキシ-2-メチル-ブテニル-4-二リン酸リダクターゼのアミノ酸配列（配列表の配列番号１８）である。
（大腸菌変異株を用いた相補性試験）
上記の手順で得られた配列のうち、1-デオキシ-D-キシルロ−ス-5-リン酸リダクトイソメラーゼ、2-C-メチル-D-エリスリトール-4-リン酸シチジルトランスフェラーゼ、2-C-メチル-D-エリスリトール-2,4-シクロ二リン酸シンターゼについては該当する遺伝子を欠損した大腸菌変異株を用いた相補性試験により各遺伝子の機能を確認した。
上記の手順で得られた配列のうち、1-デオキシ-D-キシルロ−ス-5-リン酸リダクトイソメラーゼ、2-C-メチル-D-エリスリトール-4-リン酸シチジルトランスフェラーゼ、2-C-メチル-D-エリスリトール-2,4-シクロ二リン酸シンターゼについては該当する遺伝子を欠損した大腸菌変異株を用いた相補性試験により各遺伝子の機能を確認した。
適当な制限酵素サイトを付加したsense primer と antisense primer を用いた PCR により、パラゴムノキの1-デオキシ-D-キシルロ−ス-5-リン酸リダクトイソメラーゼ、2-C-メチル-D-エリスリトール-4-リン酸シチジルトランスフェラーゼ、2-C-メチル-D-エリスリトール-2,4-シクロ二リン酸シンターゼの各遺伝子の翻訳領域の配列を増幅した。増幅断片をpMW118ベクター (nippon gene)にインフレームでクローニングした。
解析対象とする遺伝子は大腸菌にとって必須である。相補試験のバックグラウンドとして用いる1-デオキシ-D-キシルロ−ス-5-リン酸リダクトイソメラーゼ遺伝子欠損株は、培地に2-C-メチルエリスリトールを加えることで生育が可能である。また、2-C-メチル-D-エリスリトール-4-リン酸シチジルトランスフェラーゼ、2-C-メチル-D-エリスリトール-2,4-シクロ二リン酸シンターゼ遺伝子欠損株は、放線菌Streptomyces sp. CL190 株由来のメバロン酸経路に関与する遺伝子クラスター（HMG-CoA reductase, mevalonate kinase, phosphomevalonate kinase, diphosphomevalonate kinase）を含むプラスミド（pTMV20KM）が導入されており、導入したメバロン酸経路酵素により培地にメバロン酸を加えることで生育が可能である。これらの大腸菌変異株は、東京大学生物生産工学研究センターの葛山智久助教授から分与していただいた。なお本実験で用いた1-デオキシ-D-キシルロ−ス-5-リン酸リダクトイソメラーゼ欠損株はKuzuyama et al., Biosci.Biotechnol.Biochem.,63(4),776-778.1999に、2-C-メチル-D-エリスリトール-4-リン酸シチジルトランスフェラーゼと2-C-メチル-D-エリスリトール-2,4-シクロ二リン酸シンターゼ遺伝子欠損株はTakagi et al.,Tetrahedron Letters 41(2000)3395-3398に、それぞれ記載されている。
これらの変異株に、該当するパラゴムノキ由来の目的遺伝子の翻訳領域を含むpMW118ベクターを導入した。形質転換後の大腸菌の変異株は、導入したパラゴムノキ由来の目的遺伝子により機能が相補されていれば、2-C-メチルエリスリトールやメバロン酸を含まない通常のLB培地上で生育が可能となるはずである。このように相補の確認を行うことによって、目的遺伝子の機能特定を行った結果、1-デオキシ-D-キシルロ−ス-5-リン酸リダクトイソメラーゼ１つ、2-C-メチル-D-エリスリトール-4-リン酸シチジルトランスフェラーゼ２つ、2-C-メチル-D-エリスリトール-2,4-シクロ二リン酸シンターゼ２つについて機能を確認することができた。そのデータを以下に述べる。
1-デオキシ-D-キシルロ−ス-5-リン酸リダクトイソメラーゼの相補実験のデータを図２に、2-C-メチル-D-エリスリトール-4-リン酸シチジルトランスフェラーゼの相補実験のデータを図３に、2-C-メチル-D-エリスリトール-2,4-シクロ二リン酸シンターゼの相補実験のデータを図４に、それぞれ示す。
なお図２において、シャーレの１に対応する部分は野生株の系を、シャーレの２に対応する部分は大腸菌変異株の系を、シャーレの３に対応する部分は大腸菌変異株に大腸菌遺伝子ゲノム断片を加えた系を、シャーレの４に対応する部分は大腸菌変異株に大腸菌遺伝子ORFを加えた系を、シャーレの５に対応する部分は大腸菌変異株にアラビドプシス遺伝子ORFを加えた系を、シャーレの６に対応する部分は大腸菌変異株にシグナル配列を除去したアラビドプシス遺伝子ORFを加えた系を、シャーレの７に対応する部分は大腸菌変異株にパラゴムノキ遺伝子ORFを加えた系を、シャーレの８に対応する部分は大腸菌変異株にシグナル配列を除去したアラビドプシス遺伝子ORFを加えた系を、それぞれ示す。
更に図３と図４において、シャーレの１に対応する部分は野生株の系を、シャーレの２に対応する部分は大腸菌変異株の系を、シャーレの３に対応する部分は大腸菌変異株に大腸菌遺伝子ゲノム断片を加えた系を、シャーレの４に対応する部分は大腸菌変異株に大腸菌遺伝子ORFを加えた系を、シャーレの５に対応する部分は大腸菌変異株にアラビドプシス遺伝子ORFを加えた系を、シャーレの６に対応する部分は大腸菌変異株にシグナル配列を除去したアラビドプシス遺伝子ORFを加えた系を、シャーレの７と９に対応する部分は大腸菌変異株にパラゴムノキ遺伝子ORFを加えた系を、シャーレの８と１０に対応する部分は大腸菌変異株にシグナル配列を除去したアラビドプシス遺伝子ORFを加えた系を、それぞれ示す。
図２から図４において見られるように、野生株（シャーレの１に対応する部分）は正常に生育したが、大腸菌変異株（シャーレの２に対応する部分）はこの培地中で生育することができなかった。しかし、大腸菌変異株に試験する遺伝子を補ってやると大腸菌変異株は生育可能となり、相補されることが認められた。
本発明により、パラゴムノキの非メバロン酸経路に関与する遺伝子群が採取され、それらの遺伝子の塩基配列が決定された。非メバロン酸経路のIPP生合成に関与する本発明の遺伝子群は、ビタミンEやカロテノイドの生合成に関与している。よって本発明で得られた遺伝子群で植物を形質転換することにより、ビタミンEやカロテノイドの含量が高い実用植物を作成可能である。より具体的には、本発明の遺伝子群を導入して得られたパラゴムノキは、耐老化性が向上した高品質ゴムを産生することが期待できる。
Claims (34)
- 以下の（ａ）または（ｂ）に示すアミノ酸配列からなることを特徴とする蛋白質。
（ａ）配列表の配列番号２に示す、アミノ酸番号１−７２０で示されるアミノ酸配列。
（ｂ）ピルビン酸とグリセロアルデヒド3リン酸を基質として1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸を生合成する1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸シンターゼとしての機能を有する、（ａ）の一部が欠損、置換若しくは付加されたアミノ酸配列。 - 請求項１記載の蛋白質をコードする遺伝子。
- 以下の（ａ）または（ｂ）に示す塩基配列からなることを特徴とする遺伝子。
（ａ）配列表の配列番号１に示す、塩基番号２３５−２３９４で示される塩基配列。
（ｂ）ピルビン酸とグリセロアルデヒド3リン酸を基質として1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸を生合成する1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸シンターゼとしての機能を有する蛋白質をコードし、（ａ）の一部が欠損、置換若しくは付加された塩基配列。 - 以下の（ａ）または（ｂ）に示す塩基配列からなることを特徴とする遺伝子。
（ａ）配列表の配列番号１に示す、塩基番号１−２５９１で示される塩基配列。
（ｂ）ピルビン酸とグリセロアルデヒド3リン酸を基質として1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸を生合成する1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸シンターゼとしての機能を有する蛋白質をコードし、（ａ）の一部が欠損、置換若しくは付加された塩基配列。 - 請求項２乃至請求項４のいずれか一つの請求項記載の遺伝子を植物に導入することにより、該植物が産生するゴムの性質が改良された形質転換植物。
- 請求項２乃至請求項４のいずれか一つの請求項記載の遺伝子を植物に導入することにより、該植物が産生するゴムの性質を改良する方法。
- 以下の（ａ）または（ｂ）に示すアミノ酸配列からなることを特徴とする蛋白質。
（ａ）配列表の配列番号６に示す、アミノ酸番号１−３１１で示されるアミノ酸配列。
（ｂ）2-C-メチル-D-エリスリトール-4-リン酸を基質として4-(シチジン-5’-ジホスホ)-2-C-メチル-D-エリスリトールを生合成する2-C-メチル-D-エリスリトール-4-リン酸シチジルトランスフェラーゼとしての機能を有する、（ａ）の一部が欠損、置換若しくは付加されたアミノ酸配列。 - 請求項７記載の蛋白質をコードする遺伝子。
- 以下の（ａ）または（ｂ）に示す塩基配列からなることを特徴とする遺伝子。
（ａ）配列表の配列番号５に示す、塩基番号１８０−１１１５で示される塩基配列。
（ｂ）2-C-メチル-D-エリスリトール-4-リン酸を基質として4-(シチジン-5’-ジホスホ)-2-C-メチル-D-エリスリトールを生合成する2-C-メチル-D-エリスリトール-4-リン酸シチジルトランスフェラーゼとしての機能を有する蛋白質をコードし、（ａ）の一部が欠損、置換若しくは付加された塩基配列。 - 以下の（ａ）または（ｂ）に示す塩基配列からなることを特徴とする遺伝子。
（ａ）配列表の配列番号５に示す、塩基番号２１４−１１４６で示される塩基配列。
（ｂ）2-C-メチル-D-エリスリトール-4-リン酸を基質として4-(シチジン-5’-ジホスホ)-2-C-メチル-D-エリスリトールを生合成する2-C-メチル-D-エリスリトール-4-リン酸シチジルトランスフェラーゼとしての機能を有する蛋白質をコードし、（ａ）の一部が欠損、置換若しくは付加された塩基配列。 - 以下の（ａ）または（ｂ）に示す塩基配列からなることを特徴とする遺伝子。
（ａ）配列表の配列番号５に示す、塩基番号１−１３０１で示される塩基配列。
（ｂ）2-C-メチル-D-エリスリトール-4-リン酸を基質として4-(シチジン-5’-ジホスホ)-2-C-メチル-D-エリスリトールを生合成する2-C-メチル-D-エリスリトール-4-リン酸シチジルトランスフェラーゼとしての機能を有する蛋白質をコードし、（ａ）の一部が欠損、置換若しくは付加された塩基配列。 - 以下の（ａ）または（ｂ）に示す塩基配列からなることを特徴とする遺伝子。
（ａ）配列表の配列番号５に示す、塩基番号１−１３３５で示される塩基配列。
（ｂ）2-C-メチル-D-エリスリトール-4-リン酸を基質として4-(シチジン-5’-ジホスホ)-2-C-メチル-D-エリスリトールを生合成する2-C-メチル-D-エリスリトール-4-リン酸シチジルトランスフェラーゼとしての機能を有する蛋白質をコードし、（ａ）の一部が欠損、置換若しくは付加された塩基配列。 - 請求項８乃至請求項１２のいずれか一つの請求項記載の遺伝子を植物に導入することにより、該植物が産生するゴムの性質が改良された、形質転換植物。
- 請求項８乃至請求項１２のいずれか一つの請求項記載の遺伝子を植物に導入することにより、該植物が産生するゴムの性質を改良する方法。
- 以下の（ａ）または（ｂ）に示すアミノ酸配列からなることを特徴とする蛋白質。
（ａ）配列表の配列番号８に示す、アミノ酸番号１−３１１で示されるアミノ酸配列。
（ｂ）2-C-メチル-D-エリスリトール-4-リン酸を基質として4-(シチジン-5’-ジホスホ)-2-C-メチル-D-エリスリトールを生合成する2-C-メチル-D-エリスリトール-4-リン酸シチジルトランスフェラーゼとしての機能を有する、（ａ）の一部が欠損、置換若しくは付加されたアミノ酸配列。 - 請求項１５記載の蛋白質をコードする遺伝子。
- 以下の（ａ）または（ｂ）に示す塩基配列からなることを特徴とする遺伝子。
（ａ）配列表の配列番号７に示す、塩基番号１５０−１０８５で示される塩基配列。
（ｂ）2-C-メチル-D-エリスリトール-4-リン酸を基質として4-(シチジン-5’-ジホスホ)-2-C-メチル-D-エリスリトールを生合成する2-C-メチル-D-エリスリトール-4-リン酸シチジルトランスフェラーゼとしての機能を有する蛋白質をコードし、（ａ）の一部が欠損、置換若しくは付加された塩基配列。 - 以下の（ａ）または（ｂ）に示す塩基配列からなることを特徴とする遺伝子。
（ａ）配列表の配列番号７に示す、塩基番号１８５−１１１７で示される塩基配列。
（ｂ）2-C-メチル-D-エリスリトール-4-リン酸を基質として4-(シチジン-5’-ジホスホ)-2-C-メチル-D-エリスリトールを生合成する2-C-メチル-D-エリスリトール-4-リン酸シチジルトランスフェラーゼとしての機能を有する蛋白質をコードし、（ａ）の一部が欠損、置換若しくは付加された塩基配列。 - 以下の（ａ）または（ｂ）に示す塩基配列からなることを特徴とする遺伝子。
（ａ）配列表の配列番号７に示す、塩基番号１−１２５４で示される塩基配列。
（ｂ）2-C-メチル-D-エリスリトール-4-リン酸を基質として4-(シチジン-5’-ジホスホ)-2-C-メチル-D-エリスリトールを生合成する2-C-メチル-D-エリスリトール-4-リン酸シチジルトランスフェラーゼとしての機能を有する蛋白質をコードし、（ａ）の一部が欠損、置換若しくは付加された塩基配列。 - 以下の（ａ）または（ｂ）に示す塩基配列からなることを特徴とする遺伝子。
（ａ）配列表の配列番号７に示す、塩基番号１−２０６９で示される塩基配列。
（ｂ）2-C-メチル-D-エリスリトール-4-リン酸を基質として4-(シチジン-5’-ジホスホ)-2-C-メチル-D-エリスリトールを生合成する2-C-メチル-D-エリスリトール-4-リン酸シチジルトランスフェラーゼとしての機能を有する蛋白質をコードし、（ａ）の一部が欠損、置換若しくは付加された塩基配列。 - 請求項１６乃至請求項２０のいずれか一つの請求項記載の遺伝子を植物に導入することにより、該植物が産生するゴムの性質が改良された、形質転換植物。
- 請求項１６乃至請求項２０のいずれか一つの請求項記載の遺伝子を植物に導入することにより、該植物が産生するゴムの性質を改良する方法。
- 以下の（ａ）または（ｂ）に示すアミノ酸配列からなることを特徴とする蛋白質。
（ａ）配列表の配列番号１２に示す、アミノ酸番号１−２３７で示されるアミノ酸配列。
（ｂ）4-(シチジン-5’-ジホスホ)-2-C-メチル-D-エリスリトール二リン酸を基質として2-C-メチル-D-エリスリトール-2,4-シクロ二リン酸を生合成する2-C-メチル-D-エリスリトール-2,4-シクロ二リン酸シンターゼとしての機能を有する、（ａ）の一部が欠損、置換若しくは付加されたアミノ酸配列。 - 請求項２３記載の蛋白質をコードする遺伝子。
- 以下の（ａ）または（ｂ）に示す塩基配列からなることを特徴とする遺伝子。
（ａ）配列表の配列番号１１に示す、塩基番号１−７１４で示される塩基配列。
（ｂ）4-(シチジン-5’-ジホスホ)-2-C-メチル-D-エリスリトール二リン酸を基質として2-C-メチル-D-エリスリトール-2,4-シクロ二リン酸を生合成する2-C-メチル-D-エリスリトール-2,4-シクロ二リン酸シンターゼとしての機能を有する蛋白質をコードし、（ａ）の一部が欠損、置換若しくは付加された塩基配列。 - 以下の（ａ）または（ｂ）に示す塩基配列からなることを特徴とする遺伝子。
（ａ）配列表の配列番号１１に示す、塩基番号１−１０３６で示される塩基配列。
（ｂ）4-(シチジン-5’-ジホスホ)-2-C-メチル-D-エリスリトール二リン酸を基質として2-C-メチル-D-エリスリトール-2,4-シクロ二リン酸を生合成する2-C-メチル-D-エリスリトール-2,4-シクロ二リン酸シンターゼとしての機能を有する蛋白質をコードし、（ａ）の一部が欠損、置換若しくは付加された塩基配列。 - 請求項２４乃至請求項２６のいずれか一つの請求項記載の遺伝子を植物に導入することにより、該植物が産生するゴムの性質が改良された、形質転換植物。
- 請求項２４乃至請求項２６のいずれか一つの請求項記載の遺伝子を植物に導入することにより、該植物が産生するゴムの性質を改良する方法。
- 以下の（ａ）または（ｂ）に示すアミノ酸配列からなることを特徴とする蛋白質。
（ａ）配列表の配列番号１４に示す、アミノ酸番号１−２４１で示されるアミノ酸配列。
（ｂ）4-(シチジン-5’-ジホスホ)-2-C-メチル-D-エリスリトール二リン酸を基質として2-C-メチル-D-エリスリトール-2,4-シクロ二リン酸を生合成する2-C-メチル-D-エリスリトール-2,4-シクロ二リン酸シンターゼとしての機能を有する、（ａ）の一部が欠損、置換若しくは付加されたアミノ酸配列。 - 請求項２９記載の蛋白質をコードする遺伝子。
- 以下の（ａ）または（ｂ）に示す塩基配列からなることを特徴とする遺伝子。
（ａ）配列表の配列番号１３に示す、塩基番号４９−７７４で示される塩基配列。
（ｂ）4-(シチジン-5’-ジホスホ)-2-C-メチル-D-エリスリトール二リン酸を基質として2-C-メチル-D-エリスリトール-2,4-シクロ二リン酸を生合成する2-C-メチル-D-エリスリトール-2,4-シクロ二リン酸シンターゼとしての機能を有する蛋白質をコードし、（ａ）の一部が欠損、置換若しくは付加された塩基配列。 - 以下の（ａ）または（ｂ）に示す塩基配列からなることを特徴とする遺伝子。
（ａ）配列表の配列番号１３に示す、塩基番号１−９８９で示される塩基配列。
（ｂ）4-(シチジン-5’-ジホスホ)-2-C-メチル-D-エリスリトール二リン酸を基質として2-C-メチル-D-エリスリトール-2,4-シクロ二リン酸を生合成する2-C-メチル-D-エリスリトール-2,4-シクロ二リン酸シンターゼとしての機能を有する蛋白質をコードし、（ａ）の一部が欠損、置換若しくは付加された塩基配列。 - 請求項３０乃至請求項３２のいずれか一つの請求項記載の遺伝子を植物に導入することにより、該植物が産生するゴムの性質が改良された、形質転換植物。
- 請求項３０乃至請求項３２のいずれか一つの請求項記載の遺伝子を植物に導入することにより、該植物が産生するゴムの性質を改良する方法。
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