JP2013226153A - トチュウのメバロン酸経路の酵素をコードする遺伝子 - Google Patents

Abstract

【課題】トチュウのイソプレノイド化合物の生合成に関与する遺伝子群を提供すること。
【解決手段】トチュウにおけるメバロン酸からイソペンテニル二リン酸の合成に関与する遺伝子を提供する。本発明の遺伝子は、HMG-CoAシンターゼをコードする。イソペンテニル二リン酸の合成は、イソプレノイド化合物の生合成における初期の合成経路であるメバロン酸経路で行われる。メバロン酸経路には、以下の酵素が関与する：（１）アセチル-CoA C-アセチルトランスフェラーゼ；（２）3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-CoAシンターゼ；（３）HMG-CoAレダクターゼ；（４）メバロン酸キナーゼ；（５）ホスホメバロン酸キナーゼ；および（６）メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ。
【選択図】なし

Description

本発明は、トチュウのイソプレノイド化合物の生合成に関与する遺伝子群に関する。

イソプレノイド化合物の一種であるポリイソプレン（ゴム）は、イソプレン単位の重合の様式の違いからシス型とトランス型とに分類される。長鎖シス型ポリイソプレンを生産する植物としては、タンポポ、アキノノゲシなどの多くの植物が知られている。パラゴムノキ（Hevea brasiliensis）が生産するシス型ポリイソプレンは、天然ゴムとして商業的に広く利用されている。一方、長鎖トランス型ポリイソプレンについては、天然にはグッタペルカノキなどの少数の植物が生産することが知られているが、商業的には利用されていない。現在、トランス型ポリイソプレンは、化学的に合成され、ゴルフボール外皮、ギプス、スポーツプロテクターなどに使用されている。トランス型ポリイソプレンは、低融点および高弾性を示す熱可塑性エラストマーであり、絶縁体としても有用である。

イソプレノイド化合物は、炭素数５の化合物であるイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）を単位とする縮合反応により生成される。メバロン酸経路は、イソプレノイド化合物の生合成における初期の合成経路の１つである。動物・植物・菌類では、メバロン酸経路によりＩＰＰが生合成される。

ＩＰＰ生合成経路として、メバロン酸経路の他に非メバロン酸経路が存在する。植物においては、細胞質ではメバロン酸経路、色素体では非メバロン酸経路が働いているとされている。

メバロン酸経路にて作用する酵素の遺伝子は、種々の植物において公知である。例えば、Kutki（Picrorhiza kurrooa）（根にはイリドイド配糖体が多く含まれる）では、アセチル-CoA C-アセチルトランスフェラーゼ（塩基配列はGenBank登録番号DQ347964およびアミノ酸配列は登録番号ABC74567）、パラゴムノキ（シス型ポリイソプレンを合成する）では、HMG-CoAシンターゼ（塩基配列は登録番号AF429389およびアミノ酸配列は登録番号AAS46245）、HMG-CoAレダクターゼ（塩基配列は登録番号X54659およびアミノ酸配列は登録番号P29057）、メバロン酸キナーゼ（塩基配列は登録番号AF429384およびアミノ酸配列は登録番号AAL18925）、ホスホメバロン酸キナーゼ（塩基配列は登録番号AF429385およびアミノ酸配列は登録番号AAL18926）、およびメバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ（塩基配列は登録番号AF429386およびアミノ酸配列は登録番号AAL18927）が登録されている。

中国原産の木本植物であるトチュウ（杜仲、Eucommia ulmoides Oliver）は、繊維状の長鎖トランス型ポリイソプレンを産生する。トチュウの葉、樹皮、および種皮には大量のトランス型ポリイソプレンが含まれている（非特許文献１）。

また、トチュウは、その樹皮が滋養強壮および高血圧症の民間治療薬として、古くから用いられている。トチュウには、イソプレノイド化合物の一種であるイリドイドの配糖体（ゲニポシド酸）が含まれており（非特許文献２および３）、これには血圧降下作用があるとされている。

以上のように、トチュウは、トランス型ポリイソプレンおよびイリドイドのような有用なイソプレノイド化合物を含んでいる。

ゴム高含有植物を作製するために、トチュウにおけるＩＰＰ生合成経路に関与する遺伝子の取得が望まれている。従来、目的の生物種からある機能を有する相同遺伝子を取得する場合、公知遺伝子のＤＮＡ断片を用いたハイブリダイゼーションスクリーニング、または公知遺伝子の塩基配列を利用した縮重ＰＣＲとこれに引き続く5'-RACE、3'-RACEおよびRT-PCRとを組み合わせる方法が利用されてきた。しかしながら、これらの方法は確実性が低く、大変煩雑である。特に、目的遺伝子の保存領域が不明なものについては、これらの方法は適用されにくい。

トチュウの遺伝子配列の解析が行われている（非特許文献４および５）。非特許文献４には、メバロン酸経路に関与する酵素の１つであるHMG-CoAレダクターゼの遺伝子およびその配列が報告されている。しかし、メバロン酸経路に関与するそれ以外の酵素に関しては未だ報告はない。

Bamba T, Fukusaki E, Nakazawa Y, およびKobayashi A, In-situ chemical analyses of trans-polyisoprene by histochemical staining and Fourier transform infrared microspectroscopy in a rubber-producing plant, Eucommia ulmoides Oliver. Planta 215: 934-939 (2002) Kawasaki, T., Uezono, K., およびNakazawa, Y., Antihypertensive mechanism of food for specified health use: "Eucommia leaf glycoside" and its clinical application, J. Health Sci., 22, 29-36 (2000) Nakamura, T., Nakazawa, Y., Onizuka, S., Tanaka, C., Yahara, S. およびNohara, T., Studies on the constituents of Eucommia ulmoides iridoids from the leaves, Natural Medicines, 51, 275-277 (1997) Jiang J, Kai G, Cao X, およびChen F, Molecular cloning of a HMG-CoA reductase gene from Eucommia ulmoides Oliver. Biosci Rep 26: 171-181 (2006) Hou H-W, Zhou Y-T, Mwange K-N, Li W-F, He X-Q, およびCui K-M, ABP1 expression regulated by IAA and ABA is associated with the cambium periodicity in Eucommia ulmoides Oliv. J Exp Bot 57: 3857-3867 (2006)

本発明は、トチュウのイソプレノイド化合物の生合成に関与する遺伝子群を提供することを目的とする。

本発明は、トチュウにおけるメバロン酸からイソペンテニル二リン酸の合成に関与する遺伝子を提供する。上記遺伝子は、配列番号２に記載のアミノ酸配列の１位から４０８位までのアミノ酸からなるタンパク質、配列番号４に記載のアミノ酸配列の１位から４０８位までのアミノ酸からなるタンパク質、配列番号６に記載のアミノ酸配列の１位から４６３位までのアミノ酸からなるタンパク質、配列番号８に記載のアミノ酸配列の１位から４６６位までのアミノ酸からなるタンパク質、配列番号１２に記載のアミノ酸配列の１位から６２９位までのアミノ酸からなるタンパク質、配列番号１４に記載のアミノ酸配列の１位から５９１位までのアミノ酸からなるタンパク質、配列番号１６に記載のアミノ酸配列の１位から３８７位までのアミノ酸からなるタンパク質、配列番号１８に記載のアミノ酸配列の１位から５０６位までのアミノ酸からなるタンパク質、および配列番号２０に記載のアミノ酸配列の１位から４１８位までのアミノ酸からなるタンパク質からなる群から選択されるタンパク質をコードする。

１つの実施態様では、上記遺伝子は、配列番号１に記載の塩基配列の１０１位から１３２７位までのヌクレオチドを含む遺伝子、配列番号３に記載の塩基配列の１２８位から１３５４位までのヌクレオチドを含む遺伝子、配列番号５に記載の塩基配列の１７２位から１５６３位までのヌクレオチドを含む遺伝子、配列番号７に記載の塩基配列の２１６位から１６１６位までのヌクレオチドを含む遺伝子、配列番号１１に記載の塩基配列の３２位から１９２１位までのヌクレオチドを含む遺伝子、配列番号１３に記載の塩基配列の６０位から１８３５位までのヌクレオチドを含む遺伝子、配列番号１５に記載の塩基配列の６１位から１２２４位までのヌクレオチドを含む遺伝子、配列番号１７に記載の塩基配列の６８２位から２２０２位までのヌクレオチドを含む遺伝子、および配列番号１９に記載の塩基配列の６８位から１３２４位までのヌクレオチドを含む遺伝子からなる群から選択される。

さらなる実施態様では、上記遺伝子は、配列番号１に記載の塩基配列の１位から１５１６位までのヌクレオチドを含む遺伝子、配列番号３に記載の塩基配列の１位から１７５７位までのヌクレオチドを含む遺伝子、配列番号５に記載の塩基配列の１位から１８９２位までのヌクレオチドを含む遺伝子、配列番号７に記載の塩基配列の１位から１８３３位までのヌクレオチドを含む遺伝子、配列番号９に記載の塩基配列の１位から１８２５位までのヌクレオチドを含む遺伝子、配列番号１１に記載の塩基配列の１位から２０５７位までのヌクレオチドを含む遺伝子、配列番号１３に記載の塩基配列の１位から２２２５位までのヌクレオチドを含む遺伝子、配列番号１５に記載の塩基配列の１位から１３４１位までのヌクレオチドを含む遺伝子、配列番号１７に記載の塩基配列の１位から２４３２位までのヌクレオチドを含む遺伝子、および配列番号１９に記載の塩基配列の１位から１５４２位までのヌクレオチドを含む遺伝子からなる群から選択される。

本発明によれば、トチュウにおけるメバロン酸からイソペンテニル二リン酸の合成に関与する遺伝子が提供される。

本発明は、トチュウにおけるメバロン酸からイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）の合成に関与する遺伝子を提供する。ＩＰＰの合成は、イソプレノイド化合物の生合成における初期の合成経路であるメバロン酸経路で行われる。メバロン酸経路には、以下の酵素が関与する：（１）アセチル-CoA C-アセチルトランスフェラーゼ（acetyl-CoA C-acetyltransferase）；（２）3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-CoA（HMG-CoA）シンターゼ（3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA（HMG-CoA）synthase）；（３）HMG-CoAレダクターゼ（HMG-CoA reductase）；（４）メバロン酸キナーゼ（mevalonate kinase）；（５）ホスホメバロン酸キナーゼ（phosphomevalonate kinase）；および（６）メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ（mevalonate pyrophosphate decarboxylase）（「ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ」ともいう）。メバロン酸経路では、（１）アセチル-CoA C-アセチルトランスフェラーゼによりアセチル-CoAからアセトアセチル-CoAが合成され、（２）HMG-CoAシンターゼによりアセトアセチル-CoAからHMG-CoAが合成され、（３）HMG-CoAレダクターゼによりHMG-CoAがメバロン酸に変換され、（４）メバロン酸キナーゼおよび（５）ホスホメバロン酸キナーゼによりメバロン酸がメバロン酸５−二リン酸に変換され、そして（６）メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼによりイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）が生成される。

本発明の遺伝子は、配列番号２に記載のアミノ酸配列の１位から４０８位までのアミノ酸からなるタンパク質（以下、「配列番号２のタンパク質」ともいう）；配列番号４に記載のアミノ酸配列の１位から４０８位までのアミノ酸からなるタンパク質（以下、「配列番号４のタンパク質」ともいう）；配列番号６に記載のアミノ酸配列の１位から４６３位までのアミノ酸からなるタンパク質（以下、「配列番号６のタンパク質」ともいう）；配列番号８に記載のアミノ酸配列の１位から４６６位までのアミノ酸からなるタンパク質（以下、「配列番号８のタンパク質」ともいう）；配列番号１２に記載のアミノ酸配列の１位から６２９位までのアミノ酸からなるタンパク質（以下、「配列番号１２のタンパク質」ともいう）；配列番号１４に記載のアミノ酸配列の１位から５９１位までのアミノ酸からなるタンパク質（以下、「配列番号１４」のタンパク質ともいう）；配列番号１６に記載のアミノ酸配列の１位から３８７位までのアミノ酸からなるタンパク質（以下、「配列番号１６のタンパク質」ともいう）；配列番号１８に記載のアミノ酸配列の１位から５０６位までのアミノ酸からなるタンパク質（以下、「配列番号１８のタンパク質」ともいう）；および配列番号２０に記載のアミノ酸配列の１位から４１８位までのアミノ酸からなるタンパク質（以下、「配列番号２０のタンパク質」ともいう）からなる群から選択されるタンパク質をコードする。配列番号１０の１位から４６６位までのアミノ酸からなるタンパク質は、配列番号８のタンパク質と同じである。

配列番号２のタンパク質および配列番号４のタンパク質は、（１）アセチル-CoA C-アセチルトランスフェラーゼである。配列番号２のタンパク質は、配列番号１に記載の塩基配列の１０１位から１３２７位までのヌクレオチドを含む遺伝子によりコードされ得る。この遺伝子は、例えば、配列番号１の全塩基配列（１位から１５１６位）からなり得る。配列番号４のタンパク質は、配列番号３に記載の塩基配列の１２８位から１３５４位までのヌクレオチドを含む遺伝子によりコードされ得る。この遺伝子は、例えば、配列番号３の全塩基配列（１位から１７５７位）からなり得る。

配列番号６のタンパク質および配列番号８のタンパク質は、（２）HMG-CoAシンターゼである。配列番号６のタンパク質は、配列番号５に記載の塩基配列の１７２位から１５６３位までのヌクレオチドを含む遺伝子によりコードされ得る。この遺伝子は、例えば、配列番号５の全塩基配列（１位から１８９２位）からなり得る。配列番号８のタンパク質は、配列番号７に記載の塩基配列の２１６位から１６１６位まで（または配列番号９に記載の塩基配列の２１６位から１６１６位まで）のヌクレオチドを含む遺伝子によりコードされ得る。この遺伝子には、例えば、配列番号７に記載の塩基配列の１位から１８３３位までのヌクレオチドからなる遺伝子、および配列番号９に記載の塩基配列の１位から１８２５位までのヌクレオチドからなる遺伝子が含まれる。配列番号９に示される塩基配列を有する遺伝子は、その１６８９位から１８２５位までの領域において、配列番号７に示される塩基配列を有する遺伝子の１６８９位から１８３３位までの領域に対して、６箇所（配列番号７に記載の塩基配列の１６８９位、１７０９位、１７１３位、１７４５位、１７５６位、および１８２０位）の置換および１箇所（配列番号７に記載の塩基配列の１７７７位）の欠失および３’末端のポリアデニル部位の短縮を有する。

配列番号１２のタンパク質および配列番号１４のタンパク質は、（３）HMG-CoAレダクターゼである。配列番号１２のタンパク質は、配列番号１１に記載の塩基配列の３２位から１９２１位までのヌクレオチドを含む遺伝子によりコードされ得る。この遺伝子は、例えば、配列番号１１の全塩基配列（１位から２０５７位）からなり得る。配列番号１４のタンパク質は、配列番号１３に記載の塩基配列の６０位から１８３５位までのヌクレオチドを含む遺伝子によりコードされ得る。この遺伝子は、例えば、配列番号１３の全塩基配列（１位から２２２５位）からなり得る。

配列番号１６のタンパク質は、（４）メバロン酸キナーゼである。配列番号１６のタンパク質は、配列番号１５に記載の塩基配列の６１位から１２２４位までのヌクレオチドを含む遺伝子によりコードされ得る。この遺伝子は、例えば、配列番号１５の全塩基配列（１位から１３４１位）からなり得る。

配列番号１８のタンパク質は、（５）ホスホメバロン酸キナーゼである。配列番号１８のタンパク質は、配列番号１７に記載の塩基配列の６８２位から２２０２位までのヌクレオチドを含む遺伝子によりコードされ得る。この遺伝子は、例えば、配列番号１７の全塩基配列（１位から２４３２位）からなり得る。

配列番号２０のタンパク質は、（６）メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼである。配列番号２０のタンパク質は、配列番号１９に記載の塩基配列の６８位から１３２４位までのヌクレオチドを含む遺伝子によりコードされ得る。この遺伝子は、例えば、配列番号１９の全塩基配列（１位から１５４２位）からなり得る。

本発明の遺伝子は、上記のアミノ酸配列を有する酵素と機能的に同等な酵素を発現可能であるか、または上記の塩基配列を有する遺伝子と同様に機能し得る限り、１または数個のアミノ酸残基が異なるタンパク質をコードするか、または１または数個の塩基が異なるものでもあり得る。このような配列の相違は、塩基の置換、欠失、および／または挿入に由来し得、天然による変異誘発または人為的な変異誘発（例えば、部位特異的変異導入法の使用）のいずれでも生じ得る。遺伝子の機能の特定は、例えば、以下の実施例２に本質的に記載される方法のような、当業者が通常用いる方法を用いて行い得る。

本発明の遺伝子は、当業者が通常用いる方法を用いて、本明細書に記載の配列情報に基づいてプローブまたはプライマーを作製し、トチュウの染色体ＤＮＡもしくはｃＤＮＡを鋳型として用いるＰＣＲによって目的の断片を得ることができる。もちろん、ＲＮＡを鋳型として逆転写ＰＣＲを利用してもよい。本発明の遺伝子は、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの天然のポリヌクレオチドに加え、人工的なヌクレオチド誘導体を含む人工的な分子であり得る。また本発明の遺伝子は、ＤＮＡ−ＲＮＡのキメラ分子でもあり得る。

本発明の遺伝子は、当業者が通常用いる方法を用いて、酵母のような微生物、および植物に導入し得る。本発明の遺伝子は、宿主において、１つまたは複数、あるいは全部が発現されるように、形質転換され得る。例えば、メバロン酸経路に存在する一群の酵素（上記の（１）から（６））の少なくとも１つを発現するように構成してもよい。

本発明の遺伝子は、トランス型ポリイソプレンあるいはイリドイドを大量に含有する遺伝子組換え植物（例えば、トチュウ）を作製するために好適に用いられ得る。本発明の遺伝子は、例えば、トチュウに形質転換することにより、ゴムを多く含む植物を作製するために用いられ得る。

以下に、実施例を示して本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されない。

（実施例１：トチュウにおけるＥＳＴ解析）
（材料）
トチュウ植物体試料として、愛媛県生名村に生育するトチュウ標準木より５月下旬に採取した若い当年枝の師部（樹皮）および木部を使用した。

酵母の変異株ライブラリは、市販のYKO Heterozygous Essential Strain Collection-Glycerol Stocks（Open Biosystems社）を使用した。

（トチュウからのＲＮＡ抽出）
トチュウ植物体試料（当年枝の師部および木部）約４ｇを、液体窒素で冷却しつつ乳鉢・乳棒で破砕し、試料の１０倍量（w/v）の２×CTAB溶液（２％（w/v）ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイド（CTAB）、１％（w/v）2-メルカプトエタノール、0.1M Tris-HCl（pH9.5）、1.4M NaCl、20mM EDTA）に懸濁した。これを65℃にて１０分間インキュベートし、次いでクロロホルム／イソアミルアルコールで処理（洗浄）した（２回くり返す）。回収した水層に1/4（v/v）量の10M LiClを加えて混合し、−20℃にて２時間インキュベートし、ＲＮＡの選択的沈殿を行った。これを遠心分離し、沈殿を適量のトリス-EDTA（TE）緩衝液に溶解、遠心分離し、上清を回収して、多糖類を排除した。回収した上清をフェノール処理、フェノール／クロロホルム処理、およびクロロホルム／イソアミルアルコール処理し、再度LiClによるＲＮＡの選択的沈殿を行った。沈殿を７０％エタノールで洗浄し、減圧乾燥し、次いでジエチルピロカーボネート（DEPC）処理水に溶解した。得られたＲＮＡを吸光度測定により定量し、そして電気泳動によって確認した。木部約４ｇから0.84mgおよび師部約４ｇから２mgのＲＮＡが得られた（260nmと280nmとにおける吸収の比は、それぞれ1.956および1.991であった）。

（トチュウｃＤＮＡライブラリの作製）
トチュウ師部および木部由来ＲＮＡ試料から、日立計測器サービス株式会社にてＧ−キャッピング法によりｃＤＮＡライブラリを作製した。師部由来のｃＤＮＡライブラリは、ライブラリーサイズが3.8×10^５、インサート率が、８８％（２４サンプル／アガロースゲル電気泳動）、完全長率が８６％（インサートのあるクローンに対して）であった。木部由来のｃＤＮＡライブラリは、ライブラリーサイズが2.2×10^５、インサート率が７９％（２４サンプル／アガロースゲル電気泳動）、完全長率が６３％（インサートのあるクローンに対して）であった。

（ＥＳＴ配列の配列解析）
北里大学北里生命科学研究所ゲノム情報学研究室にて、トチュウ師部および木部由来ｃＤＮＡライブラリの各々約20000クローンについて配列解析を行った。配列解析により得られた配列情報から、インサートを保持しないクローンおよび配列が読めていないクローンを除去し、精度の高い配列情報を得た。師部および木部のライブラリについて、それぞれ16567および16113の精度の高いＥＳＴ配列が得られた（合計32680）。

得られた配列について、グループ分け（clustering）および注釈付け（annotation）を行った。「グループ分け」は、ＥＳＴ配列の中で同一の配列、類似した配列をグループ分けする。グループ分けのために、ＮＴＴソフトウェアのVISUALBIO clusteringを使用した。「注釈付け」は、既知遺伝子との比較によりＥＳＴ配列の注釈付けを行う。注釈付けには、NCBI BLASTを使用した相同性検索を用いた。検索の際に使用したデータベースは、nr（All non-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+PIR（Peptide Sequence Database)）である。

グループ分けおよび注釈付けで得られた情報により、アセチル-CoA C-アセチルトランスフェラーゼ、HMG-CoAシンターゼ、HMG-CoAレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、およびメバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼをコードすると推定されるＥＳＴ配列を見いだした。これらの酵素はいずれも、トチュウのイソプレノイド化合物の生合成における初期の合成経路に関与する酵素である。

（実施例２：アセチル-CoA C-アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子１）
（完全ｃＤＮＡの取得）
実施例１の解析により得られた配列から、3'-RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends, RACE）により3'末端側の配列を決定し、完全長のｃＤＮＡを取得した。

3'-RACEには、3'-Full RACE Core Set（タカラバイオ株式会社）を使用した。逆転写反応には、oligo-dTプライマーを使用した。ＰＣＲによる増幅には、oligo-dTプライマーと、既知配列の一部と同じ配列のセンスプライマーとを使用した。センスプライマーは、実施例１で得たアセチル-CoA C-アセチルトランスフェラーゼをコードすると推定されるＥＳＴ配列の情報に基づいて設計した。実施例１で得たＲＮＡを鋳型として、１回目にN192-82-tree_1968_3R_s1（配列番号２１）を、そして２回目にN192-82-tree_1968_3R_s2（配列番号２２）をセンスプライマーとして使用し、ＰＣＲを指示書どおりに行った。逆転写反応およびＰＣＲにより得られた増幅断片をpT7BlueベクターにTAクローニングし、配列解析した。

得られた完全長のｃＤＮＡは、配列番号１の塩基配列を有する。配列番号１に記載の塩基配列の１４６位から１２９９位までヌクレオチドで示される領域の塩基配列は、Kutkiのアセチル-CoA C-アセチルトランスフェラーゼ（GenBank登録番号DQ347964）と８２％の相同性を有する。オープンリーディングフレームは、１０１位から１３２７位までであった。このｃＤＮＡによりコードされる推定アミノ酸配列は、配列番号２に示す通りである。配列番号２に記載の全アミノ酸配列（１位から４０８位）は、Kutkiのアセチル-CoA C-アセチルトランスフェラーゼ（登録番号ABC74567）と８９％の相同性を有する。

（酵母変異株ライブラリを用いた相補性試験）
得られたｃＤＮＡの機能を、酵母変異株ライブラリを用いた相補性試験を用いて確認した。この相補性試験は、以下の通りに行った。

pYES2ベクター（invitrogen）のマルチクローニングサイトの40bpと同じ配列を付加したセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーを用いたＰＣＲ（９５℃にて５分を１サイクル；９５℃にて１分、５４℃にて１分、および７２℃にて１分を３０サイクル；７２℃にて７分を１サイクル；ならびに４℃ ∞を１サイクル）により、目的遺伝子の翻訳領域の配列を増幅した。

この増幅断片と、制限酵素処理により直鎖状にしたpYES2ベクターとを、Ura⁻の酵母株Y22800（EUROSCARF）に導入した。この酵母は、解析対象とするアセチル-CoA C-アセチルトランスフェラーゼ遺伝子が酵母の生育にとって必須であるため、相補試験のバックグラウンドとして、一方の対立遺伝子のみが目的遺伝子を欠損しているヘテロ二倍体を用いた。遺伝子導入には、Frozen-EZ Yeast Transformation II（ZYMO RESEARCH）を使用した。形質転換後の酵母を最少完全培地（ウラシルなし）に播いて、30℃で培養した。生育したコロニーを新しい最少完全培地（ウラシルなし）に播き、次いで30℃で培養した。酵母変異株はウラシル要求性であり、pYES2ベクターには、URA3遺伝子（オロチジン5'-リン酸デカルボキシラーゼをコードする）の配列が含まれているので、形質転換した菌体のみが生育する。生育した菌体がインサートを含むことをＰＣＲによりチェックし、次いで、この菌体をYPDA培地に移し、30℃で培養した。これを胞子形成培地に移し、25℃で培養し、得られた胞子を四分子分析に供した。

pYES2ベクターのマルチクローニングサイトに挿入した目的遺伝子の上流にGAL1プロモーターが存在するので、目的遺伝子は、ガラクトース存在下でのみ発現誘導される。したがって、YPD培地またはYPG培地（炭素源：ガラクトース）上での生育の有無を判定した。YPD培地では、変異株由来の二分子は致死であり、野生型由来の二分子のみが生育する。一方、YPG培地（炭素源：ガラクトース）上では、GAL1プロモーターを有するpYES2ベクターが挿入遺伝子の発現を誘導するため、機能を相補できれば、変異株由来のものが生存可能となり、三分子または四分子が生育すると考えられる。このように相補の確認を行うことによって、目的遺伝子の機能特定を行った。

さらに、四分子分析により得られた８胞子嚢由来のコロニー（一倍体と考えられる）を、（Ａ）YPG培地（炭素源：ガラクトース）、（Ｂ）最少完全培地（炭素源：ガラクトース、ウラシルを含まない）、（Ｃ）YPG培地（炭素源：ガラクトース、抗生物質G418を含む）、または（Ｄ）YPD培地（炭素源：グルコース）にレプリカした。

プラスミドを保持している株は、（Ｂ）の最少完全培地（炭素源：ガラクトース、ウラシルを含まない）で生育すると考えられる。変異株は、G418耐性遺伝子を有するので、（Ｃ）のYPG培地（炭素源：ガラクトース、抗生物質G418を含む）で生育すると考えられる。これらの培地における生育の結果から、プラスミドを保持した一倍体の変異株を判別できる。（Ｄ）のYPD培地（炭素源：グルコース）では、プラスミドを保持した変異株（一倍体）は生育できないはずであるが、実際には生育の有無が判別し難かったため、ストリークすることで生育の有無を判別した。

本実施例では、センスプライマーとしてN219-36-tree_1968_s（配列番号２３）およびアンチセンスプライマーとしてN219-36-tree_1968_a（配列番号２４）を用いて、上記の「完全ｃＤＮＡの取得」で得たｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、目的の翻訳領域の配列を増幅した。この増幅断片を、上記の相補性試験に供した。四分子分析では、YPG培地（炭素源：ガラクトース）上での生育が観察された。さらに、８胞子嚢由来のコロニーを用いた生育観察より、（Ｂ）の最少完全培地（炭素源：ガラクトース、ウラシルを含まない）での生育が観察された。この結果、相補により、アセチル-CoA C-アセチルトランスフェラーゼ遺伝子の機能が特定できた。

（実施例３：アセチル-CoA C-アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子２）
3'-RACE用のセンスプライマーとして、実施例１で得たアセチル-CoA C-アセチルトランスフェラーゼをコードすると推定されるＥＳＴ配列の情報に基づいて設計したN192-84-tree_11012_3R_s1（配列番号２５）（１回目）およびN192-84-tree_11012_3R_s2（配列番号２６）（２回目）を用いたこと以外は、実施例２と同様にして、完全長ｃＤＮＡを得た。

得られた完全長のｃＤＮＡは、配列番号３の塩基配列を有する。配列番号３に記載の塩基配列の１７３位から１３０５位までヌクレオチドで示される領域の塩基配列は、Kutkiのアセチル-CoA C-アセチルトランスフェラーゼ（登録番号DQ347964）と８３％の相同性を有する。オープンリーディングフレームは、１２８位から１３５４位までであった。このｃＤＮＡによりコードされる推定アミノ酸配列は、配列番号４に示す通りである。配列番号４に記載の全アミノ酸配列（１位から４０８位）は、Kutkiのアセチル-CoA C-アセチルトランスフェラーゼ（登録番号ABC74567）と８７％の相同性を有する。

本実施例では、センスプライマーとしてN219-36-tree_11012_s（配列番号２７）およびアンチセンスプライマーとしてN219-36-tree_11012_a（配列番号２８）を用いて、上記で得たｃＤＮＡを鋳型としたこと以外は、実施例２と同様にＰＣＲを行い、目的の翻訳領域の配列を増幅した。この増幅断片を、実施例２と同様に相補性試験に供し、実施例２と同様の結果が得られた。四分子分析では、YPG培地（炭素源：ガラクトース）上での生育が観察された。さらに、８胞子嚢由来のコロニーを用いた生育観察より、（Ｂ）の最少完全培地（炭素源：ガラクトース、ウラシルを含まない）での生育が観察された。この結果、相補により、アセチル-CoA C-アセチルトランスフェラーゼ遺伝子の機能が特定できた。

（実施例４：HMG-CoAシンターゼをコードする遺伝子１）
3'-RACE用のセンスプライマーとして、実施例１で得たHMG-CoAシンターゼをコードすると推定されるＥＳＴ配列の情報に基づいて設計したN192-71-tree_6098_3R_s1（配列番号２９）（１回目）およびN192-71-tree_6098_3R_s2（配列番号３０）（２回目）を用いたこと以外は、実施例２と同様にして、完全長ｃＤＮＡを得た。

得られた完全長のｃＤＮＡは、配列番号５の塩基配列を有する。配列番号５に記載の塩基配列の１７２位から１１８７位までのヌクレオチドで示される領域および１３９０位から１４３９位までのヌクレオチドで示される領域の塩基配列はそれぞれ、パラゴムノキのHMG-CoAシンターゼ（登録番号AF429389）と８３％および８６％の相同性を有する。オープンリーディングフレームは、１７２位から１５６３位までであった。このｃＤＮＡによりコードされる推定アミノ酸配列は、配列番号６に示す通りである。配列番号６に記載の全アミノ酸配列（１位から４６３位）は、パラゴムノキのHMG-CoAシンターゼ（登録番号AAS46245）と８５％の相同性を有する。

本実施例では、センスプライマーとしてN219-36-tree_6098_s（配列番号３１）およびアンチセンスプライマーとしてN219-36-tree_6098_a（配列番号３２）を用いて、上記で得たｃＤＮＡを鋳型としたこと以外は、実施例２と同様にＰＣＲを行い、目的の翻訳領域の配列を増幅した。この増幅断片を、実施例２と同様に相補性試験に供した。変異株として、Ura⁻のHMG-CoAシンターゼ欠損株であるY26527（EUROSCARF）を用いた。四分子分析では、YPG培地（炭素源：ガラクトース）上での生育が観察された。さらに、８胞子嚢由来のコロニーを用いた生育観察より、（Ｂ）の最少完全培地（炭素源：ガラクトース、ウラシルを含まない）での生育が観察された。この結果、相補により、HMG-CoAシンターゼ遺伝子の機能が特定できた。

（実施例５：HMG-CoAシンターゼをコードする遺伝子２）
3'-RACE用のセンスプライマーとして、実施例１で得たHMG-CoAシンターゼをコードすると推定されるＥＳＴ配列の情報に基づいて設計したN192-36-tree_10370_3R_s1（配列番号３３）（１回目）およびN192-36-tree_10370_3R_s2（配列番号３４）（２回目）を用いたこと以外は、実施例２と同様にして、完全長ｃＤＮＡを得た。２通りの完全長ｃＤＮＡが得られた。

得られた第一の完全長のｃＤＮＡは、配列番号７の塩基配列を有する。配列番号７に記載の塩基配列の２３４位から１４９６位までのヌクレオチドで示される領域の塩基配列は、Hevea brasiliensisのHMG-CoAシンターゼ（登録番号AF429389）と８１％の相同性を有する。得られた第二の完全長のｃＤＮＡは、配列番号９の塩基配列を有する。この第二のｃＤＮＡは、その１６８９位から１８２５位までの領域において、第一のｃＤＮＡの１６８９位から１８３３位までの領域に対して６箇所（第一のｃＤＮＡの１６８９位、１７０９位、１７１３位、１７４５位、１７５６位、および１８２０位）の置換および１箇所（第一のｃＤＮＡの１７７７位）の欠失および３’末端のポリアデニル部位の短縮を有する。配列番号９の塩基配列も、配列番号７の塩基配列と同様に、パラゴムノキのHMG-CoAシンターゼ（登録番号AF429389）と８１％の相同性を有する。オープンリーディングフレームは、両塩基配列とも２１６位から１６１６位までであった。これらのｃＤＮＡによりコードされる推定アミノ酸配列はそれぞれ、配列番号８および１０に示す通りであり、これらは同じ配列である。この推定アミノ酸配列は、配列番号８に記載の６位から４５２位までのアミノ酸領域において、パラゴムノキのHMG-CoAシンターゼ（登録番号AAS46245）と８４％の相同性を有する。

本実施例では、センスプライマーとしてN219-36-tree_10370_s（配列番号３５）およびアンチセンスプライマーとしてN219-36-tree_10370_a（配列番号３６）を用いて、上記で得たｃＤＮＡを鋳型としたこと以外は、実施例２と同様にＰＣＲを行い、目的の翻訳領域の配列を増幅した。この増幅断片を、実施例２と同様に相補性試験に供した。変異株として、Ura⁻のHMG-CoAシンターゼ欠損株であるY26527（EUROSCARF）を用いた。四分子分析では、YPG培地（炭素源：ガラクトース）上での生育が観察された。さらに、８胞子嚢由来のコロニーを用いた生育観察より、（Ｂ）の最少完全培地（炭素源：ガラクトース、ウラシルを含まない）での生育が観察された。この結果、相補により、HMG-CoAシンターゼ遺伝子の機能が特定できた。

（実施例６：HMG-CoAレダクターゼをコードする遺伝子１）
HMG-CoAレダクターゼをコードする遺伝子については、完全長のｃＤＮＡを取得するために、5'-RACE、3'-RACEおよび逆転写反応を組み合わせる方法を用いた。この方法のために、5'-Full RACE Core Set（TaKaRa）および3'-Full RACE Core Set（TaKaRa）を使用した。5'-RACE用のアンチセンスプライマーとして、N192-45-tree_8220_5R_a1（配列番号３７）（１回目）およびN192-45-tree_8220_5R_a2（配列番号３８）（２回目）を、3'-RACE用のセンスプライマーとして、N192-45-tree_8220_5R_3R_s1（配列番号３９）（１回目）およびN192-45-tree_8220_5R_3R_s2（配列番号４０）（２回目）を、そして逆転写反応用にN192-45-tree_8220_5R_p（配列番号４１）を、実施例１で得たHMG-CoAレダクターゼをコードすると推定されるＥＳＴ配列に基づいて設計した。実施例１で得たＲＮＡを鋳型として用い、これらの反応により得られた増幅断片を、実施例２と同様にして、pT7BlueベクターにTAクローニングし、配列解析した。

得られた完全長のｃＤＮＡは、配列番号１１の塩基配列を有する。配列番号１１に記載の塩基配列の２６０位から３０３位までのヌクレオチドで示される領域、７７３位から９３６位までのヌクレオチドで示される領域、および１１４８位から１８４５位までのヌクレオチドで示される領域の塩基配列はそれぞれ、リンゴ（Malus x domestica）のHMG-CoAレダクターゼ（登録番号AF315713）と８８％、８２％、および８１％の相同性を有する。オープンリーディングフレームは、３２位から１９２１位までであった。このｃＤＮＡによりコードされる推定アミノ酸配列は、配列番号１２に示す通りである。この推定アミノ酸配列は、配列番号１２に記載の３３位から６１２位までのアミノ酸領域において、カンレンボク（Camptotheca acuminata）のHMG-CoAレダクターゼ（登録番号P48021）と７８％の相同性を有する。また、非特許文献４に記載のHMG-CoAレダクターゼ（登録番号AAV54051）とは、配列番号１２に記載の３３位から６１２位までのアミノ酸領域において７３％の相同性を有する。したがって、配列番号１１の塩基配列は、非特許文献４に記載の遺伝子とは別の遺伝子座に由来するHMG-CoAレダクターゼ遺伝子であると考えられる。

（実施例７：HMG-CoAレダクターゼをコードする遺伝子２）
5'-RACE用のアンチセンスプライマーとして、N192-47-tree_13453_5R_a1（配列番号４２）（１回目）およびN192-47-tree_13453_5R_a2（配列番号４３）（２回目）を、3'-RACE用のセンスプライマーとして、N192-47-tree_13453_5R_3R_s1（配列番号４４）（１回目）およびN192-47-tree_13453_5R_3R_s2（配列番号４５）（２回目）を、そして逆転写反応用にN192-47-tree_13453_5R_p（配列番号４６）を、実施例１で得たHMG-CoAレダクターゼをコードすると推定されるＥＳＴ配列に基づいて設計したこと以外は、実施例６と同様にして、完全長ｃＤＮＡを得た。

得られた完全長のｃＤＮＡは、配列番号１３の塩基配列を有する。配列番号１３に記載の塩基配列の１６９位から３７３位までのヌクレオチドで示される領域、７５１位から１６００位までのヌクレオチドで示される領域、および１６３７位から１７２０位までのヌクレオチドで示される領域の塩基配列はそれぞれ、カンレンボクのHMG-CoAレダクターゼ（登録番号U72145）と７９％、８０％、および８９％の相同性を有する。オープンリーディングフレームは、６０位から１８３５位までであった。このｃＤＮＡによりコードされる推定アミノ酸配列は、配列番号１４に示す通りである。この推定アミノ酸配列は、配列番号１４に記載の１位から５８８位までのアミノ酸領域において、タバコ（Nicotiana tabacum）のHMG-CoAレダクターゼ（登録番号AAB87727）と７８％の相同性を有する。また、非特許文献４に記載のHMG-CoAレダクターゼ（登録番号AAV54051）とは、配列番号１４に記載の１位から５８９位までのアミノ酸領域において７５％の相同性を有する。したがって、配列番号１３の塩基配列もまた、非特許文献４に記載の遺伝子とは別の遺伝子座に由来するHMG-CoAレダクターゼ遺伝子であると考えられる。

（実施例８：メバロン酸キナーゼをコードする遺伝子）
3'-RACE用のセンスプライマーとして、実施例１で得たメバロン酸キナーゼをコードすると推定されるＥＳＴ配列の情報に基づいて設計したtree 1729 primer（配列番号４７）（１回目）およびtree 1729 primer nest（配列番号４８）（２回目）を用いたこと以外は、実施例２と同様にして、完全長ｃＤＮＡを得た。

得られた完全長のｃＤＮＡは、配列番号１５の塩基配列を有する。配列番号１５に記載の塩基配列の６１６位から１１０４位までのヌクレオチドで示される領域の塩基配列は、パラゴムノキのメバロン酸キナーゼ（登録番号AF429384）と８３％の相同性を有する。オープンリーディングフレームは、６１位から１２２４位までであった。このｃＤＮＡによりコードされる推定アミノ酸配列は、配列番号１６に示す通りである。配列番号１６に記載の全アミノ酸配列（１位から３８７位）は、パラゴムノキのメバロン酸キナーゼ（登録番号AAL18925）と７７％の相同性を有する。

本実施例では、センスプライマーとしてN219-36-tree_1729_s（配列番号４９）およびアンチセンスプライマーとしてN219-36-tree_1729_a（配列番号５０）を用いて、上記で得たｃＤＮＡを鋳型としたこと以外は、実施例２と同様にＰＣＲを行い、目的の翻訳領域の配列を増幅した。この増幅断片を、実施例２と同様に相補性試験に供した。変異株として、Ura⁻のメバロン酸キナーゼ欠損株であるY20794（EUROSCARF）を用いた。四分子分析では、YPG培地（炭素源：ガラクトース）上での生育が観察された。さらに、８胞子嚢由来のコロニーを用いた生育観察より、（Ｂ）の最少完全培地（炭素源：ガラクトース、ウラシルを含まない）での生育が観察された。この結果、相補により、メバロン酸キナーゼ遺伝子の機能が特定できた。

（実施例９：ホスホメバロン酸キナーゼをコードする遺伝子）
実施例１で得たｃＤＮＡライブラリを鋳型として、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、部分配列を取得した。この縮重ＰＣＲに用いたプライマーは、１回目は、センスプライマーとしてS_No.243_P.10_1（配列番号５１）およびアンチセンスプライマーとしてAS_No.243_P.10_1（配列番号５２）、そして２回目はセンスプライマーとしてS_No.243_P.10_2（配列番号５３）およびアンチセンスプライマーとしてAS_No.243_P.10_2（配列番号５４）であり、プライマーの設計は、BAD93946（Arabidopsis thaliana）、AAL18926（Hevea brasiliensis）、CAB52264（Schizosaccharomyces pombe）、NP593421（Schizosaccharomyces pombe）、P24521（Saccharomyces cerevisiae）、およびXP329795（Neurospora crassa）の６つのアミノ酸配列の保存領域に基づいて行った。ＰＣＲの条件は、以下の通りであった：
（1stPCR）
９５℃にて５分を１サイクル；９５℃にて１分、５５℃にて１分、および７２℃にて１分３０秒を３０サイクル；７２℃にて７分を１サイクル；ならびに４℃ ∞を１サイクル；
（2ndPCR）
９５℃にて５分を１サイクル；９５℃にて１分、５５℃にて１分、および７２℃にて１分３０秒を３０サイクル；７２℃にて７分を１サイクル；ならびに４℃ ∞を１サイクル。

上記部分配列では３’末端および５’末端の塩基配列情報が得られなかったので、実施例１で得たＲＮＡを鋳型として、5'-RACE、3'-RACEおよび逆転写反応を行った。この方法のために、5'-Full RACE Core Set（TaKaRa）および3'-Full RACE Core Set（TaKaRa）を使用した。5'-RACE用のアンチセンスプライマーとして、１回目にNo.243_P.51_race_a1（配列番号５６）および２回目にNo.243_P.51_race_a2（配列番号５５）を、3'-RACE用のセンスプライマーとして、１回目にNo.243_P.51_race_s1（配列番号５７）および２回目にNo.243_P.51_race_s2（配列番号５８）を、そして逆転写反応用として、No.243_P.51_race_p（配列番号５９）を、得られた部分断片の情報に基づいて設計した。これにより、３’末端および５’末端の塩基配列情報を得た。

３’末端および５’末端の塩基配列情報に基づいてｃＤＮＡライブラリースクリーニング用プローブを設計し、センスプライマーとして配列番号６０のプライマーを、そしてアンチセンスプライマーとして配列番号６１のプライマーを用いてＰＣＲを行った。得られた断片をプローブとして、実施例１で得たｃＤＮＡライブラリをスクリーニングした。得られた断片をpT7BlueベクターにTAクローニングし、配列解析した。

得られたｃＤＮＡ断片の全塩基配列は、配列番号１７に記載の通りである。配列番号１７に記載の塩基配列の６８１位から８８６位までのヌクレオチドで示される領域、９２２位から１０００位までのヌクレオチドで示される領域、１０４２位から１２８５位までのヌクレオチドで示される領域、１３３９位から１７３２位までのヌクレオチドで示される領域、および１８０７位から２０５４位までのヌクレオチドで示される領域の塩基配列はそれぞれ、パラゴムノキのホスホメバロン酸キナーゼ（登録番号AF429385）と８３％、８４％、８１％、８１％、および７８％の相同性を有する。オープンリーディングフレームは、６８２位から２２０２位までであった。このｃＤＮＡによりコードされる推定アミノ酸配列は、配列番号１８に示す通りである。配列番号１８に記載の全アミノ酸配列（１位から５０６位）は、パラゴムノキのホスホメバロン酸キナーゼ（登録番号AAL18926）と７８％の相同性を有する。

本実施例では、センスプライマーとして配列番号６２のプライマーおよびアンチセンスプライマーとして配列番号６３のプライマーを用いて、上記で得たｃＤＮＡを鋳型としたこと以外は、実施例２と同様にＰＣＲを行い、目的の翻訳領域の配列を増幅した。この増幅断片を、実施例２と同様に相補性試験に供した。変異株として、Ura⁻のホスホメバロン酸キナーゼ欠損株であるY20806（EUROSCARF）を用いた。四分子分析では、YPG培地（炭素源：ガラクトース）上での生育が観察された。さらに、８胞子嚢由来のコロニーを用いた生育観察より、（Ｂ）の最少完全培地（炭素源：ガラクトース、ウラシルを含まない）での生育が観察された。この結果、相補により、ホスホメバロン酸キナーゼ遺伝子の機能が特定できた。

（実施例１０：メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子）
3'-RACE用のセンスプライマーとして、実施例１で得たメバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼをコードすると推定されるＥＳＴ配列の情報に基づいて設計したN192-102-tree_13103_3R_s1（配列番号６４）（１回目）およびN192-102-tree_13103_3R_s2（配列番号６５）（２回目）を用いたこと以外は、実施例２と同様にして、完全長ｃＤＮＡを得た。

得られた完全長のｃＤＮＡは、配列番号１９の塩基配列を有する。配列番号１９に記載の塩基配列の１００位から１３２５位までのヌクレオチドで示される領域の塩基配列は、パラゴムノキのメバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ（登録番号AF429386）と８０％の相同性を有する。オープンリーディングフレームは、６８位から１３２４位までであった。このｃＤＮＡによりコードされる推定アミノ酸配列は、配列番号２０に示す通りである。この推定アミノ酸配列は、配列番号２０に記載の５位から４１８位までのアミノ酸領域において、パラゴムノキのメバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ（登録番号AAL18927）と８４％の相同性を有する。

本実施例では、センスプライマーとしてN219-36-tree_13103_s（配列番号６６）およびアンチセンスプライマーとしてN219-36-tree_13103_a（配列番号６７）を用いて、上記で得たｃＤＮＡを鋳型としたこと以外は、実施例２と同様にＰＣＲを行い、目的の翻訳領域の配列を増幅した。この増幅断片を、実施例２と同様に相補性試験に供した。変異株として、Ura⁻のメバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ欠損株であるY25418（EUROSCARF）を用いた。四分子分析では、YPG培地（炭素源：ガラクトース）上での生育が観察された。さらに、８胞子嚢由来のコロニーを用いた生育観察より、（Ｂ）の最少完全培地（炭素源：ガラクトース、ウラシルを含まない）での生育が観察された。この結果、相補により、メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子の機能が特定できた。

本発明によれば、トチュウのイソプレノイド化合物の生合成における初期の合成経路であるメバロン酸経路の諸酵素をコードする遺伝子が提供される。本発明の遺伝子は、トランス型ポリイソプレンあるいはイリドイドを大量に含有する遺伝子組換え植物（例えば、トチュウ）を作製するために好適に用いられ得る。

Claims (3)

1. トチュウにおけるメバロン酸からイソペンテニル二リン酸の合成に関与する遺伝子であって、該遺伝子が、
   配列番号６に記載のアミノ酸配列の１位から４６３位までのアミノ酸からなるタンパク質または配列番号８に記載のアミノ酸配列の１位から４６６位までのアミノ酸からなるタンパク質
   をコードする、遺伝子。
2. 前記遺伝子が、
   配列番号５に記載の塩基配列の１７２位から１５６３位までのヌクレオチドを含む遺伝子または配列番号７に記載の塩基配列の２１６位から１６１６位までのヌクレオチドを含む遺伝子
   である、請求項１に記載の遺伝子。
3. 前記遺伝子が、
   配列番号５に記載の塩基配列の１位から１８９２位までのヌクレオチドを含む遺伝子または配列番号７に記載の塩基配列の１位から１８３３位までのヌクレオチドを含む遺伝子
   である、請求項２に記載の遺伝子。