EP1071959A2 - Identifizierung chemischer wirkstoffe zur hemmung des 1-desoxy-d-xylulose-5-phosphat-biosynthesewegs in parasiten - Google Patents

Identifizierung chemischer wirkstoffe zur hemmung des 1-desoxy-d-xylulose-5-phosphat-biosynthesewegs in parasiten

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EP1071959A2
EP1071959A2 EP99920648A EP99920648A EP1071959A2 EP 1071959 A2 EP1071959 A2 EP 1071959A2 EP 99920648 A EP99920648 A EP 99920648A EP 99920648 A EP99920648 A EP 99920648A EP 1071959 A2 EP1071959 A2 EP 1071959A2
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xylulose
deoxy
protein
dna
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Jomaa Hassan
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    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere

Definitions

  • the invention relates to a method for identifying active substances which are suitable for the treatment of parasitic diseases caused by single or multi-cell parasites. / Fields of application of the invention are medicine and the pharmaceutical industry.
  • the invention further relates to proteins, as well as parts of proteins, furthermore DNA sequences which encode these proteins or parts of these proteins, de use of these DNA sequences, these proteins or their parts for the identification of substances with action against single or multicellular parasites , as well as the active ingredients identified in this way and their use for the manufacture of medicinal products.
  • parasites includes unicellular and multicellular parasites including helminths and anthropods. These cause infectious diseases in humans and animals.
  • unicellular parasites are protozoa.
  • Isoprenoids are molecules that are formed from individual isoprene units (isopentenyl diphosphate) and perform important functions in the cell. These include sterols, ubiquinones and other molecules that are important for the parasite household.
  • the previous approach was based on a model that was established m mushrooms and m suction cells. The subunit isopentenyl diphosphate is formed in mushrooms and suction cells based on the condensation of three molecules of acetyl-CoA to HMG-CoA.
  • HMG-CoA is then converted from the HMG-CoA reductase to mevalonate, which is then converted to isopentenyl diphosphate with mevalonate phosphate as an intermediate (see FIG. 7).
  • Inhibitors of HMG CoA reductase such as lovastatin, simvastatin and pravastatin have been used to inhibit the growth of the parasites. Malaria was able to achieve in vitro inhibition using very high doses of lovastatin and simvastatin, but the inhibition in vivo failed.
  • the inhibition of the DOXP metabolic pathway described above, in particular the enzymes DOXP synthase and DOXP reductoisomerase by the techniques known to the person skilled in the art, is suitable for the prevention and treatment of infections caused by single and multicellular parasites in humans and animal. Since this metabolic pathway is not available in humans, it is an excellent target for targeted chemotherapy of parasites.
  • the enzymes deoxyxylulose-5-phosphate synthase and de-soxyxylulose-5-phosphate reductoisomerase are particularly suitable as targets for chemotherapy.
  • the inhibition of the enzyme deoxyxylulose-5-phosphate reductoisomerase from malaria was particularly low in side effects and suitable, since humans have neither substrates and their precursors, nor the product of the enzyme nor the enzyme itself.
  • the present invention relates to methods for finding active substances which inhibit the DOXP metabolic pathway, and these active substances for the production of medicaments for the therapy and prophylaxis of infectious diseases caused by single or multi-cell parasites.
  • the object of the invention is to provide a new method for identifying active substances for the therapy of parasitic diseases in humans and animals. Another task is to develop a method for locating a drug that selectively kills the pathogen and has few side effects.
  • the present invention further relates to enzymes which are involved in this metabolic pathway and to parts of these enzymes. These enzymes are suitable proteins for carrying out the method according to the invention for identifying active substances.
  • the present invention further relates to DNA sequences which encode these enzymes or parts of these enzymes.
  • the present invention relates to a method and antibodies for identifying the enzymes or their parts and the production of the enzymes or their parts using recombinant technology.
  • the invention further relates to the use of these enzymes or their sections, or the use of the DNA sequences which encode these enzymes, or sections of these enzymes for the identification of substances with action against single or multicellular pathogens.
  • the invention further relates to active substances which are found with the aid of the enzymes according to the invention.
  • 1b shows the nucleotide sequence of the gene which encodes the 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase from Plasmodium falciparum
  • FIG. 2a the nucleotide sequence of the gene encoding 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase from Plasmodium falciparum and the corresponding amino acid sequence
  • FIG. 2b the nucleotide sequence of the gene, the 1-deoxy-D - Coded xylulose-5-phosphate synthase from Plasmodium falciparum and the corresponding amino acid sequence
  • Fig. 3a shows the amino acid sequence of the protein 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase from Plasmodium falciparum
  • 3b shows the amino acid sequence of the protein 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase from the parasite Plasmodium falciparum
  • FIG. 4a shows a section of the nucleotide sequence according to FIG. 1b
  • FIG. 4b shows a section of the nucleotide sequence with the corresponding ammosaur sequence according to FIG. 2b
  • FIG. 4c shows a section of the amino acid sequence according to FIG. 3b
  • Fig. 5 In vivo data for the parasitemia values after 4 days of therapy with three doses of the substances in each case: formyl, which corresponds to 3- (N-formyl-N-hydroxylammo) propyl phosphonic acid monosodium salt, and Acetyl, which corresponds to 3- (N-acetyl-N-hydroxylammo) propylphosphonic acid monosodium salt,
  • Fig. ⁇ a the inhibition of the growth of P. falciparum after addition of 3- (N-formyl-N-hydroxylammo) propylphosphonic acid monosodium salt (open circles) and 3- (N-acetyl-N-hydroxylammo) propyl- phosphonic acid monosodium salt (closed circles) for the HB3 strain
  • 6b the inhibition of the growth of P. falciparum after addition of 3- (N-formyl-N-hydroxylamino) propylphosphonic acid monosodium salt (open circles) and 3- (N-acetyl-N-hydroxylamino) propyl- phosphonic acid monosodium salt (closed circles) for strain A2
  • FIG. 6c the inhibition of the growth of P.
  • the coding genes of the enzymes DOXP synthase and DOXP reductoisomerase were detected by means of genetic methods ( Figures la, lb, 2a, 2b). After enrichment by the polymerase chain reaction from the genome of P. falciparum, these genes were cloned in bacterial plasmids and their nucleotide sequence determined. The sequence data showed a high homology of these genes with the corresponding genes from algae, plants and bacteria. The very high homologies showed that the three genes encode the enzymes DOXP synthase and DOXP reductoisomerase from P. falciparum.
  • the enzymes were purified as recombinant proteins and used for activity studies in cell-free systems.
  • the activity of the DOXP synthase was measured by converting glyceraldehyde-3-phosphate and pyruvate to l-deoxy-D-xylulose-5-phosphate.
  • the activity of the DOXP reductoisomerase was determined by converting l-deoxy-D-xylulose-5-phosphate to 2-C-methyl D-erythr ⁇ tol-4-phosphate measured in the presence of NADPH.
  • the change in the NADPH concentration is measured via a parameter variation. This process is known to the person skilled in the art.
  • the enzymes can be defined via the DNA sequence coding them (FIGS. 1a, 1b, 2a, 2b) and the ammosaic sequence derived from them (FIGS. 3a and 3b).
  • the enzymes of the individual parasites can differ from parasite to parasite.
  • Such variations of the amino acids are usually ammosaurus exchanges.
  • deletions, insertions and additions of amino acids to the overall sequence can also result.
  • the enzymes according to the invention can be glycosylated or non-glycosylated, regardless of the size and type, depending on the cell and cell type in which they are expressed.
  • the enzymes or parts of these enzymes according to the invention are produced by expression of the DNA according to the invention in suitable expression systems, for example in bacteria, in particular in E. ccn, as a prokaryotic expression system or in a eukaryotic expression system, in particular COS cells or Dictyosteliu discoideum.
  • a) are the product of a prokaryotic or eukaryotic expression of an exogenous DNA
  • b) are encoded by a sequence in Figures la
  • lb, 2a and 2b c) are encoded by DNA sequences which correspond to those in Figures la, lb, 2a and DNA sequences shown in 2b or fragments of these DNA sequences (see, for example, FIGS. 4a and 4b) hybridize in the DNA region which encodes the mature protein
  • d) are encoded by DNA sequences which have no degeneration of the genetic code would hybridize to the sequences defined in b) to c) and encode a polypeptide with the same amino acid sequence.
  • Enzymes are preferred which are encoded by the nucleotides from FIGS. 1a, 1b, 2a and 2b or by DNA sequences which, owing to the degeneration of the genetic code, would encode a polypeptide with the same amino acid sequence.
  • the two enzymes according to the invention (sequence in FIGS. 3a and 3b) can be regarded as new prototypes of specific proteins of single-cell and multi-cell parasites, in particular of the single-cell parasites.
  • An object of this invention are nucleic acid sequences which encode the enzymes and are selected from the group
  • the invention further relates to enzymes from any parasites which condense essentially pyruvate and glyceraldehyde-3-phosphate to give l-deoxy-D-xylulose-5-phosphate (DOXP synthase) and l-deoxy-D-xylulose. Convert 5-phosphate to 2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate (DOXP reductoisomerase).
  • enzymes which are analogous to the enzymes from malaria parasites, can be obtained by screening a cDNA library or genomic library of the corresponding parasite using a hybridization sample which contains sequences encoding malaria parasite methods, or by comparing the sequences the DNA and protein sequence for enzymes from malaria parasites with other parasite enzymes. Enzymes according to the invention can be obtained in large quantities in a reproducible manner with the aid of the nucleic acids.
  • the nucleic acid is integrated into suitable expression vectors by methods known to the person skilled in the art.
  • Such an expression vector preferably contains a regulatable / inducible promoter.
  • Suitable host cells are prokaryotic cells, such as, for example, E. coli, and eukaryotic cells, in particular yeasts (for example Saccharomyces cervisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris), insect cells (for example cell lines from Drosophila melanogaster such as S2 cells, Spodoptera) frugiperda, Trichoplusia ni), vertebrate cell lines, especially teratocarcinoma cell lines such as CHO or COS cells, and plant cell lines.
  • prokaryotic cells such as, for example, E. coli
  • eukaryotic cells in particular yeasts (for example Saccharomyces cervisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris), insect cells (for example cell lines from Drosophila melanogaster such as S2 cells, Spodoptera) frugiperda, Trichoplusia ni), vertebrate cell lines, especially tera
  • the enzymes according to the invention can also be expressed in transgenic plants and animals (e.g. mice, sheep, goats, pigs, guinea pigs).
  • the expression system is advantageously designed by techniques known to those skilled in the art so that the enzymes produced are excreted in the milk of the animals or can be obtained from easily obtained plant parts (fruits, leaves, flowers, shoots and roots).
  • Systems which are derived from papilloma viruses for example SV40), retroviruses, Sindbis viruses, cytomegaloviruses and vaccinia viruses are particularly suitable as expression vectors for vertebrate cells.
  • papilloma viruses for example SV40
  • retroviruses for example SV40
  • Sindbis viruses for example SV40
  • cytomegaloviruses for example SV40
  • vaccinia viruses are particularly suitable as expression vectors for vertebrate cells.
  • insect cells the baculovirus system, for plant cells systems based on the Ti plasmid from Agrobacterium tumefaciens and the bombardment of the cells with nucleic acid-coated particles.
  • the expression of the enzymes according to the invention in slime molds such as Dictyostelium discoideum, Polysphondylium pallidum and Physarum polycephalum is of particular importance since their cells can be cultured inexpensively in large quantities on simple media.
  • the use of Dictyostelium discoideum has the further advantage that this organism uses similar codons for the respective amino acids as Plasmodium falciparum and thereby a particularly effective production of the enzymes according to the invention is achieved.
  • inducible promoters e.g. due to lack of food
  • expression vectors for Dictyostelium discoideum are known. This can further increase the yield of recombinant enzyme.
  • Particularly suitable for the expression of the enzymes according to the invention are those host cells and organisms which have no intrinsic enzymes and which condense pyruvate and glyceraldehyde-3-phosphate to give 1-deoxy-D-xyluiose-5-phosphate (DOXP synthase) and 1 - Convert deoxy-D-xylulose-5-phosphate to 2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate (DOXP reductoisomerase).
  • DOE synthase 1-deoxy-D-xyluiose-5-phosphate
  • DOXP reductoisomerase 2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate
  • the enzymes according to the invention are advantageously expressed in eukaryotic cells when post-translational modifications and a native folding of the polypeptide chain are to be achieved.
  • introns are eliminated by splicing the DNA and the enzymes are produced in the polypeptide sequence characteristic of the parasites. Sequences coding introns can also be removed from the DNA sequences to be expanded by recombinant DNA technology or inserted experimentally.
  • the protein can be isolated from the host cell or the cell supernatant of the host cell by methods known to those skilled in the art. It may also be necessary to reactivate the enzymes in vitro.
  • the enzymes according to the invention or partial sequences of the enzymes can be expressed as fusion proteins with different pepti ⁇ chains. Oligo-histidm sequences and sequences derived from glutathione-S-transferase, thioredoxm or calomodm-binding peptides are particularly suitable for this purpose. Fusions with thioredoxm-derived sequences are particularly suitable for prokaryotic expression, since this increases the solubility of the recombinant enzymes.
  • the enzymes according to the invention or partial sequences of the enzymes can be expressed as fusion proteins with peptide chains known to the person skilled in the art that the recombinant enzymes are transported in the extracellular environment or in certain compartments of the host cells. the. This enables both the purification and the investigation of the biological activity of the enzymes to be facilitated.
  • the enzymes according to the invention can be obtained under standardized conditions by techniques known to the person skilled in the art by in vitro translation. Suitable systems are rabbit reticulocyte and wheat germ extracts. In vitro transcribed mRNA can also be translated into Xenopus oocytes.
  • Oligo- and polypeptides can be produced by chemical synthesis, the sequences of which are derived from the peptide sequence of the enzymes according to the invention. With a suitable choice of the sequences, such peptides have properties which are characteristic of the complete enzymes according to the invention. Such peptides can be produced in large quantities and are particularly suitable for Studies on the kinetics of enzyme activity, the regulation of enzyme activity, the three-dimensional structure of the enzymes, the inhibition of enzyme activity by different chemicals and pharmaceuticals and the binding geometry and binding affinity of different ligands.
  • a DNA with the nucleotides from the sequences shown in FIGS. 1a, 1b, 2a and 2b or a fragment according to FIGS. 4a and 4b is preferably used.
  • the invention further relates to processes for obtaining the enzymes which are involved in the DOXP pathway, in particular the enzymes DOXP synthase and DOXP reductoisomerase by isolation from the parasites.
  • the enzymes are isolated from parasite extracts using chromatographic, electrophoretic and other methods known to the person skilled in the art.
  • the enzymes are determined by measuring the respective enzymatic activity or reactivity with appropriate antibodies.
  • the detection of transformed, transfected or transduced host cells which produce the enzymes recombinantly, and the purification of the protein are preferably carried out using antibodies which bind to these enzymes.
  • Such antibodies can be obtained with the aid of the enzymes according to the invention or parts of the enzymes as an antigen or immunogen in a simple manner by known processes.
  • homologous or cross-reacting proteins of other parasites can be detected, for example, by Western blotting analyzes.
  • Another object of this invention are methods for determining the enzymatic activity of the DOXP enzymes, in particular the enzymes DOXP synthase and DOXP reductoisomerase. This can be determined according to the known instructions (Sprenger et al. PNAS, 94 (1997) 12857-62 and Kuzuyama et al. Tetrahedron Letters 39 (1998) 4509-12).
  • Such derivatives can, for example, be modified in single or more amino acids by substitution, deletion or addition.
  • the derivatization can take place, for example, via site-directed mutagenesis (site-specific mutagenesis).
  • site-directed mutagenesis site-specific mutagenesis
  • the detection methods described above can be used in suitable test kits for screening for antiparasitic the physical effects of substances can be used.
  • These include methods which are known to the person skilled in the art and are suitable for screening natural substances from flora and fauna, from plants, algae, bacteria or animals, and their derivatives, chemical libraries, including libraries which are used by techniques known to the person skilled in the art, including combinatorial chemistry (Pindur et al. Pharmacy in our time 26 (1997) 24-30; Broach et al. Nature 384 (1997) 14-6; Lack et al. Chimia 50 (1996) 445-7; Czarnik and Ellmann Accounts of chemical research 29 (1996); Chemical and engineerings News 74 (1996) 28-73; Lorin et al. Chemical reviews 96 (1996) 555-600; Weber et al. News from Chemistry, Technology and Laboratory 42 (1994 ) 698-702).
  • the present invention also relates to the use of proteins or sections of these proteins, including proteins or sections of proteins with or without enzymatic activity in techniques known to those skilled in the art for determining structures of the protein, in particular the characterization of the binding sites which are suitable for development of agents with an inhibitory effect on the enzymatic activity.
  • Active ingredients that are found with the help of the proteins according to the invention are of great interest for medicine and veterinary medicine.
  • the active substances which are found with the aid of the proteins according to the invention are suitable, with favorable warm-blood toxicity, for combating pathogenic parasites which are useful in humans and in animal husbandry and animal breeding in utility, breeding, zoo, laboratory, experimental and Hobby animals occur. They are effective against all or individual stages of development of the pests and against resistant and normally sensitive parasites. By combating the parasites, diseases, deaths and reduced performance (for example in the production of meat, milk, wool, hides, eggs, etc.) are to be reduced, so that the use of the active compounds enables more economical and simple animal husbandry
  • the results from the enzyme assays could also be confirmed in malaria culture (see examples) and in animal experiments (see examples).
  • the inhibitors determined by means of these enzyme assays were able to inhibit the growth of malaria parasites in vitro and in vivo.
  • Treatment of the animals for 8 days showed healing of the animals.
  • the acetyl form was three times more effective than the formyl form. This result is very surprising, since much higher (up to 100x) concentrations of 3- (N-acetyl-N-hydroxyammo) propylphosphonate are required to inhibit bacterial growth.
  • the method according to the invention for identifying tion of active substances and the active substances according to the invention are suitable for the therapeutic and prophylactic treatment of infections in humans and animals which are caused by parasites, fungi or viruses.
  • the compounds are used as prophylaxis against and for the treatment of infections caused by pathogens of malaria and sleepiness as well as Chagas disease, toxoplasmosis, amoebic dysentery, Leishmaniosis, Tricho ⁇ toniasis, pneumocystosis, balantidiosis, cryptosporidiosis, Sarcocystosis, Acanthoma, Naeglerose, Coccidiosis, Giardiosis and Lambliosis.
  • the methods and active substances according to the invention are particularly suitable for the treatment of malaria, sleeping sickness and leishmaniasis.
  • the active compounds according to the invention are also suitable for inhibiting the metabolic pathway of bacteria and of plants.
  • substances which are identified according to the invention as inhibitors of the DOXP pathway are also suitable for use as herbicides and for use in the treatment of bacterial infections in humans and animals.
  • Livestock and breeding animals suitable for treatment include mammals such as cattle, horses, sheep, pigs, goats, camels, water buffalos, donkeys, rabbits, salt and freshwater fish, such as. B. trout, carp and eels.
  • Suitable laboratory and experimental animals include mice, rats, guinea pigs, golden hamsters, dogs, cats and pigs.
  • Suitable pets include dogs and cats.
  • the application can be prophylactic as well as therapeutic.
  • the application of the active ingredients is carried out directly or in the form of suitable preparations known to those skilled in the art, such as enterally, parenterally, dermally or nasally.
  • the active compounds according to the invention can be used in combination with all antiinfectives known to the person skilled in the art. These include substances that have antibacterial, antiparasitic, antiviral or fungicidal effects. These include anti-infectives, which are listed in the Red List and in the specialist literature (general and special pharmacology and toxicology by Forth et al. Bl-Wissenschaftsverlag, Mannheim 1998; antibiotic therapy by Simon and Stille, Schattauer-Verlag, Stuttgart 1993).
  • the invention further relates to the combination of inhibitors of the DOXP pathway with agents that inhibit the fat pathway, including inhibitors of synthesis or lipid uptake, especially inhibitors of the mevalonate pathway.
  • the inhibitors of the enzymes HMG-COA synthase and inhibitors of HMG-CoA reductase may be mentioned here in particular.
  • HMG-CoA reductase inhibitors include, in particular, lovastatin and derivatives, mevastatin and derivatives, compactin and derivatives, simvastatin and derivatives, pravastatin and derivatives, atorvastatin and derivatives, fluvastatin and derivatives and cerivastatin and derivatives.
  • the gene encoding the P. falci parum DOX reductoisomerase was cloned by PCR amplification of the corresponding sequences of genomic DNA as a template.
  • genomic DNA the P. falciparum strain HB3 was cultivated according to the candle pot method (Tranger and Jensen (1976), Science 193, 673-675).
  • RPMI 1640 As a culture medium, RPMI 1640 (with HEPES and L-glutamine, Gibco) was supplemented with 10% human serum, 0.3 ⁇ g / ml gentamycin and 0.1 mM hypoxanthine, and a haematocrit of 5% was set with human erythrocytes.
  • the free parasites were washed twice by centrifugation (10 min, 10,000 rpm, 4 ° C.) with a solution of 1% BSA in carrier buffer.
  • the DNA preparation from the free parasites obtained was carried out according to standard protocols.
  • the parasites were first digested with Proteinase K. The mixture was then extracted four times with phenol / chloroform, the DNA solution was dialyzed overnight against TE and then precipitated with isopropanol.
  • the following primers were used for the PCR amplification:
  • the batch for the complete extension of all products was cubed 10 mm at 72 ° C.
  • the PCR product from 4 such batches was combined and purified on a 0.7% agarose gel.
  • the DNA was eluted from the agarose block using the "Kit for DNA extraction" (Millipore, Cat. No. S667).
  • the eluted DNA was precipitated with ethanol and 10 ⁇ l of H 2 O.
  • the PCR product was then processed according to the instructions from the manufacturer with the TA-clonmg kit (Invitrogen), using 20 mg msert-DNA for a ligation approach.
  • desired recombinant plasmid were identified by analytical plasmid preparation and EcoRI digestion of the plasmids.
  • the cloned PCR products were then sequenced using standard forward and reverse primers; the sequences were completed with the primer walking technique.
  • a PCR product which was present in the corresponding orientation in the pCR2.1 vector, was cloned into the expression vector pBK-CMV (Stratagene). The cloning took place via the interfaces of the restriction enzymes Not I and BamH I, which occur in the polylinker of both vectors.
  • the expression vector with the PCR product as an insert was prepared by anion exchange chromatography (Qiagen) on a preparative scale. All methods used for cloning are described in detail in J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd edition, Cold Spring Habor Laboratory Press, Cold Spring Habor, USA.
  • the COS-7 cells were cultured in DMEM medium with 10% FCS under standard conditions. 30 ml of culture medium were calculated per cell culture bottle. Cells at approx. 50% confluence were used for the transfection, which had been freshly split the day before.
  • DOTAP Boehringer was used as the transfection reagent. 40 ul DNA solution (0.5 ug / ml) were mixed with 110 ul 20 mM HEPES (pH 7.4). In addition, 100 ul DOTAP were mixed with 230 ul 20 mM HEPES (pH 7.4) in a polystyrene reaction vessel. Then the DNA solution was pipetted into the DOTAP solution and incubated for 15 min at room temperature.
  • the mixture was then mixed with 20 ml of culture medium and the medium of the COS-7 cells was replaced by this mixture. The following day the cells were transferred to new cell culture areas with fresh medium. After a further 48 hours of incubation, the transfected COS-7 cells were harvested. For this purpose, the cells were scraped off and washed three times by centrifugation in assay buffer (100 mM TrisHCl (pH 7.5), 1 mM MnCl 2 ). The cells were resuspended in a minimal volume of assay buffer and disrupted by freezing three times (in liquid nitrogen) and thawing. Cell fragments were centrifuged in a 1.5 ml reaction vessel (13,000 rp, 10 min, 4 ° C.) and the supernatant was used directly for measuring the enzyme activity or for purifying the enzyme.
  • assay buffer 100 mM TrisHCl (pH 7.5), 1 mM MnCl 2 .
  • the recombinant P. fal ciparum DOXP reductoisomerase expressed in COS-7 cells was purified to a high degree of homogeneity.
  • the purification was carried out via an affinity chromatography and a gel permeation chromatography step.
  • affinity chromatography column antibodies against the P. falciparum DOXP reductoisomerase were first prepared.
  • sections were selected from the amino acid sequence derived from the DNA sequence for which a particularly high antigenic effect could be predicted.
  • Corresponding peptides were synthesized and used for the immunization of rabbits.
  • the quality of the antisera obtained was determined both by their reactivity with the synthetic ones Peptides, as well as confirmed by Western blot analyzes. Extracts from P. falciparum and recombinant COS cells were used for the Western blot analyzes (BM Western Blottmg Kit, Boehrmger).
  • the antiserum was dialyzed against PBS to remove low molecular weight nurses.
  • the antibodies were then bound to Protein A-Sepharose and covalently coupled to DMP by cross-Img (IgG Oentation Kit, Pierce).
  • the protein extract was obtained as described in Example 1 from 55 cell culture areas with transfected COS-7 cells and loaded onto the column equilibrated with assay buffer. After washing excessively with assay buffer, the column was eluted with elution buffer (100 mM GlycmHCl (pH 2.8), 0.4% CHAPS). The eluate was immediately neutralized with 1 M TrisHCl (pH 7.5). The main fractions were identified by west blot analysis.
  • biotmylated antibodies were used for the detection in order to avoid interference by antibodies eluted from the column in small amounts.
  • the main fractions were pooled, dialyzed against assay buffer and concentrated by ultrafiltration (30 kDa, Amicon).
  • the further purification was carried out by gel permeation chromatography (Superdex 200, Pharmacia) with assay buffer as the start and elution buffer.
  • the main fractions were identified, pooled and concentrated as described above, 20% Glygerm was added and frozen at -70 ° C.
  • the purified P. falciparum DOXP reductoisomerase was shown as a uniform band at 54 kDa by SDS-PAGE (12% acrylamide) under reducing conditions and silver staining (gel code Color Silver Stam Kit, Pierce).
  • the DOXP reductoisomerase activity of the purified enzyme was confirmed in an in vitro test system.
  • 100 ⁇ l assay buffer with 0.3 mM NADPH, 0.3 mM DOXP and 10 ⁇ g recombinant enzyme was used.
  • the reaction was started by adding DOXP to the complete batch.
  • the oxidation of NADPH was monitored photometrically at 340 nm m micro quartz cuvettes at 37 ° C. This experimental system was used to demonstrate the inhibition of P. falciparum recombinant DOXP reductoisomerase by various substances.
  • the various derivatives were tested according to the modified Peters' test.
  • the substances were applied in a quarter of the half-lethal dose (LD50).
  • LD50 half-lethal dose
  • ten mice were infected with Plasmodium vmcken, the causative agent of mouse malaria. After confirmation of the infection by blood test, the treatment was carried out in four mice. Six mice that were not treated served as controls.
  • the treated group was free from live parasites after only one day.
  • the control mice had to be killed on day 5 after infection with a parasitemia of> 80%.
  • mice were still free of parasites 8 weeks after the end of treatment. Further experiments showed an efficacy of 50 mg / kg / d 3- (N-formyl-N-hydroxylamino) propyl-phosphonic acid monosodium salt in mice with a parasitemia of 80%. These mice were also free of live parasites after 1 day. The further results for 3- (N-formyl-N-hydroxylamino) propylphosphonic acid monosodium salt and 3- (N-acetyl-N-hydroxylamino) propylphosphonic acid monosodium salt are shown in FIG.
  • mice Male mice (BALB / c strain) weighing 20 to 25 g.
  • mice One day before infection, four mice were treated intraperitoneally with 50 mg / kg of 3- (N-formyl-N-hydroxylamino) propylphosphonic acid monosodium salt.
  • the mice were then infected with Plasmodium vinckeii.
  • Mice not pretreated with the substance served as a control. No infection was detected in the treated mice, whereas the control mice were killed after 5 days with a parasitemia above 80%. The treated mice were also free of parasites 8 weeks after infection.
  • Example 6 Example 6
  • the malaria parasites are first cultivated for a complete 48-hour cycle in the presence of inhibitors. In the subsequent 24 hours, the survival rate was measured by [ J H] hypoxanthine cultivation. A dilution series of 3-iN-formyl-N-hydroxylammo) propylphosphonic acid monosodium salt in a 10-fold concentration of 20 ⁇ l aliquots is placed on a microtiter plate. Then 180 ⁇ l of parasite suspensions are added to each well in culture medium. Asynchronous cultures with approx. 0.4% parasitemia and 2% hematotope are used. The microtiter plates are then incubated for 48 h.
  • Plasmodium falciparum HB3 (Honduras) is resistant to pyrimethamine.
  • Plasmodium falciparum Dd2 (Indochina) is resistant to cloroquin, quinine, py ⁇ methamine, cycloguanil and sulfadoxine.
  • Plasmodium falciparum A2 (Gamoia) is resistant to chloroquine and cycloguanil. No cross-resistance with anti-malaria drugs was found.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Auffinden von chemischen Wirkstoffen, die zur Therapie von Infektionskrankheiten geeignet sind, die durch ein- oder mehrzellige Parasiten hervorgerufen werden. Bei diesem Verfahren werden Proteine, die am 1-Desoxy-D-xylulose-5-Phosphat-Stoffwechselweg beteiligt sind, oder deren gleichwirkende Derivate mit den auf ihre Wirksamkeit gegenüber Parasiten zu untersuchenden Wirkstoffen in Berührung gebracht und die Wirkstoffe, die die Proteine oder deren Derivate inhibieren, ausgewählt. Die Erfindung betrifft ferner die aufgefundenen Wirkstoffe zur Herstellung von Arzneimitteln gegen parasitäre Infektionen.

Description

Verfahren zur Identifizierung chemischer Wirkstoffe und Wirkstoffe zur Hemmung des l-Desoxy-D-xylulose-5-Phosphat-
Biosynthesewegs
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifikation von Wirkstoffen, die zur Behandlung von parasitären Erkrankungen verursacht durch ein- oder mehrzellige Parasiten geeignet sind. /Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Medizin und die pharmazeutische Industrie. Weiter betrifft die Erfindung Proteine, sowie Teilstücke von Proteinen, ferner DNA-Sequenzen, die diese Proteine bzw. Teilstücke dieser Proteine kodieren, d e Verwendung dieser DNA-Sequenzen, dieser Proteine oder ihrer Teilstücke zur Identifizierung von Stoffen mit Wirkung gegen ein- oder mehrzellige Parasiten, sowie die auf diesem Weg identifizierten Wirkstoffe und deren Verwendung zur Herstellung von Arzneimitteln.
Der Begriff Parasiten beinhaltet einzellige Parasiten und mehrzellige Parasiten einschließlich Helminthen und Anthro- poden. Diese verursachen Infektionserkrankungen bei Mensch und Tier. Im Sinne dieser Erfindung ist die streng wissenschaftliche Definition von Parasiten anzuwenden, d.h. unter einzelligen Parasiten sind Protozoen zu verstehen.
Es existiert bereits eine Vielzahl von Mitteln gegen parasitäre Erkrankungen. Die vorhandenen Mittel werden durch die sich rasch entwickelnden Resistenzen gegen diese Mittel bereits unbrauchbar für die Therapie von Mensch und Tier. So sind bereits viele Regionen von Malaπaparasiten befallen, die gegen Standard-Medikamente wie Chloroquin resi- stent sind. Auch sinα Berichte über Resistenz-Entwicklung gegen Standard-Mittel (Praziquantel) zur Behandlung der Bilharziose bekannt. Diese Resistenzentwicklungen und andere Faktoren haben dazu gefuhrt, daß Malaria und Bilharziose bereits zu den häufigsten Erkrankungen in den Tropen gezahlt werden. Geschätzte 300-500 Millionen Menschen sind an Malaria erkrankt. 2-2,5 Millionen Menschen sterben im Jahr an Malaria. Weiter sind neue Medikamente wie Mefloqum sehr teuer m der Hersteilung und sehr nebenwirkungsreich. Es besteht daher ein großer Bedarf an Arzneimitteln zur Therapie von Mensch und Tier.
Es gab m der Vergangenheit viele Ansätze zur Entwicklung von Che otherapeutika gegen Parasiten, insbesondere gegen Krankheitserreger der Malaria und der Bilharziose. Einer dieser Ansätze befaßt sich mit der Inhibition der sogenannten Isoprenoidbiosynthese. Isoprenoide sind Moleküle, die aus einzelnen Isopreneinheiten (Isopentenyldiphosphat) gebildet werden, und wichtige Funktionen in der Zelle übernehmen. Hierzu gehören Sterole, Ubichinone und andere Moleküle, αie f r den Haushalt der Parasiten wichtig sind. Die Vorgenensweise basierte hierbei auf einem Modell, das m Pilzen und m Saugerzellen etabliert wurde. In Pilzen und m Saugerzellen entsteht die Untereinheit Isopentenyldiphosphat auf der Basis der Kondensation von drei Molekülen Acetyl-CoA zu HMG-CoA. HMG-CoA wird dann von der HMG- CoA-Reduktase zu Mevalonat umgewandelt, welches dann mit Mevalonat-Phosphat als Zwischenstufe zu Isopentenyldiphosphat umgewandelt wird (siehe Figur 7) . Inhibitoren der HMG- CoA-Reduktase wie zum Beispiel Lovastatin, Simvastatin und Pravastatin wurden zur Inhibition des Wachstums der Parasiten verwendet. Bei Malaria gelang es zwar, unter Anwendung sehr hoher Dosen Lovastatin und Simvastatin eine in vitro Inhibition zu erreichen, jedoch mißlang die Inhibition in vivo. Die Behandlung Schistosoma-infizierter Mäuse mit Lovastatin führte zu einer Inhibition der Eiablage dieser Würmer, jedoch mußten sehr hohe Konzentrationen an Lovastatin aufgewendet werden, um einen Teil der Würmer in vivo zu töten.
Es wurde nun überraschend gefunden, daß Parasiten, insbesondere Plasmodien und Trypanosomen (Verursacher der Malaria und der Schlafkrankheit) zumindest einen weiteren Stoffwechselweg zur Synthese von Isoprenoiden besitzen. Dieser Stoffwechselweg beruht auf einer Kondensation von Glycerinaldehyd-3-Phosphat und Pyruvat zu 1-Desoxy-D- xylulose-5-Phosphat (DOXP) . DOXP wird dann umgewandelt zu 2-C-Methyl-D-erythrose-4-Phosphat, das dann mit 2-C-Methyl- erythrithol-4-Phosphat als Zwischenstufe zu Isopentenyl- diphosphat umgewandelt wird. An diesem Stoffwechselweg sind unter anderem die Enzyme DOXP-Synthase und DOXP- Reduktoisomerase beteiligt (Siehe Figur 7) . Dieser Stoffwechselweg war bisher nur in Pflanzen, in Algen und in einigen Bakterien beschrieben worden (Sprenger et al. PNAS, 94 (1997) 12857-62 und Kuzuyama et al . Tetrahedron Letters 39 (1998) 4509-12) .
Die Inhibition des oben beschriebenen DOXP-Stoffwechsel- wegs, insbesondere der Enzyme DOXP-Synthase und DOXP- Reduktoisomerase durch die dem Fachmann bekannten Techniken eignet sich zur Vorbeugung und Behandlung von Infektionen, verursacht durch ein- und mehrzellige Parasiten bei Mensch und Tier. Da dieser Stoff echselweg nicht im Menschen vorhanden ist, eignet er sich hervorragend als Ziel für eine gezielte Chemotherapie von Parasiten. Insbesondere eignen sich die Enzyme Desoxyxylulose-5-Phosphat-Synthase und De- soxyxylulose-5-Phosphat-Reduktoisomerase als Ziel für eine Chemotherapie. Besonders nebenwirkungsarm und geeignet zeigte sich die Inhibition des Enzyms Desoxyxylulose-5- Phosphat-Reduktoisomerase von Malaria, da der Mensch weder über Substrate und deren Vorstufen noch über das Produkt des Enzyms noch über das Enzym selbst verfügt.
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Auffinden von Wirkstoffen, die den DOXP-Stoffwechselweg hemmen, und diese Wirkstoffe zur Herstellung von Arzneimitteln für die Therapie und Prophylaxe von Infektionskrankheiten verursacht durch ein- oder mehrzellige Parasiten.
Die Aufgabe der Erfindung ist es, ein neues Verfahren zur Identifikation von Wirkstoffen zur Therapie von parasitären Erkrankungen bei Mensch und Tier bereitzustellen. Eine weitere Aufgabe besteht darin, ein Verfahren zur Auffindung eines Medikamentes zu entwickeln, das selektiv den Erreger abtötet und nebenwirkungsarm ist.
Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren gemäß Anspruch 1 realisiert. Die Erfindungsverfahren und ermittelten Wirkstoffe sind dadurch gekennzeichnet, daß
- die Isoprenoidbiosynthese im sogenannten 1-Desoxy-D- xylulose-5-Phosphat-Stoffwechselweg gehemmt wird.
Alle beschriebenen Stoffwechselwege sind nicht in Mensch und Tier vorhanden, sondern nur in Pflanzen, Algen, manchen Eubakterien und in Parasiten, wie zum Beispiel Malariaparasiten; daher zeichnet sich diese Therapie-Strategie als sehr nebenwirkungsarm aus.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin Enzyme, die an diesem Stoffwechselweg beteiligt sind, sowie Teilstücke dieser Enzyme. Diese Enzyme sind zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Identifikation von Wirkstoffen geeignete Proteine. Die vorliegende Erfindung betrifft weiter DNA-Sequenzen, die diese Enzyme kodieren, bzw. Teilstücke dieser Enzyme.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und Antikörper zur Identifizierung der Enzyme oder ihrer Teilstücke sowie die Herstellung der Enzyme oder ihrer Teilstücke über rekombinante Technologie.
Die Erfindung betrifft weiter die Verwendung dieser Enzyme oder ihrer Teilstücke, oder die Verwendung der DNA- Sequenzen, die diese Enzyme kodieren, bzw. Teilstücke dieser Enzyme zur Identifizierung von Stoffen mit Wirkung gegen ein- oder mehrzellige Erreger.
Die Erfindung betrifft weiter Wirkstoffe, die mit Hilfe der erfindungsgemäßen Enzyme aufgefunden werden.
Im folgenden wird die Erfindung anhand der beiliegenden Zeichnungen genauer beschrieben.
Es zeigen:
Fig. la die Nukleotid-Sequenz des Gens, das das Protein 1- Desoxy-D-xylulose-5-Phosphat-Reduktoisomerase aus Plasmodium falciparum codiert, Fig. lb die Nukleotid-Sequenz des Gens, das die 1-Desoxy-D- xylulose-5-Phosphat-Synthase aus Plasmodium falciparum codiert,
Fig. 2a die Nukleotid-Sequenz des Gens, die 1-Desoxy-D- xylulose-5-Phosphat-Reduktoisomerase aus Plasmodium falciparum codiert und die entsprechende Aminosäure-Sequenz Fig. 2b die Nukleotid-Sequenz des Gens, die 1-Desoxy-D- xylulose-5-Phosphat-Synthase aus Plasmodium falciparum codiert und die entsprechende Aminosäure-Sequenz, Fig. 3a die Aminosäure-Sequenz des Proteins 1-Desoxy-D- xylulose-5-Phosphat-Reduktoιsomerase aus Plasmodium falciparum,
Fig. 3b die Aminosäure-Sequenz des Proteins 1-Desoxy-D- xylulose-5-Phosphat-Synthase aus dem Parasiten Plasmodium falciparum,
Fig 4a einen Ausschnitt aus der Nukleotid-Sequenz nach Fig. lb,
Fig. 4b einen Ausschnitt aus der Nukleotid-Sequenz mit der entsprechenden Ammosauresequenz nach Fig. 2b, Fig. 4c einen Ausschnitt aus der Aminosäure-Sequenz nach Fig. 3b,
Fig.5 In-vivo-Daten für die Parasitamie-Werte nach 4-tagi- ger Therapie mit jeweils drei Dosen der Stoffe: Formyl, das 3- (N-Formyl-N-hydroxylammo) -propyl- phosphonsaure-mononatriumsalz entspricht, und Acetyl, das 3- (N-Acetyl-N-hydroxylammo) -propyl- phosphonsaure-mononatriumsalz entspricht,
Fig. βa die Inhibition des Wachstums von P. falciparum nach Zugabe von 3- (N-Formyl-N-hydroxylammo) -propyl- phosphonsaure-mononatriumsalz (offene Kreise) und 3- (N- Acetyl-N-hydroxylammo) -propyl-phosphonsaure- mononatriumsalz (geschlossene Kreise) für den Stamm HB3, Fig. 6b die Inhibition des Wachstums von P. falciparum nach Zugabe von 3- (N-Formyl-N-hydroxylamino) -propyl- phosphonsäure-mononatriumsalz (offene Kreise) und 3- (N- Acetyl-N-hydroxylamino) -propyl-phosphonsäure- mononatriumsalz (geschlossene Kreise) für den Stamm A2, und Fig. 6c die Inhibition des Wachstums von P. falciparum nach Zugabe von 3- (N-Formyl-N-hydroxylamino) -propyl- phosphonsäure-mononatriumsalz (offene Kreise) und 3- (N- Acetyl-N-hydroxylamino) -propyl-phosphonsäure- mononatriumsalz (geschlossene Kreise) für den Stamm Dd2, und
Fig. 7 den klassischen Acetat/-Mevalonat-Biosyntheseweg im Vergleich zum alternativen DOX-P-Biosyntheseweg.
Mittels genetischer Verfahren wurden die kodierenden Gene der Enzyme DOXP-Synthase, und DOXP-Reduktoisomerase nachgewiesen (Figuren la, lb, 2a, 2b) . Nach Anreicherung durch die Polymerase-Ketten-Reaktion aus dem Genom von P. falciparum wurden diese Gene in bakteriellen Plasmiden kloniert und ihre Nukleotidsequenz bestimmt. Die Sequenzdaten zeigten eine hohe Homologie dieser Gene mit den entsprechenden Genen aus Algen, Pflanzen und Bakterien. Die sehr hohen Homologien zeigten, daß die drei Gene die Enzyme DOXP- Synthase und DOXP-Reduktoisomerase von P. falciparum codieren.
Nach Expression in heterologen Systemen wurden die Enzyme als rekombinante Proteine gereinigt und für Aktivitätsstudien in zellfreien Systemen eingesetzt. Die Aktivität der DOXP-Synthase wurde durch Umsetzung von Glycerinaldehyd-3- Phosphat und Pyruvat zu l-Desoxy-D-xylulose-5-Phosphat gemessen. Die Aktivität der DOXP-Reduktoisomerase wurde durch Umsetzung von l-Desoxy-D-xylulose-5-Phosphat zu 2-C-Methyl- D-erythrιtol-4-Phosphat m Gegenwart von NADPH gemessen. Die Messung der Veränderung der NADPH-Konzentration erfolgt über eine Parametervariation. Dieses Verfahren ist dem Fachmann bekannt.
Die Enzyme können über die sie codierende DNA-Sequenz ( Figuren la, lb, 2a, 2b) und die davon abgeleitete Ammosaure- sequenz (Figuren 3a und 3b) definiert werden. Die Enzyme der einzelnen Parasiten können sich jedoch von Parasit zu Parasit unterscheiden. Solche Variationen der Aminosäuren sind m der Regel Ammosaureaustausche. Es kann sich aber auch um Deletionen, Insertionen und Additionen von Aminosäuren zur Gesamtsequenz nandeln. Die erfmdungsgemaßen Enzyme können - sowonl im Umfang und Art abhangig von der Zelle und Zelltyp, m dem sie exprimiert werden - glycosy- liert der nicht glycosyliert sein.
Die erfmdungsgemaßen Enzyme oder Teilstucke dieser Enzyme werden durch Expression der erfmdungsgemaßen DNA m geeigneten Expressionssystemen, beispielsweise in Bakterien, insbesondere m E. ccn, als prokaryontisches Expressionssystem oder m einem eukaryontischen Expressionssystem, insbesondere COS-Zelien oder Dictyosteliu discoideum, hergestellt.
Mit Hilfe der erfmαungsgemßen Nukle sauresequenz ist es möglich, im Genom von beliebigen Parasiten die kodierenden Gene oder deren Varianten zu suchen, diese zu identifizieren und die gewünschten kodierenden Gene für die Enzyme zu isolieren. Derartige Verfahren und die hierfür geeigneten Screenmg-Methoden sind dem Fachmann bekannt. Durch die Anwendung der rekombinanten Technologie ist es möglich, eine Vielzahl von Varianten von Enzymen oder Teilstücke von Enzymen herzustellen. Derartige Derivate können beispielsweise in einzelnen oder mehreren Aminosäuren durch Substitution, Deletion oder Addition modifiziert sein. Die Derivatisierung kann beispielsweise über site directed mutagenesis (ortsspezifische Mutagenese) erfolgen. Derartige Variationen sind für einen Fachmann ohne weiteres durchführbar. Es muß lediglich sichergestellt sein, daß die charakteristischen Eigenschaften der Enzyme erhalten bleiben. Ein weiterer Gegenstand dieser Erfindung sind deshalb die Enzyme, die am DOXP-Stoffwechselweg beteiligt sind, insbesondere DOXP-Synthase und DOXP-Reduktoisomerase, die
a) das Produkt einer prokaryontischen oder eukaryontischen Expression einer exogenen DNA sind, b) codiert werden von einer Sequenz in Figuren la, lb, 2a und 2b c) codiert werden von DNA-Sequenzen, die mit den in Figuren la, lb, 2a und 2b gezeigten DNA-Sequenzen oder Fragmenten dieser DNA-Sequenzen (siehe z.B. Figuren 4a und 4b) im DNA-Bereich, der das reife Protein kodiert, hybridisieren, oder d) codiert werden von DNA-Sequenzen, die ohne die Degeneration des genetischen Codes mit den in b) bis c) definierten Sequenzen hybridisieren würden und ein Polypep- tid mit derselben Aminosäuresequenz kodieren.
Bevorzugt sind Enzyme, welche von den Nukleotiden aus Figuren la, lb, 2a und 2b oder von DNA-Sequenzen, die aufgrund der Degeneration des genetischen Codes ein Polypeptid mit derselben Aminosäuresequenz codieren würden, codiert werden. Die beiden erfindungsgemäßen Enzyme (Sequenz in Figuren 3a und 3b) können als neue Prototypen von spezifischen Proteinen ein- und mehrzelliger Parasiten, insbesondere der einzelligen Parasiten angesehen werden.
Ein Gegenstand dieser Erfindung sind Nukleinsäuresequenzen, welche die Enzyme kodieren und ausgewählt sind aus der Gruppe
a) der in den Figuren la, lb, 2a, und 2b gezeigten DNA- Sequenzen oder deren komplementäre Sequenzen, b) Nukleinsäuresequenzen, die mit einer der Sequenzen von a) hybridisieren, c) Nukleinsäuresequenzen, die ohne die Degeneration des genetischen Codes mit einer der in a) oder b) genannten Sequenzen hybridisieren wurden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Enzyme aus beliebigen Parasiten, welche m wesentlichen Pyruvat und Gly- ceraldehyd-3-Phosphat zu l-Desoxy-D-xylulose-5-Phosphat kondensieren (DOXP-Synthase) und l-Desoxy-D-xylulose-5- Phosphat zu 2-C-Methyl-D-erythritol-4-Phosphat umsetzen (DOXP-Reduktoisomerase) . Diese den Enzymen aus Malaria- Parasiten analogen Enzyme können dadurch erhalten werden, daß mit einer Hybridisierungsprobe, die Enzyme aus Malaria- Parasiten codierende Sequenzen enthält, eine cDNA- Bibliothek oder genomische Bibliothek des entsprechenden Parasiten nach dem Fachmann geläufigen Methoden gescreent wird oder über den Sequenzvergleich der DNA und Proteinsequenz für Enzyme von Malaria-Parasiten mit anderen Parasiten-Enzymen. Mit Hilfe der Nukleinsäuren können erfindungsgemäße Enzyme in reproduzierbarer Weise in großen Mengen gewonnen werden. Zur Expression in prokaryontischen und eukaryontischen Organismen wird die Nukleinsäure nach dem Fachmann geläufigen Verfahren in geeignete Expressionsvektoren integriert. Vorzugsweise enthält ein solcher Expressionsvektor einen regulierbaren/induzierbaren Promotor. Zur Expression werden diese rekombinanten Vektoren dann nach bekannten Verfahren in geeignete Wirtszellen eingeführt und die transformierten, transfizierten bzw. transduzierten Wirtszellen unter Bedingungen kultiviert, die eine Expression des heterologen Gens ermöglichen. Als Wirtszellen eignen sich prokaryonti- sche Zellen, wie z.B. E. coli, und eukaryontische Zellen, insbesondere Hefen (z.B. Saccharomyces cervisiae, Schizo- saccharomyces pombe, Pichia pastoris), Insektenzellen (z.B. Zellinien von Drosophila melanogaster wie S2-Zellen, Spo- doptera frugiperda, Trichoplusia ni), Wirbeltierzellmien, vor allem Teratokarzinoma-Zellinien wie CHO- oder COS- Zellen, und pflanzliche Zellinien.
Die erfindungsgemäßen Enzyme können auch in transgenen Pflanzen und Tieren (z.B. Mäuse, Schafe, Ziegen, Schweine, Meerschweinchen) exprimiert werden. Das Expressionssystem ist dabei vorteilhafterweise durch dem Fachmann bekannte Techniken so zu gestalten, daß die produzierten Enzyme mit der Milch der Tiere ausgeschieden werden bzw. aus leicht zu gewinnenden Pflanzenteilen (Früchten, Blättern, Blüten, Sproß- und Wurzelteilen) erhalten werden können.
Als Expressionsvektoren für Wirbeltierzellmien eignen sich besonders Systeme, die von Papillomaviren (z.B. SV40) , Re- troviren, Sindbisviren, Cytomegaloviren und Vacciniaviren abgeleitet sind. Für Insektenzellen eignet sich besonders das Baculovirus-System, für Pflanzenzellen Systeme auf der Basis des Ti-Plasmids von Agrobacterium tumefaciens und der Beschüß der Zellen mit Nukleinsäure überzogenen Partikeln.
Von besonderer Bedeutung ist die Expression der erfindungsgemäßen Enzyme in Schleimpilzen wie Dictyostelium discoideum, Polysphondylium pallidum und Physarum polycephalum, da ihre Zellen kostengünstig in großen Mengen auf einfachen Medien kultiviert werden können. Die Verwendung von Dictyostelium discoideum bietet den weiteren Vorteil, daß dieser Organismus ähnliche Codone für die jeweiligen Aminosäuren benutzt wie Plasmodium falciparum und dadurch eine besonders effektive Produktion der erfindungsgemäßen Enzyme erreicht wird. Außerdem sind induzierbare Promotoren (z.B. durch Nahrungsmangel) für Expressionsvektoren für Dictyostelium discoideum bekannt. Dadurch kann die Ausbeute an rekombinantem Enzym weiter gesteigert werden.
Für die Expression der erfindungsgemäßen Enzyme eignen sich besonders solche Wirtszellen und Organismen, die keine in- trinsischen Enzyme besitzen, die Pyruvat und Glyceraldehyd- 3-Phosphat zu l-Desoxy-D-xyluiose-5-Phosphat kondensieren (DOXP-Synthase) und l-Desoxy-D-xylulose-5-Phosphat zu 2-C- Methyl-D-erythritol-4-Phosphat umsetzen (DOXP-Reduktoisomerase) . Dies trifft für Archaebacterien, Tiere, Pilze, Schleimpilze und einige Eubakterien zu. Durch das Fehlen dieser intrinsischen Enzymaktivitäten wird die Detektion und Aufreinigung der rekombinanten Enzyme wesentlich erleichtert. Auch wird es erst dadurch möglich, mit geringem Aufwand die Aktivität und insbesondere die Hemmung der Aktivität der erfindungsgemäßen rekombinanten Enzyme durch verschiedenen Chemikalien und Pharmaka in Rohextrakten aus den Wirtszellen zu messen. Die Expression der erfmdungsgemaßen Enzyme erfolgt vor- teilhafterweise dann m eukaryontischen Zellen, wenn post- translatorische Modifikationen und eine native Faltung der Polypeptidkette erreicht werden soll. Außerdem wird m Abhängigkeit vom Expressionssystem bei der Expression genomischer DNA-Sequenzen erreicht, daß Introns durch Spleißen der DNA beseitigt und die Enzyme in der für die Parasiten charakteristischen Polypeptidsequenz produziert werden. Introns codierende Sequenzen können auch durch rekombmante DNA-Technologie aus den zu expπmierenden DNA-Sequenzen beseitigt oder experimentell eingefügt werden.
Die Isolierung des Proteins kann aus der Wirtszelle oder dem Kαlturuberstand der Wirtszelle nach dem Fachmann bekannten Verfahren erfolgen. Es kann auch eine m vitro Reaktivierung der Enzyme erforderlich sein.
Zur Erleichterung der Aufreinigung können die erfmdungsge- maßen Enzyme oder Teilsequenzen der Enzyme als Fusionspro- tein mit verschiedenen Peptiαketten exprimiert werden. Dazu eigenen sich besonders Oligo-Histidm-Sequenzen und Sequenzen, die von der Glutathion-S-Transferase, Thioredoxm oder Calmodulm-bmdenden Peptiden abgeleitet sind. Fusionen mit Thioredoxm-abgeleiteten Sequenzen eignen sich besonders für prokaryontische Expression, da dadurch die Loslichkeit der rekombinanten Enzyme erhöht wird.
Weiterhin können die erfmdungsgemaßen Enzyme oder Teilse- quenzen der Enzyme als Fusionsprotein mit solchen, dem Fachmann bekannten, Peptidketten exprimiert werden, daß die rekombinanten Enzyme m das extrazellulare Milieu oder m bestimmte Kompartimente der Wirtszellen transportiert wer- den. Dadurch kann sowohl die Aufreinigung, als auch die Untersuchung der biologischen Aktivität der Enzyme erleichtert werden.
Bei der Expression der erfindungsgemäßen Enzyme kann es sich als zweckmäßig erweisen, einzelne Codone zu verändern. Dabei ist der gezielte Austausch von Basen in der kodierenden Region auch sinnvoll, wenn die genutzten Codone in den Parasiten abweichend sind von der Codonnutzung im heterologen Expressionssystem, um eine optimale Synthese des Proteins zu gewährleisten. Zudem sind oft Deletionen von nicht-translatierten 5 'bzw. 3 '-Abschnitten sinnvoll, beispielsweise wenn mehrere destabilisierende Sequenzmotive ATTTA im 3 " -Bereich der DNA vorliegen. Dann sollten diese bei der bevorzugen Expression in Eukaryonten deletiert werden. Veränderungen dieser Art sind Deletionen, Additionen oder Austausch von Basen und ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Weiterhin können die erfmdungsgemaßen Enzyme unter standardisierten Bedingungen durch dem Fachmann bekannte Techniken durch in vitro-Translation gewonnen werden. Dafür geeignete Systeme sind Kaninchen-Reticulozyten- und Weizenkeim- Extrakte. Auch kann in vitro transskribierte mRNA in Xenopus-Oocyten translatiert werden.
Durch chemische Synthese können Oligo- und Polypeptide hergestellt werden, deren Sequenzen aus der Peptidsequenz der erfindungsgemäßen Enzyme abgeleitet sind. Bei geeigneter Wahl der Sequenzen besitzen derartige Peptide Eigenschaften, die für die vollständigen erfindungsgemäßen Enzyme charakteristisch sind. Derartige Peptide können in großen Mengen hergestellt werden und eignen sich besonders für Studien über die Kinetik der Enzymaktivität, die Regulation der Enzymaktivität, die dreidimensionale Struktur der Enzyme, die Hemmung der Enzymaktivität durch verschiedene Chemikalien und Pharmaka und die Bindungsgeometrie und Bindungsaffinität verschiedener Liganden.
Vorzugsweise wird zur rekombinanten Herstellung der erfindungsgemäßen Enzyme eine DNA mit den Nukleotiden aus den in den Figuren la, lb, 2a und 2b dargestellten Sequenzen oder ein Fragment gemäß den Figuren 4a und 4b verwendet.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Verfahren zur Gewinnung der Enzyme, die beteiligt sind am DOXP- Stoffwechselweg, insbesondere die Enzyme DOXP-Synthase und DOXP-Reduktoisomerase durch Isolierung aus den Parasiten. Die Isolierung der Enzyme erfolgt aus Parasiten-Extrakten über chromatographisch, elektrophoretische und andere dem Fachmann bekannte Verfahren. Die Enzyme werden mittels Messung der jeweiligen enzymatischen Aktivität oder Reaktivität mit entsprechenden Antikörpern ermittelt.
Der Nachweis von transformierten, transfizierten bzw. transduzierten Wirtszellen, welche die Enzyme rekombinant produzieren, sowie die Aufreinigung des Proteins erfolgen vorzugsweise über Antikörper, die an diese Enzyme binden. Derartige Antikörper sind mit Hilfe der erfindungsgemäßen Enzyme oder Teile der Enzyme als Antigen oder Immunogen in einfacher Weise nach bekannten Verfahren erhältlich.
Mit den erfindungsgemäßen Antikörpern gegen die Proteine können beispielsweise durch Western-Blotting-Analysen homologe bzw. kreuzreagierende Proteine anderer Parasiten de- tektiert werden. Ein weiterer Gegenstand dieser Erfindung sind Methoden zur Bestimmung der enzymatische Aktivität der DOXP-Enzyme, insbesondere der Enzyme DOXP-Synthase und DOXP- Reduktoisomerase. Dies kann nach den bekannten Anleitungen bestimmt werden (Sprenger et al . PNAS, 94 (1997) 12857-62 und Kuzuyama et al. Tetrahedron Letters 39 (1998) 4509-12). Hierbei wird die Kondensation von Pyruvat und Glyceralde- hyd-3-Phosphat zu l-Desoxy-D-xylulose-5-Phosphat (DOXP- Synthase) und die Umwandlung von l-Desoxy-D-xylulose-5- Phosphat zu 2-C-Methyl-D-erythritol-4-Phosphat (DOXP- Reduktoisomerase) detektiert. Ein weiterer Gegenstand dieser Erfindung ist die Verwendung diese Meßverfahren zur Ermittlung von Stoffen, die die Aktivität der jeweiligen Enzyme inhibieren.
Durch die Anwendung der rekombinanten Technologie ist es möglich, eine Vielzahl von Varianten von Enzymen oder Teilstücken von Enzymen herzustellen. Derartige Derivate können beispielsweise modifiziert sein in einzelnen oder mehreren Aminosäuren durch Substitution, Deletion oder Addition. Die Derivatisierung kann beispielsweise über site directed mutagenesis (ortsspezifische Mutagenese) erfolgen. Derartige Variationen sind für einen Fachmann ohne weiteres durchführbar. Es muß lediglich sichergestellt sein, daß die charakteristischen Eigenschaften der Enzyme erhalten bleiben.
Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Enzyme und ihrer Homologen können neue spezifische Wirkstoffe gegen Parasiten gefunden werden.
Insbesondere können die oben beschriebenen Detektions- Methoden in geeigneten Testkits zum Screening auf antipara- sitäre Wirkung von Stoffen verwendet werden. Hierzu gehören Methoden, die dem Fachmann bekannt sind und sich zum Scree- ning von Naturstoffen aus Flora und Fauna, aus Pflanzen, Algen, Bakterien oder Tieren eignen, und deren Derivate, chemischen Bibliotheken, auch Bibliotheken, die mittels dem Fachmann bekannter Techniken, einschließlich der kombinatorischen Chemie erstellt wurden (Pindur et al . Pharmazie in unserer Zeit 26 (1997) 24-30; Broach et al . Nature 384 (1997) 14-6; Lack et al. Chimia 50 (1996) 445-7; Czarnik und Ellmann Accounts of chemical research 29 (1996) ; Chemical and engineerings News 74 (1996) 28-73; Lorin et al . Chemical reviews 96 (1996) 555-600; Weber et al . Nachrichten aus Chemie, Technik und Laboratorium 42 (1994) 698- 702) .
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung von Proteinen oder Teilstücken dieser Proteine, hierzu gehören Proteine oder Teilstücke von Proteinen mit oder auch ohne enzymatischer Aktivität in dem Fachmann bekannten Techniken zur Ermittlung von Strukturen des Proteins, insbesondere die Charakterisierung der Bindungsstellen, die sich für die Entwicklung von Mitteln mit inhibierender Wirkung auf die enzymatische Aktivität eignen.
Wirkstoffe die mit Hilfe der erfindungsgemäßen Proteine aufgefunden werden, sind für die Medizin und der Tiermedizin von hohem Interesse.
Die Wirkstoffe, die mit Hilfe der erfindungsgemäßen Proteine gefunden werden, eignen sich bei günstiger Warmblüterto- xizität zur Bekämpfung von pathogenen Parasiten, die bei Menschen und in der Tierhaltung und Tierzucht bei Nutz-, Zucht-, Zoo-, Labor-, Versuchs- und Hobbytieren vorkommen. Sie sind dabei gegen alle oder einzelne Entwicklungsstadien der Schädlinge, sowie gegen resistente und normal sensible Parasiten wirksam. Durch die Bekämpfung der Parasiten sollen Krankheiten, Todesfälle und Leistungsminderungen (z.B. bei der Produktion von Fleisch, Milch, Wolle, Häuten, Eiern usw.) vermindert werden, so daß der Einsatz der Wirkstoffe eine wirtschaftlichere und einfachere Tierhaltung möglich
Unter Verwendung dieser erfmdungsgemaßen Verfahren einschließlich der etablierten Assays (Ansätze) konnte gezeigt werden, daß die Aktivität der DOXP-Reduktoisomerase durch 3- (N-acetyl-N-hydroxyammo) propylphosphonat und derivative 3- (N-formyl-N-hydroxyammo) propylphosphonat (fosmidomycin) gehemmt wird. Beide Substanzen stammen aus einer chemischen Library von Acylhydroxylam oalkylphosphonsaurederivaten. Diese Verbmdungsgruppe wurde m der Vergangenheit als her- biziα und als bakterizid besenrieben (US 4693742, DE2733658) . Hier zeigte sich die Effizienz des Systems für das Auffinden von antiparasitaren Wirkstoffen. Die Ergebnisse aus den Enzymassays konnten auch m der Malariakultur (siehe Beispiele) unα im Tierversuch (siehe Beispiele) bestätigt werden. Die mittels cieser Enzymassays ermittelten Inhibitoren konnten das Wachstum von Malariaparasiten in vitro und m vivo hemmen. Eine Behandlung der Tiere über einem Zeitraum von 8 Tagen zeigte eine Heilung der Tiere. Hier zeigte die Acetylform eine dreifach höhere Wirksamkeit als die Formylform. Dieses Ergebnis ist sehr überraschend, da wesentlich höhere (bis zu lOOOx) Konzentrationen 3- (N- acetyl-N-hydroxyammo) propylphosphonat benotigt werden, um das Bakterienwachstum zu hemmen.
Damit sind das erfindungsgemaße Verfahren zur Identifizie- rung von Wirkstoffen und die erfindungsgemäßen Wirkstoffe zur therapeutischen und prophylaktischen Behandlung von Infektionen bei Mensch und Tier geeignet, die durch Parasiten, Pilze oder Viren hervorgerufen werden. Die Verbindungen sind als Prophylaxe gegen sowie zur Behandlung von Infektionen, hervorgerufen durch Erreger der Malaria und der Schlaf rankheit sowie der Chagas-Krankheit, der Toxoplasmo- se, der Amöbenruhr, der Leishmaniosen, der Trichoπtoniasis, der Pneumozystose, der Balantidiose, der Kryptosporidiose, der Sarkozystose, der Akanthamöbose, der Naeglerose, der Kokzidiose, der Giardiose und der Lambliose geeignet.
Die erfindungsgemäßen Verfahren und erfindungsgemäßen Wirkstoffe eignen sich besonders zur Behandlung der Malaria, der Schlafkrankheit und der Leishmaniosen.
Die erfindungsgemäßen Wirkstoffe eignen sich auch zur Inhibition des Stoffwechselwegs von Bakterien, und von Pflanzen. Damit eignen sich Substanzen, die erfindungsgemäß als Inhibitoren des DOXP-Stoffwechselweges identifiziert werden, auch zur Anwendung als Herbizide und zur Anwendung bei der Behandlung von bakteriellen Infektionen bei Mensch und Tier.
Zu den für eine Behandlung geeigneten Nutz- und Zuchttieren gehören Säugetiere, wie z.B. Rinder, Pferde, Schafe, Schweine, Ziegen, Kamele, Wasserbüffel, Esel, Kaninchen, Salz- und Süßwasserfische, wie z. B. Forellen, Karpfen und Aale. Zu den geeigneten Labor- und Versuchstieren gehören Mäuse, Ratten, Meerschweinchen, Goldhamster, Hunde, Katzen und Schweine. Zu den geeigneten Hobbytieren gehören Hunde und Katzen. Die Anwendung kann sowohl prophylaktisch als auch therapeutisch erfolgen. Die Anwendung der Wirkstoffe erfolgt direkt oder in Form von geeigneten, dem Fachmann bekannten Zubereitungen wie enteral, parenteral, dermal oder nasal.
Die erfindungsgemäßen Wirkstoffe können in Kombination mit allen dem Fachmann bekannten Antiinfektiva verwendet werden. Hierzu gehören Substanzen, die antibakterielle, antiparasitäre, antivirale oder fungizide Wirkungen haben. Hierzu gehören Antiinfektiva, die in der Roten Liste und in der Fachliteratur (Allgemeine und spezielle Pharmakologie und Toxikololgie von Forth et al. Bl-Wissenschaftsverlag, Mannheim 1998; Antibiotikatherapie von Simon und Stille, Schattauer-Verlag, Stuttgart 1993) aufgeführt sind.
Da einige Parasiten sowohl über dem evalonat- Stoffwechselweg, als auch über dem DOXP-Stoffwechselweg verfügen, betrifft die Erfindung weiter die Kombination von Inhibitoren des DOXP-Stoffwechselweges mit Mitteln, die den Fettstof wechselweg inhibieren, einschließlich Inhibitoren der Synthese oder der Aufnahme von Lipiden, insbesondere Inhibitoren des Mevalonat-Stoffwechselweges . Hier seien insbesondere die Inhibitoren der Ezyme HMG-COA-Synthase und Inhibitoren der HMG-CoA-Reduktase genannt. Zu den Inhibitoren der HMG-CoA-Reduktase zählen insbesondere Lovastatin und Derivate, Mevastatin und Derivate, Compactin und Derivate, Simvastatin und Derivate, Pravastatin und Derivate, Atorvastatin und Derivate, Fluvastatin und Derivate und Ce- rivastatin und Derivate.
Beispiel 1 Expressionsklonierung des die DOXP-Reductoisomerase codierenden Gens von P. falciparum.
Die Klonierung des die DOX-Reductoisomerase von P. falci parum codierenden Gens erfolgte durch PCR-Amplifikation der entsprechenden Sequenzen von genomischer DNA als Matrize. Zur Gewinnung von genomischer DNA wurde der P. falciparum- Stamm HB3 nach der Kerzentopf-Methode kultiviert (Tranger und Jensen (1976), Science 193, 673-675). Als Kulturmedium wurde RPMI 1640 (mit HEPES und L-Glutamin, Gibco) mit 10 % humanem Serum, 0.3 μg / ml Gentamycin und 0.1 mM Hypoxan- thin supplementiert und mit humanen Erythrozyten ein Häma- tokrit von 5 % eingestellt. Für die Präparation der DNA wurden 15 Kulturschalen mit je 35 ml Kulturvolumen bei ca. 4 % Parasitämie verwendet. Die infizierten Erythrozyten wurden durch Zentrifugation geerntet und zweimal in Trager- Puffer (57 mM NaCl, 58 mM KC1, 1 mM NaH2P04, 7 mM K2HP04, 11 mM NaHCOs, 14 mM Glucose) gewaschen. Die Parasiten wurden aus den Erythrozyten freigesetzt, indem das Zellsediment mit einem lOfachen Volumen 1 liger Saponinlösung in Trager- Puffer für 5 min auf Eis lysiert wurde (modifiziert nach Kilejian (1979), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76, 4650-4653). Die freien Parasiten wurden zweimal durch Zentrifugation (10 min, 10.000 rpm, 4 °C) mit einer Lösung von 1 % BSA in Trager-Puffer gewaschen. Die DNA-Präparation aus den gewonnenen freien Parasiten erfolgte nach Standardprotokollen. Zunächst wurden die Parasiten mit Proteinase K verdaut. Dann wurde der Ansatz viermal mit Phenol / Chloroform extrahiert, die DNA-Lösung über Nacht gegen TE dialysiert und anschließend mit Isopropanol präzipitiert . Für die PCR-Amplifikation wurden folgende Primer verwendet:
PfYAEMfor 5 -CTGAATTTCATATTACAAAATTAATAGATG-3 Λ PfYAEMrev 5 λ-GTACTATGAAGAATTATGTTTGTTGTATAT-3 x .
Für die PCR-Reaktion wurde folgender Ansatz verwendet:
3 μl 10 x PCR-Puffer
2,4 μl 25 mM MgSO,
2,4 μl 2,5 mM dNTP
2 μl Matrizen-DNA (0,2 μg / ml)
2 μl Primer 1 (7,5 uM)
2 μl Primer 2 (7,5 uM)
0.2 μl Taq-Polymerase (5 U / μl) 16 μl H20
Die Amplifikation erfolgte mit folgendem Profil:
3 Zyklen: 96°C 1 mm
48 °C 1 mm 72°C 3 mm 32 Zyklen: 95 °C 40 sec 48°C 1 mm 72°C 3 mm
Nach dem letzten Zyklus wurde der Ansatz zur vollständigen Verlängerung aller Produkte noch 10 mm bei 72°C kubiert. Das PCR-Produkt von 4 derartigen Ansätzen wurde vereinigt und über ein 0.7 %ιges Agarosegel gereinigt. Die Elution der DNA aus dem Agaroseblockchen erfolgte mit dem „Kit for DNA extraction" (Millipore, Kat . Nr. S667) . Die eluierte DNA wurde mit Ethanol prazipitiert und 10 μl H20 aufgenommen. Anschließend wurde das PCR-Produkt nach den Vorschriften des Herstellers mit dem TA-clonmg kit (Invitro- gen) kloniert. Dabei wurden 20 mg msert-DNA für einen Li- gationsansatz verwendet. Bakterienkolonien, die das ge- wünschte rekombinante Plasmid trugen, wurden durch analytische Plasmidpräparation und EcoR I- Verdau der Plasmide identifiziert. Die klonierten PCR-Produkte wurden dann unter Verwendung von Standard- Forward- und Reverse-Primern sequenziert; die Sequenzen wurden mit der Technik des Primer Walkings vervollständigt.
Für die Expression in C0S-7- Zellen wurde ein PCR-Produkt, das in der entsprechenden Orientierung im pCR2.1-Vektor vorlag, in den Expressionsvektor pBK-CMV (Stratagene) um- kloniert. Die Umklonierung erfolgte dabei über die Schnittstellen der Restriktionsenzyme Not I und BamH I, die im Polylinker beider Vektoren vorkommen. Für die Transfektion der COS-7-Zellen wurde der Expressionsvektor mit dem PCR- Produkt als Insert über Anionenaustausch-Chromatographie (Qiagen) im präparativen Maßstab hergestellt. Alle für die Klonierung verwendeten Methoden sind ausführlich beschrieben in J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd editi- on, Cold Spring Habor Laboratory Press, Cold Spring Habor, USA.
Die COS-7-Zellen wurden in DMEM-Medium mit 10 % FCS unter Standardbedingungen kultiviert. Pro Zellkulturflasche wurden 30 ml Kulturmedium berechnet. Für die Transfektion wurden Zellen bei ca. 50 % Konfluenz verwendet, die am Vortag frisch gesplittet worden waren. Als Transfektionsreagenz wurde DOTAP (Boehringer) verwendet. 40 μl DNA-Lösung (0,5 μg / ml) wurden mit 110 μl 20 mM HEPES (pH 7,4) gemischt. Außerdem wurden 100 μl DOTAP mit 230 μl 20 mM HEPES (pH 7,4) in einem Polystyrol-Reaktionsgefäß gemischt. Dann wurde die DNA-Lösung zu der DOTAP-Lösung zupipettiert und 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde der Ansatz mit 20 ml Kulturmedium gemischt und das Medium der COS-7-Zellen durch dieses Gemisch ersetzt. Am folgenden Tag wurden die Zellen mit frischem Medium in neue Zellkulturflachen transferriert . Nach weiterer 48stündiger Inkubation wurden die transfizierten COS-7-Zellen geerntet. Dazu wurden die Zellen abgeschabt und dreimal durch Zentrifugation in Assay-Puffer (100 mM TrisHCl (pH 7,5), 1 mM MnCl2 ) gewaschen. Die Zellen wurden in einem minimalen Volumen Assay-Puffer resuspendiert und durch dreimaliges Einfrieren (in flüssigem Stickstoff) und Auftauen aufgeschlossen. Zellfragmente wurden in einem 1.5 ml Reaktionsgefäß abzen- tifugiert (13 000 rp , 10 min, 4 °C) und der Überstand direkt für die Messung der Enzymaktivität oder zur Aufreinigung des Enzyms verwendet.
Beispiel 2
Reinigung der rekombinanten DOXP-Reductoisomerase von P. falciparum
Zur genaueren Charakterisierung wurde die in COS-7-Zellen exprimierte rekombinante DOXP-Reductoisomerase von P. fal ciparum zur weitgehenden Homogenität aufgereinigt . Die Reinigung erfolgte über einen affinitätschromatogrphischen und einen gelpermeationschromatographischen Schritt. Zur Herstellung einer geeigneten Affinitätschromatographie- Säule wurden zunächst Antikörper gegen die DOXP- Reductoisomerase von P. falciparum hergestellt. Dazu wurden aus der von der DNA-Sequenz abgeleiteten Aminosäurensequenz solche Abschnitte ausgewählt, für die eine besonders hohe antigene Wirkung vorausgesagt werden konnte. Entsprechende Peptide wurden synthetisiert und für die Immunisierung von Kaninchen eingesetzt. Die Qualität der erhaltenen Antiseren wurde sowohl anhand ihrer Reaktivität mit den synthetischen Peptiden, als auch durch Western blot-Analysen bestätigt. Für die Western blot-Analysen (BM Western Blottmg Kit, Boehrmger) wurden Extrakte aus P. falciparum und rekombinanten COS-Zellen verwendet.
Zur Herstellung der Affmitatchromatographie-Saule wurde das Antiserum zur Beseitigung niedermolekularer Amme gegen PBS dialysiert. Die Antikörper wurden dann an Protein A- Sepharose gebunden und durch Cross-lmkmg mit DMP kovalent gekoppelt (IgG Oπentation Kit, Pierce) . Der Proteinextrakt wurde wie m Beispiel 1 beschrieben aus 55 Zellkulturflachen mit transflzierten COS-7-Zellen gewonnen und auf die mit Assay-Puffer aquilibrierte Säule geladen. Nach exzessivem Waschen mit Assay-Puffer wurde die Säule mit Elutions- Puffer (100 mM GlycmHCl (pH 2,8), 0.4 % CHAPS) eluiert. Das Eluat wurde sofort mit 1 M TrisHCl (pH 7,5) neutralisiert. Die Hauptfraktionen wurden durch Westen blot-Analyse identifiziert. Dazu wurden f r die Detektion biotmylierte Antikörper verwendet, um eine Störung durch von der Säule m geringer Menge eluierte Antikörper zu vermeiden. Die Hauptfraktionen wurden vereinigt, gegen Assay-Puffer dialysiert und durch Ultraflltration (30 kDa, Amicon) konzentriert. Die weitere Reinigung erfolgte durch Gelpermeation- schromatogrphie (Superdex 200, Pharmacia) mit Assay-Puffer als Start- und Elutions-Puffer . Die Hauptfraktionen wurden wie oben beschrieben identifiziert, vereinigt und konzentriert, mit 20 % Glygerm versetzt und bei -70°C eingefroren. Durch SDS-PAGE (12 % Acrylamid) unter reduzierenden Bedingungen und Silberfarbung (Gelcode Colour Silver Stam Kit, Pierce) wurde die gereinigte DOXP-Reductoisomerase von P. falciparum als einheitliche Bande bei 54 kDa dargestellt.
Beispiel 3 Bestimmung der Aktivität des gereinigten Enzyms und Scree- ning nach Inhibitoren
Die DOXP-Reductoisomerase-Aktivitat des gereinigten Enzyms wurde m einem in vi tro-Versuchssystem bestätigt. Für einen typischen Versuchsansatz wurdenlOO μl Assay-Puffer mit 0,3 mM NADPH, 0,3 mM DOXP und 10 μg rekombmantem Enzym verwendet. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von DOXP zum kompletten Ansatz gestartet. Die Oxidation von NADPH wurde photometrisch bei 340 nm m Mikroquarzkuvetten bei 37 °C verfolgt. Dieses Versuchssystem wurde verwendet, um die Inhibition der rekombinanten DOXP-Reductoisomerase von P. falciparum durch verschiedene Substanzen zu zeigen. Nach Zugabe von 1 μM 3- (N-Formyl-N-hydroxylammo) -propyl- phosphonsaure-mononatπumsalz und und 1 μM 3- (N-Acetyl-N- hydroxylammo) -propyl-phospnonsaure-mononatriumsalz zum Reaktionsansatz war keine Veränderung der Absorption bei 340 nm zu beobachten. Unter diesen Bedingungen wurde die DOXP- Reductoisomerase von P. fal ciparum vollständig inhibiert.
Beispiel 4
Test der Wirksamkeit der Substanzen gegen Malaria m vi vo
Die verschiedenen Derivate wurden nach dem modifizierten Peters' Test getestet. Die Substanzen wurden dabei in einem Viertel der halblethalen Dosis (LD50) appliziert. Bei dem Versuchsansatz wurden zehn Mause mit Plasmodium vmcken, dem Erreger der Mausemalaria, infiziert. Nach Bestätigung der Infektion durch Blutuntersuchung erfolgte die Behandlung in vier Mausen. Als Kontrolle dienten sechs Mause, die nicht behandelt wurden. Die Behandlung mit 1-1000 mg/kg/d , 3- (N-Formyl-N-Hydroxylamino) - propylphosphonsäuremononatriumsalz über 3 Tage führte zu einer Abtötung der Parasiten im Blut der Mäuse. Die behandelte Gruppe war bereits nach einem Tag frei von lebenden Parasiten. Die Kontrollmäuse mußten am Tag 5 nach Infektion bei einer Parasitämie von > 80% getötet werden. Die behandelten Mäuse waren auch 8 Wochen nach Behandlungsende immer noch frei von Parasiten. Weitere Experimente zeigten eine Wirksamkeit von 50 mg/kg/d 3- (N-Formyl-N-hydroxylamino) - propyl-phosphonsäure-mononatriumsalz in Mäusen mit einer Parasitämie von 80%. Auch diese Mäuse waren nach 1 Tag frei von lebenden Parasiten. Die weiteren Ergebnisse für 3- (N- Formyl-N-hydroxylamino) -propyl-phosphonsäure- mononatriumsalz und 3- (N-Acetyl-N-hydroxylamino) -propyl- phosphonsäure-mononatriumsalz sind in Figur 5 dargestellt.
Beispiel 5
Schutzwirkung vor Malaria beim Versuch mit infizierten Mäusen
Die Wirksamkeit der Verbindungen in vivo gegenüber Malaria wurde unter Heranziehen von 20 bis 25 g schweren männlichen Mäusen (BALB/c-Stamm) getestet. Einen Tag vor der Infektion wurden vier Mäuse intraperitoneal mit 50 mg/kg 3- (N-Formyl- N-hydroxylamino) -propylphosphonsäure-mononatriumsalz behandelt. Die Mäuse wurden dann mit Plasmodium vinckeii infiziert. Mäuse, die nicht mit der Substanz vorbehandelt wurden, dienten als Kontrolle. Es konnte in den behandelten Mäusen keine Infektion nachgewiesen wurden, während die Kontrollmäuse nach 5 Tagen mit einer Parasitämie über 80% getötet werden. Die behandelten Mäuse waren auch 8 Wochen nach der Infektion frei von Parasiten. Beispiel 6
In vitro Inhibition des Wachstums von Malaria Parasiten Zum Prinzip der IC50-Bestιmmung (die Konzentration, bei der die Vitalität der Parasiten um die Hälfte reduziert wird)
Zur Bestimmung der IC50-Werte werden die Malariaparasiten zunächst für einen vollständigen 48-Stunden-Zyklus in Gegenwart von Inhibitoren kultiviert, m den anschließenden 24 Stunden wurde die Uberlebensrate durch [JH] -Hypoxanthin- Embau gemessen. Auf einer Mikrotiterplatte wird eine Ver- dunnungsreihe von 3- iN-Formyl-N-hydroxylammo) - propylphosphonsauremononatriumsalz m 10-fach konzentrierten 20-μl-Alιquots vorgelegt. Dann werden zu jedem Well 180 μl Parasitensuspensicn m Kulturmedium zugefugt. Es werden asynchrone Kulturen mit ca. 0,4% Parasitämie und 2 % Häma- tokπt verwendet. Anschließend werden die Mikrotiterplatten für 48 h mkubiert. Zann werden zu jedem Well 30 μl [3H]- Hypoxanthm zugefugt. Nach 24-stundιger Inkubation wurden die Zellen geerntet und die inkorporierte Radioaktivität wurde gemessen. In den Figuren 6a, 6b und 6c sind die Ergebnisse mit den Stammen HB3, A2 und Dd2 mit bekannten Resistenzen gegen andere Malaria-Medikamente dargestellt. In beiden Stammen ergibt sich ein IC-50-Wert von unter 0,5 uM. Die Resistenzen dieser Stamme sind:
Plasmodium falciparum HB3 (Honduras) ist gegen Pyrimethamm resistent .
Plasmodium falciparum Dd2 (Indochina) ist gegen Cloroquin, Chinin, Pyπmethamin, Cycloguanil und Sulfadoxin resistent. Plasmodium falciparum A2 (Gamoia) ist gegen Chloroquin und Cycloguanil resitent. Es wurden keine Kreuzresistenzen mit Anti-Malaria-Mitteln gefunden.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zum Auffinden von chemischen Wirkstoffen, die zur Therapie von Infektionskrankheiten, hervorgerufen durch ein- oder mehrzellige Parasiten geeignet sind, dadurch gekennzeichnet, daß man Proteine, die am 1-Desoxy- D-xylulose-5-Phosphat-Stoffwechselweg beteiligt sind, oder deren gleichwirkende Derivate mit den auf ihre Wirksamkeit gegenüber Parasiten zu untersuchenden Wirkstoffen in Berührung bringt und die Wirkstoffe, die die Proteine oder deren Derivate inhibieren, auswählt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Proteine an mindestens einem der folgenden Schritte a)-i), a) Umsetzung von Glycerinaldehyd und Pyruvat zu 1- Desoxy-D-xylulose, b) Umsetzung von Glycerinaldehyd-3-Phosphat und Pyruvat zu Isopentenyldiphosphat , c) Bildung von l-Desoxy-D-xylulose-5-Phosphat , d) Umsetzung von Glycerinaldehyd-3-Phosphat und Pyruvat zu 1-Desoxy-D-xylulose-5-Phosphat, e) Umsetzung von l-Desoxy-D-xylulose-5-Phosphat f) Bildung von 2-C- ethyl-D-erythritol-4-Phosphat, g) Umsetzung von l-Desoxy-D-xylulose-5-Phosphat zu 2-C- Methyl-D-erythritol-4-Phosphat, h) Umsetzung von 2-C-Methyl-D-erythritol-4-Phosphat, i) Umsetzung von 2-C-Methyl-D-erythritol-4-Phosphat zu Isopentenyldiphosphat beteiligt sind.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff die Produktion der beteiligten Enzyme oder der beteiligten Co-Faktoren, insbesondere den Umsatz des Enzyms l-Desoxy-D-xylulose-5- Phosphat-Synthase oder l-Desoxy-D-xylulose-5-Phosphat- Reduktoisomerase hemmt, oder den Abbau der beteiligten Enzyme oder beteiligten Co- Faktoren fördert.
4. Protein mit oder ohne l-Desoxy-D-xylulose-5-Phosphat- Synthase Aktivität, welches am l-Desoxy-D-xylulose-5- Phosphat-Stoffwechselweg beteiligt ist und a) codiert wird von der in Figur lb und 2b gezeigten DNA-Sequenz oder b) codiert wird von DNA-Sequenzen, die mit den in Figur lb oder 2b gezeigten DNA-Sequenzen oder Fragmenten dieser DNA-Sequenzen im DNA-Bereich, der für das reife Protein codiert, hybridisieren.
5. Protein mit oder ohne l-Desoxy-D-xylulose-5-Phosphat- Reduktoisomerase Aktivität, das am 1-Desoxy-D-xylulose- 5-Phosphat-Stoffwechselweges beteiligt ist, dadurch gekennzeichnet, daß es a) codiert wird von der in Figur la und 2a gezeigten DNA-Sequenz oder b) codiert wird von DNA-Sequenzen, die mit den in Figur la oder 2a gezeigten DNA-Sequenzen oder Fragmenten dieser DNA-Sequenzen im DNA-Bereich, der für das reife Protein codiert hybridisieren.
6. Protein nach den Ansprüchen 4 oder 5 und weitere Proteine, die am l-Desoxy-D-xylulose-5-Phosphat-
Stoffwechselweges beteiligt sind, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus den Kulturüberständen von Parasiten oder aus den aufgeschlossenen Parasiten durch Aufreini- gung über chromatographische und elektrophoretische Techniken erhaltlich sind.
7. Protein nach einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß es a) das Produkt einer prokaryonti- schen oder eukaryontischen Expression einer exogenen DNA ist, b) codiert wird von den Sequenzen la, lb, 2a oder 2b oder codiert wird von DNA-Sequenzen, die mit den in den Figuren la, lb, 2a oder 2b gezeigten DNA-Sequenzen oder Fragmenten dieser DNA-Sequenzen im DNA-Bereich, der das reife Protein codiert, hybridisieren, oder c) codiert wird von DNA-Sequenzen, die ohne Degeneration des genetischen Codes mit den b) definierten Sequenzen hybridisieren wurden und für ein Polypeptid mit entsprechender Aminosauresequenz codieren.
8. Protein gemäß einem der vorangehenden Ansprüche 4 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß es aus den Aminosäuren der Sequenzen 2a, 2b, 3a oder 3b besteht.
9. Protein nach einem der Ansprüche 4 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein l-Desoxy-D-xylulose-5- Phosphat-Synthase oder l-Desoxy-D-xylulose-5-Phosphat- Redukto-isomerase ist.
10. Nuklemsaure, welche ein Protein gemäß einem der Ansprüche 4 bis 9 codiert, dadurch gekennzeichnet, daß sie ausgewählt ist aus der Gruppe a) der in den Figuren la, lb, 2a, 2b gezeigten DNA-Sequenzen oder der komplementären DNA-Sequenzen, b) Nukleinsäuresequenzen, die mit der Sequenz von a) hybridisieren, c) Nukleinsäuresequenzen, die ohne die Degeneration des genetischen Codes mit ei- ner der in a) oder b) genannten Sequenzen hybridisieren würden.
11. DNA, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Sequenz aufweist, ausgewählt aus der Gruppe, die aus der in Figur la gezeigten Sequenz, der in Figur lb gezeigten Sequenz, der in Figur 2a gezeigten Sequenz und der in Figur 2b gezeigten Sequenz besteht.
12. Rekombinanter Expressionsvektor, der DNA enthält, die ein Protein nach den Ansprüchen 4 bis 9 codiert und in einem transformierten Mikroorganismus oder einem transformierten eukaryontischen Zelle, oder in einem Tier oder eine Pflanze die proteincodierende DNA exprimiert.
13. Wirtszelle, insbesondere prokaryontische Wirtszelle, eukaryontische Wirtszelle, Tiere und Pflanzen, welche mit einer DNA, die ein Protein nach den Ansprüchen 4 bis 9 codiert, transfiziert ist und das genannte Protein produzieren kann.
14. Wirtszelle nach Anspruch 13, die E. coli oder eine Säugerzellinie ist.
15. Verwendung von DNA, die für ein Protein nach den Ansprüchen 4 bis 9 codiert, zur Transfektion eines proka- ryontischen oder eukaryontischen Organismus.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein aus Parasiten oder aus Kulturüberständen von Parasiten-Kulturen über chromatographische und elektrophoretische Techniken gewonnen wird.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3 und 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein durch Expression der DNA, die ein Protein nach einem der Ansprüche 4 bis
9 codiert, in einer geeigneten Wirtszelle und Isolierung des Proteins aus der Wirtszelle oder aus dem Kulturüberstand der Wirtszelle rekombinant hergestellt wird.
18. Verwendung eines Proteins aus dem 1-Desoxy-D-xylulose- 5-Phosphat-Stoffwechselweg gemäß einem der Ansprüche 4 bis 8 als Antigen oder Immunogen zur Herstellung von Antikörpern, die an dieses Protein binden.
19. Antikörper gegen ein Protein aus dem 1-Desoxy-D- xylulose-5-Phosphat-Stoffwechselweg gemäß einem der Ansprüche 4 bis 9, erhältlich durch in-vitro- Immunisierungstechniken oder durch Immunisierung eines Tieres mit einem Protein gemäß einem der vorangehenden Ansprüchen und Gewinnung der Antikörper aus dem Serum oder aus den Milzzellen der immunisierten Tiere.
20. Verwendung eines Proteins gemäß einem der Ansprüche 4 bis 9 zur Identifizierung von antiparasitär wirkenden Stoffen.
21. Verwendung eines Antikörpers gemäß Anspruch 19 zur Identifizierung eines antiparasitär wirkenden Stoffes.
22. Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren, welche ein Protein gemäß einem der Ansprüche 4 bis 9 codieren, dadurch gekennzeichnet, daß die zu untersuchende Probe mit einer Nukleinsäuresonde inkubiert wird, welche aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus a) der in den Figuren la und lb gezeigten DNA-Sequenzen oder der dazu komplementären Sequenz, b) Nukleinsäuren, die mit einer der Sequenzen von a) hybridisieren bestehen, die Nukleinsäure- sonde mit der Nukleinsäure der Probe inkubiert wird und die Hybridisierung ggf. über einen weiteren Bindepartner von Nukleinsäuresonde nachgewiesen wird.
23. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß die nachzuweisende Nukleinsäure vor dem Nachweis am- plifiziert wird.
24. Testsysteme unter Verwendung eines Proteins gemäß einem der vorangehenden Ansprüchen zur Identifizierung eines antiparasitär wirkenden Stoffes.
25. Wirkstoff zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Infektionskrankheiten verursacht durch ein- oder mehrzellige Parasiten, dadurch gekennzeichnet, daß er unter Verwendung eine Testsystems nach Anspruch 24 identifiziert wird.
26. Wirkstoff zur Herstellung eines Herbizids oder eines Arzneimittels zur Behandlung von Infektionskrankheiten verursacht durch Bakterien, dadurch gekennzeichnet, daß er unter Verwendung eine Testsystems nach Anspruch 24 identifiziert wird.
27. Wirkstoff zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Infektionskrankheiten verursacht durch ein- oder mehrzellige Parasiten, dadurch gekennzeichnet, daß er die Enzyme oder Co-Faktoren des 1-Desoxy-D-xylulose- 5-Phosphat-Stoffwechselweges hemmt .
28. Wirkstoff nach Anspruch 25 oder 27, dadurch gekennzeichnet, daß er mindestens einen der folgenden Schritte a)-i), a) Umsetzung von Glycerinaldehyd und Pyruvat zu 1- Desoxy-D-xylulose, b) Umsetzung von Glycerinldehyd-3-Phosphat und Pyruvat zu Isopentenyldiphosphat, c) Bildung von l-Desoxy-D-xylulose-5-Phosphat, d) Umsetzung von Glycerinldehyd-3-Phosphat und Pyruvat zu 1-Desoxy-D-xylulose-5-Phosphat, e) Umsetzung von l-Desoxy-D-xylulose-5-Phosphat f) Bildung von 2-C-Methyl-D-erythritol-4-Phosphat, g) Umsetzung von l-Desoxy-D-xylulose-5-Phosphat zu 2-C- Methyl-D-erythritol-4-Phosphat, h) Umsetzung von 2-C-Methyl-D-erythritol-4-Phosphat, i) Umsetzung von 2-C-Methyl-D-erythritol-4-Phosphat zu Isopentenyldiphosphat hemmt.
29. Wirkstoff nach Anspruch 25, 27 oder 28, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff die Produktion der beteiligten Enzyme oder der beteiligten Co-Faktoren, insbesondere den Umsatz des Enzyms l-Desoxy-D-xylulose-5- Phosphat-Synthase oder l-Desoxy-D-xylulose-5-Phosphat- Reduktoisomerase hemmt, oder den Abbau der beteiligten Enzyme oder beteiligten Co- Faktoren fördert.
30. Wirkstoff nach einem der Ansprüche 25 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff 3- (N-acetyl-N- hydroxyamino) -propylphosphonat oder 3- (N-formyl-N- hydroxyamino) propyl-phosphonat ist .
31. Verwendung eines Wirkstoffs nach Anspruch 25, 27 bis 30 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Infektionskrankheiten verursacht durch ein- oder mehrzellige Parasiten, insbesondere von Malaria, der Schlafkrankheit und der Leishmaniosen.
32. Verwendung nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß das Arzneimittel ferner einen oder mehrere Bestandteile der Gruppe aufweist, die aus Hemmern der Fettstoffwechselwege, der Cholesterinsynthese, der Cho- lesterinaufnähme besteht.
33. Verwendung nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß der Hemmer der Fettstoffwechselwege ein HMG-CoA- Reduktase-Hemmer oder ein HMG-CoA-Synthase-Hemmer, insbesondere Lovastatin, Mevastatin, Compactin, Simvastatin, Pravastatin, Atorvastatin, Fluvastatin und Ceriva- statin, ist.
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