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TECHNISCHES GEBIET
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Die
vorliegende Erfindung betrifft neue Tachykinin-Peptide mit verengender Aktivität auf das
Intestinum eines Wirbeltiers und Vorläufer-Polypeptide davon. Spezifischer
betrifft die vorliegende Erfindung neue Tachykinin-Peptide, die
verengende Aktivität
auf das Intestinum eines Wirbeltiers besitzen, erhalten aus der posterioren
Speicheldrüse
von Octopus vulgaris, die Vorläufer-Polypeptide
davon und ein Gen, das für
die Polypeptide codiert.
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STAND DER TECHNIK
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Eledoisin,
das aus einem Acetonextrakt der posterioren Drüse der Meerestiere Eledone
moschata und E. aldrovandi isoliert wird und eine starke antihypertensive
Aktivität
bei Hunden besitzt, ist ein physiologisch aktives Neuropeptid, das
aus 11 Aminosäureresten
besteht (Erspamer, V., et al., Experientia, 18, 58, 1962). Es war
offensichtlich, dass Eledoisin außer einer antihypertensiven
Aktivität
eine verengende bzw. kontrahierende Aktivität auf das Ileum von Meerschweinchen
zeigt und auch eine spezifische Wirkung, wie Beschleunigung der
Speichelsekretion von Hunden, bei Verabreichung über intravenöse Injektion,
zeigt.
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Danach
ist das Peptid, das die gleichen Aktivitäten besitzt, aus Froschhaut
isoliert worden und mit Physalaemin („physalaemin") bezeichnet worden
(Erspamer, V., et al., Experientia, 20, 489, 1964).
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Derartige
Peptide wurden als Tachykinin bezeichnet (Tachy(=schnell)kinin,
etwas, das schnell kontrahiert), gegenüber Bradykinin (Brady(=allmählich)kinin,
etwas mit allmählicher
bzw. stufenweiser Bewegung), da sie eine schnelle veren gende Aktivität gegenüber dem
Ileum von Meerschweinchen besitzen. Darüberhinaus ist die chemische
Struktur von Substanz P auf der Grundlage der chemischen Struktur
von derartigen Peptiden aufgeklärt
worden.
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Obgleich
Peptide, zu Tachykinin klassifiziert, anschließend nacheinander aus der Klasse
der Amphibien (Yasuhara, T., et al., Biomed. Res., 2, 613, 1981)
und der Klasse der Vögel
(Conlong, J. M., et al., Regulatory Peptides, 20, 171, 1988) isoliert
wurden, ist, außer
Eledoisin aus einem wirbellosen Tier (Champagne, D. E. & Ribeiro, J. M.:
Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91, 138, 1994), lediglich Sialokinin
ausgehend von einer Stechmücke,
die Gelbfieber übertragen
hat, gefunden worden.
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Gegenwärtig besitzt
Tachykinin eine allgemeine Aminosäuresequenz, wiedergegeben durch
die nachstehende Formel, im C-Terminus
eines Peptids:
-Phe-Yaa-Gly-Leu-Met-NH2
[worin
Yaa eine aromatische Aminosäure
(z. B. Phe, Tyr) und verzweigte Aminosäure (z. B. Val, Ile) ist] und wird
definiert als ein Gattungsbegriff für ein physiologisch aktives
Peptid, das eine Intestinum-verengende Aktivität, eine hypotensive Aktivität, eine
die Speichelsekretion beschleunigende Aktivität und dergleichen zeigt. In
solche Arten von Tachykinin sind die vorstehend genannte Substanz
P, Eledoisin, Physalamin, Neurokinin A, Neurokinin B, Kassinin und
dergleichen eingeschlossen (SEIBUTUGAKU-JITEN (Ver. 4). Iwanami
Shoten, 1997).
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Auf
diese Weise ist der Einsatz des Tachykinin-Peptids als eine chemische
Grundverbindung für
die Entwicklung eines neuen Medikaments erwartet worden. Da in Betracht
gezogen wurde, dass Substanz P bei der Schmerzübertragung als übertragende
Substanz eines primären
sensorischen Nervs teilnimmt, ist insbesondere eine Entwicklung
als Analgetika erwartet und erforscht worden. Weiterhin ist die
praktische Verwendung eines chemischen Reagenzes zur Aufklärung eines Informationsverarbeitungsmechanismus
im Nervensystem von höheren
Tieren erwartet worden.
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Darüberhinaus
beschreiben Norinder U. et al. (J. Peptide Res., Bd. 49, 1997, Seiten
155–162)
eine quantitative Struktur-Aktivität-Verwandtschaftsstudie an
einigen Substanz P-verwandten Peptiden mittels einer multivariaten
Herangehensweise unter Verwendung von PLS und einer variablen Auswahl.
Hier wurden neun neue Analoga von Substanz P (SP) entworfen, wobei
quantitative Sequenz-Aktivität-Modelle,
basierend auf den Aminosäure-z-Skalen,
mit PLS als dem statistischen Verfahren und der GOLPE-Verfahrensweise
für die variable
Auswahl verwendet wurden. Sie wurden mittels Festphasen-Peptidsynthese synthetisiert
und hinsichtlich einer Affinität
gegenüber
dem NK-1-Rezeptor aus Rattenhirn getestet, wobei alle der neuen
Substanz P-Analoga hohe Affinitäten
mit IC50-Werten
von weniger als 0,8 nM zeigten.
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Daneben
beschreiben Badgery-Parker T. et al. (Peptides, Bd. 14, 1993, Seiten
771–775)
ein Rezeptorbindungsprofil von Neuropeptid γ und seinen Fragmenten, einen
Vergleich mit den Nicht-Säuger-Peptiden Carassin
und Ranakinin an drei Säuger-Tachykinin-Rezeptoren.
Hier wurden die Tachykinin-Bindungsstellenpräferenzen
von Neuropeptin γ (NP
7), C-terminalen Fragmenten davon, anderen Säuger-Tachykininen und den Nicht-Säuger-Tachykininen
Ranakinin und Carassin in kompetitiven Membranbindungsstudien untersucht. Die
Autoren folgerten, dass die Verlängerung
des Neurokinin A-Moleküls
die Bindung an die Ratten-Tachykinin-NK-1- und -2-Bindungsstellen nicht
zu beeinflussen scheint, Ranakinin eine Aktivität für die NK-1- und Nk-2-Stelle
besitzt, ähnlich
zu der von Substanz P bzw. Neurokinin A, jedoch eine geringe Affinität für die NK-3-Stelle
besitzt und dass Carassin trotz seiner strukturellen Ähnlichkeiten
zu Neuropeptid γ nur
moderate Affinität
für Ratten-Tachykinin-Bindungsstellen
besitzt.
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Übrigens
wird behauptet, dass die posterioren Speicheldrüsen von Oktopussen Venom- bzw.
Giftdrüsen
sind, da ein Teil der Speicheldrüse
außer
dem vorstehend genannten Eledoisin toxische Substanzen, wie Tetrodotoxin,
bekannt als Fugu-Gift,
und Cephalotoxin, das ein Glycoprotein mit einer Crustaceen betäubenden
Wirkung ist, umfassen kann. Es war ferner bekannt, dass sie eine
Gruppe biogener Amine, wie Octopamin, Serotonin, Tyramin, Noradrenalin,
Histamin und Acetylcholin, umfassen könnten, und dass sie eine enzymatische
Gruppe, wie ein proteolytisches Enzym und Hyaluronidase, umfassen
könnten
(Boucaud-Camou, E. & Boucher-Rodoni,
R. 1983. Feeding and digestion in Cephalopods. In "The mollusca", (Saleuddin, A.
S. M. & Wilbur,
K. M.), Academic Press, New York). Es ist jedoch nicht beschrieben
worden, dass ein Tachykinin-Peptid außer Eledoisin gefunden wurde.
Ferner ist, obgleich entdeckt wurde, dass Eledoisin Glattmuskelkontrahierende
Aktivität,
angiektatische Aktivität
und antihypertensive Aktivität
auf Säuger
besitzt, nicht entdeckt worden, dass Eledoisin eine Rolle beim Oktopus
besitzt.
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Auf
diese Weise ist es erforderlich, die Tachykinin-Peptide aus einer größeren Zahl von Tierarten zu erforschen
bzw. aufzufinden, um eine Information darüber zu erhalten, welches für die Entwicklung
von Medikamenten und für
die Aufklärung
eines Informationsverarbeitungsmechanismus im Nervensystem höherer Tiere
verwendbar ist, und zwar basierend auf der Erforschung und dergleichen
einer Struktur-Aktivität-Beziehung durch Aufklärung einer
Artspezifität
der Peptide und einer Rolle von bzw. bei jeder der Tierarten hinsichtlich der
Tachykinin-Peptide.
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Daher
ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, das neue Tachykinin-Peptid
bereitzustellen, das zur Verwendung als chemisches Reagens zur Aufklärung eines
Informationsverarbeitungsmechanismus im Nervensystem von höheren Tieren
und als eine chemische Grundverbindung bei der Entwicklung von Medikamenten
und Pestiziden befähigt
bzw. tauglich ist, und zwar durch Erforschen bzw. Auffinden der
neuen Tachykinin-Peptide,
Aufklärung
von deren Struktur und weiterer Aufklärung von deren physiologischen
Aktivitäten.
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Ferner
ist es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur
Herstellung des Tachykinin-Peptids durch Identifizieren des Vorläufer-Polypeptids
eines derartigen Tachykinin-Peptids und des Gens, das dafür codiert,
bereitzustellen.
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OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
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Um
derartige Aufgaben zu lösen,
stellt die vorliegende Erfindung ein Tachykinin-Peptid bereit, das durch
die nachstehende Aminosäuresequenz
(II) wiedergegeben wird:
H-Lys-Pro-Pro-Ser-Ser-Ser-Glu-Phe-Xaa-Gly-Leu-Met-NH2
(II) (worin Xaa Val, Ile, Phe oder
Tyr ist).
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In
der vorliegenden Beschreibung wird, solange keine Bedingung angegeben
wird, ein Aminosäurerest
durch die von IUPAC und IUB definierte 3-Buchstaben-Notation geschrieben.
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Das
heißt,
die bezeichneten Erfinder leisteten Forschungsarbeit hinsichtlich
des Isolierens des neuen Tachykinin-Peptids aus einer posterioren
Speicheldrüse
von Octopus vulgaris, wobei die verengende Aktivität auf das
Rektum von Fischen (Karpfen) als der Parameter verwendet wurde.
Aus den vorstehend genannten Aminosäuresequenzen (II) werden die
Peptide, die durch die nachstehenden Aminosäuresequenzen (1) und (2) wiedergegeben
werden:
H-Lys-Pro-Pro-Ser-Ser-Ser-Glu-Phe-Val-Gly-Leu-Met-NH2 (1)
(hiernach als Verbindung (1) bezeichnet)
und
H-Lys-Pro-Pro-Ser-Ser-Ser-Glu-Phe-Ile-Gly-Leu-Met-NH2 (2)
(hiernach als Verbindung (2) bezeichnet)
isoliert
und gereinigt, anschließend
die chemischen Strukturen dieser Peptide identifiziert und weiterhin
deren Struktur und physiologische Aktivitäten bestätigt, und zwar mittels Totalsynthese
dieser Peptide.
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Darüberhinaus
bestimmten die bezeichneten Erfinder die vollständige primäre Aminosäuresequenz von Polypeptiden
als (ein) Vorläufer
von Tachykinin-Peptiden, wiedergegeben durch die Aminosäure(sequenz) SEQ
ID NO 3, durch Herstellen der Primer auf der Grundlage der vorstehend
genannten Aminosäuresequenzen
und Kombinieren von Analyseverfahren von Gensequenzen unter Verwendung
einer Reverse-Transkription-Polymerasekettenreaktion
(RT-PCR), die an Gesamt-RNA, präpariert
aus der posterioren Speicheldrüse von
Octopus vulgaris, durchgeführt
wird.
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Die
bezeichneten Erfinder stellten ferner fest, dass das Gen, das für das Vorläufer-Polypeptid
des vorstehend genannten Tachykinin-Peptids codiert, die durch SEQ
ID NO 4 wiedergegebene Rasensequenz besitzt.
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Daher
stellt die vorliegende Erfindung als weitere Ausführungsform
das Vorläufer-Polypeptid
des Tachykinin-Peptids, wiedergegeben durch die Aminosäure(sequenz)
SEQ ID NO 3, bereit.
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Als
weitere Ausführungsform
stellt die vorliegende Erfindung darüber hinaus ein Verfahren zur
Herstellung des Gens, das für
das vorstehend genannte Tachykinin-Peptid und Vorläufer-Polypeptid
codiert, bereit, insbesondere des Gens, das aus der Rasensequenz,
die durch SEQ ID NO 4 wiedergegeben wird, besteht, des Tachykinin-Peptids
und des Vorläufer-Polypeptids, und
zwar durch Genrekombinationstechnologie unter Verwendung des Gens
oder einer Wirtszelle, die durch einen Vektor transformiert ist
und wobei der Vektor diese Gene umfasst.
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KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
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1 zeigt
das abschließende
Elutionsprofil der Umkehrphasen-HPLC von Verbindung (1), ein Peptid der
vorliegenden Erfindung, in Beispiel 2.
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2 zeigt
das abschließende
Elutionsprofil der Umkehrphasen-HPLC von Verbindung (2), ein Peptid der
vorliegenden Erfindung, in Beispiel 3.
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3 zeigt
das Ergebnis der verengenden bzw. kontrahierenden Aktivität auf das
Rektum des Karpfens durch Zugabe von Verbindung (1) der vorliegenden
Erfindung zu der Kammer mit einer Menge, die der von einem Tier
bzw. Stück
(„head") Octopus vulgaris
entspricht, in Beispiel 6.
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4 zeigt
das Ergebnis der verengenden Aktivität auf das Rektum des Karpfens
durch Zugabe von Verbindung (2) der vorliegenden Erfindung zu der
Kammer mit einer Menge, die der von einem Tier Octopus vulgaris
entspricht, in Beispiel 6.
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5 zeigt
das Ergebnis der verengen Aktivität auf das Ileum des Meerschweinchens
durch Zugabe von Verbindung (1) der vorliegenden Erfindung zu der
Kammer mit einer Konzentration von 1 × 10–8 M
in Beispiel 7.
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6 zeigt
das Ergebnis der verengen Aktivität auf das Ileum des Meerschweinchens
durch Zugabe von Verbindung (2) der vorliegenden Erfindung zu der
Kammer mit einer Konzentration von 1 × 10–8 M
in Beispiel 7.
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7 zeigt
die Aminosäuresequenz
des Vorläufer-Polypeptids, in der
der unterstrichene Teil die Aminosäuresequenz von Tachykinin-Peptid
gemäß der vorliegenden
Erfindung ist.
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BESTE WEISE ZUR AUSFÜHRUNG DER ERFINDUNG
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Das
durch die vorliegende Erfindung bereitgestellte neue Peptid ist
ein Tachykinin-Peptid mit verengender Aktivität auf das Intestinum eines
Wirbeltiers und kann wie folgt aus Octopus vulgaris isoliert und
gereinigt werden.
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Beispielsweise
wird die posteriore Speicheldrüse
von Octopus vulgaris mit heißem
Wasser extrahiert, anschließend
wird dem Extrakt Essigsäure
bis zum Erreichen einer Konzentration von 3% zugesetzt und nach Abkühlung wird
ein Rohex trakt erhalten, wobei ein Zentrifugentrennverfahren verwendet
wird. Nach Absorbieren dieses Rohextrakts auf einer C18-Säule („C18 cartridge") (z. B. Sep-Pak(Marke)-Säulen: Waters
Co.), wird eine peptidhaltige Fraktion eluiert, wobei 60%-ige Methanollösung, enthaltend
0,1% Trifluoressigsäure
(hiernach bezeichnet als TFA), verwendet wird und anschließend kann
das ins Auge gefasste Peptid aus der Lösung abgetrennt und gereinigt
werden, indem Ionenaustauschchromatographie, Umkehrphasenchromatographie
und dergleichen verwendet werden.
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Da
die Peptide der vorliegenden Erfindung aus 12 Aminosäureresten
bestehen, können
sie ferner leicht mittels des herkömmlichen Festphasenverfahrens
unter Verwendung eines herkömmlichen
Peptidsynthesegeräts
(z. B. ein Peptidsynthesegerät
mit der Bezeichnung 433A, erhältlich
von PE Bio Systems Japan) oder des herkömmlichen organischen Syntheseverfahrens
hergestellt werden. Das unter Verwendung derartiger Verfahren erhaltene
rohe Peptid kann auf dem Wege eines herkömmlichen Reinigungsverfahrens,
wie die Umkehrphasenchromatographie oder ein Kristallisationsverfahrens,
gereinigt werden, sofern nötig.
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Andererseits
kann eine Aminosäuresequenz
der Vorläufer-Polypeptide, isoliert
aus Octopus vulgaris, und eine Rasensequenz eines Gens, codierend
für die
Polypeptide, wie folgt bestimmt werden:
Beispielsweise wird
die Gensequenz von etwa 500 Rasenpaaren bestimmt, indem RT-PCR an
Gesamt-RNA, präpariert
aus der posterioren Speicheldrüse
von Octopus vulgaris, mit den Primern, die auf der Grundlage der Aminosäuresequenz
der Tachykinin-Peptide hergestellt wurden, durchgeführt wird.
Anschließend
wurde die Bestimmung der Gensequenz des 5'-Endes und des 3'-Endes durchgeführt, wobei das 5'-RACE-Verfahren und das
3'-RACE-Verfahren
verwendet wurden. Folglich wurde geschlussfolgert, dass die Aminosäuresequenz von
Vorläufer-Polypeptiden von
Tachykinin-Peptiden die durch SEQ ID NO 3 wiedergegebene Aminosäuresequenz
hat und dass das dafür
co dierende Gen die durch SEQ ID NO 4 wiedergegebene Rasensequenz
hat.
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Daher
können
die erfindungsgemäßen Tachykinin-Peptide
und die Vorläufer-Polypeptide
davon mittels eines Genrekombinationsverfahrens hergestellt werden.
Das heißt,
dass beim Produzieren der Polypeptide unter Verwendung des Genrekombinationsverfahrens,
diese erhalten werden können
durch: Herstellen des Vektors, der das durch SEQ ID NO 4 wiedergegebene
Gen integriert hat, Transformieren einer Wirtszelle durch den Vektor,
Inkubieren oder Züchten
der Wirtszelle und Isolieren und Reinigen der interessierenden Vorläufer-Polypeptide
aus der Wirtszelle oder Kulturlösung.
Anschließend
können
die ins Auge gefassten Tachykinin-Peptide durch Ausschneiden aus
den (Prozessieren) und Modifizieren der Vorläufer-Polypeptide(n) unter Verwendung
eines Enzyms und dergleichen und weiterhin durch Aufreinigung, sofern
notwendig, erhalten werden.
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Da
das Peptid der vorliegenden Erfindung das Tachykinin-Peptid ist, das eine
Glattmuskel-kontrahierende Aktivität, eine angiektatische und
eine antihypertensive Aktivität
verursacht, kann es für
Reagenzien zur Erforschung eines Neurotransmissionssystems verwendet
werden und es stellt ferner eine neue Herangehensweise für die Entwicklung
von Wirkstoffen bereit.
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Zum
Beispiel kann das Medikament, das das Peptid der vorliegenden Erfindung
als wirksamen bzw. aktiven Inhaltsstoff enthält, in Form von oralen oder
parenteralen Formulierungen, wie Kapseln, Tabletten oder eine injizierbare
Lösung,
mit einem Exzipiens, das herkömmlicherweise
auf dem pharmazeutischen Gebiet verwendet wird, verabreicht werden.
Spezifischer können
die Peptide der vorliegenden Erfindung mit einem Exzipiens, wie
Laktose, Stärke
oder ein Derivat davon und Cellulosederivate, gemischt werden und
das resultierende Gemisch wird in eine Gelatinekapsel gefüllt, um
eine Kapselformulierung zu erhalten.
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Die
Tablettenformulierung kann hergestellt werden, indem Peptid zusammen
mit den oben genannten Exzipiens, Bindemittel, wie Natriumcarboxymethylcellulose,
Alginsäure
und Gummi arabicum, und Wasser zum Herstellen eines Granulats, sofern
nötig,
und ferner Trenn- bzw. Gleitmittel, wie Talk, Magnesiumstearat, verknetet
und anschließend
mittels einer herkömmlichen
Tablettierungsmaschine verpresst wird.
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Für eine parenterale
Formulierung kann die injizierbare Formulierung, die das Peptid
der vorliegenden Erfindung enthält,
hergestellt werden, indem Peptid mit Solubilisierungsmittel bzw.
Lösungsvermittler
in sterilisiertem destilliertem Wasser oder in sterilisierter Salzlösung gelöst und in
Ampullen gefüllt
wird. Die Formulierung kann ferner einen Stabilisator oder Puffer
enthalten. Das Peptid der vorliegenden Erfindung kann, für eine nachfolgende
Zubreitung („in
suite preparation")
mit sterilisiertem destilliertem Wasser, in Pulverform in Fläschchen
gefüllt
werden. Diese parenteralen Zubereitungen können mittels intravenöser Injektion
oder Tropf bzw. Tropfinfusion verabreicht werden.
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Die
Verabreichungsdosis des Peptids der vorliegenden Erfindung kann
in Abhängigkeit
des Alters und Zustandes von Patienten, der Verabreichungswege oder
dergleichen in einem breiten Bereich variieren und eine übliche empfohlene
Tagesdosis für
erwachsene Patienten und für
orale Verabreichung liegt innerhalb des Bereichs von näherungsweise
0,1–1.000
mg/Tag/Person, vorzugsweise 1–500
mg/Tag/Person.
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Im
Falle einer parenteralen Verabreichung liegt eine übliche empfohlene
Tagesdosis innerhalb des Bereichs von etwa 1/100 bis 1/2 der Tagesdosis
der oralen Verabreichung.
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BEISPIEL
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Die
vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele
detailliert beschrieben werden; jedoch ist die vorliegende Erfindung
nicht auf die Beispiele beschränkt.
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Beispiel 1: Abtrennung von Peptiden aus
Octopus vulgaris mit kontraktionsverstärkenden Aktivitäten („contractile
potentiating activities")
auf das Rektum eines Karpfens
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(a): Herstellung von Rohextrakt
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Die
posterioren Speicheldrüsen
von 100 Stück
Tieren bzw. Stück
bzw. Köpfen
(„heads") von Octopus vulgaris
wurden exzidiert und unter flüssigem
Stickstoff gefroren. Die gefrorenen Gewebe (221 g) wurden in 3 Portionen
aufgeteilt und eine Portion davon wurde für 10 Minuten in 800 ml destilliertem
Wasser gekocht. Nach Abkühlung
wurde der Lösung
Essigsäure
bis zum Erreichen einer Konzentration von 3% zugesetzt und die Lösung wurde
homogenisiert und anschließend
wurde die überstehende
Flüssigkeit
mittels Zentrifugalabscheidung für
10 Minuten unter 10.000 × g
bei 4°C
gewonnen. Das Präzipität wurde
zu 200 ml 3% Essigsäure/Wasser-Lösung gegeben,
anschließend
homogenisiert und zentrifugiert. Diese Verfahrensweise wurde wiederholt. Die
verbleibenden zwei Portionen gefrorenen Gewebes wurden mit der gleichen
Verfahrensweise behandelt, um die überstehende Flüssigkeit
zu erhalten. Alle Extrakte, die aus der obigen Verfahrensweise resultierten, wurden
gesammelt und unter verringertem Druck bis zu einem Wert von etwa
200 ml konzentriert, um den Rohextrakt zu erhalten.
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(b): Adsorption an einer C18-Säule
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Zu
dem in (a) erhaltenen Rohextrakt wurden 20 ml 1,0 M HCl gegeben
und das resultierende Gemisch wurde für 30 Minuten bei 4°C unter 30.000 × g zentrifugiert,
um den Überstand
zu erhalten. Der so erhaltene Überstand
wurde durch eine Säule
bzw. Patrone mit der Bezeichnung Sep-Pak (Marke) Vac C18 (10 g,
35 cm3, Waters Co.) geführt. Nachdem die Säule mit
200 ml 0,1%-iger TFA gewaschen worden war, wurden die erhaltenen
Materialien mit 100 ml einer Lösung
von 60% Methanol/ 0,1% TFA eluiert und der Eluent wurde unter verringertem
Druck konzentriert und der resultierende Rückstand wurde lyophilisiert,
wobei 0,363 g getrocknete Materialien erhalten wurden.
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(c): Kationenaustauschsäulenchromatographie
(1)
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Die
in (b) erhaltenen getrockneten Materialien wurden in 150 ml 10 mM
Phosphorsäurepufferlösung (pH
7,0) gelöst
und einer Kationenaustauschsäulenchromatographie
unterworfen, wobei (eine Säule
vom Typ) TSK-Gel SP TOYOPERL PACK 6505 (20 μm bis 50 μm, 22Φ × 200 mm, Tosoh Co.) mit einem
linearen Gravienten von 0 bis 0,6 M NaCl-Konzentration (in 10 mM
Phosphorsäurepufferlösung; pH
7,0) bei einer Flussrate von 3,0 ml/min über 60 Minuten hinweg verwendet
wurde. Jeweils 6 ml Eluent wurden mittels Überwachung der UV-Absorption
bei 215 nm gesammelt. Die kontraktionsverstärkende Aktivität auf das
Rektum, die gemäß dem nachstehenden
Beispiel 6 untersucht wurde, wurde in der Fraktion gezeigt, die
mit dem 0 M NaCl-Konzentrationsanteil
eluierte.
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(d): Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
(HPLC) (1)
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Die
aktive(n) Fraktion(en), die in (c) erhalten wurden, wurden der Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
(Umkehrphasen-HPLC) unterworfen, wobei (eine Säule vom Typ) Capcell pak C18 UG80
(5 μm, 100 × 250 mm,
Shiseido Co.) mit einem linearen Gradienten von 0 bis 60% Acetonitril
(in 0,1% TFA/Wasser; pH 2,2) bei einer Flussrate von 1,5 ml/min über 60 Minuten
hinweg verwendet wurde. Die Fraktionen (jeweils 3 ml), eluiert mit
einer Acetonitrilkonzentration von 30 bis 36%, zeigten die kontrahierende
bzw. verengende Aktivität
und diese Fraktionen wurden gesammelt.
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(e): Kationenaustausch-HPLC (2)
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Die
in (d) erhaltene Fraktion wurde einer Kationenaustausch-HPLC unterworfen,
wobei (eine Säule vom
Typ) TSK-Gel SP-5PW
(10 μm,
7,5Φ × 75 mm,
Tosoh Co.) mit einem linearen Gradienten von 0 bis 0,6 NaCl-Konzentration
(in 10 mM Phosphorsäurepufferlösung; pH
4,7) bei einer Flussrate von 1,9 ml/min über 60 Minuten verwendet wurde.
Die Fraktionen (jeweils 2 ml), die mit einer Lösung mit 0,13 bis 0,15 M NaCl-Konzentration
eluierten, zeigten die kontrahierende Aktivität und diese Fraktionen wurden
gesammelt.
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(f): Umkehrphasen-HPLC (2)
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Die
in (e) erhaltene Fraktion wurde der Umkehrphasen-HPLC unterworfen,
wobei (eine Säule
vom Typ) Capcell pak C18 UG80 (5 μm,
4,6Φ × 150 mm,
Shiseido Co.) mit einem linearen Gradienten von 20 bis 40% Acetonitril
(in 0,1% TFA/Wasser; pH 2,2) bei einer Flussrate von 1,0 ml/min über 40 Minuten
hinweg verwendet wurde. Die Fraktion (jeweils 1 ml), eluiert mit
etwa 23% Acetonitrilkonzentration (hiernach bezeichnet als Fraktion
A), und die Fraktion, eluiert mit etwa 25% Acetonitrilkonzentration
(hiernach bezeichnet als Fraktion B), zeigten die Aktivität.
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Beispiel 2: Reinigung eines Peptids aus
einer aktiven Fraktion (Nr. 1: Reinigung aus der Fraktion A)
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Die
aktive Fraktion A, erhalten mittels des Trennvorgangs (f) von Beispiel
1, wurde der Umkehrphasen-HPLC unterworfen, wobei (eine Säule vom
Typ) Capcell pak C18 UG80 (5 μm,
4,6Φ × 150 mm,
Shiseido Co.) mit 22% Acetonitril (in 0,1% TFA/Wasser; pH 2,2) bei
einer Flussrate von 0,5 ml/min verwendet wurde. Die Verbindung,
die einen einzelnen Peak bei einer Retentionszeit von 14,5 min zeigte,
wurde erhalten und diese Verbindung wird als Verbindung (1) definiert.
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Die
Darstellung des Verlaufs dieser Umkehrphasen-HPLC ist als 1 gezeigt.
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Beispiel 3: Reinigung eines Peptids aus
einer aktiven Fraktion (Nr. 2: Reinigung aus der Fraktion B)
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Die
aktive Fraktion B, erhalten mittels des Trennvorgangs (f) von Beispiel
1, wurde der Umkehrphasen-HPLC unterworfen, wobei (eine Säule vom
Typ) Capcell pak C18 UG80 (5 μm,
4,6Φ × 150 mm,
Shiseido Co.) mit 24% Acetonitril (in 0,1% TFA/Wasser; pH 2,2) bei
einer Flussrate von 0,5 ml/min verwendet wurde. Die Verbindung,
die einen einzelnen Peak bei einer Retentionszeit von 13 min zeigte,
wurde erhalten und diese Verbindung wird als Verbindung (1) definiert.
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Die
Darstellung des Verlaufs dieser Umkehrphasen-HPLC ist als 2 gezeigt.
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Beispiel 4: Identifizierung der Peptide
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Die
Strukturen der gereinigten Verbindungen (1) und (2) aus den Beispielen
2 und 3 wurden einer Bestimmung der Aminosäuresequenz unterworfen, wobei
ein Gasphasen-Sequenziergerät
vom Typ Shimadzu PSQ-1 (Shimadzu Co.) verwendet wurde. Die erhaltenen
Aminosäuresequenzen
sind in der nachstehenden TABELLE 1 gezeigt. TABELLE 1: Aminosäuresequenz von Peptiden (Einheit:
pmol)
| Nr. | Verbindung | (1) | Verbindung | (2) |
| 1 | Lys | 103 | Lys | 114 |
| 2 | Pro | 121 | Pro | 137 |
| 3 | Pro | 104 | Pro | 124 |
| 4 | Ser | 22 | Ser | 30 |
| 5 | Ser | 18 | Ser | 26 |
| 6 | Ser | 14 | Ser | 14 |
| 7 | Glu | 64 | Glu | 48 |
| 8 | Phe | 27 | Phe | 22 |
| 9 | Val | 15 | Ile | 11 |
| 10 | Gly | 10 | Gly | 11 |
| 11 | Leu | 6 | Leu | 3 |
| 12 | Met | 2 | Met | 2 |
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Die
Molekulargewichte von Verbindung (1) und Verbindung (2) wurden mittels
MALDI TOF-MS (Voyager Elite, PE Bio Systems Japan Co.) bestimmt.
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Die
erhaltenen Molekulargewichte der Verbindungen (1) und (2) sind in
der nachstehenden TABELLE 2 gezeigt. TABELLE 2: Massedaten von Peptiden
| Verbindung | Molekülformel
berechnet (M+2H)2+ | gefunden |
| (1) | C57H92N14O17S 639,31 | 639,37 |
| (2) | C58H94N14O17S 646,32 | 646,40 |
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Diese
Ergebnisse zeigen deutlich, dass die Verbindung (1), Neuropeptid
von Octopus vulgaris, isoliert und gereinigt aus Fraktion A, durch
die nachstehende Aminosäuresequenz
(1) wiedergegeben wird:
H-Lys-Pro-Pro-Ser-Ser-Ser-Glu-Phe-Val-Gly-Leu-Met-NH2 (1)
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Darüberhinaus
wird die Verbindung (2), Neuropeptid von von Octopus vulgaris, isoliert
und gereinigt aus Fraktion B, durch die nachstehende Aminosäuresequenz
(2) wiedergegeben:
H-Lys-Pro-Pro-Ser-Ser-Ser-Glu-Phe-Ile-Gly-Leu-Met-NH2 (2)
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Beispiel 5: Synthese von Peptiden mittels
des Festphasenver fahrens
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Die
Synthese von Peptiden wurde mittels des FastMoc(Marke)-Festphasenverfahrens
auf einem automatischen Peptidsynthesegerät vom Typ 433A (PE Bio Systems
Japan Co.) durchgeführt.
Die Verbindung (1) wurde unter Verwendung eines Fmoc-NH-SAL-A-Harzes (Watanabe
Chemical Industries, Co.) als Träger und
von Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Pro, Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Val, Fmoc-Gly, Fmoc-Leu
und Fmoc-Met durchgeführt.
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Ferner
wurde die Verbindung (2) ebenso unter Verwendung von Fmoc-NH-SAL-A-Harz
(Watanabe Chemical Industries, Co.) als Träger und von Fmoc-Lys(Boc),
Fmoc-Pro, Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Ile, Fmoc-Gly,
Fmoc-Leu und Fmoc-Me synthetisiert.
(Worin Abkürzungen
wie folgt verwendet werden: Fmoc = 9-Fluorenylmethoxycarbonyl, Boc
= tert.-Butoxycarbonyl, tBu = tert.-Butyl).
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Verfahrensweisen
zur Abspaltung von jedem der synthetisierten Peptide aus dem Peptid-Harz-Konjugat
und zum Entschützen
der rohen Peptide wurden unter Verwendung einer Gemischlösung von
4,3% Phenol/2,1% 1,2-Ethandithiol/4,3% Thioanisol/4,3% Wasser/85%
TFA durchgeführt.
Die Reaktionsgemische wurden filtriert und das Filtrat wurde mit
Ether gewaschen (3 mal), um etwa 100 mg der rohen Peptide zu erhalten. Etwa
10 mg der so erhaltenen 100 mg an rohem Peptid wurden einer Umkehrphasen-HPLC
unterworfen, um etwa 6 mg des gereinigten Peptids zu erhalten. Jedes
der so erhaltenen resultierenden gereinigten Peptide wurde mit Verbindung
(1) oder Verbindung (2) von Octopus vulgaris jeweils durch Vergleich
mit der gleichen Retentionszeit in der Umkehrphasen-HPLC identifiziert,
wobei jeweils Capcell pak C18 verwendet wurde. Darüberhinaus
besitzen die synthetisierten Verbindungen und die natürlichen
Verbindungen die gleichen Rektum-kontrahierenden Aktivitäten beim
Karpfen.
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Beispiel 6: Messung der Rektum-kontrahierenden
Aktivität
beim Karpfen
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Die
Rektum-kontrahierende Aktivität
beim Karpfen wurde wie folgt bestimmt. Das heißt, das Intestinum des Karpfens
wurde exzidiert und beide Enden davon wurden mit einem Baumwollfaden
befestigt bzw. verschlossen. Anschließend wurde ein Ende davon an
einer Probenkammer (2 ml Kapazität)
fixiert und ein weiteres Ende wurde an einer Übertragungsvorrichtung fi xiert,
um einen Prüfling
für die
Untersuchung zu erhalten. Die zu messenden Proben wurden in der
physiologischen Salzlösung
gelöst
und zu der Probenkammer gegeben. Die Änderungen der Spannung bzw.
Anspannung des Intestinums durch Verengung wurden aufgezeichnet.
Die Ergebnisse wurden in den 3 und 4 dargestellt.
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Wie
aus den in den Figuren gezeigten Ergebnissen ersichtlich ist, wurde
das Intestinum des Karpfens durch Zugeben der Verbindung (1) [3]
und der Verbindung (2) [4] stark kontrahiert.
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Beispiel 7: Messung der Ileum-kontrahierenden
Aktivität
beim Meerschweinchen
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Die
Ileum-kontrahierende Aktivität
beim Meerschweinchen wurde gemäß einem
Verfahren von Champagne et al. (Champagne D. E. et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA., 91, 138–142,
1994) durchgeführt.
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Das
Ileum des Meerschweinchens wurde exzidiert und die beiden Enden
wurden mit einem Baumwollfaden befestigt bzw. verschlossen. Anschließend wurde
ein Ende davon an einer Probenkammer (5 ml Kapazität) befestigt
und ein weiteres Ende wurde an einer Übertragungsvorrichtung befestigt,
um einen Prüfling
für die
Untersuchung zu erhalten. Das Innere der Probenkammer wurde mit
37°C (warmer)
physiologischer Salzlösung
konstant gehalten. Die zu messenden Proben wurden in der physiologischen
Salzlösung
gelöst
und zu der Probenkammer gegeben. Die Änderungen der Spannung des
Ileums durch Kontraktion wurden aufgezeichnet. Die Ergebnisse wurden
in den 5 und 6 dargestellt.
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Wie
aus den in den Figuren gezeigten Ergebnissen ersichtlich ist, wurde
das Ileum des Meerschweinchens durch Zugeben der Verbindung (1)
[5] und der Verbindung (2) [6] stark
kontrahiert, und zwar bei einer Konzentration der Verbindung von
1 × 10–8 M.
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Beispiel 8: Bestimmung der vollständigen Aminosäuresequenz
der Vorläufer-Polypeptide
und der Rasensequenz eines Gens, das dafür codiert
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(1) Präparation
von Gesamt-RNA aus der posterioren Speicheldrüse von Octopus vulgaris
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Etwa
1 g der posterioren Speicheldrüse
von Octopus vulgaris wurde in flüssigem
Stickstoff zerstoßen und
in 10 ml TRI-zol (Marke)-Reagenz (GIBCO BRL Co.) homogenisiert.
Nach ruhigem bzw. stabilem Stehen für 5 Minuten bei Raumtemperatur
erfolgte eine Aufteilung des Gemischs auf je 1 ml. Zu diesem Gemisch
wurden 200 μl
Chloroform gegeben und das Gemisch wurde geschüttelt („agitated") und anschließend mit der Kühlzentrifuge
(Sakuma Co.) zentrifugiert [15.000 UpM für 15 Minuten bei 4°C]. Danach
wurde eine obere wässrige
Schicht fraktioniert bzw. abgenommen und zu dieser Lösung wurden
0,5 ml Isopropanol gegeben und das Gemisch wurde für 10 Minuten
bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die überstehende Flüssigkeit
wurde nach der Zentrifugalabscheidung (15.000 UpM für 10 Minuten
bei 4°C)
unter Verwendung der Kühlzentrifuge entfernt
und anschließend
wurde 1 ml 75%iges Ethanol zu dem Rückstand gegeben. Die überstehende
Flüssigkeit
wurde nach der Zentrifugation (10.00 UpM („10,00 rpm") für
5 Minuten bei 4°C)
entfernt, um den Rückstand
zu erhalten. Anschließend
wurde die Lufttrocknung des Rückstandes
für etwa
10 Minuten durchgeführt. 10 μl DEPC-behandeltes
Wasser wurden zu dem resultierenden Rückstand gegeben und das Gemisch
wurde für
10 Minuten bei 60°C
inkubiert um RNA zu lösen
(„to
lyse RNA"). Gemäß den obenstehend
genannten Verfahren wurden etwa 3 mg Gesamt-RNA erhalten.
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(2) Degenerierte 3'-RACE
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Auf
der Basis der Aminosäuresequenz
des Peptids, das aus der posterioren Speicheldrüse von Octopus vulgaris isoliert
wurde, wurden die nachstehenden degenerierten Primer entworfen und
mittels des herkömmlichen
Verfahrens synthetisiert:
Oct-TK-M-1: (SEQ ID NO: 6)
5'-AA(A/G)CCICCII(C/G)II(C/G)II(C/G)IGA(A/G)TT(C/T)AT-3'
Oct-TK-M: (SEQ
ID NO: 7)
5'-GA(A/G)TT(C/T)AT(A/T/C)GGI(C/T)TIATGGG-3'
(worin die
Schreibung der oben angeführten
Buchstaben basierend auf der „Nucleotide
Abbreviation List" (Cell Technology,
Einzelband, „Biotechnology
Experiment Illustrated":
Shunjunsha Co.) erfolgte; die gleiche wie bei jeder der folgenden
Formeln).
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Als
nächstes
wurde eine degenerierte 3'-RACE
gemäß den nachstehenden
Stufen unter Verwendung des 5'/3'-RACE-Kits (Boehringer
Mannheim Co.) durchgeführt.
Das heißt,
2 μg Gesamt-RNA,
4 μl cDNA-Synthesepuffer,
2 μl dNTP-Mix,
1 μl Oligo-dT-Ankerprimer
(12,5 pmol/μl)
und 1 μl
AMV-Reverse-Transkriptase
(20 Einheiten/μl)
wurden zu dem DEPC-behandelten
Wasser gegeben, um ein Gesamtvolumen von 20 μl zu erhalten und das Gemisch
wurde für
60 Minuten bei 55°C
inkubiert und anschließend
wurde die Erststrang-cDNA synthetisiert, indem für 10 Minuten auf 65°C erhitzt
wurde.
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Anschließend wurde
eine erste 3'-RACE
(„1st-3'-RACE") unter den nachstehenden
Bedingungen durchgeführt.
Das heißt,
ein Gesamtvolumen von 50 μl
der Gemischlösung
von 5 μl
Erststrang-cDNA, 5 μl
10 × PCR-Puffer,
8 μl dNTP-Mix,
3 μl Oct-TK-M-1 (100 pmol/μl), 1 μl PCR-Ankerprimer
(12,5 pmol/μl),
0,5 μl TaKaRa
Ex Taq (Marke; Takara Shuzo Co.) und Wasser wurde für 5 Minuten
auf 94°C
erhitzt und es wurde weiterhin für
30 Zyklen von 30 Sekunden bei 94°C,
30 Sekunden bei 45°C
und 2 Minuten bei 72°C
erhitzt. Der Recktand wurde dann für 7 Minuten bei 72°C behandelt.
Für die
Polymerasekettenreaktion (PCR) wurde ein Thermocycler mit der Bezeichnung
GeneAmp PCR System 2400 (Perkin Elmer Co.) verwendet.
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Nachfolgend
wurde das Erst-PCR-Produkt mittels einer Zentrifugensäule [MicroSpin
(Marke) S-400, Amersham Pharmacia Co.] gereinigt und anschließend wurde
eine zweite 3'-RACE
(„2nd-3'-RACE") unter den nachstehenden
Bedingungen durchge führt.
Das heißt,
ein Gesamtvolumen von 50 μl
der Gemischlösung
von 3 μl
Erst-PCR-Produkt, 5 μl
10 × PCR-Puffer,
8 μl dNTP-Mix,
3 μl Oct-TK-M
(100 pmol/μl),
1 μl PCR-Ankerprimer
(12,5 pmol/μl),
0,5 μl TaKaRa
Ex Taq [Marke; Takara Shuzo Co.] und Wasser wurde für 5 Minuten
auf 94°C erhitzt
und es wurde ferner für
30 Zyklen von 30 Sekunden bei 94°C,
30 Sekunden bei 45°C
und 2 Minuten bei 72°C
erhitzt. Der Recktand wurde anschließend für 7 Minuten auf 72°C erhitzt.
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5 μl der erhaltenen
Reaktionslösung
wurden einer Elektrophorese an einem 1,5%igen Agarosegel unterworfen,
um die amplifizierten PCR-Produkte bei der Größe von etwa 300 bp zu bestätigen.
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(3) Ligation des PCR-Produkts
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Das
PCR-Produkt wurde an der Zentrifugensäule gereinigt und 3 μl des PCR-Produkts
wurden mit 2 μl
TA-Klonierungsvektor
pCR 2.1 (Invitrogene Co.) und 5 μl „Ligation
high" (Toyobo Co.)
gemischt und anschließend
wurde dieses Gemisch einer Ligation für eine Stunde bei 16°C unterworfen.
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(4) Transformation von Escherichia coli
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Zu
10 μl der
Ligationsreaktionslösung,
erhalten in der vorstehend angeführten
Stufe (3), wurden kompetente Zellen vom Typ Competent high E. coli
DH5α (Toyobo
Co.) gegeben und das Gemisch wurde für 50 Minuten im Eisbad stehen
gelassen. Anschließend
wurde das Gemisch einer Hitzeschockbehandlung für 50 Sekunden bei 42°C unterworfen.
Nach Abkühlung
für 2 Minuten
im Eisbad wurde 1 ml SOC-Medium zu dem Gemisch gegeben und das Gemisch
wurde für
30 Minuten bei 37°C
inkubiert. Nachfolgend wurden 10 μl
der transformierten bzw. transformierenden Lösung auf einer LB/Amp.-Agarkultur
(LB-Agarkultur, enthaltend 50 μg/ml
Ampicillin) ausgebreitet bzw. ausgestrichen, die mit 35 μl X-gal beschichtet
wird. Die verbleibende transformierte Lösung wurde bei 10.000 UpM für eine Minute zentrifugiert
um das Volumen auf etwa 100 μl
zu senken und das Gesamtvolumen davon wurde auf einer LB/Amp.-Agarkultur
ausgebreitet. Die LB/Amp.-Agarkultur wurde über Nacht bei 37°C inkubiert.
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(5) Kolonie-PCR
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Die
Kolonie-PCR wurde unter den nachstehenden Bedingungen durchgeführt, wobei
die oben erhaltene Kolonie als Matrize verwendet wurde. Es wurde
nämlich
ein Gesamtvolumen von 50 μl
der Gemischlösung
aus dem Stamm von Escherichia coli, 5 μl 10 × Reaktionspuffer, 5 μl 2 mM dNTPs,
3 μl 25
mM MgCl2, 0,5 μl M13FW-Primer (100 pmol/pl),
0,5 μl M13RV-Primer
(100 pmol/μl),
0,5 μl rTaq-DNA-Polymerase
(Toyobo Co.) und Wasser für
10 Minuten auf 94°C
erhitzt und es wurde ferner für
30 Zyklen von 30 Sekunden bei 94°C, 30
Sekunden bei 55°C
und 1 Minute bei 72°C
erhitzt. Der Recktand wurde anschließend für 5 Minuten auf 72°C erhitzt.
Anschließend
wurden 5 μl
der erhaltenen Reaktionslösung
einer Elektrophorese an einem 1,5%igen Agarosegel unterworfen.
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Der
M13FW-Primer und der M13RV-Primer, verwendet in dieser Reaktion,
wurden unter Verwendung des herkömmlichen
Verfahrens synthetisiert und ihre Sequenzen sind nachstehend angegeben:
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(6) DNA-Sequenz
-
Das
Kolonie-PCR-Produkt mit der beabsichtigten Größe (etwa 500 bp) wurde an der
Zentrifugensäule gereinigt
und die Sequenzierung des erhaltenen Produkts wurde unter Verwendung
eines DNA-Sequenzierungskits (PE Biosystems Co.) durchgeführt. Für die Sequenzierung
wurde ein Gerät
mit der Bezeichnung ABIPRISM 310 Genetic Analyzer (PE Biosystems
Co.) verwendet.
-
Die
erhaltene Sequenz wurde unter Verwendung der Genanalysesoftware
GENETYX-MAC (Software Development Co.) analysiert. Als Ergebnis
war die partielle cDNA von etwa 500 bp analysiert.
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(7) 5'-RACE
-
Die
nachstehenden Primer wurden basierend auf den Basensequenzen der
partiellen cDNA synthetisiert.
-
-
Anschließend wurde
eine 5'-RACE gemäß der nachstehenden
Verfahrensweise durchgeführt,
wobei das 5'/3'-RACE-Kit (Boehringer
Mannheim Co.) verwendet wurde. Zuerst wurden 2 μg Gesamt-RNA und 1 μl TK-M-5'-1R (12,5 pmol/μl) gemischt
und das Gemisch wurde für
10 Minuten bei 70°C
inkubiert und anschließend
im Eisbad abgekühlt.
Zu diesem Gemisch wurden 4 μl
cDNA-Synthesepuffer,
2 μl dNTP-Mix,
1 μl AMV-Reverse-Transkriptase
(20 Einheiten/μl),
DEPC-behandeltes Wasser zum Erreichen des Gesamtvolumens von 20 μl, gegeben
und das Gemisch wurde für
60 Minuten bei 55°C
und für
10 Minuten bei 65°C
inkubiert, um Erststrang-cDNA zu erhalten. Anschließend wurde
die so erhaltene Erststrang-cDNA an der Zentrifugensäule gereinigt,
anschließend
wurden 2,5 μl
Reaktionspuffer und 2,5 μl
2 mM dATP zu der Erststrang-cDNA gegeben und das Gemisch wurde für 3 Minuten
bei 94°C
stehen gelassen. Terminale Transferase (10 Einheiten/μl) wurde
zu dem Gemisch gegeben und das resultierende Gemisch wurde für 20 Minuten
bei 37°C
und für
10 Minuten bei 70°C
inkubiert, um cDNA mit dA-Ende zu erhalten.
-
Anschließend wurden
Erst-PCR und Zweit-PCR unter den nachstehenden Bedingungen durchgeführt:
-
➀ Erst-PCR:
-
Ein
Gesamtvolumen von 50 μl
der Gemischlösung
von 5 μl
cDNA mit dA-Ende, 5 μl
10 × PCR-Puffer, 8 μl dNTP-Mix,
1 μl TK-M-5'-2R (12,5 pmol/μl), 1 μl Oligo-dT-Ankerprimer
(12,5 pmol/μl),
0,5 μl TaKaRa
Ex Taq [Marke: Takara Shuzo Co.] und Wasser wurde für 5 Minuten
auf 94°C
erhitzt und es wurde ferner für
30 Zyklen von 30 Sekunden bei 94°C,
30 Sekunden bei 55°C
und 2 Minuten bei 72°C
erhitzt. Der Recktand wurde anschließend für 7 Minuten auf 72°C erhitzt.
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➁ Zweit-PCR:
-
Ein
Gesamtvolumen von 50 μl
der Gemischlösung
von 3 μl
Erst-PCR-Produkt, gereinigt an der Zentrifugensäule, 5 μl 10 × PCR-Puffer, 8 μl dNTP-Mix,
1 μl TK-M-5'-3R (12,5 pmol/μl), 1 μl PCR-Ankerprimer
(12,5 pmol/μl),
0,5 μl TakaRa
Ex Taq [Marke: Takara Shuzo Co.] und Wasser wurde mittels der gleichen
Verfahrensweise erhitzt, wie in der Erst-PCR oben beschrieben.
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Das
erhaltene Zweit-PCR-Produkt wurde einer Elektrophorese an einem
1,5%igen Agarosegel unterworfen, um die Bande mit etwa 300 bp zu
bestätigen.
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Dieses
Zweit-PCR-Produkt wurde gemäß den Verfahren
sequenziert, die vorstehend in (3), (4), (5) bzw. (6) beschrieben
wurden.
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Als
Ergebnis wurden die Größe (etwa
460 bp), die Sequenz und die Zahl (etwa 87 Aminosäurereste) von
cDNA, die für
die Vorläufer-Polypeptide
von Tachykinin-Peptiden der vorliegenden Erfindung codiert, klar. Die
Aminosäuresequenz
wird durch SEQ ID NO 3 wiedergegeben und die Sequenz der cDNA wird
durch SEQ ID NO 4 wiedergegeben.
-
Darüberhinaus
sind, innerhalb der Vorläufer-Polypeptide,
die Teile, in denen die Aminosäuresequenz den
Tachykinin-Peptiden
der vorliegenden Erfindung entspricht, in
7 gezeigt.
In der Figur ist der unterstrichene Teil die Sequenz der Aminosäuren eines
Peptids gemäß der vorliegenden
Erfindung. Beispiel
9: Formulierungsbeispiele
| Tabletten: | |
| Komponenten: | Verbindung
(1) oder (2) | 10
g |
| | Lactose | 125
g |
| | Feine
kristalline Cellulose | 25
g |
| | Mais-
bzw. Getreidestärke | 25
g |
| | 5%
Hydroxypropylmethylcellulose | 100
ml |
| | Magnesiumstearat | 5
g |
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Die
obigen Komponenten wurden gemischt und verknetet. Das resultierende
Gemisch wurde granuliert, getrocknet und anschließend tablettiert,
um Tabletten herzustellen, die 190 mg wiegen, wobei sie jeweils 10
mg Verbindung (1) oder (2) enthalten.
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Gewerbliche Anwendbarkeit
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Das
durch die vorliegende Erfindung bereitgestellte Neuropeptid, stammend
von Octopus vulgaris, ist ein Neuropeptid, das das Rektum von Karpfen
bei geringer Konzentration kontrahiert und fortgesetzt kontrahierende
Aktivität
auf das Rektum von Karpfen zeigt. Diese Ergebnisse sind ähnlich zu
den zwei Phasen der kontrahierenden Aktivität auf glatten Muskel, die für Substanz
P kennzeichnend sind.
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Weiterhin
besitzt das von Octopus vulgaris stammende Neuropeptid, das durch
die vorliegende Erfindung bereitgestellt wird, eine Aminosäuresequenz
im C-Terminus des Peptids, die durch die nachstehende Formel wiedergegeben
wird:
-Phe-Yaa-Gly-Leu-Met-NH2
(worin
Yaa die gleiche Bedeutung hat, wie oben angegeben) die charakteristisch
ist für
die Aminosäuresequenz
von Tachykinin-Peptid mit kontrahierender Aktivität auf glatten
Muskel, vasodilatative Aktivität
und antihypertensive Aktivität
bei Säugern.
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Daher
sind die Neuropeptide von Octopus vulgaris gemäß der vorliegenden Erfindung
verwendbar als biochemisches Rea genz zum Analysieren eines Neurotransmissionssystems
und sie stellen eine neue Herangehensweise, die auf die Entwicklung
von Wirkstoffen gerichtet ist, wie Medizin oder Pestizide, auf der
Grundlage der Untersuchung der Korrelation der strukturellen Aktivität auf einem
molekularen Level bereit.
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Weiterhin
sind die Vorläufer-Polypeptide
der Tachykinin-Peptide
und das Gen, das dafür
codiert, bereitgestellt durch die vorliegende Erfindung, ein wichtiges
Werkzeug zur Herstellung der Tachykinin-Peptide der vorliegenden
Erfindung.
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