KR20020016929A

KR20020016929A - 신규한 타키키닌 펩티드, 이의 전구체 펩티드 및 이를코딩하는 유전자

Info

Publication number: KR20020016929A
Application number: KR1020027001307A
Authority: KR
Inventors: 미나까따히로유끼; 이와꼬시에이꼬; 구로다교꼬
Original assignee: 도리이 신이찌로; 산또리 가부시키가이샤
Priority date: 1999-07-30
Filing date: 2000-07-25
Publication date: 2002-03-06
Also published as: JP2001103979A; US7371810B1; AU773969C; EP1213297B1; CN1376162A; EP1213297A4; US20090023184A1; KR100724331B1; WO2001009171A1; ATE393777T1; AU773969B2; DE60038741T2; AU6023900A; CA2380354A1; JP4166408B2; EP1213297A1; DE60038741D1; CN1332977C

Abstract

연체동물인 차문어의 후부 타액선으로부터 단리 및 정제된 타키키닌 펩티드. 분자수준에서 구조 활성의 상관관계에 대한 연구를 통해 약물 및 살충제를 개발하기 위한 새로운 접근법을 제공하고, (1) 아미노산 잔기의 수는 12 이고; (2) 펩티드의 N 말단은 Lys 이며; (3) C-말단으로부터 5 개의 아미노산의 아미노산 서열로 구성된 아미노산 서열 (I) : -Phe-Xaa-Gly-Leu-Met-NH₂(서열중, Xaa 는 Val, Ile, Phe 또는 Tyr 이다) 을 갖는 것을 특징으로 하는 타키키닌 펩티드. 모든 것들 중, 하기의 아미노산 서열을 갖는 신규의 펩티드:

H-Lys-Pro-Pro-Ser-Ser-Ser-Glu-Phe-Val-Gly-Leu-Met-NH₂(1)

H-Lys-Pro-Pro-Ser-Ser-Ser-Glu-Phe-Ile-Gly-Leu-Met-NH₂(2)

Description

신규한 타키키닌 펩티드, 이의 전구체 펩티드 및 이를 코딩하는 유전자 {NOVEL TACHYKININ PEPTIDES, PRECURSOR PEPTIDES THEREOF AND GENES ENCODING THE SAME}

외양성(外洋性) 엘레돈 모스카타 (Eledone moschata) 및 E.알드로반디 (E. aldrovandi)의 후부타액선의 아세톤 추출물로부터 단리되고, 개에 대해서 강력한 혈압강하 활성을 갖는, 엘레도이신은 11 개의 아미노산 잔기로 구성된 생리 활성 신경펩티드이다 (Erspamer, V., et al., Experientia, 18, 58, 1962). 엘레도이신은 혈압강하 활성외에 기니아 피그의 회장의 수축 활성을 보이고, 또한 정맥내 주사하는 경우, 개의 타액 분비의 촉진과 같은 특이적 작용을 보이는 것이 명백해졌다.

이후, 동일한 활성을 갖는 펩티드를 개구리의 피부로부터 단리하여 피살래민(physalaemin)으로 명명하였다 (Erspamer, V., et al. Experientia, 20, 489, 1964).

이러한 펩티드는 기니아 피그의 회장에 대해 신속한 수축 활성을 갖기 때문에 브래디키닌 (브래디(=서서히)키닌, 서서히 이동시키는 물질)에 대한 반대로 타키키닌 (타키(=신속한)키닌, 신속하게 수축시키는 물질)으로 명명하였다. 또한, 물질 P 의 화학적 구조가 이러한 펩티드의 화학적 구조에 기초하여 명확해졌다.

타키키닌으로 분류된 펩티드는 이후 양생류 (Yasuhara, T., et al., Biomed. Res., 2, 613, 1981) 및 조류 (Conlon, J. M., et al., Regulatory Peptides, 20, 171, 1988)로 부터 잇따라 단리되었지만, 시알로키닌만이 척추동물 유래의 엘레도이신이외에 황열병을 매개하는 모기로부터 발견되었다 (Champagne, D. E. & Ribeiro. J. M.: Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91, 138, 1994).

현재, 타키키닌은 펩티드의 C-말단내 하기식으로 나타낸 공통의 아미노산 서열을 가지며:

-Phe-Yaa-Gly-Leu-Met-NH₂

[서열중, Yaa 는 방향족 아미노산 (예, Phe, Tyr)이고, 분지된 아미노산 (예, Val, Ile)이다], 장 수축 활성, 혈압강하 활성, 타액 분비 촉진 활성 등을 나타내는 생리활성 펩티드의 총칭이다. 이러한 종류의 타키키닌에는, 전술한 물질 P, 엘레도이신, 피살라민, 뉴로키닌 A, 뉴로키닌 B, 카시닌 등이 포함된다(SEIBUTUGAKU-JITEN (Ver. 4). Iwanami Shoten, 1997).

따라서, 신약 개발용 기초 화학 화합물로서 타키키닌 펩티드의 사용이 기대된다. 특히, 물질 P 가 일차 지각 신경의 전달물질로서 통증의 전달에 참여하는 것으로 여겨지기 때문에, 진통제로서 기대 및 연구되고 있다. 또한, 고등동물의 신경계에서 정보처리 메카니즘 해명용 시약으로서의 활용이 기대된다.

한편, 팔완류의 후부타액선은 타액선의 일부가 후구(fugu)독으로 알려진 테트로도톡신 및 전술한 엘레도이신외의 갑각류를 마비시키는 효과를 갖는 당단백질인 세팔로톡신과 같은 독성 물질을 포함할 수 있기 때문에 독선이라 알려져 있다. 또한, 이것들은 옥토파민, 세로토닌, 티라민, 노라드레날린, 히스타민 및 아세틸콜린과 같은 생체 아민기를 포함할 수 있고, 단백질분해 효소 및 히알루로니다아제와 같은 효소기를 포함할 수 있는 것으로 알려져 있다 (Boucaud-Camou, E. & Boucher-Rodoni, R. 1983. Feeding and digestion in Cephalopods. In "The mollusca", (Saleuddin, A. S. M. & Wilbur, K. M.), Academic press and New York). 그러나, 엘레도이신외의 타키키닌 펩티드가 발견되었다는 보고는 없다. 또한, 엘레도이신은 포유류에 대해 평활근 수축 활성, 혈관 확장 활성 및 혈압 강하 활성을 보임이 비록 발견되었지만, 엘라도이신이 팔완류에 대하여 역할을 갖는다는 것은 발견되지 않았다.

따라서, 타키키닌 펩티드와 관련된 각 동물 종의 역할 및 펩티드의 종 특이성을 해명함으로써 구조-활성 상관관계의 연구 등을 기초하여 고등 동물의 신경계에서 정보처리메카니즘의 해명 및 의약의 개발에 유용한 정보를 얻기 위하여, 많은 수의 동물종으로부터 타키키닌 펩티드를 발견하는 것이 요망된다.

따라서, 본 발명의 목적은 신규한 타키키닌 펩티드를 발견하여, 이의 구조를명확히하고, 추가로 이의 생리활성을 해명하여, 고등 동물의 신경계에서 정보처리 메카니즘 해명용 시약 및 의약 및 살충제 개발의 기초 화합물로서 사용할 수 있는 신규의 타키키닌 펩티드를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 이러한 타키키닌 펩티드의 전구체 폴리펩티드 및 이를 코딩하는 유전자를 동정하여 타키키닌 펩티드를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 척추동물의 장에 대해 수축 활성을 갖는 신규한 타키키닌 펩티드 및 이의 전구체 폴리펩티드에 관한 것이다. 좀더 구체적으로는, 본 발명은 차문어 (Octopus vulgaris) 의 후부타액선(posterior salivary gland)에서 수득된, 척추동물의 장에 대해 수축 활성을 갖는 신규의 타키키닌 펩티드, 이의 전구체 폴리펩티드 및 이 폴리펩티드를 코딩하는 유전자에 관한 것이다.

도 1 은 실시예 2 에서 본 발명의 펩티드인 화합물 (1) 의 역상 HPLC 의 최종 용출 패턴을 나타낸다.

도 2 는 실시예 3 에서 본 발명의 펩티드인 화합물 (2) 의 역상 HPLC 의 최종 용출 패턴을 나타낸다.

도 3 은 실시예 6 에서 차문어 머리 하나의 양의 본 발명의 화합물 (1) 의 쳄버 첨가후 잉어의 직장에 대한 수축 활성의 결과를 나타낸다.

도 4 는 실시예 6 에서 차문어 머리 하나의 양의 본 발명의 화합물 (2) 의 쳄버 첨가후 잉어의 직장에 대한 수축 활성의 결과를 나타낸다.

도 5 는 실시예 7 에서 1 x 10^-8M 농도의 본 발명의 화합물 (1) 의 쳄버 첨가후 기니아 피그의 회장에 대한 수축 활성의 결과를 나타낸다.

도 6 은 실시예 7 에서 1 x 10^-8M 농도의 본 발명의 화합물 (2) 의 쳄버 첨가후 기니아 피그의 회장에 대한 수축 활성의 결과를 나타낸다.

도 7 은 밑줄친 부분이 본 발명에 따른 타키키닌 펩티드의 아미노산 서열인 전구체 폴리펩티드의 아미노산 서열을 나타낸다.

본 발명에 의해 제공되는 신규한 펩티드는 척추동물의 장에 대해 수축 활성을 갖는 타키키닌 펩티드이고, 하기와 같이 차문어로부터 단리 및 정제될 수 있다.

예컨대, 차문어의 후부 타액선을 열수로 추출한 후, 추출물에 아세트산을 3% 의 농도가 될 때까지 첨가하고, 이어서 냉각후, 조 추출물을 원심분리법으로 수득한다. 이 조 추출물을 C18 카트릿지 (예, Sep-Pak (상표명) Cartridges: Waters Co.)에 흡수시키고, 펩티드 함유 분획을 0.1% 트리플루오로 아세트산(이후 TFA 로 칭함)을 함유하는 60% 메탄올 용액을 이용하여 용출시키고, 이어서, 목적 펩티드 를 이온 교환 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피 등을 이용하여 분획으로부터 분리 및 정제시킬 수 있다.

또한, 본 발명의 펩티드는 12 개의 아미노산 잔기로 구성되기 때문에, 이것은 통상의 펩티드 합성기(예, 433A 펩티드 합성기, PE Bio Systems Japan)를 이용하여 통상의 고형상 방법 또는 통상의 유기 합성법으로 용이하게 합성시킬 수 있다. 이와 같은 방법들을 이용하여 수득된 조 펩티드는 필요하면 역상 크로마토그래피 또는 결정화 방법과 같은 통상의 정제 방법을 이용하여 정제시킬 수 있다.

한편, 차문어로부터 단리된 전구체 폴리펩티드의 아미노산 서열 및 이 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 염기서열은 하기와 같이 결정할 수 있다 :

예컨대, 차문어의 후부 타액선으로부터 제조된 총 RNA 에 대한 RT-PCR 를 타키키닌 펩티드의 아미노산 서열을 기초로 하여 제조된 프라이머를 이용하여 수행하여, 약 500 개 염기쌍의 유전자 서열을 결정한 후, 5' RACE 법 및 3' RACE 법을 이용하여 5'-말단 및 3'-말단의 유전자 서열을 결정하였다. 따라서, 타키키닌 펩티드의 전구체 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열 번호 3 으로 나타낸 아미노산 서열을 가지며, 이를 코딩하는 유전자는 서열번호 4 로 나타낸 염기 서열을 갖는 것으로 결정되었다.

따라서, 본 발명의 타키키닌 펩티드 및 이의 전구체 폴리펩티드는 유전자 재조합법으로 제조할 수 있다. 즉, 유전자 재조합법을 이용하여 폴리펩티드를 제조하는 경우, 우선 서열번호 4 로 나타낸 유전자가 통합된 벡터를 제조하고, 이 벡터로 숙주세포를 형질전환시키고, 이 숙주를 인큐베이션 또는 생육하고, 숙주세포 또는 배양액으로부터 목적하는 전구체 폴리펩티드를 단리 및 정제하여 수득할 수 있다. 이어서, 목적하는 타키키닌 펩티드를 절단 (프로세싱) 및 효소 등을 이용하여 전구체 폴리펩티드를 변형시키고, 필요에 따라 추가로 정제하여 수득할 수 있다.

본 발명의 펩티드는 평활근 수축 활성, 혈관 확장 작용 및 혈압 강하 활성을 유발하는 타키키닌 펩티드이기 때문에, 이는 신경전달계에 대한 연구용 시약으로 사용될 수 있고, 추가로 약물 개발을 위한 새로운 접근법을 제공한다.

예컨대, 본 발명의 펩티드를 활성성분으로 함유하는 의약은 경구 또는 비경구 제형, 예컨대 캡슐, 정제 또는 주사용 용액의 형태로 약학분야에서 통상적으로사용되는 부형제와 함께 투여될 수 있다. 좀더 구체적으로는, 본 발명의 펩티드는 부형제, 예컨대, 락토오스, 전분 또는 이의 유도체 및 셀룰로오스 유도체와 혼합할 수 있으며, 생성된 혼합물은 젤라틴 캡슐에 충진시켜 캡슐 제제를 수득한다.

정제 제제는 펩티드와 전술한 부형제, 결합제, 예컨대, 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스, 알긴산 및 아라비아 고무 및 물을 함께 반죽하여 필요에 따라 과립을 제조하고, 추가로 윤활제, 예컨대, 탈크, 마그네슘 스테아레이트를 첨가한후, 통상의 타정기로 압축시켜 제조할 수 있다.

비경구 제제의 경우, 본 발명의 펩티드를 함유하는 주사제는 살균증류수 또는 살균식염수에 가용화제로 펩티드를 용해시킨후, 앰플에 충진하여 제조할 수 있다. 이 제제는 추가로 안정화제 또는 버퍼를 포함할 수 있다. 본 발명의 펩티드는 살균증류수에 사용시에 용해되는 제제를 위한 분말형으로 비알에 충진시킬 수 있다. 이러한 비경구 제제는 정맥내 주사 또는 점적정주로 투여될 수 있다.

본 발명의 펩티드의 투여량은 연령, 환자의 상태, 투여경로 등의 다양한 요인에 따라 변할 수 있으며, 경구투여의 경우 성인 환자에게 권장되는 통상의 1 일 투여량은 약 0.1 - 1,000 mg/일/사람, 바람직하게는 1 - 500 mg/일/사람이다.

비경구 투여의 경우, 통상의 1 일 권장 투여량은 경구 투여의 1 투여량의 약 1/100 내지 1/2 이다

실시예

본 발명은 하기의 실시예에 관하여 상술될 것이나, 본 발명은 이에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 차문어 유래의 잉어 직장에 대한 수축증강작용을 갖는 펩티드의 분리

(a): 조 추출

차문어의 100 개의 머리의 후부타액선을 절단하여 액체질소하 냉동시켰다. 냉동된 조직 (221 g)을 3 부분으로 나누고, 이의 1 부분을 800 ml 의 증류수에서 10 분간 끓였다. 냉각후, 아세트산을 3% 농도에 도달할 때까지 상기 용액에 첨하고, 이 용액을 균질화시킨후, 상층액을 10,000 x g (4℃) 로 30 분간 원심분리시켜 수거하였다. 침전물을 200 ml 의 3% 아세트산/수용액에 첨가한후, 다시 균질화 및 원심분리시켰다. 이 절차를 반복하였다. 나머지 두 부분의 냉동 조직도 동일한 절차로 처리하여 상층액을 수득하였다. 상기 절차로부터 생성된 추출물 모두를 수거하여 감압하 약 200 ml 로 농축시켜 조 추출물을 수득하였다.

(b): C18 카트릿지에의 흡착

(a)에서 수득한 조 추출물에, 20 ml 의 1.0 M HCl 을 첨가하고, 생성된 혼합물을 30,000 x g 로 4℃ 에서 30 분간 원심분리시켜 상층액을 수득하였다. 이렇게 수득한 상층액을 Sep-Pak (상표명) Vac C18 카트릿지 (10 g, 35 cc, Waters Co.)를 통해 통과시켰다. 카트릿지를 200 ml 의 0.1% TFA 로 세정시키고, 남는 물질들은 100 ml 의 60% 메탄올/ 0.1% TFA 용액으로 용출시키고, 이어서, 이 용출액을 감압하 농축시켜 생성된 잔류물을 동결건조시켜, 0.363 g 의 건조물을 수득하였다.

(c): 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피 (1)

(b) 에서 수득한 건조물을 150 ml 의 10 mM 인산 버퍼액 (pH 7.0)에 용해시킨후, TSK-겔 SP TOYOPERL PACK 650S (20 ㎛ 내지 50 ㎛, 22φ x 200 mm, Tosoh Co.)을 이용한 양이온 교환 크로마토그래피에 걸어, 0 내지 0.6 M NaCl 농도 (10 mM 인산 버퍼액중: pH 7.0) 의 직선 농도구배로 3.0 ml/분의 유동속도로 60 분간 용출시켰다. 215 nm 의 UV 흡수를 모니터하여 용출액을 6 ml 씩 수거한 후, 후술된 실시예 6 에 따라 조사한 결과, 직장 수축 증강 활성이 0 M NaCl 농도부로 용출된 분획에서 발견되었다.

(d): 역상 고속 액체 크로마토그래피 (HPLC) (1)

(c) 에서 수득한 활성 분획을 Capcell pak C18 UG80 (5 ㎛, 10φ x 250 mm, Shiseido Co.) 를 이용한 역상 고속 액체 크로마토그래피 (역상 HPLC)에 걸어, 0 내지 60% 아세토니트릴 (0.1% TFA/수중: pH 2.2)의 직선 농도구배로, 1.5 ml/분의 유동속도로 60 분간 용출시켰다. 30 내지 36% 농도의 아세토니트릴로 용출된 분획 (각 3ml) 이 수축활성을 보였으며, 이 분획들을 수거하였다.

(e): 양이온 교환 HPLC (2)

(d)에서 수득한 분획을 TSK-겔 SP-5PW (10 ㎛, 7.5φ x 75 mm, Tosoh Co.)를 이용한 양이온 교환 HPLC 에 걸어, 0 내지 0.6 M NaCl 농도 (10 mM 인산 버퍼액중: pH 4.7)의 직선 농도구배로, 1.0 ml/분의 유동속도로 60 분간 용출시켰다. 0.13 내지 0.15 M NaCl 농도의 용액으로 용출된 분획 (각 2ml)이 수축활성을 보였으며, 이러한 분획은 수거하였다.

(f): 역상 HPLC (2)

(e)에서 수득한 분획을 Capcell pak C18 UG80 (5 ㎛, 4.6 φ x 150 mm,Shiseido Co.)를 이용한 역상 HPLC 에 걸어, 20 내지 40% 아세토니트릴 (0.1 % TFA/수중: pH 2.2)의 직선 농도구배로, 1.0 ml/분의 유동속도로 40 분간 용출시켰다. 약 23% 농도의 아세토니트릴로 용출된 분획 (각 1ml) (이후 분획 A 로 칭함) 및 약 25% 농도의 아세토니트릴로 용출된 분획 (이후 분획 B 칭함)이 활성을 보였다.

실시예 2: 활성분획으로부터 펩티드의 정제 (No. 1: 분획 A 로 부터 정제)

실시예 1 의 분리작업 (f) 로 수득된 활성 분획 A 를 Capcell pak C18 UG80 (5 ㎛, 4.6φ x 150 mm, Shiseido Co.)를 이용한 역상 HPLC 에 걸어, 22% 아세토니트릴 (0.1% TFA/수중: pH 2.2)로 0.5 ml/분의 유동속도로 용출시켰다. 14.5 분의 체류시간에서 단일피크를 보이는 화합물을 수득하여, 이 화합물을 화합물 (1)로 정하였다.

상기 역상 HPLC의 전개도를 도 1 로 나타내었다.

실시예 3: 활성 분획으로부터 펩티드의 정제 (No. 2: 분획 B 로부터 정제)

실시예 1 의 분리 작업 (f) 로 수득한 활성 분획 B 는 Capcell pak C18 UG80 (5 ㎛, 4.6 φx 150 mm, Shiseido Co.) 를 이용한 역상 HPLC 에 걸어, 24% 아세토니트릴 (0.1% TFA/수중: pH 2.2)로 0.5 ml/분의 유동속도로 용출시켰다. 13 분의 체류시간에서 단일 피크를 보이는 화합물을 화합물 (2)로 정하였다.

상기 역상 HPLC 의 전개도를 도 2 로 나타내었다.

실시예 4: 펩티드의 동정

실시예 2 및 3 에서 정제된 화합물 (1) 및 (2)의 구조를 Shimadzu PSQ-1 형기상 시퀀서 (Shimadzu Co.)를 이용하여 해석하여 아미노산 서열을 결정하였다. 수득된 아미노산 서열은 하기 표 1 에 나타내었다.

펩티드의 아미노산 서열 (단위: pmol)

NO.	화합물 (1)	화합물 (2)
1	Lys 103	Lys 114
2	Pro 121	Pro 137
3	Pro 104	Pro 124
4	Ser 22	Ser 30
5	Ser 18	Ser 26
6	Ser 14	Ser 14
7	Glu 64	Glu 48
8	Phe 27	Phe 22
9	Val 15	Ile 11
10	Gly 10	Gly 11
11	Leu 6	Leu 3
12	Met 2	Met 2

화합물 (1) 및 화합물 (2) 의 분자량을 MALDI TOF-MS (Voyager Elite, PE Bio Systems Japan Co.)로 확인하였다.

화합물 (1) 및 (2) 의 수득된 분자량은 하기 표 2 에 나타내었다.

펩티드의 질량 데이타

화합물	분자식 이론치(M+2H)²⁺	실측치
(1)	C₅₇H₉₂N₁₄O₁₇S 639.31	639.37
(2)	C₅₈H₉₄N₁₄O₁₇S 646.32	646.40

상기 결과는 분획 A 로 부터 단리 및 정제된 차문어의 신경펩티드인 화합물 (1) 는 하기 아미노산 서열 (1) 임을 명확히 보여준다:

H-Lys-Pro-Pro-Ser-Ser-Ser-Glu-Phe-Val-Gly-Leu-Met-NH₂(1)

더욱이, 분획 B 로부터 단리 및 정제된 차문어의 신경펩티드인 화합물 (2)는하기 아미노산 서열 (2) 이다 :

H-Lys-Pro-Pro-Ser-Ser-Ser-Glu-Phe-Ile-Gly-Leu-Met-NH₂(2)

실시예 5: 고상법에 의한 펩티드의 합성

펩티드의 합성을 자동 433A 펩티드 합성기 (PE Bio Systems Japan Co.)를 이용하여 FastMoc (상표명) 고상법으로 수행하였다. 화합물 (1) 은 Fmoc-NH-SAL-A 수지 (Watanabe Chemical Industries, Co.)를 지지체로 하여, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Pro, Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Val, Fmoc-Gly, Fmoc-Leu 및 Fmoc-Met 를 이용하여 합성시켰다.

더욱이, 화합물 (2)는 또한 Fmoc-NH-SAL-A 수지 (Watanabe Chemical Industries, Co.)를 지지체로 하여, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Pro, Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Ile, Fmoc-Gly, Fmoc-Leu 및 Fmoc-Me 를 이용하여 합성시켰다.

(여기에서, 사용된 약어는 다음과 같다: Fmoc = 9-플루오레닐-메톡시카르보닐, Boc = t-부톡시카르보닐, tBu = t-부틸)

펩티드-수지 컨쥬게이트로부터 합성된 펩티드의 각각의 절단을 위한 절차 및 조 펩티드의 탈보호는 4.3% 의 페놀/ 2.1% 의 1,2-에탄디티올/4.3% 의 티오아니솔/ 4.3% 의 물/85% 의 TFA 혼합액을 이용하여 수행하였다. 반응 혼합물을 여과한 후, 여과액을 에테르 (3 회)로 세정하여 약 100 mg 의 조 펩티드를 수득하였다. 이렇게 수득한 100 mg 의 조 펩티드중 약 10 mg 을 역상 HPLC 에 걸어 약 6 mg 의 정제된 펩티드를 수득하였다. 이렇게 수득된 각각의 생성된 정제 펩티드를 각각Capcell pak C18 를 이용한 역상 HPLC 에서 동일한 체류 시간과 비교하여 차문어의 화합물 (1) 또는 화합물 (2) 로 확인하였다. 더욱이, 합성된 화합물 및 천연 화합물은 잉어와 동일한 직장 수축 활성을 갖는다.

실시예 6: 잉어의 직장 수축 활성의 측정

잉어의 직장 수축 활성은 하기와 같이 측정하였다. 즉, 잉어의 장을 절단한 후, 이의 양 끝을 목면사로 묶었다. 이어서, 이의 한 끝을 시료 쳄버 (2 ml 용량) 에 고정시키고, 다른 쪽 끝은 트랜스듀서에 고정시켜 시험용 표본을 제조하였다. 측정코자 하는 시료를 생리식염수에 용해시킨 후, 시료 쳄버에 첨가하였다. 수축에 의한 장의 장력의 변화를 기록하였다. 이 결과는 도 3 및 4 에 나타내었다.

도면에 나타낸 결과로 부터 명백한 바와 같이, 화합물 (1) [도 3] 및 화합물 (2) [도 4] 의 첨가에 의해, 잉어의 장이 강력하게 수축되었다.

실시예 7: 기니아 피그의 회장 수축 활성의 측정

기니아 피그의 회장 수축 활성은 문헌 (Champagne et al. Champagne D.E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 91, 138-142, 1994)의 방법에 따라 수행하였다.

기니아 피그의 회장을 절단하여, 이의 양 끝을 목면사로 묶었다. 이어서, 이의 한 끝을 시료 쳄버 (5 ml 용량)에 고정시키고, 나머지 한 쪽 끝은 트랜스듀서에 고정시켜 시험용 표본을 수득하였다. 시료 쳄버의 내부는 37℃ 생리 식염수로 일정하게 유지시켰다. 측정코자 하는 시료를 생리식염수에 용해시켜, 시료 쳄버에첨가하였다. 수축에 의한 회장의 장력의 변화를 기록하였다. 이 결과를 도 5 및 6 에 나타내었다.

도면에 나타낸 결과로부터 명백한 바와 같이, 화합물 (1) [도 5] 및 화합물 (2) [도 6]의 첨가에 의해, 기니아 피그의 회장이 화합물의 1 x 10^-8M 농도에서 강력하게 수축되었다.

실시예 8: 전구체 폴리펩티드의 전 아미노산 서열 및 이를 코딩하는 유전자의 염기 서열의 결정

(1) 차문어의 후부 타액선의 총 RNA 의 제조

차문어의 약 1 g 의 후부 타액선을 액체 질소에서 분쇄한 후, 10 ml TRIzol (상표명) 시약 (GIBCO BRL Co.)에서 균질화시켰다. 실온에서 5 분간 안정하게 정치시킨 후, 혼합물을 각 1 ml 씩 분할하였다. 이 혼합물에 200 ㎕ 의 클로로포름을 첨가하고, 이어서 이 혼합물을 교반한 후, 냉각된 원심분리기 (Sakuma Co.) 를 이용하여 원심분리시켰다 [15,000rpm, 15 분, 4℃]. 상층 수성층을 분획화시킨 후, 이 용액에 0.5 ml의 이소프로판올을 첨가하여, 실온에서 10 분간 정치시켰다. 상층액을 제거후 냉각된 원심분리기를 이용하여 원심분리 (15,000rpm, 10 분, 4℃)후 제거하고, 이어서 75% 에탄올 1ml를 잔류물에 첨가하였다. 상층액을 원심분리 (10,000rpm, 5 분, 4℃)후 제거하여 잔류물을 수득한 후, 약 10 분간 풍건시켰다. 10 ㎕ 의 DEPC-처리수를 생성된 잔류물에 첨가하고, 혼합물을 60℃ 에서 10 분간 인큐베이션시켜 RNA 를 용해시켰다. 약 3 mg 의 총 RNA 를 전술한 방법에 따라 수득하였다.

(2) 축중 3'-RACE

차문어의 후부 타액선으로부터 단리된 펩티드의 아미노산 서열을 기초로 하여, 하기의 축중 프라이머를 설계 및 통상의 방법으로 합성시켰다 :

Oct-TK-M-1:

5'-AA(A/G)CCICCII(C/G)II(C/G)II(C/G)IGA(A/G)TT(C/T)AT-3'

Oct-TK-M:

5'-GA(A/G)TT(C/T)AT(A/T/C)GGI(C/T)TIATGGG-3'

(서열에서, 전술한 알파벳 문자는 "Nucleotide Abbreviation List" (Cell Technology, separate volume, "Biotechnology Experiment Illustrated": Shunjunsha Co.)에 따라 표기하였다; 하기의 각 식에서도 동일하다)

다음, 축중 3'-RACE 를 5'/3'-RACE Kit (Boehringer Mannheim Co.)를 이용하여 하기의 단계에 따라 수행하였다. 즉, 2 ㎍ 의 총 RNA, 4 ㎕ 의 cDNA 합성 버퍼, 2 ㎕ 의 dNTP 믹스, 1 ㎕ 의 올리고 dT-앵커 프라이머 (12.5 pmol/㎕) 및 1 ㎕ 의 AMV 역전사효소 (20 단위/㎕) 를 DEPC-처리수에 첨가하여 총 부피 20 ㎕ 를 수득하여, 이 혼합물을 55℃ 에서 60 분간 인큐베이션시킨 후, 제 1 - 가닥 cDNA 를 65℃ 에서 10 분간 가열하여 합성시켰다.

다음, 1 차-3'-RACE 를 하기 조건 하에서 수행하였다. 즉, 5 ㎕ 의 제 1 -가닥 cDNA, 5 ㎕ 의 10 x PCR 버퍼, 8 ㎕ 의 dNTP 믹스, 3 ㎕ 의 Oct-TK-M-1 (100 pmol/㎕), 1 ㎕ 의 PCR 앵커 프라이머 (12.5 pmol/㎕), 0.5 ㎕ 의 TaKaRa Ex Taq (상표명; Takara Shuzo Co.) 및 물의 총 50 ㎕ 부피의 혼합물 용액을 94℃ 에서 5분간 가열시킨 후, 추가로 94℃ 에서 30 초, 45℃ 에서 30 초 및 72℃ 에서 2 분의 30 사이클동안 가열시켰다. 이어서 반응물을 72℃ 에서 7 분간 처리하였다. 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR)을 위해, GeneAmp PCR System 2400 열 사이클러 (Perkin Elmer Co.) 를 사용하였다.

이어서, 1 차 - PCR 산물을 스핀 컬럼 [MicroSpin (상표명) S-400, Amersham Pharmacia Co.] 로 정제시킨 후, 2 차-3'-RACE 를 하기의 조건 하에서 수행하였다. 즉, 3 ㎕ 의 1 차 - PCR 산물, 5 ㎕ 의 10 x PCR 버퍼, 8 ㎕ 의 dNTP 믹스, 3 ㎕ 의 Oct-TK-M (100 pmol/㎕), 1 ㎕ 의 PCR 앵커 프라이머 (12.5 pmol/㎕), 0.5 ㎕ 의 TaKaRa Ex Taq [상표명; Takara Shuzo Co.] 및 물의 총 50 ㎕ 의 혼합물 용액을 94℃ 에서 5 분간 가열한 후, 추가로 94℃ 에서 30 초, 45℃ 에서 30 초 및 72℃ 에서 2 분의 30 사이클 동안 가열시켰다. 이어서 반응물을 72℃ 에서 7 분간 가열시켰다.

5 ㎕ 의 수득된 반응 용액을 1.5 % 아가로오스 겔상에서 전기영동시켜, 약 300bp 크기에서 증폭 PCR 산물을 확인하였다.

(3) PCR 산물의 연결

PCR 산물을 스핀 컬럼으로 정제시키고, 이어서 3 ㎕ 의 PCR 산물을 2 ㎕ 의 TA 클로닝 벡터 pCR 2.1 (Invitrogene Co.) 및 5 ㎕ 의 Ligation high (Toyobo Co.)와 혼합시킨 후, 생성된 혼합물을 16℃에서 1 시간동안 연결시켰다.

(4) 대장균의 형질전환

전술한 (3) 에서 수득한 연결 반응 용액의 10 ㎕ 에, 컴피턴트 세포,Competent high E. coli DH5α(Toyobo Co.)를 첨가하고, 생성된 혼합물을 빙조에서 30 분간 정치시켰다. 이어서, 이 혼합물을 42℃ 에서 50 초동안 열 쇼킹시켰다. 빙조에서 2 분간 냉각시킨 후, 1 ml 의 SOC 배지를 혼합물에 첨가한 후, 이 혼합물을 37℃ 에서 30 분간 인큐베이션시켰다. 이어서, 10 ㎕ 의 형질전환 용액을 35 ㎕ 의 X-gal 이 도포된 LB/Amp. 아가배지 (50 ㎍/ml 의 암피실린을 함유하는 LB 아가배지)에 접종하였다. 잔류 형질전환용액을 10,000rpm 으로 1 분간 원심분리시켜 약 100 ㎕의 양을 감소시키고, 이의 전량을 LB/Amp. 아가 배지상에 접종하였다. LB/Amp. 아가 배지를 37℃ 에서 밤새워 인큐베이션시켰다.

(5) 콜로니 PCR

콜로니 PCR 을 상기에서 수득한 콜로니를 주형으로 사용하여 하기 조건하에서 수행하였다. 즉, 대장균, 5 ㎕ 의 10 x 반응 버퍼, 5 ㎕ 의 2 mM dNTPs, 3 ㎕ 의 25 mM MgCl₂, 0.5 ㎕ 의 M13FW 프라이머 (100pmol/㎕), 0.5 ㎕ 의 M13RV 프라이머 (100pmol/㎕), 0.5 ㎕ 의 rTaq DNA 폴리머라아제 (Toyobo Co.) 및 물의 총 50㎕ 부피의 혼합물 용액을 94℃ 에서 10 분간 가열한 후, 추가로 94℃ 에서 30 초, 55℃ 에서 30 초 및 72℃ 에서 1 분의 30 사이클동안 가열하였다. 이어서 반응물을 72℃ 에서 5 분간 가열하였다. 이어서, 수득된 반응용액의 5 ㎕ 를 1.5 % 아가로오스 겔상에서 전기영동시켰다.

이 반응에서 사용된 M13FW 프라이머 및 M13RV 프라이머를 통상의 방법으로 합성시키고, 이의 서열은 하기에 나타내었다 :

M13FW: 5'-GTAAAACGACGGCCAGTG-3'

M13RW: 5'-GGAAACAGCTATGACCATG-3'

(6) DNA 서열

표적 크기(약 500 bp)를 갖는 콜로니 PCR 산물을 스핀 컬럼상에서 정제시키고, 이어서 수득된 산물의 서열분석을 DNA Sequencing Kit (PE Biosystems Co.)를 이용하여 실시하였다. 서열분석을 위해, ABIPRISM 310 Genetic Analyzer (PE Biosystems Co.)를 사용하였다.

수득된 서열을 유전자 분석 소프트웨어 GENETYX-MAC (Software Development Co.)를 이용하여 분석하였다. 그 결과, 약 500 bp 의 부분 cDNA 가 분석되었다.

(7) 5'-RACE

하기 프라이머를 부분 cDNA 의 염기서열을 기초로 하여 합성하였다.

TK-M-5'-1R: 5'-TTCAGGTTTCAGTTCATTGGG-3'

TK-M-5'-2R: 5'-TTTCGGTGGACCTCTCTTAC-3'

TK-M-5'-3R: 5'-TTCAGACATAGAACCAGGATG-3'

이어서, 하기의 절차에 따라, 5'-RACE 를 5'/3'-RACE Kit (Boehringer Mannheim Co.)를 이용하여 수행하였다. 처음에, 2 ㎍ 의 총 RNA 및 1 ㎕ 의 TK-M-5'-1R (12.5 pmol/㎕) 를 혼합하여, 70℃ 에서 10 분간 인큐베이션시킨 후, 빙조에서 냉각시켰다. 이 혼합물에 4 ㎕ 의 cDNA 합성 버퍼, 2 ㎕ 의 dNTP 믹스, 1 ㎕ 의 AMV 역전사효소 (20 단위/㎕), DEPC-처리수를 첨가하여 총 부피 20 ㎕ 를 수득한 후, 이 혼합물을 55℃ 에서 60 분 및 65℃ 에서 10 분간 인큐베이션시켜 제 1 - 가닥 cDNA 를 수득하였다. 이어서, 이렇게 수득된 제 1 - 가닥 cDNA 를 스핀 컬럼상에서 정제시킨 후, 2.5 ㎕ 의 반응 버퍼 및 2.5 ㎕ 의 2 mM dATP 를 제 1 - 가닥 cDNA 에 첨가하여, 94℃ 에서 3 분간 정치시켰다. 말단 트랜스퍼라아제(10 단위/㎕) 를 혼합물에 첨가한 후, 생성된 혼합물을 37℃ 에서 20 분 및 70℃ 에서 10 분간 인큐베이션시켜 dA-꼬리(tailed) cDNA 를 수득하였다.

이어서, 1 차-PCR 및 2 차-PCR 를 하기 조건하에서 수행하였다 :

① 1 차-PCR

5 ㎕ 의 dA-꼬리 cDNA, 5 ㎕ 의 10 x PCR 버퍼, 8 ㎕ 의 dNTP 믹스, 1 ㎕ 의 TK-M-5'-2R (12.5pmol/㎕), 1 ㎕ 의 올리고 dT-앵커 프라이머 (12.5 pmol/㎕), 0.5 ㎕ 의 TaKaRa Ex Taq [상표명: Takara Shuzo Co.] 및 물의 총 50 ㎕ 부피의 혼합물 용액을 94℃ 에서 5 분간 가열시킨후, 추가로 94℃ 에서 30 초, 55℃ 에서 30 초 및 72℃에서 2 분의 30 사이클 동안 가열시켰다. 이어서 반응물을 72℃ 에서 7 분간 가열시켰다.

② 2 차-PCR:

스핀 컬럼에서 정제된 3 μl 의 1 차-PCR 산물, 5 ㎕ 의 10 x PCR 버퍼, 8 ㎕ 의 dNTP 믹스, 1 ㎕ 의 TK-M-5'-3R (12.5pmol/㎕), 1 ㎕ 의 PCR 앵커 프라이머 (12.5 pmol/㎕), 0.5 ㎕ 의 TaKaRa Ex Taq [상표명: Takara Shuzo Co.] 및 물의 총 50 ㎕ 부피의 혼합물 용액을 상기 1 차-PCR 에 기재된 절차와 동일하게 가열시켰다.

수득된 2 차-PCR 산물을 1.5 % 아가로오스 겔상에서 전기영동시켜 약 300bp 밴드를 확인하였다.

이 2 차-PCR 산물을 전술한 (3), (4), (5) 및 (6) 에 기재된 방법에 따라 각각 서열분석시켰다.

그 결과, 본 발명의 타키키닌 펩티드의 전구체 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA 의 크기 (약 460bp), 서열 및 수 (약 87 개의 아미노산 잔기)가 밝혀졌다. 아미노산 서열은 서열번호 3 으로 나타내었고, cDNA 의 서열은 서열번호 4 로 나타내었다.

더욱이, 전구체 폴리펩티드들 중에서, 본 발명의 타키키닌 펩티드에 해당하는 아미노산 서열이 존재하는 부분을 도 7 에 나타내었다. 도면에서, 밑줄친 부분은 본 발명에 따른 펩티드의 아미노산의 서열이다.

실시예 9: 제제예

정제:

성분 : 화합물 (1) 또는 (2) 10 g

락토오스 125 g

미세결정 셀룰로오스 25 g

옥수수 전분 25 g

5 % 히드록시프로필 메틸셀룰로오스 100 ml

마그네슘 스테아레이트 5 g

상기 성분들을 혼합하여 반죽시켰다. 생성된 혼합물을 과립화시켜 건조시킨 후, 타정하여 각 10 mg 의 화합물 (1) 또는 (2) 를 함유하는 중량 190 mg 의 정제를 제조하였다.

이러한 문제를 해결하기 위하여, 본 발명은 하기의 특성을 가진 타키키닌 펩티드를 제공한다 :

(1) 아미노산 잔기의 수는 12 이고;

(2) 펩티드의 N 말단은 Lys 이며;

(3) C-말단으로부터 5 개의 아미노산의 아미노산 서열은 하기의 아미노산 서열 (I) 이다 :

-Phe-Xaa-Gly-Leu-Met-NH₂(I),

(서열중, Xaa 는 Val, Ile, Phe 또는 Tyr 이다).

이들중, 본 발명은 하기 아미노산 서열 (II) 로 나타낸 타키키닌 펩티드를 제공한다:

H-Lys-Pro-Pro-Ser-Ser-Ser-Glu-Phe-Xaa-Gly-Leu-Met-NH₂(II)

(서열중, Xaa 는 Val, Ile, Phe 또는 Tyr 이다).

본원의 명세서에서, 특별한 조건이 주어지지 않는한, 아미노산 잔기는 IUPAC 및 IUB 에 의해 정의된 3 문자 표시법으로 표기한다.

즉, 본 발명자는 파라미터로서 어류 (잉어(carps))의 직장의 수축 활성을 이용하여 차문어의 후부타액선으로부터 신규의 타키키닌 펩티드를 단리하기 위한 연구를 수행하여, 전술한 아미노산 서열 (II)들 중에서, 하기 아미노산 서열 (1) 및 (2)로 나타낸 펩티드를 단리 및 정제한후, 이 펩티드들의 화학 구조를 동정하고, 추가로 이 펩티드의 전 합성으로 이의 구조 및 생리 활성을 확인하였다:

H-Lys-Pro-Pro-Ser-Ser-Ser-Glu-Phe-Val-Gly-Leu-Met-NH₂(1), (이후, 화합물 (1)로 칭함), 및

H-Lys-Pro-Pro-Ser-Ser-Ser-Glu-Phe-Ile-Gly-Leu-Met-NH₂(2)

(이후, 화합물 (2)로 칭함).

또한, 본원의 발명자는 전술한 아미노산 서열을 기초로 한 프라이머를 제조하고, 차문어의 후부타액선으로부터 제조된 전 RNA 에 대하여 수행된 역전사 폴리머라아제 연쇄반응 (RT-PCR)을 이용한 유전자 서열의 분석 방법을 결합시킴으로써 타키키닌 펩티드의 전구체로서의 폴리펩티드의 전장 일차 아미노산 서열은 아미노산 서열번호 3 임을 확인하였다.

본원의 발명자는 추가로 전술한 타키키닌 펩티드의 전구체 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 서열번호 4 로 나타낸 염기서열을 가짐을 확인하였다.

따라서, 본 발명은, 또 하나의 구현예로서, 아미노산 서열번호 3 으로 나타낸 타키키닌 펩티드의 전구체 폴리펩티드, 또는 하나 이상의 아미노산의 부가 또는 결실로 부분적으로 변형된 이의 아미노산 서열 및/또는 또 다른 아미노산의 부가로 부분적으로 변형된 이의 아미노산 서열을 제공한다.

더욱이, 또 하나의 구현예로서, 본 발명은 전술한 타키키닌 펩티드 및 전구체 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 특히 벡터 또는 상기 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환된 숙주 세포 또는 상기 유전자를 이용한 유전자 재조합 기술에 의한 서열번호 4 로 나타낸 염기, 타키키닌 펩티드 및 전구체 폴리펩티드로 구성된 유전자를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명에 의해서 제공된 차문어 유래의 신경펩티드는 저 농도에서 잉어의 직장을 신속하게 수축시키고, 지속적으로 잉어의 직장에 대해 수축 활성을 보이는 신경펩티드이다. 이 결과는 물질 P 를 특징으로 하는 평활근에 대한 2 개의 상의 수축 활성과 유사하다.

또한, 본 발명에 의해 제공된 차문어 유래의 신경펩티드는 하기식으로 나타낸 펩티드의 C 말단내 아미노산 서열을 가지며:

-Phe-Yaa-Gly-Leu-Met-NH₂

(서열중, Yaa 는 전술한 바와 같다)

포유류의 평활근 수축 활성, 혈관확장작용 및 혈압강하 활성을 갖는 타키키닌 펩티드의 아미노산 서열을 특징으로 한다.

따라서, 본 발명의 차문어의 신경펩티드는 신경전달계 분석용 생화학적 시약으로서 유용하고, 이는 분자수준에서 구조 할성의 상관관계의 연구에 기초한 의약 또는 살충제와 같은 약물 개발에 새로운 접근법을 제공한다.

또한, 본 발명에 의해 제공된 타키키닌 펩티드의 전구체 폴리펩티드 및 이를 코딩하는 유전자는 본 발명의 타키키닌 펩티드를 제조하기 위한 중요한 도구가 되었다.

Claims

하기의 특성을 갖는 타키키닌 펩티드 :

(1) 아미노산 잔기의 수는 12 이고;

(2) 펩티드의 N 말단은 Lys 이며;

(3) C-말단으로부터 5 개의 아미노산의 아미노산 서열은 하기의 아미노산 서열 (I) 로 표시됨 :

-Phe-Xaa-Gly-Leu-Met-NH₂(I),

(서열 중, Xaa 는 Val, Ile, Phe 또는 Tyr 이다).
제 1 항에 있어서, 펩티드는 하기의 아미노산 서열 (II) 로 표시되는 펩티드:

H-Lys-Pro-Pro-Ser-Ser-Ser-Glu-Phe-Xaa-Gly-Leu-Met-NH₂(II)

(서열 중, Xaa 는 Val, Ile, Phe 또는 Tyr 이다).
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 펩티드는 차문어의 후부 타액선으로부터 수득되는 펩티드.
제 1 항 내지 제 3 항중 어느 한 항에 있어서, 펩티드는 하기 아미노산 서열(1) 로 표시되는 펩티드:

H-Lys-Pro-Pro-Ser-Ser-Ser-Glu-Phe-Val-Gly-Leu-Met-NH₂(1)
제 1 항 내지 제 3 항중 어느 한 항에 있어서, 펩티드는 하기 아미노산 서열 (2) 로 표시되는 펩티드:

H-Lys-Pro-Pro-Ser-Ser-Ser-Glu-Phe-Ile-Gly-Leu-Met-NH₂(2)
서열 번호 3 으로 나타낸 아미노산 서열, 또는 하나 이상의 아미노산의 부가 또는 결실 및/또는 상기 아미노산 서열의 다른 아미노산에 의한 치환으로 변형된 아미노산 서열을 갖는 타키키닌 펩티드의 전구체 폴리펩티드.
제 6 항에 따른 타키키닌 펩티드의 전구체 폴리펩티드를 코딩하는 DNA.
서열 번호 4 로 나타낸 염기 서열을 갖는 DNA.
제 7 항 또는 제 8 항에 따른 DNA 와 하이브리다이징하는 DNA.
서열번호 1, 2 또는 3 으로 나타낸 아미노산 서열중 어느 하나를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 하이브리다이징하는 DNA.
제 7 항 내지 제 10 항중 어느 한 항에 따른 DNA 를 포함하는 벡터.
제 11 항에 따른 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
제 12 항에서 청구된 숙주세포를 배양하거나 생육시킨 후, 숙주 세포 또는 배양액으로부터 타키키닌 펩티드의 전구체 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함하는 타키키닌 펩티드의 전구체 폴리펩티드의 제조방법.
제 13 항에 따른 방법으로 수득한 타키키닌 펩티드의 전구체 폴리펩티드.
제 13 항에 따른 방법으로 수득한 전구체 폴리펩티드로부터 타키키닌 펩티드의 전구체 폴리펩티드를 프로세싱하여, 상기 폴리펩티드의 C-말단을 변형시키는 것을 포함하는 타키키닌 펩티드의 제조방법.
제 15 항에 따른 방법으로 수득한 타키키닌 펩티드.
제 16 항에 있어서, 상기 펩티드는 하기 아미노산 서열 (1) 또는 (2) 로 표시되는 타키키닌 펩티드:

H-Lys-Pro-Pro-Ser-Ser-Ser-Glu-Phe-Val-Gly-Leu-Met-NH₂(1)

H-Lys-Pro-Pro-Ser-Ser-Ser-Glu-Phe-Ile-Gly-Leu-Met-NH₂(2)
활성성분으로 제 1 항 내지 제 5 항중 어느 한 항에 따른 타키키닌 펩티드를 포함함하는 의약 또는 살충제.