WO2001009171A1

WO2001009171A1 - Nouveaux peptides de la tachykinine, leurs peptides precurseurs et genes les codant

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Publication number: WO2001009171A1
Application number: PCT/JP2000/004944
Authority: WO
Inventors: Hiroyuki Minakata; Eiko Iwakoshi; Kyoko Kuroda
Original assignee: Suntory Limited
Priority date: 1999-07-30
Filing date: 2000-07-25
Publication date: 2001-02-08
Also published as: EP1213297B1; US7371810B1; KR100724331B1; ATE393777T1; AU6023900A; EP1213297A1; JP2001103979A; DE60038741T2; CA2380354A1; DE60038741D1; AU773969B2; JP4166408B2; AU773969C; CN1376162A; KR20020016929A; US20090023184A1; CN1332977C; EP1213297A4

Description

明細新規夕キキニンペプチド、およびその前駆体ポリペプチドならびにこれらをコードする遺伝子技術分野

本発明は、脊椎動物の腸管を収縮する活性を有する、新規な夕キキニンべプチドおよびその前駆体ポリペプチドに関し、さらに詳細には、マダコ（Oc t op u s vu l g a r i s) の後部唾腺から得られる、脊椎動物の腸管を収縮する活性を有する新規なタキキニンペプチド、およびその前駆体ポリペプチドならびにこれらをコードする遺伝子に関する。背景技術

外洋性ジヤコウダコ（£ J e c? on e mo s c Λ a ί: aおよび . a 1 d r o va n d i) の後部唾腺のァセトン抽出物が、ィヌに対して強力な血圧降下作用を示すことから単離されたエレドイシン（e 1 e d o i s i n) は、アミノ酸残基 1 1からなる生理活性神経ペプチドである（E r S p ame r, V. ら， E x p e r i e n t i a, 1 8, 58, 1 9 62) 。このエレドィシンは、血圧降下作用のほかにモルモットの回腸を収縮させる作用を有しており、また、静注した場合には、ィヌの唾液分泌を促進するという特異な作用をも有していることが明らかにされている。

その後、同様の作用をもつペプチドが力エルの皮膚から単離されており、これはフィザラミン（p hy s a l a em i n) と名付けられている（E r s p am e r， V. ら， Exp e r i e n t i a, 20, 489, 1 964) 。

これらのペプチドは、モルモットの回腸を素早く収縮させる作用を有するために、ブラジキニン（b r a d y (緩徐に） k i n i n (動かすもの））に対して、夕キキニン（t a c hy (= f a s t) k i n i n、早く収縮させるもの）と命名された。また、これらのペプチドの構造がもとになつて、サブスタンス P (s ub s t an c e P) の構造が明らかにされた。

タキキニンに分類されるペプチドは、その後、両生類（Ya s uh a r a, T. ら， B i ome d. Re s. , 2, 61 3, 1 981 や、鳥類（C o n 1 o n， J . M. ら， Re gu l a t o ry Pe p t i d e s' 20 , 1 71, 1 988) などの脊椎動物から次々と単離されているが、無脊椎動物からはエレドイシンの他に、黄熱病を媒介する蚊から、シァロキニン（s i a 1 ok i n i n) が発見されただけである（Ch amp agne, D. E. & R i b e i r o， J. M. ： P r o c. Na t l. Ac a d. S c i . ひ SA, 91, 1 3 8, 1 994) 。

今日では、タキキニンはペプチド結合の C末端に、下式で示される共通のアミノ酸配列：

-Ph e-Ya a-G l y-L e u-Me t一 NH₂

(式中、 Ya aは、芳香族アミノ酸（Ph e、 Ty r) や分枝アミノ酸（Va 1、 I 1 e) である）

を有し、腸管収縮作用、血圧降下作用、唾液分泌促進作用などを示す生理活性べプチドの総称とされている。そのようなタキキニンには、前記サブスタンス P (P物質）、エレドイシン、フィザラミンのほか、ニューロキニン A (n e u r o k i n i n A) 、ニューロキニン B (n e u r ok i n i n B) 、カシニン（k a s s i n i n) などが含まれる（生物学辞典（第 4版）、岩波書店、 1 997) 。

このように、夕キキニンペプチドは、新しい医薬品開発の基礎化合物として活用が期待されており、特に、サブスタンス Pは一次知覚神経の伝達物質として、痛みの伝達に関与していると考えられていることから、鎮痛薬としての開発が期待され、研究が行われている。また、高等動物の神経系における情報処理機構解明用の試薬としての活用も期待されている。ところで、夕コの後部唾腺は、前記のエレドイシンの他に、甲殻類をしびれさせる効果をもつ糖タンパク、セファロトキシン、フグ毒として知られるテトロドトキシンなどの毒物質を含んでいるものがあり、毒腺といわれている。さらにォクトパミン、セロトニン、チラミン、ノルアドレナリン、ヒスタミン、ァセチルコリンなどの生体アミン類や、タンパク分解酵素、ヒアルロニダーゼなどの酵素類を含んでいるものがあることが知られている（Bou c aud-Camou, E. & Bou c h e r— Rodon i , R. 1983. Fe ed i ng a n d d i ge s t i on i n C e p h a 1 o p o d s . In "Th e m o 1 1 u s c a" , (S a 1 e u d d i n, A. S. M. & Wi l bu r, K. M. ) , Ac ad emi c p r e s s and New Yo r k. ) 。し力しながら、エレドイシン以外のタキキニンペプチドが見出されたとの報告はない。また、エレドイシンは、哺乳類に対しては平滑筋収縮作用や血管拡張作用、血圧降下作用を有することが明らかにされたが、タコにおける役割についてはほとんどわかっていない。

こうしたことから、夕キキニンペプチドについての個々の動物種における役割や、種族特異性を明らかにして、構造—活性相関の研究などにより高等動物の神経系における情報処理機構の解明や、医薬品の開発に結びつく情報を得るためには、さらに多くの動物種から、夕キキニンペプチドを見いだすことが必要とされている。したがって、本発明は、新たな夕キキニンペプチドを見出し、その構造を明らかにするとともに、その生理活性を解明し、高等動物の神経系における情報処理機構の解明用の試薬や、農薬または医薬品開発における基礎化合物としても利用可能な、新規夕キキニンペプチドを提供することを課題とする。さらに本発明は、これら夕キキニンペプチドの前駆体ポリペプチドおよびそれをコードする遺伝子を明らかにし、かかる夕キキニンペプチドを製造する方法を提供することを課題とする。発明の開示

かかる課題を解決するため、本発明は、次の特性：

① アミノ酸残基数が 12であり；

② N末端が Ly sであり；

③ C末端から 5つのアミノ酸が次のアミノ酸配列式（I ) 、

-P h e -X a a-G l y-L e u-Me t -NH₂ ( I )

(式中、 Xa aは Vaし I l e、 Ph e、または Ty rを表す）で表される夕キキニンペプチドを提供する。

そのなかでも本発明は、次のアミノ酸配列式（I I ) ：

H-Ly s -P r o-P r o-S e r - S e r - S e r -G 1 u-P h e - Xa a-G l y-L e u-Me t -NH₂ ( I I )

なお、本明細書においては、特にことわりのない限り、アミノ酸残基は、 I U ?八〇ぉょび1 UBの定める 3文字表記で表す。すなわち本発明者らは、マダコ (Oc t op u s vu l ga r i s) の後部唾腺から新たな夕キキニンペプチドを得るべく、マダコの後部唾腺から、魚類 (コィ）の直腸の収縮を指標に検索を行ない、上記アミノ酸配列式（I I ) のなかでも、次のアミノ酸配列式（1) および（2) ：

H-Ly s -P r o-P r o-S e r -S e r -S e r -G l u -P h e -

V a l — G l y— L e u— Me t— ΝΗ') ( 1 ) (以下、このペプチドを化合物（1) と称する）

H-Ly s -P r o-P r o-S e r-S e r-S e r-G l u-Phe-

I l e-G l y-Le u-Me t -NH₂ (2)

(以下、このペプチドを化合物（2) と称する）

で表されるペプチドを分離、精製し、その化学構造を決定するとともに、全合成によりその構造および生理活性を確認した。さらに本発明者らは、上記のアミノ酸配列をもとにプライマーを作成し、マダコの後部唾腺から調製した t o t a 1 RNAに対して、逆転写ポリメラ一ゼ連鎖反応（RT— PCR) 法などを用いた遺伝子配列の解析手段を組み合わせることにより、タキキニンべプチドの前駆体であるポリぺプチドの全一次アミノ酸配列は、配列番号 3で示されることを明らかにした。

さらに本発明者らは、当該タキキニンぺプチドの前駆体ポリペプチドをコードする遺伝子は、配列番号 4に示す塩基配列を有するものであることを明らかにした。したがって、本発明は別の態様として、配列番号 3で表されるアミノ酸配列、あるいはそのアミノ酸配列に対して 1個または複数個のアミノ酸の付加、欠失、および Zまたは他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有する、タキキニンべプチドの前駆体ポリぺプチドを提供する。

さらに別の態様として、本発明は、かかる夕キキニンペプチドおよび前駆体ポリペプチドをコードする遺伝子、特に、配列番号 4に示す塩基配列からなる遺伝子、ならびにこれらの遺伝子を含んでなるベクタ一およびベクターにより形質転換された宿主、あるいはこれら遺伝子を用いた遺伝子組換え技術による前駆体ポリぺプチドおよび夕キキニンべプチドの製造方法を提供する。図面の簡単な説明

第 1図は、実施例 2における、本発明のペプチドである化合物（1) の最終溶出パターンを示す逆相 H P L Cの展開図である。

第 2図は、実施例 3における、本発明のペプチドである化合物（2) の最終溶出パターンを示す逆相 HP LCの展開図である。

第 3図は、実施例 6における、本発明の化合物（1) について、コィの直腸を収縮させる活性結果を示す図であり、マダコ 1匹分に相当する量の化合物（1) をチヤンバーに加えたときの結果を示す。

第 4図は、実施例 6における、本発明の化合物（2) について、コィの直腸を収縮させる活性結果を示す図であり、マダコ 1匹分に相当する量の化合物（2) をチヤンバーに加えた時の結果を示す。

第 5図は、実施例 7における、本発明の化合物（1) について、モルモットの回腸を収縮させる活性結果を示す図であり、 1 X 1 0— ⁸Mの化合物（1) をチャンバーに加えた時の結果を示す。

第 6図は、実施例 7における、本発明の化合物（2) について、モルモットの回腸を収縮させる活性結果を示す図であり、 1 X 1 0— ⁸ Mの化合物（2) をチャンバーに加えた時の結果を示す。

第 7図は、本発明の前駆体ポリペプチド中で、本発明の夕キキニンペプチドに該当するアミノ酸配列が存在する部分（アンダーライン該当部分）を示す図である。発明を実施するための最良の形態

本発明が提供する新規べプチドは、脊椎動物の腸管収縮作用を有する夕キキニンペプチドであり、マダコ Oc t o p u s v u 1 g a r i s、から、例えば以下の方法により単離、精製することができる。

すなわち、マダコの後部唾腺を熱水抽出し、その抽出液に酢酸を 3%濃度になるように加え、冷却後遠心分離して粗抽出物を得る。この粗抽出物を C 18力一トリッジ（例えば S e p-P a k (登録商標） Ca r t r i dge s :ウォー夕ーズ社製）に吸着させた後、 0. 1%トリフルォロ酢酸（以下、 TFAと略す）を含む 60 %メタノールで溶出してペプチド画分を分取し、この画分をイオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等に付して、目的とするぺプチドを分離、精製することができる。

また、本発明のペプチドはアミノ酸残基数 12のペプチドであるため、通常のペプチド合成機（例えば PEバイオシステムズジャパン社製ペプチド合成機 43 3 A型）を用いた固相合成法や、通常の有機合成化学的手法により容易に合成することができる。これらの方法で得られた粗ペプチドは、必要であれば逆相高速液体ク口マトグラフィ一や結晶化等の通常の精製手法によつて、精製することができる。一方、マダコから単離された夕キキニンペプチドの前駆体ポリペプチドのアミノ酸配列、および当該ポリペプチドをコードする遺伝子の塩基配列は、次のようにして決定することができる。

すなわち、上記により得られたタキキニンペプチドのアミノ酸配列をもとにプライマ一を作成し、マダコの後部唾腺より調製した t o t a 1 RNAに対して逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT— PCR) を行い、約 500塩基対の遺伝子配列を解明し、続いて 5，一 RACE法、 3' —RACE法を用いて 5' 末端および 3' 末端側の遺伝子配列を解明することができる。本発明においては、この方法によりマダコの夕キキニンべプチドの前駆体ポリぺプチドは、配列番号 3で示されるアミノ酸配列を有するものであること、当該前駆体ポリペプチドをコードする遺伝子は、配列番号 4に示す塩基配列を有するものであることを明らかにした。

したがって、本発明の夕キキニンべプチドの前駆体ポリぺプチドおよび夕キキニンペプチドは、遺伝子組み換え法によっても製造することができる。すなわち、遺伝子組み換え法によって製造する場合は、例えば、配列番号 4で示される遺伝子を組み込んだベクターを作成し、当該ベクターによって宿主の形質転換を行つた後、該宿主を培養または成育させ、該宿主または該宿主の培養液から目的の前駆体ポリペプチドを単離、精製すれば良い。そして、前駆体ポリペプチドから目的の夕キキニンペプチドを得るには、前駆体ポリペプチドから酵素などを用いて切り出し（プロセッシング）および修飾を行い、必要に応じて精製すれば良い。本発明のペプチドは、脊椎動物において平滑筋収縮作用や血管拡張作用、血圧降下作用をもたらすタキキニンペプチドであるため、神経伝達系研究用の試薬としてだけでなく、医薬への新たなアプローチを与える有用な化合物として利用することができる。

例えば、本発明のペプチドを有効成分とする医薬としては、製剤学的に慣用されている賦形剤と共にカプセル剤、錠剤、注射剤等の適当な剤形で、経口的または非経口的に投与することができる。具体的には、本発明のペプチドを、乳糖、デンプンまたはその誘導体、セルロース誘導体等の賦形剤と混合したのち、ゼラチン力プセルに充填することにより力プセル剤を調製することができる。

また錠剤は、上記の賦形剤の他に、カルボキシメチルセルロースナトリウム、アルギン酸、アラビアゴム等の結合剤と水を加えて練合し、必要により顆粒として造粒したのち、さらにタルク、ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤を添加して、通常の圧縮打錠機を用いて錠剤に調製することができる。

さらに、非経口投与に際しては、本発明のペプチドを溶解補助剤と共に滅菌蒸留水あるいは滅菌生理食塩水に溶解し、アンプルに封入して注射用製剤とすることができる。この場合、必要により安定化剤、緩衝物質等を含有させてもよい。また、粉末のままバイアル充填し、滅菌蒸留水により用時溶解型の製剤とすることもできる。これらの非経口投与製剤は、静脈内投与、あるいは点滴静注により投与することができる。

なお本発明の有効成分であるペプチドの投与量は、種々の要因、例えば治療すべき病態、患者の症状、重篤度、患者の年齢、さらには投与経路等を考慮して、適宜設定すればよい。一般的に経口投与の場合には、有効成分として通常 0. 1 〜 100 OmgZ日/ヒト、好ましくは：！〜 50 OmgZ日/ヒトの範囲内で、また非経口投与の場合には、経口投与の場合における投与量の約 1Z100〜1 / 2程度の範囲内で適宜選択し投与することができる。実施例

以下に実施例により本発明をさらに説明するが、本発明の範囲は、これらのみに限定されるものではない。実施例 1 ：マダコからコィ直腸の収縮増強作用を有するペプチド類の分離

(a) ：粗抽出

マダコ（Oc Z: op u s vu l ga r i s) 1 00匹から後部唾腺を摘出し、液体窒素にて凍結保存した。凍結保存した摘出組織 (2 2 1 g) を 3等分し、その 1Z3量を沸騰した蒸留水 80 Om l中に入れ、 1 0分間煮沸した。放冷後、酢酸を 3%濃度になるように加え、ホモジナイズした後、 4でで 30分間、 1 0， 0 0 0 X gで遠心分離して、上清を得た。一方、沈殿物に 2 0 0m 1の 3 %酢酸を加え、再度ホモジナイズした後、同様に遠心分離をして、上清を得た。さらに、沈殿物に 20 0m lの 3%酢酸を加えた後、同様に処理し、上清を得た。残りの摘出組織を 2回に分けて、上記と同様の各 3回の抽出操作を行い、上清を得た。得られた上清を集め、減圧下に約 2 00m 1になるまで濃縮し、粗抽出物とした。

(b) ： C 1 8カートリッジへの吸着

(a) で得られた粗抽出物に、 1. OM— HC 1を 2 Om 1加え、 4°Cで 3 0 分間、 30, 000 xgで遠心分離した。得られた上清を、 S e p— Pak (登録商標） Va c C 18カートリッジ（10 g、 35 c c、ウォーターズ社製）に通した。カートリッジを 0. 1 %TFA20 Om 1で洗浄した後、保持物質を 60%メタノール /0. 1%TFA10 Omlで溶出し、溶出液を減圧濃縮後、凍結乾燥させ、乾燥物 0. 363 gを得た。

(c) ：陽イオン交換カラムクロマトグラフィー（1)

(b) で得られた乾燥物を 1 OmMリン酸バッファー（pH7. 0) 150m 1に溶かし、 TSKge l S Pトヨパールパック 650 S (20〜50 ΠΊ、 Φ 22 X 200mm, 東ソー製）を用いた陽イオン交換カラムクロマトグラフィー（陽イオン交換 HPLC) に付し、流速 3. Oml/mi nで、 1 OmMリン酸緩衝液（pH 7. 0) 中、 60分間で 0Mから 0. 6Mの NaC lの直線濃度勾配で溶出した。 215 nmの紫外線吸収のモニターにより 6mlずつに分画し、溶出した各フラクションを、後記する実施例 6に示す方法に従って生物検定したところ、 OMのNaC 1濃度で溶出された画分に直腸収縮増強活性が見られた。

(d) ：逆相高速液体カラムクロマトグラフィー（1)

(c) で得られた活性画分を、 C a p c e 1 1 p a k C 18 UG80 (5 m, Φ 10 X 25 Omm, 資生堂製）を用いた逆相高速液体カラムクロマトグラフィ一（逆相 HPLC) に付し、流速 1. 5mlZmi nで、 0. 1% TFA (pH2. 2) 中、 60分間で 0 %から 60 %のァセトニトリルの直線濃度勾配で溶出した。 3mlずつの溶出画分を生物検定に付したところ、ァセトニトリル 30〜36 %に溶出される画分に活性が見られた。

(e) ：陽イオン交換 HPLC (2)

(d) で得られた画分を、 TSKg e 1 S P— 5 PW (10 m、 Φ 7. 5 X 75 mm, 東ソー製）を用いた陽イオン交換 H P L Cに付し、流速 1. Om

1 /mi nで、 1 OmMリン酸緩衝液（pH4. 7) 中、 60分間で0 1から0. 6MのNaC 1の直線濃度勾配で溶出した。 2m 1ずつの溶出画分を生物検定したところ、 0. 13〜0. 15 Mの NaC 1濃度で溶出された画分に活性が見られた。

( f ) ：逆相 HPLC (2)

(e) で得られた画分を、 C a p c e 1 1 p a k C 18 UG80 (5 ^ m、 Φ4. 6 X 150mm, 資生堂製）を用いた逆相 H P L Cに付し、流速 1. OmlZmi nで、 0. 1 %TFA (pH 2. 2) 中、 40分間で、 20〜4 0%のァセトニトリルの直線濃度勾配で溶出した。 1mlずつ分画し、ァセトニトリル濃度約 23%に溶出する画分（以下、画分 Aという）、およびァセトニトリル濃度約 25%に溶出する画分（以下、画分 Bという）に活性を認めた。実施例 2 ：活性画分からペプチド類の精製（その 1 ：活性画分 Aからの精製）実施例 1の分離操作（ f ) で得られた活性画分 Aを、 Cap c e l l p ak C I 8 UG 80 ( 5 m, Φ4. 6 X 15 Omm, 資生堂製）を用いた逆相 HPLCに付し、流速 5mlZmi nで、 0. 1%TFA (pH2. 2) 中、ァセトニトリル濃度 22%で展開した。保持時間 14. 5分に単一のピークを示す化合物が得られた。この化合物を化合物（1) とした。

この逆相 HPLCの展開図を、第 1図として示す。実施例 3 ：活性画分からペプチド類の精製（その 2 ：活性画分 Bからの精製）実施例 1の分離操作（ f ) で得られた活性画分 Bを、 Cap c e l l ak C 18 UG80 (5 m, Φ4. 6 X 15 Omm, 資生堂製）を用いた逆相 HPLCに付し、流速 0. 5mlZmi nで、 0. 1%TFA (pH2. 2) 中、ァセトニトリル濃度 24%で展開した。保持時間 13分に単一のピークを示す化合物が得られた。この化合物を、化合物（2) とした。

この逆相 HPLCの展開図を、第 2図，実施例 4 ：類の同定

上記の実施例 2および 3で純化した、化合物（1) および化合物（2) の構造を、 Sh imad z u P S Q— 1型気相シークェンサ一（島津製作所製）によつて解析した。得られた各アミノ酸配列を、下記第 1表に示した。第 1表：ペプチドのアミノ酸配列（単位： pmo 1)

化合物（1) および化合物（2) の分子量は、 MALD I TOF-MS (V oy age r E l i t e, P Eバイオシステムズジャパン社製）によって確認した。その測定値を下記第 2表に示した。第 2表：ぺプチドの M Sデータ

以上の機器分析データにより、活性画分 Aより単離、精製されたマダコの神経ペプチド類である化合物（1) は、次のアミノ酸配列式（1)

H-Ly s -P r o-P r o-S e r - S e r - S e r -G 1 u— Ph e—

V a 1 -G l y-L e u-Me t -NH₂ (1)

で表されることが明らかになった。また、活性画分 Bより単離、精製されたマダコの神経類である化合物 (2) は、次のアミノ酸配列式（2)

H-Ly s -P r o-P r o-S e r -S e r -S e G 1 u -P h e -

I 1 e— G 1 y— L e u— Me t— NH₂ (2)

で表されることが明らかになつた。実施例 5 ：固相法によるペプチド類の合成

ペプチド類の合成は、 PEバイオシステムズジャパン社製の全自動ペプチド合成機 43 3A型を用い、 F a s t Mo c (登録商標）法により合成した。

なお、化合物（1) の合成には、 Fmo c— NH— S AL— Aレジン（渡辺化学工業社製）を担体とし、 Fmo c— Ly s (B o c) 、 Fmo c— P r o、 F mo c - S e r ( t B u) 、 Fmo c -G 1 u (O t B u) 、 Fmo c— Ph e、 Fmo c - V a \ , Fmo c— G l y、 Fmo c— L e uおよび Fmo c— M e tを用いた。

また、化合物（2) の合成には、 Fmo c— NH— SAL— Aレジン（渡辺化学工業社製）を担体とし、 Fmo c— Ly s (Bo c) 、 Fmo c— P r o、 F mo c - S e r ( t B u) 、 Fmo c— G l u (O t B u) 、 Fmo c _Ph e、 Fmo c_ I l e、 Fmoc— G l y、 Fmo c— L e uおよび Fmo c—Me tを用いた。

(ただし、 Fmo ciま 9— F l uo r e ny lme t hoxyc a r bony l を、 Bocは t— Bu t oxyc a r bony lを、 t Buは t— Bu t y lを示す。 ) 反応終了後のぺプチド樹脂からの粗べプチドの切離しと脱保護には、フエノール 4. 3%Z1， 2—エタンジチオール 2. 1%Zチオア二ソール 4. 3 %Z水 4. 3 %ZTFA85 %を用いた。反応混合物を濾過し、濾液にエーテルを加えてペプチドを沈殿させ、沈殿をエーテルで 3回洗浄し、粗ペプチド約 l O Omg を得た。このうちの約 1 Omgの粗ペプチドを逆相 HPLCにより精製し、約 6 m gの精製べプチドを得た。

精製ペプチドは、 C a p c e 1 1 p a k C 18を用いる逆相 H P L Cにおいて、保持時間がそれぞれマダコ由来の化合物（1) および（2) と全く一致した。また、コィの直腸収縮活性においても、合成物はそれぞれの天然物と同様であった。実施例 6 ：コィの直腸収縮活性の測定

コィの直腸収縮活性の測定は、次のとおり実施した。すなわち、コィの腸管を摘出し、その両端を木綿の糸で縛り、一端を試料添加用のチャンバ一（容量 2m 1) に固定し、他端をトランスデューサ一につないで検定の標本とした。検定すべき検体は、生理食塩水に溶解してチャンバ一に添加し、収縮による張力の変化を記録した。

その結果を、第 3図および第 4図に示した。図中の結果からも明らかなように、化合物（1) [第 3図] および化合物 (2) [第 4図] は、コィの腸管を強く収縮させている。実施例 7 ：モルモット回腸収縮活性の測定

モルモット回腸の収縮活性の測定は、シャンパーニュら（Ch amp agn e D. E. e t a 1. P r o c. Na t l. Ac a d. S c i . USA. 91, 1 38-142, 1 994) の方法に従って実施した。

モルモットの回腸を摘出し、その両端を木綿の糸でしばり、一端を試料添加用のチャンバ一（容量 5m l) に固定し、他端をトランスデューサ一につないで検定の標本とした。また、チャンバ一内は常に 37での生理食塩水で一定に保たれており、検定すべき検体は、生理食塩水に溶解してチャンバ一に添加し、収縮による張力の変化を記録した。

その結果を、第 5図および第 6図に示した。

図中の結果からも明らかなように、化合物（1) [第 5図] および化合物 (2) [第 6図] は、それぞれ 1 X 10— ⁸ Mの濃度で、モルモットの回腸を強く収縮させている。実施例 8 ：前駆体ポリペプチドの全アミノ酸構造およびそれをコードする遺伝子の塩基配列決定

(1) マダコ後部唾腺 t o t a 1 RNAの調製

マダコの後部唾腺約 1 gを液体窒素中で粉砕し、 101111の丁1^ 1 20 1 (登録商標）試薬（G I BCO BRL社製）に溶解した後ホモジナイズした。室温で 5分間静置した後、 1mlずつ分注し、 200 1ずつクロ口ホルムを加えて撹拌後、冷却遠心機（佐久間製作所社製）で遠心分離（15， 000 r pm、 1 5分間、 4°C) した。上層の水層を分取して、 0. 5m 1ずつイソプロパノールを加え、室温で 10分静置した。冷却遠心機で遠心分離（1 5， 000 r pm、 10分間、 4°C) した後、上清を除いて lm 1の 75%エタノールを加えて再度遠心分離（ 10, 000 r pm、 5分間、 4°C) した。上清を除いて約 10分間風乾し、 10 1の DEPC—処理水を加え、 6 O :で 10分間インキュベートして RNAを溶解した。以上の方法で約 3mgの t o t a l RNAが得られた。 (2) d e ge n e r a t e 3 ' -RACE

マダコの後部唾腺から単離されたペプチドの配列を基に、次の縮重プライマーを設計し、常法により合成した。

Oct-TK-M-1： 5' -AA(A/G) CCICCI I (C/G) 11 (C/G) 11 (C/G) IGA(A/G)TT(C/T)AT- 3' Oct-TK-M ： 5' -GA(A/G) TT (C/T) AT (A/T/C) GGI (C/T) TIATGGG-3'

(各式中の英文字は「ヌクレオチド略語表」による（細胞工学別冊「バイオ実験イラストレイテッド」：秀潤社）；以下の各式において同じ。）

次に、 5， Z3' — RACE K i t (Boe h r i nge r Ma n n h e im社製）を用いて、以下の手順で d e g e n e r a t e 3 ' —RACEを行なった。すなわち、の t o t a l RNA、 4 1の cDNA s yn t h e s i s u f f e r, 2 1の dNTP mi x, 1 z lの o l i g o d T- ncho r p r ime r (12. 5 pmo 1 / n 1 ) , 1 の AM V r e v e r s e t r an s c r i p t a s e (20un i t sZy l) 、 DE PC—処理水を加えて全量 20 1にし、 55でで 60分間インキュベートの後、 65T:で 10分間処理して 1 s t— s t r and cDNAを合成した。次に、以下の条件で 1 s t— 3 ' —RACEを行った。すなわち、 5 1の 1 s t— s t r and cDNA、 5 1の 10 XPCR u f f e r, 8 u 1の dNTP m i , 3 / 1の O c t— T K— M— 1 ( 100 pmo 1 1) 、の PCR an c ho r p r i me r (12. 5 pmo \ / 1) 、 0. 5 z lの TaKaRa Ex Ta q (登録商標）（宝酒造社製）、水を混合して全量 50 1にし、 94°C5分間の後、 94 °C 30秒間、 45 °C 3 0秒間、 72 °C 2分間で 30サイクル、その後 72 °Cで 7分反応させた。ポリメラ一ゼ連鎖反応（PCR) には、 Ge n e Amp PCR Sy s t em 24 00 t h e rma l c y c l e r (Pe r k i n E 1 me r社製）を用いた。

続いて、 1 s t _P CR産物をスピンカラム（M i c r o S p i n (登録商標） S— 400, Ame r s h am Ph a rma c i a社製）で精製し、以下の条件で 2 nd— 3' — RACEを行った。すなわち、 3 1の 1 s t— PCR 産物、 5 1の 1 0 XPCR bu f f e r, 8 1の dNTP m i x、 3 1の O c t— TK— M ( 1 00 pmo 1 1 )、 1 /x lの PCR a n c h o r p r ime r (1 2. 5 pmo 1 / n 1 ) , 0. の TaKaR a Ex Taq (登録商標）（宝酒造社製）、水を混合して全量 50 1にし、 9 4で5分間の後、 94 30秒間、 45 : 30秒間、 72 : 2分間で 30サイクル、その後 72でで 7分間反応させた。

反応液 5； 1を 1. 5 %ァガロースゲルで電気泳動した結果、約 300 b ρの PCR産物の増幅がみられた。

(3) PCR産物の連結反応（ 1 i g a t i o n)

PCR産物をスピンカラムで精製し、そのうち 3 1と 2 1の TAクロー二ングベクター p CR 2. 1 ( I n V i t r o g e n e社製）、 5 1の L i g a t i on h i gh (東洋紡社製）を混合して 16でで 1時間連結反応（ 1 i g a t i on) を行なっ。

(4) 大腸菌の形質転換

上記（3) で得た 10 /i 1の連結反応溶液を、コンビテントセル Comp e t e n t h i gh E. c o 1 i DH 5 α (東洋紡社製）に混合し、氷中に 3 0分間静置した後、 42°Cで 50秒間ヒートショックを行なった。氷中で 2分間冷却した後、 1m lの S〇C me d i umを加え、 37 °Cで 30分間インキュベ一トした。続いて、 LBZAmp. ( 50 gZm 1アンピシリンを含む L B) 寒天培地上に 35 X 1の X— g a 1を塗布した後、 1 0 1の形質転換体をまいた。残りの形質転換体も 10， 000 r pmで 1分間遠沈して容量を 100 /z l程度に減らし、全量を LBZAmp. 寒天培地にまいた。培地は 37°Cで一晚培養した。

(5) コロニー（c o l ony) PCR

得られたコロニーを铸型にして、以下の条件でコロニ一（c o l ony) PC Rを行った。すなわち、大腸菌の菌体、 5 1の l O X r e a c t i on b u f f e r、 5 1の 2mM dNTP s、 3 / 1の 25mM MgC l ₂、 0. 5 w lの M13FW p r ime r (100 pmo \ / \ ) 、 0. 5 1の M 13RV p r ime r (100 pmo \ / n \ ) 0. 5 1の r T a d D NA p o 1 yme r a s e (東洋紡社製）および水を混合して全量 50 1にし、 90でにて 10分間の後、 94 30秒間、 55 30秒間、 72で 1分間で 30サイクル、 72ででさらに 5分間反応させた。反応液 5 1を 1. 5%ァガロースゲルで電気泳動した。

なお、この反応に使用した Ml 3 FW p r ime rおよび Ml 3RV p r ime rは常法により合成した。その配列を以下に示す。

M13FW： 5'-GTAAAACGACGGCCAGTG-3'

M13RV： 5' -GGAAACAGCTATGACCATG-3'

(6) DNAシークェンス

目的のサイズ（約 500 b p) のコロニー（c o l ony) PCR産物をスピンカラムで精製して、 DNA S e qu enc i ng K i t (PE B i o s y s t ems社製）を用いてシークェンスを行った。シークェンスには、 AB I PR I SM 310 Ge ne t i c An a l y z e r (PE B i o s y s t ems社製）を用いた。

得られた配列を、遺伝子解析ソフト GENETYX— MAC (ソフトウェア開発社製）を用いて解析した結果、約 500 b pの部分 cDNA配列が解明できた。

(7) 5 ' -RACE 部分 c DN Aの塩基配列から、以下のプライマーを合成した。

TK-M-5' -1R： 5' -TTCAGGTTTCAGTTCATTGGG-3 '

TK-M-5' -2R： 5' -TTTCGGTGGACCTCTCTTAC-3'

TK-M-5' -3R： 5' -TTCAGACATAGAACCAGGATG-3 '

次に、 5， Z3 ' — RACE K i t (B o e h r i n g e r Ma n n h e i m社製）を用いて以下の手順で 5， —RACEを行った。まず、 2 gの t o t a 1 RNAと 1 1の TK— M_ 5 ' — 1 R (1 2. 5 pmo l / / l ) を混合して、 7 0 で 1 0分間処理した後、氷中で冷却した。そこに、 4 n 1の c DNA s yn t h e s i s bu f f e r、 2 1の dNTP m i x, 1 1の AMV r e v e r s e t r an s c r i p t a s e ( 20 u n i t s / II I ) , DE PC—処理水を混合して全量 20 1にし、 5 5でで 60分間インキュペートした後、 6 5でで 1 0分間処理して、 l s t _ s t r a n d c DN Aを合成した。次いで、 l s t _ s t r and c DNAをスピンカラムで精製した後、 2. 5 ^ 1の r e a c t i o n b u f f e r, 2. 5 1の 2mM d ATPを加えて 94 で 3分間処理し、そこに 1 1の t e rm i n a 1 t r an s f e r a s e (1 0 un i t s i 1 ) を加えて 3 7 で 20分間インキュペートした後、 7 0でで 1 0分間処理して dA— t a i 1 e d cDNAを合成した。

次いで、 1 s t— PCRおよび 2 n d— PCRを、以下の条件で行った。

® 1 s t— PCR：

5 1の d A— t a i 1 e d c DNA, 5 ^ 1の 1 0 X PCR b u f f e r、 8 ^ 1の dNTP m i x、の TK— M— 5 ' - 2 R (1 2. 5 p mo l Z/x l) 、 I m \ (Do \ i g o dT— a n c h o r p r i me r (1 2. 5 pmo \ / n \ ) , 0. 5 1の T aK aR a Ex T a q (登録商標）（宝酒造社製）および水を混合して全量 5 0 ^ 1にし、 94°Cで 5分間の後、 94 °C 3 0秒間、 5 5 °C 30秒間、 7 2 °C 2分間で 30サイクル、その後 7 2 °C で 7分間反応させた。

② 2nd— PCR :

3 1のスピンカラム精製した 1 s t— P CR産物、 5 1の 1 0 X P CR u f f e r, 8 1の dNTP mi x、 1 1の TK— M— 5 ' — 3 R (1 2. 5 pmo \ \ ) , 1 1の PCR anc ho r p r ime r (1 2. 5 pmo l / I ) 、 0. の TaKaR a Ex T a q (登録商標）

(宝酒造社製）および水を混合して全量 50 1にし、 1 3 ー？じ尺と同じサィクルで行った。

以上の方法で得られた 2nd_PCR産物を 1. 5 %ァガロースゲルで電気泳動したところ、約 300 b pのバンドが確認できた。

この 2nd _PCR産物を上記の方法（3) 、（4) 、 (5) および（6) に記載した方法にしたがってシークェンスを行なった。

その結果、タキキニンペプチドの前駆体ペプチドをコードする遺伝子（cDN A) のサイズ（約 460 bp) と、その推定アミノ酸の数（87アミノ酸残基）と配列を明らかにすることができた。そのアミノ酸配列を配列番号 3に、また c DNAの配列を配列番号 4に示した。

また、前駆体ポリペプチド中で、本発明の夕キキニンペプチドに該当するアミノ酸配列が存在する部分を第 7図に示した。図中のアンダーラインで示したアミノ酸配列に該当する部分が、本発明のぺプチドに該当するアミノ酸配列が存在する部分である。実施例 9 ：製剤例

錠剤

組成：化合物（1) または（2) 10 g

乳糖 125 g

微結晶セルロース 25 g トウモロコシデンプン 25 g

5 %ヒドロキシプロピルメチルセルロース 100m l

ステアリン酸マグネシウム 5 g

上記成分を常法により練合、造粒、乾燥後打錠し、 1錠中有効成分として化合物（1) または化合物（2) を 1 Omg含有する重量 19 Omgの錠剤を得た。産業上の利用の可能性

本発明が提供するマダコ神経ペプチドは、低濃度でコィの直腸をすばやく収縮させ、それに続く持続的な収縮をもたらす作用を有する神経ペプチドであり、このような結果は、サブスタンス Pの平滑筋収縮に特徵的な二相の収縮に類似している。

また本発明のマダコ神経べプチドは、 C末端側に哺乳類において平滑筋収縮や血管拡張作用、ならびに血圧降下作用をもたらすタキキニンペプチドに特有の構造である；

-Phe-Ya a-G l y-Le u-Me t一 NH₂

(式中、 Y a aは前記と同義である）

を有している。このことから、本発明のマダコ神経ペプチドは、タキキニンぺプチドに分類される。

したがって、本発明のマダコ神経ペプチドは、神経伝達系を解明するための生化学試薬として有用なものであり、また、分子レベルでの構造活性相関の研究を通じて、医薬および農薬等への新たなアプローチを与えるものである。

さらに、本発明によって得られるタキキニンぺプチドの前駆体ポリぺプチドおよびそれをコードする遺伝子は、本発明の夕キキニンべプチドを製造する際の重要なツールとなる。

Claims

請求の範囲

1. 次の特性：

① アミノ酸残基数が 12であり；

② N末端が Ly sであり；

③ C末端から 5つのアミノ酸が次のアミノ酸配列式（I) 、

-Ph e-Xa a-G l y-Le u-Me t -NH₂ (I) (式中、 Xaaは Va l、 I l e、 Ph e、または Ty rを表す）で表される夕キキニンペプチド。

2. 次のアミノ酸配列式（I I) ：

H-Ly s -P r o-P r o-S e r - S e r - S e r -G 1 u— Phe—

Xa a-G l y-Leu-Me t -NH₂ (I I)

(式中、 Xa aは Va l、 l i e, Ph e, または T y rを表す）で表される請求の範囲第 1項に記載のぺプチド。

2. マダコ（Oc t opu s vu r i s) の後部唾腺から得られる請求の範囲第 1項または第 2項に記載のぺプチド。

4. 次のアミノ酸配列式（1) ：

H-Ly s -P r o-P r o-S e r - S e r - S e r -G 1 u— Phe—

Va 1 -G l y-Le u-Me t -NH₂ ( 1 )

で表される請求の範囲第 1項ないし第 3項のいずれかに記載のぺプチド。 5. 次のアミノ酸配列式（2) ：

H-Ly s -P r o-P r o-S e r-S e r-S e r-G l u-Phe- I 1 e-G l y-L e u-Me t -NH₂ (2)

で表される請求の範囲第 1項ないし第 3項のいずれかに記載のぺプチド。

6. 配列番号 3に示すアミノ酸配列、あるいは該アミノ酸配列に対して 1個または複数個のアミノ酸の付加、欠失、および Zまたは他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有する、タキキニンべプチドの前駆体ポリぺプチド。

7. 請求の範囲第 6項に記載の夕キキニンペプチドの前駆体ポリペプチドをコ —ドする DNA。

8. 配列番号 4に示す塩基配列からなる DNA。

9. 請求の範囲第 7項または第 8項に記載の D N Aとハイブリダイズする D N A。

10. 配列番号 1ないし配列番号 3に示すアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとハイブリダィズする D A N。 11. 請求の範囲第 7項ないし第 10項のいずれかに記載の DNAを含んでなるベクター。

12. 請求の範囲第 1 1項に記載のベクターにより形質転換された宿主。 13. 請求の範囲第 12項に記載の宿主を培養し、または生育させ、そして該宿主または該宿主の培養液から夕キキニンペプチドの前駆体ボリペプチドを採取する、タキキニンべプチドの前駆体ポリぺプチドの製造方法。

14. 請求の範囲第 13項に記載の方法により得られる、夕キキニ

の前駆体ポリペプチド。

15. 請求の範囲第 13項に記載の方法により得られる夕キキニンペプチドの前駆体ポリペプチドから、タキキニンペプチドの前駆体を切り出し、続いて C末端を修飾することを特徴とする夕キキニンペプチドの製造方法。

6. 請求の範囲第 15項に記載の方法により得られるタキキニ

17. 次のアミノ酸配列式（1) および（2) ：

H-Ly s -P r o-P r o-S e r - S e r - S e r -G 1 u— Phe

Va l -G l y-L e u-Me t -NH₂ (1)

H-Ly s -P r o-P r o-S e r一 S e r - S e r -G 1 u-Ph e

I 1 e _G 1 y— L e u— Me t—NH₂ (2)

で表される請求の範囲第 16項に記載の夕キキ二：

18. 請求の範囲第 1項ないし第 5項のいずれか 1項に記載する夕キキニプチドを有効成分とする医薬または農薬。